CN102453092B - 抗镰刀菌单链抗体的筛选及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种抗镰刀菌单链抗体的筛选及其在镰刀菌免疫学检测方面的应用。直接从串珠镰刀菌细胞壁蛋白(CWP)免疫的小鼠脾脏细胞出发，利用分子克隆方法和技术构建单链抗体基因文库，再通过噬菌体展示技术筛选、表达ELISA鉴定及序列测定，最后获得一个高亲和力的抗镰刀菌单链抗体及其编码基因，命名为Fv-chic1F11。该单链抗体在大肠杆菌中进行大量表达纯化后可直接应用于镰刀菌的检测，包括在检测田间作物、饲料或粮食镰刀菌污染中的应用。

Description

抗镰刀菌单链抗体的筛选及应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种抗镰刀菌单链抗体的筛选及应用，与抗体筛选技术有关。

背景技术

镰刀菌是世界上广泛存在的一类非专性、非宿主特异性的病原真菌，易产生于生长期和储存期的粮食作物及其产品中。镰刀菌能够侵染小麦(Triticum aestivum)、大麦(Hordeum vulgare)、燕麦(Avena sativaL.)、玉米(Zea mays L.)、水稻(Oryza sativa)、黑麦(Secale cereale L.)等多种禾谷类作物，引起种腐、苗腐、茎腐和穗腐等病害，严重影响作物的生长发育状况及籽粒质量，从而造成严重的经济损失。镰刀菌侵染作物后还可产生多种真菌毒素，在世界各地的谷类作物和动物饲料草料中都发现存在不同程度的镰刀菌毒素污染。自然界几类危害较大、出现频率高的真菌毒素中，其中脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)、雪腐镰刀菌烯醇(Nivalenol，NIV)、玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)、伏马菌素(Fumonisins，FBs)、T-2毒素以及这些毒素的衍生物等就是由镰刀菌属真菌产生的主要镰刀菌毒素。这些毒素不仅在病原菌与植物互作中起致毒因子或致病因子的作用，更为严重的是它们可抑制真核生物细胞蛋白质合成，具有强烈的致呕性和免疫抑制作用，可破坏人和动物的免疫系统，越来越多的证据还显示这些毒素具有神经毒性、致畸性和致癌性。因此，镰刀菌污染作物产生的真菌毒素能引起人和动物多种疾病，给人畜健康造成了严重的威胁。

镰刀菌侵染作物引起的各种病害是我国小麦、玉米和水稻等主要粮食作物生产上的重要病害，特别是在我国长江流域、华中、华南及东北小麦玉米种植区流行频繁，近年来已有向黄淮区扩展蔓延之势。调查也显示我国的主要粮食作物籽粒均不同程度受到镰刀菌及其产生的真菌毒素的污染，且新粮中污染程度重于陈粮。因此，快速、可靠、适合大规模操作的检测方法是调查镰刀菌污染、防控镰刀菌及其产生的真菌毒素危害人畜健康所必需的前提条件。目前，对粮食作物及其制品中镰刀菌污染的检测主要通过培养后进行菌丝和孢子形态特征的观察或借助PCR技术进行分子检测，但这两种检测方法在对样品处理时都需要较繁锁的操作，不适合大规模连续性操作，而免疫学检测方法样品处理简单，检测过程也可规模化、程序化操作，省时省力，易于推广使用。本发明通过构建免疫抗体基因文库，利用噬菌体抗体库技术筛选获得抗镰刀菌单链抗体，可为检测和调查玉米等粮食作物及其制品中镰刀菌的污染情况提供快速可靠的检测手段。

发明内容

本发明目的在于克服现有检测技术存在的缺陷和不足，利用噬菌体抗体库技术获得一种抗镰刀菌单链抗体，用于在植物或植物来源产品中镰刀菌污染情况的免疫检测，为镰刀菌病害调查及出入境粮食和饲料等的镰刀菌检验检疫提供可靠有效的检测手段。

本发明是这样实现的：直接从串珠镰刀菌细胞壁蛋白(CWP)免疫的鸡脾脏细胞出发，利用分子克隆方法和技术构建单链抗体基因文库，再通过噬菌体展示技术筛选、表达ELISA鉴定及序列测定，最后获得一个高亲和力的抗镰刀菌单链抗体及其编码基因，申请人将其命名为Fv-chic 1F11，该单链抗体可在大肠杆菌中进行可溶性表达。

本发明的抗镰刀菌单链抗体由822个核苷酸组成，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

本发明的抗镰刀菌单链抗体由273个氨基酸组成，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。

本发明的抗镰刀菌单链抗体主要由抗体重链可变区V_H、抗体轻链可变区V_L和连接肽组成，抗体重链可变区V_H和抗体轻链可变区V_L通过连接肽(Gly₄ Ser)₃连接共同完成镰刀菌的识别和结合。

本发明的抗镰刀菌单链抗体的重链可变区V_H由381个核苷酸组成，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示。

本发明的抗镰刀菌单链抗体的重链可变区V_H由127个氨基酸组成，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：4所示。

本发明的抗镰刀菌单链抗体的轻链可变区V_L由318个核苷酸组成，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：5所示。

本发明的抗镰刀菌单链抗体的轻链可变区V_L由106个氨基酸组成，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：6所示。

本发明的抗镰刀菌单链抗体在大肠杆菌中进行大量表达纯化后可直接应用于镰刀菌的检测，所述的应用包括在检测田间作物、粮食或饲料镰刀菌污染中的应用，也可以作为在制备ELISA检测试剂盒中的应用。本发明的有益效果：

1、本发明的有益效果之一是利用噬菌体抗体库技术，构建了抗镰刀菌单链抗体基因文库，通过噬菌体展示技术筛选获得一个高亲和力的抗镰刀菌单链抗体及其编码基因。

2、本发明的有益效果之二是提供的单链抗体可用于在粮食作物的籽粒、饲料或粮食产品中的因潜在的镰刀菌污染的生物材料的快速检测。本发明所提供的抗镰刀菌单链抗体通过重组大肠杆菌表达纯化后可直接用于镰刀菌的检测。

3、本发明的有益效果之三是提供的单链抗体生产成本低。本发明所提供的抗镰刀菌单链抗体可在重组大肠杆菌中进行大量可溶性表达，不需要贵重的仪器和繁锁的操作，成本低，适合大规模的生产。

4、本发明的有益效果之四是提供的单链抗体基因易于通过基因工程操作，如碱基突变等改变基因特性，提高单链抗体的稳定性或亲和力。

附图说明

SEQ ID NO：1是本发明的抗镰刀菌单链抗体的核苷酸序列，序列全长为822bp。

SEQ ID NO：2是本发明的抗镰刀菌单链抗体的氨基酸序列，由273个氨基酸组成。

SEQ ID NO：3是本发明的抗镰刀菌单链抗体重链可变区V_H的核苷酸序列，序列全长为381bp。

SEQ ID NO：4是本发明的抗镰刀菌单链抗体重链可变区V_H的氨基酸序列，由127个氨基酸组成。

SEQ ID NO：5是本发明的抗镰刀菌单链抗体轻链可变区V_L的核苷酸序列，序列全长为318bp。

SEQ ID NO：6是本发明的抗镰刀菌单链抗体轻链可变区V_L的氨基酸序列，由106个氨基酸组成。

图1：是本发明的技术流程图。

图2：是本发明V_H和V_L片段PCR扩增产物凝胶电泳图。

图中：M：DNA分子量标准；V_H：重链可变区片段；V_L：轻链可变区片段；CK：水对照。

图3：是本发明scFv片段PCR扩增产物凝胶电泳图。

图中：M：DNA分子量标准；scFv：单链抗体片段。

图4：是本发明载体pHENHi结构图。

图5：是本发明检测抗体基因文库阳性克隆率提取的质粒DNA凝胶电泳图。

图中：M：DNA分子量标准；泳道1～22：22个单克隆菌编号；PK：阳性对照；V：载体。

图6：是本发明检测抗体基因文库阳性克隆率PCR扩增产物凝胶电泳图。

图中：M：DNA分子量标准；泳道1～22：22个单克隆菌编号；NK：阴性对照；PK：阳性对照。

图7：是本发明检测抗体基因文库多样性BstN I限制性内切酶酶切产物凝胶电泳图。

图中：M：DNA分子量标准；泳道1～22：22个单克隆菌编号；NK：阴性对照；PK：阳性对照。

图8：是本发明纯化的Fv-chic 1F11单链抗体SDS-PAGE电泳检测图。

图中：M：蛋白分子量标准；泳道1～3：缓冲液B1、B2和B3洗脱液(杂蛋白)；泳道4～6：缓冲液C1、C2和C3洗脱液(目的蛋白)。

图9：是本发明纯化的Fv-chic 1F11单链抗体Western blot分析图。

图中：M：蛋白分子量标准；泳道1：纯化的Fv-chic 1F11单链抗体。

图10：是本发明Western blot分析单链抗体Fv-chic 1F11与镰刀菌CWP结合情况图(左图为真菌CWP的SDS-PAGE电泳图，右图为相对应的Western blot图)。

图中：M：蛋白分子量标准；泳道1：串珠镰刀菌CWP；泳道2：禾谷镰刀菌CWP；泳道3：黄曲霉CWP；泳道4：油菜菌核菌CWP。

具体实施方式

实施例1：串珠镰刀菌细胞壁蛋白(CWP)制备

1)用接种针挑取串珠镰刀菌(Fusarium verticillioides)wh1-2(该菌株已于2010年10月28日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为：CCTCC M 2010283)，接种于20ml CMC培养基(成分：0.75％(W/V)羧甲基纤维素酯，0.05％(W/V)NH₄NO₃，0.05％(W/V)KH₂PO₄，0.025％(W/V)MgSO₄·7H₂O，0.05％(W/V)酵母粉)中，28℃，200r/min振荡光照培养3天。

2)取1ml孢子液接种于160ml Czapek培养基(成分：3％(W/V)蔗糖，0.3％(W/V)NaNO₃，0.1％(W/V)K₂HPO₄，0.05％(W/V)MgSO₄·7H₂O，0.05％(W/V)KCl，0.001％(W/V)FeSO₄，pH 9.0)中，28℃，225r/min振荡避光培养5～7天。

3)用2层灭菌纱布过滤培养液，并用灭菌水洗涤3次后将菌丝置于超净工作台上吹干。

4)在研钵中加入液氮研磨菌丝，装入2ml离心管中，置于冰上。

5)加入1.5～2ml CWP缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)，pH 7.8)混匀。

6)4℃，50r/min旋转洗涤30min。

7)4℃，4600r/min离心10min，弃上清。

8)用预冷的CWP洗脱液(1M NaCl，1mM PMSF)洗涤3～5次(每次4℃，50r/min旋转洗涤30min，再4℃，4600r/min离心10min后弃上清)。

9)加入10ml含1mM PMSF的灭菌水混匀，4600r/min离心10min。

10)提取的串珠镰刀菌CWP溶于1xPBS中，于-20℃保存备用。

实施例2：动物免疫

用制备的串珠镰刀菌CWP免疫来亨母鸡(购自华中农业大学养鸡场)4次，每次间隔14天。第一次取500μl免疫抗原与300μl弗氏完全佐剂混合后免疫，后三次取500μl免疫抗原与300μl弗氏不完全佐剂混合后免疫。第三次免疫后第5天取血清从1∶10³倍比稀释至1∶128×10³，参照林巧爱、董海艳主编，《医学免疫学与微生物学实验指导》，浙江大学出版社，2006年出版介绍的间接ELISA法检测免疫鸡血清中抗体的水平。检测结果显示被免疫后的鸡血清中产生了较高的抗体滴度(稀释度＞1∶10⁵)。

实施例3：免疫鸡脾脏RNA提取、mRNA纯化及cDNA第一链合成

1)对产生了较高抗体滴度的鸡再加强免疫一次，7天后取免疫鸡的脾脏。

2)利用TRNzol-A⁺总RNA提取试剂(购自天根生化科技(北京)有限公司产品，按照该试剂的说明书操作)提取脾脏总RNA。

3)用mRNA纯化试剂盒(购自QIAGEN公司，按该试剂盒的说明书操作)对步骤2)提取的总RNA进行纯化。

4)用SuperScript^TM III反转录酶(购自Invitrogen公司，按照该酶的说明书操作)分别以步骤3)得到的纯化mRNA为模板，用特异引物chicVHM(CGGTGGGGGACATCTGAGTGGG)反转录合成抗体重链可变区(V_H)的cDNA第一链；用特异引物chicVLM(AGGGGTGGAGG ACCTGCACCTC)反转录合成轻链可变区(V_L)的cDNA第一链。

实施例4：PCR扩增重链可变区(V_H)、轻链可变区(V_L)及单链抗体(scFv)基因

1)PCR扩增重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)基因

以实施例3反转录合成的重链可变区(V_H)的cDNA为模板，用正向引物CPDVHF(ATCTAGGCATCCCTTGGCCCAGCCGGCCATGGCTGCCGTGACGTTGGACGAGTCC)和反向引物CHIC Gly(GCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTGAGGAGACGAT GACCTCGGTCCC)进行PCR扩增获得重链可变区片段(V_H)；以实施例3反转录合成的轻链可变区(V_L)的cDNA为模板，用正向引物CHIC Ser(GGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGG CGGATCGGCGCTGACTCAGCCGTCCTCGGTG)和反向引物CPDVLB(TGACCTTCGAGGATGCGCGGCCGCGTCGACGGGCTGGCCTAGGACGGTCAG)进行PCR扩增获得轻链可变区片段(V₁)。在50μl PCR反应液中，含有4μl cDNA，5μl PCR缓冲液(含Mg²⁺)，8μl 1.25mM dNTPs，2μl正向引物(10μM)，2μl反向引物(10μM)，2.5U Taq聚合酶。PCR反应条件为：95℃5min；94℃1min，55℃1min，72℃80sec，30个循环；最后72℃10min。PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，其结果如图2所示，V_H和V_L片段大小与预期相一致。

2)用DNA凝胶回收试剂盒(购自QIAGEN公司，按照该试剂盒的说明书操作)分别纯化步骤1)扩增得到的V_H和V_L片段。

3)SOE-PCR扩增单链抗体(scFv)基因

加入近等摩尔的V_H和V_L片段作为模板，用正向引物CPDVHF和反向引物CPDVLB进行SOE-PCR扩增获得scFv基因。SOE-PCR分两步反应完成，第一步反应在50μl PCR反应液中，含有V_H和V_L片段各400ng，5μl PCR缓冲液(含Mg²⁺)，8μl 1.25mM dNTPs，2.5U Taq聚合酶。PCR反应条件为：95℃5min，55℃2min，72℃15min，7个循环；第二步反应在50μl PCR反应液中，含有10μl第一步反应PCR产物，4μl PCR缓冲液(含Mg²⁺)，8μl 1.25mM dNTPs，2μl正向引物(10μM)，2μl反向引物(10μM)，2.5U Taq聚合酶。PCR反应条件为：95℃5min；94℃1min，55℃80sec，72℃2min，30个循环；最后72℃10min。PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，其结果如图3所示，scFv片段大小与预期相一致。

4)用DNA凝胶回收试剂盒(购自QIAGEN公司，按照该试剂盒的说明书操作)回收纯化步骤3)获得的scFv片段。

实施例5：载体pHENHi及scFv片段酶切、连接

1)分别用Sfi I和Not I限制性内切酶(购自NEB公司，按照该酶的说明书操作)双酶切载体pHENHi(德国弗朗霍夫分子生物与应用生态学研究所赠送)和实施例4得到的scFv片段。

2)用DNA凝胶回收试剂盒(购自QIAGEN公司，按照该试剂盒的说明书操作)纯化步骤1)酶切后的pHENHi载体和scFv片段。

3)用T4DNA连接酶(购自NEB公司，按照该酶的说明书操作)连接步骤2)回收的pHENHi载体和scFv片段，得到酶切连接产物pHENHi-scFv。

4)参照J.萨姆布鲁克等[美]，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2003年，第三版介绍的方法对步骤3)得到的酶切连接产物pHENHi-scFv进行乙醇沉淀除盐。

实施例6：单链抗体基因文库构建

1)大肠杆菌XL1-Blue MRF’感受态细胞制备

用无菌牙签蘸取-80℃冰箱保存的大肠杆菌XL1-Blue MRF’株，在LB固体培养基(成分：1％(W/V)胰蛋白胨，0.5％(W/V)酵母提取物，1％(W/V)NaCl，1.5％(W/V)琼脂，pH 7.0)平板上划线，于37℃培养箱培养16h后，挑取一单克隆菌落接种到5ml LB液体培养基(成分：1％(W/V)胰蛋白胨，0.5％(W/V)酵母提取物，1％(W/V)NaCl，pH 7.0)中，37℃，200r/min振荡过夜培养16h。取1.6ml菌液加入到160ml LB液体培养基中，37℃，230r/min振荡培养至OD₆₀₀达到0.45左右时，取出培养菌的三角瓶置于冰上冷却30min后，将菌液分装于50ml离心管中，4℃，4000r/min离心15min，弃上清，然后用30ml预冷的10％(V/V)甘油洗涤菌体沉淀两次(4℃，4000r/min离心15min后弃上清)。最后每个离心管中加入100μl预冷的GYT培养基(成分：0.25％(W/V)胰蛋白胨，0.125％(W/V)酵母提取物，10％(V/V)甘油)悬浮菌体，分装成100μl/管，立即保存于-80℃冰箱。

2)电转化酶切连接产物

将-80℃保存的大肠杆菌XL1-Blue MRF’感受态细胞取出，置冰上溶化后，每管感受态细胞(100μl)中加入5μl酶切连接产物pHENHi-scFv，小心轻微地混匀后放冰上静置3min，然后将感受态细胞转移至冰上预冷的电转化杯(0.2mm)(购自BIO-RAD公司)中，用BIO-RAD公司的MicroPulser^TM电转化仪进行电转化(设置Bacteria Ec2程序)。转化后立即加入1ml SOC培养基(成分：2％(W/V)胰蛋白胨，0.5％(W/V)酵母提取物，0.05％(W/V)NaCl，20mM葡萄糖，pH 7.0)到电转化杯中，并将菌液转移至离心管中，37℃，200r/min振荡培养1h使细菌复苏。

3)电转化感受态细胞涂布平板培养

取出复苏后的感受态细胞，取100μl涂布于LB固体培养基(含1％(W/V)葡萄糖，100μg/ml氨苄青霉素(Amp))平板用于计算单克隆菌落数。其余的菌液通过6000r/min离心1min后吸取部分上清丢弃，每管保留约100～150μl上清重悬菌体，涂布于LB固体培养基(含1％(W/V)葡萄糖，100μg/mlAmp)平板。培养基平板放置于37℃恒温箱过夜培养12～16h至单克隆菌落长出。

4)抗体基因文库收集保存

计算电转化感受态细胞涂布平板培养后长出的单克隆菌落数量，估算抗体基因文库容量。收集LB固体培养基平板上长出的菌落，加入等体积50％(V/V)甘油保存于-80℃冰箱。

通过以上步骤操作，最后构建的抗镰刀菌单链抗体基因文库容量约为1×10⁵cfu。

实施例7：单链抗体基因文库鉴定

1)从实施例6平板上长出的转化子中随机挑取22个单克隆菌落接种到LB液体培养基(含1％(W/V)葡萄糖，100μg/ml Amp)中，37℃，220r/min振荡过夜培养16h。

2)参照J.萨姆布鲁克等[美]，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2003年，第三版介绍的煮沸裂解法提取质粒DNA，通过0.8％(W/V)琼脂糖凝胶电泳检测抗体基因文库的阳性率。

3)以步骤2)得到的质粒DNA为模板，用正向引物pHENpel(GCAGCCGCTGGATTG TTATTACTCGC)和反向引物pHENmyc(ATTCAGATCCTCTTCTGAGATGAG)进行PCR扩增。在25μl PCR反应液中，含有50ng质粒DNA，2.5μl PCR缓冲液(含Mg^2-)，2μl 1.25mM dNTPs，1μl止向引物pHENpel(10μM)，1μl反向引物pHENmyc(10μM)，1.25U Taq聚合酶。PCR反应条件为：94℃5min；94℃50sec，48℃90sec，72℃90sec，35个循环；最后72℃10min。PCR产物通过1％(W/V)琼脂糖凝胶电泳检测抗体基因文库的阳性率。

4)用BstN I限制性内切酶(购自NEB公司，按照该酶的说明书操作)酶切步骤3)扩增的PCR产物，酶切产物通过1.5％(W/V)琼脂糖凝胶电泳检测抗体基因文库的多样性。

鉴定结果如图5～7所示，构建的抗体基因文库阳性率95％，多样性高于60％。

实施例8：噬菌体展示筛选单链抗体基因文库

1)取实施例6收集保存的菌液(抗体基因文库)800μl加入到50ml 2TY培养基(成分：1.6％(W/V)胰蛋白胨，1％(W/V)酵母提取物，0.5％(W/V)NaCl，pH 7.0)(含1％(W/V)葡萄糖，100μg/ml Amp)中，37℃，230r/min振荡培养至OD₆₀₀达到0.5。

2)取5ml菌液于50ml离心管中，加入0.5μl M13KO7辅助噬菌体(购自Amersham Biosciences公司，参照J.萨姆布鲁克等[美]，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2003年，第三版介绍的方法制备保存，其中：噬菌体的量为大肠杆菌的20倍)，混匀后于37℃水浴静置30min。

3)4000r/min离心10min，去上清，然后重悬于140ml 2TY培养基中(含100μg/ml Amp，25μg/ml卡那霉素(Kan))，30℃，200r/min振荡过夜培养至少15h。

4)将过夜培养的菌液分装于50ml离心管中，4℃，4000r/min离心30min。

5)取上清，加入1/5体积的PEG/NaCl溶液(20％(W/V)聚乙二醇(PEG)6000，2.5M NaCl)，充分混匀后置冰上沉淀1h。

6)4℃，8000r/min离心30min，去上清，将沉淀重悬于40ml灭菌水中，并立即加入1/5体积的PEG/NaCl溶液，充分混匀后4℃放置20min。

7)4℃，4000r/min离心30min，去上清。

8)轻微离心，去除残留的PEG/NaCl溶液。

9)加入1.6ml灭菌水重悬沉淀，并4℃，4000r/min离心10min，取上清于4℃保存(取10μl采用10^-2～10^-11梯度稀释来测定滴度)。

10)用串珠镰刀菌CWP包被ELISA板(共20孔，每孔100μl)，37℃水浴2h。

11)用磷酸盐缓冲液(PBS)(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na₂HPO₄，1.8mM KH₂PO₄，pH 7.2～7.4)洗涤3次。

12)每孔加入150μl封闭液(含2％(W/V)脱脂奶粉的PBS溶液)，37℃水浴封闭2h(用封闭液封闭一空白孔作为阴性对照)。

10)用200μl PBS分别洗涤3次，每次3min。

11)每孔中加入100μl取步骤9)保存的上清(噬菌体)，37℃水浴2h。

12)用200μl PBST(含0.1％(V/V)Tween 20的PBS)和PBS分别洗涤5次，每次3min(第二轮和第三轮淘选时增加洗涤次数至10次和15次)。

13)每孔加入100μl三乙胺溶液(100mM)，室温放置10min。

14)立即加入50μl Tris-HCl溶液(1M，pH 7.4)中和，并转移至50ml离心管中。

15)取6ml在37℃，230r/min振荡培养条件下生长到OD₆₀₀为0.5～0.9的大肠杆菌XL1-Blue MRF’加入到50ml离心管中，37℃水浴侵染30min。

16)4000r/min离心10min，去上清。

17)加入800μl LB培养基重悬菌体后涂布于TYE固体培养基(成分：1％(W/V)胰蛋白胨，0.5％(W/V)酵母提取物，0.8％(W/V)NaCl，1.5％(W/V)琼脂，pH 7.0)平板上(涂板时采用10^-2～10^-6梯度稀释来测定滴度)，37℃恒温箱过夜培养12～16h至菌落长出。

18)收集TYE固体培养基平板上长出的菌落，进行下一轮淘选或加入等体积50％(V/V)甘油保存于-80℃冰箱。

实施例9：小量表达ELISA鉴定淘选抗体库

1)实施例8完成三轮淘选后，用灭菌牙签从TYE固体培养基平板上随机挑取47个单克隆菌接种到装有180μl 2TY培养基(含1％(W/V)葡萄糖，100μg/ml Amp)的96孔培养板中，将培养板于37℃，150r/min振荡过夜培养16h。

2)从每孔中取20μl菌液加入到新的装有180μl 2TY培养基(含1％(W/V)葡萄糖，100μg/ml Amp)的96孔培养板中，37℃，150r/min振荡培养6h。

3)4℃，1800r/min离心10min，弃上清。

4)加入180μl新的2TY培养基(含100μg/ml Amp和1mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG))至培养板中，25℃，150r/min振荡过夜诱导表达12～16h。

5)4℃，1800r/min离心10min，每孔中取100μl上清用于ELISA鉴定。

6)在ELISA板孔中加入100μl串珠镰刀菌CWP，37℃水浴包被2h。

7)用200μl PBS洗涤3次。

8)在抗原包被的孔及对照孔中分别加入150μl封闭液(含2％(W/V)脱脂奶粉的PBS溶液)，于37℃水浴封闭2h。

9)用200μl PBS分别洗涤3次，每次3min。

10)在抗原包被孔及其对照孔中分别加入50μl步骤5)收集的上清，并加入50μl封闭液，37℃反应2h。

11)用200μl PBST和PBS分别洗涤3次，每次3min。

12)每孔加入100μl封闭液稀释(体积比为1∶5000)的抗His单克隆抗体(购自天根生化科技(北京)有限公司)，37℃反应1.5h。

13)用200μl PBST和PBS分别洗涤3次，每次3min。

14)每孔加入100μl封闭液稀释(体积比为1∶5000)的碱性磷酸酶(AP)标记的羊抗鼠Fc特异抗体(购自Sigma公司)，37℃反应1.5h。

15)用200μl PBST和PBS分别洗涤3次，每次3min。

16)每孔加入100μl显色液(0.1％(W/V)对硝基苯磷酸二钠溶液)，黑暗条件下反应15～30min。

17)每孔加入50μl NaOH溶液(3M)终止反应，用酶标仪测OD₄₀₅读值。

小量表达ELISA鉴定结果显示，47个单克隆样品中有7个显色，样品OD₄₀₅值与阴性对照OD₄₀₅值之比P/N值为13.4～21.1，说明筛选得到了对镰刀菌CWP亲和力高的单链抗体。单克隆培养菌液送上海英骏生物技术有限公司测序，结果分析后得到一个可用于检测镰刀菌的单链抗体，命名为Fv-chic 1F11，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。含有该基因的大肠杆菌命名为重组大肠杆菌XL1-Blue MRF’/pHENHi-1F11，单克隆培养菌液加等体积50％(V/V)甘油保存于-80℃冰箱。

实施例10：重组大肠杆菌大量表达单链抗体Fv-chic 1F11及抗体回收

1)取5μl甘油保存的重组大肠杆菌XL1-Blue MRF’/pHENHi-1F11接种于20ml 2TY培养基(含1％(W/V)葡萄糖，100μg/ml Amp)中，37℃，200r/min振荡过夜培养12h。

2)取8ml过夜培养菌液加入160ml 2TY培养基(含1％(W/V)葡萄糖，100μg/ml Amp)中，37℃，200r/min振荡培养至OD₆₀₀达到0.5左右。

3)加入终浓度为1mM的IPTG，置于30℃，200r/min诱导表达8h。

4)取培养菌液分装到50ml离心管中，4℃，3000g离心10min，弃上清。

5)每管中加入500μl PPB溶液(30mM Tris-HCl，20％(W/V)蔗糖，pH 8.0)重悬菌体，再加入1μl乙二胺四乙酸(EDTA)溶液(终浓度1mM)，冰上放置15min。

6)4℃，3000g离心15min，上清装入另一离心管中。

7)每管中加入1ml MgCl₂溶液(终浓度5mM)重悬菌体，再加入2μl EDTA溶液(终浓度1mM)，冰上放置15min。

8)4℃，3000g离心15min，上清与步骤6)上清合并。

9)取收集步骤6)和8)上清的离心管于4℃，12000r/min离心15min。

10)取上清用PBS透析。

实施例11：用Ni-NAT柱纯化大量表达的单链抗体Fv-chic 1F11

1)安装纯化柱(购自BIO-RAD公司)，加入400μl充分混匀的基质(购自QIAGEN公司)，使其固定2h以上。

2)剪去下端封口，使液体流下，用5ml PBS进行平衡。

3)加入实施例2回收的单链抗体样品过柱，收集保存过柱后的样品流出液。

4)加1ml缓冲液B(50mM Na₂HPO₄，20mM咪唑)洗脱纯化柱3次，分别收集洗脱液为B1、B2、B3(杂蛋白)。

5)加400μl缓冲液C(50mM Na₂HPO₄，250mM咪唑)洗脱纯化柱3次，分别收集洗脱液为C1、C2、C3(目的蛋白)。

6)加5ml PBS平衡纯化柱后，加入1ml 30％(V/V)酒精4℃保存纯化柱。

7)目的蛋白(单链抗体)通过SDS-PAGE电泳检测后用PBS透析。

实施例12：SDS-PAGE电泳检测和Western blot分析表达纯化的单链抗体Fv-chic 1F11

1)SDS-PAGE电泳检测：取10μL实施例11纯化的单链抗体Fv-chic 1F11，加入2.5μL 5×十二烷基硫酸钠(SDS)加样缓冲液(250mM Tris-HCl(pH 6.8)，10％(W/V)SDS(电泳级)，0.5％(W/V)溴酚蓝，50％(V/V)甘油，5％(W/V)β-巯基乙醇)，充分混匀，水浴煮沸5min，然后置于冰上备用。参照J.萨姆布鲁克等[美]，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2003年，第三版介绍的方法制备分离胶和浓缩胶，加入1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液(25mM Tris，250mM甘氨酸，0.1％(W/V)SDS)，取放置在冰上的样品上样，先用80伏电压电泳20min，再用120伏电压电泳80～120min至溴酚蓝跑至分离胶外。取下凝胶，去掉浓缩胶后用染色液(0.1％(W/V)考马斯亮蓝R-250，25％(V/V)异丙醇，10％(V/V)冰醋酸)染色30min，然后用脱色液(5％(V/V)甲醇，7.5％(V/V)冰醋酸)脱色3～5次，即可观察照相，结果如图8所示，可见约30kD大小的目的蛋白。

2)Western blot分析：按SDS-PAGE检测所述方法进行SDS-PAGE电泳后的凝胶不经染色液染色，直接用BIO-RAD公司

SD Semi-Dry Transfer Cell半干转印装置将凝胶中的蛋白转印到尼龙膜上，于200mA恒定电流转膜25min。转印结束后，将尼龙膜转移到含有封闭液(5％(W/V)脱脂奶粉，20mM Tris-HCl(pH 8.0)，150mM NaCl)的杂交盒中，室温平缓摇动15～20min后放置37℃2h或4℃过夜。然后倒掉封闭液，加入10ml TBST(20mM Tris-HCl(pH 8.0)，150mM NaCl，0.1％(V/V)Tween 20)洗涤3次，每次5min。再加入10ml经TBST稀释(体积比为1∶5000)的抗His单克隆抗体(购自天根生化科技(北京)有限公司)，室温平缓摇动2h后倒掉，用10ml TBST缓冲液洗涤3次，每次5min。再加入10ml经TBST缓冲液稀释(体积比为1∶5000)的AP标记羊抗鼠Fc特异抗体(购自Sigma公司)，室温平缓摇动2h后倒掉，用10ml TBST和TBS(20mM Tris-HCl(pH 8.0)，150mM NaCl)分别洗涤5次，每次5min。最后用BCIP/NBT显色试剂盒(购自武汉博士德生物工程有限公司，按照试剂盒说明书操作)显色10～20min后，用蒸馏水终止反应，即可观察并照相。结果如图9所示，在约36kD大小处出现特异性条带，表明表达的抗体完整性较好，能够在重组大肠杆菌中正常表达。特异条带大小与SDS-PAGE电泳条带大小不一致，可能是由于预染蛋白分子量标准因与染料共价偶联而在SDS-PAGE电泳时的迁移特性发生某些改变的缘故而造成的。

实施例13：Western blot分析单链抗体Fv-chic 1F11与镰刀菌CWP结合情况

按实施例12进行SDS-PAGE检测所述方法对串珠镰刀菌、禾谷镰刀菌、黄曲霉和油菜菌核菌的CWP进行SDS-PAGE电泳后的凝胶不经染色液染色，直接用BIO-RAD公司

SD Semi-Dry Transfer Cell半干转印装置将凝胶中的蛋白转印到尼龙膜上，于200mA恒定电流转膜25min。转印结束后，将尼龙膜转移到含有封闭液(5％(W/V)脱脂奶粉，20mM Tris-HCl(pH 8.0)，150mM NaCl)的杂交盒中，室温平缓摇动15～20min后放置37℃2h或4℃过夜。然后倒掉封闭液，加入10ml TBST(20mM Tris-HCl(pH 8.0)，150mM NaCl，0.1％(V/V)Tween 20)洗涤3次，每次5min。加入10ml经TBST稀释的实施例11纯化的单链抗体Fv-chic 1F11(200～500nM)，室温平缓摇动2h后倒掉，用10ml TBST缓冲液洗涤3次，每次5min。再加入10ml经TBST稀释(体积比为1∶5000)的抗His单克隆抗体(购自天根生化科技(北京)有限公司)，室温平缓摇动2h后倒掉，用10ml TBST缓冲液洗涤3次，每次5min。再加入10ml经TBST缓冲液稀释(体积比为1∶5000)的AP标记羊抗鼠Fc特异抗体(购自Sigma公司)，室温平缓摇动2h后倒掉，用10ml TBST和TBS(20mM Tris-HCl(pH 8.0)，150mM NaCl)分别洗涤5次，每次5min。最后用BCIP/NBT显色试剂盒(购自武汉博士德生物工程有限公司，按照试剂盒说明书操作)显色10～20min后，用蒸馏水终止反应，即可观察并照相。Western blot分析结果如图10所示，单链抗体Fv-chic 1F11能很好的与串珠镰刀菌和禾谷镰刀菌的CWP结合，而不能与黄曲霉和油菜菌核菌的CWP结合，说明同一属内不同种的真菌细胞壁成分及细胞壁蛋白结构存在相似性，单链抗体Fv-chic 1F11能用于镰刀菌的检测。

实施例14：纯化的单链抗体Fv-chic 1F11用于镰刀菌及其孢子检测

1)在ELISA板孔中加入100μl镰刀菌CWP或孢子液，37℃水浴包被2h。

2)用200μl PBS洗涤3次。

3)在抗原包被孔及其对照孔中分别加入150μl封闭液(含2％(W/V)脱脂奶粉的PBS溶液)，37℃水浴封闭2h。

4)用200μl PBS洗涤3次，每次3min。

5)每孔加入100μl封闭液稀释的实施例11纯化的单链抗体Fv-chic 1F11(200～500nM)，37℃反应2h。

6)用200μl PBST和PBS分别洗涤3次，每次3min。

7)每孔加入100μl封闭液稀释(体积比为1∶5000)的抗His单克隆抗体(购自天根生化科技(北京)有限公司)，37℃反应1.5h。

8)用200μl PBST和PBS分别洗涤3次，每次3min。

9)每孔加入100μl封闭液稀释(体积比为1∶5000)的AP标记的羊抗鼠Fc特异抗体(购自Sigma公司)，37℃反应1.5h。

10)用200μl PBST和PBS分别洗涤3次，每次3min。

11)每孔加入100μl显色液(0.1％(W/V)对硝基苯磷酸二钠溶液)，黑暗条件下反应15～30min。

12)每孔加入50μl NaOH溶液(3M)终止反应，用酶标仪测OD₄₀₅读值。

加入显色液显色30min后，串珠镰刀菌CWP包被孔OD₄₀₅值与阴性对照OD₄₀₅值之比P/N＝38.2，禾谷镰刀菌CWP包被孔OD₄₀₅值与阴性对照OD₄₀₅值之比P/N＝23.4，串珠镰刀菌孢子液包被孔OD₄₀₅值与阴性对照OD₄₀₅值之比P/N＝15.7，禾谷镰刀菌孢子液包被孔OD₄₀₅值与阴性对照OD₄₀₅值之比P/N＝9.3，这些结果说明重组大肠杆菌大量表达纯化的单链抗体Fv-chic 1F11对镰刀菌CWP和孢子液都有很高的亲和力，能用于镰刀菌的检测。

实施例15：纯化的单链抗体Fv-chic 1F11用于检测镰刀菌污染的玉米籽粒

1)取镰刀菌侵染症状明显和健康的玉米籽粒3～5粒，分别研磨成玉米粉。

2)将玉米粉转到离心管中，加入约1ml PBS混匀后，取玉米粉乳浊液加入到ELISA板孔中(每孔100μl)，37℃水浴包被2h。

3)用200μl PBS洗涤3～5次。

4)每孔加入150μl封闭液(含2％(W/V)脱脂奶粉的PBS溶液)，37℃水浴封闭2h。

5)用200PBS洗涤3次，每次3min。

6)加入100μl封闭液稀释的实施例11纯化的单链抗体Fv-chic 1F11(200～500nM)或加入100μl封闭液作对照，37℃反应2h。

7)用200μl PBST和PBS分别洗涤3次，每次3min。

8)每孔加入100μl封闭液稀释(体积比为1∶5000)的抗His单克隆抗体(购自天根生化科技(北京)有限公司)，37℃反应1.5h。

9)用200μl PBST和PBS分别洗涤3次，每次3min。

10)每孔加入100μl封闭液稀释(体积比为1∶5000)的AP标记的羊抗鼠Fc特异抗体(购自Sigma公司)，37℃反应1.5h。

11)用200μl PBST和PBS分别洗涤3次，每次3min。

12)每孔加入100μl显色液(0.1％(W/V)对硝基苯磷酸二钠溶液)，黑暗条件下反应15～30min。

13)每孔加入50μl NaOH溶液(3M)终止反应，用酶标仪测OD₄₀₅读值。

加入显色液显色30min后，镰刀菌侵染症状明显玉米籽粒样品OD₄₀₅值与健康玉米籽粒样品OD₄₀₅值之比P/N＝5.05；在镰刀菌侵染症状明显玉米籽粒的样品中，步骤6)加入封闭液稀释的单链抗体Fv-chic 1F11的OD₄₀₅值与加入封闭液的对照OD₄₀₅值之比P/N＝10.76；而在健康玉米籽粒的样品中，步骤6)加入封闭液稀释的单链抗体Fv-chic 1F11的OD₄₀₅值与加入封闭液的对照OD₄₀₅值之比P/N＝1.98。这些结果表明重组大肠杆菌大量表达纯化的单链抗体Fv-chic 1F11能用来检测植物或植物来源产品中是否存在镰刀菌污染。

Claims (2)

1.一种抗镰刀菌单链抗体，其特征在于，所述的抗镰刀菌单链抗体的编码核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示；其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示；所述的抗镰刀菌单链抗体还具有下列特征：

所述的抗镰刀菌单链抗体主要由抗体重链可变区V_H，抗体轻链可变区V_L和连接肽组成，所述的抗体重链可变区V_H和抗体轻链可变区V_L通过连接肽(Gly₄ Ser)₃连接共同完成镰刀菌的识别和结合；

其中：

所述的抗体重链可变区V_H由381个核苷酸编码，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示；

所述的抗体重链可变区V_H由127个氨基酸组成，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：4所示；

所述的抗体轻链可变区V_L由318个核苷酸编码，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：5所示；和

所述的抗体轻链可变区V_L由106个氨基酸组成，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：6所示。

2.权利要求1所述的抗镰刀菌单链抗体在制备镰刀菌ELISA检测试剂盒中的应用。

Images