CN114685651A - 一种特异识别aav9衣壳蛋白的多克隆抗体及制备方法 - Google Patents

一种特异识别aav9衣壳蛋白的多克隆抗体及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种特异识别AAV9衣壳蛋白的多克隆抗体及制备方法，将8处AAV9衣壳可变区氨基酸序列依次连接即为本发明所指AAV9可变区VR的氨基酸序列SEQ ID NO.1，由氨基酸序列得到编码AAV9衣壳可变区的DNA序列如SEQ ID NO.2，将DNA序列插入到原核表达载体pET30a获得质粒pET30a‑AAV‑VR，转化大肠杆菌扩增，采用IPTG诱导表达多价抗原肽，在变性条件下经Ni‑NTA树脂进行纯化，然后透析复性，纯化得到AAV9可变区蛋白免疫日本大耳朵白兔，以此制备多克隆抗体，ELISA检测抗体效价，Western‑blot及细胞免疫荧光检测抗体的应用。抗体效价为1:10240000，该抗体能特异性识别AAV9衣壳蛋白序列。为后续AAV载体开发以及AAV生物学功能研究奠定了基础。

Description

一种特异识别AAV9衣壳蛋白的多克隆抗体及制备方法
技术领域
本发明涉及一种医药生物化工技术领域，具体地说，是关于一种特异性识别AAV9衣壳蛋白的多克隆抗体制备方法。
背景技术
腺相关病毒（Adeno-associated Virus ，AAV）属于细小病毒科依赖病毒属，该病毒在人类及灵长类等脊椎动物体内广泛存在，目前科学界普遍认为AAV不会引起人类疾病的产生。近年来国内外科研平台将AAV载体用于体内基因治疗的临床试验数量逐步增加，其优异的安全性，以及针对靶向器官组织的高效转导性，使其成为针对体内基因治疗的首选载体系统。AAV病毒粒子直径约25 nm，其中包裹着4.7 kb的单链DNA基因组，基因组由Rep基因和Cap基因组成，两侧是反向末端重复序列（inverted terminal repeats，ITR)，左侧的ORF编码四种复制蛋白，根据它们的分子量命名为：Rep78、Rep68、Rep52和Rep40，右侧的ORF通过不同起始密码子编码三个衣壳蛋白VP1、VP2和VP3，这三种结构蛋白共用一个共同的羧基末端，但具有不同的氨基末端，AAV组装过程中，VP1、VP2和VP3以1：1：10的比例形成二十面体病毒衣壳。
由于AAV不同血清型之间具有较高的保守性，大多AAV衣壳蛋白抗体缺乏特异性，往往一种抗体识别多种血清型AAV，目前市面上还没有特异性针对AAV9衣壳蛋白的商业化抗体。基于此，本发明根据AAV1-AAV10衣壳蛋白一级结构序列分析，共发现8处AAV9衣壳可变区（Aa262-269，Aa448-483，Aa488-510，Aa527-540，Aa545-557，Aa576-601，Aa661-668，Aa706-718），将AAV9衣壳独有的可变区DNA序列进行人工拼接后合成，经过原核蛋白表达纯化，以纯化的蛋白为抗原免疫日本大耳朵白兔，制备兔多克隆抗体，采用多种方式验证人工制备的抗原任然保留了抗原性，并且理论上制备的抗体具有较好的特异性，仅能识别AAV9病毒衣壳蛋白，为后续研究AAV9的生物学功能以及AAV9载体的改造及优化奠定了基础。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供一种抗AAV9衣壳可变区的多克隆抗体，其特征在于，用于制备AAV9衣壳可变区多克隆抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，其DNA编码序列为SEQ ID NO:2。
一种抗AAV9衣壳可变区的多克隆抗体的制备方法包括如下步骤：
（1）获得AAV9衣壳蛋白可变区氨基酸序列；
（2）编码步骤（1）中氨基酸序列为可变区的DNA序列并构建到pET-30a原核表达载体，5′末端酶切位点为XhoⅠ，3′末端酶切位点为NdeⅠ，得到重组pET-30a-AAV9-VR可变区蛋白质粒；
（3）将重组pET-30a-AAV9-VR可变区蛋白质粒导入大肠杆菌菌株 BL21（DE3）进行扩增，接种于含有卡拉霉素的琼脂平板培养基上进行阳性克隆的筛选，纯化得到AAV9可变区蛋白；
（4）AAV9可变区蛋白免疫日本大耳朵白兔，得到抗AAV9衣壳可变区的多克隆抗体。
所述的AAV9衣壳蛋白可变区氨基酸序列为AAV9可变区中的Aa262-269，Aa448-483，Aa488-510，Aa527-540，Aa545-557，Aa576-601，Aa661-668，Aa706-718可变区序列拼接所得。
本发明将所述的抗AAV9衣壳可变区的多克隆抗体或所述的AAV9病毒载体在选择性识别AAV9病毒衣壳蛋白上的应用。
AAV载体具有免疫原性低、很少或几乎不整合宿主基因组、可实现组织异性等特点，目前AAV载体已逐渐成为体内基因治疗的主要载体。已有三种基于AAV载体的基因治疗药物上市，分别是Glybera、Luxturna和Zolgensma。Glybera采用AAV1携带脂蛋白脂酶基因，用于治疗遗传性脂蛋白酯酶缺乏的患者，于2012年10月获得欧洲药品管理局批准上市；Luxturna采用AAV2将正常的RPE65基因导入患者体内，用于治疗由RPE65基因突变导致的遗传性视网膜疾病，于2017年12月获得美国食品药品监督管理局批准；Zolgensma采用AAV9携带治疗基因SMN1，用于治疗2岁以下的脊髓性肌肉萎缩症患者，于2019年5月经美国食品药品监督 管理局批准上市。AAV载体的开发以及优化离不开AAV抗体的使用，本研究旨在建立一种原核表达AAV9衣壳蛋白可变区抗原肽的方法以及制备一种特异性识别AAV9的多克隆抗体。
为获得大量可用作抗原免疫日本大耳朵白兔的AAV9可变区蛋白，我们将构建的pET-30a-AAV9-VR原核表达质粒转化入大肠杆菌菌BL21（DE3）中。分析发现，细菌内AAV9可变区蛋白能被 IPTG 诱导性表达，且主要以包涵体的形式存在，这可能与AAV9可变区蛋白诱导性表达的速度过快和细菌内浓度过高有关。
由于重组 AAV9可变区蛋白带有His标签，本发明在尿素变性的条件下利用 Ni-NTA 树脂亲和层析法成功获得高纯度的AAV9可变区蛋白。为制备抗AAV9可变区蛋白多克隆抗体，我们将纯化后的AAV9可变区蛋白用做抗原免疫日本大耳朵白兔，经过1次启动免疫和2次加强免疫后，获得高效价的抗AAV9衣壳可变区多克隆抗体。该抗体能特异性识别和结合AAV9衣壳蛋白，而不能识别其他血清型AAV，如AAV2、AAV6等，可有效用于AAV9衣壳蛋白的免疫印迹、ELISA等生物化学分析实验。
综上所述，本实验成功建立了AAV9衣壳可变区的原核表达纯化技术，成功制备了抗 AAV9衣壳可变区的多克隆抗体，制备的抗体理论上仅识别AAV9衣壳蛋白，上述研究有助于后续AAV载体的改造、新型AAV载体的筛选、AAV检测以及AAV生物学功能等研究。
附图说明
图1为pET30a-AAV9-VR可变区质粒的酶切鉴定，其中，M： DNA maker 1：AAV9可变区质粒 2：XhoI+NdeI 酶切后。
图2 SDS-PAGE分析AAV9可变区蛋白的诱导表达，其中，M：Protein marker；1：IPTG诱导0h；2：IPTG 诱导 2h；3：IPTG诱导 4 h；4：IPTG 诱导 6 h；5：IPTG 诱导 8 h，箭头指示AAV9可变区蛋白所在的位置。
图3 SDS-PAGE 分析AAV9可变区蛋白的纯化，其中，M：标准蛋白 marker-441 ；1 ：Ni-NTA 树脂亲和层析纯化后的纯化蛋白；2 ：IPTG 诱导 6 h 全菌 ；3 ：IPTG 诱导 0 h全菌，箭头指示AAV9可变区蛋白所在的位置。
图4 Western bloting 鉴定AAV9可变区蛋白，其中，1：IPTG诱导0 h ；2：Ni-NTA树脂亲和层析纯化后的纯化蛋白，指示AAV9可变区蛋白所在的位置。
图5 ELISA 分析制备血清的效价。
图6 Western bloting分析制备抗体的特异性。
图7 抗血清用于细胞免疫荧光检测。
具体实施方式
本发明的实施例所用的材料为
pET-30a表达质粒及大肠杆菌菌株BL21（DE3）购自北京全式金生物技术股份有限公司，日本大耳白兔（雄性）购自湖北省实验动物研究中心。Ni-NTA蛋白纯化树脂, 羊抗兔IgG-His抗体、HRP 标记的羊抗兔 IgG 由北京中杉金桥生物技术有限公司提供，ECL显色液为美国 Thermo Scientific公司产品；Ni-NTA树脂为德国 Novagen公司产品，弗氏不完全佐剂和弗式完全佐剂为购自美国 Sigma-aldrich 公司，其它化学试剂由美国Sigma等公司提供。
实施例1
AAV衣壳可变区蛋白序列获得
从NCBI网站下载获得AAV1-AAV10衣壳蛋白氨基酸序列，将序列导入软件DNAMAN，序列同源性比对分析，发现8处AAV9可变区（Aa262-269，Aa448-483，Aa488-510，Aa527-540，Aa545-557，Aa576-601，Aa661-668，Aa706-718），将可变区序列进行拼接，获得的序列即为AAV9衣壳蛋白可变区序列，编码可变区的DNA序列由金唯智生物公司合成并构建到pET-30a原核表达载体，5′末端酶切位点为XhoⅠ，3′末端酶切位点为NdeⅠ。AAV9可变区质粒pET30a-AAV9-VR经 XhoI+NdeI 酶切后，用1% 的琼脂糖凝胶电泳分离，可见5500bp与1000bp两个限制性片段（图 1），结果与预期一致。酶切鉴定为阳性的重组质粒经 DNA 测序，证实质粒中插入序列正确，阅读框架对接无误。
可变区蛋白原核表达
将经过测序检验正确的重组pET-30a-AAV9-VR可变区蛋白质粒通过转化导入大肠杆菌菌株 BL21（DE3）中，接种于含有卡拉霉素的琼脂平板培养基上进行阳性克隆的筛选，筛选出的阳性克隆接种到5mL含有卡拉霉素的LB液体培养基中，37℃ 220rpm振荡培养，待菌液 OD 值达到0.8-1.0时，加入终浓度为1mmol/L 的IPTG继续同条件培养，分别在诱导0h、2 h、4 h、6 h和8 h后进行取样，5000rpm离心3 min，收集菌体并重悬于PBS中（KH2PO4 2mmol/L，Na2HPO4 10 mmol/L，NaCl 137 mmol/L，KCl 2.7 mmol/L），超声裂解细菌后，11000×g 离心，分别取上清和沉淀制样，经SDS-PAGE分析AAV9可变区蛋白的表达情况，由此确定最佳外源蛋白诱导表达条件。
将重组pET-30a/AAV9可变区质粒转化入大肠杆菌BL21（DE3）中，IPTG（终浓度为1mmol/L诱导0-6h，每间隔2h进行取样，经过15%的 SDS-PAGE 分析， 结果（图 2）显示 IPTG诱导后，在相对分子质量20kD 附近有一新蛋白产生，与预期AAV9可变区蛋白重组蛋白的相对分子质量一致。确认条件后，将大肠杆菌进行放大培养，收集过夜菌液进行超声裂解，取诱导后的细菌沉淀通过Ni-NTA亲和层析法纯化蛋白，得到的纯化后蛋白经SDS-PAGE分析，结果（图 3）显示 AAV9可变区蛋白位置与预期相符合。
可变区蛋白的纯化及复性
经过上述的诱导鉴定，将成功转化pET-30a/AAV可变区蛋白的BL21（DE3）阳性单克隆菌放大培养（1000mL培养液）。待菌液OD值达到0.8-1.0时，继续采用终浓度为1mmol/L的IPTG诱导表达8h后，5000rpm离心5min收集菌体经高浓度尿素（8 mol/L 尿素，0.1 mol/LNa2HPO4，0.01 mol/L Tris-HCl，pH 8.0）裂解细菌，37℃振荡裂解2h，离心30min去除不溶性碎片。根据曹春雨等文献中所提供的破碎细菌方法，本实验采用离心后将上清液置于超声条件下进行超声破碎细菌，使细菌充分裂解，最终收集上清。上清与Ni-NTA树脂杂交2h后上柱，用洗脱液A（8 mol/L尿素，100 mmol/L Na2HPO4，10 mmol/L Tris，pH6.3）洗脱杂蛋白，再用洗脱液 B（8 mol/L 尿素，100 mmol/L Na2HPO4，10 mmol/L Tris，pH4.3）洗脱目的蛋白。纯化后的蛋白用Ni-NT亲和层析分离纯化上清中的重组蛋白。纯化后的重组蛋白经尿素浓度梯度递减的透析液，分步透析去除尿素而复性。透析缓冲溶液为50mmol/L Tris-HCL(pH为7.5) 250mmol/L NaCl 0.01mmol/L EDTA 1mol/L DTT其中尿素浓度梯度下降，其含量分别为5、2.5、1和0mol/L（各透析12ｈ）透析后的蛋白于-80℃保存备用。
由于诱导表达的 AAV9可变区蛋白带有 6× His标签，实验采用Ni-NTA亲和层析法对表达菌中的AAV9可变区蛋白进行纯化。纯化后的蛋白经不同浓度的尿素透析缓冲液复性后，使用 SDS-PAGE 和 Western blotting（抗His标签抗体作为一抗）对其进行纯度和特异性鉴定。结果（图4）显示，大肠杆菌中诱导表达的AAV9可变区蛋白能被Ni-NTA高效纯化。
兔多克隆抗血清制备
纯化后的AAV9可变区蛋白用作抗原免疫日本大耳朵白兔，首次免疫取 600 μg（480 μL蛋白抗原与520 μL佐剂乳化，并加入1 mL PBS）抗原与弗氏完全佐剂乳化后，颈部脱毛后背部多点注射。注射前，分别从日本大耳朵白兔里取2 mL动脉血清，作为后续实验阴性对照。依据吕亚丰等相关实验结论，针对再注射增强免疫，本研究选择两周后进行2次加强免疫，每次间隔时间两周，加强免疫采用AAV9可变区蛋白与弗氏不完全佐剂乳化，颈背部脱毛后背部多点注射。末次免疫后耳中动脉取血，4℃静置1 h后，4℃，12000r/min 离心收集血清，加入等体积甘油、1%叠氮钠后-20℃保存备用。
制备的抗血清抗体效价检测
间接ELISA法被用于检测本研究制备的抗血清中AAV9可变区蛋白多克隆抗体效价。将纯化的AAV9可变区蛋白用包被缓冲液（pH为9.6的碳酸盐溶液）稀释至终浓度为10μg/mL 后，加入96孔酶标板，每孔100μL，置于4℃包被16 h，3%的BSA 于37℃封闭2 h，减少非特异性结合，加入系列稀释的血清，100μL/孔，以未免疫日本大耳朵白兔血清为阴性对照，PBS为空白对照，37℃孵育1h ；再加入1：5000稀释的带有HRP标记的羊抗兔 IgG，100μL/孔，37℃孵育1h ；TMB 法显色，采用终止液终止反应后，使用酶标仪检测各孔A450 值。以空白对照调零，待测孔A450 值与阴性对照孔A450 值的比值≥ 2.1 即判为阳性，以能获得阳性的最大稀释度作为待检血清的抗体效价。
血清效价检测将纯化的AAV9可变区蛋白用抗原包被酶标板，免疫血清等比稀释后作为一抗，结果（图 5）表明ELISA 法检测制备抗血清的效价1:10240000。
法鉴定制备的AAV9可变区蛋白抗体
以本实验制备的抗血清为一抗，Western bolt法检测多种血清型AAV，以验证本实验制备的抗AAV9可变区抗体。AAV2、AAV6、AAV9病毒样品经 SDS-PAGE 分离后以 300 mA 恒流电转移到 PVDF膜，膜采用含5% BSA的TBST封闭2 h。用本实验制备的AAV抗体为一抗（1：100稀释）4℃孵育过夜，羊抗兔 IgG 为二抗，室温孵育1h后使用TBST进行漂洗，ECL法显色并记录结果。制备抗体用于AAV9可变区蛋白重组蛋白的 Western bloting 检测。以纯化的AAV2、AAV6、AAV9为样品，以制备的AAV衣壳蛋白可变区抗体为一抗，Western blotting 检测AAV抗体对不同血清型的AAV病毒的识别效果，结果（图 6）表明， 制备的AAV抗体能特异性识别和结合AAV9病毒，可用于该种血清型AAV病毒相关的Western blot 检测。
细胞免疫荧光法鉴定AAV9可变区蛋白抗体
将表达AAV9衣壳蛋白的质粒转染4T-1细胞，转染48h后将细胞接种于玻片继续培养，待细胞贴壁后，PBS洗涤3次，4%多聚甲醛室温固定细胞15 min，0.5%的TritonX-100室温通透20 min，PBS洗涤玻片3次后，正常山羊血清室温封闭30 min，每张玻片滴加本实验制备的抗血清（1:200 稀释）后放入湿盒，4℃孵育过夜，PBS 洗 涤玻片后滴加荧光二抗（1:200稀释），湿盒中室 温避光孵育 1 h，洗涤未结合的二抗后，滴加 DAPI（1:50）避光孵育 10-15 min（复染细胞核），PBS 洗去多余的DAPI，用含有抗荧光淬灭剂的封片剂封片，荧光显微镜观测结果。在293T细胞中转染AAV9衣壳蛋白质粒，以制备的AAV9可变区抗体为一抗，以Cy3标记的羊抗兔 IgG 为二抗，免疫荧光法检测293T细胞内AAV9衣壳蛋白的表达。结果（图7）显示，制备抗体能有效用于血清型AAV9的细胞免疫荧光分析。
本发明的技术方案对AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10病毒衣壳蛋白氨基酸序列进行同源比对，共发现10处AAV9衣壳可变区，将8处AAV9衣壳可变区氨基酸序列依次连接即为本发明所指AAV9可变区VR的氨基酸序列SEQ ID NO.1，由氨基酸序列得到编码AAV9衣壳可变区的DNA序列如SEQ ID NO.2，将DNA序列插入到原核表达载体pET30a获得质粒pET30a-AAV-VR，转化大肠杆菌扩增，采用IPTG诱导表达多价抗原肽，在变性条件下经Ni-NTA树脂进行纯化，然后透析复性，纯化得到AAV9可变区蛋白免疫日本大耳朵白兔，以此制备多克隆抗体，ELISA检测抗体效价，Western-blot及细胞免疫荧光检测抗体的应用。
序列表
<110>三峡大学
<120>一种特异识别AAV9衣壳蛋白的多克隆抗体及制备方法
<160>总数目18
<210>1
<211>141
<212>氨基酸序列
<213>人工序列
<223>衣壳蛋白可变区VR的氨基酸序列
<400>1
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<210>2
<211>423
<212>DNA
<213>人工序列
<223>衣壳蛋白可变区VR的DNA序列
<400>2
AACAGCACGAGCGGCGGCAGCAGTAGCAAAACCATTAACGGCAGCGGTCAGAATCAGCAGACCCTGAAATTTAGCGTGGCGGGCCCGAGCAACATGGCGGTGCAAGGCCGCAACTATATTCCGGGCCCGAGCCGCGTGAGCACCACCGTGACGCAGAACAATAACAGCGAATTTGCGTGGCCGGGCGCGAGCAGCTGGGCGCATAAAGAAGGCGAAGATCGCTTTTTTCCGCTGAGCGGCAGCAAACAAGGCACCGGCCGCGATAACGTGGATGCGGATAAAAGCTATGGCCAAGTGGCGACCAACCATCAGAGCGCGCAAGCGCAAGCGCAGACCGGCTGGGTGCAGAACCAAGGCATTGCGTTTAACAAAGATAAACTGAACTATAAAAGCAACAACGTGGAATTTGCGGTGAACACCGAA
<210>3
<211>8
<212>氨基酸序列
<213>人工序列
<223>衣壳蛋白可变区Aa262-269的氨基酸序列
<400>3
NSTSGGSS
<210>4
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<223>衣壳蛋白可变区Aa262-269的DNA序列
<400>4
AACAGCACGAGCGGCGGCAGCAGT
<210>5
<211>36
<212>氨基酸序列
<213>人工序列
<223>衣壳蛋白可变区Aa448-483的氨基酸序列
<400>5
SKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPS
<210>6
<211>423
<212>DNA
<213>人工序列
<223>衣壳蛋白可变区Aa448-483的DNA序列
<400>6
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<210>7
<211>23
<212>氨基酸序列
<213>人工序列
<223>衣壳蛋白可变区Aa488-510的氨基酸序列
<400>7
RVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWA
<210>8
<211>69
<212>DNA
<213>人工序列
<223>衣壳蛋白可变区Aa488-510的DNA序列
<400>8
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<210>9
<211>14
<212>氨基酸序列
<213>人工序列
<223>衣壳蛋白可变区Aa527-540的氨基酸序列
<400>9
HKEGEDRFFPLSGS
<210>10
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<223>衣壳蛋白可变区Aa527-540的DNA序列
<400>10
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<210>11
<211>13
<212>氨基酸序列
<213>人工序列
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<400>11
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<210>12
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<223>衣壳蛋白可变区Aa545-557的DNA序列
<400>12
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<210>13
<211>26
<212>氨基酸序列
<213>人工序列
<223>衣壳蛋白可变区Aa576-601的氨基酸序列
<400>13
SYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGI
<210>14
<211>78
<212>DNA
<213>人工序列
<223>衣壳蛋白可变区Aa576-601的DNA序列
<400>14
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<212>氨基酸序列
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<400>15
AFNKDKLN
<210>16
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
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<400>16
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<211>13
<212>氨基酸序列
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<210>18
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<212>DNA
<213>人工序列
<223>衣壳蛋白可变区Aa706-718的DNA序列
<400>18
TATAAAAGCAACAACGTGGAATTTGCGGTGAACACCGAA
序列表
<110>三峡大学
<120>一种特异识别AAV9衣壳蛋白的多克隆抗体及制备方法
<160>总数目18
<210>1
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<223>衣壳蛋白可变区Aa706-718的DNA序列
<400>18
TATAAAAGCAACAACGTGGAATTTGCGGTGAACACCGAA

Claims (4)

1.抗AAV9衣壳可变区的多克隆抗体，其特征在于，制备该抗体的衣壳蛋白可变区VR的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，编码可变区VR的DNA序列为SEQ ID NO:2。
2.一种抗AAV9衣壳可变区的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）获得AAV9衣壳蛋白可变区氨基酸序列；
（2）编码步骤（1）中氨基酸序列为可变区的DNA序列并构建到pET-30a原核表达载体，5′末端酶切位点为XhoⅠ，3′末端酶切位点为NdeⅠ，得到重组pET-30a-AAV9-VR可变区蛋白质粒；
（3）将重组pET-30a-AAV9-VR可变区蛋白质粒导入大肠杆菌菌株 BL21（DE3）进行扩增，接种于含有卡拉霉素的琼脂平板培养基上进行阳性克隆的筛选，挑取阳性克隆进行IPTG诱导表达可变区VR蛋白，纯化得到AAV9可变区蛋白VR；
（4）AAV9可变区蛋白VR免疫日本大耳朵白兔，得到抗AAV9衣壳可变区的多克隆抗体。
3.根据权利要求3所述的抗AAV9衣壳可变区的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，AAV9衣壳蛋白可变区VR氨基酸序列为AAV9衣壳蛋白中的Aa262-269，Aa448-483，Aa488-510，Aa527-540，Aa545-557，Aa576-601，Aa661-668，Aa706-718氨基酸序列拼接所得。
4.权利要求1所述的抗AAV9衣壳可变区的多克隆抗体在选择性识别AAV9病毒衣壳蛋白上的应用。
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