CN103582651A - 识别人类乳突病毒(hpv)l2蛋白质的单克隆抗体及使用其的测定hpv中和抗体的效价的方法 - Google Patents

识别人类乳突病毒(hpv)l2蛋白质的单克隆抗体及使用其的测定hpv中和抗体的效价的方法 Download PDF

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Abstract

本发明系有关对于多种高危险型HPV等具有结合活性的单克隆抗体的开发。本发明亦提供简单又高通量的测定交叉中和抗体效价的方法，其可用于分析实验对象血清样品中抗HPV的交叉中和抗体等。本发明测定交叉中和抗体效价的方法包含：制备对抗具有高危险型HPV共同特异性氨基酸序列的肽的单克隆抗体，及使用此单克隆抗体分析交叉中和抗体等步骤。

Description

识别人类乳突病毒(HPV)L2蛋白质的单克隆抗体及使用其的测定HPV中和抗体的效价的方法
技术领域
本发明涉及识别HPV L2蛋白质的单克隆抗体及使用该单克隆抗体测定交叉中和抗体的抗体效价的方法。
现有技术
HPV具有超过100种基因型。感染黏膜上皮(黏膜HPV)的基因型中，至少有15种(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68与73等高危险型)系子宫颈癌的原因。
HPV颗粒具有20面体壳体结构，系由L1蛋白质的72个五聚物(壳粒)与L2蛋白质的12个分子组成，其内装入DNA基因体。于利用重组DNA技术大量单独表达L1蛋白质时，形成类壳体结构(L1-壳体)。于与L2蛋白质共表达时，形成与病毒颗粒相同组成的壳体(L1/L2-壳体)。L1-壳体具有强免疫原性，于接种于动物时，显示不需任何佐剂即诱发抗体生成及诱发细胞免疫性。此免疫原性对HPV的类型具特异性，以第16型L1-壳体免疫处理时，诱发针对第16型具特异性的反应。
L1-壳体作为疫苗抗原用时，可预防HPV感染。含HPV第6、11、16与18型的L1-壳体或以HPV第16与18型作为抗原的疫苗已于国外开发，亦于日本上市。然而，彼等第一代疫苗抗原具高度类型特异性，例如，第16型L1-壳体疫苗仅能预防HPV第16型的感染。因此，有需要开发一种疫苗抗原，其诱发诸高危险型共同的中和抗体。
本发明人等先前已发现，HPV第16型的L2蛋白质含有类型共同中和抗原决定部位，并已证实彼等抗原决定部位可作为第二代类型共同HPV疫苗抗原的用(非专利文件1、非专利文件2、非专利文件3、非专利文件4)。
尤其，于所有高危险型HPV中，HPV16L2蛋白质的氨基酸56至75氨基酸序列为高保守，以与钥孔血蓝蛋白(KLH)接合的形式(KLH-P56/75)，或以由插入第16型L1蛋白质氨基酸430至433内的携带此区域的嵌合蛋白质组成的嵌合壳体[16L1-430(56/75)嵌合壳体]的形式接种于动物时，此区域可诱发有效对抗广泛类型的交叉中和抗体(专利文件1、非专利文件3、与非专利文件4)。由彼等发现显示，具有L2蛋白质的氨基酸56至75氨基酸序列的抗原，系作为第二代HPV疫苗用以有效对抗所有高危险型HPV的大有可为候选者，其实际应用目前正在开发中。
[现有技术文献]
[专利文献]
专利文件1：WO2009/001867
[非专利文献]
非专利文献1：Kawana K,et al.：Common neutralization epitope inminor capsid protein L2of human papillomavirus types16and6.J.Virology,73,6188-6190,1999
非专利文献2：Kawana K,et al.,：Safety and immunogenicity of apeptide containing the cross-neutralization epitope of HPV16L2administered nasally in healthy volunteers.Vaccine,21：4256-4260,2003
非专利文献3：Kondo K,et al.,：Neutralization of HPV16,18,31,and58pseudovirons with antisera induced by immunizing rabbitswith synthetic peptides representing segments of the HPV16minorcapsid protein L2surface region.Virology,358：266-272,2007
非专利文献4：Kondo K,et al.,Modification of humanpapillomavirus-like particle vaccine by insertion of thecross-reactive L2-epitopes.J.Med.Virol.,80：841-846,2008
发明内容
（发明要解决的课题）
为了实际使用包含L2蛋白质的氨基酸56至75氨基酸序列的抗原作为第二代HPV疫苗，需要研究此抗原是否于人体中有效地诱发交叉中和抗体。特别是于临床试验中，由于得自实验对象的许多血清样品必须测定，因此需要一种简单又高通量的方法以测定交叉中和抗体效价。
由于没有允许HPV增殖的培养细胞株，因而使用一种感染性假病毒(其通过将报导基因的表达质粒装入HPV L1/L2-壳体而得到)监测HPV感染。利用测定抑制此感染性假病毒的感染能力，检测抗HPV的中和抗体。然而，此方法无法区分基因型-特异性中和抗体(亦即，对抗各HPV L1蛋白质的抗体)的感染抑制及交叉中和抗体(亦即，对抗HPV型共同L2蛋白质的抗体)的感染抑制，且因需要大量精力及时间，亦不适用于许多分析物的检测。
于此等情况下，有需要开发一种高通量方法，以测定由第二代HPV疫苗诱发的交叉中和抗体的抗体效价。
（解决课题的方法）
本发明人等已制备一种针对具有高危险型HPV的L2蛋白质共同的特定氨基酸序列的肽的单克隆抗体，并已发现使用此单克隆抗体检测由第二代HPV疫苗诱发的交叉中和抗体的方法；此发现导致完成本发明。
亦即，本发明提供以下所示的抗HPV L2蛋白质单克隆抗体、使用上述单克隆抗体检测或诊断交叉中和抗体的方法、分析试剂盒、包含上述单克隆抗体的诊断试剂或医药品、以及产生上述单克隆抗体的细胞等。
[1]一种单克隆抗体，其识别人类乳突病毒L2蛋白质的共同抗原决定部位。
[2]根据上述[1]的单克隆抗体，其中，人类乳突病毒L2蛋白质的该共同抗原决定部位由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：24或SEQ ID NO：25所示氨基酸序列组成。
[3]根据上述[1]的单克隆抗体，其中，人类乳突病毒L2蛋白质的该共同抗原决定部位由SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示氨基酸序列组成。
[4]根据上述[1]的单克隆抗体，其包含SEQ ID NO：11(CDRH1)、SEQ ID NO：12(CDRH2)、SEQ ID NO：13(CDRH3)、SEQ ID NO：14(CDRL1)、SEQ ID NO：15(CDRL2)及SEQ ID NO：16(CDRL3)所示氨基酸序列。
[5]根据上述[1]的单克隆抗体，其包含SEQ ID NO：17(CDRH1)、SEQ ID NO：18(CDRH2)、SEQ ID NO：19(CDRH3)、SEQ ID NO：20(CDRL1)、SEQ ID NO：21(CDRL2)及SEQ ID NO：22(CDRL3)所示氨基酸序列。
[6]根据上述[1]的单克隆抗体，其重链可变区系SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，而其轻链可变区系SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。
[7]根据上述[1]的单克隆抗体，其重链可变区系SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列，而其轻链可变区系SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列。
[8]根据上述[6]的单克隆抗体，其识别人类乳突病毒L2蛋白质，且由保藏号FERM BP-11304的杂交瘤细胞株产生。
[9]根据上述[7]的单克隆抗体，其识别人类乳突病毒L2蛋白质，且由保藏号FERM BP-11305的杂交瘤细胞株产生。
[10]一种测定人类乳突病毒(HPV)的交叉中和抗体的抗体效价的方法，该方法包括下述步骤：
(a)使测试样品与HPV抗原接触，使该样品中的抗体与该抗原结合的步骤；及
(b)添加根据权利要求1所述的单克隆抗体至步骤(a)的反应体系中，测定结合于该抗原的该单克隆抗体的量的步骤。
[11]一种测定人类乳突病毒(HPV)的交叉中和抗体的抗体效价的方法，该方法包括下述步骤：
(a)使测试样品与HPV抗原接触，使该样品中的抗体与该抗原结合的步骤；及
(b)使步骤(a)中未与抗体结合的剩余的抗原决定部位与权利要求1所述的单克隆抗体接触，测定结合于该抗原决定部位的该单克隆抗体的量。
[12]一种测定人类乳突病毒(HPV)的交叉中和抗体的抗体效价的方法，该方法包括下述步骤：
(a)使权利要求1所述的单克隆抗体与测试样品混合后，与HPV抗原接触，形成抗体/抗原复合物；及
(b)测定步骤(a)所得抗体/抗原复合物中的、形成了抗体/抗原复合物的该单克隆抗体的量。
[13][10]或[11]所述的方法，其中，使结合于抗原的该单克隆抗体或与该抗原决定部位接触并结合的单克隆抗体，与识别该单克隆抗体的标记第二抗体接触，通过在测试样品存在及不存在下测定由该标记第二抗体产生的信号的强度，测定该测试样品中能够存在的交叉中和抗体的抗体效价。
[14-1]根据上述[12]的方法，其中，使步骤(a)中形成的单克隆抗体与抗原的复合物与识别该单克隆抗体的标记第二抗体接触，通过测定添加测试样品前后的由该标记第二抗体产生的信号强度，从而测定该测试样品中能够存在的交叉中和抗体的抗体效价。
[14-2]根据上述[12]的方法，其中，使步骤(a)中形成的单克隆抗体与抗原的复合物与识别该单克隆抗体的标记第二抗体接触通过测试样品存在及不存在下测定由标记第二抗体产生的信号强度，从而测定测试样品中能够存在的交叉中和抗体的抗体效价。
[15]根据上述[10]至[14-2]中任一项的方法，其中，该HPV抗原固定于固体支撑物。
[16]一种用于测定测试样品中的HPV交叉中和抗体存在的试剂盒，其包含(a)固定于固体支撑物的HPV抗原，(b)根据上述[1]的单克隆抗体，及(c)识别根据上述[1]的单克隆抗体的标记第二抗体。
[17]一种HPV感染的诊断试剂，其包含根据上述[1]的单克隆抗体。
[18]一种细胞株，其产生根据上述[1]的单克隆抗体。
[19]根据上述[18]的细胞株，其保藏号为FERM BP-11304或FERM BP-11305。
[20]一种医药品，其包含根据上述[1]的单克隆抗体。
[21]一种HPV治疗剂，其包含根据上述[1]的单克隆抗体。
（发明的效果）
根据本发明，本发明单克隆抗体与HPV抗原间的结合可由与样品的竞争抑制程度测定，从而得知样品中交叉中和抗体的水平。由于使用ELISA，本发明方法因此迅速又简单，且容许高通量测定临床试验中得自实验对象的许多血清样品中的交叉中和抗体效价。再者，本发明的单克隆抗体亦可用于诊断HPV感染或作为HPV感染的治疗剂用。
附图说明
图1显示利用ELISA的抗原决定部位图谱定位结果。
图2显示P56/75由单克隆抗体13B及24B识别的抗原决定部位，以及高危险型HPV间保守的氨基酸序列区。
图3显示利用单克隆抗体13B及24B的第16型及58型假病毒的中和。
图4显示单克隆抗体13B及24B与高危险型L1/L2-壳体的结合。
图5显示如何使用单克隆抗体13B及24B以ELISA测定交叉中和抗体效价。
图6显示经KLH-接合肽或嵌合壳体免疫处理的兔子中诱发的交叉中和抗体。
图7显示单克隆抗体13B及24B中重链及轻链可变区的氨基酸序列，以及其互补决定区(CDRs)。
图8显示利用ELISA的抗原决定部位图谱定位结果。
图9显示P56/75中被单克隆抗体13B及24B识别的抗原决定部位，以及高危险型HPV间保守的氨基酸序列区。
图10显示利用单克隆抗体13B及24B的第16、18、31、33、35、51、52及58型假病毒的中和。
图11显示单克隆抗体13B及24B与高危险型L1/L2-壳体的结合。
发明的具体实施方式
下文将说明如何制备识别HPV L2蛋白质单克隆抗体(下文亦称为本发明单克隆抗体)的抗原，及如何制备此类单克隆抗体。
人类乳突病毒具有L1及L2两个结构基因，其产物具有如同壳体蛋白质的功能。
“人类乳突病毒L2蛋白质”一词意指由人类乳突病毒(HPV)的L2基因编码的蛋白质(Zhou J et al.,Expression of vacciniarecombinant HPV16L1and L2ORF proteins in epithelial cells issufficient for assembly of HPV virion-like particles.Virology.185：251-257,1991)。
用于本发明的HPV L2蛋白质或L2肽可为，例如，由GGLGIGTGSGTGGRTGYIPL(SEQ ID NO：1)所示的蛋白质(多肽)或其衍生物。
具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的多肽衍生物的实例包括(1)由上述氨基酸序列中删除1或多个[较佳为约1至10个，更佳为数个(1至9或1至5个)，又更佳为1、2或3个]氨基酸构成者；(2)于上述氨基酸序列中添加1或多个[较佳为约1至20个，更佳为约1至10个，又更佳为数个(1至9个)，尚又更佳为1、2或3个]氨基酸构成者；(3)于上述氨基酸序列中插入1或多个[较佳为约1至20个，更佳为约1至10个，又更佳为数个(1至9个)，尚又更佳为1、2或3个]氨基酸构成者；或(4)于上述氨基酸序列中取代1或多个[较佳为约1至10个，更佳为数个(1至9或1至5个)，又更佳为1、2或3个]其他氨基酸构成者；或(5)其任何组合。
应注意的是，本文使用的蛋白质(多肽)标记法中，依照标准用法及惯例，左侧方向为N端(氨基端)方向，右侧方向为C端(羧基端)方向。
本发明使用的蛋白质于C末端可具有选自羧基、羧酸酯基、酰胺基基或酯的任何基团。
本文所用的“抗体”一词意指能识别或与作为抗原的HPV L2蛋白质结合的整个抗体分子或其片段；其可为多克隆或单克隆。
本文所用的“单克隆抗体”一词系指得自单一类型抗体产生细胞的抗体分子。“单克隆抗体”一词涵盖单克隆抗体分子本身或其片段。
上述抗体或单克隆抗体的“片段”系指全长抗体的一部分，通常包含抗原结合区或可变区的部分；举例而言，抗体片段包括Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段；其他片段包括双功能抗体(diabodies)、线性抗体、单链抗体分子、及由抗体片段组成的多重特异性抗体。
本发明方法中所用的较佳单克隆抗体为IgG1或IgG2抗体，其包含源自小鼠的轻链与重链可变区，及源自小鼠的γ1重链与κ轻链恒定区。
此外，如后文所述，作为医药品用者较佳为部分或完全人源化或为嵌合的单克隆抗体。
本文所用的“共同抗原决定部位”一词意指HPV L2蛋白质氨基酸序列内的区域，其于高危险型HPV间为高保守，及可被本发明单克隆抗体识别；其实例为氨基酸序列GTGGRTGYIPL(SEQ IDNO：2)、GGLGIGTGSGTGGR(SEQ ID NO：3)、SGTGGRTGYI(SEQID NO：24)或LGIGTGSGTG(SEQ ID NO：25)或氨基酸序列GTGGRTGYIPL(SEQ ID NO：2)或GGLGIGTGSGTGGR(SEQ IDNO：3)，或其突变序列。
具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：24与SEQID NO：25所示氨基酸序列的突变序列的多肽包括(1)由上述氨基酸序列中删除1至3个(或1至2个、或1个)氨基酸构成者；(2)于上述氨基酸序列中添加1至3个(或1至2个、或1个)氨基酸构成者；(3)于上述氨基酸序列中插入1至3个(或1至2个、或1个)氨基酸构成者；或(4)于上述氨基酸序列中取代1至3个(或1至2个、或1个)其他氨基酸构成者；或(5)其任何组合。
本文所用的“识别HPV L2蛋白质”一词意指特异性地结合HPVL2蛋白质，更具体而言，意指该特异性抗原-抗体反应可利用例如酶免疫测定法的免疫测定法检测。
根据本发明的识别HPV L2蛋白质的单克隆抗体可为任何型态，只要其特异性地结合HPV L2蛋白质的部分肽[较佳为SEQ IDNO：1的HPV L2肽(P56/75)]即可。此类单克隆抗体的实例包括特异性地结合具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列或其衍生物的多肽者。
根据本发明的识别HPV L2蛋白质的单克隆抗体的更具体实例，包括特异性地结合HPV L2蛋白质中的共同抗原决定部位者(较佳为SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25的肽)。
识别SEQ ID NO：2肽的单克隆抗体于本文中系指13B，而识别SEQ ID NO：3肽的单克隆抗体于本文中系指24B。13B亦涵盖识别SEQ ID NO：24肽的单克隆抗体，24B亦涵盖识别SEQ ID NO：25肽的单克隆抗体。
本文所用的“互补决定区”一词意指于可变区内的区域，其以互补方式直接与抗原结合，更具体而言系指图7所示重链或轻链的三个区域(CDRH1、CDRH2及CDRH3，或CDRL1、CDRL2及CDRL3)。
较佳的单克隆抗体为单克隆抗体13B或24B，其互补决定区(CDRs)具有图7所示重链及轻链的CDR1至CDR3序列。
更佳者为其重链可变区系SEQ ID NO：7所示氨基酸序列及其轻链可变区系SEQ ID NO：8所示氨基酸序列，其中SEQ ID NOs：7与8所示氨基酸序列，除其互补决定区外，可为其突变序列的单克隆抗体。此类互补决定区为例如SEQ ID NOs：11至16所示氨基酸序列的至少一者。
替代地较佳者为其重链可变区系SEQ ID NO：9所示氨基酸序列及其轻链可变区系SEQ ID NO：10所示氨基酸序列，其中SEQ IDNOs：9与10所示氨基酸序列，除其互补决定区外，可为其突变序列的单克隆抗体。此类互补决定区为例如SEQ ID NOs：17至22所示氨基酸序列的至少一者。
除其互补决定区外，SEQ ID NOs：7至10所示氨基酸序列的突变序列包括(1)由上述氨基酸序列中删除1或多个[较佳为约1至10个，更佳为数个(1至9或1至5个)，又更佳为1、2或3个]氨基酸构成者；(2)于上述氨基酸序列中添加1或多个[较佳为约1至20个，更佳为约1至10个，又更佳为数个(1至9个)，尚又更佳为1、2或3个]氨基酸构成者；(3)于上述氨基酸序列中插入1或多个[较佳为约1至20个，更佳为约1至10个，又更佳为数个(1至9个)，尚又更佳为1、2或3个]氨基酸构成者；或(4)于上述氨基酸序列中取代1或多个[较佳为约1至10个，更佳为数个(1至9或1至5个)，又更佳为1、2或3个]其他氨基酸构成者；或(5)其任何组合。
恒定区的氨基酸序列可为衍生自人类或哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔、绵羊、猪、牛、猫、狗、猴子)的IgG1或IgG2抗体者。
单克隆抗体13B的实例包括由标示为小鼠-小鼠杂交瘤13B(FERM BP-11304)的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体；单克隆抗体24B的实例包括由标示为小鼠-小鼠杂交瘤24B(FERM BP-11305)的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体。
“交叉中和抗体”一词意指能中和二或多个HPV基因型的抗体，或能中和2或多个HPV基因型感染的抗体。已知HPV具有非常大量的基因型，例如第6、11、16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68与73型(参见zur Hausen H.Papillomavirusinfections--a major cause of human cancers.Biochim Biophys Acta.1288：F55-78,1996)。较佳的交叉中和抗体为能中和三或多个高危险型HPV(第16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68与73型)的抗体。更佳者为能中和第16与18型以及选自第33、52与58型的至少一或多个HPV类型的抗体。更具体而言，较佳者为能特异地结合上述高危险型HPV的L2蛋白质且能中和HPV的抗体。
“HPV抗原”一词意指于交叉中和抗体的检测中，能用以形成抗原/抗体复合物的抗原。可使用的HPV抗原可为任何基因型，只要其具有共同类型的抗原决定部位(例如，共同抗原决定部位)，例如携带L2蛋白质的壳体或假病毒。较佳者为HPV16的L1/L2嵌合壳体。再者，亦可能使用全长L2肽或其部分[例如，L2肽(56至75)]或其突变体、或与钥孔血蓝蛋白(例如，KLH-P56/75)或与BSA接合的L2肽等作为HPV抗原。
“标记第二抗体”一词意指识别本发明单克隆抗体的抗体，其系以能产生可检测信号(例如酶活性、放射性同位素、生色或发光)的物质标记。
兹于下文说明如何制备本发明单克隆抗体的抗原，以及如何制备本发明的单克隆抗体。
(1)制备抗原
任何抗原均可用以制备本发明单克隆抗体，例如具有涵盖HPVL2蛋白质氨基酸56至75序列的肽[L2肽(56至75)]，更具体而言为具有一或多个抗原决定基的(合成)肽，其与含SEQ ID NO：1所示氨基酸序列或其盐的多肽，以及由SEQ ID NO：1所示氨基酸序列或其衍生物组成的多肽(亦简称为L2肽抗原)相同。
含SEQ ID NO：1所示氨基酸序列或其盐的多肽可藉由已知方法制备，例如，根据于WO09/01867所记载的方法。此外，作为L2肽抗原用的肽亦可(1)根据肽合成的已知技术或(2)利用以适当肽酶切割含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2、3、24或25所示氨基酸序列的多肽予以制备。
肽合成技术可为固相合成技术或液相合成技术。亦即，部分肽或能构成此类肽的氨基酸与其余部分缩合，若产物具有保护基团，则消除彼等保护基团，从而可制备所需肽。缩合及消除保护基团的已知程序可于下述文件中找到，例如：
(i)M.Bodanszky and M.A.Ondetti,Peptide Synthesis,IntersciencePublishers,New York(1966)；及
(ii)Schroeder and Luebke,The Peptide,Academic Press,NewYork(1965)。
反应后，可利用标准纯化程序(例如组合使用溶剂萃取法、蒸馏、管柱层析法、液体层析法及再结晶)纯化及单离该肽。若如此得到的肽呈游离型，则可藉由已知方法将其转化为适当盐类型；相反地，若得到的肽呈盐类型，则可藉由已知方法将其转化为游离型。
酰胺型的肽可使用适于形成酰胺的市售可得肽合成树脂予以合成。此类树脂的实例包括氯甲基树脂、羟甲基树脂、二苯甲胺树脂、胺甲基树脂、4-苄氧基苄醇树脂、4-甲基二苯甲胺树脂、PAM树脂、4-羟甲基甲苯酰胺甲基树脂、聚丙烯酰胺树脂、4-(2',4'-二甲氧苯基-羟甲基)苯氧树脂、4-(2',4'-二甲氧苯基-茀甲氧羰酰(Fmoc)胺乙基)苯氧树脂等。使用此类树脂，根据各种已知缩合技术，使其α-氨基及侧链(各)官能基经适当保护的氨基酸于树脂上与所需肽序列一致地予以缩合。反应的最后步骤中，使肽与树脂裂离，同时移除各种保护基团，从而制得所需肽。替代地，使用氯三苯甲基树脂、肟树脂、4-羟苯甲酸树脂或类似物合成及使部分经保护的肽裂离并以例行方式移除保护基团，从而可制得所需肽。
如上所述，为了缩合经保护的氨基酸，可使用可用于肽合成的各种活化试剂，特佳者为碳二亚胺类。碳二亚胺类的实例包括DCC、N,N'-二异丙基碳二亚胺、N-乙基-N'-(3-二甲胺脯胺酰基)碳二亚胺等。欲以彼等试剂活化，可使经保护的氨基酸与抑制消旋反应添加剂(例如，HOBt、HOOBt)一同直接添加于树脂，或可于添加至树脂的前，经活化成为对称酸酐类或HOBt酯类或HOOBt酯类。用于活化经保护的氨基酸或其与树脂缩合反应的溶剂可从已知可用于肽缩合反应的溶剂间适当选定；其实例包括酰胺类(例如，N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯啶酮)、卤化烃(例如，二氯甲烷、氯仿)、醇类(例如，三氟乙醇)、亚砜类(例如，二甲亚砜)、三级胺(例如，吡啶)、醚类(例如，二　烷、四氢呋喃)、腈类(例如，乙腈、丙腈)、酯类(例如，乙酸甲酯、乙酸乙酯)或其适当混合物。反应温度可从已知用于肽键形成反应的范围适当选定，通常从约-20℃至约50℃的范围适当选定。通常使用约1.5倍至约4倍过量的活化氨基酸衍生物。经茚三酮反应测试，若缩合不够，则可于未消除保护基团下，重复缩合反应而确保充分缩合。若连重复反应也未达成充分缩合，则可藉由乙酸酐或乙酰咪唑使未反应的氨基酸乙酰化，从而防止对其后反应的任何影响。
起始氨基酸中，氨基保护基的实例可为苄氧基羰基、叔丁氧基羰基、叔戊氧基羰基、异莰氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、2-氯-苄氧基羰基、2-溴-苄氧基羰基、金刚烷氧基羰基、三氟乙酰基、酞酰基、甲酰基、2-硝基苯基亚磺基、二苯基膦噻吩甲酰基、N-9-茀甲氧基羰基等。羧基保护基的实例可为C1-6烷基、C3-8环烷基、C7-14芳烷基、2-金刚烷基、4-硝基苄基、4-甲氧基苄基、4-氯苄基、苯甲酰基甲基与苄氧基羰酰肼基、叔丁氧基羰基酰肼基、三苯甲基酰肼基等。
丝氨酸与苏氨酸中的羟基，举例而言，可利用酯化或醚化予以保护。于此情形下，适用于酯化的基团实例包括低级(C1-6)烷酰基(例如，乙酰基)、芳酰基(例如，苄酰基)、碳酸衍生的基团(例如，苄氧基羰基、乙氧基羰基)等。同样地，适用于醚化的基团实例包括苄基、四氢吡喃基、叔丁基等。
酪氨酸中的酚羟基的保护基实例包括苄基、氯-苄基、2-硝基苄基、溴-苄氧基羰基、叔丁基等。
组氨酸中的咪唑的保护基实例包括对甲苯磺酰基、4-甲氧基-2,3,6-三甲苯磺酰基、二硝基酚基、苄氧基甲基、叔丁氧基甲基、叔丁氧基羰基、三苯甲基、N-9-茀甲氧基羰基等。
起始物质中活化型羧基的实例为对应的酸酐类、迭氮化物、活化酯类[带有醇的酯类(例如，五氯酚、2,4,5-三氯酚、2,4-二硝基酚、氰甲醇、对硝基酚、HONB、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基酞酰亚胺、HOBt)]等。起始物质中活化型氨基的实例为对应的磷酰胺类。
移除(消除)保护基团的技术包括，例如，催化剂(例如，Pd-黑或Pd-碳)存在下，于氢气流中的催化还原；以无水氟化氢、甲磺酸、三氟甲磺酸、三氟乙酸或其混合物等酸处理；以二异丙基乙胺、三乙胺、哌啶、哌嗪等碱处理，以及于液态氨中以钠还原。利用上述酸处理的消除反应通常于温度-20℃至40℃进行，并添加对酸处理有效的阳离子捕获剂(例如，苯甲醚、酚、苯甲硫醚、间甲酚、对甲酚、二甲硫醚、1,4-丁二硫醇,1,2-乙二硫醇)。同样地，于组氨酸中作为咪唑保护基用的2,4-二硝基苯基可藉由硫酚处理而移除，色氨酸中作为吲哚保护基用的甲酰基不仅可如上述，于1,2-乙烷二硫醇或1,4-丁烷二硫醇存在下，经由酸处理脱保护，惟亦可以稀释氢氧化钠、稀释氨水等碱处理予以移除。
起始物质中，不应涉及反应的官能基的保护与保护基，以及保护基的消除与涉及反应的官能基的活化，可从已知基团或已知方法中适当选定。
获得酰胺型肽的另一技术如下。首先，使羧基端氨基酸的α-羧基酰胺化，接着从氨基侧使肽链延伸至所需链长，随后自此肽链利用只移除N末端α-氨基上的保护基制备一肽，及利用只移除C端羧基上的保护基制备一肽(或氨基酸)，如上述，于混合溶剂中使此二肽进一步缩合。此缩合反应的细节如上述。将利用缩合反应制得的经保护的肽纯化后，以上述方法移除所有保护基，制得所需的粗制肽。充分利用各种已知纯化技术纯化此粗制肽，将其主要溶离份冷冻干燥，从而可制得酰胺型的所需肽。
欲获得酯型肽时，使羧基端氨基酸的α-羧基与所需醇缩合，得到氨基酸酯，随后重复用以获得酰胺型肽的相同程序，从而可制得酯型的所需肽。
L2肽抗原可直接用于免疫处理。替代地，L2肽抗原亦可接合或吸附至适当载剂上以用于免疫处理。该载剂可为任何类型，且只要对抗接合或吸附于该载剂上的L2肽抗原的单克隆抗体可有效被诱发，则可以任何比率与L2肽抗原(半抗原)混合以供接合或吸附。一般而言，可使用每半抗原0.1至100重量比的常被用于制备对抗半抗原的单克隆抗体的天然或合成的聚合载剂以供接合或吸附。可供使用的天然聚合载剂实例包括哺乳动物血清白蛋白(例如牛、兔或人类血清白蛋白)、哺乳动物甲状腺球蛋白(例如牛或兔甲状腺球蛋白)、哺乳动物血红素(例如牛、兔、人类或绵羊血红素)、钥孔血蓝蛋白等。可供使用的合成聚合载剂实例包括聚合物或共聚物的各种乳胶，例如聚氨基酸类、聚苯乙烯类、聚丙烯酸类(polyacryls)、聚乙烯类、聚丙烯类等。
此外，各种缩合剂可用于半抗原与载剂间的偶合。便于使用的缩合剂实例包括容许酪氨酸、组氨酸或色氨酸交联的重氮化合物(例如，双重氮联苯胺)；容许氨基酸间的交联的二醛化合物(例如，戊二醛)；二异氰酸酯化合物(例如，甲苯-2,4-二异氰酸酯)；容许硫醇基间的交联的二马来亚酰胺化合物(例如，N,N'-邻伸苯基二马来亚酰胺)；容许氨基与硫醇基间的交联的马来亚酰胺活化酯化合物；容许氨基与羧基间的交联的碳二亚胺化合物等。此外，关于氨基间的交联，其中一氨基可与具有二硫吡啶基[例如，3-(2-吡啶基二硫)丙酸N-琥珀酰亚氨基(SPDP)]的活化酯试剂反应，然后还原从而引入硫醇基，而另一氨基可以马来亚酰胺活化酯试剂处理以引入马来亚酰胺基基，随后使此二氨基反应。
于本发明单克隆抗体的制备中，如上述的L2肽抗原较佳为与KLH(钥孔血蓝蛋白)接合。应注意的是，KLH与L2肽抗原间较佳的复合物系于N末端具附加的半胱氨酸残基，以避免肽区遭此KLH遮盖。
(2)制备单克隆抗体
利用例如腹膜内输注、静脉内输注、皮内注射、皮下注射或其他施用模式，单独或与载剂或稀释剂组合下，施用L2肽抗原至温血动物可能产生抗体的部位。欲增强抗体产生力，于施用抗原期间，可施用弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂。通常系每2至6周重复施用一次，总共二至10次。温血动物的实例包括猴子、兔、狗、天竺鼠、小鼠、大鼠、绵羊、山羊、鸡等，于单克隆抗体制备中，较佳为使用小鼠。
为了制备单克隆抗体，于以L2肽抗原免疫处理的温血动物(例如小鼠)中，挑选显现抗体效价者，并于最后免疫处理2至5天后，摘取其脾脏或淋巴结。可使彼等脾脏或淋巴结中所含抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合，从而制备产生本发明单克隆抗体的杂交瘤(下文中亦称为本发明的抗体产生杂交瘤)。
血清中的抗L2肽抗体效价，举例而言，可利用如下文后述的标记L2肽与抗血清样品反应，然后测定该标记结合于抗体分子的活性予以测定。细胞融合可藉由已知方法完成，例如，根据
Figure BDA00003422847100191
与Milstein[Nature,vol.256,page495(1975)]的方法。融合启动子的实例包括聚乙二醇(PEG)、仙台(Sendai)病毒等，较佳为使用PEG或类似物。骨髓瘤细胞的实例包括NS-1、P3U1、SP2/0、AP-1等，较佳为使用P3U1或类似物。所使用的抗体产生细胞(脾脏细胞)与骨髓瘤细胞间的较佳比率通常约1：1至20：1，以约10%至80%的浓度添加PEG(较佳为PEG1000至PEG6000)，温度通常为20℃至40℃，较佳为30℃至37℃，通常持续培养1至10分钟，从而达成有效的细胞融合。
可使用各种技术筛选本发明之抗体产生杂交瘤。例如，将杂交瘤培养上清液各自添加至含有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列之多肽或其盐或其部分肽直接或与载剂组合吸附于其上之固相(例如微量培养板)，接着添加放射性或酶性标记之抗免疫球蛋白抗体(用于细胞融合之抗体产生细胞系源自小鼠时，则使用抗小鼠免疫球蛋白抗体)或蛋白质A，以检测结合于该固相之本发明抗体。替代地，将杂交瘤培养上清液各自添加至抗免疫球蛋白抗体或蛋白质A吸附于其上之固相，接着添加放射性或酶性标记之含SEQ ID NO：1所示氨基酸序列之多肽，以检测结合于该固相之本发明单克隆抗体。于上述筛选中，亦可使用HPV16L1/L2-壳体作为抗原。本发明之单克隆抗体产生杂交瘤之筛选或育种，通常系于HAT(次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷)存在下之含10%至20%胎牛血清之动物细胞培养基(例如，RPMI1640)中完成。各杂交瘤培养上清液之抗体效价可藉由如上述测定本发明抗体于抗血清中抗体效价之相同方法测定。
本发明单克隆抗体可从本发明抗体产生杂交瘤之培养产物(例如培养上清液、培养细胞)中获得。替代地，本发明单克隆抗体亦可从以本发明抗体产生杂交瘤活体接种(例如腹膜内)非人类温血动物之体液(例如腹水、血液)中获得。如同多克隆抗体之标准分离及纯化，本发明之单克隆抗体可根据免疫球蛋白之分离及纯化技术[例如，盐析法、酒精沉淀、等电点沉淀、电泳、以离子交换剂(例如，DEAE)吸附/脱附、超速离心法、凝胶过滤法、使用仅收集单克隆抗体分子之固定化抗原之固相或活性吸附剂(例如，蛋白质A或蛋白质G)然后解离以获得单克隆抗体分子之特殊纯化技术]，从此类培养产物或体液中分离及纯化。
如上述，本发明单克隆抗体可利用于温血动物之体内或体外培养杂交瘤细胞，及从其体液或培养产物中收集单克隆抗体分子获得。
应注意的是，(a)产生与含SEQ ID NO：1所示氨基酸序列之多肽之部分区域具反应性之本发明单克隆抗体之杂交瘤，及(b)产生与上述多肽具反应性惟不与其部分区域具反应性之本发明单克隆抗体之杂交瘤，举例而言，可利用测定对应于部分区域之肽与由各杂交瘤产生之单克隆抗体间之结合进行筛选。
(3)交叉中和抗体之分析
本发明单克隆抗体提供交叉中和抗体之有效分析或检测，较佳为对抗人类乳突病毒(HPV)之交叉中和抗体抗体效价之有效分析或检测。
更具体而言，可利用下述完成分析：
方法A，其包括下述步骤：
(a)使测试样品与HPV抗原接触，以建立样品中抗体与抗原之结合；及
(b)使步骤(a)中仍未与抗体结合之剩余的抗原决定部位与本发明单克隆抗体接触，以测定结合抗原决定部位之单克隆抗体量；或
方法B，其包括下述步骤：
(a)使本发明单克隆抗体与测试样品之混合物与HPV抗原接触，以形成抗体/抗原复合物；及
(b)测定步骤(a)所得抗体/抗原复合物中，用以形成彼等复合物之本发明单克隆抗体量。
替代地，方法A可包括下述步骤：
(a)使测试样品与HPV抗原接触，以建立样品中抗体与抗原之结合；及
(b)添加本发明单克隆抗体至步骤(a)之反应系中，以测定结合于抗原之单克隆抗体量。
下文将进一步说明根据本发明之交叉中和抗体之分析。
本发明单克隆抗体可用于任何类型之分析。测试溶液中对应于交叉中和抗体量之本发明单克隆抗体量之分析，较佳为可利用化学或物理方法检测，然后从含有已知抗体量之标准溶液进行计算。
本发明方法使用根据本发明之识别HPV L2蛋白质中共同抗原决定部位之单克隆抗体，及意欲根据结合于该HPV抗原之抗体量，测定样品之抗体效价。因此，本发明方法可测定对抗HPV之识别该共同抗原决定部位之交叉中和抗体之抗体效价。
其细节如下。
于使用方法A时，为了分析测试样品中识别类型共同抗原决定部位之抗体，乃使固定量之抗原与系列稀释之样品接触，以建立样品中抗体与抗原之结合，随后添加足量之本发明单克隆抗体，以测定结合于抗原之本发明单克隆抗体量。于此情形下，足量之本发明单克隆抗体意指单克隆抗体之量等于或大于可结合于存在反应系中抗原决定部位之单克隆抗体总量；其可从用于该分析之HPV抗原量及抗体效价测定。添加于步骤(a)反应系之本发明单克隆抗体系与剩余的之抗原决定部位接触及结合。本文所用之“剩余的抗原决定部位”一词意指未与样品中之抗体分子结合之HPV抗原决定部位，或从存在反应系中之所有抗原决定部位中排除结合于样品中之抗体分子之抗原决定部位后，剩余的之HPV抗原决定部位。本发明之单克隆抗体可结合于所接触抗原决定部位中其可识别之抗原决定部位。结合于抗原之本发明单克隆抗体，可为结合于步骤(a)测试样品中未结合抗体分子之抗原分子者，或可为经由与样品中之抗体分子置换而结合于抗原分子者。结合于抗原之本发明单克隆抗体之量举例而言，可利用使识别该单克隆抗体之标记第二抗体与单克隆抗体接触(例如，与剩余的抗原决定部位接触之单克隆抗体)，及测定由该标记第二抗体产生之信号强度予以测定。此方法指示足以占据抗原决定部位(亦即结合于反应系中全部抗原决定部位)之样品最大稀释。例如，可比较测试样品存在与否间之信号强度，从而测定测试样品中可能之交叉中和抗体之抗体效价。测试样品不存在下之信号强度可利用以能作为负对照组之样品(例如，水、缓冲液、血液)置换步骤(a)之测试样品进行测定。
于使用方法B时，为了分析测试样品中识别类型共同抗原决定部位之抗体，乃使系列稀释之样品各自与固定量之本发明抗体混合，接着使各混合物与固定量抗原反应，以形成抗体/抗原复合物，随后测定结合于抗原之本发明单克隆抗体量。例如，结合于抗原之本发明单克隆抗体之量可利用使本发明单克隆抗体与抗原间形成之抗体/抗原复合物与识别该单克隆抗体之标记第二抗体接触，并测定由该标记第二抗体产生之信号强度予以测定。此方法指示经由竞争结合抑制本发明单克隆抗体结合作用(根据对抑制先行测定之参考值)之样品最大稀释。例如，可比较测试样品存在与否间或添加测试样品前后间之信号强度，从而测定测试样品中可能之交叉中和抗体之抗体效价。测试样品不存在下之信号强度可利用以能作为负对照组之样品(例如，水、缓冲液、血液)置换步骤(a)之测试样品进行测定。
本文所用之“抗体效价”一词意指抗体对其抗原之结合强度指数或样品中之抗体量指数。于本发明方法中，抗体效价可呈稀释因子予以测定。先行测定本发明单克隆抗体结合量之参考点，当样品之稀释因子达到此参考点时，可视其为样品中所含抗体之抗体效价。例如，于方法A之情形下，反应系中结合所有抗原决定部位所需之样品稀释因子，亦即，样品不再显示本发明单克隆抗体结合量之任何减少时之稀释因子，可决定为样品中所含抗体之抗体效价。同样地，于方法B之情形下，本发明单克隆抗体之结合抑制所需之样品稀释因子，亦即，样品不再显示本发明单克隆抗体结合量之任何增加时之稀释因子，可决定为样品中所含抗体之抗体效价。
较高稀释因子表示较高之抗体效价，而较低稀释因子表示较低之抗体效价。
于上述方法A中，“接触”一词意指测试样品或本发明单克隆抗体与测试样品之混合物，与HPV抗原一起置于彼等于特定条件下可反应之环境中，更具体而言，意指测试样品中之抗体或本发明单克隆抗体，与HPV抗原一起置于特定条件下该等抗体或单克隆抗体结合于HPV抗原之环境中。“接触”一词涵盖测试样品之混合或与HPV抗原之混合物、HPV抗原与测试样品之混合或混合物、HPV抗原固定化固体支撑物与测试样品之共存或混合物、将测试样品或混合物注射入固体支撑物中等。在测试样品、或单克隆抗体或其混合物与HPV抗原间接触后，测试样品中之抗体或本发明单克隆抗体即结合于HPV抗原。
(i)测试样品之制备
较佳之测试样品为人类全血或血清等。如下文所述，全血可视需要于制备为ELISA/RIA之测试样品或西方印迹法(westernblotting)之测试样品前，高速离心以移除不溶性物质。
作为ELISA/RIA之测试样品用时，举例而言，收集之血清可直接或以缓冲液适当稀释后使用。作为西方印迹法(电泳)之测试样品用时，举例而言，血清可直接或以缓冲液适当稀释后使用。于圆点/狭缝印迹法情形下，测试样品可以如上述之相同方法制备。
(ii)将HPV抗原固定于固相上
欲特异性地检测如此获得之测试样品中之交叉中和抗体，可利用免疫沉淀法、配体结合技术或类似方法使HPV抗原沉淀，然后不被固定于固相上而供检测，或替代地，HPV抗原可固定于固体支撑物上(固相)，然后供检测。关于将蛋白质固定于固相上，西方印迹法、圆点印迹法或狭缝印迹法中所用之膜包括硝化纤维素膜(例如，BioRad Laboratories产品)、尼龙膜[例如，Hybond-ECL(Amersham Pharmacia)]、棉膜[例如Blot Absorbent Filter(BioRadLaboratories)]或聚偏氟乙烯(PVDF)膜(例如BioRad Laboratories产品)等。
用以自电泳凝胶移转抗原蛋白质至薄膜之所谓印迹技术包括湿式印迹(J.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M.Shevach,W.Strober之CURRENTPROTOCOLS IN IMMUNOLOGYvolume2ed)，以及半干式印迹[参见CURRENTPROTOCOLS INIMMUNOLOGY volume2(文献同上)]。用于圆点印迹或狭缝印迹之仪器亦为市售可得[例如Bio-Dot(BioRad Laboratories)]。
另一方面，关于根据ELISA/RIA之检测或定量，系将HPV抗原或其稀释物[例如以含有0.05%迭氮化钠之磷酸盐缓冲盐液(下文中称为“PBS”)稀释者]分配至特别设计之96孔板[例如ImmunoplateMaxisorp(Nunc)]中，然后令其于4℃至室温静置隔夜或于37°C静置1至3小时，从而使HPV抗原经由吸附于孔底表面而被固定于固相上。
(4)测定交叉中和抗体之抗体效价
于此用于测定抗体效价之技术包括各种已知技术，例如放射性免疫测定法(下文称为“RIA”)、固相酶免疫测定法(下文称为“ELISA”)、萤光抗体技术、被动血球凝集等，就检测灵敏度、快速、精确度、可自动化操作等而言，以ELISA为更佳。
举例而言，根据ELISA，本发明之抗体效价测定可利用下述程序完成。首先，将纯化或部分纯化之HPV抗原吸附于例如ELISA用之96孔板固相表面上，然后于足够形成抗体/抗原复合物之条件下，与经系列稀释之测试样品(例如人类血清)中之交叉中和抗体接触一段时间。洗涤后，以根据本发明之鼠类单克隆抗体作为第一抗体接触，本发明单克隆抗体即结合于仍未与抗体结合之剩余的抗原决定部位。接着，添加酶标记之抗小鼠抗体作为第二抗体，使其结合于鼠类单克隆抗体。洗涤后，添加酶基质，测定由于基质降解之生色所诱发之吸光度变化，从而计算抗体效价。
除上述程序外，测试样品在用于测定之前，可与根据本发明之鼠类单克隆抗体混合，作为第一抗体用。
各测试样品系列稀释(例如，二或多个步骤，较佳为三或多个步骤之稀释)所得吸光度数据，可利用平行线分析用以定量各血清之交叉中和抗体效价。关于平行线分析，可使用含本发明单克隆抗体之标准溶液[参见实施例3(测试方法3)]。
用于本发明方法中之HPV抗原可为于大肠杆菌细胞或培养细胞中表达之全部或部分HPV L2蛋白质、由HPVL1及L2蛋白质组成之壳体、假病毒、或具有部分L2蛋白质序列之合成肽。
用于本发明方法之单克隆抗体可为13B、24B、或13B及24B之混合物。替代地，用于本发明方法之单克隆抗体为根据本发明之单克隆抗体；较佳为识别HPV L2蛋白质中共同抗原决定部位之单克隆抗体；更佳为包含SEQ ID NO：11(CDRH1)、SEQ ID NO：12(CDRH2)、SEQ ID NO：13(CDRH3)、SEQ ID NO：14(CDRL1)、SEQ ID NO：15(CDRL2)与SEQ ID NO：16(CDRL3)所示氨基酸序列之单克隆抗体，或包含SEQ ID NO：17(CDRH1)、SEQ ID NO：18(CDRH2)、SEQ ID NO：19(CDRH3)、SEQ ID NO：20(CDRL1)、SEQ ID NO：21(CDRL2)与SEQ ID NO：22(CDRL3)所示氨基酸序列之单克隆抗体；又更佳为其重链可变区系SEQ ID NO：7所示氨基酸序列及其轻链可变区系SEQ ID NO：8所示氨基酸序列之单克隆抗体，或其重链可变区系SEQ ID NO：9所示氨基酸序列及其轻链可变区系SEQ ID NO：10所示氨基酸序列之单克隆抗体；或尚又更佳为由杂交瘤细胞株FERM BP-11304或FERM BP-11305所产生之单克隆抗体。
如上述，本发明单克隆抗体基于其特异性而可用于交叉中和抗体之检测或分析。
(i)检测
为了用于检测，本发明单克隆抗体可直接标记或与特异地识别该抗体(识别与用以制备单克隆抗体相同动物来源之抗体)之标记第二抗体合作，作为第一抗体用。
较佳之标记类型，包括但不限于酶(碱性磷酸酶或辣根过氧化酶)或生物素(惟酶标记链霉抗生物素蛋白进一步结合于第二抗体上之生物素)。有关使用标记第二抗体(或标记链霉抗生物素蛋白)技术，预先标记抗体(或链霉抗生物素蛋白)之各种产品为市售可得。于RIA情形下，系使用例如I125放射性同位素标记之抗体，及利用液体闪烁计数器或类似仪器完成分析。
利用检测彼等酶标记之活性，测定交叉中和抗体之量(效价)。于碱性磷酸酶或辣根过氧化酶时，经由彼等酶之催化作用而引起生色或光发射之基质为市售可得。于本发明中，使用以辣根过氧化酶(HRP)标记之酶较佳。
于使用生色基质时，西方印迹法或圆点/狭缝印迹法可凭目视检测。于ELISA中，较佳为利用市售可得之微量板计读器测定各孔吸光度予以定量(测定波长随基质而不同)。
另一方面，于使用光发射基质时，利用于X光片或影像板上之自动放射摄影术，或利用拍立得相机之照相术，可藉由西方印迹法或圆点/狭缝印迹法进行检测；亦可利用密度检测法或以Molecular Imager Fx系统(BioRad Laboratories)定量等。于ELISA中使用光发射基质时，系以发射微量板计读器(例如BioRadLaboratories产品)测定酶活性。
(ii)测定操作
1)西方印迹法、圆点印迹法或狭缝印迹法
首先，为了避免单克隆抗体分子之非特异性吸附，使薄膜于含有此类非特异性吸附之抑制剂(例如，脱脂牛乳、酪蛋白、牛血清白蛋白、明胶、聚乙烯吡咯啶酮)之缓冲液中预浸渍(封阻)一段特定时间。封阻液系由例如5%脱脂牛乳与0.05%至0.1%Tween20之磷酸缓冲盐液(PBS)或tris-缓冲盐液(TBS)组成。脱脂牛乳可用Block Ace(Dainippon Pharmaceutical Co.,Ltd.,Japan)、1%至10%牛血清白蛋白、0.5%至3%明胶或1%聚乙烯吡咯啶酮等代替。封阻时间为于4℃16至24小时或于室温1至3小时。
接着，以含有0.05%至0.1%Tween20之PBS或TBS(下文中亦称为“洗涤液”)洗涤该薄膜以移除多余的封阻液，然后于以封阻液适当稀释之测试样品或本发明单克隆抗体之溶液中浸渍一段特定时间，从而使测试样品中之交叉中和抗体或单克隆抗体结合于薄膜上之抗原分子，以形成抗体/抗原复合物。可利用西方印迹法预备实验决定用于样品或单克隆抗体之稀释因子。此抗体反应操作较佳为于室温进行2小时。完成抗体反应操作后，以洗涤液洗涤薄膜；然后于上述形成之抗体/抗原复合物中，添加适当稀释之单克隆抗体或测试样品及使其结合。若使用有标记单克隆抗体，则可立即进行检测。若使用无标记单克隆抗体，则使该复合物进一步进行第二抗体反应。于使用市售可得产品作为标记第二抗体时，使用前以封阻液稀释2000倍至20000倍(根据随附说明书，若于其中找到较佳稀释因子)。洗涤去除第一抗体后，于室温使该薄膜浸渍于第二抗体溶液中45分钟至1小时，并以洗涤液洗涤，随后以适于所用标记方法之方式检测。洗涤操作举例而言可如下完成：首先于洗涤液中振荡该薄膜15分钟，置换新鲜洗涤液后继续振荡5分钟，然后以新鲜洗涤液置换后再振荡5分钟，若需要，则于洗涤操作期间可继续置换洗涤液。
2)ELISA/RIA
首先，为了避免单克隆抗体分子非特异性地吸附于HPV抗原固定板孔底表面，使用之前与西方印迹法同样地封阻该板，封阻条件如西方印迹法中所述。
接着，以含有0.05%至0.1%Tween20之PBS或TBS(下文中亦称为“洗涤液”)洗涤各孔以移除多余的封阻液，然后将以洗涤液适当稀释之测试样品溶液分配至诸孔中，随后培育一段特定时间以容许样品中之交叉中和抗体与抗原分子结合。用于样品之稀释因子举例而言，可利用ELISA预备实验决定。此抗体反应操作较佳为于室温进行约1小时。完成抗体反应操作后，以洗涤液洗涤各孔。接着，将适当稀释之本发明单克隆抗体溶液分配至各孔中，经由培育一段特定时间使其与抗原分子结合。若使用有标记单克隆抗体，则可立即进行检测。若使用无标记单克隆抗体，则使该板进一步进行第二抗体反应。于使用市售可得产品作为标记第二抗体时，使用前以封阻液稀释2000倍至20000倍(根据随附说明书，若于其中找到较佳稀释因子)。洗涤去除第一抗体后，将第二抗体溶液分配至各孔中，并于室温培育1至3小时。以洗涤液洗涤各孔，随后以适于所用标记方法之方式检测。洗涤操作举例而言可如下完成：首先将洗涤液分配至各孔中，并使板振荡5分钟，置换新鲜洗涤液后继续振荡5分钟，然后以新鲜洗涤液置换后再振荡5分钟，若需要，洗涤操作期间可继续置换洗涤液。
应注意的是测试样品与本发明单克隆抗体可适当地以相反顺序使用。
本发明亦提供测定测试样品中抗HPV交叉中和抗体存在或抗体效价之试剂盒，或测定抗HPV交叉中和抗体抗体效价之试剂盒。更具体而言，此类试剂盒包含(a)固定于固体支撑物之HPV抗原，(b)本发明之单克隆抗体，及(c)识别本发明单克隆抗体之标记第二抗体。此类试剂盒可进一步包含测定所需之试剂、缓冲液、水、容器、使用说明书等。
(5)包含本发明单克隆抗体之医药品
本发明单克隆抗体可作为医药品用，例如HPV之预防或治疗剂，亦即，HPV感染或HPV感染所诱发疾病之预防或治疗剂。欲作为医药品用，该单克隆抗体必须可与需要治疗或预防此类疾病之人类或动物物种相容。
HPV感染所诱发疾病包括子宫颈癌、尖形湿疣、疣、及其他疾病。包含本发明单克隆抗体之HPV预防或治疗剂较佳为子宫颈癌之预防或治疗剂。
于一较佳具体实例中，作为医药品用之本发明单克隆抗体，于施用人类时，具有减低的风险抗原性。更具体而言，其为一种完全人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体例如小鼠-人类嵌合抗体，特佳为完全人类抗体。人源化及嵌合抗体可藉由基因工程方式，根据下文后述程序制备。完全人类抗体可利用人类-人类(或小鼠)杂交瘤产生，惟彼等理想地系利用人类抗体产生动物(例如小鼠)或如下文后述之噬菌体表达技术产生，使藉由稳定方式及较低成本提供大量抗体。
(i)嵌合抗体之制备
本文所用之"嵌合抗体"一词意指其H链与L链可变区(VH与VL)序列衍生自一种哺乳类物种，而恒定区(CH与CL)序列则衍生自另一种哺乳类物种之抗体。该可变区序列较佳为衍生自可容易地自其制备杂交瘤之动物物种(例如小鼠)，而该恒定区序列较佳为衍生自欲施用目标之哺乳类物种。
嵌合抗体之制备技术包括例如于美国专利案No.6,331,415所记载之方法或自其部分修改之方法。更具体而言，首先利用例行方式，以如上述所得产生本发明单克隆抗体之杂交瘤(例如，小鼠-小鼠杂交瘤)制备mRNA或总RNA，然后用以合成cDNA。使用cDNA作为模板，以例行方式用适当引物[例如，以包含VH或VL N端序列之编码核苷酸序列之寡DNA作为意义引物，及以可与CH或CL N端序列之编码核苷酸序列杂交之寡DNA为反义引物(参见，例如Bio/Technology,9：88-89,1991)]进行PCR，从而放大及纯化编码VH与VL之DNA。以相同方式，使用以另一哺乳动物(例如人类)淋巴细胞或类似物制备之RNA作为模板，以RT-PCR放大及纯化编码CH与CL之DNA，再以例行方式将VH与VL分别连接于CH与CL，所得嵌合H链DNA与嵌合L链DNA各自插入适当表达载体[例如，于CHO细胞、COS细胞、小鼠骨髓瘤细胞等中之包含具转录活性之启动子(例如CMV启动子、SV40启动子)之载体]中。编码此二链之DNA可插入分离之载体，或可串联插入单一载体中。所得嵌合H链与嵌合L链表达载体用以转形至宿主细胞。宿主细胞之实例包括动物细胞，例如上文提及之小鼠骨髓瘤细胞，以及中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、衍生自猴子之COS-7与非洲绿猴肾细胞、衍生自大鼠之GHS细胞等。可藉由任何适用于动物细胞之方式完成转形，较佳为利用电穿孔或类似方法。于适于宿主细胞之培养基中培养一段特定时间后，收集培养物上清液，以如上述之相同方法纯化以分离嵌合之单克隆抗体分子。替代地，当使用已建立之基因转殖技术及大规模养殖家畜(家禽)技术已累积之动物(例如，母牛、山羊、鸡)之生殖细胞作为宿主细胞，以例行方式产生基因转殖动物时，则从所得动物之乳液或蛋可容易且大量地得到嵌合单克隆抗体。再者，使用已建立之基因转殖技术及已被大规模栽培作为主要作物之植物细胞(例如，玉米、米、小麦、黄豆或烟草细胞)作为宿主细胞以产生基因转殖植物，例如利用显微注射或电穿孔至原生质粒中或利用粒子枪或Ti载体转形至完整细胞，从而可自所得种子或树叶获得大量嵌合单克隆抗体。
所得嵌合单克隆抗体以木瓜酶水解得到Fab，以胃蛋白酶水解得到F(ab')2。
替代地，编码小鼠VH与VL之各DNA可经由适当连接子{例如，编码由1至40个氨基酸，较佳为3至30个氨基酸，更佳为5至20个氨基酸组成肽(例如，[Ser-(Gly)m]n或[(Gly)m-Ser]n(其中m为0至10之整数，n为1至5之整数))之DNA}粘接以产生scFv。此外，编码CH3之DNA可进一步经由适当连接子黏接以产生微型抗体单体，或替代地，编码全长CH之DNA可进一步经由适当连接子黏接，以产生scFv-Fc。编码以基因工程方式修饰(接合)之此等抗体分子之各DNA，置于适当启动子控制下时，能于微生物(例如，大肠杆菌、酵母)中表达，因而得以大规模产生抗体分子。
编码小鼠VH与VL之各DNA串联插入单一启动子下游，然后引入大肠杆菌细胞中时，经由单编码区之基因表达形成称为Fv之二聚体。同样地，利用分子模拟，VH与VL架构区(FRs)中之适当氨基酸各自被Cys置换时，于此二链间，经由分子间之双硫键连接形成称为dsFv之二聚体。
(ii)人源化抗体
本文所用之“人源化抗体”一词意指除了存在可变区中之各互补决定区(CDRs)外，所有区域(亦即，恒定区及可变区中之各FR)之序列系源自人类，而仅CDR序列系衍生自其他哺乳类物种之抗体。较佳之其他哺乳类物种包括例如可容易地由其制备杂交瘤之动物物种(例如小鼠)。“完全人类抗体”一词意指包括各CDR之重链与轻链二者之所有序列实质上系衍生自人类基因之抗体。
人源化抗体之制备技术包括，例如于美国专利案Nos.5,225,539、5,585,089、5,693,761与5,693,762所记载之方法或自其部分修改之方法。更具体而言，如同上述嵌合抗体之情况，分离编码衍生自非人类哺乳类物种(例如，小鼠)之VH与VL之各DNA，然后以例行方式用自动DNA定序仪(例如，Applied Biosystems产品)定序。对照已知抗体序列之资料库[例如Kabat资料库(参见Kabat et al.,“Sequences of Proteins of Immunological Interest”,USDepartment of Health and Human Services,Public Health Service,edited by NIH,5th edition,1991)]，分析比对所得核苷酸序列或自其推论之氨基酸序列，以决定重链及轻链中之各CDR与各FR。设计核苷酸序列，使其FR序列类似于已决定FR序列的人类抗体之L链与H链[例如，人类κ型L链亚群I及人类H链亚群II或III(参见Kabat et al.,1991(文献同上))]之编码核苷酸序列中之CDR编码区，以已决定异源CDR之编码核苷酸序列置换。将彼等核苷酸序列分割成约20至40个碱基之片段，互补于彼等核苷酸序列之序列亦分割成约20至40个碱基之片段，使与上述片段交替重迭。彼等片段各自以DNA合成仪合成，其可藉由例行方式进行杂交及黏接，以建构编码具有人类来源之各FR及衍生自另一哺乳类物种之各CDR之VH与VL之各DNA。就更迅速及有效地移植衍生自另一哺乳类物种之各CDR至人类来源之VH与VL而言，欲达此目的较佳者为利用PCR之定点突变。此类技术之实例包括见述于JP5-227970A等之序列性CDR移植。如此得到之编码VH与VL之各DNA可藉由如上述嵌合抗体之相同方式，分别粘接于编码人类来源之CH与CL之各DNA，然后将其引入适当宿主细胞中，从而获得产生人源化抗体之细胞或基因转殖动物/植物。
如同嵌合抗体之情况，人源化抗体亦可利用基因工程程序转变为scFv、scFv-Fc、微型抗体、dsFv、Fv等，及于使用适当启动子时，可于微生物(例如，大肠杆菌、酵母)中产生。
人源化抗体之制备技术亦可调整，举例而言，以制备较佳为可施用杂交瘤制备技术尚未建立之其他动物物种[其实例为广被养殖之家畜(家禽)，包括乳牛、猪、绵羊、山羊与鸡，以及包括狗与猫之宠物动物]之单克隆抗体。
(iii)使用产生人类抗体之动物制备完全人类抗体
于剔除(KO)内源免疫球蛋白(Ig)基因之非人类温血动物中，引入功能性人类Ig基因。以抗原免疫处理时，该动物将产生人类抗体而非自己之抗体。因此，使用杂交瘤制备技术已建立之动物(例如，小鼠)时，以习知用于制备小鼠单克隆抗体之相同方式，即可能获得完全人类单克隆抗体。首先，将使用标准基因转殖(Tg)技术之以人类IgH及L链微型基因转形之小鼠，与使用标准KO技术使其内源小鼠Ig基因不活化之小鼠交配，以获得产生人类抗体之小鼠(参见Immunol.Today,17：391-397,1996)。由彼等小鼠产生之若干人类单克隆抗体已在进行临床试验，惟关于抗人类Ig人类抗体(HAHA)之产生则仍未见报导。
之后，Abgenix Inc.[商品名：XenoMouose(参见例如Nat.Genet.,15：146-156,1997；美国专利案No.5,939,598)]及Medarex Inc.[商品名：Hu-Mab小鼠(参见例如Nat.Biotechnol.,14：845-851,1996；美国专利案No.5,545,806)]利用酵母人工染色体(YAC)载体，产生携带较大人类Ig基因之Tg小鼠。此类小鼠得以产生更广谱之人类抗体。然而，人类Ig基因由于抗原结合部位系由例如以约80类型V片段、约30类型D片段与约6类型J片段之各种组合建构之VDJ外显子(H链)编码而达成其多样性。基于此因，H链(染色体14)之全长达到约1.5Mb、κL链(染色体2)约2Mb及λL链(染色体22)约1Mb。为了于其他动物物种中复制与人类同样广泛多样性之抗体谱，一般期盼引入各Ig基因之全长序列。然而，可插入习知基因转殖载体(例如，质粒、粘接质粒、BAC、YAC)之DNA通常为数kb至数百kb长，因此利用涉及注射选殖DNA至受精卵中之习知基因转殖动物制备技术，难以引入全长序列。
Tomizuka等(Nat.Genet.,16：133-143,1997)将携带Ig基因之原态人类染色体片段(hCF)引入小鼠[转殖染色体(TC)小鼠]中，以产生具有全长人类Ig基因之小鼠。亦即，首先，用纺锤体形成抑制剂(例如，乙酰甲基秋水仙素)处理具有人类染色体(其中包括H链基因之染色体14及包括κL链基因之染色体2各自以例如药剂抗性之标记物标记)之人类-小鼠杂交细胞约48小时，以制备含有封于核膜内之一个至数个染色体或其片段之微细胞，随后利用微核融合，将染色体引入小鼠ES细胞中。以含药之培养基挑选携带具有人类Ig基因之染色体或其片段之杂种ES细胞，并以通常用于制备KO小鼠之相同方式，将其显微注射入小鼠胚胎中。分析所得嵌合小鼠之毛色图案等以挑选生殖细胞嵌合体，从而建立携带人类染色体14片段(TC(hCF14))之TC小鼠品系及携带人类染色体2片段(TC(hCF2))之TC小鼠品系。以例行方式产生内源H链及κL链基因被剔除之小鼠(分别为KO(IgH)及KO(Igκ))，重复交配此四品系以建立具有全部四类型基因突变之小鼠品系(双重TC/KO)。
以如常见用于制备小鼠单克隆抗体之相同方式处理如上述产生之双重TC/KO小鼠时，即可制备产生抗原特异性人类单克隆抗体之杂交瘤。然而，由于包括κL链基因之hCF2于小鼠细胞中不稳定，因此此类小鼠比正常小鼠得到杂交瘤之效率低而较为不利。
另一方面，上述Hu-Mab小鼠包含约50%之κL链基因，惟具有双重可变区簇之结构。因此，彼等显现与于具全长基因小鼠中观察到之相同κ链多样性(另一方面，Hu-Mab小鼠由于仅包含约10%之H链基因，因此显现低H链多样性及对抗原之反应不足)。此外，由于κL链基因经由YAC载体(Igκ-YAC)插入小鼠染色体中，所以稳定维持于彼等小鼠之细胞中。基于彼等优点，乃使TC(hCF14)与Hu-Mab小鼠交配以产生稳定携带hCF14与Igκ-YAC之小鼠(商品名：KM小鼠)，其能达成与正常小鼠相同之杂交瘤产生效率及对抗原之相同抗体亲合力。
再者，为了更全面复制与人类相同之多样性抗体谱，可能产生进一步修饰以具有λL链基因之产生人类抗体之动物。此类动物可如上述相同方式，利用产生经修饰以具有携带λL链基因之人类染色体22或其片段(TC(hCF22))之TC小鼠，然后使此小鼠与上述双重TC/KO小鼠或KM小鼠交配；或替代地，可利用建构包括例如H链与λL链基因座之人类人工染色体(HAC)，然后将HAC引入小鼠细胞中而获得(Nat.Biotechnol.,18：1086-1090,2000)。
(iv)使用噬菌体显现人类抗体库之完全人类抗体之制备
另一制备完全人类抗体之方法系根据噬菌体显现技术。于此方法中，PCR诱发之突变有时可能被引入CDR以外之区域内，因此于临床试验中，有少数HAHA产生之报导。另一方面，此方法之优点在于无宿主动物产生之跨物种病毒感染之风险，及抗体特异性不受限制(抗禁忌殖株、糖链等之抗体亦可容易制备)等。
噬菌体显现人类抗体库之制备技术包括但不限于下文所述。
虽然任何噬菌体均可使用，惟通常优先使用丝状噬菌体(Ff噬菌体)。欲于噬菌体表面显现外来蛋白质，举例而言，可利用该外来蛋白质与任何外套蛋白质(g3p及g6p至g9p)融合(常与g3p或g8p之N末端融合)后表达及显现。噬菌体显现载体之实例包括：1)供引入融合于噬菌体基因体内之外套蛋白质基因状态之外来基因，从而呈与外来蛋白质之融合蛋白质，于噬菌体表面显现全部外套蛋白质者；以及2)供插入与野生型外套蛋白质基因分开之融合蛋白质编码基因，从而同时表达融合蛋白质与野生型外套蛋白质者；及3)经设计使以具有野生型外套蛋白质基因之辅助噬菌体，感染具有携带融合蛋白质编码基因之噬菌质粒载体之大肠杆菌细胞，以产生同时表达融合蛋白质及野生型外套蛋白质之噬菌体颗粒者。然而，由于融合大的外来蛋白质时，1)型噬菌体显现载体失去其感染能力，因此使用2)或3)型噬菌体显现载体制备抗体库。
特定载体之实例，可提出见述于Holt等(Curr.Opin.Biotechnol.,11：445-449,2000)者；例如，pCES1(参见J.Biol.Chem.,274：18218-18230,1999)为于单一乳糖启动子控制下，包含g3p讯息肽κL链恒定区下游之编码DNA及g3p讯息肽CH3下游之编码DNA、His-标签、c-myc标签、琥珀终止密码子(TAG)、随后为g3p编码序列之表达Fab之噬菌质粒载体。于引入具有琥珀突变之大肠杆菌细胞中时，此载体于g3p外套蛋白质上显现Fab，而于HB2151或无琥珀突变之其他菌株中表达时，则产生可溶性Fab抗体。至于表达scFv之噬菌质粒载体，举例而言，可使用pHEN1(J.Mol.Biol.,222:581-597,1991)或类似物。
另一方面，辅助噬菌体之实例包括M13-KO7、VCSM13等。
噬菌体显现载体之其他实例包括经设计使包括半胱氨酸密码子之编码序列黏接于抗体基因之各3'-末端及外套蛋白质基因之5'-末端，以同时独立地表达彼等二基因(不为融合蛋白质)，因此抗体可经由所引入半胱氨酸残基间之S-S键结，显现于噬菌体表面之外套蛋白质上者(CysDisplayTM technique,Morphosys)。
人类抗体库可为任何类型，包括天然/非免疫抗体库、合成抗体库、免疫抗体库等。
天然/非免疫抗体库系如下获得之抗体库：利用RT-PCR得到正常人类拥有之VH与VL基因，然后随机转殖至如上述之噬菌体显现载体。通常，使用衍生自得自正常人类周边血液、骨髓、扁桃腺或类似物中之淋巴细胞之mRNA作为模板。欲避免例如病例史之V基因偏差，仅放大衍生自无因抗原致敏诱发类型转换之IgM之mRNA，如此制备之抗体库特称为天然抗体库；典型的实例包括CAT Inc.之抗体库(参见J.Mol.Biol.,222：581-597,1991；Nat.Biotechnol.,14：309-314,1996)、MRC Inc.之抗体库(参见Annu.Rev.Immunol.,12：433-455,1994)、Dyax Inc.之抗体库(参见J.Biol.Chem.,1999(文献同上)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,14：7969-7974,2000)等。
合成抗体库系如下获得：挑选人类B细胞中之功能特异性抗体基因，以适当大小之随机氨基酸序列之编码DNA置换其V基因片段中之抗原结合区(例如，CDR3)，以建构抗体库。由于从开始就可用产生功能性scFv与Fab之VH与VL基因之组合物建构抗体库，因而此类合成抗体库被认为于抗体表达效率及稳定性上极为优异；典型的实例包括Morphosys Inc.之HuCAL抗体库(参见J.Mol.Biol.,296：57-86,2000)、BioInvent Inc.之抗体库(参见Nat.Biotechnol.,18：852,2000)、Crucell Inc.之抗体库(参见Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92：3938,1995；J.Immunol.Methods,272：219-233,2003)等。
免疫抗体库系如下获得：以如上述天然/非免疫抗体库之相同方式，从取自对抗血液中标靶抗原具增加抗体效价之人类(例如癌症病患、自体免疫疾病、感染等及接受疫苗接种之实验对象)之淋巴细胞，或从如上述利用活体外免疫，以标靶抗原人工免疫之人类淋巴细胞制备mRNAs，及利用RT-PCR技术放大VH与VL基因，以建构抗体库。该抗体库于开始时即含有所需抗体基因，因此可能从相当小尺寸之抗体库中获得所需抗体。
虽然抗体库具更广泛多样性更佳，惟按照下述淘选(panning)操作中能操纵之噬菌体数(1011至1013个噬菌体)，及通常淘选中分离及扩增所需噬菌体数(100至1,000个噬菌体/殖株)，约108至1011个殖株即适合实际用途。约108个殖株之抗体库通常得以筛选Kd值为10-9级数之抗体。
利用噬菌体显现技术筛选对抗标靶抗原之抗体之程序称为淘选。更具体而言，例如，将抗原固定化之载体与噬菌体库互相接触，洗掉未结合之噬菌体，然后从载体释出结合之噬菌体，感染至大肠杆菌细胞中以增殖彼等噬菌体。此系列操作重复约3至5次，以增加显现抗原特异性抗体之噬菌体。用于抗原固定化之载体实例包括一般用于抗原抗体反应或亲和层析法之各种载体，例如不溶性多醣(例如，洋菜糖、聚葡萄醣、纤维素)、合成树脂(例如，聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚硅氧)、微量板、试管、薄膜、管柱及由玻璃、金属等制成之珠粒，以及表面电浆子共振(SPR)之感测晶片等。抗原固定化可利用一般用以不溶化或固定化蛋白质或酶等之物理吸附或化学键结法达成。举例而言，优先使用生物素-(链霉)抗生物素蛋白系统或类似物。若作为标靶抗原用之内源配体系如肽之小分子，则应特别留意以防止作为抗原决定基用之区域因与该载体接合而被掩盖。关于洗涤未结合噬菌体，可连续使用封阻液例如BSA溶液(一或二次)及含表面活性剂(例如，Tween)之PBS(3至5次)。亦有报告指出，较佳为使用柠檬酸盐缓冲液(pH5)或类似物。欲释出特异性噬菌体，通常使用酸(例如，0.1M盐酸)，虽然亦可能利用以特异蛋白酶切割(例如，可将胰蛋白酶切割部位之编码基因序列引入至抗体基因与外套蛋白质基因间之接合处；于此情形下，由于野生型外套蛋白质显现于释出噬菌体之表面，即使外套蛋白质全系显融合蛋白质表达，该噬菌体可感染也可于大肠杆菌细胞中增殖)、以可溶性抗原竞争性释出、或还原S-S键(例如，于上述CysDisplayTM中，淘选后使用适当还原剂，将抗体分子从外套蛋白质解离，从而可收集抗原特异性噬菌体)释出噬菌体。以酸释出时，使用Tris等中和释出之噬菌体，然后感染大肠杆菌细胞；培养后，以例行方式收集噬菌体。
一旦经由淘选增加显现抗原特异性抗体之噬菌体后，使彼等噬菌体感染入大肠杆菌细胞中，然后接种于培养板上进行转殖。再收集噬菌体，利用上述抗体效价测定技术(例如，ELISA、RIA、FIA)或利用根据FACS或SPR之技术，确定其抗原结合活性。
欲从挑选之显现抗原特异性抗体之噬菌体殖株单离及纯化抗体分子，举例而言，若所用噬菌体显现载体为携带于抗体基因及外套蛋白质基因间接合处引入之琥珀终止密码子之载体，则当该噬菌体感染不具琥珀突变之大肠杆菌(例如，HB2151株)时，即产生可溶性抗体分子并分泌至周质或培养基中；因此以溶菌酶溶解细胞壁收集细胞外级分，然后以上述相同方法予以纯化。当载体已经修饰成为携带His-标签或c-myc标签时，则使用IMAC或抗c-myc抗体管柱即可容易地纯化抗体分子。替代地，若于淘选时使用特定蛋白酶切割，则以此蛋白酶处理后，可将抗体分子从噬菌体表面分离，使利用进行相同纯化操作即可纯化所需抗体分子。
使用产生人类抗体之动物及噬菌体显现人类抗体库之制备完全人类抗体之技术亦可调整以制备其他动物物种之单克隆抗体，其实例为被广泛养殖为家畜(家禽)之动物，包括乳牛、猪、绵羊、山羊与鸡，以及包括狗与猫之宠物动物。于非人类动物中使用免疫抗体库更为实际，因存在较少有关以标靶抗原人工免疫处理之伦理问题。
包含本发明单克隆抗体之预防及/或治疗剂具低毒性，且可为溶液或为任何适当剂量型之医药组成物，利用非经肠或经口路径直接施用人类或哺乳动物(例如，大鼠、兔、绵羊、猪、乳牛、猫、狗、猴)。
本发明单克隆抗体可单独或以适当医药组成物施用。用于施用之此等医药组成物可包含本发明单克隆抗体或其盐，及药理学上可接受之载剂、稀释剂或赋形剂。此等医药组成物系以适于经口或非经肠施用之任何剂量型提供。
供非经肠施用时，举例而言，系使用例如注射剂及栓剂等组成物，注射剂可涵盖例如静脉内注射剂、皮下注射剂、皮内注射剂、肌内注射剂、点滴输液等剂量型。
此类注射剂可以已知方法制备。制备注射剂时，举例而言，可使上述本发明单克隆抗体或其盐于注射常用之无菌水性或油性基质溶液中溶解、悬浮或乳化。供此目的之注射用水溶液之实例包括生理食盐液、含葡萄糖及其他辅助剂之等张溶液等，其可与适当增溶剂如醇类(例如，乙醇)、多醇类(例如，聚丙二醇、聚乙二醇)、非离子性表面活性剂[例如，聚山梨糖醇酯80、HCO-50(氢化蓖麻油之聚氧乙烯(50mol)加合物)]等组合使用。供此目的之油性基质溶液之实例包括芝麻油、黄豆油等，其可与增溶剂例如苄酸苄酯、苄醇等组合使用。所制备之注射液较佳为装于适当安瓿中。供直肠内施用用之栓剂可使上述单克隆抗体或其盐与通常用于栓剂之基底混合而制备。
经口施用用组成物包括固体或液体剂量型，更具体而言为锭剂(包括糖衣锭剂与膜衣锭剂)、丸剂、粒剂、粉剂、胶囊(包括软胶囊)、糖浆、乳剂、悬浮剂等。此类组成物可以已知方法制备及可包含一般用于调配剂领域之载剂、稀释剂或赋形剂。用于锭剂之载剂及赋形剂之实例包括乳糖、淀粉、蔗糖、与硬脂酸镁。
彼等非经肠或经口医药组成物系有利地调配为适合活性成分剂量之单位剂量型。此等单位剂量型之实例包括锭剂、丸剂、胶囊、注射剂(安瓿)、与栓剂。单克隆抗体含量通常为约每单位剂量型5至500mg。特别是，上述单克隆抗体含量以于注射剂中约5至100mg及于其他剂量型中约10至250mg为较佳。
应注意的是，上述各组成物可包含其他活性成分，只要彼等与上述单克隆抗体组合时不引起有害之相互作用即可。
含本发明单克隆抗体之预防、治疗或诊断剂(医药品)之剂量将取决于施用目标、欲治疗或诊断之疾病、症状、施用路径等。举例而言，用于治疗成人子宫颈癌时，本发明单克隆抗体系有利地以通常约0.01至20mg/kg体重，较佳为约0.1至10mg/kg体重，更佳为约0.1至5mg/kg体重之单一剂量，每天约一至五次，较佳为约一至三次，经由静脉内路径施用。用于非经肠施用之其他情形(例如，皮下施用)及经口施用时，可施用相同剂量。若症状特别严重，则可视症状而增加剂量。
本发明医药品可以试剂盒形式提供。此类试剂盒可包含本发明医药品，以及附加活性成分、附加医药品、使用说明书、容器等。(6)包含本发明单克隆抗体之诊断HPV感染用试剂
本发明单克隆抗体可作为诊断HPV感染用试剂。欲使用本发明单克隆抗体检测HPV感染，举例而言，首先使样品(例如，刮取之子宫颈细胞样品)中之蛋白质固定于多孔板(例如，96孔或384孔板)孔底表面或于膜上，然后供使用本发明单克隆抗体检测样品中之HPV用。于彼等技术中，使用多孔板(例如，96孔或384孔板)者通常称为固相酶免疫测定法(ELISA)或放射性免疫测定法(RIA)。另一方面，以固定于膜上为基础之技术包括，于聚丙烯酰胺电泳(西方印迹法)后，使样品中之蛋白质移转至膜者，或使样品或其稀释物直接浸渍于膜中者，亦即，所谓圆点印迹或狭缝印迹法。
实施例
兹经由下文实施例进一步更具细节地说明本发明，彼等实施例仅供详细叙述本发明具体实例之说明用途，而不拟于任何意识上限制本发明或其说明用具体实例之范围及意义。同样地，本发明范围亦不受限于本文叙述之特定具体实例。除了本说明书中之叙述外，针对本发明之各种修饰，本领域技术人员从说明书、权利要求及附图将明显可见。
本文所引用的所有参考文献，包括专利、专利申请及期刊论文，其全部内容均并入本文以资参考。
1.制备识别人类乳突病毒第16型(HPV16)L2蛋白质的单克隆抗体
使人工合成肽[HPV16L2蛋白质的氨基酸56至75：P56/75(SEQ ID NO：1)]与钥孔血蓝蛋白(KLH)经由半胱氨酸接合，以制备抗原(KLH-P56/75)。将此抗原(50μg/动物)与弗氏完全佐剂(FCA)一起，皮内接种于三只Balb/c小鼠中。在2、4及6周后，以相同方式追加小鼠免疫处理。第一次免疫处理7周后，使KLH-P56/75(25μg/动物)与FCA一起静脉内注射。最后一次免疫处理6天后，收集小鼠脾脏细胞，以6：1的比率与P3U1骨髓瘤细胞混合，随后使用50%聚乙二醇(PEG)进行细胞融合。于补充次黄嘌呤、氨基喋呤(aminopterin)与胸腺嘧啶核苷的培养基(HAT培养基)中挑选融合细胞，并繁殖该细胞。使用HPV16L1/L2-壳体作为抗原，以ELISA筛选分泌抗HPV16L2抗体的细胞株。结果，获得分别产生单克隆抗体13B及24B的两株细胞株。该产生抗体13B的细胞及产生抗体24B的细胞分别称为“小鼠-小鼠杂交瘤13B”及“小鼠-小鼠杂交瘤24B”，由本申请案的申请人依布达佩斯条约于2010年10月15日国际保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(Central6,1-1-1Higashi,Tsukuba,Ibaraki,Japan zip code：305-8566)，国际保藏号分别为FERM BP-11304及FERM BP-11305。彼等13B-及24B-产生细胞各自经腹膜内接种入5只Balb/c小鼠中，以制备富含各自的单克隆抗体的小鼠腹水样品。
2.单克隆抗体13B及24B的抗原决定部位图谱定位(mapping)
于ELISA中，使用包含自N或C端有数个氨基酸删除或数个氨基酸的丙氨酸置换的P56/75的突变肽作为抗原(与KLH接合)，利用分析彼等与其氨基酸被丙氨酸部分置换的P56/75突变肽的结合，决定各单克隆抗体结合的必须氨基酸(图2双下划线处)，及与各单克隆抗体结合的有关氨基酸(图2下划线处)，从而预测单克隆抗体13B及24B的抗原决定部位。所用抗原肽及ELISA结果示于图1。彼等结果显示，13B及24B识别的区域分别涵盖HPV16L2蛋白质的氨基酸67至72及56至58。
以此方式预测的单克隆抗体13B及24B于P56/75中的抗原决定部位与高危险型HPV间的保守氨基酸序列区一起表示于图2。
同样地，以如上述的相同方法，使用包含自N或C端有数个氨基酸删除或数个氨基酸端丙氨酸取代的P56/75的其他变异肽作为抗原(与BSA接合)，以决定各单克隆抗体的抗原决定部位。所用抗原肽及ELISA结果表示于图8。
讨论结果，认为13B识别的抗原决定部位系位于HPV16L2蛋白质中的氨基酸64至73区域，而24B识别的抗原决定部位系位于HPV16L2蛋白质中的氨基酸58至67区域(图9下划线处)。
图9显示以此方式预测的单克隆抗体13B及24B于P56/75中的抗原决定部位与高危险型HPV间的保守氨基酸序列区。
3.测定交叉中和抗体效价的方法
分析抗体13B及24B的对抗HPV假病毒感染的交叉抑制能力及其对HPV L1/L2-壳体的交叉结合能力。从测定其干扰抗体13B或24B与HPV16L2抗原结合的能力，推论测试血清中的交叉中和抗体效价。
(测试方法1)测定单克隆抗体对抗HPV16、18、31、33、35、51、52与58假病毒(PsV)的中和活性
(1)使HPV16或HPV58L1及L2表达质粒与分泌性碱性磷酸酶(SEAP)表达质粒混合，将其转染入293FT细胞中。转染2天后，使细胞悬浮于清洁剂缓冲液[0.35%Brij58、1μl RNase(Ambion#2286)的D-PBS溶液(0.9mM CaCl2、10mM MgCl2)]，于37℃培养隔夜。令其于冰上静置5分钟后，于4℃，10,000g，使细胞离心10分钟，收集上清液。将收集的上清液覆盖于27%、33%、39%碘克沙醇(以0.8M NaCl的PBS溶液制备)上，于16℃，以50,000rpm超离心3.5小时。超离心后，收集含HPV16或HPV58假病毒(PsV)的级分，供进行中和实验用。
使以酚红无细胞培养液稀释的PsV与含有抗体腹水(13B、24B或其混合物)混合，于4℃反应1小时，然后感染已培养于96孔板中的293FT细胞。3天后，收集40μl培养上清液，使其与20μl0.05%CHAPS溶液及200μl基质溶液[添加1锭4-硝基苯磷酸二钠盐六水合物(Sigma N9389)至20ml含9.5M二乙醇胺、1mM MgCl2与0.5mM ZnCl2的溶液中]混合。生色后，测定450nm的吸光度。针对与各抗体混合时的PsV感染度及与小鼠血清(免疫前，1:50稀释)混合时的PsV感染度(负对照组)进行比较。
(结果)
发现13B及24B均具有对抗HPV16与HPV58假病毒的中和活性，抗体13B与24B的混合物比单独抗体13B或24B显现更强的中和活性(图3)。
(2)再者，除了HPV16与HPV58的外，亦以如上文(1)所示相同方法，分析抗体13B及24B对抗HPV18、31、33、35、51与52假病毒的中和活性。于此分析中，使用抗FLAG单克隆抗体M2(50μg/ml)作为负对照组，从小鼠腹水纯化的单克隆抗体(50μg/ml)作为抗体13B及24B。使抗体溶液(抗FLAG抗体M2、13B、24B或13B与24B的混合物)与PsV悬浮液混合以产生25μg/mL的抗体浓度。此外，针对与各抗体混合时的PsV感染度及与负对照组(抗FLAG抗体M2)混合时的PsV感染度进行比较，随后利用t-试验测定各抗体中和活性存在与否。
(结果)
发现13B中和HPV16、18、31、33、51与58，而24B中和HPV16、18、31、33、35、51、52与58。亦即，于所测试的假病毒中，13B中和除了HPV35与HPV52外所有类型的假病毒；24B中和经测试的所有类型假病毒。再者，抗体13B与24B的混合物比单独者显现更强的中和活性(图10)。
(测试方法2)测定单克隆抗体对高危险型L1/L2-壳体的结合活性(1)将各类型HPV的L1及L2表达质粒转染入293FT细胞中。以如用于PsV的相同方法进行从转染细胞的L1/L2-壳体的抽出与纯化(参见测试方法1)。
于96孔ELISA培养板的各孔中，添加容量50μl的以PBS稀释的L1/L2-壳体(0.5μg/ml)，令其于4℃静置隔夜。室温下，以封阻液(含有5%脱脂牛乳与0.1%Tween20的PBS)封阻2小时以制备抗原固定化培养板。
含各单克隆抗体的腹水以封阻液进行1：100的稀释，令其与固定于ELISA培养板的L1/L2-壳体反应。以PBST洗涤后，于各孔添加已以封阻液进行1：2000稀释的辣根过氧化酶(HRP)-标记的抗小鼠IgG抗体(Santa Cruz：sc-2031)，于室温反应1小时。以PBST洗涤后，于各孔添加基质溶液(2mg/ml邻苯二胺与0.0065%过氧化氢水溶液的0.1M柠檬酸三钠溶液，pH4.8)，于室温反应。生色后，测定450nm的吸光度。
(结果)
如ELISA的分析，13B及24B分别结合于第16、31、33、51与58型的L1/L2-壳体及第16、31、33、35、51、52与58型的L1/L2-壳体。亦即，13B结合于除了第35与52型外的所有测试抗原；24B结合于所有测试抗原。
21A(于实例1杂交瘤挑选时结合于具涵盖HPV16型L2蛋白质的氨基酸56至75序列的肽，惟对HPV16假病毒无中和活性的抗体)与测试抗原均未结合(图4)。
(2)再者，除了上述测试的16、31、33、35、51、52与58型L1/L2-壳体外，亦以如上文(1)所示的相同方法，分析13B及24B与18型L1/L2-壳体的结合。同样地，制备仅由L1构成的壳体，以如上文(1)所示相同方法，分析各抗体与此壳体的结合。自小鼠腹水纯化的各单克隆抗体，使用前以封阻液稀释至250ng/孔。
(结果)
13B及24B亦结合于第18型L1/L2-壳体。亦即，13B结合于除了第35与52型外的所有测试抗原；24B结合于所有测试抗原。此外，无抗体结合于仅由L1构成的壳体，表示彼等抗体系特异性地结合于各类型的L2蛋白质(图11)。
(测试方法3)测定血清中交叉中和抗体效价
以HPV16L1-及L2-表达的杆状病毒感染昆虫细胞(Sf9)，制备作为抗原的HPV16L1/L2-壳体。病毒感染3天后，使细胞悬浮于含有0.5%NP-40的PBS中，以分离其细胞核。使细胞核悬浮于含有氯化铯(1.28g/ml)的PBS中，以超声波处理使其均质化。均质物于20℃，以34,000rpm离心20小时，以收集含L1/L2-壳体的级分。于含有0.5M氯化钠的PBS中透析该级分隔夜。于超离心管中，从顶部依序覆盖含5%及60%蔗糖的PBS溶液，于其上进一步覆盖经透析的级分，随后于4℃，以31,000rpm离心2小时。使含有L1/L2-壳体的级分于含0.5M氯化钠的PBS中透析隔夜，及作为抗原用。
于96孔ELISA培养板的各孔添加容量50μl的以PBS稀释的HPV16L1/L2-壳体(5μg/ml)，令其于4℃静置隔夜。室温下，以含有5%脱脂牛乳的PBST(含有0.1%Tween-20的PBS)封阻培养板2小时，以制备抗原固定化的培养板。
各自添加以1/10至1/6250，5倍增量系列稀释的封阻液制备的系列稀释的测试血清，例如兔子抗P56/75血清及对照组血清，至抗原固定化培养板的孔中，于室温反应2小时。所用测试血清系以KLH-P53/69[经由半胱氨酸与KLH接合的具P53/69氨基酸序列(SEQ ID NO：23)的肽]、KLH-P56/75、KLH-P18/38(WO2009/001867)或16L1-430(56/75)嵌合壳体(WO2009/001867)免疫处理的兔血清。所用KLH为“
Figure BDA00003422847100511
mcKLH(于PBS缓冲液中)”(ThermoScientific Pierce)。以PBST洗涤后，使培养板与分别以封阻液进行1：100000及1：3000稀释的13B及24B的小鼠腹水于室温反应2小时。以PBST洗涤后，添加以封阻液进行1：2000稀释的辣根过氧化酶(HRP)-标记的抗小鼠IgG抗体(Santa Cruz：sc-2031)至各孔，于室温反应1小时。以PBST洗涤后，添加基质溶液(2mg/ml邻苯二胺与0.0065%过氧化氢水溶液的0.1M柠檬酸三钠溶液，pH4.8)，于室温反应。生色后，测定450nm的吸光度。利用平行线分析，使用各测试血清于1/50、1/250与1/1250稀释所得吸光度数据，定量各血清的交叉中和抗体效价。
(结果)
发现以KLH-P56/75及16L1-430(56/75)嵌合壳体免疫处理的兔血清含有抑制单克隆抗体13B结合的抗体；以KLH-P53/69、KLH-P56/75及16L1-430(56/75)免疫处理的兔血清含有抑制单克隆抗体24B结合的抗体；作为负对照组所用的以KLH-P18/38免疫处理的兔血清不含抑制彼等单克隆抗体结合的抗体(第5及6图)。
根据图6ELISA的结果，定量抗体效价。以经KLH-P56/75免疫处理的兔血清作为标准血清，利用平行线分析，从1/50、1/250及1/1250稀释所获得的OD值，定量各兔血清的交叉中和抗体效价。所得结果表示于下文表中。
[表1]
表1：利用平行线定量法对交叉中和抗体效价进行定量
抑制13B结合的抗体的抗体效价
Figure BDA00003422847100521
抑制24B结合的抗体的抗体效价
Figure BDA00003422847100531
4.单克隆抗体13B及24B的亚型分析
使用KLH-P56/75-固定化的琼脂糖4B(GE Healthcare)亲和力纯化13B及24B。使用小鼠单克隆抗体分型测试试剂盒(AbDSerotec)分析经纯化抗体的亚型；发现13B为IgG1，而24B为IgG2b；其轻链各为κ链。
5.分析单克隆抗体13B及24B的可变区氨基酸序列
使用RNeasy迷你试剂盒(QIAGEN)，从13B-及24B-产生杂交瘤(登录编号FERM BP-11304及FERM BP-11305)抽取RNA。利用SMARTer RACE cDNA放大试剂盒(Clontech)使RNA转变为cDNA，同时于各cDNA的5'末端添加转接子。以转接子为引物及以IgG1恒定区(5'-ATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC)[SEQ ID NO：4]为引物，利用PCR放大13B的重链。以转接子为引物及以IgG2b恒定区(5'-AGGGGCCAGTGGATAGACTGATGG)[SEQ ID NO：5]为引物，利用PCR放大24B的重链。以转接子为引物及以κ链恒定区(5'-GGATACAGTTGGTGCAGCATC)[SEQ ID NO：6]为引物，利用PCR各自扩增13B及24B的轻链。PCR产物于琼脂糖凝胶上电泳分析后，切出条带，各自转殖至pGEM-T Easy载体(Promega)中。分析各链约10个转殖株的核苷酸序列，以排除可能因PCR误差产生的序列。从cDNA的核苷酸序列推论氨基酸序列。
经亲和力纯化的13B及24B于聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析，然后转移至PVDF膜上，利用Edman降解法，分析其重链及轻链的N端氨基酸序列(5个残基)，从而证实其与从核苷酸序列推论的氨基酸序列相配。
13B及24B的可变区氨基酸序列表示于表2；再者，其互补决定区(CDRs)1至3的序列表示于表3。
同样地，图7表示13B及24B的可变区氨基酸序列，以及其互补决定区(CDR)1至3。
[表2]
Figure BDA00003422847100551
Figure BDA00003422847100552
[表3]
13B的CDR序列
24B的CDR序列
Figure BDA00003422847100562
工业实用性
本发明单克隆抗体与有非常大量基因型的高危险型HPV具结合活性，使用本发明单克隆抗体的抗体效价测定方法为有用的方法，其得以大规模且迅速地测定实验对象血清样品中的交叉中和抗体效价，例如，针对疫苗开发的临床研究中，特别是第二代HPV疫苗的实际应用。此外，本发明单克隆抗体亦可作为感染高危险型HPV的诊断或治疗剂用。
Figure IDA00003422848000011
Figure IDA00003422848000021
Figure IDA00003422848000041
Figure IDA00003422848000051
Figure IDA00003422848000091
Figure IDA00003422848000101
Figure IDA00003422848000121
PCT/RO/134表

Claims (21)

1.一种单克隆抗体，其识别人类乳突病毒L2蛋白质的共同抗原决定部位。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其中，人类乳突病毒L2蛋白质的共同抗原决定部位由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列组成。
3.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其中，人类乳突病毒L2蛋白质的共同抗原决定部位由SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列组成。
4.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其包含SEQ ID NO：11(CDRH1)、SEQ ID NO：12(CDRH2)、SEQ ID NO：13(CDRH3)、SEQ ID NO：14(CDRL1)、SEQ ID NO：15(CDRL2)及SEQ ID NO：16(CDRL3)所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其包含SEQ ID NO：17(CDRH1)、SEQ ID NO：18(CDRH2)、SEQ ID NO：19(CDRH3)、SEQ ID NO：20(CDRL1)、SEQ ID NO：21(CDRL2)及SEQ ID NO：22(CDRL3)所示的氨基酸序列。
6.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其重链可变区是SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，而其轻链可变区是SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。
7.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其重链可变区是SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列，而其轻链可变区是SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列。
8.根据权利要求6所述的单克隆抗体，其识别人类乳突病毒L2蛋白质，且由保藏号FERM BP-11304的杂交瘤细胞株产生。
9.根据权利要求7所述的单克隆抗体，其识别人类乳突病毒L2蛋白质，且由保藏号FERM BP-11305的杂交瘤细胞株产生。
10.一种测定人类乳突病毒(HPV)的交叉中和抗体的抗体效价的方法，该方法包括下述步骤：
(a)使测试样品与HPV抗原接触，使该样品中的抗体与该抗原结合的步骤；及
(b)添加根据权利要求1所述的单克隆抗体至步骤(a)的反应体系中，测定结合于该抗原的该单克隆抗体的量的步骤。
11.一种测定人类乳突病毒(HPV)的交叉中和抗体的抗体效价的方法，该方法包括下述步骤：
(a)使测试样品与HPV抗原接触，使该样品中的抗体与该抗原结合的步骤；及
(b)使步骤(a)中未与抗体结合的剩余的抗原决定部位与权利要求1所述的单克隆抗体接触，测定结合于该抗原决定部位的该单克隆抗体的量。
12.一种测定人类乳突病毒(HPV)的交叉中和抗体的抗体效价的方法，该方法包括下述步骤：
(a)使权利要求1所述的单克隆抗体与测试样品混合后，与HPV抗原接触，形成抗体/抗原复合物；及
(b)测定步骤(a)所得抗体/抗原复合物中的、形成了抗体/抗原复合物的该单克隆抗体的量。
13.根据权利要求10或11所述的方法，其中，使结合于抗原的该单克隆抗体或与该抗原决定部位接触并结合的单克隆抗体，与识别该单克隆抗体的标记第二抗体接触，通过在测试样品存在及不存在下测定由该标记第二抗体产生的信号的强度，测定该测试样品中能够存在的交叉中和抗体的抗体效价。
14.根据权利要求12所述的方法，其中，使步骤(a)中形成的单克隆抗体与抗原的复合物与识别该单克隆抗体的标记第二抗体接触，通过测试样品存在及不存在下的由该标记第二抗体产生的信号的强度，测定该测试样品中能够存在的交叉中和抗体的抗体效价。
15.根据权利要求10至14中任一项所述的方法，其中，该HPV抗原固定于固体支撑物。
16.一种用于测定测试样品中HPV交叉中和抗体的存在的试剂盒，其包含(a)固定于固体支撑物的HPV抗原，(b)权利要求1所述的单克隆抗体，及(c)识别权利要求1所述的单克隆抗体的标记第二抗体。
17.一种HPV感染的诊断试剂，其包含权利要求1所述的单克隆抗体。
18.一种细胞株，其产生权利要求1所述的单克隆抗体。
19.根据权利要求18所述的细胞株，其保藏号为FERM BP-11304或FERM BP-11305。
20.一种医药品，其包含权利要求1所述的单克隆抗体。
21.一种HPV治疗剂，其包含权利要求1所述的单克隆抗体。
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