CN101871944B

CN101871944B - 一种茶尺蠖核型多角体病毒的定性检测方法

Info

Publication number: CN101871944B
Application number: CN 201010190023
Authority: CN
Inventors: 肖强; 付建玉; 杜军利; 唐美君
Original assignee: Tea Research Institute Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Tea Research Institute Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2010-06-02
Filing date: 2010-06-02
Publication date: 2013-07-10
Anticipated expiration: 2030-06-02
Also published as: CN101871944A

Abstract

一种茶尺蠖核型多角体病毒的定性检测方法，属生物制剂检测技术领域，其特征在于：先制备茶尺蠖核型多角体病毒多角体蛋白单克隆抗体，然后将待检样品进行包被，使用间接Elisa方法进行检测。本发明借助免疫学手段，突破了传统的生物测定技术，解决了茶尺蠖核型多角体病毒的准确定性问题。与传统生物测定方法相比，本方法毒力指标检测更为精细，毒力评价周期大大缩短，可广泛用于病毒制剂质量的评定，规范茶尺蠖病毒的生产应用。

Description

一种茶尺蠖核型多角体病毒的定性检测方法

技术领域

本发明属生物制剂检测技术领域，具体涉及一种病毒制剂的定性检测方法。

背景技术

茶尺蠖核型多角体病毒(Ectropis obliqua nucleopolyhedrovirus，EoNPV)属杆状病毒科，核型多角体病毒属，该病毒于1977年在我国首次发现。EoNPV是茶尺蠖的病原性天敌，通过幼虫取食后在虫体内迅速增殖，致使其感染发病而死亡。目前这种病毒已可以通过室内大量增殖，经配制形成产品，进行商业化生产，近年来，EoNPV作为一种高效病毒杀虫剂在各省茶区广泛推广使用，对茶尺蠖进行有效的生物防治，产生了良好的社会、经济和生态效益。因为这种病毒产品不同于一般的农药，它是一个活体，目前只有通过生物测定的方法进行检测。也就是说，用病毒产品喂饲茶尺蠖幼虫，看是否发病来确定该生物农药产品是否有效，这是因为核型多角体病毒是寄主专一性的，因而茶尺蠖病毒只能感染茶尺蠖幼虫。这种传统的生物测定的方法使得目前在EoNPV病毒制剂的生产、使用过程中存在毒力指标检测粗放、评价周期过长、制剂质量难以有效监控等问题。

发明内容

鉴于现有技术中存在的上述问题，本发明发明利用免疫学原理，通过制备茶尺蠖核型多角体病毒多角体蛋白单克隆抗体，再借助ELISA手段来定性检测未知样品中是否有茶尺蠖核型多角体病毒。

所述的一种茶尺蠖核型多角体病毒的定性检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1)制备茶尺蠖核型多角体病毒单克隆抗体；

2)样品检测；

所述的步骤1)主要包括以下步骤：

a.茶尺蠖核型多角体病毒的分离纯化；

b.将纯化的茶尺蠖核型多角体病毒作为抗原对小鼠进行免疫；

c.细胞融合和克隆：在加强免疫3天后取小鼠脾细胞和正处于对数生长期的骨髓瘤细胞在PEG6000的作用下进行细胞融合，每次融合后，将细胞接种于96孔培养板，用含HAT的1640完全培养基选择培养10天，然后将HAT改为HT培养1周；待细胞长至显微镜视野的1/4，取培养上清用ELISA法检测抗体，以茶尺蠖核型多角体病毒作为包被原对所选阳性细胞进行再筛选，选择最终的阳性细胞以有限稀释法进行克隆；

d.对检测为阳性单克隆细胞株进行传代培养，筛选出阳性单克隆抗体细胞株；

e.杂交瘤细胞腹水效价测定；

f.单抗对病毒蛋白特异性识别；

所述的步骤2)主要包括以下步骤：

a.将待检样品置于包被液中，按每孔100μL加入酶联板的小孔中，设置对照，37℃下包被3-4h或4℃冰箱包被过夜；

b.用1×PBST洗涤3次，每次5min；

c.加150μL重量百分浓度为2％-5％的脱脂奶粉，37℃下封闭1h；

d.配制茶尺蠖核型多角体病毒单克隆抗体于2wt％-5wt％脱脂奶粉中，体积配比为1∶1000，每孔加100μL，37℃下温浴1h；

e.用1×PBST洗涤3次，每次5min；

f.用1×PBST将辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠稀释5000倍，每孔加100μL稀释后的抗体，37℃下温育1h；

g.用1×PBST洗涤3次，每次5min；

h.加100μL显色液，37℃下温育3-5min；

i.加50μL终止液；

j.用酶标仪测读各孔在λ＝492nm处的光密度值OD，计算P/N＝样品OD值/对照OD值，若P/N≥2.1，即为阳性。

所述的一种茶尺蠖核型多角体病毒的定性检测方法，其特征在于步骤1)步骤a所述的茶尺蠖核型多角体病毒分离纯化方法为：以茶尺蠖核型多角体病毒感染茶尺蠖幼虫，收集被感染的茶尺蠖虫尸，用研钵将虫尸磨碎，用5层粗棉布过滤其中较大颗粒后，使用新配制的裂解液裂解1-2h，裂解液为0.1mol/L Na₂CO₃，0.05mol/L NaCl，pH＝10.3；用50％的HCl中和碱液，3000g离心5min，去除其中未裂解的多角体；再160000g、1.5h超速离心，沉淀茶尺蠖核型多角体病毒；最后用PBS溶解纯化的病毒粒子，存于4℃冰箱待用。

所述的一种茶尺蠖核型多角体病毒的定性检测方法，其特征在于步骤1)步骤b所述的小鼠免疫具体方法如下：将分离纯化后的茶尺蠖核型多角体病毒粒子作为抗原与等量福氏完全佐剂充分混合，经皮下多点注射BALB/c小鼠，每只80-100μg，间隔14d用含等量的福氏不完全佐剂的蛋白抗原相同剂量作第2、3、4次免疫，14d后，腹腔注射不加佐剂的蛋白抗原，每只100μg，3d后取脾细胞用于细胞融合。

所述的一种茶尺蠖核型多角体病毒的定性检测方法，其特征在于步骤1)步骤e所述的杂交瘤细胞腹水效价测定方法为：将筛选出的阳性单克隆杂交瘤细胞株进行扩大培养，并向小鼠腹部注射降植烷，一周后，使用生理盐水将细胞沉淀悬浮，接种于小鼠腹腔，待小鼠腹腔明显鼓胀，抽取腹水测定其抗体效价并保存于4℃备检；培养上清或腹水，经稀释后加到包被原包被的酶标板中，孵育、洗涤后，再加入HRP标记的羊抗鼠IgG，底物显色；阳性对照为小鼠阳性血清，同时分别以同等稀释的Sp2/O培养上清，或无免疫小鼠血清为阴性对照，空白对照为PBS。

所述的一种茶尺蠖核型多角体病毒的定性检测方法，其特征在于步骤1)步骤f所述的单抗对病毒蛋白特异性识别方法为：首先是克隆表达茶尺蠖核型多角体病毒蛋白基因，根据茶尺蠖核型多角体病毒基因组的多角体蛋白基因序列，采用DNAStar软件，设计了一对特异性引物如下：EoNPV ph F：5’-atgtatactcgttaca-3’和EoNPV ph R：5’-ttaatacgcaggtcct-3’，扩增多角体蛋白基因，PCR反应采用25μL体系，PCR扩增程序如下：先94℃预变性3min；然后94℃30s，62℃30s，72℃30s；循环30次，最后72℃延伸10min；PCR产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定；

将扩增的基因片段克隆连接至pMD18-T克隆载体，连接产物转化至TG1，提取质粒，用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切切下ph基因片段，并连接到经BamHⅠ和 XhoⅠ双酶切的表达载体质粒pGEX-4T2，提取质粒并用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定，得到表达载体质粒pGEX-4T2-ph；

将构建的pGEX-4T2-ph表达载体转化表达菌E.coli BL21，挑取单菌落并在37℃、200rpm/min条件下对其进行培养8-10h；第二天用5％菌液转接于5mLLB液体培养基中，培养2-3h，直至OD600为0.4-0.6，随后加入0.1mmol/L的IPTG，在37℃对其诱导培养6-8h，收集菌体，用PBS稀释，然后加入SDS-PAGE上样缓冲液，进行沸水浴5min，使用12000g转速离心10min去除不溶物质，取10μL样品进行SDS-PAGE检测及Western-blot分析；在此过程中，同时以BL21菌液和转化pGEX-4T2的诱导菌液作为参照；

利用Western-blot对两株单抗的特异性进行鉴定，按常规方法进行；将茶尺蠖病毒粒子、多角体表达蛋白、载体pEGX-4T2表达蛋白进行SDS-PAGE，用小鼠腹水作为一抗。

上述的一种茶尺蠖核型多角体病毒的定性检测方法，突破了传统的生物测定技术，解决了茶尺蠖核型多角体病毒的准确定性问题。本发明的优点是借助免疫学手段，制备了茶尺蠖核型多角体病毒单克隆抗体，建立了茶尺蠖核型多角体病毒的准确定性检测方法，与传统生物测定方法相比，本方法毒力指标检测更为精细，毒力评价周期大大缩短，可广泛用于病毒制剂质量的评定，规范茶尺蠖病毒的生产应用。

附图说明

图1为EoNPV Western-blot分析结果；

图2为SDS-PAGE和Western-blot分析结果；

图2中：M：蛋白质分子质量标准；1：GST-Ph融合蛋白；2：PGEX-4T-2 载体；3：ph融合蛋白；4：PGEX-4T-2。

具体实施方式

现结合本发明的实施例对本发明作进一步说明。

实施例1、茶尺蠖核型多角体病毒多角体蛋白单克隆抗体的制备

1.EoNPV病毒粒子的分离纯化

以茶尺蠖核型多角体病毒EoNPV(浙江杭州株)感染适龄幼虫，收集并磨碎染病死亡虫尸；用5层粗棉布过滤其中较大颗粒后，使用适量新配制的裂解液0.1mol/L Na₂CO₃，0.05mol/L NaCl(pH＝10.3)裂解多角体1-2h；用50％的HCl中和碱液，3000g离心5min，去除其中未裂解的多角体；在160000g、1.5h超速离心，沉淀EoNPV病毒粒子；最后用PBS溶解纯化的病毒粒子，存于4℃冰箱待用。

2.小鼠免疫

将分离纯化后的茶尺蠖核型多角体病毒粒子作为抗原与等量福氏完全佐剂充分混合，经皮下多点注射BALB/c小鼠，每只80-100μg，间隔14d用含等量的福氏不完全佐剂的蛋白抗原相同剂量作第2、3、4次免疫，14d后，腹腔注射不加佐剂的蛋白抗原，每只100μg，3d后取脾细胞用于细胞融合。

3.细胞融合和克隆

在加强免疫后3天左右取小鼠脾细胞和正处于对数生长期的骨髓瘤细胞在PEG6000的作用下进行融合，每次融合后，将细胞接种于96孔培养板，用含HAT的1640完全培养基选择培养10天左右，然后将HAT改为HT培养1周。

待细胞长至显微镜视野的1/4，取培养上清用ELISA法检测抗体，以EoNPV病毒粒子作为包被原对所选阳性细胞进行再筛选，选择最终的阳性细胞以有限稀释法进行克隆。

4.阳性单克隆抗体细胞株的筛选

对检测为阳性的单克隆细胞株进行规律传代培养，并且每一代检测它们的抗体分泌情况，最终获得稳定分泌抗体的EoNPV单克隆抗体细胞株。目的：初筛选所得细胞株不一定是单个杂交瘤细胞株，里面可能混有其它细胞，因此必须进行3次以上的亚克隆，直至所有细胞孔都为阳性方可。

5.小鼠腹水制备及鉴定

将最后筛选出的阳性单克隆杂交瘤细胞株进行扩大培养，并向小鼠腹部注射降植烷，一周后，使用生理盐水将细胞沉淀悬浮，接种于小鼠腹腔，待小鼠腹腔明显鼓胀，抽取腹水测定其抗体效价并保存于4℃备检。

6.McAb效价测定

培养上清或腹水，经稀释后加到包被原包被的酶标板中，孵育、洗涤后，再加入HRP标记的羊抗鼠IgG，底物显色。阳性对照为小鼠阳性血清，同时分别以同等稀释的Sp2/O培养上清，或无免疫小鼠血清为阴性对照，空白对照为PBS。

7.单抗对病毒蛋白特异性识别

首先是克隆表达茶尺蠖核型多角体病毒蛋白基因，根据茶尺蠖核型多角体病毒基因组(NC_008586.1)的多角体蛋白基因序列，采用DNAStar软件，设计了一对特异性引物，EoNPV ph F：5’-GGATCCatgtatactcgttaca-3’(见序列表SEQ No.1)和EoNPV ph R：5’-CTCGAGttaatacgcaggtcct-3’(见序列表 SEQ No.2)扩增多角体蛋白基因(GGATCC和CTCGAG为酶切位点)。PCR反应采用25μL体系，PCR扩增程序如下：先94℃预变性3min；然后94℃30s，62℃30s，72℃30s；循环30次，最后72℃延伸10min。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定，预测片段大小约741bp。(测序结果为：ATGTATACTCGTTACAGTTACAACCCGTCGTTGGGTCGCACCTACGTCTACGACAATAAGTATTTCAAGAATCTCGGCGCCGTAATCAAAAACGCCAAACGCAAGAAGCATCAACTTGAACATGAAGTCGAAGAACACGCTCTCGACCCTCTGGACAGGTATCTTGTTGCCGAGGACCCTTTCATGGGGCCGGGCAAGAATCAAAAACTAACTTTGTTCAAAGAGATTCGCAACGTCAAGCCCGACACGATGAAACTGATCGTTAATTGGAGCGGCAAAGAATTTCTCAGAGAAACTTGGACTCGTTTCATGGAAGACAGTTTCCCCATTGTCAACGACCAAGAAGTGATGGACGTGTTTTTGGTGATTAACATGCGTCCCACCAGGCCCAACCGTTGTTACAAATTCTTAGCTCAACACGCGCTGCGTTGCGATCCCGATTACGTGCCGCACGAGGTGATCAGAATCGTTGAGCCCAGCTACGTGGGCAGCAACAACGAATATCGCATCAGTCTGGCTAAACGCGGAGGCGGTTGCCCCGTTATGAACCTGCACGCCGAGTACACCAACTCTTTCGAGGAATTCATCAACCGCGTGATTTGGGAGAATTTCTACAAGCCCATCGTGTATGTGGGCACCGATTCCGCCGAAGAGGAGGAAATCCTACTTGAAGTTTCGCTTGTCTTCAAAATCAAAGAATTCGCCCCTGACGCACCTTTGTATTCAGGACCTGCGTATTAA(见序列表SEQ No.3)。

将扩增的基因片段克隆连接至pMD18-T克隆载体，连接产物转化至TG1，提取质粒，用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切切下ph基因片段，并连接到经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切的表达载体质粒pGEX-4T2，提取质粒并用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定，得到表达载体质粒pGEX-4T2-ph。

将构建的pGEX-4T2-ph表达载体转化表达菌E.coli BL21，挑取单菌落并在37℃、200rpm/min条件下对其进行培养8-10h。第二天用5％菌液转接于5mL LB液体培养基中，培养2-3h，直至OD600为0.4-0.6，随后加入0.1mmol/L的IPTG，在37℃对其诱导培养6-8h，收集菌体，用PBS稀释，然后加入SDS-PAGE上样缓冲液，进行沸水浴5min，使用12000rpm转速离心10min去除不溶物质，取10μL左右样品进行SDS-PAGE检测及Western-blot分析。在此过程中，同时以BL21菌液和转化pGEX-4T2的诱导菌液作为参照。

利用Western-blot对两株单抗的特异性进行鉴定，按常规方法进行。将茶尺蠖病毒粒子、多角体表达蛋白、载体pEGX-4T2表达蛋白进行SDS-PAGE，用小鼠腹水作为一抗。通过Western-blot实验，以确定与EoNPV单抗特异性结合的蛋白是否是该病毒的多角体蛋白。

分析结果见图1和图2。其中图1中，制备的单抗与茶尺蠖核型多角体病毒蛋白结合，证明该单抗为茶尺蠖核型多角体病毒的单抗，即此单抗可以用于茶尺蠖核型多角体病毒的定性检测。图2中：SDS-PAGE的样品1和2分别为表达的GST-Ph融合蛋白，ph代表茶尺蠖核型多角体病毒的多角体蛋白、PGEX-4T-2载体；Western-blot的样品3和4分别为ph蛋白、PGEX-4T-2。

实施例2、ELISA检测

取EoNPV生物制剂和化学农药，使用0.9％的生理盐水将样品按1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000稀释，用移液枪将其混匀，为稀释后的样品设置3个重复，并设置阴性对照，用1×PBS作为阴性对照。将上述配置稀释后的样品随后向酶标板小孔分别加入100μL/孔。在4℃冰箱包被过夜或者37℃下包被2-3h。

A.使用1×PBST连续洗涤酶标板3次，每次洗涤5min；

B.配制2％-4％的脱脂奶粉，向小孔中分别加150μL 2％-5％脱脂奶粉，在 37℃下封闭1h。

C.使用1×PBST连续洗涤酶标板3次，每次洗涤5min；

D.将制备的EoNPV单克隆抗体溶于2％-5％脱脂奶粉中，按1∶1000稀释，每孔加100μL，在37℃下温浴1-2h。

E.使用1×PBST连续洗涤酶标板3次，每次洗涤5min；

F.将辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠按1∶5000用1×PBST稀释，在酶标板中每孔加入100μL 37℃下温育1h。

G.使用1×PBST连续洗涤酶标板3次，每次洗涤5min；加显色液100μL/孔，在37℃下温育10-15min。显色液为24.3mL 0.1M柠檬酸和25.7mL 0.2MNa₂HPO₄等体积混合，并在临用前加入20mg邻苯二胺和75μL双氧水。

H.向每孔加入2mol/L H₂SO₄终止液50μL，终止该反应。

I.使用酶标仪测读酶标板各孔在λ＝492nm处的光密度值OD，然后计算P/N＝样品OD值/对照OD值。如果P/N≥2.1，则为阳性。

试验结果：应用上述所制备的抗体对样品进行ELISA检测，结果显示，阳性EoNPV生物制剂样品均显色，且颜色较深，阴性对照无显色反应，且化学农药和1×PBS阴性对照的OD492值均较小，另外EoNPV生物制剂样品与阴性对照OD492值之比大于2.1。

序列表

<110>中国农业科学院茶叶研究所

<120>一种茶尺蠖核型多角体病毒的定性检测方法

<130>案卷参考号

<160>3

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

atgtatactc gttaca 16

<210>2

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

ttaatacgca ggtcct 16

<210>3

<211>741

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

atgtatactc gttacagtta caacccgtcg ttgggtcgca cctacgtcta cgacaataag 60

tatttcaaga atctcggcgc cgtaatcaaa aacgccaaac gcaagaagca tcaacttgaa 120

catgaagtcg aagaacacgc tctcgaccct ctggacaggt atcttgttgc cgaggaccct 180

ttcatggggc cgggcaagaa tcaaaaacta actttgttca aagagattcg caacgtcaag 240

cccgacacga tgaaactgat cgttaattgg agcggcaaag aatttctcag agaaacttgg 300

actcgtttca tggaagacag tttccccatt gtcaacgacc aagaagtgat ggacgtgttt 360

ttggtgatta acatgcgtcc caccaggccc aaccgttgtt acaaattctt agctcaacac 420

gcgctgcgtt gcgatcccga ttacgtgccg cacgaggtga tcagaatcgt tgagcccagc 480

tacgtgggca gcaacaacga atatcgcatc agtctggcta aacgcggagg cggttgcccc 540

gttatgaacc tgcacgccga gtacaccaac tctttcgagg aattcatcaa ccgcgtgatt 600

tgggagaatt tctacaagcc catcgtgtat gtgggcaccg attccgccga agaggaggaa 660

atcctacttg aagtttcgct tgtcttcaaa atcaaagaat tcgcccctga cgcacctttg 720

tattcaggac ctgcgtatta a 741

Claims

1.一种茶尺蠖核型多角体病毒的定性检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1）制备茶尺蠖核型多角体病毒单克隆抗体；

2）样品检测；

所述的步骤1）主要包括以下步骤：

a.茶尺蠖核型多角体病毒的分离纯化；

以茶尺蠖核型多角体病毒感染茶尺蠖幼虫，收集被感染的茶尺蠖虫尸，用研钵将虫尸磨碎，用5层粗棉布过滤其中较大颗粒后，使用新配制的裂解液裂解1-2h，裂解液为0.1 mol/L Na₂CO₃，0.05 mol/L NaCl，pH=10.3；用50%的HCl中和碱液，3000g离心5min，去除其中未裂解的多角体；再160000g、1.5h超速离心，沉淀茶尺蠖核型多角体病毒；最后用PBS溶解纯化的病毒粒子，存于4℃冰箱待用；

e.杂交瘤细胞腹水效价测定；

f．单抗对病毒蛋白特异性识别；

首先是克隆表达茶尺蠖核型多角体病毒蛋白基因，根据茶尺蠖核型多角体病毒基因组的多角体蛋白基因序列，采用DNAStar软件，设计了一对特异性引物如下：EoNPV ph F: 5'-atgtatactcgttaca-3'和

EoNPV ph R: 5'-ttaatacgcaggtcct-3'，扩增多角体蛋白基因，PCR反应采用25μL体系，PCR扩增程序如下：先94℃预变性3min；然后94℃ 30s，62℃30s，72℃30s；循环30次，最后72℃延伸10min；PCR产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定；

将扩增的基因片段克隆连接至pMD18-T克隆载体，连接产物转化至TG1，提取质粒，用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切切下ph基因片段，并连接到经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切的表达载体质粒pGEX-4T2，提取质粒并用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定，得到表达载体质粒pGEX-4T2-ph；

将构建的pGEX-4T2-ph表达载体转化表达菌E.coli BL21，挑取单菌落并在37℃、200rpm/min条件下对其进行培养8-10h；第二天用5%菌液转接于5mL LB液体培养基中，培养2-3h，直至OD600为0.4-0.6，随后加入0.1mmol/L的IPTG，在37℃对其诱导培养6-8h，收集菌体，用PBS稀释，然后加入SDS-PAGE上样缓冲液，进行沸水浴5min，使用12000g转速离心10min去除不溶物质，取10μL样品进行SDS-PAGE检测及Western-blot分析；在此过程中，同时以BL21菌液和转化pGEX-4T2的诱导菌液作为参照；

利用Western-blot对两株单抗的特异性进行鉴定，按常规方法进行；将茶尺蠖病毒粒子、多角体表达蛋白、载体pEGX-4T2表达蛋白进行SDS-PAGE，用小鼠腹水作为一抗；

所述的步骤2）主要包括以下步骤：

b.用1×PBST洗涤3次，每次5min；

c.加150μL重量百分浓度为2%-5%的脱脂奶粉，37℃下封闭1h；

d.配制茶尺蠖核型多角体病毒单克隆抗体于2wt%-5wt%脱脂奶粉中,体积配比为1：1000，每孔加100μL，37℃下温浴1h；

e.用1×PBST洗涤3次，每次5min；

g.用1×PBST洗涤3次，每次5min；

h.加100μL显色液，37℃下温育3-5min；

i.加50μL终止液；

j.用酶标仪测读各孔在λ=492nm处的光密度值OD，计算P/N=样品OD值/对照OD值，若P/N≥2.1，即为阳性。