CN117106092A - 一种抗玉米赤霉烯酮和玉米赤霉醇纳米抗体及其应用 - Google Patents

一种抗玉米赤霉烯酮和玉米赤霉醇纳米抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗玉米赤霉烯酮和玉米赤霉醇纳米抗体及其应用，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。所述纳米抗体能够同时识别玉米赤霉烯酮和玉米赤霉醇，且具有良好的热稳定性、有机溶剂耐受性及优异的耐酸性。进一步地，本发明基于所述纳米抗体还提供一种检测玉米赤霉烯酮和玉米赤霉醇的方法，对玉米赤霉烯酮和玉米赤霉醇的半数抑制（IC50）分别为1.35和2.53 ng/mL，线性范围分别为0.26～19.07ng/mL和0.56～39.36ng/mL，最低检测限（LOD）分别为0.09和0.20 ng/mL，检测灵敏度高，准确性好，且操作简单耗时短，适于推广使用。

Description

一种抗玉米赤霉烯酮和玉米赤霉醇纳米抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及一种抗玉米赤霉烯酮和玉米赤霉醇的纳米抗体及其应用。
背景技术
玉米赤霉烯酮（Zearalenone, ZEN）是一种具有类雌激素作用的非甾体雌激素类真菌毒素，由镰刀菌产生，这类霉菌可在多种谷物与饲料上滋生，特别是在温度中等湿度较高的环境可以导致毒素的大量产生。玉米赤霉烯酮被摄入体内后，在动物体内转化产生主要的还原性代谢产物有玉米赤霉醇（Zeranol，ZAL）。玉米赤霉烯酮类化合物危害主要是因为其与天然存在的雌激素的化学结构类似，具有相似的分子机制和活性，能与哺乳动物体内雌激素受体ERa和ERb结合，表现出激素紊乱现象，引起生殖系统功能障碍，甚至是流产、死胎和畸形等，也会造成肝毒性、血液毒性、免疫毒性、遗传毒性和致癌。相比于玉米赤霉烯酮，其代谢产物玉米赤霉醇具有更强的雌激素作用。但玉米赤霉烯酮及其代谢物对饲料及其产品的污染会残留在可食用的动物组织或动物产品中，会影响人体生殖系统发育。因此，针对饲料和食品中玉米赤霉烯酮及其代谢物的检测具有重要意义。
现有用于检测玉米赤霉烯酮和玉米赤霉醇的方法中，酶联免疫吸附测定法（ELISA）由于具有灵敏度高、特异性强、仪器设备要求低以及样本前处理相对简单等优点而被广泛应用。但酶联免疫吸附测定法主要以单克隆抗体和多克隆抗体为主，此类抗体在极端条件下的稳定性差，容易失活。另在对样品进行前处理的过程需要使用有机溶剂，而有机溶剂的残留使得以单克隆抗体和多克隆抗体为主的免疫学检测的灵敏度和准确度大大降低。因此，目前缺乏一种稳定性好，灵敏度高、能耐有机溶剂的能同时抗玉米赤霉烯酮和玉米赤霉醇的抗体。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种抗玉米赤霉烯酮和玉米赤霉醇的纳米抗体及其应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
本发明提供了一种抗玉米赤霉烯酮和玉米赤霉醇的纳米抗体，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明通过制备人工抗原免疫羊驼获得纳米抗体基因文库，后续通过生物淘筛，从羊驼免疫抗体基因文库中筛选得到了一种抗玉米赤霉烯酮和/或玉米赤霉醇的纳米抗体，并将其命名为纳米抗体Nbzel-338。
优选地，所述纳米抗体Nbzel-1包括4个框架区（FR1、FR2、FR3、FR4）和3个互补决定区（CDR1、CDR2、CDR3），4个框架区和3个互补决定区的排列顺序依次为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
优选地，FR1的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，FR2的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，FR3的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，FR4的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示；CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。
本发明还提供了一种编码所述纳米抗体Nbzel-338的基因，其核苷酸序列如SEQID No.9所示。
本发明还提供了一种重组载体，所述载体中含有编码纳米抗体Nbzel-338的基因。
本发明还提供了一种重组细胞，所述细胞中含有上述重组载体。
由于本发明已给出了纳米抗体Nbzel-338的氨基酸序列和编码该纳米抗体的基因序列，本领域技术人员可在此基础上通过已知的重组DNA技术得到本申请所述纳米抗体。因此，任何可用于制备本发明所述纳米抗体的重组载体或重组细胞等也应在本发明的保护范围之内。
进一步地，本发明对制备所得的纳米抗体Nbzel-338进行耐受性分析，发现所述纳米抗体Nbzel-338具有良好的热稳定性，良好的有机溶剂（甲醇）耐受性及优异的耐酸性，在实际样品检测的前处理过程中不会受到有机溶剂以及pH的影响，对玉米赤霉烯酮和/或玉米赤霉醇进行免疫检测的结果准确度高、特异性强、灵敏度高。
因此，本发明提供所述纳米抗体在检测玉米赤霉烯酮及玉米赤霉醇中的应用。
本发明还提供所述纳米抗体、所述基因、所述重组载体或所述重组细胞在制备检测玉米赤霉烯酮及其玉米赤霉醇的产品中的应用。
本发明还提供一种用于检测玉米赤霉烯酮和/或玉米赤霉醇的试剂盒。
进一步地，所述试剂盒含有纳米抗体Nbzel-338。
本发明还提供一种检测玉米赤霉烯酮和玉米赤霉醇的方法，所述方法为用玉米赤霉烯酮半抗原与载体蛋白偶联得到的完全抗原做包被原，用所述纳米抗体作为检测抗体进行检测。
进一步地，所述玉米赤霉烯酮半抗原的结构式如式（I）所示：
式（I）。
进一步地，所述载体蛋白为刀豆球蛋白A（ConA）。
进一步地，所述包被原的结构式如式（Ⅱ）所示：
式（Ⅱ）。
具体地，所述包被原被称为ZEL-A-ConA。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种抗玉米赤霉烯酮和/或玉米赤霉醇的纳米抗体，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。所述纳米抗体具有良好的热稳定性，良好的有机溶剂（甲醇）耐受性及优异的耐酸性，不易受有机溶剂以及pH的影响。进一步地，本发明将所述纳米抗体用于检测玉米赤霉烯酮和/或玉米赤霉醇，其操作简单，耗时短，结果准确度高。所述纳米抗体对玉米赤霉烯酮和玉米赤霉醇的半数抑制（IC50）分别为1.35和2.53 ng/mL，线性范围分别为0.26～19.07ng/mL和0.56～39.36ng/mL，最低检测限（LOD）分别为0.09和0.20 ng/mL，可用于实际样品中玉米赤霉烯酮和/或玉米赤霉醇的残留检测或用于制备检测玉米赤霉烯酮和/或玉米赤霉醇的产品，具有很高的应用价值。
附图说明
图1为纳米抗体Nbzel-338的氨基酸序列及结构域划分示意图。
图2玉米赤霉烯酮半抗原、刀豆球蛋白A、血蓝蛋白（KLH）和人工抗原的紫外全波长扫描结果图。
图3为基于纳米抗体Nbzel-338建立的间接竞争ELISA标准曲线图。
图4为不同比例有机溶剂/PBS作为稀释液时纳米抗体Nbzel-338的活性曲线图。
图5为纳米抗体Nbzel-338的酸碱耐受性分析结果图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1 构建羊驼免疫抗体文库
1、完全抗原ZEL-A-LF和ZEL-A-ConA的制备
本发明所用半抗原的结构式如式（I）所示：
式（I）。
本发明将式（I）所示半抗原通过活泼酯法分别偶联血蓝蛋白（KLH）和刀豆球蛋白A（ConA），制备获得完全抗原ZEL-A-LF和ZEL-A-ConA。其中，ZEL-A-LF为免疫抗原，ZEL-A-ConA为包被原。利用紫外分光光度计对制备得到的玉米赤霉烯酮半抗原（ZEL-A）、刀豆球蛋白A、血蓝蛋白（KLH）和人工抗原（ZEL-A-LF、ZEL-A-ConA）进行紫外全波长扫描，结果如图2所示。由图2所示结果可知，血蓝蛋白（KLH）和刀豆球蛋白A（ConA），分别在210 nm左右出现了显著的吸收峰，人工抗原同时具有半抗原ZEL-A和载体蛋白的吸收特征和在最大吸收峰均有偏移；说明本发明成功合成了人工抗原。
所述完全抗原的结构式如式（Ⅱ）所示：
式（Ⅱ）。
2、羊驼的免疫
用ZEL-A-LF作为免疫抗原对健康的羊驼进行动物免疫，在羊驼背颈部进行皮下注射，每次免疫剂量为0.5 mg的免疫抗原。首次免疫时，用0.5 mL完全弗氏佐剂与免疫抗原混合乳化后免疫，后续加强免疫用0.5 mL不完全弗氏佐剂与抗原乳化后免疫，之后每间隔2周加强免疫一次，共进行3次加强免疫。
免疫前取10 mL血分离血清作为阴性对照。从第二次免疫开始，每次取免疫一周后的血液10 mL进行血清效价以及竞争反应检测。在第三次免疫后，采集50～100 mL外周血，用于构建纳米抗体文库。
3、羊驼淋巴细胞的分离
羊驼外周血采集后需尽快进行淋巴细胞分离，具体操作方法如下：
将羊驼外周血与无菌生理盐水在容积为50 mL的无RNA酶离心管中以2:1的体积比混合稀释，稀释后用商品化的淋巴细胞分离液进行淋巴细胞分离；在无菌的50 mL离心管中加入15 mL淋巴分离液，用无菌巴氏滴管沿着试管壁缓慢加入15 mL的稀释血液，800 g离心25 min；取淋巴细胞层到新的50 mL离心管，用生理盐水稀释2倍，4℃条件下1500 g离心10min，弃上清；用5 mL生理盐水吹散淋巴细胞，再次1500 g离心10 min，弃上清，以充分洗涤淋巴细胞；每份淋巴细胞中加入适量的裂解液（TRNsol）后分装，每1 mL作为一份分装到2mL离心管中，于-80℃保存备用，用于总RNA的提取。
4、总RNA的提取
采用广州捷倍斯生物科技有限公司的RNA提取试剂盒（R4105）提取上述分离保存的淋巴细胞总RNA，根据说明书进行操作即可。
提取总RNA后取少许样品，利用核酸电泳对RNA的质量进行检测，同时利用超微量分光光度计（nanodrop）中测定RNA的浓度。理想的RNA样品应完整无降解，从核酸电泳凝胶上可见清晰的28S和18S条带，且无基因组DNA混杂，在260 nm及280 nm下的紫外吸收值比值（A260/A280）应在2.0左右。如果出现基因组DNA污染，应在反转录前用DNA酶去除基因组DNA，并再次通过电泳验证基因组DNA已除去且RNA没有在此过程中发生降解；如果RNA已经发生降解，则需要重新提取RNA。RNA应尽快反转录成cDNA或短暂保存在-80℃环境。
5、cDNA的合成
以提取的总RNA为模板，参照Takara公司的第一链反转录试剂盒说明书进行cDNA第一链的合成。具体方法为：
（1）按照表1所示的cDNA合成的第一步反应体系，将试剂在无核酸酶的离心管中混合，在冰浴下操作；
表1 cDNA合成的第一步反应体系
（2）按表格配制好反应体系后于65℃孵育5 min，冰浴冷却2 min；
（3）按照表2所示的cDNA合成的第二步反应体系，在步骤（2）反应后的体系中加入试剂；
表2 cDNA合成的第二步反应体系
（4）配制好反应体系后于42℃孵育60 min，70℃孵育5 min；反转录产物cDNA于-80℃保存。
6、纳米抗体目的基因的扩增
本发明利用巢式PCR对目的基因进行两步法扩增。
第一轮PCR：以反转录所得cDNA作为第一轮PCR模板，利用引物CALL001/CALL002进行第一轮PCR反应，引物CALL001和CALL002的核苷酸序列如表5所示，第一轮PCR的反应体系如表3所示。
表3 巢式PCR第一步反应体系
第一轮PCR的反应条件为：94℃ 5 min；94℃ 30 s；55℃ 30 s；72℃1 min，30cycle；72℃ 10 min。
第二轮PCR：采用试剂盒回收第一轮PCR反应产物，适当稀释后作为第二轮PCR的模板，利用引物F/R1或引物F/R2进行第二轮PCR反应，引物F、R1和R2的序列如表5所示，第二轮PCR的反应体系如表4所示。第二轮PCR的反应条件为：94℃ 5min；94℃ 30s；55℃ 30s；72℃1min 30cycle；72℃ 10min。
表4 第二轮PCR的反应体系
表5 纳米抗体VHH目的基因的扩增所用的引物及其核苷酸序列
7、基因文库的构建
（1）VHH目标基因及载体的酶切
采用SfiI酶对VHH目标基因及pComb3xss载体进行酶切反应。酶切条件为50℃恒温反应16 h。
pComb3xss载体酶切产物通过琼脂糖凝胶回收分子量为3500 bp的条带；VHH基因酶切产物通过DNA回收试剂盒直接清洁回收。
（2）酶切产物的连接
将载体pComb3xss和VHH片段混匀（摩尔比1：3），16℃反应16 h后用DNA回收试剂盒清洁回收。
（3）电击转化
取5 μL连接产物加入到50 μL电转感受态E.coliTG1中，轻轻混匀后转移到0.2 cm的电转杯中电击转化（电压为1.8 kv），电击后立即向电转杯分两次加入800 μL和150 μL预热到37℃的SOC培养基，收集到无菌离心管中，于37℃，250 rpm培养1 h复苏细胞。
取50 μL复苏菌液进行梯度稀释，将各浓度梯度稀释菌液各取100 μL涂布于直径90 mm的LB-Amp培养皿作为计数板，37℃培养过夜。剩余未稀释的复苏菌液全部涂布于直径120 mm的LB-Amp培养皿，每1 mL菌液涂布于2～3个培养皿作为扩增板，37℃扩增培养过夜。
统计计数培养皿上的菌落数，计算复苏菌液中的细菌总数，进行多次电击转化，使转化菌落总数累计达到107cfu以上，此数目即为纳米抗体基因文库的库容量。
将扩增板中的转基因大肠杆菌菌落用细胞刮刀刮下，离心收集菌体，弃上清后重新加入LB-Amp液体培养基（每电转一管加入0.5 mL）重悬，混合均匀后加入终浓度为25%的无菌甘油（v/v），取50 μL菌液进行梯度稀释后测定细胞数，其余菌液分装后于-80℃冻存，即为纳米抗体基因库。
8、噬菌体救援
根据上述转基因大肠杆菌细胞数测定结果接种10倍库容量以上的细胞于150 mL的LB-Amp液体培养基中，控制OD600＜0.2，37℃下250 rpm培养至对数期（OD600约0.4～0.6）；加入1 mL滴度为1012cfu/mL以上的辅助噬菌体M13K07，37℃静置30 min后，250 rpm培养1h，加入Kana（卡那霉素，工作浓度为50 μg/mL）37℃，250 rpm培养过夜。将菌液转移到离心瓶，12000 rpm 4℃离心15 min，取上清，加入1/4体积的PEG/NaCl，冰浴2.5 h以上。12000rpm 4℃离心15min，弃上清，沉淀用750 μL TBS重悬，转移到1.5 mL离心管，4000 rpm25℃离心5 min，过0.22 μm聚醚砜滤膜。取10 μL噬菌体测定滴度，其余混合均匀后加入终浓度50％的无菌甘油（v/v），-80℃保存，即为纳米抗体噬菌体库，可直接用于亲和淘选。
实施例2 纳米抗体的亲和淘选及其鉴定
1、纳米抗体的亲和淘选
（1）抗原和载体蛋白固定化
亲和淘选使用吸附力较强的强吸附酶标板，每轮淘选包板1列，共4轮包板4列。以式（I）所示半抗原通过活泼酯法偶联刀豆球蛋白A（ConA）后制备所得的完全抗原ZEL-A-ConA作为检测抗原。
AB孔用包被原刀豆球蛋白A（刀豆球蛋白A）稀释至1 mg/mL，CDEF孔用CB包被液将检测抗原ZEL-A-ConA稀释至10 μg/mL，加入强吸附板微孔中，每孔100 μL，37℃静置过夜。此外，因羊驼可能免疫过多种载体蛋白，将乳铁蛋白（LF）、钥孔血蓝蛋白（KLH）和牛血清白蛋白（BSA）三种免疫载体蛋白混合稀释，使终浓度均为2 mg/mL，单独包被1列免疫原载体蛋白孔。第二天用PBST（0.01M PBS，0.05% Tween-20）洗板两次后，每孔加入120 μL 1%鱼胶蛋白溶液37℃静置3 h。倒出孔内液体并在吸水纸上拍干，37℃烘干1 h，4℃保存备用。
（2）阳性噬菌体筛选
将实施例1的噬菌体文库加入到2个免疫原载体蛋白孔，每孔150 μL，37℃震荡孵育1 h（仅第1轮需要此步骤，第2，3，4轮直接从AB孔开始）。将游离噬菌体转移到包被原载体蛋白AB孔，每孔150 μL，37℃震荡孵育1 h。将游离噬菌体转移到3个有固定化抗原（ZEL-A-ConA）的微孔中，每孔100 μL，37℃震荡孵育1 h。弃去孔中游离的噬菌体，用PBST（0.01MPBS，0.05%Tween-20（v/v））洗涤微孔10次，再用PBS洗涤微孔5次。加入100 μL 10 mg/mL的胰蛋白酶-TBS溶液37℃洗脱30 min。收集噬菌体，取10 µL洗脱噬菌体测定滴度，其余的用于侵染5 mL生长至对数期的E.coli TG1菌株进行扩增。第二天用PEG/NaCl沉淀扩增后的噬菌体，并测定噬菌体的滴度。
在第二、三、四轮的淘选过程中，ZEL-A-ConA的包板浓度分别降到1000 ng/mL、500ng/mL和100 ng/mL，重复步骤（2）的筛选方案。用PBST（0.01M PBS，0.05%Tween-20（v/v））与PBS洗涤后，采用药物竞争洗脱方式，即加入一定浓度的药物，37℃孵育1 h，吸出孔内液体，即为洗脱下来的噬菌体。药物洗脱浓度分别1000 ng/mL、500 ng/mL和100 ng/mL。以上条件可以根据实际免疫情况进行调整，如果血清效价较低，可以适当提高淘选时的检测抗原ZEL-A-ConA浓度；如果抑制率较低，则需适当提高竞争反应的药物浓度。
2、阳性克隆的鉴定
采用间接酶联免疫吸附法进行阳性噬菌体克隆的鉴定。具体方法为：
（1）抗原固定化
检测抗原ZEL-A-ConA用包被液稀释至1 μg/mL，每孔100 μL，37℃静置过夜。第二天用PBST（0.01M PBS，0.05% Tween-20）洗板两次后，每孔加入120 μL 2%的脱脂奶粉溶液37℃静置3 h。倒出孔内液体并在吸水纸上拍干，37℃烘干1 h，4℃保存备用。
（2）纳米抗体小量表达
从第3、4轮淘选的output滴度测定平板上每轮随机挑选96个单菌落，接种到每孔装有0.5 mL LB-Amp的96孔深孔板中，同时接种一个TG1单克隆作为阴性对照，37℃，180rpm培养过夜，作为菌液“母板”。
从母板中每孔取出10μL菌液接种到另一块每孔装有1mL LB-Amp的96孔深孔板中，接种的孔编号要与母板对应，37℃，180 rpm培养4 h至对数期，每孔加入IPTG（1：1000比例，v/v）37℃，180 rpm培养过夜。
（3）酶联免疫鉴定阳性克隆
将培养过夜的加入IPTG的深孔板4000 rpm，10 min离心，加入50 µL上清到已经包被好的酶标板中，37℃孵育40 min，用PBST（0.01M PBS，0.06%Tween-20（v/v））洗板五次，拍干孔内液体，加入1:5000稀释HRP标记的抗VHH二抗100 µL，37℃孵育30 min，用PBST（0.01MPBS，0.06%Tween-20（v/v））洗板五次，拍干孔内液体，加入100 µLTMB底物液，37℃避光显色10 min；加入50 µL终止液（10% H2SO4，v/v）终止反应，用酶标仪测定450 nm处的吸收值。选取OD450大于阴性3倍的噬菌体克隆为阳性克隆。
选取OD450大于阴性3倍的噬菌体克隆为阳性克隆进行阳性纳米抗体的鉴定。加入效价组：50 µL经间接ELISA鉴定为阳性克隆的上清液和50 µL的PBS；抑制组：50 µL经间接ELISA鉴定为阳性克隆的上清液和50 µL的玉米赤霉烯酮/玉米赤霉醇标准品（浓度为1 µg/mL），37℃孵育40 min，用PBST（0.01M PBS，0.06%Tween-20（v/v））洗板五次，拍干孔内液体，加入1:5000稀释HRP标记的抗VHH二抗100 µL，37℃孵育30 min，用PBST（0.01M PBS，0.06%Tween-20（v/v））洗板五次，拍干孔内液体，加入100 µLTMB底物液，37℃避光显色10 min，加入50 µL终止液（10%H2SO4，v/v）终止反应，用酶标仪测定450 nm处的吸收值。
选取在板1中OD值大于阴性对照孔3倍，且具有明显抑制的克隆，记录其为Nbzel-338菌株，并将母板中对应孔的菌液转移到无菌离心管中，加入甘油冻存备用。
实施例3 纳米抗体Nbzel-338编码基因的测序及其氨基酸序列的确定
1、实验方法
将经过间接竞争ELISA鉴定获得的纳米抗体Nbzel-338的菌株送到测序公司进行测序，获得纳米抗体Nbzel-338的核苷酸序列；根据DNA测序结果及密码子表，获得纳米抗体Nbzel-338的氨基酸序列。
2、实验结果
纳米抗体Nbzel-338的VHH的氨基酸序列如下（SEQ ID No.1）所示：
QLQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKERELVAGVSIRDGRIYYADSVKGRFTISRDNGKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCNAPKGSYSDSYYYTRILNNDYWGQGTQVTVSSEPKTPKPQDGQAG。
纳米抗体Nbzel-338的氨基酸编号及结构域示意图如图1所示，由图可以看出，所述纳米抗体Nbzel-338包括4个框架区（Framework region，FR）和3个互补决定区（Complementarity-determiningregion，CDR）。4个框架区和3个互补决定区的排列顺序依次为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
其中，第1～25位氨基酸序列为FR1，其氨基酸序列为QLQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS（SEQ ID No.2）；第26～33位氨基酸序列为CDR1，其氨基酸序列为GSIFSINA（SEQ ID No.6）；第34～50位氨基酸序列为FR2，其氨基酸序列为MGWYRQAPGKERELVAG（SEQ ID No.3）；第51～58位氨基酸序列为CDR2，其氨基酸序列为VSIRDGRI（SEQ ID No.7）；第59～96位氨基酸序列为FR3，其氨基酸序列YYADSVKGRFTISRDNGKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYC（SEQ ID No.4）；第97～117位氨基酸序列为CDR3，其氨基酸序列为NAPKGSYSDSYYYTRILNNDY（SEQ ID No.8）；第118～141位氨基酸序列为FR4，其氨基酸序列为WGQGTQVTVSSEPKTPKPQDGQAG（SEQ ID No.5）。
纳米抗体Nbzel-338的核苷酸序列如下（SEQ ID No.9）所示：
cagttgcagctcgtggagtctgggggaggcttggtgcaacctggggggtctctgagactctcctgtgcagcctctggaagcatcttcagtatcaatgccatgggctggtaccgccaggctccagggaaggagcgcgagttggtcgcaggtgttagtattcgtgatggtaggatatactatgcagactctgtgaagggccgattcaccatctccagagacaatggcaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacacggccatgtattactgtaacgcacccaaggggagttatagcgatagttactactacacgaggattctcaataatgactactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctcagaacccaagacaccaaaaccacaagacggccaggccggc。
实施例4 纳米抗体Nbzel-338的大量制备
本发明以蛋白表达的形式大量制备纳米抗体Nbzel-338，具体方法为：
用试剂盒提取纳米抗体Nbzel-338菌株的质粒，将质粒用化学转化的方法转入E.coliBL21（DE3）中。从转化平板上挑一单菌落接种于10 mL LB（含Amp）培养基中，37℃，250 rpm培养过夜。将过夜培养物按1：100的比例接种于750 mL LB（Amp）培养基中，37℃，250 rpm培养至OD600nm约为0.4～0.6时，加入IPTG（1:1000比例，v/v），37℃，250 rpm培养过夜。第二天4℃，12000 rpm离心5 min，收集菌体沉淀，用蔗糖渗透压冻融法，12000 rpm离心10 min，取上清，将上清进行亲和层析纯化，即得表达的特异性纳米抗体Nbzel-338。
实施例5 利用纳米抗体Nbzel-338检测玉米赤霉烯酮和/或玉米赤霉醇
1、包被及封闭
用包被液将ZEL-A-ConA包被原稀释至1 μg/mL，37℃包被过夜。第二天用PBST（0.01MPBS，0.05％Tween-20（v/v））洗板两次后，加入1%鱼胶蛋白溶液，每孔120 μL，37℃封闭3 h，弃封闭液，37℃烘干1 h，用密封袋装于4℃待用。
2、检测玉米赤霉烯酮和/或玉米赤霉醇
（1）实验方法
用包被液将ZEL-A-ConA包被原稀释至1 μg/mL，37℃包被过夜。第二天用PBST（0.01M PBS，0.05%Tween-20（v/v））洗板两次后，加入120 μL/孔2%的脱脂奶粉溶液，37℃封闭3 h，弃封闭液，37℃烘干1 h。每孔加入50 μL纳米抗体和一系列不同浓度的50 μL的玉米赤霉烯酮标准品（或玉米赤霉醇标准品），37℃条件下孵育40 min，用PBST洗板五次，拍干孔内液体，加入1:5000稀释的HRP标记的抗VHH二抗100 μL，37℃孵育30 min，用PBST洗板五次，拍干孔内液体，加入100 μL TMB底物液，37℃避光显色10 min；加入50 μL的终止液（10%H2SO4，v/v）终止反应；用酶标仪读取450 nm处的吸收值。以玉米赤霉烯酮和玉米赤霉醇标准品的浓度为横坐标，B/B0（玉米赤霉烯酮和玉米赤霉醇）的孔的OD450/未加入玉米赤霉烯酮和玉米赤霉醇的孔的OD450为纵坐标，建立间接竞争标准曲线。
（2）实验结果
基于纳米抗体Nbzel-338建立的间接竞争ELISA标准曲线图如图3所示，由图可以看出，标准曲线呈S型，线性相关性较好，针对玉米赤霉烯酮和玉米赤霉醇的半数抑制（IC50）分别为1.35和2.53 ng/mL，线性范围分别为0.26～19.07ng/mL和0.56～39.36ng/mL，最低检测限（LOD）分别为0.09和0.20 ng/mL。
实施例6 纳米抗体Nbzel-338的有机耐受性分析
（1）实验方法
用不同浓度（10%、20%、30%、40%、50%）的甲醇与PBS的混合液，和不同浓度（10%、20%、30%、40%、50%）的丙酮作为稀释液，将纳米抗体Nbzel-338稀释至同一工作浓度，以测定抗体与抗原的结合能力，未加有机溶剂稀释液稀释的抗体与抗原结合能力作为100%，评价纳米抗体对甲醇耐受能力。具体方法为：
将50 µL的稀释好的纳米抗体Nbzel-338和50 µL的PBS加入到已包好的酶标板中，37℃孵育40 min，用PBST（0.01M PBS，0.06%Tween-20（v/v））洗板五次，拍干孔内液体，加入1:5000稀释HRP标记的抗VHH二抗100 µL，37℃孵育30 min，用PBST（0.01M PBS，0.06%Tween-20（v/v））洗板五次，拍干孔内液体，加入100 µLTMB底物液，37℃避光显色10 min；加入50 µL终止液（10％H2SO4，v/v）终止反应；用酶标仪读取450 nm处的吸收值。
（2）实验结果
不同比例有机溶剂/PBS作为稀释液时，纳米抗体Nbzel-338的活性曲线图如图4所示，由图可以看出，随着有机浓度的提高，纳米抗体Nbzel-338的活性逐渐下降，但30%的甲醇/PBS溶液下，仍具有75%以上的活性，在30%的丙酮/PBS下仍具有80%以上的活性，表明该纳米抗体Nbzel-338具有良好的甲醇和丙酮耐受性，在实际样品检测的前处理过程中，可以添加30%以下的中浓度甲醇/丙酮溶液。
实施例7 纳米抗体在不同pH条件下的活性测定
（1）实验方法
用不同pH值（1.4，2.4，3.4，4.4，5.4，6.4，7.4，8.4，9.4，10.4，11.4）的0.01M PBS作为抗体稀释液。将纳米抗体Nbzel-338稀释至同一工作浓度，以测定抗体与抗原的结合能力，未加有机溶剂稀释液稀释的抗体与抗原结合能力作为100%，评价纳米抗体对甲醇耐受能力。具体方法为：
将50 µL的稀释好的纳米抗体Nbzel-338和50 µL的PBS加入到已包好的酶标板中，37℃孵育40 min，用PBST（0.01M PBS，0.06%Tween-20（v/v））洗板五次，拍干孔内液体，加入1:5000稀释HRP标记的抗VHH二抗100 µL，37℃孵育30 min，用PBST（0.01M PBS，0.06%Tween-20（v/v））洗板五次，拍干孔内液体，加入100 µLTMB底物液，37℃避光显色10 min；加入50 µL终止液（10% H2SO4，v/v）终止反应；用酶标仪读取450 nm处的吸收值。
（2）实验结果
测定结果如图5所示，由图可以看出，在pH 2.4～10.4范围内，纳米抗体Nbzel-338的结合活性有所提升，在pH=5.5，结合活性提高至250%。在强碱性pH=11.4和pH=1.4，活性接近失活，结果表明纳米抗体Nbzel-338具有良好的耐酸和耐弱碱性，纳米抗体Nbzel-338更适合在酸性与弱碱性环境下工作。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1. 一种抗玉米赤霉烯酮和玉米赤霉醇的纳米抗体，其特征在于，所述抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2. 一种编码权利要求1所述纳米抗体的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。
3.一种重组载体，其特征在于，含有权利要求2所述基因。
4.一种重组细胞，其特征在于，含有权利要求3所述重组载体。
5.权利要求1所述纳米抗体在检测玉米赤霉烯酮及玉米赤霉醇中的应用。
6.权利要求1所述纳米抗体、权利要求2所述基因、权利要求3所述重组载体或权利要求4所述重组细胞在制备检测玉米赤霉烯酮及玉米赤霉醇产品中的应用。
7.一种用于检测玉米赤霉烯酮及玉米赤霉醇的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述纳米抗体。
8.一种检测玉米赤霉烯酮和玉米赤霉醇的方法，其特征在于，用玉米赤霉烯酮半抗原与载体蛋白偶联得到的完全抗原做包被原，用权利要求1所述纳米抗体作为检测抗体进行检测。
9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述玉米赤霉烯酮半抗原的结构式如式（I）所示：。
10.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述载体蛋白为刀豆球蛋白A。
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