CN107602704A - 一种抗前列腺癌干细胞抗原单链抗体融合蛋白的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及单链抗体制作技术领域，尤其是一种抗前列腺癌干细胞抗原单链抗体融合蛋白的制备方法，具体涉及到分泌抗前列腺癌干细胞PSCA单链抗体的原核表达载体的构建、表达及应用，所述的抗前列腺癌干细胞抗原特异单链抗体‑碱性磷酸酶融合蛋白PaFv，形式为scFv‑AP，使用方便不需要添加酶标二抗，它即具有抗体的特异性结合抗原、又具有酶活性直接使底物显色的功能，而且此产品结构稳定，可用工程菌发酵生产。

Description

一种抗前列腺癌干细胞抗原单链抗体融合蛋白的制备方法

技术领域

本发明涉及单链抗体制作技术领域，尤其是一种抗前列腺癌干细胞抗原单链抗体融合蛋白的制备方法，具体是一种分泌抗前列腺癌干细胞PSCA单链抗体的原核表达载体的构建、表达及应用，所述的抗前列腺癌干细胞抗原特异单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白PaFv，形式为scFv-AP，使用方便不需要添加酶标二抗，它即具有抗体的特异性结合抗原、又具有酶活性直接使底物显色的功能，而且此产品结构稳定，可用工程菌发酵生产。

背景技术

前列腺癌是目前全球发病率较高的新发恶性肿瘤，其发病率居第二位，患病现象具有明显的地理以及种族差异，在欧美等发达国家中则是位于第一位，在亚非等发展中国家，其发病率虽然低于欧美国家，但是近年来的调查表明，随着平均年龄的增加以及生活方式的改变，主要是饮食结构的改变，前列腺癌在发展中国家的发病率也呈现迅速上升的趋势。在我国，前列腺癌在泌尿生殖系统恶性肿瘤的患病率已经从第三位跃居首位，成为危害我国男性健康的重要疾病。随着分子生物学研究的迅速发展，对大多数肿瘤的发生和发展，在分子水平和细胞水平的变化上，人们有了更深的认识前列腺癌的持续和扩散依赖于雄激素受体传导信号，因此雄激素去势治疗是除外科手术与放射治疗外的标准前列腺癌治疗方法，多数前列腺癌患者在首次接受雄激素去势治疗后都有显著疗效。但经过短暂的缓解期后，几乎所有患者都会复发并由雄激素依赖性前列腺癌发展成高度恶化且广泛转移的雄激素非依赖性前列腺癌，使常规的雄激素去势治疗失去效果。转变后的前列腺癌治疗非常棘手，死亡率极高，因此成为危害男性人群健康的重大疾病。许多前列腺癌患者在患病早期过程中不表现任何症状，因没有及时治疗，最终导致患者病情加重。

目前早期检查前列腺癌的方法包括前列腺特异性抗原(prostate specificantigen,PSA)检测、直肠指检(digital rectal examination,DRE)、经直肠超声(transrectal ultrsonography,TRUS)引导下穿刺活检以及磁共振检查(magneticresonance imaging,MRI)。尽管临床上采用PSA作为前列腺癌筛查的指标已使用多年，但其敏感性和特异性一直饱受诟病。前列腺癌由于破坏了正常的前列腺组织，使PSA漏出到血液中而导致PSA增高，但是PSA增高并非前列腺癌所特有。当前列腺炎、前列腺增生或穿刺活检等都可能会引起PSA增高。特别是当PSA处于4.0～10.0ng/mL之间时(称之为PSA检测的“灰色诊断区域”)，前列腺增生及前列腺癌仅靠PSA很难鉴别，因此，PSA检测具有一定的局限性，其只能作为初步筛选前列腺癌的检查。DRE是目前临床发现前列腺癌的常规检查方法之一，其检测方法简单易行，无侵袭性，费用低廉，由于70％的前列腺癌病灶起源于前列腺外周带，因此DRE对前列腺癌的早期和分期诊断都具有重要价值，但DRE检测个人主观性太强，对发生于周围带及中央带较小的结节性病灶漏诊率相对较高，与检查者经验是密切相关的。经RUS引导下的前列腺穿刺活检被认为是目前确诊前列腺癌的金标准，但受前列腺体积及穿刺针数的影响，存在一定的漏诊率。MRI以其较高的多平面及多参数成像、软组织分辨率及无电离辐射等的优点，现已成为无创性诊断前列腺癌的首选方法，但是磁共振成像检测价格昂贵，对于经济不发达的地区并没有投入使用这项技术，所以还有很多早期患者无法很快检测出前列腺癌。

前列腺干细胞抗原(prostate stem cell antigen,PSCA)是表达在前列腺上皮细胞表面的含123个氨基酸残基的GPI锚定蛋白，是Reiter等发现的一种前列腺癌相关抗原。由于前列腺干细胞抗原具有较高的前列腺组织特异性，其蛋白质分子锚定在细胞表面而并非分泌形式，其在正常前列腺组织中低表达，而在前列腺癌组织中高表达，具有与雄性激素非依赖性和转移癌的形成有关的特点，因此利用PSCA作为前列腺癌前期诊断的潜在靶标而受到了广泛关注。单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白是通过基因工程操作技术将单链抗体和碱性磷酸酶的编码基因连接起来，在大肠杆菌等表达系统中融合表达的蛋白产物。目前，scFv-AP已成功用于多种抗原的检测，包括镰刀菌(Fusarium)、狂犬病毒、炭疽杆菌(Bacillus Anthracis)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)、黄曲霉(Aspergillus)、玉米赤霉烯酮毒素、甜菜坏死黄脉病毒(BNYVV)和痢疾内变形虫(Entamoeba histolytica)等。

而对于scFv-AP还未被应用于前列腺癌的检测处理，也没有相应的文献报道，采用scFv-AP对前列腺癌进行检测的研究。

鉴于此，本研究者将scFv-AP应用于前列腺癌的检测，并对其构建和表达形式进行研究，为检测前列腺癌提供一种抗前列腺癌干细胞抗原单链抗体融合蛋白。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种快捷方便的前列腺癌检测技术，以特异性抗原PSCA为研究对象，根据大肠杆菌密码子的偏爱性优化碱基，合成抗PSCA的单链抗体基因PaFv基因，构建ScFv-AP型融合蛋白表达载体，原核表达的融合蛋白，既具有抗体的特异性性结合抗原、又具有酶活性直接使底物显色的功能，不需要添加酶标二抗，可用工程菌发酵生产。

以特异性抗原PSCA为研究对象，根据大肠杆菌的密码子偏爱性进行碱基优化，合成抗PSCA的单链抗体基因PaFv，用Sfi I和Not I限制性核酸内切酶酶切后，连接至含有AP编码基因的pDAP2/S载体上，转化至大肠杆菌XL1-Blue中，获得的菌种申请人将其命名为PaFv-XL1根据优化的scFv-AP融合蛋白表达条件，以IPTG终浓度0.1mM、诱导温度16℃、摇床转速200r/min、诱导表达20h，表达产物经Ni离子亲和层析柱进行纯化，SDS-PAGE电泳和Western blot检测融合蛋白的表达情况，AP直接显色法检测融合蛋白的活性，利用ELISA分析抗体的可溶性和活性，对所得的单克隆抗体进行生物学评价。经基因工程操作，Westernblot检测融合蛋白的表达情况，ELISA分析单链抗体的生物学活性，得到的抗PSCA单链抗体申请人将其命名为PaFv。

申请人将所得的能够表达抗前列腺癌干细胞抗原特异单链抗体—碱性磷酸酶融合蛋白PaFv菌种PaFv-XL1于2015年1月16日保存在贵州省贵阳市贵安新区贵州医科大学生物技术教研室。

PaFv单链抗体编码基因由824个核苷酸编码，其序列为SEQ ID NO：1所示。

PaFv单链抗体序列为SEQ ID NO：2所示，由277个氨基酸组成，本发明的抗前列腺癌干细胞特异单链抗体主要由抗体重链可变区V_H、抗体轻链可变区V_L和连接肽组成，抗体重链可变区VH和抗体轻链可变区V_L通过连接肽(Gly4Ser)₃连接共同完成对前列腺癌干细胞特异抗原的识别和结合。

在前列腺癌干细胞特异抗原检测中的应用，其应用过程是：

通过直接竞争酶联免疫反应或制备检测试剂盒或蛋白芯片等应用于前列腺癌干细胞特异抗原的检测。

在酶联免疫吸附板孔中加入100μL PSCA(5ng/μL)或PBS溶液(对照)，37℃温浴2h后用200μL PBS洗涤3次；加入150μL 1％(w/v)浓度的小牛血清白蛋白(BSA)溶液，37℃封闭2h；用200μL PBS洗涤3次；加入100μL纯化的本发明的单链抗体(0.2μg/mL)，37℃包被2h；用200μL PBST(含0.1％(v/v)浓度的Tween-20的PBS溶液)和PBS分别洗涤3次后，加入100μL0.2％(w/v)pNPP显色液，黑暗条件下反应45min，加入50μL NaOH溶液(3mol/L)终止反应，用酶标仪测OD_405nm读值，每个样品重复三次。ELISA不需添加酶标二抗，简单快捷，结果显示本发明的单链抗体与PSCA特异性结合。

构建获得能够表达PaFv-AP单链抗体的菌株PaFv-XL1，该菌株可用于大量生产高亲和力的抗前列腺癌干细胞单链抗体。

具有活性的单链抗体PaFv-AP带有His标签，可通过亲和层析分离纯化，得到的单链抗体纯度与亲和力都很高，可用于前列腺癌的检测分析。

PaFv-AP单链抗体虽在大肠杆菌中以包涵体的形式存在，但可通过包涵体破碎溶解获得可溶性抗体，操作简单，生产成本低。

附图说明

图1为本发明创造的工艺流程图。

图2为本发明创造对密码子优化前后的PaFv基因序列比较。

图3为利用ELISA方法检测PaFv-AP融合蛋白的可溶性和活性的关系图。

图4为利用SDS-PAGE电泳检测纯化的PaFv抗体结果图。

M：蛋白质分子质量标准；1：纯化的蛋白；2：超声波处理菌体上清液。

图5为利用Western Blot检测PaFv-AP表达情况。

M：蛋白质分子质量标准；1：超声波处理菌体上清液；2：超声波处理菌体沉淀。

图6为载体pDAP2/S结构图。

具体实施方式

下面结合附图和具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。

实施例，如图1～6所示。

单链抗体(PaFv)基因的设计与合成

根据大肠杆菌密码子偏爱性，优化抗PSCA单链抗体PaFv的碱基序列，并在5’端添加Sfi I酶切位点(GGCCCAGCCGGCCATGG)，在3’端添加218连接肽和Not I酶切位点(GCGGCCGC)，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

碱基裂解法提取质粒DNA、载体DNA

1)挑取PaFv单菌落或20μL保存菌液接种于20mL含100μg/mL氨苄青霉素的2TY液体培养基中，在37℃恒温摇床200r/min振荡培养12～16h。

2)吸取1mL菌液至1.5mL离心管中，5000r/min离心2min，弃上清液，尽可能除去上清液。

3)加入200μL溶液I(50mM葡萄糖、25mM Tris-HCl、10mM EDTA，pH＝8.0)，用移液器充分悬浮菌体。

4)加入400μL溶液II(0.2mM NaOH、1％SDS，pH＝12.6左右，现用现配)，温和缓慢地上下翻转离心管，温和混匀。

5)加入300μL预冷的溶液III(5mM KAc 60mL、冰醋酸11.5mL、重蒸水28.5mL，pH＝4.6)，上下翻转离心管，温和混匀。

6)4℃，12000r/min离心5min。

7)移取上清液至新离心管中，加入2/3倍体积的PCI，充分混匀，12000r/min离心5min。

8)移取上清液至新离心管中，加2倍体积的无水乙醇或0.6倍体积的异丙醇，混匀，12000r/min离心5min，倒掉上清液。

9)加500μL 70％乙醇洗涤DNA沉淀两次，12000r/min离心2min，倒掉酒精，室温风干10min。

10)加20μL超纯水(含20μg/mL RNaseA)溶解DNA沉淀，37℃恒温放置1h，-20℃保存备用。

11)取2μL抽提的重组质粒DNA通过1％琼脂糖凝胶电泳检测。

DNA纯化

用Axygen公司的DNA凝胶回收试剂盒纯化酶切产物，其操作步骤如下：

1)大孔点样，每孔50μL，90V电泳45min。

2)在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，切下后装进2mL离心管中并切碎。计算凝胶重量，该重量作为一个凝胶体积(如100mg＝100μL体积)。

3)加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后于75℃加热，间断混合(每2～3min)，直至凝胶块完全熔化(约6～8min)。

4)加0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀。当分离的DNA片段小于400bp时，需再加入1个凝胶体积的异丙醇。

5)将步骤4中的混合液吸出来，转移到DNA制备管(置于2mL离心管)中，12000g离心1min。弃滤液。

6)将制备管置回2mL离心管，加500μL Buffer W1，12000g离心30s，弃滤液。

7)将制备管置回2mL离心管，加700μL Buffer W2，12000g离心30s，弃滤液。以同样的方法再用700μL Buffer W2洗涤一次12000g离心1min。

8)将制备管置回2mL离心管中，12000g离心1min。

9)将制备管置于洁净的1.5mL离心管中，在制备膜中央加25～30μL Eluent或去离子水，室温静置1min。12000g离心1min洗脱DNA。

10)配制1％琼脂糖凝胶进行电泳检测。

酶切反应

1)sfiI单酶切体系：50μL

52℃酶切过夜

2)DNA凝胶回收试剂盒纯化sfi I酶切的PaFv基因及pDAP2/S载体，取2μL酶切的DNA通过1％琼脂糖凝胶电泳检测。

3)Not I单酶切反应体系：50μL

4)DNA凝胶回收试剂盒纯化Not I酶切的PaFv基因及pDAP2/S载体，取2μL酶切的DNA通过1％琼脂糖凝胶电泳检测。

重组表达载体pDAP2/S-PaFv的构建

在微量离心管中配置如下pDAP2/S-PaFv构建体系：10μL。

低温恒温水浴16℃连接过夜24h。

大肠杆菌热激转化感受态细胞制备

1)用无菌牙签蘸取-80℃甘油保存的XL1-Blue菌液，在2TY固体培养基平板上划线，37℃过夜培养12～16h。

2)挑取单菌落接种于5mL 2TY液体培养基中，37℃，200r/min振荡过夜培养12～16h。

3)取2mL过夜培养菌液加入到200mL 2TY液体培养基中，37℃，200r/min振荡培养至OD600nm达到0.5，冰上放置20min。

4)将菌液分装到50mL离心管中，4℃，4000r/min离心10min，弃上清。

5)每管加入8mL预冷的0.1M CaCl2溶液悬浮菌体。

6)4℃，4000r/min离心10min，弃上清。

7)重复步骤5和6洗涤一次。

8)每管加入800μL含15％甘油的CaCl2溶液(0.1M)，50μL/管分装后保存于-80℃备用。

酶连接产物转化

1)分别将50μL感受态细胞XL1-Blue于冰上解冻。

2)将5μL连接产物与感受态细胞混匀，冰浴30min。

3)42℃热休克90s，立即冰浴3～5min。

4)加入500μL预热(37℃)的SOC培养基，37℃，200r/min振荡培养45～60min。

5)取200μL加入到含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，用涂布棒涂匀后自然干燥5～10min，37℃倒置培养过夜。

试剂盒提取重组质粒DNA

1)分别在LB培养基上挑取5～10个单克隆接种于5mL含100μg/mL氨苄青霉素2TY液体培养基中，37℃，200r/min振荡培养12～16h。

2)取1～4mL过夜培养菌液于2mL离心管中，12000g离心1min，弃尽上清加250μLBuffer S1悬浮菌体沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块。

3)加入250μL Buffer S2，温和并充分地上下翻转4～6次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透明的溶液(此步骤不宜超过5min)。

4)加入350μL Buffer S3，温和并充分地上下翻转混合6～8次，12000g离心10min。

5)吸取上一步骤的离心上清液并转移到制备管置于2mL离心管中，12000g离心1min，弃滤液。

6)将制备管置回离心管，加500μL Buffer W1，12000g离心1min，弃滤液。将制备管置回离心管，加700μL Buffer W2，12000g离心1min，弃滤液；以同样的方法再用700μLBuffer W2洗涤一次，弃滤液。

7)将制备管置回2mL离心管中，12000g离心1min。

8)将置备管移入新的1.5mL离心管中，在制备管膜中央加150μL EluentA室温静置1min，12000g离心1min。

PCR鉴定阳性转化子

从LB平板培养基上长出的菌落中，随机挑取5～10个单克隆菌落于5mL含100μg/mL氨苄青霉素2TY液体培养基中，37℃，200r/min振荡培养12～16h，提取重组质粒DNA加入特异性引物进行PCR鉴定。引物pDAP2-Spel序列：TTTCAAGGAGACAGTCATAAT；引物pDAP2-Sap序列：GTTAAACGGCGAGCA。

在0.2mL PCR反应管中按如下体系配制PCR反应液：20μL。

2)PCR反应条件：95℃5min；94℃1min，55℃80s，72℃2min，30个循环；72℃10min。

3)PCR反应结束后，配制1％琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆。

菌种保存及检测：

取50％的甘油500μL和500μL菌液于1.5mL离心管中保存菌种，在超净工作台内操作，另取1mL菌液送与南京金斯瑞生物科技有限公司测序验证。

蛋白的原核表达

1)取20μL-80℃甘油保存的菌液接种于含100μg/mL氨苄青霉素的20mL 2TY液体培养基中，37℃，200r/min振荡过夜培养12～16h。

2)取10mL过夜培养菌液加入含100μg/mL氨苄青霉素的200mL2TY液体培养基中，37℃，200r/min振荡培养至OD600nm达到0.5～0.6。

3)加入终浓度1mM IPTG，置于恒温摇床200r/min诱导表达，16℃表达20h。

4)取培养菌液分装到50mL离心管中，4℃，5000r/min离心10min。

5)倒掉上清，加入50μg/mL的溶菌酶30μL及5mL的PBS重悬菌体，反复冻融4～5次。

6)将冻融的菌液取出用待针头的注射器反复吹打5～7次后12000r/min离心。

7)离心后留上清弃沉淀，采用亲和层析柱进行纯化。

His标签的纯化

1)安装纯化柱，加入500μL充分混匀的Ni-TAT基质，静置30min。

2)剪去下端封口，使液体流下，加入5mL PBS，每次1mL，平衡基质。

3)加入超量表达回收样品过柱，重复过柱一次，收集保存过柱后样品流出液。

4)加入Buffer B洗脱纯化柱3次，每次1mL，分别收集杂蛋白(除PaFv-AP外蛋白)B1、B2、B3。

5)加入Buffer C洗脱纯化柱3次，每次1mL，分别收集目的蛋白(PaFv-AP)C1、C2、C3。

6)用5mL PBS平衡纯化柱，每次1mL，加入20％乙醇封闭柱子，4℃保存。

7)取样品B1、C1、C2、C3，制备12％分离胶点样进行SDS-PAGE。

SDS-PAGE

1)配制12％的分离胶和5％的浓缩胶，先向垂直电泳板里注入分离胶，待其凝固后再加入浓缩胶插入梳齿，待其凝固后使用。

2)取10μL蛋白样品B1、C1、C2、C3，加入2.5μL 5×SDS加样缓冲液，充分混匀，水浴煮沸5min，置于冰上备用。

3)在电泳槽中加入700mL 1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液，取放置在冰上的样品上样。

4)先用80V电泳40min，再用120V电泳1～2h至溴酚蓝跑至分离胶外。

5)考马斯亮蓝染色法染色30min。

6)加入脱色液3～5次，并洗脱过夜。

Western blot检测融合蛋白

1)取10μL步骤2.3.12离心收集的沉淀和上清及经过纯化后的C1，经过12％SDS-PAGE电泳后转膜。

2)转膜：依次放滤纸、SDS-PAGE电泳胶、硝酸纤维素膜(NC膜)、滤纸(每放一层滤纸、胶、膜要用玻璃棒赶走汽包)，用37V电压转膜过夜。

3)洗涤：用TBST洗涤2次，每次用10min。

4)封闭：用5％的脱脂奶粉，封闭1.5h。

5)洗涤：用TBST洗涤2次，每次10min。

6)敷一抗：用1％的脱脂奶粉1:5000稀释抗His单克隆抗体，常温包被2h后或4℃冰箱包被过夜。

7)洗涤：用TBST洗涤2次，TBS洗涤3次，每次10min。

8)敷二抗：用1％的脱脂奶粉1:5000稀释AP标记的羊抗鼠抗体，常温包被2h。

9)洗涤：用TBST洗涤2次，TBS洗涤3次，每次10min。

10)显色：用BCIP/NBT显色试剂盒显色10～20min。加入蒸馏水终止显色反应。

融合蛋白的活性检测

首先在ELISA板孔中加入95μL PBS和5μL细菌总蛋白，再加入20μL 1％pNPP显色液显色15～30min，读取OD_405nm值直接检测scFv-AP融合蛋白。

Claims (2)

1.一种抗前列腺癌干细胞抗原单链抗体融合蛋白的制备方法，其特征在于：根据大肠杆菌的密码子偏爱性进行碱基优化，合成抗PSCA的单链抗体基因PaFv；构建重组表达载体pDAP2/S-PaFv，转入至大肠杆菌XL1-Blue中，获得PaFv-XL1菌种；蛋白的原核表达，His标签分离纯化目的蛋白，制备12％分离胶点样进行SDS-PAGE，Western Blot鉴定目的蛋白，并用ELISA检测PaFv单链抗体活性。

2.权利要求1所述的抗前列腺癌干细胞抗原单链抗体融合蛋白可直接用于酶联免疫反应或制备检测试剂盒或蛋白芯片方式应用于前列腺癌干细胞特异抗原的检测。