CN105218676A - 玉米赤霉烯酮抗独特型纳米抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及玉米赤霉烯酮抗独特型纳米抗体制备及其应用,其氨基酸序列SEQ？ID？NO.1，还涉及编码该氨基酸的核苷酸。本发明纳米抗体可以替代价格昂贵且具有毒性的ZEN标准品，并作为竞争抗原或固相包被抗原应用于ZEN的免疫学检测，该纳米抗体具有与天然ZEN分子相似的免疫反应特性，效果良好。纳米抗体相比于传统的基于多肽的抗原模拟表位及基于IgG的传统抗独特型抗体，具有结构更加稳定、耐酸碱和高温、检测灵敏度高等特性，因此其免疫检测稳定性得到了极大的提升，同时对环境的耐受能力也得到了提升。

Description

玉米赤霉烯酮抗独特型纳米抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及玉米赤霉烯酮抗独特型纳米抗体(zearalenoneanti-idiotypicnanobodies)制备及其应用.

背景技术

玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)是由镰刀菌产生的一种类雌激素样真菌毒素，其化学名为6-(10-羟基-6氧基-十一碳烯基)β-雷锁酸内酯161～163℃，不溶于水，溶于碱性溶液、乙醚、苯、甲醇以及乙醇等。玉米赤霉烯酮广泛存在于霉变的玉米、高粱、小麦、燕麦、大麦等谷类作物以及奶中。产生玉米赤霉烯酮最常见菌属是禾谷镰刀菌，此外为三线镰刀菌、木贼镰刀菌、雪腐镰刀菌、粉红镰刀菌等。ZEN具有类雌激素样作用、生殖发育毒性、免疫毒性、细胞毒性、肝毒性，对肿瘤产生也有一定影响，因此谷物在田间、收获及在储存过程中一旦被ZEN污染，不仅会给养殖业带来巨大的经济损失，更重要的是可能对人类和动物的健康造成严重的危害，因此对食品中ZEN的检测具有重要意义。

目前比较常用的检测ZEN方法有:高效液相色谱法，气相色谱法，薄层层析法，高效液相色谱-质谱联用法，免疫检测法等，但以免疫学检测方法较为方便、实用，适合于大规模样品的快速检测。免疫学检测方法往往涉及到使用毒素小分子标准品来建立标准曲线。用标准品的劣势首先在于毒素小分子提取工作困难，现在我国大多使用进口产品，而且某些产品进口受限，这样相对增加了成本，最重要的是毒素分子标准品的使用很容易造成环境的污染和对操作人员身体的危害。因此，人们开始利用抗独特型抗体和抗原模拟表位来实现有害小分子物质标准品的替代，并取得了一定的进展。噬菌体展示肽库技术的主要特点是可有效地筛选出与目标靶体特异结合的噬菌体展示多肽，并且在探索受体与配体之间相互作用结合位点、寻求高亲和力生物活性的配体分子、探索未知蛋白质空间结构表位等方面应用广泛。

本发明通过用噬菌体展示技术，从驼源天然单域重链抗体库中筛选能与靶分子(抗ZEN单克隆抗体)特异性结合的纳米抗体，以纳米抗体作为ZEN抗原的替代物应用于免疫学分析检测领域。该方法避免了传统抗独特型抗体制备所需的动物免疫过程，且具有普遍适用性，筛选得到的纳米抗体具有与天然ZEN分子相似的免疫反应特性，可替代价格昂贵且毒性强的ZEN标准品，并作为竞争抗原或固相包被抗原应用于ZEN的免疫学检测。

发明内容

本发明以抗ZEN单克隆抗体为靶分子，将靶分子固相包被于酶标板上，投入驼源天然单域重链抗体库进行亲和淘选，获得了一种玉米赤霉烯酮抗独特型纳米抗体(Z6)，其具有SEQIDNO.:1所示的氨基酸序列。

其氨基酸序列的IMGT编号和结构域划分如图1所示。

本发明所提及的纳米抗体包括四个框架区(Frameworkregion,FR)和三个互补决定区(Complementarity-determiningregion,CDR)。其中，框架区(FR1-FR4)分别选自SEQIDNO.:2，SEQIDNO.:4，SEQIDNO.:6和SEQIDNO.:8，互补决定区(CDR1-CDR3)分别选自SEQIDNO.:3，SEQIDNO.:5和SEQIDNO.:7。框架区结构相对保守，主要起着维持蛋白质结构的作用；互补决定区结构相对多样化，主要负责抗体的识别。

本发明提供一种蛋白质或多肽，包含SEQIDNO.:2，SEQIDNO.:4，SEQIDNO.:6和SEQIDNO.:8中的一个或两个及以上的氨基酸序列，且至少与其中一个的氨基酸序列有90％同源性。

本发明提供一种蛋白质或多肽，包含SEQIDNO.:3，SEQIDNO.:5和SEQIDNO.:7中的一个或两个及以上的氨基酸序列，且至少与其中一个的氨基酸序列有80％同源性。

本发明还涉及编码该纳米抗体氨基酸序列的核苷酸，其序列为SEQIDNO.:9。

本发明提及的纳米抗体可通过噬菌体扩增或基因工程重组表达的方式进行大量制备。噬菌体扩增是指将展示有该纳米抗体的噬菌体，通过生物扩增的方式，大量繁殖生产展示有该纳米抗体的噬菌体粒子。基因工程重组表达的方式是指将编码该纳米抗体的基因，通过克隆至表达载体，以蛋白表达的形式进行该纳米抗体的大量制备。

本发明还涉及所述纳米抗体在非疾病诊断治疗目的免疫学检测分析中的应用。免疫学检测的类型包括酶联免疫吸附检测、胶体金免疫层析、免疫斑点杂交等基于抗原-抗体特异性反应的免疫学分析检测类型。

本发明所述的纳米抗体在应用时，可以通过噬菌体扩增获得的展示有纳米抗体的噬菌体粒子直接用于分析检测，当然，也可以将纳米抗体经过原核生物或真核生物表达后以蛋白的形式进行免疫学检测分析。该纳米抗体以固相抗原或竞争抗原在非疾病诊断治疗目的免疫学检测分析中的应用。

本发明还涉及该纳米抗体在非疾病诊断治疗目的免疫学检测分析中的应用，具体为纳米抗体在制备ZEN的模拟物试剂中的应用。

本发明中所叙述的一些术语具有如下含义：

同源性：描述两个或多个氨基酸序列的相似程度，第一个氨基酸序列和第二个氨基酸序列之间的同源性百分比可以通过【第一氨基酸序列中与第二氨基酸序列中相应位置处的氨基酸残基相同的氨基酸残基的数量】除以【第一个氨基酸序列中氨基酸总数】再乘以【100％】来计算，其中第二氨基酸序列中的某个氨基酸的缺失、插入、替换或添加(与第一氨基酸相比)被认为是有差别。另外，同源性百分比也可以利用已知的用于序列比对的计算机运算程序(如：NCBIBlast)获得。

结构域：蛋白质三级结构的基本结构单位，通常具有一定的功能。

IMGT编号：IMGT数据库(TheInternationalImMunoGeneTicsDatabase)中的一种已经标准化的抗体氨基酸序列编号方法。具体编号方法可以参考文献(Ehrenmann,F.,Q.Kaas,etal.(2010)."IMGT/3Dstructure-DBandIMGT/DomainGapAlign:adatabaseandatoolforimmunoglobulinsorantibodies,Tcellreceptors,MHC,IgSFandMhcSF."NucleicAcidsRes38(Databaseissue):D301-307.Lefranc,M.P.,C.Pommie,etal.(2003)."IMGTuniquenumberingforimmunoglobulinandTcellreceptorvariabledomainsandIgsuperfamilyV-likedomains."DevCompImmunol27(1):55-77.)中的描述。

密码子(codon)：亦称三联体密码(tripletcode)，指对应于某种氨基酸的核苷酸三联体。在转译过程中决定该种氨基酸插入生长中多肽链的位置。

前述纳米抗体可以替换价格昂贵且毒性强的ZEN标准品，并作为竞争抗原或固相包被抗原应用于ZEN的免疫学检测，该纳米抗体具有与天然ZEN分子相似的免疫反应特性，效果良好。

本发明的有益效果是：本发明纳米抗体可以替代价格昂贵且毒性强的ZEN标准品，并作为竞争抗原或固相包被抗原应用于ZEN的免疫学检测。该纳米抗体具有与天然ZEN分子相似的免疫反应特性，可提高ZEN检测灵敏度，减少ZEN标准品对操作人员健康和环境的危害，节约成本。本发明制备纳米抗体的方法具有普遍适用性，可用于其他小分子物质抗原替代物的筛选和制备，具有很高的应用价值。

附图说明

图1为纳米抗体(Z6)的氨基酸编号及结构域示意图。

图2为以纳米抗体(Z6)建立的间接竞争ELISA标准曲线。检测范围为0.2-1.22ng/mL，IC₅₀为0.49ng/mL。

具体实施方式

实施例1.驼源天然单域重链抗体库的构建

1)驼源白细胞的分离：在离心管中加入淋巴细胞分离液，再缓慢加入等体积血液样品，1000g离心50min；小心吸取中间层悬浮的白细胞至一新的离心管中，加入1/2体积的PBS，1000g离心15min；弃上清，用PBS洗下离心管壁上的白细胞，1000g离心10min；弃上清，加入500μLPBS重悬白细胞并计数；以体积比1：15加入裂解液(RNAiso)保存备用。

2)总RNA提取：向上述裂解液中加入1/4体积的氯仿，剧烈震荡20s使其充分乳化，室温静置5min；4℃12000g离心15min，取上清转移至另一新鲜离心管中；加入等体积的异丙醇，充分混匀后室温静置10min；4℃10000g离心20min，弃上清，缓慢加入75％乙醇1mL，小心洗涤离心管管壁；4℃，12000g离心5min后弃去乙醇；室温干燥沉淀5min，加入适量的RNase-free水溶解沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80℃保存。

3)cDNA的合成：将反转录用的引物、dNTPMixture和模板RNA混合，65℃5min，迅速冰浴。具体配制如下：

然后在上述Microtube中配置下列反转录反应液：

PCR仪上按下列条件进行反转录反应：42℃35min，50℃45min，70℃10min。PCR产物于-20℃保存备用。

4)抗体可变区基因扩增：将反转录得到的cDNA作为模板进行PCR反应。

第一轮PCR：

PCR反应条件：96℃1min；98℃6s，55℃20s，72℃65s，35cycles；75℃10min。

采用试剂盒回收PCR扩增产物，适当稀释后作为第二轮PCR的模板。

第二轮PCR：

PCR反应条件：94℃5min；98℃8s，52℃15s，72℃50s，6cycles；98℃10s，68℃45s，30cycles；72℃7min。

5)文库构建：

A.VHH编码基因及载体的双酶切

分别采用SfiI和NotI酶对VHH编码基因和pHEN1载体进行双酶切。

B.酶切后产物的连接

将载体pHEN1和VHH片段混匀(摩尔比1∶7)，于16℃连接8h。先后加入5μL(1/10量)的3MCH₃COONa(pH5.2)和125μL(2.5倍量)的冷无水乙醇，-20℃静置2h，10000rpm离心回收沉淀，用70％的冷乙醇清洗沉淀，室温干燥，溶于10μL去离子水中。

C.电转化

取5μL连接产物加至80μL感受态细胞E.coliTG1中，充分混匀，冰上放置1min。转入0.1cm的电击杯中电击转化(电压为1.8kV)，立即向电击杯中加入900μLLB培养基，37℃160rpm培养1h。将菌液涂布于LB-AG平板，37℃倒置培养过夜。

6)文库的救援：接种超过10倍库容量的细胞于100mL2×YT/amp/2％葡萄糖，培养至OD600达0.5；加入辅助噬菌体(20:l感染复数)，37℃，静置15min后，220rpm培养45min；4℃，1000g离心10min；弃上清，加入100mL新鲜的2×YT/amp/kan培养基重悬沉淀，30℃培养过夜；4℃10000rpm离心10min，取上清；加入1/5体积的PEG-NaCl溶液，4℃静置3-4h；4℃10000rpm离心15min，弃上清，沉淀用1mLPBS重悬；取10μL测定库容，其余加入终浓度50％甘油，-80℃保存。

实施例2.纳米抗体的亲和淘选及其鉴定

1)纳米抗体的亲和淘选：首先，用PBS(pH7.4)将抗ZEN单克隆抗体稀释至终浓度100μg/mL，4℃包被过夜。第二天用PBST(10mMPBS，0.1％Tween-20(v/v))洗涤5次后，加入5％BSA-PBS(或5％OVA-PBS)37℃封闭1小时。然后用PBST洗涤6次，每孔加入100μL驼源天然单域重链抗体库(滴度约2.0×10¹¹cfu)，37℃孵育2小时。弃去未结合的噬菌体，用PBST洗涤10次，加入100μL的Glycine-HCl(0.2M,pH2.2)洗脱7min后，立即用15μLTris-HCl(1M，pH9.1)中和。取10μL洗脱噬菌体测定滴度，其余的用于感染25mL生长至对数期的E.coliTG1菌株进行扩增。第三天用PEG/NaCl沉淀扩增后的噬菌体，并测定噬菌体的滴度。

在第二、第三和第四轮的淘选过程中，包被的抗ZEN单克隆抗体浓度分别为50μg/mL，25μg/mL和10μg/mL，加入噬菌体孵育后用PBST洗涤次数分别为10次，15次和15次，其余步骤同上。

2)阳性噬菌体克隆的鉴定：第四轮淘选后测定噬菌体滴度的平板上随机挑取20个克隆，进行噬菌体的扩增，采用间接酶联免疫吸附检测方法(IndirectEnzymeLinkedimmunoasorbentassay,I-ELISA)进行阳性噬菌体克隆的鉴定。具体方法为：首先，用PBS(pH7.4)将抗ZEN单克隆抗体稀释至5μg/mL，4℃包被过夜。第二天用PBST(10mMPBS,0.05％Tween-20(v/v))洗涤3次后，加入300μL的5％脱脂奶粉，37℃封闭2小时；弃封闭液，PBST洗涤3次后，加入100μL噬菌体扩增液(2.0×10¹¹cfu)，以原始噬菌体肽库作为阴性对照，37℃孵育1小时；加入1:5000倍稀释的HRP标记抗M13噬菌体二抗100μL，37℃孵育1小时；加入100μLTMB底物溶液，避光显色10min；加入50μL终止液(2MH₂SO₄)终止反应；用酶标仪(ThermoScientificMultiskanFC)测定450nm处的吸收值。选取OD₄₅₀大于阴性对照2倍的噬菌体克隆为阳性克隆。

3)阳性纳米抗体的鉴定：采用间接竞争ELISA的方法进行阳性纳米抗体的鉴定，具体方法为：用PBS(pH7.4)将抗ZEN单克隆抗体稀释至2μg/mL，4℃包被过夜；第二天用PBST(10mMPBS,0.05％Tween-20(v/v))洗涤5次后，加入300μL的5％脱脂奶粉，37℃封闭1小时；加入50μL经间接ELISA鉴定为阳性的噬菌体克隆(1.0×10¹¹cfu)和50μLZEN标准品(浓度范围为0-10ng/ml)，37℃孵育1小时；加入1:5000稀释HRP标记的抗M13噬菌体二抗100μL，37℃孵育1小时；加入100μLTMB底物溶液，避光显色10min，测定OD₄₅₀，能结合抗ZEN单克隆抗体，且能被ZEN标准品所阻断的噬菌体，鉴定为阳性纳米抗体，结果显示获得1株阳性纳米抗体，命名为Z6。

实施例3.纳米抗体编码基因的测序及其氨基酸序列的确定

将经过间接竞争ELISA鉴定展示有阳性纳米抗体的噬菌体克隆进行DNA测序，根据DNA测序结果及密码子表可获得纳米抗体的氨基酸序列，如SEQIDNO.1所示。

实施例4.阳性纳米抗体的大量制备

(1)以噬菌体扩增的方式进行制备

将展示有阳性纳米抗体的噬菌体加入至20mL接种有E.coliTG1的培养物中，37℃220rpm振荡培养6h。将培养物转入另一离心管中，4℃10000rpm离心10min，将上清的上部80％转入一新鲜的离心管中，加入1/6体积的PEG/NaCl，4℃静置120min后，4℃10000rpm离心10min，弃上清；再加入少量PBS清洗噬菌体。4℃10000rpm离心10min，弃上清，加入1mLPBS进行重悬，即为噬菌体扩增液。

(2)以蛋白表达的形式进行制备

分别采用NcoI和NotI酶对外源编码VHH基因和表达载体(pET-25b)进行双酶切，将VHH编码基因克隆至表达载体pET-25b，经PCR和酶切验证后，将重组表达载体转入大肠杆菌Rosetta(DE3)。从转化平板上挑一单菌落接种于5mLLB液体培养基中，37℃，220r/min振荡培养过夜，将过夜培养物按1％接种量(v/v)接种于50mL的LB/Amp，2％葡萄糖培养基中，37℃，220r/min振荡培养；当培养物菌体浓度OD600达到0.5时，向培养物中加入0.1mM的IPTG，30℃，180r/min振荡培养6h；将培养物于4℃，8000rpm，离心20min收集菌体沉淀。重悬细胞于5mL预冷的PBS溶液，超声破碎10min后，8000rpm离心20min取上清，将上清进行亲和层析纯化，即得表达的纳米抗体。

实施例5.纳米抗体作为固相包被抗原在ELISA中的应用

(1)样品提取

称取5g样品(谷物及其相关制品)，加入25毫升PBS(pH7.4)溶液，充分振荡5分钟；将提取液用whatman1号滤纸进行过滤，取2毫升滤液加入6毫升PBS混匀后，即为样品提取液，待用。

(2)包被及封闭

用10mMPBS(pH7.4)将表达的纳米抗体稀释至2μg/mL，100μL包被于酶标板，4℃孵育过夜。第二天用PBST(10mMPBS,0.05％Tween-20(v/v))洗涤3次后，用含有5％脱脂奶粉的PBS进行封闭，37℃孵育1小时后，用PBST洗板6次待用。

(3)标准曲线的建立

取出经步骤(2)处理好的板条，每孔分别投入50μL抗ZEN单克隆抗体(5μg/ml)和一系列不同浓度的50μLZEN标准品，37℃孵育1小时。加入1:2000稀释HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育1小时。然后用TMB底物显色，读取OD₄₅₀。以ZEN标准品浓度对数为横坐标，结合率(加入ZEN的孔的OD₄₅₀/未加入ZEN的孔的OD₄₅₀×100％)为纵坐标，建立间接竞争标准曲线。结果显示标准曲线呈S型，线性相关性较好，检测范围为0.20-1.22ng/mL，IC₅₀为0.49ng/mL(图1)。

(4)样品的检测

取出经步骤(2)处理好的板条，每孔分别投入50μL抗ZEN单克隆抗体(5μg/ml)和待测样品提取液，37℃孵育1小时。加入1:2000稀释HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育1小时。然后用TMB底物显色，读取OD450。计算结合率，并根据标准曲线，倒推出样品中ZEN的含量。

Claims (6)

1.玉米赤霉烯酮抗独特型的纳米抗体，其特征在于具有SEQIDNO.:1所示的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述纳米抗体的氨基酸序列的核苷酸，其序列为SEQIDNO.:9。

3.如权利要求1所述纳米抗体的制备方法，其特征在于通过噬菌体扩增或基因工程重组表达的方式进行大量制备；所述噬菌体扩增是指将展示有该纳米抗体的噬菌体，通过生物扩增的方式，大量繁殖生产展示有该纳米抗体的噬菌体粒子；所述基因工程重组表达的方式是指将编码该纳米抗体的基因，通过克隆至表达载体，以蛋白表达的形式进行该纳米抗体的大量制备。

4.权利要求1所述纳米抗体在免疫学检测分析中的应用。

5.如权利要求4所述应用，其特征在于该纳米抗体以固相抗原或竞争抗原在免疫学检测分析中的应用。

6.如权利要求4所述应用，其特征在于该纳米抗体在制备ZEN模拟物试剂中的应用。