KR102479887B1 - 항체의 정제 방법 - Google Patents

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조지 미트라
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유나이티드 세러퓨틱스 코오포레이션
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Abstract

본원의 개시는 생물학적 조성물을 포스페이트 완충 염수 (PBS)를 포함하는 조성물로 투석여과하여 정제된 조성물을 수득하는 단계를 포함하는, 생물학적 조성물의 정제 방법을 포함한다. 본원에서 개시되는 방법은 생물학적 조성물로부터 비스(2-히드록시에틸)아미노-트리스(히드록시메틸)메탄 (비스-트리스)와 같은 1종 이상의 불순물을 제거하는 데에 특히 유용할 수 있다.

Description

항체의 정제 방법{METHOD FOR PURIFYING ANTIBODIES}
[관련 출원의 상호-참조]
본 출원은 2014년 7월 25일자 U.S. 특허 가출원 제62/028,994호의 우선권을 주장하는 바, 그의 내용이 전체적으로 본원에 참조로 포함된다.
모노클로날 항체 및 기타 생물학적 물질들을 정제하기 위한 공지의 과정은 종종 원치 않는 불순물을 제거하는 것을 필요로 하는데, 치료 용도로 생물제제가 제조되는 경우에 이는 특히 중요하다. 불순물을 제거하는 한 가지 방식은 투석여과를 통하는 것이다. 투석여과에 대해서는 관련 기술분야에 알려져 있는 바, 예를 들면 모두 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Wayne P. Olson, Separations Technology: Pharmaceutical and Biotechnology Applications (Interpharm Press 1995)]; [Munir Cheryan, Ultrafiltration and Microfiltration Handbook (2d ed. CRC Press 1998)]; [Stefan Behme, Manufacturing of Pharmaceutical Proteins (Wiley-VCH 2009)]; 및 [Glyn N. Stacey, Medicines from Animal Cell Culture (John Wiley 2007)]에 기술되어 있다.
ch14.18 (본원에서는 "디누툭시맙"으로도 지칭됨)은 항-GD2 모노클로날 항체이며, 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Gillies et al., Journal of Immunological Methods 125:191-202 (1989)]에 기술되어 있다. 치료 목적으로 ch14.18 항체를 사용할 때에는, 비스(2-히드록시에틸)아미노-트리스(히드록시메틸)메탄 (비스-트리스(Bis-tris))과 같은 불순물을 제거하여 모노클로날 항체의 안전성 및 효과성을 확보하는 것이 중요하다. 따라서, 생물학적 조성물로부터 원치 않는 불순물을 제거하는 방법에 대한 필요성이 존재한다.
[발명의 개요]
본원에서 기술되는 본 발명의 많은 실시양태들이 포스페이트 완충 염수 (PBS)를 사용하여 생물학적 조성물을 투석여과함으로써 정제된 조성물을 수득하는 단계를 포함하는 생물학적 조성물의 정제 방법에 관한 것이다.
일 실시양태에서, 상기 생물학적 조성물은 적어도 1종의 단리된 단백질을 포함한다.
일 실시양태에서, 상기 단리된 단백질은 모노클로날 항체이다. 일 실시양태에서, 상기 모노클로날 항체는 ch14.18이다.
일 실시양태에서, 생물학적 조성물은 적어도 1종의 불순물을 추가적으로 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 불순물은 비스(2-히드록시에틸)아미노-트리스(히드록시메틸)메탄 (비스-트리스)이다. 일 실시양태에서, 생물학적 조성물 중 비스-트리스의 농도는 6.3 내지 6.7의 pH에서 비스-트리스 10 내지 50 mM이다.
일 실시양태에서, 상기 투석여과는 생물학적 조성물로부터 적어도 50 %의 비스-트리스를 제거한다. 일 실시양태에서, 투석여과는 생물학적 조성물로부터 적어도 70 %의 비스-트리스를 제거한다.
일 실시양태에서, 상기 PBS의 농도는 나트륨 포스페이트 10 내지 50 mM 및 NaCl 100 내지 200 mM이다.
일 실시양태에서, 모노클로날 항체는 PBS를 포함하는 조성물로 투석여과되기 전에 적어도 2.0 내지 5.0 AU의 농도로 농축된다. 일 실시양태에서, 모노클로날 항체는 PBS를 포함하는 조성물로 투석여과되기 전에 적어도 4.0 내지 6.0 AU의 농도로 농축된다.
일 실시양태에서, 상기 방법은 적어도 하나의 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 모노클로날 항체를 단리 및 정제하는 단계를 추가적으로 포함한다.
일 실시양태에서, 상기 방법은 적어도 하나의 친화성 크로마토그래피 컬럼, 적어도 하나의 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼 및/또는 적어도 하나의 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 모노클로날 항체를 단리 및 정제하는 단계를 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼은 캅토™ 부착 컬럼(Capto™ adhere column)이다. 일 실시양태에서, 모노클로날 항체는 비스-트리스를 포함하는 조성물을 사용하여 캅토™ 부착 컬럼으로부터 용리된다.
일 실시양태에서는, 적어도 3 부피 단위의 생물학적 조성물이 1 부피 단위의 PBS를 포함하는 조성물로 투석여과된다. 일 실시양태에서는, 적어도 5 부피 단위의 생물학적 조성물이 1 부피 단위의 PBS를 포함하는 조성물로 투석여과된다.
일 실시양태에서, 정제된 조성물은 히스티딘을 포함하는 조성물로 추가 투석여과된다.
추가적으로 기술되는 것은 하기를 포함하는 모노클로날 항체의 정제 방법이다:
(a) 모노클로날 항체를 포함하는 제1 조성물을 친화성 크로마토그래피 컬럼으로 통과시킴으로써, 모노클로날 항체를 포함하는 제2 조성물을 수득하는 단계; (b) 제2 조성물의 pH를 낮추어 제3 조성물을 수득하는 단계; (c) 제3 조성물을 용매-세제로 세척하여 제4 조성물을 수득하는 단계; (d) 제4 조성물을 세척하여 용매-세제를 제거함으로써, 제5 조성물을 수득하는 단계; (e) 제5 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼으로 통과시킴으로써, 모노클로날 항체를 포함하는 제6 조성물을 수득하는 단계; (f) 제6 조성물을 나노-여과에 적용하여 제7 조성물을 수득하는 단계; (g) 제7 조성물을 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼으로 통과시킴으로써, 모노클로날 항체 및 비스-트리스를 포함하는 제8 조성물을 수득하는 단계; 및 (h) 제8 조성물을 PBS를 포함하는 조성물로 투석여과함으로써, 모노클로날 항체는 포함하나 비스-트리스는 실질적으로 없는 제9 조성물을 수득하는 단계.
도 1은 PBS를 사용한 투석여과 후 ch14.18의 약한 양이온 교환 HPLC 분석을 보여준다. 선 A는 PBS를 사용하여 투석여과된 ch14.18을 나타낸다. 선 B는 HBS로 투석여과된 ch14.18을 나타내며, 모두 215 nm에서 모니터링된 것이다.
도 2는 약한 양이온 교환 HPLC 컬럼상에 적재된 25 mM 비스-트리스의 샘플을 나타내며, ~7분의 체류 시간을 가지는 피크가 비스-트리스로 인한 것임을 입증하고 있다. 약한 양이온 교환에 의한 25 mM 비스-트리스의 평가. 선 A는 215 nm에서 모니터링된 흡광도를 표시한다. 선 B는 280 nm에서 모니터링된 흡광도를 표시한다.
도 3은 새 수지 또는 사용된 수지로부터의 캅토™ 부착 용출액 모음 (eluate pool)의 약한 양이온 HPLC를 나타내는 것이며, ~7분의 피크가 선행 사용으로부터의 컬럼상의 소정 오염물이 아니라 비스-트리스에 기인한다는 것을 입증하고 있다. 새 크로마토그래피 컬럼 또는 사용된 크로마토그래피 컬럼으로부터 유래하는 ch14.18이 없는 캅토™ 부착 용출액 모음의 샘플. 선 A는 새 컬럼으로부터의 샘플에 대한 것이다. 선 B는 사용된 컬럼으로부터의 것이다.
도 4는 PBS로의 투석여과 전에 오염물이 혼합된 ch14.18의 약한 양이온 교환 HPLC 크로마토그래피를 나타낸다. 선 A는 오염물이 혼합되지 않은 ch14.18을 나타낸다. 선 B는 트리부틸 포스페이트 및 폴리소르베이트 80이 혼합된 ch14.18을 나타낸다. 선 C는 메토트렉세이트가 혼합된 ch14.18을 나타낸다. 정제 과정으로부터의 미량 첨가제 중 어느 것도 ~7분에서의 피크의 원인이 되지 않는다 (도 1 및 2).
도 5는 모노클로날 항체 (예컨대 ch14.18)를 정제하기 위한 방법 흐름도의 일 실시양태를 도시하는 개략도를 제공한다. 이와 같은 정제 과정은 국립 암 연구소 (NCI)에 의해 처음 개발되었던 것으로써 (실시예 2 참조), 이후 유나이티드 세라퓨틱스 코포레이션(United Therapeutics Corp)에 의해 개선된 것이다 (실시예 1 참조).
본원에서 기술되는 많은 실시양태들이 포스페이트 완충 염수 (PBS)를 사용하여 생물학적 조성물을 투석여과함으로써 정제된 조성물을 수득하는 단계를 포함하는 생물학적 조성물의 정제 방법에 관한 것이다.
생물학적 조성물
관련 기술분야에 알려져 있는 많은 생물학적 조성물들이 본원에서 기술되는 방법을 사용하여 정제될 수 있다. 상기 생물학적 조성물은 단백질, 핵산, 세포, 조직, 백신 및 혈액 또는 이들의 구성요소를 포함하여, 화학적으로 합성되기보다는 생물학적으로 생성되는 적어도 1종의 물질을 포함할 수 있다.
생물학적 조성물은 예를 들면 재조합 단백질을 포함하여, 적어도 1종의 단리된 단백질을 포함할 수 있다. 생물학적 조성물은 예를 들면 적어도 1종의 단리된 핵산을 포함할 수 있다. 생물학적 조성물은 예를 들면 적어도 1종의 모노클로날 항체를 포함할 수 있다. 생물학적 조성물은 예를 들면 적어도 1종의 키메라 항체, 변경된 항체 또는 인간화된 항체를 포함할 수 있다.
구체적인 일 실시양태에서, 생물학적 조성물은 적어도 1종의 ch14.18 모노클로날 항체를 포함하지만, 다른 항체 및 생물제제가 본원에서 개시되는 교시에 의해 정제될 수도 있다.
생물학적 조성물은 예를 들면 적어도 1종의 불순물을 포함할 수 있다. 상기 불순물은 예를 들면 비스-트리스와 같은 바람직하지 않은 염일 수 있다. 생물학적 조성물 중 비스-트리스 불순물의 농도는 예를 들면 1 내지 100 mM의 비스-트리스, 또는 10 내지 50 mM의 비스-트리스, 또는 20 내지 40 mM의 비스-트리스일 수 있다. pH는 예를 들면 6 내지 7, 또는 6.3 내지 6.7, 또는 6.4 내지 6.6일 수 있다.
PBS를 사용한 투석여과
일부 실시양태에서, 본원에서 기술되는 방법은 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5 또는 적어도 6 부피 단위의 생물학적 조성물을 1 부피 단위의 PBS로 투석여과하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 생물학적 조성물은 바람직하지 않은 비스-트리스를 포함하며, 본원에서 기술되는 방법은 PBS 투석여과에 의해 생물학적 조성물로부터 적어도 30 %, 적어도 50 %, 적어도 70 %, 적어도 90 % 또는 적어도 95 %의 비스-트리스를 제거하는 단계를 포함한다.
PBS의 농도는 예를 들면 10 내지 50 mM의 나트륨 포스페이트 및 100 내지 200 mM의 NaCl일 수 있다.
일부 실시양태에서는, PBS를 사용하여 투석여과되기 전에, 생물학적 조성물이 먼저 농축된다.
일부 실시양태에서는, PBS 투석여과 후, 생물학적 조성물이 20 mM의 히스티딘, 150 mM의 NaCl 및 0.05 %의 트윈(Tween) 20 염수 (HBS)를 포함하는 제제로 투석여과된다.
모노클로날 항체의 단리
본원에서 기술되는 여러 실시양태에서, 상기 방법은 또한 PBS 투석여과 전에 모노클로날 항체를 단리 및 정제하는 단계를 포함한다. 모노클로날 항체는 예를 들면 적어도 하나의 크로마토그래피 컬럼에 의해 단리 및 정제될 수 있다. 모노클로날 항체는 예를 들면 적어도 하나의 친화성 크로마토그래피 컬럼, 적어도 하나의 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼 및/또는 적어도 하나의 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 의해 단리 및 정제될 수 있다. 상기 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼은 예를 들면 캅토™ 부착 컬럼일 수 있다.
캅토™ 부착 컬럼에 대해서는 관련 기술분야에 알려져 있으며, GE 헬스케어 라이프 사이언시즈(Healthcare Life Sciences) 사로부터 시중에서 구입가능하다. 이는 충전 상 크로마토그래피에 의한 단백질 A 매체상에서의 포획 후의 모노클로날 항체의 중간 정제 및 세련(polishing)을 위한 다중모드 매체이다. 본원에서 기술되는 일부 실시양태는 캅토™ 부착 컬럼을 사용하여 모노클로날 항체를 정제하며 상기 모노클로날 항체가 비스-트리스 완충제를 포함하는 조성물을 사용하여 용리되는 단계를 포함한다. 용리된 항체 제제는 이후 상기에서 논의된 바와 같은 PBS를 포함하는 제제로 투석여과되어야 하며, 임의적으로 HBS를 포함하는 제제로 추가 투석여과된다.
본원에서 기술되는 방법은 예를 들면 수확된 모노클로날 항체를 포함하는 생물학적 조성물을 농축하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본원에서 기술되는 방법은 예를 들면 생물학적 조성물을 단백질 A 평형 완충제로 투석여과하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 특정 측면에서, 상기 단백질 A 평형 완충제는 25 내지 100 mM의 나트륨 포스페이트, 0.5 내지 2.0 M의 NaCl을 포함하며, 7.0 내지 8.0의 pH를 가진다.
본원에서 기술되는 방법은 예를 들면 생물학적 조성물을 단백질 A 친화성 컬럼과 같은 친화성 크로마토그래피 컬럼으로 통과시키는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본원에서 기술되는 방법은 예를 들면 생물학적 조성물의 pH를 낮추는 것에 의한 바이러스 불활성화 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본원에서 기술되는 방법은 예를 들면 용매-세제를 사용하여 생물학적 조성물을 세척하는 것에 의한 바이러스 불활성화 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 구체적인 측면에서, 상기 용매-세제는 10 내지 25 %의 폴리소르베이트 (트윈), 5 내지 10 %의 트리부틸 포스페이트를 포함한다.
본원에서 기술되는 방법은 예를 들면 생물학적 조성물을 세척하여 임의의 용매-세제를 제거하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본원에서 기술되는 방법은 예를 들면 생물학적 조성물을 50HS 평형 완충제로 투석여과하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 구체적인 측면에서, 상기 50HS 평형 완충제는 5 내지 20 mM의 시트레이트, 5 내지 30 mM의 포스페이트, 15 내지 100 mM의 나트륨 클로라이드를 포함하며, 4.0 내지 5.5의 pH를 가진다.
본원에서 기술되는 방법은 예를 들면 생물학적 조성물을 50HS 컬럼과 같은 양이온 교환 친화성 크로마토그래피 컬럼으로 통과시키는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본원에서 기술되는 방법은 예를 들면 생물학적 조성물을 나노-여과에 적용하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본원에서 기술되는 방법은 예를 들면 PBS 투석여과 전에 생물학적 조성물을 캅토™ 부착 컬럼과 같은 음이온 교환 친화성 크로마토그래피 컬럼으로 통과시키는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 모노클로날 항체는 비스-트리스 완충제를 사용하여 캅토™ 부착 컬럼으로부터 용리될 수 있다.
본원에서 기술되는 방법은 예를 들면 PBS 투석여과 후 생물학적 조성물을 히스티딘 완충제로 투석여과하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 본원에서 기술되는 방법은 하기의 단계들을 포함한다:
(a) 모노클로날 항체를 포함하는 제1 조성물을 친화성 크로마토그래피 컬럼으로 통과시킴으로써, 모노클로날 항체를 포함하는 제2 조성물을 수득하는 단계;
(b) 제2 조성물의 pH를 낮추어 제3 조성물을 수득하는 단계;
(c) 제3 조성물을 용매-세제로 세척하여 제4 조성물을 수득하는 단계;
(d) 제4 조성물을 세척하여 용매-세제를 제거함으로써, 제5 조성물을 수득하는 단계;
(e) 제5 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼으로 통과시킴으로써, 모노클로날 항체를 포함하는 제6 조성물을 수득하는 단계;
(f) 제6 조성물을 나노-여과에 적용하여 제7 조성물을 수득하는 단계;
(g) 제7 조성물을 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼으로 통과시킴으로써, 모노클로날 항체 및 비스-트리스를 포함하는 제8 조성물을 수득하는 단계; 및
(h) 제8 조성물을 PBS를 포함하는 조성물로 투석여과함으로써, 모노클로날 항체는 포함하나 비스-트리스는 실질적으로 없는 제9 조성물을 수득하는 단계.
[ 실시예 ]
작용 실시예
실시예 1 - 약한 양이온 교환 HPLC 검정법의 개발
ch14.18 정제 방법의 개발에 있어서, 목적은 국립 암 연구소(National Cancer Institute) (NCI)에 의해 처음에 개발되었던 정제 방법 (NCI에 의해 처음에 개발되었던 방법에 대해서는 도 5 참조)을 개선하는 것이었다. 추가적인 목적은 더 우수한 능력을 가지거나, 더 우수한 유동 특성을 가지거나, 또는 다음 사용 전에 수지를 정화하는 데에 유용할 수 있는 더 독한 화학물질에 대하여 허용성인 크로마토그래피 수지 (예컨대 GE 헬스케어 사의 캅토™ 부착 수지)로 업그레이드하는 것이었다.
최종 2회 크로마토그래피 단계 (도 5의 항목 18 및 19 참조)의 경우, NCI는 ch14.18의 응집물 및 이량체를 제거하기 위한 슈퍼덱스(Superdex) 200 크기-배제 크로마토그래피 컬럼에 이어지는 세련 수지로서의 Q 세파로스(Sepharose) 음이온 교환 수지를 사용하였다. 이를 바이러스, 응집물 및 미량 오염물을 제거하는 수지 - GE 헬스케어 사의 캅토™ 부착 수지 (예컨대 그 전체가 본원에 참조로 포함되며 https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1334667780708/litdoc28906405_20120420104439.pdf에서 입수가능한 GE 헬스케어 라이프 사이언시즈 사, 지침 28-9064-05 캅토™ 부착 친화성 크로마토그래피 제품 매뉴얼 참조) -로 업그레이드하였다. 상기 수지는 혼합 모드 수지이며, 음이온 교환과 소수성 상호작용의 조합이다. 이를 오염물은 수지에 결합하지만 ch14.18 모노클로날 항체는 결합하지 않고 유통 유지되는 유통 모드(flow through mode)로 작동시켰다.
ch14.18의 정제를 변경하는 동시에, 품질 표시 검정법들도 개발하였다. 그들 중 하나가 약한 양이온 교환 크로마토그래피 HPLC 검정법이었다. 여기에는, 토소(TOSOH) 사의 TSKGEL CM-3SW 컬럼을 사용하여 ch14.18의 순도를 평가하였다. 이 분석에서, 항체는 컬럼에 결합되었다가 염 구배가 컬럼을 통해 전개되면 컬럼으로부터 용리되었다. 낮은 염 나트륨 포스페이트 완충제 (완충제 A)에서 컬럼을 평형화한 후, 나트륨 포스페이트/나트륨 퍼클로레이트 완충제 (완충제 B)의 농도를 증가시킴으로써 구배를 생성시켰다. 이 분리 방법을 사용하여 215 nm에서 컬럼 유출물이 모니터링되었고, ch14.18 피크는 대략 주입 후 15-19분에 컬럼으로부터 용리되었다. 방법 및 구배가 최적화되면서, ch14.18의 상기 체류 시간은 변화되었다. 상기 검정법의 개발 동안, 다양한 ch14.18 샘플을 시험하였는데, 그들 중 일부에서, ~7.5분의 체류 시간을 가지는 상당히 큰 피크가 관찰되었다. 이 오염물을 확인하기 위한 시도로, ch14.18의 샘플을 제조 과정의 초기에 첨가되는 오염물과 혼합하였다 (도 1 참조). 오염물을 함유하지 않는 ch14.18의 샘플에 메토트렉세이트 또는 트리부틸 포스페이트 및 폴리소르베이트 80을 혼합하였다. 이들 오염물들 중 어느 것도 7.5분의 체류 시간을 갖는 피크의 공급원인 것으로 나타나지 않았다.
샘플의 공급원을 추적하는 것, 그리고 정제 과정의 어느 단계에서 샘플이 유래하는지를 통하여, 문제의 피크가 정제 과정의 최종 세련 단계인 캅토™ 부착 크로마토그래피 후에야만 나타났다는 것이 알려졌다. 오염물은 공동-정제되며 컬럼에서 농축되는 세포 배양 과정 유래의 숙주 세포 단백질과 같은 소정의 미량 오염물인 것으로 의심되었다. 사용된 컬럼 또는 새 컬럼에 적재된 캅토™ 부착 컬럼에서의 모의 전개로부터의 샘플을 약한 양이온 교환 크로마토그래피 HPLC에 의해 평가하였다 (도 2 참조). 7.5분에서의 오염물 피크가 양 샘플에서 대략 동일한 농도로 발견되었고, 이는 오염물이 상류 오염물로부터 유래하는 것은 아님을 나타낸다.
샘플을 함유한 ch14.18의 샘플 및 함유하지 않은 샘플의 기원을 추적함으로써, 오염물이 캅토™ 부착 정제 단계에 사용되었던 완충제 염인 비스-트리스라는 것이 분명해졌다 (도 3 참조).
오염물을 확인하였기 때문에, 다음에 전체 정제 과정을 통과한 정제된 ch14.18 샘플 중 일부는 비스-트리스 피크를 포함한 반면 다른 것은 포함하지 않았던 이유를 조사하였다. 또한 NCI에 의해 사용된 포스페이트 완충 염수 (PBS) 중 제제로부터 전환된 20 mM 히스티딘, 150 mM NaCl, 0.05 % 트윈 20 염수 (HBS) 중 최종 항체 제제를 개발하였다. ch14.18을 함유하는 캅토™ 부착 생성물 모음(product pool)을 직접 HBS 완충제로 투석여과하는 경우, 비스-트리스 피크가 투석잔류물 모음(retentate pool)로부터 투석여과하지 않는다는 것이 주목되었다. 그러나, 이 모음을 먼저 포스페이트 완충 염수로 투석여과한 다음 HBS 완충제로 투석여과하는 경우, 비스-트리스가 용액으로부터 완전히 제거되었다. 도 4는 HBS로 투석여과되거나 PBS를 사용하여 투석여과된 캅토™ 부착 크로마토그래피 단계로부터의 ch14.18을 나타낸다.
결론적으로, 캅토™ 부착 컬럼은 생물공학 산업에서 모노클로날 항체의 정제에 통상적으로 사용되고 있다. 이는 잔류 단백질 A 리간드, 잔류 숙주 세포 DNA, 잔류 숙주 세포 단백질, 항체 응집물 및 바이러스와 같은 미량 오염물의 제거에 효용을 갖는다. PBS를 사용한 투석여과가 ch14.18과 같은 모노클로날 항체의 최종 제제화에 앞서 비스-트리스 불순물을 제거하기 위한 효과적인 방식인 것으로 입증되었다.
실시예 2 - 방법 흐름도
모노클로날 항체 (예컨대 ch14.18)를 정제하기 위한 일 실시양태를 도시하는 방법 흐름도가 도 5에 제공된다. 도시된 방법이 엄격하게 제한됨을 의미하는 것은 아니어서, 구체적인 필요사항 및 당면 공정 상황에 따라 조정될 수 있다. 도 5의 방법은 일반적으로 하기의 단계들을 나타내는 것이다:
항목 8. 모노클로날 항체 수확물 (예컨대 조 수확물)의 개시 모음 및 여과.
항목 9. 항목 8의 수확물을 친화성 크로마토그래피 컬럼 (예컨대 단백질 A 크로마토그래피 컬럼)으로 통과시킴으로써, 모노클로날 항체를 포함하는 제2 조성물을 수득함.
항목 10. 제2 조성물의 pH를 낮추어 바이러스를 불활성화함으로써 제3 조성물을 수득함. 다음에, 제3 조성물을 용매-세제로 세척하여 제4 조성물을 수득한 다음, 그것을 다시 세척하여 용매-세제를 제거함으로써 제5 조성물을 수득함.
항목 11. 제5 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼 (예컨대 SP 세파로스 FF 크로마토그래피)으로 통과시킴으로써, 모노클로날 항체를 포함하는 제6 조성물을 수득함. 단백질 A 크로마토그래피를 반복한 후 (항목 12), 이어서 바이러스 불활성화를 반복하고 (항목 13), 이어서 양이온 교환 크로마토그래피 (예컨대 세파로스)를 반복할 수 있음 (항목 14). 다음에, 세파로스 전개를 모음하여 제6 조성물을 형성시킴.
항목 16. 제6 조성물을 나노-여과에 적용하여 바이러스를 추가적으로 제거함으로써 제7 조성물을 수득함.
항목 17, 18, 19. 제7 조성물을 수퍼덱스 200 크기-배제 크로마토그래피 컬럼으로 통과시켜 모노클로날 항체를 농축함으로써, 모노클로날 항체의 응집물 및 이량체를 제거함. 다음에, 조성물을 Q 세파로스 음이온 교환 수지로 통과시킴으로써, 모노클로날 항체를 포함하는 제8 조성물을 수득함.
항목 20. 농축 및 최종 여과. 다음에, 제8 조성물을 PBS를 포함하는 조성물로의 투석여과를 포함한 농축 및 최종 여과에 적용함으로써, 모노클로날 항체를 포함하는 제9 조성물을 수득함.
추가 실시양태
실시양태 1 - 포스페이트 완충 염수 (PBS)를 사용하여 생물학적 조성물을 투석여과함으로써 정제된 조성물을 수득하는 단계를 포함하는, 생물학적 조성물의 정제 방법.
실시양태 2 - 생물학적 조성물이 적어도 1종의 단리된 단백질을 포함하는, 실시양태 1의 방법.
실시양태 3 - 생물학적 조성물이 ch14.18과 같은 적어도 1종의 단리된 모노클로날 항체를 포함하는, 실시양태 1 내지 2 중 어느 것의 방법.
실시양태 4 - 생물학적 조성물이 비스(2-히드록시에틸)아미노-트리스(히드록시메틸)메탄 (비스-트리스)과 같은 적어도 1종의 불순물을 추가적으로 포함하는, 실시양태 1 내지 3 중 어느 것의 방법.
실시양태 5 - 생물학적 조성물이 6.3 내지 6.7의 pH에서 비스-트리스 10 내지 50 mM의 농도로 비스-트리스를 추가 포함하는, 실시양태 1 내지 4 중 어느 것의 방법.
실시양태 6 - 투석여과가 생물학적 조성물로부터 적어도 50 %, 적어도 70 % 또는 적어도 90 %의 비스-트리스를 제거하는, 실시양태 1 내지 5 중 어느 것의 방법.
실시양태 7 - PBS의 농도가 10 내지 50 mM의 나트륨 포스페이트 및 100 내지 200 mM의 NaCl인, 실시양태 1 내지 6 중 어느 것의 방법.
실시양태 8 - 모노클로날 항체가 PBS를 포함하는 조성물로 투석여과되기 전에 적어도 2.0 내지 5.0 AU의 농도로 농축되는, 실시양태 1 내지 7 중 어느 것의 방법.
실시양태 9 - 적어도 하나의 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 모노클로날 항체를 단리 및 정제하는 단계를 포함하는, 실시양태 1 내지 8 중 어느 것의 방법.
실시양태 10 - 적어도 하나의 친화성 크로마토그래피 컬럼, 적어도 하나의 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼 및/또는 적어도 하나의 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼 예컨대 캅토™ 부착 컬럼을 사용하여 모노클로날 항체를 단리 및 정제하는 단계를 포함하는, 실시양태 1 내지 9 중 어느 것의 방법.
실시양태 11 - 모노클로날 항체가 PBS를 사용하여 투석여과되기 전에 비스-트리스를 포함하는 조성물을 사용하여 캅토™ 부착 컬럼으로부터 용리되는, 실시양태 1 내지 10 중 어느 것의 방법.
실시양태 12 - 적어도 3 부피 단위, 적어도 4 부피 단위, 적어도 5 부피 단위 또는 적어도 6 부피 단위의 생물학적 조성물이 1 부피 단위의 PBS를 포함하는 조성물로 투석여과되는, 실시양태 1 내지 11 중 어느 것의 방법.
실시양태 13 - 정제된 조성물이 히스티딘을 포함하는 조성물로 추가 투석여과되는, 실시양태 1 내지 12 중 어느 것의 방법.
실시양태 14 - 하기를 포함하는, 모노클로날 항체의 정제 방법: (a) 모노클로날 항체를 포함하는 제1 조성물을 친화성 크로마토그래피 컬럼으로 통과시킴으로써, 모노클로날 항체를 포함하는 제2 조성물을 수득하는 단계; (b) 제2 조성물의 pH를 낮추어 제3 조성물을 수득하는 단계; (c) 제3 조성물을 용매-세제로 세척하여 제4 조성물을 수득하는 단계; (d) 제4 조성물을 세척하여 용매-세제를 제거함으로써, 제5 조성물을 수득하는 단계; (e) 제5 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼으로 통과시킴으로써, 모노클로날 항체를 포함하는 제6 조성물을 수득하는 단계; (f) 제6 조성물을 나노-여과에 적용하여 제7 조성물을 수득하는 단계; (g) 제7 조성물을 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼으로 통과시킴으로써, 모노클로날 항체 및 비스-트리스를 포함하는 제8 조성물을 수득하는 단계; 및 (h) 제8 조성물을 PBS를 포함하는 조성물로 투석여과함으로써, 모노클로날 항체는 포함하나 비스-트리스는 실질적으로 없는 제9 조성물을 수득하는 단계.

Claims (38)

  1. 포스페이트 완충 염수 (PBS)를 사용하여 생물학적 조성물을 투석여과함으로써 정제된 조성물을 수득하는 단계를 포함하는 생물학적 조성물의 정제 방법이며, 상기 생물학적 조성물은 적어도 1종의 불순물을 포함하며, 상기 불순물은 비스(2-히드록시에틸)아미노-트리스(히드록시메틸)메탄 (비스-트리스)이며, 상기 생물학적 조성물은 Ch14.18 모노클로날 항체를 포함하는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 생물학적 조성물 중 비스-트리스의 농도가 6.3 내지 6.7의 pH에서 비스-트리스 10 내지 50 mM인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 투석여과가 생물학적 조성물로부터 적어도 50 %의 비스-트리스를 제거하는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 투석여과가 생물학적 조성물로부터 적어도 70 %의 비스-트리스를 제거하는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, PBS의 농도가 나트륨 포스페이트 10 내지 50 mM 및 NaCl 100 내지 200 mM인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 모노클로날 항체가 PBS를 포함하는 조성물로 투석여과되기 전에 적어도 2.0 내지 5.0 AU의 농도로 농축되는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 모노클로날 항체가 PBS를 포함하는 조성물로 투석여과되기 전에 적어도 4.0 내지 6.0 AU의 농도로 농축되는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 모노클로날 항체를 단리 및 정제하는 단계를 추가적으로 포함하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 적어도 하나의 친화성 크로마토그래피 컬럼, 적어도 하나의 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼 및/또는 적어도 하나의 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 모노클로날 항체를 단리 및 정제하는 단계를 포함하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼이 다중모드 매체 컬럼인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 모노클로날 항체가 비스-트리스를 포함하는 조성물을 사용하여 다중모드 매체 컬럼으로부터 용리되는 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 적어도 3 부피 단위의 생물학적 조성물이 1 부피 단위의 PBS를 포함하는 조성물로 투석여과되는 것인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 적어도 5 부피 단위의 생물학적 조성물이 1 부피 단위의 PBS를 포함하는 조성물로 투석여과되는 것인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 정제된 조성물이 히스티딘을 포함하는 조성물로 추가 투석여과되는 것인 방법.
  15. (a) 모노클로날 항체를 포함하는 제1 조성물을 친화성 크로마토그래피 컬럼으로 통과시킴으로써, 모노클로날 항체를 포함하는 제2 조성물을 수득하는 단계;
    (b) 제2 조성물의 pH를 낮추어 제3 조성물을 수득하는 단계;
    (c) 제3 조성물을 용매-세제로 세척하여 제4 조성물을 수득하는 단계;
    (d) 제4 조성물을 세척하여 용매-세제를 제거함으로써, 제5 조성물을 수득하는 단계;
    (e) 제5 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼으로 통과시킴으로써, 모노클로날 항체를 포함하는 제6 조성물을 수득하는 단계;
    (f) 제6 조성물을 나노-여과에 적용하여 제7 조성물을 수득하는 단계;
    (g) 제7 조성물을 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼으로 통과시킴으로써, 모노클로날 항체 및 비스-트리스를 포함하는 제8 조성물을 수득하는 단계; 및
    (h) 제8 조성물을 PBS를 포함하는 조성물로 투석여과함으로써, 모노클로날 항체는 포함하나 비스-트리스는 실질적으로 없는 제9 조성물을 수득하는 단계
    를 포함하는 모노클로날 항체의 정제 방법.
  16. 포스페이트 완충 염수 (PBS)를 사용하여 생물학적 조성물을 투석여과함으로써 생물학적 조성물로부터 적어도 50 %의 비스-트리스를 제거하는 단계를 포함하며, 상기 생물학적 조성물은 ch14.18 모노클로날 항체를 포함하는 것인, 생물학적 조성물로부터의 비스(2-히드록시에틸)아미노-트리스(히드록시메틸)메탄 (비스-트리스)의 제거 방법.
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