KR100758816B1 - 웨스트나일 바이러스 특이 단클론항체 5ｅ8, 이를 생산하는융합세포주 및 이를 이용한 효소결합면역측정법 - Google Patents
웨스트나일 바이러스 특이 단클론항체 5ｅ8, 이를 생산하는융합세포주 및 이를 이용한 효소결합면역측정법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 웨스트나일 바이러스의 외피 E 단백질의 E367 알라닌 부위에 결합하는 단클론항체를 분비하는 융합 세포주 및 상기 단클론항체를 이용한 진단방법에 관한 것이다.
본 발명의 목적은 웨스트나일 바이러스의 외피 E 단백질의 E367 알라닌 부위에 결합하여, 감수성 세포 내 바이러스 감염을 저해시키는 중화 단클론항체 5E8을 분비하는 융합세포주를 제공하고, 여기에서 분비되어지는 5E8 단클론항체를 이용하여 웨스트나일 바이러스 중화항체를 신속하게 검출하는 새로운 진단방법을 제공함에 있다.
좀더 상세하게는, 본 발명의 융합세포주는 웨스트나일 바이러스 항원으로 면역한 발브씨(Balb/c) 마우스의 B 면역세포와 SP2/0 골수종유래 세포 간의 세포융합에 의해 작성되었으며, 웨스트나일 바이러스 E 외피단백질의 E367 알라닌 부위에 결합하는 중화 단클론항체를 분비함을 특징으로 한다. 또한 단클론항체 5E8을 사용하여 경합적 효소결합면역측정법으로 웨스트나일 바이러스 감염 중화항체를 수 시간 내에 신속하게 검출할 수 있는 진단방법을 제공한다.
본 발명의 융합세포주에 의해 생산되는 단클론항체는 웨스트나일 바이러스를 중화시킬 수 있는 능력을 보유하고 있으므로, 진단항체로서 뿐만 아니라 치료제 항체 개발에도 사용될 수 있다. 신규한 본 발명의 진단방법은 축종에 관계없이 혈청 진단에 사용할 수 있으며, 웨스트나일 바이러스 예방을 위하여 백신접종된 개체에 서 감염방어항체 수준을 신속히 측정할 수 있다.
웨스트나일 바이러스, 단클론항체, 중화항체, 경합적 효소결합면역측정법
Description
도 1은 본 발명의 단클론항체 5E8의 웨스트나일 바이러스 중화능을 나타내는 플라크감소중화시험(PRNT) 결과의 도면이다.
도 2는 본 발명의 단클론항체 5E8에 대하여 중화반응을 회피하는 웨스트나일 바이러스 변이주를 확인하는 플라크감소중화시험(PRNT) 결과의 도면이다.
도 3은 웨스트나일 바이러스 wild type (WNV-WT)과 웨스트나일 바이러스 변이주(WNV-mutnat)간의 E 외피단백질 도메인 Ⅲ 내에서 아미노산 차이를 보이는 서열을 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명의 단클론항체 5E8을 이용하여 웨스트나일 바이러스 감염 방어항체를 ELISA법으로 검출하는 모식도이다.
도 5는 본 발명의 단클론항체 5E8을 이용한 경합적 효소결합면역측정법으로 여러 가지 토끼혈청에 대한 중화 항체가를 측정한 결과이다.
본 발명은 웨스트나일 바이러스의 E 외피단백질의 367번째 아미노산(E367)인 알라닌 부위에 결합하고 웨스트나일 바이러스를 중화시킬 수 있는 단클론항체, 이를 분비하는 융합세포주 및 이를 이용한 효소결합면역측정법에 관한 것이다.
웨스트나일 바이러스(West Nile Virus; WNV)는 웨스트나일뇌염(West Nile Encephalitis)을 유발하는 바이러스 병원체로서, 1937년 아프리카 우간다의 웨스트나일강 서부지역의 한 여성으로부터 최초로 분리되었다. 웨스트나일 바이러스는 아프리카, 아시아, 아메리카 및 유럽지역의 모기가 활동하는 지역에 존재하면서, 사람과 말에 치명적인 뇌염을 유발할 수 있으며, 그 이외에 조류, 파충류, 설치류 등 광범위한 동물에 감염된다.
우리나라의 경우 아직까지 이 질병의 발생이 없으나, 국내에 발생할 경우 사람(특히 노약자) 및 야생 조류의 피해가 예상된다. 그러므로 이 질병의 발생이 의심될 경우 신속한 진단에 의하여 국가적 차원의 강력한 방역조치가 수행되어야만 웨스트나일 바이러스로 인한 피해를 최소화할 수 있다.
사람이나 동물에서 웨스트나일 바이러스 감염을 예방하는데 있어서 웨스트나일 바이러스 중화항체가 중요한 역할을 한다. 감염 숙주에서의 웨스트나일 바이러스 중화항체는 웨스트나일 바이러스 E 외피단백질, 특히 도메인 Ⅲ 부위에 의하여 주로 생성된다.
웨스트나일 바이러스에 감염되거나 면역된 사람이나 동물에서의 웨스트나일 바이러스 중화항체의 검출이나 항체수준의 평가는 현재까지 플라크감소중화시험법(Plaque Reduction Neutralization Test; PRNT)에 의존하고 있다. 이 검사방법은 인체에 치명적인 웨스트나일 바이러스 병원체를 취급하여야 하므로 생체안전도 3 등급(Biosafety Level 3) 이상의 특수 밀폐실험실에서 수행되어야 하며, 검사기간도 최소 4일 이상이 소요되는 등의 문제점이 있다.
이에, 본 발명은 일반실험실에서 웨스트나일 바이러스 중화항체를 신속히 검사할 수 있는 방법을 제공하고자 한다. 이를 위하여 웨스트나일 바이러스를 중화하는 단클론항체 5E8을 분비하는 융합세포주를 제조하였다. 본 발명은 단클론항체 5E8이 웨스트나일 바이러스의 E 단백질의 도메인 Ⅲ 부위에 위치하는 E367 알라닌 에 결합하는 것을 확인하였고, 이러한 결과는 종래의 중화 단클론항체들의 결합부위와는 전혀 다른 새로운 종류의 중화항체임을 제공하는 것이다.
본 발명은 ELISA 원리를 적용하여 단클론항체 5E8을 검사혈청시료 내 웨스트나일 바이러스 중화항체와 경합반응을 실시하여 웨스트나일 바이러스 중화항체를 검출하는 방법을 제공하는 데 목적이 있다.
본 발명은 축종에 관계없이 동일한 방식의 경합적 효소결합면역측정법을 적용하여 혈청내 웨스트나일 바이러스 중화항체를 수 시간만에 검사할 수 있는 진단방법을 제공함에 목적이 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명은
웨스트나일 바이러스 E 외피단백질의 항체 결합부위에 결합하여, 웨스트나일 바이러스를 중화시키는 웨스트나일 바이러스 중화 단클론항체 5E8를 제공한다.
또한 상기 웨스트나일 바이러스 항원이나 재조합 E 외피단백질을 마우스에 면역시키고, 이로부터 분리한 면역 B세포와 마우스 골수종유래세포간의 세포융합에 의해서 생산되어, 웨스트나일 바이러스를 중화시키는 웨스트나일 바이러스 특이 단클론항체 5E8을 생산하는 융합세포주(기탁번호 KCLRF-BP-00117)를 제공한다.
또한 상기 웨스트나일 바이러스 중화단클론항체 5E8을 이용한 효소결합면역측정법(ELISA)으로, 검사혈청과 단클론항체 5E8간의 경합적 반응에 의하여 웨스트나일 바이러스 중화 단클론항체를 검출하는 하기와 같은 웨스트나일 바이러스의 중화항체 검출방법을 제공한다.
그 방법을 구체적으로 설명하면;
(1) 웨스트나일 바이러스 특이 단클론항체 2F10을 효소결합면역측정법(ELISA) 플레이트에 코팅하는 단계;
(2) 상기 플레이트에 부착되지 않은 항체들을 세척하여 제거하는 단계;
(3) 상기 플레이트에 웨스트나일 바이러스 항원을 반응시키는 단계;
(4) 상기 플레이트에 부착되지 않은 웨스트나일 바이러스 항원을 세척하여 제거하는 단계;
(5) 검사혈청시료와 상기 호스레디쉬 페록시다제를 결합시킨 단클론항체 5E8을 경합적으로 반응시키는 단계;
(6) 상기 플레이트에 부착되지 않은 항체들을 세척하여 제거하는 단계;
(7) 효소반응에 의한 발색반응의 흡광도를 측정하여 검사 혈청 중의 웨스트나일 바이러스 중화항체 수준을 측정하는 단계;
또한 본 발명의 효소결합면역측정법은 호스레디쉬 페록시다제를 결합시킨 단클론항체 5E8 컨쥬게이트를 제조하는 단계를 포함한다.
그리고 본 발명의 융합세포주는 웨스트나일 바이러스 NY385-99주 (미국 American Tissue Culture Collection사) 항원으로 면역시킨 발브시 마우스로부터 채취한 B 림프구와 SP2/0 골수종유래 세포 간의 세포융합에 의하여 작성된 것으로 단클론항체 5E8을 분비함을 특징으로 한다. 또한 본 발명의 단클론항체 5E8은 웨스트나일 바이러스 E 외피단백질의 E367 알라닌 부위에 결합하여, 세포내 웨스트나일 바이러스 감염을 방어하는 것을 특징으로 한다.
이하, 본 발명을 도면을 참조하여 보다 구체적으로 설명한다.
도 1은 본 발명의 단클론항체 5E8의 웨스트나일 바이러스 중화능을 나타내는 플라크감소중화시험(PRNT) 결과의 도면이다. 이때 A : 웨스트나일 바이러스; B : 단클론항체 5E8 + 웨스트나일 바이러스; C : 음성대조(배양액)을 나타낸다. 그림에서 보는 바와 같이, 중화 단클론항체 5E8의 첨가로 인하여 웨스트나일 바이러스가 세포에 결합하는 것이 억제되었다.
도 2는 본 발명의 단클론항체 5E8에 대하여 중화반응을 회피하는 웨스트나일 바이러스 변이주를 확인하는 플라크감소중화시험(PRNT) 결과의 도면이다. 이때 A : 중화반응회피 웨스트나일 바이러스 변이주(WNV-mutant); B : 단클론항체 5E8와 WNV-mutant의 혼합; C : 음성대조(배양액)을 나타낸다. 도 B는 단클론항체 5E8에 대한 중화반응회피 변이주이기 때문에 도 1의 B와는 달리 단클론항체 5E8에 의해서 억제되지 않았다. 단클론항체 5E8에 대한 중화반응회피 변이주가 제대로 만들어졌음을 알 수 있었다.
도 3은 웨스트나일 바이러스 wild type (WNV-WT)과 웨스트나일 바이러스 변이주(WNV-mutant)간의 E 외피단백질 도메인 Ⅲ 내에서 아미노산 차이를 보이는 부분을 나타내는 도면이다. 웨스트나일 바이러스 wild type 에서는 E 외피단백질 367번째 아미노산이 알라닌이었는데, 단클론항체 5E8에 대한 웨스트나일 바이러스 변이주에서는 해당 아미노산이 발린으로 치환되었다.
도 4는 신규한 본 발명의 단클론항체 5E8을 이용하여 웨스트나일 바이러스 감염 방어항체를 경합적 효소결합면역측정법으로 신속하게 검출하는 모식도이다.
이를 단계적으로 상술하면,
(1) 웨스트나일 바이러스특이 단클론항체 2F10을 ELISA 플레이트에 코팅하는 단계;
(2) 상기 플레이트에 부착되지 않은 항체들을 세척하여 제거하는 단계;
(3) 상기 플레이트에 웨스트나일 바이러스 항원을 반응시키는 단계;
(4) 상기 플레이트에 부착되지 않은 웨스트나일 바이러스 항원을 세척하여 제거하는 단계;
(5) 검사혈청시료와 호스레이쉬 페록시다제를 결합시킨 단클론항체 5E8을 경합적으로 반응시키는 단계;
(6) 상기 플레이트에 부착되지 않은 항체들을 세척하여 제거하는 단계;
(7) 효소반응에 의한 발색반응의 흡광도를 측정하여 검사 혈청 중의 웨스트나일 바이러스 중화항체 수준을 측정하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 웨스트나일 바이러스 중화항체 검출방법이다.
또한 본 발명의 효소결합면역측정법은 호스레디쉬 페록시다제를 결합시킨 단클론항체 5E8 컨쥬게이트를 제조하는 단계를 포함한다.
플레이트 코팅에 사용하는 단클론항체 2F10은 웨스트나일 바이러스 진단항원을 포획하기 위한 항체로서, 일반적인 다른 웨스트나일 바이러스 특이 단클론항체를 사용해도 무방하다.
상기의 효소결합면역측정법에 사용되어지는 단클론항체 5E8은 바이러스 중화 관련 부위에 결합을 하기 때문에 표준진단법인 바이러스 중화시험(PRNT)을 대체하여 일반실험실에서 손쉽게 감염개체 혹은 백신접종 개체 혈청내의 바이러스 중화항체를 신속히 검출할 수 있다는 이점이 있다.
단클론항체 5E8은 웨스트나일 바이러스 항원이나 재조합 E 외피단백질을 마우스에 면역시키고, 이로부터 분리한 면역 B세포와 마우스 골수종유래세포간의 세포 융합에 의해서 생산된다. 이렇게 만들어진 융합세포주로서, 대한민국 서울시에 위치한 한국세포주은행(Korean Cell Line Research)에 2005년 7월 22일자로 기탁된 기탁번호 KCLRF-BP-00117의 융합세포주를 이용할 수 있다.
도 5는 신규한 본 발명의 단클론항체 5E8을 이용한 경합적 효소결합면역측정법으로 여러 가지 토끼혈청에 대한 중화 항체가를 측정한 결과를 보여주는 그래프이다. 이때 7 : 웨스트나일 바이러스(NY385-99주)를 접종 후 7일째 채혈한 혈청, 14 : 웨스트나일 바이러스(NY385-99주)를 접종 후 14일째 채혈한 혈청, 21 : 웨스트나일 바이러스(NY385-99주)를 접종 후 21일째 채혈한 혈청, B956 : 웨스트나일 바이러스(B956주)를 2회 접종 후 채혈한 혈청, 그리고 SVDV : 대조군으로서, 돼지수포병 바이러스를 3회 접종 후에 채혈한 혈청을 각각 나타내는 것이다.
이하, 본 발명을 실시예, 비교예 및 실험예를 통하여 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 이에 의해 한정되는 것은 아니고, 당업자에서 통상적으로 주지된 변형, 치환 및 삽입 등을 수행할 수 있으며, 이에 대한 것도 본원 발명의 범위에 포함된다.
[실시예 1] 웨스트나일 바이러스 특이 단클론항체를 생산하는 융합세포주의 제작.
단클론항체를 작성하기 위하여 농축 정제한 웨스트나일 바이러스(NY385-99주, 미국 American Tissue Culture Collection사)를 이용하였다. 즉 고역가의 웨스트나일 바이러스를 Vero 세포(미국 American Tissue Culture Collection 사)에 감염시킨 후 약 5일 후에 배양 상층액만을 수확하여 5000xg에서 30분간 원심분리하여 세포성분을 제거하였다. 상기의 바이러스 배양 상층액 1ℓ에 바이너리에틸이민을 최종농도가 1mM가 되게 첨가하여 37도에서 4시간 동안 바이러스를 불활화 한 다음 치오황산나트륨을 최종농도가 10mM이 되게 첨가하여 37도에서 1시간 동안 반응시켰다. 불활화 바이러스 배양액 1ℓ에 폴리에틸렌 글리콜[Polyethylene glycol 800 (PEG 8000)] 23g 및 염화나트륨(Sodium chloride) 70g을 가하여 4℃에서 밤새 반응시켰다. 상기의 배양액을 5000xg에서 30분간 원심분리하여 배양 상층액을 제거하고, 침전물을 차가운 0.01M PBS 10㎖로 부유한 후, 바이러스 항원을 투석(Dialysis)하여 제조하였다.
불활화 웨스트나일 바이러스 항원은 불완전 프로인트어쥬반트(Incomplete Freund Adjuvant)와 동량으로 균질하게 혼합한 다음, 혼합액 0.05㎖를 발브시 마우스(Balb/c mouse)의 발바닥(Foot-pad)에 접종하였다. 면역 후, 12 ~ 15일 사이에 슬와 임파절(Popliteal lymph node)을 채취하여 세포융합에 사용하였다.
세포융합은 폴리에틸렌글리콜을 사용하는 일반적인 방법으로 다음과 같이 실 시하였다. 상기 채취한 림프구를 무혈청 배지(Serum Free Medium; SFM)로 세척한 후, 마우스 골수종 유래세포주(SP2/0-Ag14 mouse myeloma cell line)와 5 : 1 내지 10 : 1 비율로 혼합한 후 PEG1500을 첨가하여 융합하였다. 융합이 완료된 세포는 HAT(Hypoxanthine Aminopterin Thymidine) 증식배지(10% 우태아혈청을 첨가한 D-MEM)에 적당히 희석한 후 미리 마우스복강세포를 배양되어 있는 96웰 마이크로플레이트에 100㎕씩 분주하여 37℃, 5% 이산화탄소 배양기 내에서 배양하였다.
웨스트나일 바이러스에 대한 단클론항체를 생산하는 융합세포주의 선발은 다음과 같이 실시하였다. 상기 세포융합의 결과로 융합세포가 증식한 웰의 배양 상층액을 수거하여 간접형광항체법에 슬라이드에 코팅된 웨스트나일 바이러스 감염세포에 특이 양성반응을 보이는 웰의 융합세포들을 마우스 복강세포가 배양된 96웰 플레이트에 웰당 0.5개의 세포가 포함되도록 첨가하고 단일클론(clone)이 형성될 때까지 배양하였다. 웨스트나일 바이러스에 대한 항체를 생산하면서 단 하나의 클론만이 증식하는 웰이 융합을 선발하였다. 상기 선발된 융합세포주를 발브시 마우스(Balb/c mouse)의 복강에 접종하여 생성시킨 복수를 채취하여 실험에 사용하였다. 작성한 단클론항체들은 바이러스 중화능 (하기의 실시예 3) 및 E 외피단백질 도메인 III와의 반응성(하기의 실시예 6)을 조사하였다. 본 실험에서 선발된 웨스트나일 바이러스에 대한 단클론항체 생산 세포주의 특성은 하기 표 1에 표시하였다.
| 단클론항체 | Isotype | E 단백질 도메인 Ⅲ 반응성 | 바이러스 중화능 |
| 5E8 | IgG1, κ | 유 | 유 |
| 2F10 | IgG2, κ | 무 | 무 |
[실시예 2] 효소결합면역측정법에 의한 단클론항체의 반응성 조사
상기 실시예 1의 단클론항체들의 웨스트나일 바이러스에 대한 반응성 보유여부를 평가하기 위하여 간접 효소결합면역측정법를 다음과 같이 실시하였다. 불활화 웨스트나일 바이러스 항원을 0.01M PBS로 5 내지 10㎍/㎖되게 희석하여 ELISA 플레이트의 웰에 50㎕씩 분주한 후 37℃에서 1시간 동안 흡착시켰다. 또한 Vero 세포를 음성 대조항원으로 사용하였으며, 동일한 방법으로 흡착시켰다. 그 다음, ELISA 플레이트에 부착하지 않은 산물들은 0.05% 트윈 20(Tween 20)이 함유된 0.002M PBS(PBST) 세척용액으로 3회 세척하여 제거하였다. 그 후 블로킹 완충용액(0.01M PBS에 0.05% 트윈 20 및 5 스킴밀크를 첨가한 용액)으로 1 : 1000 배 희석한 단클론항체를 각 항원 당 두 웰씩 반복하여 웰당 50㎕씩 분주하고 37℃에서 1시간 동안 반응하게 하였다. 이때 웨스트나일 항체 양성 마우스 혈청과 웨스트나일 항체 음성 마우스 혈청을 모든 플레이트 마다 첨가하여 반응의 평가기준으로 삼았다. 상기 반응이 끝난 후, PBST로 3회 세척하고 항-마우스 면역글로불린 페록시다제 컨쥬게이트(anti-mouse IgG+IgA+IgM Peroxidase conjugate; KPL사)를 불로킹 완충용액으로 2000배되게 희석하여 각 웰에 50㎕씩 분주하여 37℃에서 1시간 동안 반응하게 하였다. 상기 반응이 끝난 후, ELISA 플레이트를 PBST로 3회 세척하고 오피디(O-PhenyleneDiamine; OPD) 용액(Sigma사)을 각 웰에 50㎕씩 분주한 후, 실온에서 10분간 발색시켰다. 그 후 1.25M 황산용액을 웰당 50㎕씩 분주함으로써 발색반응을 중지시키고 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 상기 반응의 결과 판정에서, 음성대조 검사항원의 합광도 대비 최소 2배 이상일 경우 양성으로 판정하였다.
표 2는 웨스트나일 바이러스에 대한 단클론항체의 반응성을 조사한 결과이다. 단클론항체 5E8과 2F10 모두 웨스트나일 바이러스에 대하여 강한 항원-항체반응을 나타내었다. 대조군으로 사용한 돼지수포병 바이러스 특이 단클론항체(3H10)은 웨스트나일 바이러스 항원과 전혀 반응성이 없었다. 이 결과는 단클론항체 5E8과 2F10이 웨스트나일 바이러스에 특이적으로 반응하는 단클론항체임을 보여주는 것이다.
| 단클론항체 | 단클론항체 희석배수별 흡광도 | ||
| 1 : 1000 | 1 : 4000 | 1 : 16000 | |
| 5E8 | 1.12 | 1.06 | 0.97 |
| 2F10 | 1.85 | 2.29 | 2.25 |
| 3H10(음성대조) | 0.05 | 0.05 | 0.05 |
[실시예 3] 단클론항체의 웨스트나일 바이러스 중화능 보유여부 조사
상기 실시예 1의 단클론항체들이 웨스트나일 바이러스 중화능을 보유하고 있는지를 평가하기 위하여 플라크감소중화시험(Plaque Reduction Neutralization Test, PRNT)을 다음과 같이 실시하였다. 기니픽혈청 10%(v/v)를 함유한 배양액으로 100 plaque forming unit (PFU)/ml 로 희석한 웨스트나일 바이러스 NY385-99주를 동일 배양액으로 100배 희석한 단클론항체와 혼합하여 37℃에서 75분간 반응시켰다. 그 후, 미리 24웰 플레이트에 단층 배양한 Vero 세포주에 0.1㎖씩 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 배양액, 바이러스액, 단클론항체 만을 첨가한 웰을 각각 대조웰로 사용하였다. 반응이 완료한 후, 접종액을 모두 제거하고 1% 한천이 함유된 배양액으로 일차 오버레이(overlay)하여 3일간 37℃, 5% 이산화탄소 배양기 내에서 배양하였다. 그 후 1% 한천과 0.006% Neutral red 가 함유된 배양액으로 이차 오버레이(overlay)하여 다음날 각 웰에 형성된 플라크의 수를 측정하였다. 바이러스만 첨가한 웰의 플라크 수의 90% 이상 감소한 경우 바이러스 중화능을 보유하고 있다고 판정하였다.
도 1은 실시예 3의 플라크감소중화시험 결과를 나타낸 도면이다. 웨스트나일 바이러스만을 접종한 웰(A)에서는 많은 플라크가 관찰되었으나, 단클론항체 5E8와 혼합한 웨스트나일 바이러스 혼합액을 접종한 웰에서는 플라크가 전혀 형성되지 않았다. 이것은 단클론항체 5E8이 웨스트나일 바이러스에 대한 중화능이 있음을 보여주는 결과이다.
[실시예 4] 단클론항체의 반응부위 결정을 위한 중화반응회피 변이주 작성
상기 실시예 1의 중화 단클론항체 5E8가 결합하는 웨스트나일 바이러스 내 결합부위 즉 에피톱을 분석하기 위하여 중화반응회피 변이주를 다음과 같이 실시하여 작성하였다. 미리 단층배양한 Vero 세포에 10-1부터 10진희석한 웨스트나일 바이러스 NY395-99주와 2%의 단클론항체 5E8 복수(Ascitic fluids)를 함께 접종하여 7일간 37℃, 5% 이산화탄소 배양기 내에서 배양하였다. 세포변성을 보이지 않은 가장 높은 농도의 바이러스 첨가 웰의 상층액을 선발하여 플라크 시험을 실시하였고, 최소한 3개 이상의 플라크를 채취하여 2%의 단클론항체 5E8 복수를 포함한 배양액에서 각각 증식하였다.
도 2는 웨스트나일 바이러스 중화반응회피 변이주를 작성하여 단클론항체 5E8에 의한 중화반응을 회피하는지 여부를 확인하기 위하여 플라크감소중화시험(PRNT)를 실시한 결과이다. 웨스트나일 바이러스 중화반응 회피 변이주만을 접종한 웰(A)과 비교 관찰하였을 때, 웨스트나일 바이러스 중화반응 회피 변이주(WNV-mutant)를 단클론항체 5E8와 혼합하여 접종한 웰(B)에서도 플라크의 감소가 일어나지 않았다. 이는 중화반응 회피 변이주가 단클론항체 5E8에 대한 중화회피 변이주가 정확하게 제작되었음을 보여주는 결과이다.
[실시예 5] 중화반응 회피 변이주의 E 외피단백질 도메인 Ⅲ 염기서열 분석
상기의 각 변이주 바이러스를 Vero 세포주에 접종한 후, 배양 상층액으로부터 RNeasy RNA extraction kit (Qiagen)를 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 전체 RNA를 추출하였다. 웨스트나일 바이러스 E 외피단백질 도메인 Ⅲ 유전자의 cDNA 합성은 상기에서 추출한 전체 RNA와 하기 서열번호: 2의 리버스 프라이머(reverse primer)를 cDNA 합성을 위한 RT primix kit (Bioneer)의 튜브에 첨가하여 제조사의 매뉴얼에 따라 첫 번째 가닥 cDNA를 합성하였다. 그 다음, 첫 번째 가닥 cDNA, 서열번호: 1의 포워드 프라이머(forward primer), 서열번호: 2의 리버스 프라이머(reverse primer)를 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)을 위한 PCR premix kit(Bioneer)의 튜브에 첨가하여 95℃에서 5분간 열처리한 후 94℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃에서 1분을 1 사이클로 하여 PCR 증폭기 (PE 9600; Perkin Elmer)에서 30 사이클 반복하여 PCR 증폭을 실시하고, 마지막으로 72℃ 5분간 DNA 합성을 실시하였다.
서열번호: 1 (Forward primer): 5'-ggatcccagttgaagggaacaaccta-3'
서열번호: 2 (Reverse primer): 5'-aagcttacgctcctttgagggtggttg-3'
상기에서 증폭된 각 바이러스 클론의 E 외피단백질 도메인 Ⅲ 유전자 cDNA 단편은 제한효소처리없이, 바로 pGEM-Teasy(Promega사, USA) 플라스미드에 클로닝하여, 자동염기서열분석기(ABI 377, USA)를 사용하여 유전자 염기서열을 비교 분석하였다.
도 3은 중화반응회피 웨스트나일 바이러스 변이주(WNV△5E8)의 E 외피단백질 도메인 Ⅲ의 염기서열을 도식화한 것이다. 정상 대조 바이러스 클론과 비교하였을 때 중화반응회피 변이주는 E 외피단백질 367번째의 아미노산인 알라닌이 발린으로 치환되었다. 이것은 E367 알라닌 부위가 단클론항체 5E8의 결합반응 부위임을 보여주고 있는 것이다.
[실시예 6] 대장균발현 E 외피단백질의 도메인 Ⅲ를 이용한 단클론항체 5E8의 결합 부위 확인
상기 실시예 5에서 중화반응회피 바이러스 변이주의 염기서열분석을 통하여 분석된 E367 부위가 실제로 단클론항체 5E8의 결합반응부위인지 여부를 확인하기 위하여 웨스트나일 바이러스 NY385-99(WNV-WT)와 E367 알라닌이 발린으로 전환된 바이러스 변이주(WNV-mutant) 각각의 E 외피단백질의 도메인 Ⅲ (E296부터 E415)를 말토오즈결합단백질(Maltose-binding protein; MBP)에 융합한 형태로 대장균에서 발현하였다. 표 3은 상기 실시예 2의 간접 효소결합면역측정법으로 각 바이러스의 재조합 E 외피단백질 도메인 Ⅲ (E-Ⅲ) 단백질에 대한 단클론항체 5E8의 반응성을 조사한 결과이다. 단클론항체 5E8은 WNV-WT 유래 재조합 E-Ⅲ 단백질에 대하여는 강한 항원-항체반응을 나타내었으나, E367 알라닌이 E367 발린으로 전환된 WNV-mutant 유래 재조합 E-Ⅲ 단백질에 대하여는 전혀 반응성이 나타나지 않았다. 이 결과는 E367 알라닌이 단클론항체 5E8의 중요한 결합부위임을 나타내는 것이다.
| 단클론항체 | 흡광도(재조합 E-Ⅲ 항원 이용한 효소결합면역측정법) | ||
| WNV-WT | WNV-mutant | MBP(항원대조) | |
| 5E8 | 1.62 | 0.05 | 0.05 |
| 2F10 | 0.05 | 0.05 | 0.05 |
[실시예 7] 단클론항체(5E8) 호스레디쉬 페록시다제 컨쥬게이트 제조
상기 단클론항체 5E8은 Immunopure(A/G)TM IgG Purification kit(PIERCE사, USA)를 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 정제하였다. 그런 다음 정제된 단클론항체(1.2mg/300㎕)는 Peroxidase labeling kit(Roche사)를 사용하여 페록시다제와 컨쥬게이트시켰다. 상기의 단클론항체 페록시다제 컨쥬게이트는 상기 페록시다제 항체 라벨링키트에서 제공하는 안정화완충용액(Stabilization solution)과 동량으로 혼합하여 액체질소에서 급격히 얼린 후 -70℃에서 보관하였다. 단클론항체 5E8 컨쥬게이트는 500배 희석하여 본 발명의 ELISA에 사용하였다.
[실시예 8] 단클론항체 5E8을 이용한 웨스트나일 바이러스 중화항체 검출 효소결합면역측정법
단클론항체 5E8을 이용하여 웨스트나일 바이러스 중화항체를 검출하기 위한 효소결합면역측정법은 웨스트나일 바이러스 항원을 포획하는 단클론항체 2F10, 검사혈청내 항체와 경합반응하는 단클론항체 5E8 (페록시다제가 결합된 컨쥬게이트)를 사용하는 방법으로서 웨스트나일 바이러스 중화항체를 검출하는 방법은 다음과 같다.
효소결합면역측정법 플레이트 0.01M PBS, pH 7.4로 희석한 단클론항체 2F10 (2.5㎍/㎖)를 웰당 50㎕씩 분주하여 37℃에서 1시간 동안 반응하게 하였다. PBST로 플레이트를 3회 세척한 후, 블로킹 완충용액(상기 실시예 2 기재)으로 적정하게 희석한 불활화 웨스트나일 바이러스 항원 (실시예 1 참조)을 웰당 50㎕씩 분주하여 37℃에서 1시간 동안 반응하게 하였다. 그 후 PBST로 세척한 다음, 검사혈청 (1:5 희석 또는 단계희석)과 단클론항체 5E8 컨쥬게이트(500배 희석) 혼합액을 웰당 50㎕씩 분주하여 37℃에서 1시간 동안 반응하게 하였다. 양성 및 음성 대조혈청도 동일한 방법으로 반응을 실시하였다. 상기 반응이 끝난 후, 효소결합면역측정법 플레이트를 PBST로 3회 세척하고 OPD(O-PhenyleneDiamine) 용액(Sigma 사)을 각 웰에 50㎕씩 분주한 후, 실온에서 10분간 발색시켰다. 그 후 1.25M 황산용액을 웰당 50㎕씩 분주함으로서 발색반응을 중지시키고 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 검사의 결과는 혈청없이 단클론항체만을 첨가한 웰(단클론항체 대조웰)의 흡광도 대비 검사웰의 흡광도 억제율 %로 환산하여 분석하였다. 상기 반응의 결과 판정에서, 단클론항체 대조웰의 흡광도보다 50% 이상 발색이 저해된 웰, 즉 발색저해도(Percent Inhibition, PI)가 50 이상인 경우 웨스트나일 바이러스 중화항체 양성반응으로 판정하였다.
[시험예 1] 웨스트나일 바이러스를 실험 감염한 마우스 혈청에의 적용.
발브시 마우스에 1,000 PFU의 웨스트나일 바이러스 NY385-99주를 감염시킨 후 일주일 간격으로 채취한 마우스 혈청을 대상으로 본 발명의 진단방법으로 검사하여, 플라크감소중화시험법의 결과와 비교하였다.
표 4는 본 발명의 웨스트나일 바이러스 중화항체 검출 c-ELISA에 의하여 상기 검사시료를 조사한 결과이다. 검사한 마우스혈청 시료 중 감염 후 7일째 및 14일째 혈청에서 강한 양성반응을 나타내었으며, 이들 혈청들은 모두 플라크감소중화시험(PRNT)에서도 100배 이상의 중화항체가를 보였다. PBS를 접종한 마우스 혈청들은 모두 음성반응을 나타내었다. 이것은 본 발명의 효소결합면역측정법이 플라크감소중화시험법의 결과와 동일하게 효과적으로 웨스트나일 중화항체를 검출할 수 있음을 나타낸다.
| 검사방법 | PBS 접종 14일후 혈청 (검사두수) | 접종 7일후 혈청 (검사두수) | 접종 14일후 혈청 (검사두수) |
| 본 발명의 ELISA검사결과 (평균PI ±표준편차) | 0.7 ± 9.8 (n=10) | 95.2 ± 1.4 (n=4) | 93.4 ± 2.1 (n=3) |
| 플라크감소중화시험 | < 1 : 10 | > 1 : 100 | > 1 : 100 |
[시험예 2] 웨스트나일 바이러스를 실험 감염한 토끼혈청에의 적용.
토끼의 근육으로 1,000 PFU의 웨스트나일 바이러스 NY385-99주를 감염시킨 후 일주일 간격으로 채취한 토끼혈청을 대상으로 본 발명의 진단방법으로 검사하여, 플라크감소중화시험법의 결과와 비교하였다.
도 5는 본 발명의 웨스트나일 바이러스 중화항체 검출 c-ELISA에 의하여 상기 검사시료를 조사한 결과이다. 검사한 토끼혈청 시료 중 감염 후 7일째부터 21일째까지 공히 강한 양성반응을 나타내었으며, 이들 혈청들은 모두 플라크감소중화시험(PRNT)에서도 100배 이상의 중화항체가를 보였다. 참고로, 웨스트나일 바이러스를 유전적으로 크게 두 가지로 대별했을 때, 본 실험에 사용한 뉴욕주(385-99주)는 lineage 1에 속하고, B957주는 lineage 2에 속한다. B956주 토끼혈청(플라크감소중화시험에서 100배 이상의 중화항체가를 보임.)과의 반응성에서도 lineage 1 혈청에서와 마찬가지로 강한 양성반응을 나타내었다. 즉, 본 발명의 효소결합면역측정법은 웨스트나일 바이러스의 lineage에 상관없이 모든 웨스트나일 바이러스의 중화항체를 검출할 수 있음을 보여주는 것이다. 그리고, 대조군으로서 사용한 돼지수포병 바이러스에 대한 토끼혈청에서는 완전한 음성반응을 나타내었다. 이것은 본 발명의 효소결합면역측정법이 플라크감소중화시험법의 결과와 동일하게 웨스트나일바이러스 특이적인 반응을 나타내며, 또한, 접종 7일째부터 매우 강한 양성반응을 보일 정도로 초기 감염시에도 효과적으로 웨스트나일 중화항체를 검출할 수 있음을 보여주는 것이다.
[시험예 3] 웨스트나일 바이러스를 실험 감염한 거위 혈청에의 적용.
거위에 1,000 PFU의 웨스트나일 바이러스 NY385-99주를 감염시킨 후 일주일 간격으로 채취한 거위혈청을 대상으로 본 발명의 진단방법으로 검사하여, 플라크감소중화시험법의 결과와 비교하였다.
표 5는 본 발명의 웨스트나일 바이러스 중화항체검출 c-ELISA에 의하여 상기 검사시료를 조사한 결과이다. 검사한 거위혈청 시료 중 감염 후 7일째 및 14일째 혈청에서 강한 양성반응을 나타내었으며, 이들 혈청들은 모두 플라크감소중화시험(PRNT)에서도 100배 이상의 중화항체가를 보였다. 대조군으로서 PBS를 접종한 개체에서는 모두 음성반응을 나타내었다. 이것은 본 발명의 효소결합면역측정법이 플라크감소중화시험법의 결과와 동일하게 효과적으로 또한 접종초기에도 신속하게 웨스트나일 중화항체를 검출할 수 있음을 보여준다.
| 검사방법 | PBS 접종 14일후 혈청 (검사두수) | 접종 7일후 혈청 (검사두수) | 접종 14일후 혈청 (검사두수) |
| 본 발명의 ELISA검사결과 (평균PI ±표준편차) | 35.7 ± 5.5 (n=3) | 93.6 ± 2.1 (n=5) | 96.0 ± 0.8 (n=4) |
| 플라크감소중화시험 | < 1 : 10 | > 1 : 100 | > 1 : 100 |
[시험예 4] 웨스트나일 바이러스 백신접종 말 혈청에의 적용.
웨스트나일 바이러스 불활화 백신을 접종한 말 혈청 212점과 웨스트나일 바이러스 항체가 없는 몽골지역의 비백신접종 말 혈청 96점을 실시예 7에 기재된 본 발명의 진단방법으로 검사하여, 플라크감소중화시험법(PRNT)의 결과와 비교하였다.
표 6은 본 발명의 웨스트나일 바이러스 중화항체검출 c-ELISA에 의하여 상기 검사시료를 조사한 결과이다. 본 발명의 c-ELISA는 검사한 말 혈청 중, PRNT 양성혈청 180점 가운데서 166점에서 중화항체를 검출하여 상대적 민감도가 92%이었으며, PRNT 음성혈청 127점 중 2점에서 양성반응을 나타내어 상대적 특이도 98%를 나타내었다. 이 결과는 본 발명의 c-ELISA가 웨스트나일 바이러스 중화항체를 효과적이고 특이적으로 검출하고 있음을 나타내고 있는 것으로서, 본 발명의 ELISA가 현재 웨스트나일열 표준진단법으로 사용되어지는 플라크감소중화시험(PRNT)법을 대체할 수 있음을 나타낸다.
| 플라크감소중화시험(PRNT) | ||||
| 양 성 | 음 성 | 소 계 | ||
| 본 발명의 ELISA | 양성 | 166 | 2 | 166 |
| 음성 | 14 | 125 | 139 | |
| 소계 | 180 | 127 | 307 | |
이상의 실시예 및 시험예를 통하여 살펴본 바와 같이, 본 발명의 융합세포주에 의해 생산되는 단클론항체는 웨스트나일 바이러스를 중화시킬 수 있는 능력을 보유하고 있으므로, 진단항체로서 뿐만 아니라 치료제 항체로 개발에도 사용될 수 있다.
신규한 본 발명의 진단방법은 토끼, 거위, 말 등의 축종에 관계없이 모든 감염축종의 혈청 진단에 사용할 수 있으며, 웨스트나일 바이러스 예방을 위하여 백신접종된 개체에서 감염방어항체 수준을 신속히 측정할 수 있다.
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Claims (5)
- 삭제
- 웨스트나일 바이러스 항원이나 재조합 E 외피단백질을 마우스에 면역시키고, 이로부터 분리한 면역 B세포와 마우스 골수종유래세포간의 세포융합에 의해서 생산되어, 웨스트나일 바이러스를 중화시키는 웨스트나일 바이러스 특이 단클론항체 5E8을 생산함을 특징으로 하는 융합세포주(기탁번호 KCLRF-BP-00117).
- 제 2항의 웨스트나일 바이러스 중화단클론항체 5E8을 이용한 효소결합면역측정법(ELISA)으로,검사혈청과 단클론항체 5E8간의 경합적 반응에 의하여 웨스트나일 바이러스 중화 단클론항체를 검출하는 것을 특징으로 하는 웨스트나일 바이러스의 중화항체 검출방법.
- 제 3항에 있어서,(1) 웨스트나일 바이러스 특이 단클론항체를 효소결합면역측정법(ELISA) 플레이트에 코팅하는 단계;(2) 상기 플레이트에 부착되지 않은 항체들을 세척하여 제거하는 단계;(3) 상기 플레이트에 웨스트나일 바이러스 항원을 반응시키는 단계;(4) 상기 플레이트에 부착되지 않은 웨스트나일 바이러스 항원을 세척하여 제거하는 단계;(5) 검사혈청시료와 호스레디쉬 페록시다제를 결합시킨 단클론항체 5E8을 경합적으로 반응시키는 단계;(6) 상기 플레이트에 부착되지 않은 항체들을 세척하여 제거하는 단계;(7) 효소반응에 의한 발색반응의 흡광도를 측정하여 검사 혈청 중의 웨스트나일 바이러스 중화항체 수준을 측정하는 단계;를 포함하여 구성되는 단계를 수행함을 특징으로 하는 웨스트나일 바이러스의 중화항체 검출방법.
- 제 4항에 있어서,상기 호스레디쉬 페록시다제와 결합된 단클론항체 5E8을 사용하는 것을 특징으로 하는 웨스트나일 바이러스의 중화항체 검출방법.
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| US20040213808A1 (en) | 2002-12-11 | 2004-10-28 | Michael Lieberman | Recombinant vaccine against flavivirus infection |
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