CN1680581A - 一种抗突变乙型肝炎病毒表面抗原的单克隆抗体及其制备方法 - Google Patents

一种抗突变乙型肝炎病毒表面抗原的单克隆抗体及其制备方法 Download PDF

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Abstract

一种由杂交瘤细胞株CGMCC HBSP2分泌的抗突变乙型肝炎病毒表面抗原的单克隆抗体。按照本发明制备的抗突变乙型肝炎病毒表面抗原的单克隆抗体，可以同时检测出包括14种突变株和野生株在内的乙肝病毒，能够代替常规乙肝表面抗原检测试剂盒中的HBsAb，制成乙肝表面抗原诊断试剂盒。采用该抗体可以避免用常规试剂诊断时造成的漏诊，使变异和非变异的乙肝病毒携带者或者乙肝患者得到确诊，从而获得及时治疗。特别是在对献血员进行筛查的时候，能够检测出采用常规试剂盒检测不出的变异病毒携带者，避免将乙肝患者的血液当做健康的血液输给受血者，确保血源质量。

Description

一种抗突变乙型肝炎病毒表面抗原的单克隆抗体及其制备方法
技术领域
本发明属于乙型肝炎病毒抗体，具体涉及一种抗野生及突变的多功能乙型肝炎病毒表面抗原的单克隆抗体。
背景技术
乙型肝炎是一个全球性健康问题。全球约有3亿5千万HBV慢性携带者，每年死于乙型肝炎的患者有2百万，使之成为全球第9大引起死亡的疾病。我国HBV慢性携带者占全球的1/3，是世界上HBV病毒携带率最高的国家。估计人群HBsAg阳性率为10.3％。有一亿以上无症状HBsAg携带者，现症患者已超过3000万人，发病率约为30.41％。乙型肝炎不仅严重威胁我国人民的健康，还为社会带来严重的经济负担。
HBV的突变率较高，有研究表明，HBV的突变率达到30％以上。HBV的不同基因区均可发生突变，但主要的危害最大的变异发生在S区和前S区变异：S基因“a”决定簇G 145 R变异，可产生免疫逃逸株，抗原性发生改变，与抗-HBs的亲和力降低，导致常规乙肝疫苗免疫无效。应用拉米夫定治疗慢性乙肝，1年后YMDD变异株的发生率为14～32％，2年为38％，3年为49％，4年为66％(中华肝脏病杂志2004年第12卷第7期第425页《2004年拉米夫定临床应用专家共识》)。
要对如此庞大的乙肝发病人群进行治疗，首先得发现乙肝患者，这就需要进行诊断，足见检测乙肝试剂的重要性。目前国内外乙肝诊断试剂有很多种，如有单纯检测乙肝表面抗原的，也有同时检测乙肝表面抗原的，还有对乙肝病毒的DNA进行检测的。采用的检测方法有多种，有基于抗原抗体反应的免疫检测法，也有利用生物芯片进行检测的，具体的检测技术也不同，可谓五花八门。
但这些诊断试剂有一个致命的缺陷，就是对于发生了突变的乙肝病毒不能检测出来，尤其是表面抗原HBsAg发生了变异的乙肝病毒，用常规的试剂无法诊断，这样就会造成漏诊。使得乙肝病毒携带者或者乙肝患者得不到确诊，从而也就不能获得治疗。更为严重的是，在对献血员进行筛查的时候，如果采用常规的试剂盒进行，就可能将乙肝患者的血液当做健康的血液输给受血者，从而造成很严重的交叉感染。
针对这种情况，研制开发能够检测出包括突变株和野生株在内的乙肝病毒的试剂盒，就具有非常重要的意义。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种抗突变乙型肝炎病毒表面抗原的单克隆抗体以及其制备方法，这是一种可以同时检测到突变乙肝病毒表面抗原和野生乙肝病毒表面抗原的乙肝表面抗体。采用该乙肝表面抗体可制备能够同时检测出包括突变株和野生株在内的新的乙肝病毒表面抗原的检测试剂盒。
本发明的技术解决方案是：一种抗突变乙型肝炎病毒表面抗原的单克隆抗体，用血源乙肝疫苗常规免疫BALB/C小鼠，用ELISA方法检测乙肝表面抗体证实免疫成功，通过杂交瘤细胞技术获得抗HBsAg单克隆抗体。
本发明由杂交瘤细胞株HBSP2分泌的抗突变乙型肝炎病毒表面抗原的单克隆抗体。该微生物(株)已于2004年11月23日保存于CGMCC，保藏编号：1252。
一种杂交瘤细胞株CGMCC HBSP2的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)制备免疫原：将血源性乙肝疫苗HBsAg蛋白滴在硝酸纤维素膜上；
(2)免疫：按常规外科操作将硝酸纤维膜埋入待免疫的小鼠脾内，间隔两周后加强免疫，腹腔注射重组突变HBsAg蛋白与福氏不完全佐剂混合液，第三次免疫起每次间隔3周至1个月；
(3)筛选：用酶联免疫吸附法(ELISA)筛选免疫鼠血清；
(4)细胞融合、筛选及克隆化：选抗血清效价最高的鼠取脾细胞与骨髓瘤细胞体外融合，经三次亚克隆获得稳定分泌抗突变HbsAg蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株CGMCC HBSP2。
上述由杂交瘤细胞株CGMCC HBSP2分泌的抗突变乙型肝炎病毒表面抗原的单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
(1)单克隆抗体的提取与纯化：将获得的稳定分泌抗突变HbsAg蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株CGMCC HBSP2体外扩大培养后，定期收集上清液；
(2)腹水制备：将扩大培养后的细胞株打入BALB/C小鼠腹腔以产生大量腹水，用降脂烷处理小鼠腹腔，将杂交瘤细胞注入小鼠腹腔，待小鼠腹腔足够大时用注射器吸出腹水，盐析法纯化；在腹水制备中，将扩大培养后的细胞株打入鼠腹腔的杂交瘤细胞数为1×107个，7-10天后收集腹水，经提取、纯化后即可得到抗突变HBsAg蛋白单克隆抗体。
本发明由杂交瘤细胞株CGMCC HBSP2分泌的抗突变乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体，代替常规乙肝表面抗原检测试剂盒中的HBsAb，在乙肝表面抗原诊断试剂盒中的应用。
按照本发明制备的抗突变乙型肝炎病毒表面抗原的单克隆抗体，可以同时检测出包括14种突变株和野生株在内的乙肝病毒，能够代替常规乙肝表面抗原检测试剂盒中的HBsAb，制成乙肝表面抗原诊断试剂盒。采用该抗体可以避免用常规试剂诊断时造成的漏诊，使变异和非变异的乙肝病毒携带者或者乙肝患者得到确诊，从而获得及时治疗。特别是在对献血员进行筛查的时候，能够检测出采用常规试剂盒检测不出的变异病毒携带者，避免将乙肝患者的血液当做健康的血液输给受血者，确保血源质量。
具体实施方式
实施例一：杂交瘤技术制备抗乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的单克隆抗体
一、材料
BALB/C纯系小鼠，雌性，8周龄。SP2/0骨髓瘤细胞株、RPMI1640培养基、新生小牛血清、次黄嘌呤-氨甲喋呤-胸腺嘧啶(HAT)、次黄嘌呤-胸腺嘧啶(HT)、聚乙二醇(PEG4000)，(以上均由华美生物工程公司提供)。辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠免疫球蛋白(武汉博士德生物制品公司)。
二、方法
1.免疫原制备  10μg(5μl，2μg/μl)抗原滴在2mm×2mm的硝酸纤维素膜(NC)上，晾干。
2.免疫  脾内植入免疫，小鼠氯胺酮麻醉，四肢固定后脾区拔毛，酒精消毒，左腋中线肋边缘下作5mm切口，入腹牵出脾脏下缘，切开脾包膜，填入已吸附抗原之NC膜，压迫止血，切口全层一针缝合。
免疫方案首次免疫采用脾内植入；间隔2周后加强免疫，腹腔注射抗原与福氏不完全佐剂混合液(1∶1)1ml；第3次免疫起每次间隔3周至1个月。
3.ELISA筛选  用含0.2％戊二醛的磷酸缓冲液(pH5.8)处理酶标板4h，加10μg/ml表面抗原溶液37℃包被2h，含10％NBS的PBS(pH7.4)37℃封闭2h，PBS/T冲洗3遍，4℃保持。用时每包被孔加稀释血清或杂交瘤细胞培养上清100μl，37℃孵育30min，PBS/T冲洗5遍，加1∶5000的HRP-羊抗小鼠IgG，37℃孵育30min，最后加底物-联苯胺(TMB)、底物-双氧水(H2O2)室温显色10-15min，以SP2/0骨髓瘤细胞培养上清为阴性对照。
4.细胞融合、筛选及克隆化  融合前3天，对血清效价最高的小鼠眶下经脉注射无佐剂抗原100μg，按常规方法，取小鼠脾细胞与SP2/0细胞(5∶1)融合，HAT选择培养，用上述ELISA法筛选，阳性孔经3次有限稀释克隆化。
5.单克隆抗体的提取与纯化  经过克隆的杂交瘤细胞扩大培养后，每隔3天收集1次上清液，1000r/min离心10min，上清液经硫酸氨分级沉淀法纯化后-20℃冻存。
6.腹水制备  在每只BALB/C小鼠腹腔内注入0.5ml液体降脂烷，10天后同法每只注入已培养的杂交瘤细胞106个，10天后小鼠腹部明显隆起，手触有波动感，用16号针头采集腹水。1500r/min离心30min，收集上清，-20℃冻存。
7.mAb初步鉴定
7.1效价测定用间接ELISA法检测杂交瘤培养上清及诱生腹水抗体免疫学效价。包被抗原为重组突变HBsAg蛋白，酶标记物为羊抗鼠HRP酶标二抗，酶底物为TMB-H2O2。
7.2 McAb类型鉴定按罗氏(Roche)公司小鼠免疫球蛋白亚类测定试剂盒说明操作。
7.3单克隆抗体特异性测定蛋白免疫印记(Western Blot)分析首先进行聚丙稀酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，再电转至PVDF膜上，一、二抗结合后，二氨基联苯胺(DAB)显色。
实施例二：抗-HBsAg单克隆抗体检测变异表面抗原
1.表达变异表面抗原重组质粒的构建及表达
在HBV S基因两测设计一对引物，根据文献报道的S基因的突变位点设计位点特异性的突变引物21对，通过PCR方法定点突变HBV S基因。将变异S基因克隆到真核表达载体PCR3.1，测序证实正确后用于实验。共构建21种表达变异HBsAg的重组质粒。
将21种表达变异HBsAg的重组质粒转染COS-7细胞，收集上清。
2.抗-HBsAg单克隆抗体E1C与变异表面抗原的反应性检测
将纯化抗-HBs单抗E1C以合适的稀释度包被ELISA反应孔，封闭后分别加入21种含有变乙肝表面抗原的细胞培养上清，37℃，1小时；洗涤后加入HRP标记的多抗-HBs，37℃，45分钟；洗涤后加入TMB显色剂，比色。根据颜色的比值计算S/N值，判断结果(见表一)。
3.国内常用HBsAg试剂盒检测变异表面抗原
选国内8个厂家生产的HBsAg检测试剂盒分别检测表达变异表面抗原的细胞培养上清。检测方法按试剂盒说明书进行，比较国内常用HBsAg检测试剂盒检测变异HBsAg的能力(见表二)。
4.比较单抗E1C和两种国产试剂盒检测R145R HBsAg的灵敏度。
将细胞表达的含G145R HBsAg上清从1∶5到1∶640倍稀释，用单抗E1C包被后检测系列稀释样品的反应性(见表三)。
实施例1和实施例2的鉴定结果如下：
1.杂交瘤细胞系的建立与克隆免疫小鼠血ELISA效价均达1∶104以上，取脾细胞与SP2/0细胞融合后HAT培养基培养，1周左右部分孔见细胞克隆性生长，2周后细胞生长超过孔底面积1/3，融合成功率为75％，特异性抗体阳性率为28.3％，经3次克隆化后保留一株最佳杂交瘤细胞株E1C。
2.抗突变HBsAg单抗的鉴定
2.1效价用间接ELISA法检测E1C腹水型单抗及细胞培养上清中单抗效价分别为1∶6.4×104、1∶160。
单克隆抗体E1C梯度稀释后ELISA测定OD450值如下：
E1C
杂交瘤细胞培养上清   1∶102.698    1∶1001.734   1∶10001.053     1∶100000.477   Control0.046
腹水   1∶10002.872    1∶100001.814   1∶10万1.226     1∶100万0.744   1∶1000万0.350
注：阳性标准：检测孔OD值/对照组OD值＞2.1
2.2免疫球蛋白(Ig)类别及亚型测定  经鉴定，所得细胞株E1C分泌的免疫球蛋白为IgG2a，轻链类型为κ。
2.3特异性Western-Blot鉴定E1C可与突变HBsAg蛋白发生特异性结合。
表一：抗乙肝HBsAg单抗检测变异HBsAg的结果
样品     E1C
HBsAg adr     100
                  HBsAg
                  (ayw)          100
                  HBsAgadw       100
                  G145R          63.0
                  L98V           41.82
                  Y100S          34.38
                  C124R          1.95
                  T123N          1.95
                  M133T          57.25
                  Y134N          63.55
                  P142S          50.74
                  G145K          93.54
                  D144A          104.44
                  M133I          29.48
                  Q129R          69.52
                  D144E          94.95
                  A166V          114.32
                  P127S          129.51
                  T118K          68.23
                  M125T          32.81
                  阳性数         15/17
                  Hela细胞       0.34
注：检测结果以野生HBsAg的OD值为100％，其余样品的OD值与之相比的百分数为检测结果。
表二：国内9种HBsAg检测试剂盒检测变异HBsAg的结果
样品   甲   乙  丙   丁   戊  己  庚   辛  壬
HBsAg(adr)   100   100  100   100   100  100  100   100  100
G145R   10.35   0.68  0.06   4.42   9.19  2.22  2.28   3.51  2.24
L98V   75.35   76.68  24.13   77.07   47.31  31.78  21.97   51.07  47.64
Y100S   89.68   4.12  0.56   4.11   13.73  6.18  37.04   9.55  6.91
C124R   0.59   0.92  1.71   1.49   0.88  1.88  2.48   2.04  0.98
T123N   0.58   0.84  1.37   2.09   1.83  3.81  4.83   4.91  2.49
M133T   6.54   3.49  1.37   7.16   6.7  4.14  8.91   6.29  59.13
Y134N   48.89   48.23  4.88   61.28   23.39  0.98  2.28   14.56  58.04
P142S   47.28   1.95  3.53   14.76   15.84  4.05  1.82   25.58  2.54
G145K   83.48   92.01  91.84   95.43   82.47  70.55  48.87   79.92  67.14
D144A   118.54   112.96  82.22   92.87   97.14  84.13  93.32   96.27  57.27
M133I   19.56   11.56  0.41   7.64   17.18  10.26  14.75   17.67  10.53
Q129R   68.65   53.42  0.12   70.44   5.45  49.44  53.14   46.18  3.68
D144E   69.41   78.52  86.55   70.43   85.04  53.57  40.67   66.49  72.83
A166V   83.14   214.63  183.2   94.22   93.53  92.2  107.19   105.37  132.0
P127S   93.08   85.44  91.55   70.45   91.51  62.68  78.54   84.28  85.15
 T118K  64.25  38.46  21.38  68.79  48.54  39.58  64.74  48.82  80.47
 M125T  42.53  2.62  36.54  3.51  3.98  48.71  37.05  4.65  1.58
 检测阳性数  14/17  11/17  8/17  12/17  14/17  11/17  12/17  13/17  11/17
 COS-7细胞  0.25  0.36  0.12  0.13  0.09  0.28  0.41  0.48  0.21
注：检测结果以野生HBsAg的OD值为100％，其余样品的OD值与之相比的百分数为检测结果。
表三：比较单抗E11C与两种试剂检测G145R HBsAg的灵敏度
    1∶5     1∶10     1∶20     1∶40     1∶80     1∶160     1∶320     1∶640
乙     0.161     0.081     0.063     0.051     0.052     0.048     0.057     0.042
甲     0.612     0.304     0.236     0.108     0.074     0.051     0.057     0.027
E1C     2.568     2.041     1.642     1.027     0.638     0.312     0.148     0.061
阴性对照     0.036     0.012     0.042     0.036     0.014     0.022     0.031     0.014
注：结果以比色后的OD值表示
实施例三：乙肝表面抗原检测试剂盒的制备
以本发明制备的抗突变HBsAg单抗代替常规乙肝表面抗原检测试剂盒中的HBsAb，其余试剂和材料与常规乙肝表面抗原检测试剂盒中的一样。检测方法也与常规的乙肝表面抗原检测试剂盒一样。

Claims (4)

1、一种由杂交瘤细胞株CGMCC HBSP2分泌的抗突变乙型肝炎病毒表面抗原的单克隆抗体。
2、一种杂交瘤细胞株CGMCC HBSP2的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)制备免疫原：将血源性乙肝疫苗HBsAg蛋白滴在硝酸纤维素膜上；
(2)免疫：按常规外科操作将硝酸纤维膜埋入待免疫的小鼠脾内，间隔两周后加强免疫，腹腔注射重组突变HBsAg蛋白与福氏不完全佐剂混合液，第三次免疫起每次间隔3周至1个月；
(3)筛选：用酶联免疫吸附法(ELISA)筛选免疫鼠血清；
(4)细胞融合、筛选及克隆化：选抗血清效价最高的鼠取脾细胞与骨髓瘤细胞体外融合，经三次亚克隆获得稳定分泌抗突变HbsAg蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株CGMCC HBSP2。
3、一种由杂交瘤细胞株CGMCC HBSP2分泌的抗突变乙型肝炎病毒表面抗原的单克隆抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)单克隆抗体的提取与纯化：将获得的稳定分泌抗突变HbsAg蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株CGMCC HBSP2体外扩大培养后，定期收集上清液；
(2)腹水制备：将扩大培养后的细胞株打入BALB/C小鼠腹腔以产生大量腹水，用降脂烷处理小鼠腹腔，将杂交瘤细胞注入小鼠腹腔，待小鼠腹腔足够大时用注射器吸出腹水，盐析法纯化；在腹水制备中，将扩大培养后的细胞株打入鼠腹腔的杂交瘤细胞数为1×107个，7-10天后收集腹水，经提取、纯化后即可得到抗突变HBsAg蛋白单克隆抗体。
4、一种由杂交瘤细胞株CGMCC HBSP2分泌的抗突变乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体，代替常规乙肝表面抗原检测试剂盒中的HBsAb，在乙肝表面抗原诊断试剂盒中的应用。
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