CN107976536B - 一种检测母猪初乳中sIgA的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种检测母猪初乳中sIgA的试剂盒，属于生物技术领域。检测母猪初乳中sIgA的试剂盒，包括猪sIgA‑Fc蛋白纳米抗体51溶液和辣根过氧化物酶标记的猪sIgA‑Fc蛋白纳米抗体72溶液；所述猪sIgA‑Fc蛋白纳米抗体51的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述猪sIgA‑Fc蛋白纳米抗体72的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。本发明检测母猪初乳中sIgA水平的试剂盒，制备方法简单、制作成本低、特异性强、灵敏度高、稳定性好。

Description

一种检测母猪初乳中sIgA的试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测母猪初乳中sIgA的试剂盒。

背景技术

动物黏膜免疫系统是机体整个免疫网络的重要组成部分，是具有其独特结构和功能的独立免疫体系。黏膜免疫防御着外界病原体对机体的入侵，是动物机体防御感染的第一道防线，因此黏膜免疫在预防动物传染病中发挥了巨大的作用。在黏膜免疫机制中，免疫球蛋白A(Immunoglobulin A,IgA)起着举足轻重的作用。其中，分泌型免疫球蛋白A(Secretory Immunoglobulin A,SIgA)是机体黏膜局部抗感染免疫的主要效应因子，又称为黏膜局部抗体。IgA有单体、双体和多聚体之分，血清中以7S的单体即血清型IgA为主，分泌液中以11S的双体即sIgA为主。sIgA的主要功能有：阻抑黏附、免疫排除、溶解细菌、中和病毒、介导ADCC、抗炎症、促进天然因子的作用以及调节黏膜免疫反应。它是机体黏膜防御系统的主要成分，在黏膜免疫中发挥关键作用，主要由J链连接的IgA二聚体以及分泌片段(SC)结合后形成，分子量约400KDa，多见于胃肠道、呼吸道、泌尿生殖道和口腔/鼻腔粘膜部位。因此，机体黏膜sIgA的分泌水平对机体黏膜免疫应答具有重要的保护意义。

仔猪在出生时体内没有免疫球蛋白，出生后通过摄取母猪的初乳而获得免疫球蛋白。初乳中免疫球蛋白主要是IgA，且以分泌型的sIgA为主。新生仔猪摄取初乳后经肠上皮进入循环，为机体提供了来自母猪的免疫球蛋白，进入仔猪消化道的病毒是通过与初乳中的抗体在肠道不断中和而起主要保护作用的。所以，通过检测妊娠母猪初乳中的sIgA水平，是目前预防、监控和诊断新生仔猪疾病的主要手段，对妊娠母猪疫苗免疫效果评价、哺乳仔猪免疫程序的制定和流行状态检测具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测母猪初乳中sIgA水平的试剂盒，该试剂盒制备方法简单、制作成本低、特异性强、灵敏度高、稳定性好。

本发明的目的采用如下技术方案实现。

检测母猪初乳中sIgA的试剂盒，包括猪sIgA-Fc蛋白纳米抗体51溶液和辣根过氧化物酶标记的猪sIgA-Fc蛋白纳米抗体72溶液；所述猪sIgA-Fc蛋白纳米抗体51的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述猪sIgA-Fc蛋白纳米抗体72的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

优选的技术方案中，所述猪sIgA-Fc蛋白纳米抗体51的浓度为0.2-2.0mg/mL，辣根过氧化物酶标记的猪sIgA-Fc蛋白纳米抗体72的浓度为20-100μg/mL。

在本发明中，所述猪sIgA-Fc蛋白纳米抗体51采用如下方法制备：将猪sIgA-Fc蛋白纳米抗体51的编码基因插入pMECS载体，然后导入大肠杆菌WK6感受态细胞，获得重组菌A；诱导重组菌A表达目的蛋白，裂解重组菌A后纯化获得纳米抗体51。

优选的技术方案中，猪sIgA-Fc蛋白纳米抗体51的编码基因序列如SEQ ID NO:2所示。

在本发明中，所述辣根过氧化物酶标记的猪sIgA-Fc蛋白纳米抗体72采用如下方法制备：将猪sIgA-Fc蛋白纳米抗体72的编码基因插入pMECS载体，然后导入大肠杆菌WK6感受态细胞，获得重组菌B；诱导重组菌B表达目的蛋白，裂解重组菌B后纯化获得纳米抗体72；采用辣根过氧化物酶标记纳米抗体72。

在本发明中，猪sIgA-Fc蛋白纳米抗体72的编码基因序列如SEQ ID NO:4所示。

在本发明中，所述试剂盒还包括辣根过氧化物酶显色液、猪sIgA标准品、牛血清白蛋白溶液、包被液、封闭液、洗涤液、样品稀释液、终止液和酶标板。

本发明的有益效果在于：本发明通过噬菌体展示技术进行纳米抗体的筛选，得到了两个可以识别不同表位、高灵敏度、高特异性、高稳定性的猪sIgA-Fc蛋白纳米抗体，分别可以作为检测母猪初乳中sIgA的包被抗体和检测抗体。本发明利用所获得的两株纳米抗体建立的双抗夹心ELISA检测试剂盒，是国内外首次利用纳米抗体研制的母猪初乳中sIgA双抗夹心ELISA检测试剂盒，特异性好、稳定性高、操作简单、省时省力，适合临床样品的批量检测，可以实现对母猪初乳中sIgA进行高灵敏度的检测，检测下限达到了0.001μg/mL。由于本发明所获得的纳米抗体可以通过培养重组菌，原核诱导表达的方法制备，且具有较高的稳定性。所以，在与其他同类型抗体相比时，本发明获得的纳米抗体在检测诊断试剂盒的研发方面可以显著延长试剂盒的有效期、缩短试剂盒研发周期、降低制作成本。

附图说明

图1猪sIgA-Fc基因片段PCR扩增结果。其中M：DL2000bp DNA marker，另一泳道为猪sIgA-Fc基因片段扩增产物。

图2纯化后的猪sIgA-Fc蛋白的SDS-PAGE电泳图和Western Blot鉴定结果。泳道1:是纯化后的猪sIgA-Fc蛋白的SDS-PAGE鉴定结果；泳道2:是纯化后的猪sIgA-Fc蛋白的Western Blot鉴定结果；M:protein standards。

图3VHH基因PCR扩增结果。其中M：DL2000bp DNA marker，另一泳道为VHH基因片段扩增产物。

图4显示了噬菌体基因文库单克隆的鉴定电泳图。其中泳道1-24分别表示随机挑选构建的噬菌体基因文库单克隆，M：DL2000bp DNA marker。

图5显示了噬菌体文库3轮亲和筛选富集过程，first round、second round、thirdround分别表示第一、第二、第三轮筛选；每轮筛选中，左侧为：猪sIgA-Fc蛋白组；右侧为：空白对照组。

图6间接ELISA方法检测纳米抗体的结合活性。横坐标表示不同纳米抗体编号，纵坐标表示OD₄₅₀数值，sIgA-Fc表示样品孔，Control表示对照孔。

图7间接ELISA方法检测纳米抗体的特异性。横坐标表示不同纳米抗体编号，纵坐标表示OD₄₅₀数值，sIgA-Fc、IgG、IgM、sIgA-Fab表示包被抗原。

图8纯化后的纳米抗体51和72的SDS-PAGE电泳图和Western Blot鉴定结果。泳道1，2:分别是纯化后的纳米抗体51、72的Western Blot鉴定结果；泳道3、4:分别是纯化后的纳米抗体72、51的SDS-PAGE鉴定结果；M:protein standards。

图9纳米抗体热稳定性鉴定结果，横坐标表示处理时间，纵坐标表示相对活力。

图10间接ELISA方法检测HRP标记后的Nb51、Nb72与猪sIgA-Fc蛋白的结合活性。横坐标表示HRP标记的不同的纳米抗体编号，纵坐标表示OD₄₅₀数值，sIgA-Fc表示样品孔，Control表示对照孔。

图11双抗体夹心法鉴定纳米抗体敏感性，横坐标为猪sIgA-Fc蛋白的浓度，纵坐标表示OD₄₅₀数值，Nb51表示捕获抗体。

具体实施方式

本发明结合附图和具体实施例作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。

实施例1猪sIgA-Fc蛋白的制备

1.猪sIgA编码基因的合成

根据NCBI公布的猪sIgA编码基因的核苷酸序列(序列登录号为NM_001123112.2)，将该编码基因送上海生工生物技术有限公司进行合成。

2.引物的设计与合成

利用引物设计软件Primer5.0设计用于扩增猪sIgA中Fc段蛋白(缩写为sIgA-Fc蛋白)编码基因(缩写为sIgA-Fc基因)片段(360bp)的PCR引物F和R。各引物的具体序列如表1。

表1PCR扩增引物

引物	序列(5’-3’)
		F	<u>GAGCTC</u>AAAGTTAACACCT(下划线为Sac Ⅰ酶切位点)
R	<u>CTCGAG</u>AACGTTAACATGGGTCGGT(下划线为Xho Ⅰ酶切位点)

3.sIgA-Fc片段的扩增

利用本实施例标题1合成的猪sIgA编码基因片段为模板，利用F和R为上下游引物，PCR扩增获得大小约为360bp的基因片段。反应条件为：95℃3min；95℃30s，59℃1min，72℃1min，共30个循环；72℃10min。反应结束后，PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，紫外灯下观察目的条带，如图1所示，可见大约360bp的sIgA-Fc基因片段，与预期大小一致。利用凝胶回收试剂盒(购自TAKARA公司)对目的条带进行纯化和回收。

4.猪sIgA-Fc蛋白的诱导表达与纯化鉴定

将纯化回收的猪sIgA-Fc基因片段采用Sac I和Xho I酶切后，连入pET28a载体(购自Novagen公司)。将连接产物转化至E.coli BL21感受态细胞(购自Novagen公司)中，37℃培养1h，将菌液离心浓缩后涂在含有卡那霉素抗性的LB平板培养基上，37℃培养12～16小时；挑选单个菌落，获得表达猪sIgA-Fc蛋白的重组菌1。

利用重组菌1制备猪sIgA-Fc蛋白。具体方法如下：将重组菌1接种在5mL含有卡那霉素的LB培养液中，在37℃摇床中培养至OD₆₀₀＝0.6～0.9，取1mL菌液转接至500mL LB培养液中，在37℃摇床中培养，当OD₆₀₀值达到0.6～0.9时，加入终浓度为1M的IPTG，在28℃摇床中培养12～16小时诱导重组菌表达目的蛋白，离心收集菌体沉淀，利用超声破碎重组菌1，取菌体裂解液作为猪sIgA-Fc蛋白粗提液，采用镍柱(购自GE Healthcare公司)亲和层析法纯化猪sIgA-Fc蛋白。取纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定。从图2可以看到猪sIgA-Fc蛋白在大约13kD处均有明显条带，与目的片段预期大小相一致，纯度达90％以上。

实施例2针对猪sIgA-Fc蛋白纳米抗体文库的构建

1.RNA的提取与cDNA的合成

将1mg实施例1制备的猪sIgA-Fc蛋白与弗氏完全佐剂等体积混合，对一只新疆双峰驼进行免疫；1周之后，将1mg猪sIgA-Fc蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混合，免疫该双峰驼，每周一次，共免疫6次，刺激机体产生针对抗原的特异性抗体；免疫结束后，提取100mL骆驼外周血淋巴细胞，提取淋巴细胞的总RNA，按照反转录试剂盒(购自TAKARA公司)说明操作，合成cDNA。

2.引物的设计与合成

根据参考文献(Beta-lactamase inhibitors derived from single-domainantibody fragments elicited in the camelidae，Conrath Katja et.al，Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2001，45,2807-2812.)设计用于扩增骆驼重链抗体可变区基因VHH片段(350bp)的PCR引物C1F、C1R、V_HHF和V_HHR。各引物的具体序列如表2。

表2PCR扩增引物

引物	序列(5’-3’)
		C1F	GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG
C1R	GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC
		V<sub>HH</sub>F	GATGTGCAG<u>CTGCAG</u>GAGTCTGGRGGAGG(下划线为Pst Ⅰ酶切位点)
V<sub>HH</sub>R	CTAGT<u>GCGGCCGC</u>TGAGGAGACGGTGACCTGGGT(下划线为NotⅠ酶切位点)

注：表2中的简并碱基R＝A或G。

3.VHH片段的扩增

利用本实施例标题1中合成的骆驼cDNA为模板，PCR扩增VHH片段。首先，以cDNA为模板，利用C1F和C1R为上下游引物，扩增获得大小约为750bp的基因片段，反应条件为：95℃3min；95℃30s，59℃1min，72℃1min，共30个循环；72℃10min。反应结束后，回收大小约为750bp的基因片段。然后，以该大小约为750bp的基因片段为模板，利用V_HHF和V_HHR为上下游引物，扩增VHH片段，反应条件为：95℃3min；95℃30s，58℃1min，72℃30s，共30个循环；72℃10min。反应结束后，PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，紫外灯下观察目的条带，如图3所示，可见大约350bp的VHH基因片段，与预期大小一致。利用凝胶回收试剂盒(购自TAKARA公司)对目的条带进行纯化和回收。

4.噬菌体展示基因文库的构建

纯化回收的VHH基因片段采用Pst I和Not I酶切后，连入pMECS载体(购自Novagen公司)。将连接产物转化至E.coli TG1感受态细胞(购自Novagen公司)中，37℃培养1h，将菌液离心浓缩后涂在含有氨苄抗性的LB平板培养基上，37℃过夜生长之后随机挑选24个单克隆菌落，利用V_HHF和V_HHR为上下游引物进行菌落PCR鉴定。结果如图4，24个单克隆菌落经菌落PCR鉴定，有22个单克隆菌落含有大小约为350bp的目的片段，说明该文库的插入率达到了91.7％。将上述平板中的菌落刮入LB液体培养基中，然后加入终浓度为30％的甘油，分装保存于-80℃备用，此即为猪sIgA-Fc蛋白的纳米抗体噬菌体展示文库。

实施例3针对猪sIgA-Fc蛋白纳米抗体的筛选过程

1.噬菌体展示文库的扩增

取200μL于-80℃冻存的噬菌体展示文库，接种至500mL 2×TY培养基中，37℃、摇床转速为200rpm条件下培养3-5h后，加入50μL辅助噬菌体VCSM13(购自Novagen公司)，37℃孵育1h，随后37℃、摇床转速为200rpm条件下培养过夜。次日，加入80g的PEG6000(购自上海生工公司)沉淀噬菌体，该沉淀即为扩增后的噬菌体展示文库。将噬菌体展示文库重悬于5mL 0.1M PBS缓冲液中，得到其悬液。

2.亲和筛选

将10μg猪sIgA-Fc蛋白加入到10mL、100mM的NaHCO₃溶液(pH8.2)中，混合均匀，取100μL加入96孔酶标板的每孔中，在4℃包被过夜，设立无抗原包被的空白组作为空白对照；次日，每孔加入1％脱脂乳溶液100μL，室温封闭2h；然后，每孔加入100μL扩增后的噬菌体展示文库悬液，室温作用1h，用含有0.05％Tween-20的PBS缓冲液洗5遍，洗掉不结合的噬菌体，随后用100μL浓度为100mM的三乙胺(购自上海生工公司)溶液将与猪sIgA-Fc蛋白特异性结合的噬菌体洗脱下，并感染5倍体积处于对数期生长的大肠杆菌TG1细胞，37℃培养1h，加入50μL辅助噬菌体VCSM13(购自Novagen公司)侵染TG1细胞，离心取上清液，即得第一轮筛选到的噬菌体，用于下一轮的筛选。相同筛选过程共进行3轮。每一轮筛选获得的噬菌体各取10μL涂于LB固体培养基上，均在37℃过夜培养，用于观察亲和筛选富集过程。如图5所示，文库经三轮亲和筛选后，每一轮筛选富集到的噬菌体均较上一轮要多。

实施例4酶联免疫方法(ELISA)筛选特异性阳性克隆

1.纳米抗体的表达

从实施例3中第三轮筛选后富集在LB平板上的菌落中，挑选95个单菌落分别接种于96孔板(添加有含100μg/mL氨苄青霉素的TB培养基)的各孔中，并设置一个仅加入了TB培养基的空白对照，在37℃、摇床转速为200rpm条件下培养至对数生长期，各孔均加入终浓度为1mM的IPTG，在28℃、摇床转速为200rpm条件下过夜培养。次日，利用超声破碎法裂解各菌，离心后取裂解液，分别获得各重组菌表达的、针对猪sIgA-Fc蛋白的纳米抗体，各纳米抗体编号依次为1～96。

2.间接ELISA方法检测纳米抗体的结合活性

采用间接ELISA反应鉴定编号1～96的各纳米抗体与猪sIgA-Fc蛋白的结合活性。将10μg猪sIgA-Fc蛋白加入到10mL浓度为100mM的NaHCO₃溶液(pH8.2)中，混合均匀，取100μL加入到96孔酶标板的每个样品孔中，在4℃包被过夜，对照孔中以100mM的NaHCO₃溶液(pH8.2)替代猪sIgA-Fc蛋白溶液进行包被；次日，弃掉板内液体，利用含有0.05％Tween-20的PBS缓冲液洗5遍，拍干，每孔加入5％脱脂乳溶液100μL，室温封闭2h；利用含有0.05％Tween-20的PBS缓冲液洗5遍，将各纳米抗体依次加入ELISA板的各孔中，室温下孵育1h，利用含有0.05％Tween-20的PBS缓冲液洗去未结合的纳米抗体，加入100μL经1:2000稀释后的Mouse anti-HA tag antibody(鼠抗HA抗体，购自北京康为世纪公司)，室温放置1h，利用含有0.05％Tween-20的PBS缓冲液洗去未结合的抗体，加入100μL经1:2000稀释后的HRPlabeled goat anti-mouse IgG(辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠抗体，购自艾美捷公司)，室温放置1h，利用含有0.05％Tween-20的PBS缓冲液洗去未结合的抗体，加入辣根过氧化物酶显色液(购自上海生工公司)，37℃孵育15min，每孔各加2M的硫酸溶液50μL终止反应，使用酶标仪测定各孔在450nm波长处的吸光值OD₄₅₀。当样品孔OD₄₅₀值大于对照孔OD₄₅₀值2.5倍以上时，判为阳性克隆孔。结果如图6所示，纳米抗体51和72可与猪sIgA-Fc蛋白发生结合反应。

3.特异性的鉴定

按照本实施例标题2中间接ELISA检测方法，分别检测纳米抗体51和纳米抗体72与猪IgG、IgM、sIgA的Fab片段(购自南京奥青公司)之间的交叉反应性，利用酶标仪测定相应OD₄₅₀，不同之处在于ELISA板的包被抗原采用猪IgG、IgM、sIgA的Fab片段替代猪sIgA-Fc蛋白。结果如图7所示，本发明获得的纳米抗体51和纳米抗体72对猪IgG、IgM、sIgA的Fab片段交叉反应性极低，说明纳米抗体51和纳米抗体72是针对猪sIgA-Fc蛋白的特异性纳米抗体。

分别抽提表达纳米抗体51和纳米抗体72重组菌的质粒，送上海生工公司进行序列测定，分别获得纳米抗体51、纳米抗体72的基因序列和氨基酸序列。纳米抗体51的氨基酸序列和基因序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，纳米抗体72的氨基酸序列和基因序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。

实施例5猪sIgA-Fc蛋白纳米抗体的纯化

分别抽提表达纳米抗体51和72的重组菌中的质粒，42℃分别转化到大肠杆菌WK6感受态细胞(购自Novagen公司)中，37℃、摇床转速为200rpm的条件下培养1h，离心浓缩菌液，并将其涂布在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养12～16小时；挑选单个菌落，分别获得表达纳米抗体51的重组菌A和表达纳米抗体72的重组菌B；或者将纳米抗体51和72的编码基因送至华大、生工等生物技术公司进行合成，然后插入pMECS载体(购自Novagen公司)的Pst I和Not I酶切位点之间，随后分别在42℃转化到大肠杆菌WK6感受态细胞(购自Novagen公司)，也可以得到重组菌A和重组菌B。

分别采用重组菌A和重组菌B制备纳米抗体51和纳米抗体72。具体方法如下：将重组菌接种在5mL含有氨苄青霉素的LB培养液中，在37℃摇床中培养至OD₆₀₀＝0.6～0.9，取1mL菌液转接至500mL TB培养液中，在37℃摇床中培养，当OD₆₀₀值达到0.6～0.9时，加入终浓度为1mM的IPTG，在28℃摇床中培养12～16小时诱导重组菌表达目的蛋白，离心收集菌体沉淀，利用超声破碎菌体，取裂解液作为纳米抗体粗提液，采用镍柱(购自GE Healthcare公司)亲和层析法纯化纳米抗体。取纯化后的纳米抗体进行SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定。从图8可以看到纳米抗体51、72在大约17kD处均有明显条带，与目的片段预期大小相一致，纯度达90％以上。

实施例6猪sIgA-Fc蛋白纳米抗体热稳定性鉴定

用PBS缓冲液将纳米抗体51、72均稀释到1mg/mL，37℃分别静置0、4、8、12、24和48h；将处理后的纳米抗体分别转移至采用猪sIgA-Fc蛋白包被过夜的ELISA板中，室温下孵育1h，用含有0.05％Tween 20的PBS缓冲液洗去未结合的抗体，加入100μL经1:2000稀释后的Mouse anti-HA tag antibody(鼠抗HA抗体，购自北京康为世纪公司)，室温放置1h，用含有0.05％Tween 20的PBS缓冲液洗去未结合的抗体，加入100μL经1:2000稀释后的HRPlabeled goat anti-mouse IgG(辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠抗体，购自艾美捷公司)，室温放置1h，用含有0.05％Tween 20的PBS缓冲液洗去未结合的抗体，加入辣根过氧化物酶显色液，37℃孵育15min，每孔各加50μL 2M的硫酸溶液终止反应，使用酶标仪测定450nm波长处的吸光值。如图9所示，两株纳米抗体在37℃处理不同时间后，仍保持较好的反应活性，说明纳米抗体51、72具有较好的热稳定性，与传统抗体相比，本发明所获得的纳米抗体用作诊断试剂盒的检测试剂可以延长试剂盒的有效期。

实施例7纳米抗体敏感性的鉴定

1.制备HRP标记的纳米抗体：

分别制备HRP标记的纳米抗体51和HRP标记的纳米抗体72。称取10mg HRP(辣根过氧化物酶，购自上海生工公司)溶于2mL双蒸水中，加入1mL新鲜配制的0.1M的偏高碘酸钠溶液，4℃放置30min；加入2.5％乙二醇水溶液2mL，室温放置1h；加入1mg待标记的纳米抗体51或纳米抗体72，调节pH至9.0，4℃放置12-16h，加入0.1mL浓度为5mg/mL的硼氢化钠溶液，混匀后在4℃放置3h；3000rpm离心30min，去除沉淀物，上清即为HRP标记的纳米抗体。利用实施例4中的间接ELISA方法检测酶标纳米抗体的反应能力。如图10所示，HRP标记后的纳米抗体51、纳米抗体72仍具有较强的与猪sIgA-Fc蛋白的结合能力，且结合能力几乎等同未标记的纳米抗体。纳米抗体51、纳米抗体72分别缩写为Nb51和Nb72。

2.纳米抗体识别表位的鉴定

Nb51和Nb72分别作为捕获抗体直接包被96孔酶标板，每孔1μg，4℃包被过夜；次日，弃掉板内液体，用含有0.05％Tween 20的PBS缓冲液洗5遍，拍干，每孔加入5％脱脂乳溶液100μL，室温封闭2h；利用含有0.05％Tween-20的PBS缓冲液洗5遍，加入猪sIgA-Fc蛋白(10μg/mL)作为中间抗原，每孔100μL，室温孵育1h；用含有0.05％Tween 20的PBS缓冲液洗5遍，以Nb51包被的酶标板中加入HRP标记的Nb72(HRP-Nb72)，以Nb72包被的酶标板中加入HRP标记的Nb51(HRP-Nb51)，每孔0.5μg，室温孵育1h；用含有0.05％Tween 20的PBS缓冲液洗5遍，加入100μL辣根过氧化物酶显色液，37℃孵育15min，每孔各加50μL、2M的硫酸溶液终止反应，使用酶标仪测定450nm波长处的吸光值。利用两株纳米抗体进行双抗体夹心ELISA鉴定，从表3可见，两株纳米抗体分别识别不同的抗原表位。

表3双抗体夹心ELISA鉴定纳米抗体识别表位(OD₄₅₀)

捕获抗体	HRP-Nb51	HRP-Nb72
			Nb51	-	1.89
Nb72	1.76	-

3.纳米抗体敏感性的鉴定

取Nb51作为捕获抗体包被酶标板，每孔1μg，4℃包被过夜；次日，弃掉板内液体，用含有0.05％Tween 20的PBS缓冲液洗5遍，拍干，每孔加入5％脱脂乳溶液100μL，室温封闭2h；利用含有0.05％Tween-20的PBS缓冲液洗5遍，分别加入0μg/mL、0.001μg/mL、0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL的猪sIgA-Fc蛋白作为中间抗原进行孵育，每孔100μL，室温孵育1h；用含有0.05％Tween 20的PBS缓冲液洗5遍，加入HRP-Nb72，每孔0.5μg，室温孵育1h；用含有0.05％Tween 20的PBS缓冲液洗5遍，加入100μL辣根过氧化物酶显色液，37℃孵育15min，每孔各加50μL 2M硫酸溶液终止反应，使用酶标仪测定450nm波长处的吸光值。如图11所示，利用Nb51、Nb72建立的双抗体夹心ELISA，可以有效地对猪sIgA-Fc蛋白进行检测，检测下限可达0.001μg/mL。

实施例8母猪初乳中sIgA检测试剂盒的组装

1.母猪初乳中sIgA检测试剂盒的组成

试剂盒的组成包括：

(1)Nb51溶液：Nb51的浓度为1mg/mL，溶剂为0.1M PBS缓冲液(pH7.4)。0.1M PBS缓冲液(pH7.4)配制方法：取8g氯化钠、0.2g氯化钾、1.44g磷酸氢二钠和0.24g磷酸二氢钾溶于水，定容至1L，调pH至7.4，高压灭菌之后室温保存。

(2)HRP标记的Nb72溶液：溶剂为0.1M PBS缓冲液(pH7.4)，HRP标记的Nb72浓度为50μg/mL。

(3)辣根过氧化物酶显色液：称取100mg TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺，购自上海生工公司)溶于50mL无水乙醇中制成TMB储存液。取0.5mL TMB储存液加到10mL磷酸-柠檬酸底物缓冲液(含有0.2M磷酸氢二钠和0.1M柠檬酸的水溶液)中，再加入50μL质量百分浓度为30％的双氧水，混匀，即为辣根过氧化物酶显色液。辣根过氧化物酶显色液在使用前配制。

(4)猪sIgA标准品：猪sIgA标准品是100μg/mL的猪sIgA(购自南京奥青公司)溶液，溶剂为0.1M PBS缓冲液(pH7.4)。

(5)阴性对照样品：100μg/mL的BSA(牛血清白蛋白)水溶液。

(6)包被液：100mM的NaHCO₃水溶液，pH8.2。

(7)封闭液：溶质为脱脂乳，溶剂为0.1M PBS缓冲液(pH7.4)，脱脂乳的浓度为5％(质量百分浓度)。

(8)洗涤液：溶质为Tween20，溶剂为0.1M PBS缓冲液(pH7.4)，Tween20的浓度为0.05％(质量百分浓度)。

(9)样品稀释液：溶质为BSA(牛血清白蛋白)，溶剂为0.1M PBS缓冲液(pH7.4)，BSA的浓度为1％(质量百分浓度)。

(10)终止液：2M硫酸溶液，溶剂为水。

(11)酶标板：购自NUNC公司，5块、96孔、未包被抗原。

2.母猪初乳中sIgA检测试剂盒的使用方法：

(1)利用包被液将Nb51溶液稀释至10μg/mL，96孔酶标板中每孔加入100μL，在4℃包被12～16小时；

(2)弃掉板内液体，利用洗涤液洗5遍，拍干，每孔加入200μL封闭液，室温封闭1小时；

(3)弃掉板内液体，利用洗涤液洗5遍，拍干；利用样品稀释液将待检样品稀释2-10倍，加入到96孔酶标板内，每孔100μL，室温孵育1小时；同时设置猪sIgA标准品用于标准曲线的制备，利用样品稀释液将猪sIgA标准品倍比稀释(浓度依次为10μg/mL，1μg/mL，0.1μg/mL，0.01μg/mL，0.001μg/mL，0μg/mL)，每孔加入100μL，同时设立100μg/mL BSA水溶液作为阴性对照，样品稀释液作为空白对照，每个稀释度设立3个重复孔；

(4)弃掉板内液体，利用洗涤液洗5遍，拍干，每孔加入100μL利用样品稀释液1:1000稀释的HRP标记的Nb72溶液，室温孵育1小时；

(5)弃掉板内液体，利用洗涤液洗5遍，拍干，每孔加入100μL辣根过氧化物酶显色液，室温孵育15分钟，每孔加入50μL终止液终止反应，利用酶标仪测定各孔在450nm波长下的吸光值OD₄₅₀；

(6)结果判定：当待检样品孔的OD₄₅₀大于阴性对照孔OD₄₅₀数值2倍以上时，即为阳性，待检样品中sIgA的具体浓度根据标准品制作的标准曲线确定。

实施例9母猪初乳中sIgA检测试剂盒的应用

1.母猪初乳中sIgA检测试剂盒灵敏度的测定

按照实施例8中方法检测标准品，操作结束后，利用各标准品的浓度和相应的OD₄₅₀数值制作非线性回归方程式作为标准曲线(方程式为y＝-0.029x²+0.46x+0.21，R²＝0.981，其中y为所测定的OD₄₅₀数值，x为样品中sIgA的浓度，R²属于统计学范畴，代表决定系数)。利用待检样品的OD₄₅₀数值可计算出样品中sIgA的浓度。检测结果如表4所示：

表4标准品检测结果

标准品浓度(μg/mL)	10	1	0.1	0.01	0.001	0	空白对照孔	阴性对照孔
									OD<sub>450</sub>	1.56	1.17	0.82	0.62	0.46	0.21	0.13	0.12

从表4还可以看出，本发明试剂盒的检测灵敏度可达0.001μg/mL，即当待检样品中猪sIgA的含量大于等于0.001μg/mL时，能够被本试剂盒检出。

2.母猪初乳中sIgA检测试剂盒特异性的测定

分别检测实施例8中试剂盒与猪IgG、IgM之间的交叉反应性，试剂盒的使用方法如实施例8所示，检测结果如表5所示：

表5本发明试剂盒特异性的检测结果

待检样品	sIgA	IgG	IgM	空白对照孔	阴性对照孔
						OD<sub>450</sub>	1.57	0.12	0.13	0.12	0.12

检测结果表明，本发明试剂盒具有较好的特异性，能够准确鉴别母猪初乳中sIgA。

3.本发明试剂盒在检测母猪初乳中sIgA水平中的应用

取分娩母猪初乳，分别添加不同体积的猪sIgA标准品，使初乳中添加的sIgA终浓度(不包括初乳本身含有的sIgA浓度)分别达到0.008μg/mL、0.08μg/mL、0.8μg/mL和8μg/mL，充分混匀，按照实施例8所示检测方法进行操作，同时设置未混合标准品的初乳作为阴性对照，未混合初乳的标准品(10μg/mL)作为阳性对照，样品稀释液为空白对照，检测结果如表6所示：

表6母猪初乳中添加不同浓度sIgA的检测结果

检测结果表明，由于正常分娩母猪的初乳中均含有少量sIgA，所以阴性对照样品(即未混合标准品的初乳)也出现了一定的OD₄₅₀数值。而通过检测添加了不同浓度猪sIgA标准品的初乳发现，利用所检测到的OD₄₅₀数值带入标准曲线方程式，通过计算得到的sIgA浓度值再减去母猪初乳本身含有的sIgA浓度(即阴性对照样品的检出值)，得到利用试剂盒检测到的添加的sIgA标准品的浓度，该检测值与理论添加量的符合率可达98.67％±1.53％。上述结果说明本发明试剂盒具有较好的特异性和较高的灵敏度，能够准确检测母猪初乳中的sIgA水平。

本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一种检测母猪初乳中sIgA的试剂盒

<130> 20171117

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 120

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Nb51

<400> 1

Arg Gly Ser Gly Arg Ser Ile Glu Glu His Leu Cys Ser Leu Glu Ala

1 5 10 15

Phe Asp Asp Ser Gln Thr Ala Ser Thr Ser Pro Ser Val Ser Leu Thr

20 25 30

Ser Lys Asp Arg Thr Gly Thr Gly Lys Gly Ser Ala Arg Val Thr Thr

35 40 45

Thr Asn Ser Gly Gly Leu Cys Ile Gly Leu Val Thr Gly Val Asp Leu

50 55 60

Gly Ala Asn Asn Asn Phe Thr Thr Arg Asp Asp His Lys Asn Thr Lys

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Leu Asp Asn Pro Lys Ala Glu Asp Thr Ala Arg Tyr Ser

85 90 95

Arg Pro Arg Ala Trp Trp Cys Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Tyr

115 120

<210> 2

<211> 360

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Nb51编码基因

<400> 2

caggggcagc ggcaggagta tagaggagca tctctgcagt ttggaggcgt ttgatgattc 60

tcaaaccgcc tccacttcac cttcagtctc actaacatct aaggaccgca caggaacagg 120

gaagggtagc gcacgcgtca caactaccaa tagtggtggt ttatgcatcg ggctagtaac 180

cggcgtcgac ttgggcgcca ataacaattt cacaaccaga gacgaccaca agaacacgaa 240

gtatttgcaa ttggacaacc cgaaagctga ggacacggcc aggtattccc ggccaagagc 300

ctggtggtgt aactactggg gccaggggac ccaggtcacc gtctcctcag cggccgcata 360

<210> 3

<211> 128

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Nb72

<400> 3

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ser Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Pro Val Phe Thr Tyr Ser Arg Tyr

20 25 30

Arg Val Gly Trp Phe Arg Gln Pro Gln Gly Lys Glu Arg Glu Glu Val

35 40 45

Ala Ser Val Asp Asn Asp Gly Leu Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Glu Asp Lys Ala Lys Asn Met Val Tyr Leu

65 70 75 80

Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ala Asp Val Arg Gly Arg Gly Trp Leu Asp Gly Arg Trp Tyr Pro Ser

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Tyr

115 120 125

<210> 4

<211> 384

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Nb72编码基因

<400> 4

caggtgcagc tgcaggagtc tggaggaggc tcggtgcagt ctggagggtc tctgagactc 60

tcctgtgcag cccctgtatt cacctacagt aggtaccgcg tgggctggtt ccgccagcct 120

caagggaagg agcgcgagga ggtcgcgagt gttgataatg atggactcac aagttacgca 180

gactccgtga agggccgatt taccatctca gaagacaagg ccaagaacat ggtgtatctg 240

gaaatgaaca gcctgaaacc tgaggacacg gccatgtatt actgtgcggc agatgtacgc 300

ggccggggat ggttagatgg tcgttggtac cccagctact ggggccaggg gacccaggtc 360

accgtctcct cagcggccgc atac 384

Claims (7)

1.检测母猪初乳中sIgA的试剂盒，其特征在于包括猪sIgA-Fc蛋白纳米抗体51溶液和辣根过氧化物酶标记的猪sIgA-Fc蛋白纳米抗体72溶液；所述猪sIgA-Fc蛋白纳米抗体51的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述猪sIgA-Fc蛋白纳米抗体72的氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示。

2.根据权利要求1所述检测母猪初乳中sIgA的试剂盒，其特征在于所述猪sIgA-Fc蛋白纳米抗体51的浓度为0.2-2.0mg/mL，辣根过氧化物酶标记的猪sIgA-Fc蛋白纳米抗体72的浓度为20-100µg/mL。

3.根据权利要求1所述检测母猪初乳中sIgA的试剂盒，其特征在于所述猪sIgA-Fc蛋白纳米抗体51采用如下方法制备：将猪sIgA-Fc蛋白纳米抗体51的编码基因插入pMECS载体，然后导入大肠杆菌WK6感受态细胞，获得重组菌A；诱导重组菌A表达目的蛋白，裂解重组菌A后纯化获得纳米抗体51。

4.根据权利要求3所述检测母猪初乳中sIgA的试剂盒，其特征在于猪sIgA-Fc蛋白纳米抗体51的编码基因序列如SEQ ID NO:2所示。

5.根据权利要求1-4之一所述检测母猪初乳中sIgA的试剂盒，其特征在于所述辣根过氧化物酶标记的猪sIgA-Fc蛋白纳米抗体72采用如下方法制备：将猪sIgA-Fc蛋白纳米抗体72的编码基因插入pMECS载体，然后导入大肠杆菌WK6感受态细胞，获得重组菌B；诱导重组菌B表达目的蛋白，裂解重组菌B后纯化获得纳米抗体72；采用辣根过氧化物酶标记纳米抗体72。

6.根据权利要求5所述检测母猪初乳中sIgA的试剂盒，其特征在于猪sIgA-Fc蛋白纳米抗体72的编码基因序列如SEQ ID NO:4所示。

7.根据权利要求6所述检测母猪初乳中sIgA的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括辣根过氧化物酶显色液、猪sIgA标准品、牛血清白蛋白溶液、包被液、封闭液、洗涤液、样品稀释液、终止液和酶标板。

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