CN103965358A

CN103965358A - 模拟桔青霉素抗原的纳米抗体及其应用

Info

Publication number: CN103965358A
Application number: CN201410160576.4A
Authority: CN
Inventors: 李燕萍; 许杨; 熊亮; 何庆华
Original assignee: Nanchang University
Current assignee: Nanchang University
Priority date: 2014-04-22
Filing date: 2014-04-22
Publication date: 2014-08-06
Anticipated expiration: 2034-04-22
Also published as: CN103965358B

Abstract

本发明属于生物技术领域，设计一种模拟桔青霉素抗原的纳米抗体，具有（a）SEQIDNO.:1所示的氨基酸序列或将该序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有针对抗桔青霉素单克隆抗体或多克隆抗体结合活性的由（a）衍生的与（a）具有90%以上同源性的氨基酸序列。本发明纳米抗体能模拟模拟桔青霉素抗原，具有广阔的市场空间。

Description

模拟桔青霉素抗原的纳米抗体及其应用

技术领域

本专利涉及生物技术领域，具体涉及模拟桔青霉素抗原的纳米抗体及其应用。

背景技术

桔青霉素(Citrinin，CIT)，又称为桔霉素，是青霉属和曲霉属等真菌菌株产生的真菌毒素，广泛存在于多种食品及动物饲料中。CIT污染也存在于传统红曲发酵产品，广泛用于食品着色及风味增强。同时因其发酵代谢产物有多种功能活性成分也用于保健食品中。毒理学研究表明CIT具有肾毒性、肝毒性和潜在的致畸性，且能引发肿瘤和诱发突变。严重危害人体和动物的健康。因此，对食品中CIT含量的检测监控十分必要。

目前，常见的真菌毒素检测方法有高效液相色谱法、液质联用分析法、免疫分析法。高效液相色谱法等仪器分析法具有检测准确、重复性好等特点，但同时也有仪器价格昂贵、样品前处理过程繁琐、样本检测耗时长、不能同时检测多个样品等缺点，因而其使用受到极大的限制，不适于基层监控使用。酶联免疫吸附检测法以其高灵敏度、检测方便、成本低廉等优势广泛用于真菌毒素的初步检测。然而，在方法建立过程中，必须使用真菌毒素标准品作为竞争抗原和制备包被抗原，对检测人员的健康和环境造成极大的威胁。因此，采用抗独特型抗体及抗原模拟表位等技术可替代有害的毒素标准品，并已取得了一定的进展。噬菌体展示技术已广泛用于从天然抗体库或免疫抗体库中淘选得到特异抗体。该技术在研究未知蛋白空间结构表位，受体与配体结合位点、寻找高亲和力生物活性的配体分子及新型疫苗的开发等方面也得到广泛应用。

发明内容

本发明通过对天然纳米抗体噬菌体展示库中，筛选得到能与抗桔青霉素单克隆抗体特异结合的纳米抗体，该抗体具有与天然CIT分子相似的反应特性，能替代毒性较强的CIT标准品，并可作为竞争抗原或固相包被抗原应用于CIT的免疫学检测。

本发明以抗CIT单克隆抗体为靶分子，将其固相包被于酶标板上，加入噬菌体展示的天然驼源单域重链纳米抗体库，进行亲和淘选，获得了可以模拟桔青霉素抗原的纳米抗体。

本发明模拟桔青霉素抗原的纳米抗体：

（a）该抗体的氨基酸序列如下：

QLQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAGSGRTFNRYPMSWFRQVPGKEREFVAEINWSGSSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVFLQMSSLKPEDTAVYYCAAGSPGRYDYWGQGTQVTVSS

上述纳米抗体的序列中，大写英文字母分别代表二十一种已知的天然L-型氨基酸残基或其D-型异构体的一种，即A代表丙氨酸残基，C代表半胱氨酸残基，D代表天冬氨酸残基，E代表谷氨酸残基，F代表苯丙氨酸残基，G代表甘氨酸残基，I代表异亮氨酸残基，K代表赖氨酸残基，L代表亮氨酸残基，M代表蛋氨酸残基，N代表天冬酰胺酸残基，P代表脯氨酸残基，Q代表谷胺酰氨酸残基，R代表精氨酸残基，S代表丝氨酸残基，T代表苏氨酸残基，V代表缬氨酸残基，W代表色氨酸残基，Y代表酪氨酸残基。

（b）将（a）中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有针对抗桔青霉素单克隆抗体结合活性的由（a）衍生的与（a）具有90%以上同源性的氨基酸序列。

本发明还涉及所述模拟桔青霉素抗原的纳米抗体的核苷酸。

以及，包含所述核苷酸序列的载体，包含所述的载体的宿主细胞。

本发明提及的模拟桔青霉素抗原的纳米抗体可通过噬菌体扩增或基因工程重组表达的方式进行大量制备。噬菌体扩增是指将展示有模拟桔青霉素抗原的纳米抗体的噬菌体，通过生物扩增的方式，大量繁殖展示有该纳米抗体的噬菌体粒子。基因工程重组表达的方式是指将编码该抗体的基因，通过克隆至表达载体上，以蛋白的形式大量制备。

本发明还涉及所述的该纳米抗体在免疫学检测分析中的应用。包括酶联免疫吸附检测、胶体金免疫层析、免疫斑点杂交等基于抗原-抗体特异性反应的免疫学分析检测方法。

本发明模拟桔青霉素抗原的纳米抗体在应用时，可通过噬菌体扩增获得的展示有该纳米抗体的噬菌体粒子直接用于分析检测，也可以通过基因工程表达成蛋白作为包被抗原用于分析检测。当然，也可作为CIT标准品的代替物来进行免疫学检测分析。

还涉及该纳米抗体以固相抗原或竞争抗原在免疫学检测分析中的应用。

前述该纳米抗体可替代具有较强毒性CIT标准品，并作为固相包被抗原或竞争抗原应用于CIT的免疫学检测。该纳米抗体具有与天然CIT分子相似的免疫反应特性，效果非常好。

本发明的意义在于可替代毒性较强的CIT标准品，并可作为竞争抗原或固相抗原应用于CIT的免疫学检测，具有和天然CIT分子相似的免疫反应特异性。该方法成本低，可多样品同时检测，具有很高的应用价值。

附图说明

图1为该纳米抗体以噬菌体展示形式作为竞争抗原时的间接竞争ELISA标准曲线。检测范围1.50 - 45.94 ng/mL，IC₅₀为11.55 ng/mL。

图2为该纳米抗体以抗体蛋白形式作为固相包被抗原时的间接竞争ELISA标准曲线。检测范围12.14-196.35 ng/mL，IC₅₀为48.94 ng/mL。

具体实施方式

本发明将通过以下实施例作进一步的说明。

实施例1. 抗桔青霉素单克隆抗体的制备

（一）免疫抗原的制备

桔青霉素为小分子半抗原不具备免疫源性，但可以通过偶联大分子载体蛋白使其具有免疫源性。通过对桔青霉毒素结构分析，其具有羟基、羧基和羰基三个基团，都可通过适当的化学方法与蛋白质偶联。但羧基和羟基是其抗原决定簇中的重要基团，若利用其作为连接基团与蛋白质连接将导致桔青霉素抗原性的改变，不能引发机体产生针对桔青霉素分子的抗体。故采用甲醛加成法，通过桔青霉素分子上的C₁位置的活泼氢制备桔青霉素人工抗原。具体步骤如下：0.5 mg桔青霉素溶解于150 μl甲醇中，加入100 μl 37％的甲醛，滴入5 mg匙眼贝血蓝蛋白(KLH, pH 4.2)溶液中，37 ℃反应24 h，即得到桔青霉素人工抗原。同样与卵清蛋白（OVA）反应得到的桔青霉素人工抗原作为检测抗原。反应结束后，置0.01 M PBS 4℃透析72h。

（二）抗桔青霉素单克隆抗体的制备

BALB/c小鼠经桔青霉素人工抗原免疫4次后，间隔四周，尾静脉注射人工抗原0.05mg/只，3天后，脾细胞在50％PEG融合剂作用下与对数期生长的SP2/O杂交瘤细胞融合。经HAT选择培养液培养7d后，换HT培养基培养，取杂交瘤细胞培养上清进行间接ELISA筛选阳性克隆，采用间接竞争ELISA筛选分泌抗桔青霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞。阳性细胞经有限稀释法亚克隆3次均为100%的阳性后，建立细胞系并冻存。并将杂交瘤细胞接种于提前注射降植烷的BALB/c小鼠腹腔，制备腹水，经辛酸．硫酸铵沉淀法纯化单抗。

(三) 抗桔青霉素单克隆抗体的鉴定

经上述实验，筛选到一株分泌抗桔青霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株(4G6)，3次亚克隆后，全部克隆为阳克隆。采用小鼠单抗分型试纸条测定该单抗为IgG_2a型。与其他OTA、ZEN、AFB₁和DON等常见的真菌毒素基本无交叉反应。成功筛选得到抗桔青霉素单克隆抗体。

实施例2. 天然单域重链抗体噬菌体展示文库的构建及鉴定

（一）天然单域重链抗体噬菌体展示文库的构建

从两只健康未免疫的羊驼白细胞中提取总RNA。以Oligo dT反转录获得cDNA，经半巢式PCR获得重链抗体的可变区编码基因。将噬菌粒载体pHEN1和PCR扩增得到的可变区编码基因分别用 Sfi I、Not I双酶切后，用T4 DNA连接酶连接过夜，连接产物电转化至大肠杆菌TG1中，取10μL转化后菌液倍数稀释测定库容量。其余菌液涂布于含100 μg/mL 2×YT培养板上。用含30%甘油的2×YT培养基刮下所有菌落。接种10倍库容量的活细胞于5mL的2×YT(含2%葡萄糖、100 μg/mL氨苄青霉素)培养基中，37℃，220r/min培养至OD 600nm达0.5，按感染复数20:1加入辅助噬菌体，37℃、220r/min 培养60min。将培养物在 1000 g 离心10min，用50mL的2×YT(含100 μg/mL氨苄青霉素和50 μg/mL卡那霉素) 培养液重悬沉淀，30℃、220r/min过夜培养，8000g离心取上清，PEG法纯化噬菌体，即得到噬菌体展示抗体文库，取10 μL测定滴度，其余分装于-80℃保存备用。

（二）抗体噬菌体展示文库的鉴定

随机挑取40个克隆进行分析，利用载体上的通用引物(M13-R和pHEN-R)进行PCR验证。其中有35个能扩增出400-750bp条带，提示文库的克隆效率约为87%，因此该初级文库的实际库容为1.9×10⁷个。

实施例3.模拟桔青霉素抗原纳米抗体的亲和淘选及其鉴定

（一）纳米抗体的亲和淘选

用10 mM PBS (pH 7.4) 稀释抗CIT单克隆抗体4G6，并以终浓度100 μg/mL 包被于酶标板上，4℃孵育过夜。第二天用PBST (PBS包含0.1% Tween-20 (v/v) ) 洗涤10次后，加入300 μl封闭液（3% BSA-PBS）4℃孵育1小时。1小时后弃封闭液，用PBST洗涤5次，加入100 μl制备的噬菌体展示抗体文库（用PBS稀释噬菌体至约1.0×10¹¹ c.f.u），37℃孵育反应1小时。弃去未结合的噬菌体，用PBST洗涤10次，结合上的噬菌体用0.2 M Glycine-HCl (pH 2.2) 洗脱，并立即用15 μl 1 M Tris-HCl (pH 9.1) 中和。取10 μl洗脱噬菌体测定滴度，其余的用于感染20mL生长至对数前期的E. coli TG1菌株进行扩增。次日用PEG/NaCl沉淀纯化噬菌体，并测定扩增后噬菌体的滴度。噬菌体回收率按以下公式计算：回收率=（洗脱噬菌体/投入噬菌体）×100%。

在随后三轮淘选过程中，包被的抗CIT单克隆抗体浓度分别为75 μg/mL，50 μg/mL，25μg/mL，并用CIT标品溶液替代酸洗脱液，进行竞争洗脱。洗脱噬菌体的扩增同上。

（二）阳性噬菌体克隆的鉴定

从平板上随机挑取30个噬菌体克隆进行扩增。用10 mM PBS (pH 7.4) 稀释抗CIT单克隆抗体，10 μg/mL包被96孔酶标板，4℃孵育过夜。第二天用PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (v/v))洗涤3次后，用含有4%脱脂奶粉的PBS进行封闭，37℃孵育1小时。投入100 μl扩增后的噬菌体克隆，以原始噬菌库体作为阴性对照，噬菌体浓度梯度稀释，37℃孵育1小时。加入1:5000稀释HRP标记的抗M13噬菌体二抗，37℃孵育1小时。然后用TMB底物显色，酶标仪（Thermo Scientific，USA）读取450 nm处的吸收值。选取OD₄₅₀大于阴性对照2倍的噬菌体克隆为阳性克隆。

（三）噬菌体竞争结合实验

用10 mM PBS (pH 7.4) 稀释抗CIT单克隆抗体，10 μg/mL包被96孔酶标板，4℃孵育过夜。第二天用PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (v/v)) 洗涤3次后，用含有4%脱脂奶粉的PBS封闭，37℃孵育1小时。投入50 μl噬菌体和50 μl CIT（100ng/mL），37℃孵育1小时。加入1:5000稀释HRP标记的抗M13噬菌体二抗，37℃孵育0.5小时。然后用TMB底物显色，读取OD₄₅₀。能结合抗CIT单克隆抗体，且能被CIT标准品阻断的噬菌体pHEN-X27，鉴定为模拟桔青霉素抗原的阳性克隆。

实施例4. 编码模拟桔青霉素抗原的纳米抗体基因的测序及氨基酸序列的确定

将前述得到的阳性克隆pHEN-X27进行扩增，菌液送自南京金斯瑞测序公司测序。依据测序结果及密码子表可获得该纳米抗体的氨基酸序列为：QLQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAGSGRTFNRYPMSWFRQVPGKEREFVAEINWSGSSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVFLQMSSLKPEDTAVYYCAAGSPGRYDYWGQGTQVTVSS。

实施例5. 模拟桔青霉素抗原的纳米抗体的大量制备

（一）以噬菌体扩增的方式制备

将展示有含有模拟桔青霉素抗原的纳米抗体阳性克隆子的TG1菌液加入至20mL 2×YT（含有氨苄青霉素）液体培养基中，培养至对数生长期，加入辅助噬菌体进行救援。37℃孵育1小时后离心，用等体积培养基2×YT（含有氨苄青霉素和卡那霉素）重悬菌体后，30℃摇床培养过夜。次日离心后，取上清加入1/5体积的PEG/NaCl，4℃静置2小时。离心后，弃上清，加入1mL PBS重悬沉淀，即为噬菌体扩增液。

（二）以纳米抗体蛋白的方式制备

从含有模拟桔青霉素抗原的纳米抗体阳性克隆子的TG1菌液提取质粒后，经Nco I和Not I双酶切后回收编码抗体的基因片段，然后亚克隆至表达载体pET-25b (+) (Novagen公司，加入6个组氨酸标签)，电转化至 Rosetta (DE3)感受态细胞中。涂布于LB-A（含氨苄青霉素）固体培养基中，37℃培养过夜，得到阳性克隆。

将上述得到的阳性克隆子，从平板上挑单菌落接种于5mL LB-AC（含氨苄青霉素和氯霉素）液体培养基中，37℃培养过夜。将过夜培养物按1%接种量（v/v）接种于50mL的LB-AC培养基中，37℃，200r/min振荡培养1-2小时，当培养物细菌浓度OD600达到0.7-0.9时，加入终浓度为0.1 mM的IPTG诱导，30℃振荡培养6-8小时。离心收集菌体沉淀，重悬于1 mL PBS溶液中，超声破碎后，离心取上清。经过Ni柱纯化后，得到较高纯度的纳米抗体蛋白。

实施例6.模拟桔青霉素抗原的纳米抗体作为竞争抗原在ELISA中的应用

（一）样品提取

取红曲液态发酵样品2 mL，加入甲醇萃取后用PBS调至甲醇终浓度为10%，样品待测。

（二）包被及封闭

用10 mM PBS (pH 7.4) 稀释抗CIT单克隆抗体，0.75 μg/mL包被于96孔酶标板，4℃孵育过夜。次日用PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (v/v)) 洗涤3次后，用含有4%脱脂奶粉的PBS封闭，37℃孵育1小时后，再用PBST洗涤3次，4℃保存待用。

（三）标准曲线的建立

取出经上述步骤处理的酶标板，每孔分别投入50 μl表面展示有纳米抗体的噬菌体和一系列不同浓度的50 μl CIT标准品，37℃孵育1小时。加入1:5000稀释HRP标记的抗M13噬菌体二抗，37℃孵育0.5小时。然后用TMB底物显色，读取OD₄₅₀。以CIT浓度对数为横坐标，结合率（加入CIT的孔的OD₄₅₀/未加入CIT孔的OD₄₅₀×100%）为纵坐标，结果显示标准曲线呈S型，线性相关性较好，检测范围1.50 - 45.94 ng/mL，IC₅₀为11.55 ng/mL（图1）。

（四）样品的检测

取出处理好的酶标板，每孔分别投入50 μl表面展示有纳米抗体的噬菌体和待测样品提取液，其余步骤同上述步骤。根据标准曲线，倒推出样品中CIT的含量。

实施例7. 模拟桔青霉素抗原的纳米抗体作为固相抗原在ELISA中的应用

（一）样品提取

取红曲大米固体发酵样品1g，加入5mL甲醇超声萃取20 min后，静置30min，将上清液转入具塞试管中。残渣再加5mL甲醇超声萃取，共萃取3次，合并上清液。取适量用PBS调至甲醇终浓度为10%后待测。

（二）包被及封闭

用10 mM PBS (pH 7.4) 稀释抗纳米抗体至终浓度1.8 μg/mL，取100μl包被于96孔酶标板，4℃孵育过夜。次日用PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (v/v)) 洗涤3次后，用含有4%脱脂奶粉的PBS封闭，37℃孵育1小时后，再用PBST洗涤3次，4℃保存待用。

（三）标准曲线的建立

取出经上述步骤处理的酶标板，每孔分别投入50 μl浓度为3.5 μg/mL抗CIT单克隆抗体和一系列不同浓度的50 μl CIT标准品，37℃孵育1小时。加入1:2000稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗，37℃孵育0.5小时。然后用TMB底物显色，读取OD₄₅₀。以CIT浓度对数为横坐标，结合率（加入CIT的孔的OD₄₅₀/未加入CIT孔的OD₄₅₀×100%）为纵坐标，结果也显示标准曲线呈S型，线性相关性较好，检测范围12.14-196.35 ng/mL，IC₅₀为48.94 ng/mL（图2）。

（四）样品的检测

取出处理好的酶标板，每孔分别投入50 μl浓度为3.5μg/mL抗CIT单克隆抗体和待测样品提取液，其余步骤同上述步骤。根据标准曲线，倒推出样品中CIT的含量。

实施例7：易错PCR法对模拟桔青霉素抗原的纳米抗体进行改造

以噬菌粒pHEN-X27作为模板，易错PCR向X27的DNA序列片段中随机引入突变，上游引物F：5’-TCG CGG CCC AGC CGG CCA TGG CCC AGT TGC AGC TG -3’, 下游引物R：5'- CGA GTG CGG CCG CTT GTG GTT TTG GTG TCT TGG G- 3'。 50 μL易错PCR体系如下：5 μL 10×易错PCR缓冲液（500 mmol/L KCl, 70 mmol/L MgCl₂, 100 mmol/L Tris-HCl pH 8.3, 0.1%（W/V，明胶））；0.5 mmol/L dATP/dGTP, 2.5 mmol/L dCTP/dTTP; 引物F/R各40 pmol；MgCl₂ 7 mmol/L；MnCl₂ 0.3 mmol/L；Taq DNA聚合酶2.5 U, ddH₂O补至50μL。PCR扩增条件：94°C，3 min；94°C 1 min，59°C 1 min，72°C 2 min，30个循环；72°C 10 min。易错PCR扩增产物经DNA纯化试剂盒纯化后，用限制性内切酶SfiI和NotI对扩增产物和噬菌粒pHEN1进行酶切，酶切产物经凝胶纯化试剂盒纯化后进行连接，转化至大肠杆菌TG1感受态细胞，涂布LBA平板，37°C过夜培养。将获得的转化子用辅助噬菌体KM13进行救援，得到展示突变的X27片段的噬菌体展示突变文库。

采用应用实例3中的亲和淘选和鉴定的方法，获取具有与原始单域重链抗体X27同样性质（即与天然桔青霉素分子相似的反应特性，能与抗桔青霉素单克隆抗体或多克隆抗体结合）的突变体，这些突变体的氨基酸序列具有与抗桔青霉素单克隆抗体或多克隆抗体结合活性，由（a）衍生的与（a）具有90%以上同源性。

SEQUENCE LISTING

<110> 南昌大学

<120> 模拟桔青霉素抗原的纳米抗体及其应用

<130> 2014

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Arg Thr Phe Asn Arg Tyr

20 25 30

Pro Met Ser Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Glu Ile Asn Trp Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Gly Ser Pro Gly Arg Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tcgcggccca gccggccatg gcccagttgc agctg 35

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgagtgcggc cgcttgtggt tttggtgtct tggg 34

Claims

1.模拟桔青霉素抗原的纳米抗体，其特征如（a）或（b）所述：（a）、具有SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列；或 (b)、将（a）中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有针对抗桔青霉素单克隆抗体或多克隆抗体结合活性的由（a）衍生的与（a）具有90%以上同源性的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述模拟桔青霉素抗原的纳米抗体的核苷酸。

3.包含权利要求2所述核苷酸序列的载体。

4.包含权利要求3所述的载体的宿主细胞。

5.根据权利要求1所述纳米抗体的制备方法，其特征在于通过噬菌体扩增或基因工程重组表达的方式进行大量制备；所述噬菌体扩增是指将展示模拟桔青霉素抗原的纳米抗体的噬菌体，通过生物扩增的方式，大量繁殖展示有纳米抗体的噬菌体粒子；所述基因工程重组表达的方式是指将编码纳米抗体的基因，通过克隆至表达载体，以抗体蛋白的形式大量制备。

6.权利要求1所述模拟桔青霉素抗原的纳米抗体在免疫学检测分析中的应用。

7.根据权利要求6所述应用，其特征在于该纳米抗体以固相抗原或竞争抗原在免疫学检测分析中的应用。