CN104530230B

CN104530230B - 一种鸭甲肝病毒vp1蛋白基因及其应用

Info

Publication number: CN104530230B
Application number: CN201410775871.0A
Authority: CN
Inventors: 庄鸿章
Original assignee: Huian Yicheng Electromechanical Equipment Engineering Co Ltd
Current assignee: Hangzhou Baiyu Biotechnology Co., Ltd
Priority date: 2014-12-13
Filing date: 2014-12-13
Publication date: 2018-01-30
Anticipated expiration: 2034-12-13
Also published as: CN104530230A

Abstract

本发明首先提供一种新型复合鸭甲肝病毒结构蛋白VP1，其编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1；并以该结构蛋白VP1作为抗原来制备复合鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗。本发明利用pET28a(+)表达性载体构建了能表达复合鸭甲肝病毒结构蛋白VP1的大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌。经SDS‑PAGE分析，表达出了20kD重组目的蛋白。将重组蛋白纯化后制备成基因工程亚单位疫苗，免疫4月龄麻鸭(产蛋种)，两次免疫后可以使孵化的雏鸭获得对DHAV‑1和DHAV‑3毒株的免疫保护。

Description

一种鸭甲肝病毒VP1蛋白基因及其应用

技术领域

本发明属于功能基因改造技术领域，具体涉及一种鸭甲肝病毒VP1蛋白基因及其应用。

背景技术

鸭甲肝病毒(Duck hepatitis A viral，DHAV)主要感染1-3周龄雏鸭，是引起高度致病、传播迅速的鸭病毒性疾病，死亡率高达90％以上。其呈世界范围分布，给养鸭业带来极大的损失。鸭甲肝病毒主要分为3个基因型：A、B和C，对应于三个血清型DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3。DHAV-1最早是在1950年从美国分离得到，是经典毒株，目前分布于世界各地，是中国目前流行的主要毒株。DHAV-3为最早分离自韩国的新型毒株。这三种血清型的相互无交叉保护或者仅有有限的交叉保护。

近年来流行病学调查显示，我国DHAV-3的持续出现，并经常与DHAV-1的共感染，而国内已经批准上市的鸭病毒性肝炎疫苗(鸭病毒性肝炎弱毒株A66株、CH60株)均为DHAV-1株，已不能对目前国内复杂的鸭病毒性肝炎疾病提供有效保护。因此开发一种新型复合疫苗株，既可对DHAV-1又可对DHAV-3提供保护无疑对养鸭业的健康发展具有重要意义。

DHAV的VP1基因由714个碱基组成，编码VP1蛋白大小为26.4kD，含有多个DHAV抗原表位，是鸭肝炎病毒主要的保护性抗原，可诱导机体产生较强的抗体反应并获得免疫保护，是设计DHAV新型疫苗的首选目标基因。本发明通过将DHAV-1和DHAV-3 VP1基因的优势抗原表位进行重组、连接，成功获得一段新型复合鸭甲肝病毒VP1蛋白基因，可用于新型鸭甲肝疫苗的开发和应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型复合鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗，即获得一种新型复合的鸭甲肝病毒结构蛋白VP1，并以该结构蛋白VP1作为抗原来制备复合鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗。

本发明首先提供一种新型复合鸭甲肝病毒结构蛋白VP1，其编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1；

上述蛋白的一种核苷酸序列为SEQ ID NO:2；

本发明还提供一种复合鸭甲肝病毒基因工程重组亚单位疫苗，其中的抗原为上述的复合鸭甲肝病毒结构蛋白VP1，其浓度为0.1-1mg/ml之间；

本发明的复合鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗，其制备步骤如下：

1)将复合VP1基因连入表达载体中，构建成表达重组质粒；

2)将构建的表达重组质粒转化宿主菌,构建了能表达复合鸭甲肝病毒结构蛋白VP1的重组基因工程菌；用该重组基因工程菌表达出复合鸭甲肝病毒结构蛋白VP1；

3)对重组表达的VP1蛋白进行纯化后，加入白油佐剂制成疫苗。

本发明利用pET28a(+)表达性载体构建了能表达复合鸭甲肝病毒结构蛋白VP1的大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌。经SDS-PAGE分析，表达出了20kD重组目的蛋白。将重组蛋白纯化后制备成基因工程亚单位疫苗，免疫4月龄麻鸭(产蛋种)，两次免疫后可以使孵化的雏鸭获得对DHAV-1和DHAV-3毒株的免疫保护。

具体实施方式

下面结合具体实施方式来进一步描述本发明，但本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的技术方案的情况下可以对本发明的技术方案的细节和形式进行修改或替换，这些修改和替换均落入本发明保护范围内。

实施例1 新型复合鸭甲肝病毒VP1蛋白及其基因的获得

1、对DHAV-1代表毒株(GenBank登录号：GU363950.1)的VP1蛋白序列和DHAV-3代表毒株(GenBank登录号：EU289393.1)的VP1蛋白序列进行抗原性分析，分别选取DHAV-1的VP1蛋白优势抗原表位(94-146)与DHAV-3的VP1蛋白优势抗原表位(115-223)进行拼接，中间加入蛋白lingker(GGGSGGGS)以促进两段序列的正确折叠，最终获得的新型复合鸭甲肝病毒VP1蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

2、根据获得的新型复合鸭甲肝病毒VP1蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO:1，根据大肠杆菌基因密码子偏好性进行重新设计，获得编码复合鸭甲肝病毒VP1的核苷酸序列SEQ IDNO:2。将基因序列两端加上BamH I和Hind III酶切位点并送上海捷瑞生物工程有限公司全基因合成。

实施例2 基因工程蛋白表达载体的构建与工程菌的获得

1、上述全基因合成的VP1基因蛋白基因BamH I和Hind III双酶切后连入pET28a载体相应的酶切位点，构建pET28a/VP1表达载体。

2、用CaCl₂法将pET28a/VP1表达载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)，涂布于含50μg/ml卡那霉素的琼脂平板，37℃过夜培养。选取10个单菌落提取质粒，BamH I和Hind III双酶切验证阳性的菌落进一步测序鉴定。将测序验证后的阳性克隆在LB培养基中发酵培养至0.6～0.8时加入0.5mM IPTG诱导4～5小时，离心收集菌体跑SDS-PAGE电泳，同时设立未诱导菌体作为对照。结果诱导后阳性克隆比对照菌在20kD处多出一条蛋白条带，与重组蛋白理论分子量一致，表达量约为30％以上。分别经DHAV-1和DHAV-3抗体免疫印迹检定，均显示阳性反应。证明获得的阳性克隆为高效表达基因工程蛋白的工程菌，命名为HZ株。

实施例3 发酵、纯化与复合鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗的制备

1、发酵工艺

1)LB培养基作为种子培养基，含5g/L葡萄糖和5g/L MgSO₄·7H₂O的LB培养基作为发酵培养基，补料为葡萄糖400g/L、蛋白胨24g/L、酵母提取物10g/L、NaCl 5g/L、MgSO₄·7H₂O 5g/L。

2)发酵过程

挑取鉴定过的工程菌接种于含卡那霉素的浓度为50μg/ml的LB培养基，37℃振荡培养8小时，作为种子液。将种子液按5％接种量接种于发酵罐中，调节好各参数，37℃，200转，溶氧控制在20％以上。发酵4.5小时后开始流加补料，发酵6小时后加入0.5mmol/L IPTG进行诱导表达，表达后6小时发酵结束。

3)镍柱纯化、脱盐

4)亲和层析

采用镍离子金属螯合层析柱，重组蛋白可以用含400mmol/L咪唑的洗脱液洗下来，纯度达到90％以上

5)脱盐

收集的重组蛋白洗脱液放入透析袋，PBS液作为透析外液，透析脱盐后用甲醛灭活后测蛋白浓度，用PBS液稀释至0.5mg/ml，0.22μm过滤除菌，即得重组蛋白液。

2、复合鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗的制备

将制备的重组蛋白96份与灭菌的4份吐温-80充分搅拌混合作为水相。同时注射用白油94份，加6份的司本80、硬脂酸铝2份，混合均匀，高压灭菌后作为油相。按水相和油相1:3比例混合乳化即可制备复合鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗。按兽用生物制品规程的检验方法进行性状、无菌检验、安全检验均合格。

具体操作规程如下：

1 菌毒种

1.1 制造用菌种为复合鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗生产菌株HZ株，检验用DHAV-1强毒W株、DHAV-3强毒VF3株由本发明人鉴定、保存和供应。

1.2 生产用菌种标准

1.2.1 形态和生化特性

含有卡那霉素的LB琼脂平板上过夜培养，在培养板上呈现圆形、边缘整齐、突起、乳白色有光泽的光滑菌落，革兰氏染色后，镜下显示为革兰氏阴性短杆菌；生化试验结果均为葡萄糖发酵+，吲哚试验+，甲基红试验+，VP-，枸橼酸利用试验-。

1.2.2 培养特性可在含有卡那霉素的培养基中生长。

1.2.3 鉴别检验

1.2.3.1 PCR检测将本菌的LB液体培养物3μl做模板，用以下PCR引物进行PCR扩增，应能扩增出324bp左右的片段。

P1:5′-GATGGGGGGAGTAATGAT-3′

P2：5′-GGTAACGGAAAAAACAGG-3′

扩增的条件如下：94℃5min变性，94℃30S，50℃30S，72℃1min，30个循环，72℃延伸10min。

1.2.3.2 Western-blot检测将LB固体培养平板上的重组菌单菌落接种于5ml含有卡那霉素的LB液体培养基中，培养至OD₆₀₀值在0.6～1.0之间时加入0.5mM的IPTG诱导，持续培养4小时，收集菌体，用PBS重悬后高压匀质破碎，8000r/min离心去沉淀，上清液与抗鸭甲肝病毒1型阳性血清和抗鸭甲肝病毒3型阳性血清进行Western-blot试验，应出现特异性条带。

1.2.4 纯粹用适宜培养基检查，应纯粹。

1.2.6 基础种子代次 F3～F7代。

1.2.7 保存冻干菌种，-20℃，保存期为2年。

2 疫苗制造及半成品检验

2.1 生产用种子制备

2.1.1 一级种子繁殖和鉴定将冻干菌种分别接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养8～10小时，然后划线接种于含卡那霉素的LB固体培养基上37℃培养16～18小时，作为一级种子。在2～8℃保存，不超过14天；在培养基上传代，应不超过2代。

2.1.2 二级种子繁殖在一级种子中选取符合1.2.1项标准的典型菌落10个混合于少量LB培养液中，接种于含卡那霉素的LB培养液中，37℃培养8～10小时，进行纯粹检验，应纯粹。置2～8℃保存，应不超过3天。

2.2 制苗用培养基为改良LB培养基，每1000ml培养基中含胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，葡萄糖5g，MgSO₄·7H₂O 5g。

2.3 制苗用抗原液制备

2.3.1 菌液培养用培养罐通气培养，按培养罐容积装入适量培养基(70％左右)及消泡剂，灭菌后按培养基量的5％接种二级种子菌液，37℃通气培养，待菌液的OD₆₀₀值达到7.0时，加入10g/L的α-乳糖诱导，再继续培养6～8小时。使用20％NaOH调节pH在7.0，通过转速关联控制溶氧在20％以上。当溶氧迅速上升时，流加补料。

2.3.2 破菌培养结束后，离心收集菌体。收集的菌体用PBS清洗2次，将收集的菌体用PBS制成10％的悬液，在4℃下用高压匀浆机破碎细菌。破碎后的菌液，8000r/min，离心15分钟，收集上清液。

2.3.3 镍柱层析纯化收集的重组蛋白洗脱液放入透析袋，PBS液作为透析外液，透析脱盐后即得重组蛋白液。

2.3.4 灭活将纯化的上清液中按比例加入10％的甲醛溶液，甲醛溶液的最终浓度为0.2％，37℃灭活12小时，以灭活残存的大肠杆菌。取少量样品进行半成品检验。2～8℃保存，不超过7天；-15℃以下保存，不超过60天。

2.4 半成品检验

2.4.1 VP1含量检测用BCA法检测上清液蛋白浓度，稀释至终浓度0.5mg/ml，无菌过滤，待用。

2.4.2 无菌检验按现行《中国兽药典》进行检验，应无菌生长。

2.4.3 内毒素含量检测按鲎试剂方法进行内毒素检测，内毒素含量不高于1000EU/ml者方可用于制苗。

2.5 疫苗制备

2.5.1 油相制备取优质注射用白油94份，硬脂酸铝2份。在油相罐中混合均匀，加热融化至半透明状，再加司本-80 6份，至温度达到125～130℃时维持30分钟，冷却至室温备用。

2.5.2 水相制备取灭菌的吐温-80 4份，加检验合格的半成品96份，充分搅拌至吐温-80完全溶解。

2.5.3 乳化取油相3份置于高速剪切机内，开动电机低速搅拌，同时缓缓加入水相1份，再以3600r/min乳化40分钟，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液，终浓度达到0.01％。乳化后，取样10ml加入离心管，以3000r/min离心15分钟，管底析出水相应不超过0.5ml。

2.5.4 分装定量分装，密封瓶口。

3 成品检验

3.1 物理性状

外观为乳白色乳剂。

剂型为油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第1滴外，均应不扩散。

稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，经3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不超过0.5ml。

黏度按现行《中国兽药典》进行，应符合规定。

装量检查按现行《中国兽药典》进行，应符合规定。

3.2 无菌检验按现行《中国兽药典》进行，应无菌生长。

3.3 安全检验取1日龄雏鸭10只，肌肉或颈部皮下注射疫苗0.5ml/只，观察14天，应不出现由疫苗引起的局部和全身不良反应。

3.4 效力检验下列方法任择其一。

3.4.1 抗体检测将4月龄麻鸭(产蛋种)10只平均分为两组，第一组为免疫组，用制备的复合鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗进行二次免疫(第一次免疫21天后进行第二次免疫，每次每只0.5ml，皮下注射)，第二次免疫14天后测对DHAV-3的血清中和抗体效价。第二组为对照组，注射同等体积的无菌生理盐水。免疫组对DHAV-1的血清中和抗体效价应≥1:128，对DHAV-3的血清中和抗体效价应≥1:256，而对照组中和抗体效价均应为阴性。

3.4.2 攻毒保护将4月龄麻鸭(产蛋种)10只平均分为二组，每组5只。第一组为免疫组，用本发明制备的鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗进行二次免疫(第一次免疫21天后进行第二次免疫，每次每只0.5ml，皮下注射)，第二组为生理盐水对照组，注射同等体积的无菌生理盐水。第二次免疫后21-28天收集各组鸭所产的鸭蛋进行孵化，分别与雏鸭出壳后的14天各随机取10只，分别用DHAV-1强毒W株(100LD₅₀)和DHAV-3强毒VF-3株(100LD₅₀)注射攻毒，攻毒14天后统计攻毒保护率(未死亡的只数占总只数的百分率)。免疫组应至少保护8只，对照组全部死亡。

3.5 甲醛、汞类防腐剂残留量测定按现行《中国兽药典》进行，应符合规定。

实施例4 复合鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗免疫后的抗体效价

将4月龄麻鸭(产蛋种)10只平均分为两组，第一组为免疫组，用制备的鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗进行二次免疫(第一次免疫21天后进行第二次免疫，每次每只0.5ml，皮下注射)，第二次免疫14天后分别测对DHAV-1和DHAV-3的血清中和抗体效价。第二组为对照组，注射同等体积的无菌生理盐水。结果表明免疫组对DHAV-1的血清中和抗体效价≥1:128，对DHAV-3的血清中和抗体效价≥1:256，而对照组中和抗体效价均为阴性。

表1：复合鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗免疫后的抗体效价

实施例5 复合鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗免疫后的攻毒保护试验

将4月龄麻鸭(产蛋种)60只平均分为二组，每组30只。第一组为免疫组，用本发明制备的复合鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗进行二次免疫(第一次免疫21天后进行第二次免疫，每次每只0.5ml，皮下注射)，第二组为生理盐水对照组，注射同等体积的无菌生理盐水。第二次免疫后21-28天收集各组鸭所产的鸭蛋进行孵化，于雏鸭出壳后14天各随机取10只，分别用DHAV-1强毒W株(100LD₅₀)和DHAV-3强毒VF-3株(100LD₅₀)注射攻毒，攻毒14天后统计攻毒保护率(未死亡的只数占总只数的百分率)。同时设立疫苗对照组，其免疫程序按说明书进行：取生理盐水对照组鸭蛋进行孵化，取孵化后1日龄雏鸭30只皮下免疫鸭肝炎弱毒疫苗(A66株)，0.5ml/只，于免疫后14天各随机取10只，分别用DHAV-1强毒W株(100LD₅₀)和DHAV-3强毒VF-3株(100LD₅₀)注射攻毒，攻毒14天后统计攻毒保护率(未死亡的只数占总只数的百分率)。

表2：复合鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗免疫后的攻毒保护试验

结果表明制备的复合鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗对雏鸭的被动保护期在14天以上，免疫后的雏鸭在14天对DHAV-1强毒W株攻毒保护率在80％，对DHAV-3强毒VF-3株攻毒保护率在90％。而鸭肝炎弱毒疫苗株(A66株)对DHAV-1强毒W株攻毒保护率在90％以上，对DHAV-3强毒VF-3株攻毒保护率仅为30％，生理盐水对照组的攻毒保护率为0％。证明现有疫苗株不能对DHAV-3强毒株VF-3提供完全保护，而本发明的疫苗则对DHAV-1和DHAV-3毒株保护率良好。

Claims

1.一种鸭甲肝病毒结构蛋白VP1，其特征在于，所述的鸭甲肝病毒结构蛋白VP1的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

2.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1所述的鸭甲肝病毒结构蛋白VP1。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

4.权利要求1所述的鸭甲肝病毒结构蛋白VP1在制备疫苗中的应用。

5.一种鸭甲肝病毒基因工程重组亚单位疫苗，其特征在于，所述的疫苗其中的抗原为权利要求1所述的鸭甲肝病毒结构蛋白VP1。

6.如权利要求5所述的疫苗，其特征在于，所述的疫苗中鸭甲肝病毒结构蛋白VP1的浓度为0.1-1mg/ml。

7.权利要求5所述的疫苗的制备方法，其特征在于，包括有如下的步骤：

1)将权利要求2所述的基因连入表达载体中，构建成表达重组质粒；