CN102558382B - 一种b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的纯化方法 - Google Patents

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本发明公开了一种b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的纯化方法，本方法使用羟基磷灰石进行Hib荚膜多糖的纯化，过程如下：将Hib荚膜多糖粗糖溶解于20mM磷酸盐缓冲液，将得到的Hib荚膜多糖粗糖溶液上样于羟基磷灰石层析柱；使用20mM磷酸盐缓冲液洗2个柱体积，收集流穿峰；用高盐缓冲液洗脱结合的蛋白质，将收集的流穿峰用G-25葡萄糖凝胶柱进行缓冲液置换，最终得到Hib荚膜多糖精糖原液。本发明的优点在于采用羟基磷灰石进行荚膜多糖的纯化，避免了使用苯酚对环境和人体带来的危害，并且得到的Hib荚膜多糖纯度可达到行业标准。

Description

一种b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的纯化方法
技术领域
本发明涉及疫苗领域，具体涉及一种b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的纯化方法。
背景技术
在Hib疫苗制备的过程中，荚膜多糖的制备是关键的步骤。在我国多采用和流行性脑膜炎球菌以及伤寒Vi多糖提取相似的工艺来提取荚膜多糖。此工艺采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)与酸性多糖形成季胺络合物从而沉淀多糖。但是CTAB对核酸、蛋白质也有不同程度的沉淀作用，因此要获得纯度较高的荚膜多糖，必须进一步去除沉淀的核酸和蛋白质。常规的去除蛋白质的方法是用苯酚抽提去除蛋白质。但是该工艺的缺点是会产生大量的废弃苯酚，苯酚是一种强腐蚀性的高毒性物质，对环境有严重危害，对水体和大气可造成污染。苯酚对皮肤、粘膜有强烈的腐蚀作用，可抑制中枢神经或损害肝、肾功能。人吸入高浓度苯酚气体可致头痛、头晕、乏力、视物模糊、肺水肿等。因此，对去除蛋白质的工艺进行改进是有实际意义的。
羟基磷灰石是磷酸钙的一种形式，具有独特的选择性和分辨率，经常能够分离一些其他技术无法区分的生物分子。羟基磷灰石填料广泛用于核酸、蛋白、病毒以及其他大分子的分离纯化。当前还没有将羟基磷灰石用于b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的纯化的工艺。
发明内容
本发明的目的即在于克服现有技术的不足，提供一种b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的纯化方法，该方法不使用苯酚来进行荚膜多糖的纯化，减轻了对环境的危害和对人体的损害，并且得到的Hib荚膜多糖纯度可达到行业标准。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的纯化方法，包括以下步骤：
A.装填一根羟基磷灰石层析柱，用20mM磷酸盐缓冲液平衡2个柱体积直至基线平稳；
B.将b型流感嗜血杆菌(Hib)荚膜多糖粗糖溶解于20mM磷酸盐缓冲液，将得到的Hib荚膜多糖粗糖溶液上样于层析柱上；
C.使用20mM磷酸盐缓冲液洗2个柱体积，收集流穿峰；
D.用高盐缓冲液洗脱结合在层析柱上的蛋白质，再生层析柱；
E.将收集的流穿峰用G-25葡萄糖凝胶柱进行缓冲液置换，流动相为无热原的注射用水，收集含Hib荚膜多糖的洗脱峰，最终得到Hib荚膜多糖精糖原液。
在上述步骤中，Hib荚膜多糖粗糖是通过对Hib样本进行处理得到的沉淀物。
在上述步骤中，20mM磷酸盐缓冲液的pH值为6.9。
在步骤B中，将50～150mgHib荚膜多糖粗糖溶解于50ml 20mM磷酸盐缓冲液。
在步骤D中，高盐缓冲液为pH值为6.9，由20mM磷酸盐缓冲液和0.2M氯化钠组成的液体。
本发明的优点在于，采用羟基磷灰石进行荚膜多糖的纯化，避免了使用苯酚对环境和人体带来的危害，并且得到的Hib荚膜多糖纯度可达到行业标准。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，本发明的保护范围不限于以下所述。
一种b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的纯化方法，包括以下步骤：
A.装填一根羟基磷灰石层析柱，用20mM磷酸盐缓冲液平衡2个柱体积直至基线平稳；
B.将b型流感嗜血杆菌(Hib)荚膜多糖粗糖溶解于20mM磷酸盐缓冲液，将得到的Hib荚膜多糖粗糖溶液上样于层析柱上；
C.使用20mM磷酸盐缓冲液洗2个柱体积，收集流穿峰；
D.用高盐缓冲液洗脱结合在层析柱上的蛋白质，再生层析柱；
E.将收集的流穿峰用G-25葡萄糖凝胶柱进行缓冲液置换，流动相为无热原的注射用水，收集含Hib荚膜多糖的洗脱峰，最终得到Hib荚膜多糖精糖原液。
在上述步骤中，Hib荚膜多糖粗糖是通过对Hib样本进行处理得到的沉淀物。
在上述步骤中，20mM磷酸盐缓冲液的pH值为6.9。
在步骤B中，将50～150mgHib荚膜多糖粗糖溶解于50ml 20mM磷酸盐缓冲液。
在步骤D中，高盐缓冲液为pH值为6.9，由20mM磷酸盐缓冲液和0.2M氯化钠组成的液体。
Hib荚膜多糖粗糖制取方法如下：
参照文献公开的方法(Anderson，1977.INFCTION AND IMMUNITY.Vol 15.No.2，P472～477)进行Hib的培养。培养基采用CY培养基，1升培养基含10g酸水解酪蛋白，5g酵母提取物，5g葡萄糖，1mg氯化血红素，1mg辅酶I，0.1M PB，培养基的pH值为7.6。培养温度为37℃，振荡速度为220rpm，待菌种浓度OD660为0.5后接种至发酵罐继续培养，维持培养温度37℃，搅拌速度150rpm，培养8～10h后加入浓度为0.5％(v/v)的甲醛杀菌，收获时菌液浓度OD660＞4.0。
杀菌后的培养液采用10000rpm离心30min沉淀菌体，收集上清液。将CTAB加入上清液中，CTAB与上清液的重量体积比(w/v)为1∶1000，室温搅拌1h，得到的混合液10000rpm离心30min后收集CTAB与Hib荚膜多糖的复合物沉淀。沉淀用0.5～1M氯化钠溶液溶解，室温搅拌2小时，使Hib荚膜多糖与CTAB解离。加入4℃预冷的无水乙醇至乙醇终浓度为25％(v/v)，4℃搅拌过夜。10000rpm离心30min，收集上清液，上清液中继续加入无水乙醇至乙醇终浓度为75％(v/v)，4℃搅拌过夜，10000rpm离心30min，收集沉淀。沉淀用无水乙醇和丙酮各洗涤两次，最终得到的沉淀即为Hib荚膜多糖粗糖。
实施例一：
预先装填一根羟基磷灰石层析柱(5cm×20cm)，用20mM PB缓冲液(pH6.9)平衡柱子2个柱体积直至OD206nm基线平稳。然后将50mg Hib荚膜多糖粗糖溶解于50ml 20mM PB缓冲液(pH6.9)，上样于层析柱上。上样完成后先用缓冲液A(20mM PB缓冲液，pH6.9)洗2个柱体积，收集流穿峰。然后用缓冲液B(20mM PB缓冲液，0.2M氯化钠，pH6.9)洗脱结合在层析柱上的的蛋白质，再生层析柱。
预先装填一根G-25葡萄糖凝胶柱(5cm×20cm)，用无热原的注射用水平衡层析柱直至OD206nm基线平稳。然后将收集的流穿峰上样于G-25葡萄糖凝胶柱上。用无热原的注射用水作为流动相洗脱，收集含Hib荚膜多糖的洗脱峰，最终得到Hib荚膜多糖精糖原液，并取样检测。
各项检定指标如下：
Figure BDA0000136604980000031
实施例二：
预先装填一根羟基磷灰石层析柱(5cm×20cm)，用20mM PB缓冲液(pH6.9)平衡柱子2个柱体积直至OD206nm基线平稳。然后将100mg Hib荚膜多糖粗糖溶解于50ml 20mM PB缓冲液(pH6.9)，上样于层析柱上。上样完成后先用缓冲液A(20mM PB缓冲液，pH6.9)洗2个柱体积，收集流穿峰。然后用缓冲液B(20mM PB缓冲液，0.2M氯化钠，pH6.9)洗脱结合在层析柱上的的蛋白质，再生层析柱。
预先装填一根G-25葡萄糖凝胶柱(5cm×20cm)，用无热原的注射用水平衡层析柱直至OD206nm基线平稳。然后将收集的流穿峰上样于G-25葡萄糖凝胶柱上。用无热原的注射用水作为流动相洗脱，收集含Hib荚膜多糖的洗脱峰，最终得到Hib荚膜多糖精糖原液，并取样检测。
各项检定指标如下：
Figure BDA0000136604980000041
实施例三：
预先装填一根羟基磷灰石层析柱(5cm×20cm)，用20mM PB缓冲液(pH6.9)平衡柱子2个柱体积直至OD206nm基线平稳。然后将100mg Hib荚膜多糖粗糖溶解于50ml 20mM PB缓冲液(pH6.9)，上样于层析柱上。上样完成后先用缓冲液A(20mM PB缓冲液，pH6.9)洗2个柱体积，收集流穿峰。然后用缓冲液B(20mM PB缓冲液，0.2M氯化钠，pH6.9)洗脱结合在层析柱上的的蛋白质，再生层析柱。
预先装填一根G-25葡萄糖凝胶柱(5cm×20cm)，用无热原的注射用水平衡层析柱直至OD206nm基线平稳。然后将收集的流穿峰上样于G-25葡萄糖凝胶柱上。用无热原的注射用水作为流动相洗脱，收集含Hib荚膜多糖的洗脱峰，最终得到Hib荚膜多糖精糖原液，并取样检测。
各项检定指标如下：
通过本发明制备的Hib荚膜多糖各项检定指标与行业标准的比较：
Figure BDA0000136604980000043
从上表中可以看出，本发明制备的Hib荚膜多糖的蛋白含量、核酸含量、核糖含量、磷含量和内毒素含量均达到行业标准，且制备过程中完全不使用苯酚，杜绝了因使用苯酚对环境和人体带来的危害。

Claims (1)

1.一种b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
A．装填一根羟基磷灰石层析柱，用pH6.9、20mM磷酸盐缓冲液平衡2个柱体积直至基线平稳；
B．对b型流感嗜血杆菌Hib样本进行处理得到的沉淀物为Hib荚膜多糖粗糖，将50～150mg Hib荚膜多糖粗糖溶解于50ml、pH6.9、20mM 磷酸盐缓冲液，将得到的Hib荚膜多糖粗糖溶液上样于层析柱上；
C．使用pH6.9、20mM磷酸盐缓冲液洗2个柱体积，收集流穿峰；
D．用pH值为6.9、由20mM磷酸盐缓冲液和0.2M氯化钠组成的高盐缓冲液洗脱结合在层析柱上的蛋白质，再生层析柱；
E．将收集的流穿峰用G-25葡萄糖凝胶柱进行缓冲液置换，流动相为无热原的注射用水，收集含Hib荚膜多糖的洗脱峰，最终得到Hib荚膜多糖精糖原液。
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