CN105602906B - 可分泌抗突变b型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可分泌抗B型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞，保藏号为CCTCC No：2015224。本发明还公开了上述可分泌抗B型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体，并且指出了该单克隆抗体在制备B型肝炎检测试剂领域或制备B型肝炎检测设备领域的应用。这种单克隆抗体既可以与野生型的HBsAg结合，又可以与突变型HBsAg结合，从而在HBV的检查中，提高了检查的阳性率，避免了由于HBV病毒基因组发生突变而导致的假阴性。本发明还公开了一种包括上述的单克隆抗体的B型肝炎检测试纸。
Description
技术领域
本发明涉及B型肝炎病毒抗体及免疫检测领域，尤其是涉及一种可分泌抗突变B型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及应用。
背景技术
B型肝炎病毒(HBV)是具有脂质双层膜的外鞘、作为蛋白质的核壳、DNA 聚合酶和基因组DNA的嗜肝DNA病毒科的双链DNA病毒。位于B型肝炎病毒(HBV)S蛋白质的表面抗原(HBsAg)与病毒的感染有关。HBV等病毒进化速度迅速，基因组发生突变的概率高。如果HBsAg的结构变化，以往用于 HBV诊断的抗HBs抗体就不能与HBsAg结合，有时会将HBV感染者诊断为 HBV阴性。因此在HBV的检查中，重要的是要使用既可以与野生型的HBsAg 结合，又可以与突变型HBsAg结合的抗体。
发明内容
基于此，有必要提供一种可分泌抗B型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞，该可分泌抗B型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体及应用。这种单克隆抗体既可以与野生型的HBsAg结合，又可以与突变型HBsAg结合。
一种可分泌抗B型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞，保藏号为 CCTCCNo：C2015224 。
在一个实施例中，所述单克隆抗体为由权利要求1所述的杂交瘤细胞分泌的抗B型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体。
在一个实施例中，所述单克隆抗体可识别野生型B型肝炎病毒表面抗原 HBsAg和突变型B型肝炎病毒表面抗原HBsAg。
在一个实施例中，所述单克隆抗体可识别多个突变型B型肝炎病毒表面抗原HBsAg的“a”抗原决定基。
在一个实施例中，所述单克隆抗体可识别突变型B型肝炎病毒表面抗原 HBsAg的“a”抗原决定基的一个突变。
在一个实施例中，所述突变型B型肝炎病毒表面抗原HBsAg为sAg突变。
在一个实施例中，所述sAg突变的突变序列为G145R、T131N、A159V、 S143M、F158S、F161S、L134R或T123I。
在一个实施例中，所述单克隆抗体为鼠源单克隆抗体。
上述的单克隆抗体在制备B型肝炎检测试剂领域或制备B型肝炎检测设备领域的应用。
一种B型肝炎检测试纸，包括上述的单克隆抗体以及与所述单克隆抗体结合的固相载体。
这种单克隆抗体既可以与野生型的HBsAg结合，又可以与突变型HBsAg 结合，从而在HBV的检查中，提高了检查的阳性率，避免了由于HBV病毒基因组发生突变而导致的假阴性。
附图说明
图1为实施例1中单克隆抗体检测HBsAg的效价图。
图2为实施例1中单克隆抗体检测亲和力的鉴定图。
具体实施方式
下面主要结合附图及具体实施例对可分泌抗突变B型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及应用作进一步详细的说明。
一实施方式的可分泌抗突变B型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞于2015年12月17日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏号为CCTCC No：C2015224 ，分类命名：杂交瘤细胞株 12E6。
这种杂交瘤细胞的分泌产量高，其分泌得到的单克隆抗体能够针对性的识别B型肝炎病毒表面抗原，并且具有高亲和力、高特异性、不仅能识别野生型 HBsAg，也可以识别突变型HBsAg等优点，可广泛应用在B型肝炎病毒表面抗原检测领域，如检测试剂或检测设备的制备领域等，在特异性、灵敏度和检测率等方面较之传统的单克隆抗体具有显著的优势。
一实施方式的单克隆抗体，为上述可分泌抗突变B型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞分泌的抗突变B型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体。
这种单克隆抗体可识别野生型B型肝炎病毒表面抗原HBsAg和突变型B型肝炎病毒表面抗原HBsAg。
优选的，这种单克隆抗体可识别多个突变型B型肝炎病毒表面抗原HBsAg 的“a”抗原决定基。
优选的，这种单克隆抗体可识别突变型B型肝炎病毒表面抗原HBsAg的“a”抗原决定基的一个突变。
更优选的，突变型B型肝炎病毒表面抗原HBsAg为sAg突变。
特别的，sAg突变的突变序列为G145R、T131N、A159V、S143M、F158S、 F161S、L134R或T123I。
这种单克隆抗体可以为鼠源单克隆抗体。
这种单克隆抗体既可以与野生型的HBsAg结合，又可以与突变型HBsAg 结合，从而在HBV的检查中，提高了检查的阳性率，避免了由于HBV病毒基因组发生突变而导致的假阴性。
这种单克隆抗体可以用于制备B型肝炎检测试剂领域或制备B型肝炎检测设备领域。
具体的，一实施方式的B型肝炎检测试纸，包括上述单克隆抗体以及与上述单克隆抗体结合的固相载体。
固相载体可以为磁性微球、乳胶微球、聚苯乙烯板或硝酸纤维素膜。
单克隆抗体与固相载体结合后，通过加入另一个或多个抗体或者免疫活性片段的标记物形成抗原抗体复合物，测定值的高低在一定量抗体存在时与样品中的B型肝炎病毒表面抗原成正比。通过特定仪器的测定值，参照校准曲线即可计算出待测样品中B型肝炎病毒表面抗原的含量。
此外，单克隆抗体还可以直接或间接结合固相载体后作为包被抗体，通过另一个或多个抗体或者免疫活性片段的标记物(辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、吖啶酯、荧光物质、胶体金等)用于其他形式的B型肝炎病毒表面抗原检测试剂或设备中。
通过使用上述杂交瘤细胞分泌的抗突变B型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体，在提高灵敏度的同时改善特异性。通过使用上述抗突变B型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体，制备得到的试剂盒与现有B型肝炎检测试剂盒相比，在特异性、灵敏度及检出率方面都具有显著的优势。
下面主要结合附图及具体实施例对可分泌抗突变B型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞分泌、单克隆抗体及应用作进一步详细的说明。
实施例1
杂交瘤细胞株的建立与抗突变B型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体的制备
1.抗原免疫
将等量重组B型肝炎病毒表面抗原(深圳市菲鹏生物股份有限公司生产，货号BA-PAB-MU0001)与弗氏完全佐剂(外观：琥珀色细胞悬浮液；组份：Paraffin Oil 85％，Mannide Monooleate 15％，Mycobacterium smegmatis 1mg/mL)混合，得到油状乳液。将该乳液以0.2mL的剂量皮下注射BALB/c小鼠(广州省实验动物中心，6周龄雌性，5只)背部位点，第一次免疫14天后腹腔增强免疫(等量抗原与弗氏不完全佐剂混合)，增强免疫到四针后，采尾血进行效价检测，效价达到融合要求。
融合前3天，用相同剂量抗原腹腔注射追加免疫，免疫方法同上。
2.杂交瘤细胞株的制备
(1)饲养细胞的制备
以BALB/c鼠腹腔巨噬细胞作饲养细胞。在融合前1天，BALB/c鼠拉颈处死，75％酒精全身浸泡，超净台内，无菌操作下用剪刀剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用注射器腹腔注入RPMI 1640基础培养液5mL，反复冲洗，回收冲洗液， 1000rpm，离心5分钟，留沉淀，用RPMI1640筛选培养液(含HAT的RPMI 1640 完全培养液中)重悬，调整细胞浓度1×105个/mL，加入96孔板，150μL/孔，37℃， 5％CO2培养过夜。
(2)免疫脾细胞的制备
小鼠末次免疫后三天，在无菌条件下取出脾脏，置于平皿中，RPMI 1640基础培养液冲洗一次，放于小烧杯的尼龙网上磨碎过滤，制成细胞悬液。离心，弃上清，RPMI 1640基础培养液重悬，如此重复三次，得到免疫脾细胞，计数。
(3)骨髓瘤细胞的制备
小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0经8-氮鸟嘌呤筛选后，培养至对数生长期，取两大瓶制成细胞悬液，离心，弃上清，用RPMI 1640基础培养液重悬，如些重复三次，得到骨髓瘤细胞，计数。
(4)细胞融合及HAT选择杂交瘤
将骨髓瘤细胞与免疫脾细胞按1:10比例混合，在50mL塑胶离心管内用 RPMI 1640基础培养液洗1次，1200rpm，离心8分钟。弃上清，将细胞混匀，缓慢加入1mL50％的PEG1500融合，融合1分钟后加入15mL的RPMI 1640基础培养液终止细胞融合。1000rpm，离心5分钟。弃上清，用50mL的RPMI 1640 筛选培养液轻轻重悬，平分于10块96孔板，50μL/孔，37℃，5％CO2培养。培养至第六天，换HAT培养液(含HAT的RPMI 1640完全培养液)两次。
(5)抗体的检测
用0.06M pH9.6碳酸缓冲溶液稀释天然HBsAg，使其终浓度为2μg/mL。每孔0.1mL，加入96孔聚苯乙烯板，37℃2小时或4℃过夜。次日，用含10％小牛血清或1％脱脂奶粉的0.02M pH7.2PBS，0.15mL/孔，37℃封闭2小时，用于检测。融合后第七天，取细胞上清0.1mL于上述96孔检测板中，37℃30分钟，水洗六次后加入2000倍稀释的辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG(深圳市菲鹏生物股份有限公司生产，货号BA-PAB-MU0001)，37℃30分钟同上洗后，每孔加入100μL含0.1％(M/V)邻苯二胺，0.1％(V/V)双氧水，pH5.0柠檬酸磷酸缓冲液，37℃15分钟，加入稀硫酸溶液，每孔50μL，测450nm吸收值。 RPMI 1640完全培养液作为阴性对照，以测定值与对照值的比≧2.0为阳性细胞孔。
分泌抗体阳性细胞孔以1个细胞/孔在96孔培养板上用有限稀释法克隆，筛选阳性孔依上法连续克隆三次，扩大培养后，用含10％DMSO的培养液冻存，细胞密度为106个/mL。细胞融合一次共获得1株能稳定分泌抗体的细胞株，命名为杂交瘤细胞株12E6(CCTCC No：C2015224 )。
3.单克隆抗体的制备
选6～8周健壮的BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5mL的降植烷；10天后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞。接种细胞7-10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获5～10mL腹水。收集腹水，离心取上清，放于-20℃冰箱保存。
取腹水上清，用3倍体积的PBS稀释后滤纸过滤。将所得的滤液在1mL/min 的流速下加到一个已用PBS平衡的蛋白G亲和层析柱(购自Amersham Biosciences公司)。然后用PBS以1mL/min的流速洗涤未被蛋白G吸附的物质直至在OD280nm下的吸收值达到基线为止。再用0.1M的甘氨酸洗脱液(pH2.5) 洗脱并回收该抗体。所回收的溶液用0.1M Tris(pH8.8)中和，通过超滤将抗体浓度调节到一个合适的浓度，-20℃分装冻存。
4.效价测定
以间接ELISA法检测，上述杂交瘤细胞培养上清效价2.18×103，腹水抗体效价5.12×105。具体实验步骤如下：
(1)包被：将天然HBsAg稀释至2μg/mL，100μL/孔加至酶标板，37℃2 小时或者4℃过夜；
(2)用洗板机洗板5次，每次每孔注洗液350uL，停留20秒；最后拍干；
(3)用洗涤液洗去包被液，用封闭液封闭，每孔150uL，37℃放置1.5-2 小时；
(4)洗板机洗板5次，每次每孔注洗液350uL，停留20秒；最后拍干；
(5)加样品：分别将稀释成不同梯度的细胞培养上清和腹水加入用HBsAg 天然抗原包被好的酶标板，100uL/孔，37℃反应1小时(同时做阴性对照孔和阳性对照孔)；
(6)洗板机洗板5次，每次每孔注洗液350uL，停留20秒；最后拍干；
(7)加辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG酶标二抗(用封闭液稀释6000倍)， 100uL/孔，37℃反应1小时；
(8)洗板机洗板5次，每次每孔注洗液350uL，停留20秒；最后拍干；
(9)加显色液TMB：即用即配，100uL/孔，37℃避光反应30分钟；
(10)终止反应：于各反应孔中加入2M的硫酸，50uL/孔；
(11)酶标仪读数：450nm，630nm波长测定，最终测定该杂交瘤细胞培养上清与HBsAg天然抗原的反应效价为2.18×103，腹水抗体与HBsAg天然抗原反应效价为5.12×105。
5、B型肝炎病毒表面抗原单抗类型鉴定
参考4中的操作，用抗体亚类鉴定试剂盒，对抗突变B型肝炎病毒表面抗原单抗类、亚类进行鉴定，通过ELISA法，在450nm，630nm波长测定吸光度，鉴定结果如下表1所示。
表1：抗突变B型肝炎病毒表面抗原单抗类型鉴定结果
由表1可以看出，实施例中制得的单克隆抗体为IgG1，轻链类型为κ。
参考4中的操作，以HBsAg重组抗原包板酶标板，包被浓度为1μg/mL，该单克隆抗体腹水测定效价结果图如图1所示。
由图1可以看出，该单克隆抗体腹水测定效价为1:128k，抗体的滴度属较高的水平。
6.单克隆抗体鉴定
(1)亲和力：上述杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体以ELISA法检测，其亲和力常数(Kaff)为8.68×109。
以下为具体测定杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体亲和力的过程，采用紫外吸收法测定纯化后单抗的浓度，即：
蛋白浓度(mg/mL)＝1.45×OD280nm﹣0.74×OD260nm。
采用ELISA法计算亲和常数，步骤如下：分别用浓度为4μg/mL、2μg/mL 和1μg/mL的重组B型肝炎病毒表面抗原(深圳市菲鹏生物股份有限公司生产，货号BA-PAB-MU0001)包板酶标板，加入已知浓度且进行倍比稀释的单克隆抗体，其它同上述效价测定步骤。
最后以各单抗不同浓度的对数值为横坐标，以其相应的450nm，630nm波长吸光度为纵坐标，绘制出不同浓度抗原的三条反应曲线，得到图2。
如图2所示，取各曲线上部趋于平坦段的数值为OD-100，查出其OD-50 点的单抗浓度[Ab]t，故可得[Ab]t，[Ab′]t和[Ab〞]t三个值，按下列Beatty等推导公式计算Kaff值：
当包被抗原浓度为2μg/mL时：
Kaff1＝1/2(2[Ab′]t-[Ab]t)
或Kaff2＝1/2(2[Ab〞]t-[Ab′]t)
1μg/mL时：Kaff3＝3/2(4[Ab〞]t-[Ab]t)
这样单抗每次测定可得三个Kaff值，平均值即其亲和力常数Kaff。
(2)特异性：上述杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体以Western-Blot鉴定，可与突变HBsAg蛋白发生特异性结合，得到表2和表3。
表2：抗突变HBsAg蛋白单抗检测变异HBsAg结果
注：检测结果以野生HBsAg的OD为100％，其余样品的OD值与之相比的百分数为检测结果。
表3：国内5种HBsAg检测试剂盒检测变异HBsAg的结果
注：检测结果以野生HBsAg的OD为100％，其余样品的OD值与之相比的百分数为检测结果。
由表2和表3可以看出，该单克隆抗体可与以上突变序列为G145R、T131N、 A159V、S143M、F158S、F161S、L134R或T123I的突变型HBsAg结合，从而在HBV的检查中，提高了检查的阳性率，避免了由于HBV病毒基因组发生突变而导致的假阴性。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种可分泌抗突变B型肝炎病毒表面抗原的单克隆抗体的杂交瘤细胞，其特征在于，保藏号为CCTCC No：C2015224。
2.一种单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为由权利要求1所述的杂交瘤细胞分泌的抗突变B型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体。
3.如权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体可识别野生型B型肝炎病毒表面抗原HBsAg和突变型B型肝炎病毒表面抗原HBsAg。
4.如权利要求3所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体可识别多个突变型B型肝炎病毒表面抗原HBsAg的“a”抗原决定基。
5.如权利要求3所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体可识别突变型B型肝炎病毒表面抗原HBsAg的“a”抗原决定基的一个突变。
6.如权利要求5所述的单克隆抗体，其特征在于，所述突变型B型肝炎病毒表面抗原HBsAg为sAg突变。
7.如权利要求6所述的单克隆抗体，其特征在于，所述sAg突变的突变序列为G145R、T131N、A159V、S143M、F158S、F161S、L134R或T123I。
8.如权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为鼠源单克隆抗体。
9.权利要求2～8中任一项所述的单克隆抗体在制备B型肝炎检测试剂领域或制备B型肝炎检测设备领域的应用。
10.一种B型肝炎检测试纸，其特征在于，包括权利要求2～8中任一项所述的单克隆抗体以及与所述单克隆抗体结合的固相载体。
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