JP7506605B6 - 肺炎球菌莢膜多糖類担体タンパク質複合体の製造方法 - Google Patents
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発明の背景
(1)発明の分野
本発明は、特定の肺炎球菌血清型の1つ以上の活性化肺炎球菌多糖類および担体タンパク質が別々に凍結乾燥され、この別々に凍結乾燥された多糖類および担体タンパク質が別々に有機溶媒中で再構成され、次いで、再構成された多糖類および担体タンパク質がTee-混合によって一緒に組み合わされ、結合されて、多糖類担体タンパク質複合体を産生する、肺炎球菌嚢多糖類タンパク質複合体を産生するための方法に関する。それぞれ特定の血清型の多糖類を含む複数の複合体を用いて、ワクチンに使用するための複合体の組合せを有する多価肺炎球菌免疫原性組成物を製造することができる。
(1)発明の分野
本発明は、特定の肺炎球菌血清型の1つ以上の活性化肺炎球菌多糖類および担体タンパク質が別々に凍結乾燥され、この別々に凍結乾燥された多糖類および担体タンパク質が別々に有機溶媒中で再構成され、次いで、再構成された多糖類および担体タンパク質がTee-混合によって一緒に組み合わされ、結合されて、多糖類担体タンパク質複合体を産生する、肺炎球菌嚢多糖類タンパク質複合体を産生するための方法に関する。それぞれ特定の血清型の多糖類を含む複数の複合体を用いて、ワクチンに使用するための複合体の組合せを有する多価肺炎球菌免疫原性組成物を製造することができる。
(2)関連技術の説明
莢膜をもつ細菌の一例である肺炎球菌は、世界中で深刻な病気の重大な原因となっている。米国疾病対策センター(CDC)は1997年、米国で毎年、肺炎球菌性髄膜炎3000例、肺炎球菌性菌血症50,000例、肺炎球菌性中耳炎7,000,000例、肺炎球菌性肺炎500,000例があると推定している。Centers for Disease Control and Prevention, MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1997, 46(RR-8): 1-13を参照のこと。さらに、これらの疾患の合併症は、最大8%の死亡率および25%の肺炎球菌性髄膜炎を伴う神経学的後遺症を報告している一部の研究では重大となりうる。Arditi et al., 1998, Pediatrics 102:1087-97参照。
莢膜をもつ細菌の一例である肺炎球菌は、世界中で深刻な病気の重大な原因となっている。米国疾病対策センター(CDC)は1997年、米国で毎年、肺炎球菌性髄膜炎3000例、肺炎球菌性菌血症50,000例、肺炎球菌性中耳炎7,000,000例、肺炎球菌性肺炎500,000例があると推定している。Centers for Disease Control and Prevention, MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1997, 46(RR-8): 1-13を参照のこと。さらに、これらの疾患の合併症は、最大8%の死亡率および25%の肺炎球菌性髄膜炎を伴う神経学的後遺症を報告している一部の研究では重大となりうる。Arditi et al., 1998, Pediatrics 102:1087-97参照。
長年認可されてきた多価肺炎球菌多糖類体ワクチンは、成人、特に高齢者やハイリスク者の肺炎球菌疾患の予防に非常に重要であることが証明されている。しかしながら、乳児および幼児は非複合型肺炎球菌多糖類体に対する反応が不良である。細菌の多糖類はT細胞非依存性の免疫原であり、乳児では弱い誘発反応しか誘発しないか、または反応を誘発しない。細菌の多糖類免疫原を担体タンパク質に化学的に結合させると、幼児において免疫応答がT細胞依存性免疫応答に変換される。ジフテリアトキソイド(DTx、DTの化学的無毒化体)およびCRM197は、そのアミノ酸配列にT細胞刺激エピトープが存在するため、細菌多糖類免疫原の担体タンパク質として記載されている。
したがって、担体タンパク質に結合した細菌莢膜の15の多糖類を含む多糖類-タンパク質複合体ワクチンが開発され、さらなるものが開発中である。開発された結合型ワクチンの例としては、インフルエンザ菌b型(Hib)結合型ワクチン(例:HIBTITER(登録商標))ならびに肺炎球菌に対する結合型ワクチン(PREVNAR(登録商標)やPREVNAR 13(登録商標)など)や髄膜炎菌に対する結合型ワクチン(例:MENJUGATE(登録商標))が挙げられる。
多糖類抗原を担体タンパク質に結合させ、反応混合物を精製して、結合したタンパク質をもたない遊離の多糖類、結合した多糖類抗原をもたない遊離の担体タンパク質、および低分子量の多糖類タンパク質複合体を除去することができる。遊離多糖類、遊離タンパク質、および低分子量複合体の精製のための種々の方法が、当技術分野において公知であり、例えば、疎水性クロマトグラフィー、接線限外濾過、ダイアフィルトレーションなどが含まれる。例えば、国際特許出願公開WO00/38711号、米国特許第6,146,902号、およびLei et al.、2000、Dev. Biol. 103:259-264を参照のこと。遊離多糖類の量を減少させる方法には、さらに、米国特許第7,709,001号および米国特許出願公開第20110201791号に開示されているような担体タンパク質および多糖類の共凍結乾燥が含まれ、これら文献は、担体タンパク質と多糖類の共凍結乾燥が、特に莢膜多糖類19Aに関して、担体タンパク質と多糖類の別個の凍結乾燥よりも好ましいことも示している。しかし、共凍結乾燥によって、個々の製剤やサイクルパラメータを、より少ない手順で最適化することが妨げられ、また、所望の溶液サイズで担体タンパク質や多糖類血清型供給物を産生することも妨げられる。
Centers for Disease Control and Prevention, MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1997, 46(RR-8): 1-13
Arditi et al., 1998, Pediatrics 102:1087-97
Lei et al.、2000、Dev. Biol. 103:259-264
したがって、遊離多糖類および低分子量複合体などの不純物を含まない安定な多糖類タンパク質複合体を産生する改良された方法が引き続き必要とされている。
発明の概要
本発明は、肺炎球菌ワクチンとして使用するための多価肺炎球菌多糖類タンパク質複合体を産生するための工程を提供し、当該工程において、様々な昇華工程を用いた肺炎球菌多糖類および担体タンパク質の個別の凍結乾燥が調製され、次いで、結合工程において使用され、肺炎球菌ワクチンに使用するための多価肺炎球菌多糖類タンパク質複合体が産生される。個別の乾燥の工程は、多糖類および担体タンパク質の共凍結乾燥を上回る様々な利点を提供し、これには、個々の製剤およびサイクルパラメータを最適化する能力、便利な取り扱い、および所望の溶液サイズを有する個々の多糖類および担体タンパク質調製物を産生する能力が含まれるが、これらに限定されない。
本発明は、肺炎球菌ワクチンとして使用するための多価肺炎球菌多糖類タンパク質複合体を産生するための工程を提供し、当該工程において、様々な昇華工程を用いた肺炎球菌多糖類および担体タンパク質の個別の凍結乾燥が調製され、次いで、結合工程において使用され、肺炎球菌ワクチンに使用するための多価肺炎球菌多糖類タンパク質複合体が産生される。個別の乾燥の工程は、多糖類および担体タンパク質の共凍結乾燥を上回る様々な利点を提供し、これには、個々の製剤およびサイクルパラメータを最適化する能力、便利な取り扱い、および所望の溶液サイズを有する個々の多糖類および担体タンパク質調製物を産生する能力が含まれるが、これらに限定されない。
本発明は、以下の(A)(B)および(C)の方法を提供する:
(A)担体タンパク質に共有結合した1つの肺炎球菌血清型由来の複数の肺炎球菌多糖類を含む組成物を製造するための方法であって、
(a)1つの肺炎球菌血清型由来の複数の活性化肺炎球菌多糖類を含む第1の乾燥組成物、および担体タンパク質を含む第2の乾燥組成物を提供する工程;
(b)第1の乾燥組成物および第2の乾燥組成物を有機溶媒中で別々に再構成し、混和して、肺炎球菌血清型の活性化多糖類を含む第1の均質溶液および担体タンパク質を含む第2の均質溶液を提供する工程;
(c)第1の均質溶液と第2の均質溶液をTee-混合して混合物を調製する工程;
(d)前記混合物に還元剤を添加して、1つの肺炎球菌血清型の多糖類に結合した担体タンパク質を含む複合体溶液を製造する工程;
を含む方法:
(B)担体タンパク質に共有結合した1つ以上の肺炎球菌多糖類を含む組成物を製造する方法であって、
(a)1つ以上の肺炎球菌血清型由来の活性化肺炎球菌多糖類を含む第1の乾燥組成物、および担体タンパク質を含む第2の乾燥組成物を提供する工程;
(b)第1の乾燥組成物および第2の乾燥組成物を有機溶媒中で別々に再構成し、混和して、1つ以上の活性化多糖類を含む第1の均質溶液および担体タンパク質を含む第2の均質溶液を提供する工程;
(c)第1の均質溶液と第2の均質溶液をTee-混合して混合物を調製する工程;
(d)前記混合物に還元剤を添加して、前記肺炎球菌血清型の1つ以上の多糖類に結合した担体タンパク質を含む複合体溶液を製造する工程;
を含む方法、および
(C)担体タンパク質に共有結合した2つ以上の肺炎球菌多糖類を含む組成物を製造する方法であって、
(a)2つ以上の肺炎球菌血清型由来の活性化肺炎球菌多糖類を含む第1の乾燥組成物、および担体タンパク質を含む第2の乾燥組成物を提供する工程;
(b)第1の乾燥組成物および第2の乾燥組成物を有機溶媒中で別々に再構成し、混和して、2つ以上の活性化多糖類を含む第1の均質溶液および担体タンパク質を含む第2の均質溶液を提供する工程;
(c)第1の均質溶液と第2の均質溶液をTee-混合して混合物を調製する工程;
(d)前記混合物に還元剤を加えて、前記肺炎球菌血清型の2つ以上の多糖類に複合した担体タンパク質を含む複合体溶液を生成する工程;を含む方法。
(A)担体タンパク質に共有結合した1つの肺炎球菌血清型由来の複数の肺炎球菌多糖類を含む組成物を製造するための方法であって、
(a)1つの肺炎球菌血清型由来の複数の活性化肺炎球菌多糖類を含む第1の乾燥組成物、および担体タンパク質を含む第2の乾燥組成物を提供する工程;
(b)第1の乾燥組成物および第2の乾燥組成物を有機溶媒中で別々に再構成し、混和して、肺炎球菌血清型の活性化多糖類を含む第1の均質溶液および担体タンパク質を含む第2の均質溶液を提供する工程;
(c)第1の均質溶液と第2の均質溶液をTee-混合して混合物を調製する工程;
(d)前記混合物に還元剤を添加して、1つの肺炎球菌血清型の多糖類に結合した担体タンパク質を含む複合体溶液を製造する工程;
を含む方法:
(B)担体タンパク質に共有結合した1つ以上の肺炎球菌多糖類を含む組成物を製造する方法であって、
(a)1つ以上の肺炎球菌血清型由来の活性化肺炎球菌多糖類を含む第1の乾燥組成物、および担体タンパク質を含む第2の乾燥組成物を提供する工程;
(b)第1の乾燥組成物および第2の乾燥組成物を有機溶媒中で別々に再構成し、混和して、1つ以上の活性化多糖類を含む第1の均質溶液および担体タンパク質を含む第2の均質溶液を提供する工程;
(c)第1の均質溶液と第2の均質溶液をTee-混合して混合物を調製する工程;
(d)前記混合物に還元剤を添加して、前記肺炎球菌血清型の1つ以上の多糖類に結合した担体タンパク質を含む複合体溶液を製造する工程;
を含む方法、および
(C)担体タンパク質に共有結合した2つ以上の肺炎球菌多糖類を含む組成物を製造する方法であって、
(a)2つ以上の肺炎球菌血清型由来の活性化肺炎球菌多糖類を含む第1の乾燥組成物、および担体タンパク質を含む第2の乾燥組成物を提供する工程;
(b)第1の乾燥組成物および第2の乾燥組成物を有機溶媒中で別々に再構成し、混和して、2つ以上の活性化多糖類を含む第1の均質溶液および担体タンパク質を含む第2の均質溶液を提供する工程;
(c)第1の均質溶液と第2の均質溶液をTee-混合して混合物を調製する工程;
(d)前記混合物に還元剤を加えて、前記肺炎球菌血清型の2つ以上の多糖類に複合した担体タンパク質を含む複合体溶液を生成する工程;を含む方法。
この方法の特定の実施形態において、第1および第2の乾燥組成物は、凍結乾燥および放射エネルギー真空(REV)脱水から選択される昇華乾燥工程によって調製される。さらなる実施形態において、昇華乾燥工程は、ケーキまたはリオスフェア(lyospere)ビーズの形態で第1の水溶液および第2の水溶液を凍結することを含む。別の実施形態では、昇華乾燥は、金属トレイ、プラスチックトレイ、ビニール袋、およびクラスIチューブバイアルからなる群から選択される容器で実施されるバルク乾燥である。
特定の実施形態において、第1および第2の乾燥組成物の各々は、約6%以下の最終水分含有量を有する。特定の実施形態において、第1および第2の乾燥組成物の各々は、約5%以下の最終水分含有量を有する。特定の実施形態において、第1および第2の乾燥組成物の各々は、約4%以下の最終水分含有量を有する。特定の実施形態において、第1および第2の乾燥組成物の各々は、約3%以下の最終水分含有量を有する。特定の実施形態において、第1および第2の乾燥組成物の各々は、約2%以下の最終的な水分含有量を有する。
特定の実施形態では、第1および第2の乾燥組成物は、第1および第2の乾燥組成物を製造するために、1、2、またはそれ以上の肺炎球菌血清型由来の活性化肺炎球菌多糖類を含む第1の水溶液および担体タンパク質と緩衝液を含む第2の水溶液の昇華乾燥によって調製され、ここで、第1および第2の水溶液は、約0.5% (w/v)またはそれ以上のショ糖を含み、昇華乾燥が凍結乾燥および放射エネルギー真空(REV)脱水から選択される。特定の実施形態では、第1の水溶液は、約4%~6% (w/v)のショ糖を含み、第2の水溶液は、約4%~8% (w/v)のショ糖を含む。
特定の実施形態では、第1の水溶液は、約6~9mg/mLの濃度で多糖類を含み、第2の水溶液は、約6~12mg/mLの濃度で担体タンパク質を含む。特定の実施形態では、第1の水溶液は、約6または9mg/mLの濃度で多糖類を含み、第2の水溶液は、約6、9、10、または12mg/mLの濃度で担体タンパク質を含む。
特定の実施態様において、有機溶媒は非プロトン性溶媒である。特定の実施態様において、非プロトン性溶媒は、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、酢酸エチルアセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド(DMSO)、アセトン、またはヘキサメチルリン酸トリアミドである。特定の実施形態において、有機溶媒はDMSOである。
この方法の特定の実施形態において、工程(b)における再構成は8分以内で行われる。特定の実施形態では、工程(b)における再構成は6分以内で行われる。特定の実施形態では、工程(b)における再構成は4分以内で行われる。特定の実施形態では、工程(b)における再構成は2分以内で行われる。特定の実施形態において、再構成は約2分を含む。特定の実施形態において、工程(b)における再構成は1分以内で行われる。
特定の実施形態では、工程(b)における第1および第2の均質溶液を作るための混合は、120分以内で行われる。特定の実施形態では、工程(b)における混合は90分以内で行われる。特定の実施形態では、工程(b)における混合は60分以内で行われる。特定の実施形態では、工程(b)における混合は30分以内で行われる。特定の実施形態では、工程(b)における混合は15分以内で行われる。特定の実施形態では、工程(b)における混合は10分以内で行われる。特定の実施態様において、担体タンパク質を含む第二の均質溶液は、Tee-混合によって多糖類を含む第1の均質溶液と組み合わせる前に、約6時間以内、DMSO溶液中にある。
特定の実施形態では、各複合体溶液は、重量基準で、担体タンパク質に対する多糖類約0.6~約1.3の比率で担体タンパク質に結合した多糖類を含む。特定の実施形態では、各複合体溶液は、重量基準で、担体タンパク質に対する多糖類約0.9~約1.5の比率で担体タンパク質に結合した多糖類を含む。特定の実施形態では、各複合体溶液は、重量基準で、担体タンパク質に対する多糖類約0.6~約1.5の比率で担体タンパク質に結合した多糖類を含む。
特定の実施形態において、複合体溶液は、溶液中の全多糖類の約15%未満である遊離多糖類濃度を有する。特定の実施形態において、複合体溶液は、溶液中の全多糖類の約10%未満である遊離多糖類濃度を有する。
特定の実施形態において、複合体は、5(mol/mol)を超える担体タンパク質リジン損失値を有する。
特定の実施形態では、各複合体溶液は、重量対重量基準で担体タンパク質に対して約0.6~約1.3の比率で担体タンパク質に複合した多糖類および溶液中の全多糖類の約15%未満である遊離多糖類濃度を含み、複合体は5(mol/mol)を超える担体タンパク質リジン損失値を有する。
特定の実施態様において、緩衝液は、pH範囲5.0~7.0のヒスチジン、コハク酸塩、MES、MOPS、HEPES、または酢酸塩緩衝液である。
特定の実施形態では、緩衝液は5.0~7.0のpH範囲のリン酸塩またはクエン酸塩緩衝液である。
特定の実施態様において、多糖類は、血清型1、2、3、4、5、6A、6B、6C、6D、6E、6G、6H、7F、7A、7B、7C、8、9A、9L、9N、9V、10F、10A、10B、10C、11F、11A、11B、11C、11D、11E、12F、12A、12B、13、14、15F、15A、15B、15C、16F、16A、17F、17A、18F、18A、18B、18C、19F、19A、19B、19C、20A、20B、21、22F、22A、23F、23A、23B、24F、24A、24B、25F、25A、27、28F、28A、29、31、32F、32A、33F、33A、33B、33C、33D、33E、34、35F、35A、35B、35C、36、37、38、39、40、41F、41A、42、43、44、45、46、47F、47A、48、CWPS1、CPS2、およびCWPS3からなる群から選択される肺炎球菌血清型から得られる。
特定の実施態様において、肺炎球菌多糖類は、酸化剤と反応することによって活性化される。
特定の実施態様において、担体タンパク質は、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、百日咳トキソイド、細菌性細胞溶解素、およびニューモリシンからなる群より選択される不活化細菌性トキソイドである。特定の実施形態において、不活化細菌トキソイドはCRM197である。
特定の実施形態において、複合体溶液は滅菌濾過される。
本発明は、担体タンパク質に共有結合した1つ以上の肺炎連鎖球菌多糖類を含む組成物を製造するための方法を提供し、この方法は、
(a)(i)1つ以上の肺炎球菌血清型由来の活性化肺炎球菌多糖類を含む第1の水溶液、および(ii)担体タンパク質および緩衝液を含む第2の水溶液を提供する工程;
(b)第1の水溶液と第2の水溶液を昇華乾燥工程で別々に乾燥させて、乾燥した1つ以上の活性化多糖類を含む第1の乾燥組成物と、乾燥担体タンパク質を含む第2の乾燥組成物を製造する工程;
(c)乾燥組成物に有機溶媒を添加し、混合することにより、第1の乾燥組成物および第2の乾燥組成物を別々に再構成して、1つ以上の活性化多糖類を含む第1の均質溶液および担体タンパク質を含む第2の均質溶液を提供する工程;
(d)第1の均質溶液と第2の均質溶液をTee-混合して混合物を調製する工程;および
(e)前記混合物に還元剤を加えて、肺炎球菌血清型の1つ以上の活性化多糖類に複合した担体タンパク質を含む複合体溶液を生成する工程を含む。
(a)(i)1つ以上の肺炎球菌血清型由来の活性化肺炎球菌多糖類を含む第1の水溶液、および(ii)担体タンパク質および緩衝液を含む第2の水溶液を提供する工程;
(b)第1の水溶液と第2の水溶液を昇華乾燥工程で別々に乾燥させて、乾燥した1つ以上の活性化多糖類を含む第1の乾燥組成物と、乾燥担体タンパク質を含む第2の乾燥組成物を製造する工程;
(c)乾燥組成物に有機溶媒を添加し、混合することにより、第1の乾燥組成物および第2の乾燥組成物を別々に再構成して、1つ以上の活性化多糖類を含む第1の均質溶液および担体タンパク質を含む第2の均質溶液を提供する工程;
(d)第1の均質溶液と第2の均質溶液をTee-混合して混合物を調製する工程;および
(e)前記混合物に還元剤を加えて、肺炎球菌血清型の1つ以上の活性化多糖類に複合した担体タンパク質を含む複合体溶液を生成する工程を含む。
この方法の特定の実施形態において、昇華乾燥工程は、凍結乾燥および放射エネルギー真空(REV)脱水から選択される。さらなる実施形態において、昇華乾燥工程は、ケーキまたはリオスフェアビーズの形態で第1および第2の水溶液を凍結することを含む。別の実施形態では、昇華乾燥は、金属トレイ、プラスチックトレイ、ビニール袋、およびクラスIチューブバイアルからなる群から選択される容器で実施されるバルク乾燥である。
特定の実施形態において、第1および第2の乾燥組成物の各々は、約6%以下の最終水分含有量を有する。特定の実施形態において、第1および第2の乾燥組成物の各々は、約5%以下の最終水分含有量を有する。特定の実施形態において、第1および第2の乾燥組成物の各々は、約4%以下の最終水分含有量を有する。特定の実施形態において、第1および第2の乾燥組成物の各々は、約3%以下の最終水分含有量を有する。特定の実施形態において、第1および第2の乾燥組成物の各々は、約2%以下の最終的な水分含有量を有する。
特定の実施態様において、第1および第2の水溶液は、約0.5% (w/v)以上のショ糖を含む。特定の実施形態では、第1の水溶液は、約4%~6% (w/v)のショ糖を含み、第2の水溶液は、約4%~8% (w/v)のショ糖を含む。
特定の実施形態では、第1の水溶液は、約6~9mg/mLの濃度で多糖類を含み、第2の水溶液は、約6~12mg/mLの濃度で担体タンパク質を含む。特定の実施形態では、第1の水溶液は、約6または9mg/mLの濃度で多糖類を含み、第2の水溶液は、約6、9、10、または12mg/mLの濃度で担体タンパク質を含む。
特定の実施態様において、有機溶媒は非プロトン性溶媒である。特定の実施態様において、非プロトン性溶媒は、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、酢酸エチルアセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド(DMSO)、アセトン、またはヘキサメチルリン酸トリアミドである。特定の実施形態において、有機溶媒はDMSOである。
この方法の特定の実施形態において、工程(c)における再構成は8分以内で行われる。特定の実施形態では、工程(c)における再構成は6分以内で行われる。特定の実施形態では、工程(c)での再構成は4分以内で行われる。特定の実施形態では、工程(c)における再構成は2分以内で行われる。特定の実施形態において、再構成は約2分を含む。特定の実施形態では、工程(c)における再構成は1分以内で行われる。
特定の実施形態では、工程(c)における第1および第2の均質溶液を作るための混合は、120分以内で行われる。特定の実施形態では、工程(c)における混合は90分以内で行われる。特定の実施形態では、工程(c)における混合は60分以内で行われる。特定の実施形態では、工程(c)における混合は30分以内で行われる。特定の実施形態では、工程(c)における混合は15分以内で行われる。特定の実施形態では、工程(c)における混合は10分以内で行われる。特定の実施態様において、担体タンパク質を含む第二の均質溶液は、Tee-混合によって多糖類を含む第1の均質溶液と組み合わせる前に、約6時間以下、DMSO溶液中にある。
特定の実施形態では、各複合体溶液は、重量基準で、担体タンパク質に対する多糖類約0.6~約1.3の比率で担体タンパク質に複合した多糖類を含む。特定の実施形態では、各複合体溶液は、重量基準で、担体タンパク質に対する多糖類約0.9~約1.5の比率で担体タンパク質に複合した多糖類を含む。特定の実施形態では、各複合体溶液は、重量基準で、担体タンパク質に対する多糖類約0.6~約1.5の比率で担体タンパク質に複合した多糖類を含む。
特定の実施形態において、複合体溶液は、溶液中の全多糖類の約15%未満である遊離多糖類濃度を含む。特定の実施形態において、複合体溶液は、溶液中の全多糖類の約10%未満である遊離多糖類濃度を含む。
特定の実施形態において、複合体は、5(mol/mol)を超える担体タンパク質リジン損失値を有する。
特定の実施形態では、各複合体溶液は、重量基準で担体タンパク質に対して約0.6~約1.3の比率で担体タンパク質に複合した多糖類および溶液中の全多糖類の約15%未満である遊離多糖類濃度を含み、複合体は5(mol/mol)を超える担体タンパク質リジン損失値を有する。
特定の実施態様において、緩衝液は、pH範囲5.0~7.0のヒスチジン、コハク酸塩、MES、MOPS、HEPES、または酢酸塩緩衝液である。
特定の実施形態では、緩衝液は5.0~7.0のpH範囲のリン酸塩またはクエン酸塩緩衝液である。
特定の実施態様において、多糖類は、血清型1、2、3、4、5、6A、6B、6C、6D、6E、6G、6H、7F、7A、7B、7C、8、9A、9L、9N、9V、10F、10A、10B、10C、11F、11A、11B、11C、11D、11E、12F、12A、12B、13、14、15F、15A、15B、15C、16F、16A、17F、17A、18F、18A、18B、18C、19F、19A、19B、19C、20A、20B、21、22F、22A、23F、23A、23B、24F、24A、24B、25F、25A、27、28F、28A、29、31、32F、32A、33F、33A、33B、33C、33D、33E、34、35F、35A、35B、35C、36、37、38、39、40、41F、41A、42、43、44、45、46、47F、47A、48、CWPS1、CPS2、およびCWPS3からなる群から選択される肺炎球菌血清型から得られる。
特定の実施態様において、肺炎球菌多糖類は、酸化剤と反応することによって活性化される。
特定の実施態様において、担体タンパク質は、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、百日咳トキソイド、細菌性細胞溶解素、またはニューモリシンからなる群より選択される不活化細菌性トキソイドである。特定の実施形態において、不活化細菌トキソイドはCRM197である。
特定の実施形態において、複合体溶液は滅菌濾過される。
本発明はさらに、2以上の複合体を含み、各複合体は、担体タンパク質に共有結合した1以上の血清型由来の肺炎球菌多糖類を有する組成物を作製するための方法を提供し、この方法は
(a)(i)各々が特定の肺炎球菌血清型の活性化多糖類を含む2以上の第1の水溶液であって、多糖類が酸化剤と反応して活性化多糖類を提供しており、該2以上の第1の水溶液が同一でないことを特徴する第1の水溶液、または、(ii)各々が2以上の肺炎球菌血清型の活性化多糖類を含む2以上の第1の水溶液であって、多糖類が酸化剤と反応して活性化多糖類を提供しており、該2以上の第1の水溶液が同一でないことを特徴とする第1の水溶液を提供する工程;
(b)2以上の第2の水溶液を提供する工程(各々が担体タンパク質および緩衝液を含み、ここで、2以上の第2の水溶液の量は、少なくとも、前記2以上の第1の水溶液の量に相当する);
(c)前記2以上の第1の水溶液と前記2以上の第2の水溶液を昇華乾燥工程で別々に乾燥させて、各々が乾燥多糖類を含む2つ以上の第1の乾燥組成物、および各々が乾燥担体タンパク質を含む2以上の第2の乾燥組成物を製造する工程;
(d)2以上の第1の乾燥組成物の各々と、2以上の第2の乾燥組成物の各々を有機溶媒中で別々に再構成し、混合して2以上の第1の均質溶液(該第1の均質溶液は、各々が独立して、(i)特定の肺炎球菌血清型の多糖類、または(ii)2以上の特定の肺炎球菌血清型の多糖類のいずれかを含む)および、各々が担体タンパク質を含む2以上の第2の均質溶液を提供する工程;
(e)Tee-混合によって各第1の均質溶液を第2の均質溶液と別々に組み合わせて、複数の混合物を製造する工程;
(f)複数の混合物に還元剤を加えて、複数の複合体溶液を生成する工程;
(g)複数の複合体溶液の2以上を組み合わせて2以上の複合体を含む組成物を産生する工程(各複合体は、担体タンパク質に共有結合している1つ以上の血清型由来の肺炎球菌多糖類を有する)
を含む。
(a)(i)各々が特定の肺炎球菌血清型の活性化多糖類を含む2以上の第1の水溶液であって、多糖類が酸化剤と反応して活性化多糖類を提供しており、該2以上の第1の水溶液が同一でないことを特徴する第1の水溶液、または、(ii)各々が2以上の肺炎球菌血清型の活性化多糖類を含む2以上の第1の水溶液であって、多糖類が酸化剤と反応して活性化多糖類を提供しており、該2以上の第1の水溶液が同一でないことを特徴とする第1の水溶液を提供する工程;
(b)2以上の第2の水溶液を提供する工程(各々が担体タンパク質および緩衝液を含み、ここで、2以上の第2の水溶液の量は、少なくとも、前記2以上の第1の水溶液の量に相当する);
(c)前記2以上の第1の水溶液と前記2以上の第2の水溶液を昇華乾燥工程で別々に乾燥させて、各々が乾燥多糖類を含む2つ以上の第1の乾燥組成物、および各々が乾燥担体タンパク質を含む2以上の第2の乾燥組成物を製造する工程;
(d)2以上の第1の乾燥組成物の各々と、2以上の第2の乾燥組成物の各々を有機溶媒中で別々に再構成し、混合して2以上の第1の均質溶液(該第1の均質溶液は、各々が独立して、(i)特定の肺炎球菌血清型の多糖類、または(ii)2以上の特定の肺炎球菌血清型の多糖類のいずれかを含む)および、各々が担体タンパク質を含む2以上の第2の均質溶液を提供する工程;
(e)Tee-混合によって各第1の均質溶液を第2の均質溶液と別々に組み合わせて、複数の混合物を製造する工程;
(f)複数の混合物に還元剤を加えて、複数の複合体溶液を生成する工程;
(g)複数の複合体溶液の2以上を組み合わせて2以上の複合体を含む組成物を産生する工程(各複合体は、担体タンパク質に共有結合している1つ以上の血清型由来の肺炎球菌多糖類を有する)
を含む。
この方法の特定の実施形態において、少なくとも1つの複合体溶液は、第1の均質溶液と第2の均質溶液を別々にTee-混合して複数の複合体溶液を生成することによって調製される;または、少なくとも1つの複合体溶液は、第1の水溶液と第2の均質溶液を別々にTee-混合して複数の複合体溶液を生成することによって調製される;または、各複合体溶液は、第1の均質溶液と第2の均質溶液を別々にTee-混合して複数の複合体溶液を生成することによって調製される;または、各複合体溶液は、第1の水溶液と第2の均質溶液を別々にTee-混合して複数の複合体溶液を生成することによって調製される。
この方法の特定の実施形態において、昇華乾燥工程は、凍結乾燥および放射エネルギー真空(REV)脱水から選択される。さらなる実施形態において、昇華乾燥工程は、ケーキまたはリオスフェアビーズの形態で第1および第2の水溶液を凍結することを含む。別の実施形態では、乾燥は、金属トレイ、プラスチックトレイ、ビニール袋、およびクラスIチューブバイアルからなる群より選択される容器で実施されるバルク乾燥である。
特定の実施形態において、第1および第2の乾燥組成物の各々は、約6%以下の最終水分含有量を有する。特定の実施形態において、第1および第2の乾燥組成物の各々は、約5%以下の最終水分含有量を有する。特定の実施形態において、第1および第2の乾燥組成物の各々は、約4%以下の最終水分含有量を有する。特定の実施形態において、第1および第2の乾燥組成物の各々は、約3%以下の最終水分含有量を有する。特定の実施形態において、第1および第2の乾燥組成物の各々は、約2%以下の最終的な水分含有量を有する。
特定の実施態様において、第1および第2の水溶液は、約0.5% (w/v)以上のショ糖を含む。特定の実施形態では、第1の水溶液は、約4%~6% (w/v)のショ糖を含み、第2の水溶液は、約4%~8% (w/v)のショ糖を含む。
特定の実施形態では、第1の水溶液は、約6~9mg/mLの濃度で多糖類を含み、第2の水溶液は、約6~12mg/mLの濃度で担体タンパク質を含む。特定の実施形態では、第2の水溶液は、約6または9mg/mLの濃度で多糖類を含み、約6、9、10、または12mg/mLの濃度で担体タンパク質を含む。
特定の実施態様において、有機溶媒は非プロトン性溶媒である。特定の実施態様において、非プロトン性溶媒は、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、酢酸エチルアセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド(DMSO)、アセトン、またはヘキサメチルリン酸トリアミドである。特定の実施形態において、有機溶媒はDMSOである。
この方法の特定の実施形態において、工程(d)における再構成は8分以内で行われる。特定の実施形態では、工程(d)における再構成は6分以内で行われる。特定の実施形態では、工程(d)における再構成は4分以内で行われる。特定の実施形態では、工程(d)における再構成は2分以内で行われる。特定の実施形態において、再構成は約2分を含む。特定の実施形態では、工程(d)における再構成は1分以内で行われる。
特定の実施形態では、工程(d)における第1および第2の均質溶液を作るための混合は、120分以内で行われる。特定の実施形態では、工程(d)における混合は90分以内で行われる。特定の実施形態では、工程(d)における混合は60分以内で行われる。特定の実施形態では、工程(d)における混合は30分以内で行われる。特定の実施形態では、工程(d)における混合は15分以内で行われる。特定の実施形態では、工程(d)における混合は10分以内で行われる。特定の実施態様において、担体タンパク質を含む第二均質溶液は、Tee-混合によって多糖類を含む第1の均質溶液と組み合わせる前に、約6時間以内、DMSO溶液中にある。
特定の実施形態では、各複合体溶液は、重量基準で、担体タンパク質に対する多糖類約0.6~約1.3の比率で担体タンパク質に複合した多糖類を含む。特定の実施形態では、各複合体溶液は、重量基準で、担体タンパク質に対する多糖類約0.9~約1.5の比率で担体タンパク質に複合した多糖類を含む。特定の実施形態では、各複合体溶液は、重量基準で、担体タンパク質に対する多糖類約0.6~約1.5の比率で担体タンパク質に複合した多糖類を含む。
特定の実施形態において、複合体溶液は、溶液中の全多糖類の約15%未満である遊離多糖類濃度を含む。特定の実施形態において、複合体溶液は、溶液中の全多糖類の約10%未満である遊離多糖類濃度を含む。
特定の実施形態において、複合体は、5(mol/mol)を超える担体タンパク質リジン損失値を有する。
特定の実施形態では、各複合体溶液は、重量基準で担体タンパク質に対する約0.6~約1.3多糖類の比率で担体タンパク質に複合した多糖類、溶液中の全多糖類の約15%未満である遊離多糖類濃度を含み、複合体は5(mol/mol)を超える担体タンパク質リジン損失値を有する。
特定の実施態様において、緩衝液は、pH範囲5.0~7.0のヒスチジン、コハク酸塩、MES、MOPS、HEPES、または酢酸塩緩衝液である。
特定の実施形態では、緩衝液は5.0~7.0のpH範囲のリン酸塩またはクエン酸塩緩衝液である。
特定の実施態様において、多糖類は、血清型1、2、3、4、5、6A、6B、6C、6D、6E、6G、6H、7F、7A、7B、7C、8、9A、9L、9N、9V、10F、10A、10B、10C、11F、11A、11B、11C、11D、11E、12F、12A、12B、13、14、15F、15A、15B、15C、16F、16A、17F、17A、18F、18A、18B、18C、19F、19A、19B、19C、20A、20B、21、22F、22A、23F、23A、23B、24F、24A、24B、25F、25A、27、28F、28A、29、31、32F、32A、33F、33A、33B、33C、33D、33E、34、35F、35A、35B、35C、36、37、38、39、40、41F、41A、42、43、44、45、46、47F、47A、48、CWPS1、CPS2、およびCWPS3からなる群から選択される肺炎球菌血清型から得られる。
特定の実施態様において、肺炎球菌多糖類は、酸化剤と反応することによって活性化される。
特定の実施態様において、担体タンパク質は、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、百日咳トキソイド、細菌性細胞溶解素、またはニューモリシンからなる群より選択される不活化細菌性トキソイドである。特定の実施形態において、不活化細菌トキソイドはCRM197である。
特定の実施形態において、複合体溶液は滅菌濾過される。
本発明は、さらに、担体タンパク質に結合した肺炎球菌血清型多糖類1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、および33Fを含む多価肺炎球菌結合型ワクチンを製造するための方法を含み、この方法は、
(a)23の乾燥担体タンパク質組成物、および1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、および33Fから選択された肺炎球菌血清型由来の乾燥した活性化多糖類を各々が含む23の乾燥した活性化多糖類組成物を提供する工程(該23の乾燥した活性化多糖類組成物は、いずれも同一の肺炎球菌血清型由来の活性化多糖類を含まない);
(b)前記23の乾燥担体タンパク質組成物および前記23の乾燥した活性化多糖類組成物を、別々に有機溶媒中において再構成し、混和して、各々が担体タンパク質を含む23の均質な担体タンパク質溶液および各々が特定の肺炎球菌血清型の活性化多糖類を含む23の均質な活性化多糖類溶液を提供する工程(該23の均質な溶液は、いずれも同一の肺炎球菌血清型由来の活性化多糖類を含まない);
(c)前記23の均質な担体タンパク質溶液の各々を、Tee-混合によって前記23の均質な活性化多糖類溶液の1つと組み合わせて、各々が担体タンパク質および特定の肺炎球菌血清型の活性化多糖類を含む23の混合物を製造する工程(該23の混合物は、いずれも同一の肺炎球菌血清型由来の活性化多糖類を含まない);
(d)前記23の混合物の各々に還元剤を加えて、各々が特定の肺炎球菌血清型の多糖類に結合した担体タンパク質を含む23の複合体溶液を製造する工程(該23の複合体溶液は、いずれも同一の肺炎球菌血清型由来の活性化多糖類を含まない);および
(e)前記23の複合体溶液を組み合わせて、肺炎球菌血清型多糖類1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、および33Fに対する多価免疫原性複合体またはワクチンを提供する工程、を含む。
(a)23の乾燥担体タンパク質組成物、および1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、および33Fから選択された肺炎球菌血清型由来の乾燥した活性化多糖類を各々が含む23の乾燥した活性化多糖類組成物を提供する工程(該23の乾燥した活性化多糖類組成物は、いずれも同一の肺炎球菌血清型由来の活性化多糖類を含まない);
(b)前記23の乾燥担体タンパク質組成物および前記23の乾燥した活性化多糖類組成物を、別々に有機溶媒中において再構成し、混和して、各々が担体タンパク質を含む23の均質な担体タンパク質溶液および各々が特定の肺炎球菌血清型の活性化多糖類を含む23の均質な活性化多糖類溶液を提供する工程(該23の均質な溶液は、いずれも同一の肺炎球菌血清型由来の活性化多糖類を含まない);
(c)前記23の均質な担体タンパク質溶液の各々を、Tee-混合によって前記23の均質な活性化多糖類溶液の1つと組み合わせて、各々が担体タンパク質および特定の肺炎球菌血清型の活性化多糖類を含む23の混合物を製造する工程(該23の混合物は、いずれも同一の肺炎球菌血清型由来の活性化多糖類を含まない);
(d)前記23の混合物の各々に還元剤を加えて、各々が特定の肺炎球菌血清型の多糖類に結合した担体タンパク質を含む23の複合体溶液を製造する工程(該23の複合体溶液は、いずれも同一の肺炎球菌血清型由来の活性化多糖類を含まない);および
(e)前記23の複合体溶液を組み合わせて、肺炎球菌血清型多糖類1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、および33Fに対する多価免疫原性複合体またはワクチンを提供する工程、を含む。
本発明はさらに、肺炎球菌血清型多糖類1、4、3、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F、および33Fに対する多価免疫原性複合体またはワクチンを製造するための方法を含み、この方法は、
(a)15の乾燥担体タンパク質組成物、および1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F、および33Fから選択された肺炎球菌血清型由来の乾燥した活性化多糖類を各々が含む15の乾燥した活性化多糖類組成物を提供する工程(該15の乾燥した活性化多糖類組成物は、いずれも同一の肺炎球菌血清型由来の活性化多糖類を含まない);
(b)前記15の乾燥担体タンパク質組成物および前記15の乾燥した活性化多糖類組成物を、別々に有機溶媒中において再構成し、混合して、各々が担体タンパク質を含む15の均質な担体タンパク質溶液および各々が特定の肺炎球菌血清型の活性化多糖類を含む15の均質な活性化多糖類溶液を提供する工程(該15の均質な溶液は、いずれも同一の肺炎球菌血清型由来の活性化多糖類を含まない);
(c)前記15の均質な担体タンパク質溶液の各々を、Tee-混合によって前記15の均質な活性化多糖類溶液の1つと組み合わせて、各々が担体タンパク質および特定の肺炎球菌血清型の活性化多糖類を含む15の混合物を生成する工程(該15の混合物は、いずれもが同一の肺炎球菌血清型由来の活性化多糖類を含まない);
(d)前記15の混合物の各々に還元剤を加えて、各々が特定の肺炎球菌血清型の多糖類に結合した担体タンパク質を含む15の複合体溶液を製造する工程(該15の複合体溶液は、いずれも同一の肺炎球菌血清型由来の活性化多糖類を含まない);および
(e)前記15の複合体溶液を組み合わせて、担体タンパク質に結合した肺炎球菌血清型多糖類1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F、および33Fを含む多価肺炎球菌結合型ワクチンを提供する工程、を含む。
(a)15の乾燥担体タンパク質組成物、および1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F、および33Fから選択された肺炎球菌血清型由来の乾燥した活性化多糖類を各々が含む15の乾燥した活性化多糖類組成物を提供する工程(該15の乾燥した活性化多糖類組成物は、いずれも同一の肺炎球菌血清型由来の活性化多糖類を含まない);
(b)前記15の乾燥担体タンパク質組成物および前記15の乾燥した活性化多糖類組成物を、別々に有機溶媒中において再構成し、混合して、各々が担体タンパク質を含む15の均質な担体タンパク質溶液および各々が特定の肺炎球菌血清型の活性化多糖類を含む15の均質な活性化多糖類溶液を提供する工程(該15の均質な溶液は、いずれも同一の肺炎球菌血清型由来の活性化多糖類を含まない);
(c)前記15の均質な担体タンパク質溶液の各々を、Tee-混合によって前記15の均質な活性化多糖類溶液の1つと組み合わせて、各々が担体タンパク質および特定の肺炎球菌血清型の活性化多糖類を含む15の混合物を生成する工程(該15の混合物は、いずれもが同一の肺炎球菌血清型由来の活性化多糖類を含まない);
(d)前記15の混合物の各々に還元剤を加えて、各々が特定の肺炎球菌血清型の多糖類に結合した担体タンパク質を含む15の複合体溶液を製造する工程(該15の複合体溶液は、いずれも同一の肺炎球菌血清型由来の活性化多糖類を含まない);および
(e)前記15の複合体溶液を組み合わせて、担体タンパク質に結合した肺炎球菌血清型多糖類1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F、および33Fを含む多価肺炎球菌結合型ワクチンを提供する工程、を含む。
本発明は、さらに、担体タンパク質に結合した肺炎球菌血清型多糖類1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、および23Fを含む多価肺炎球菌結合型ワクチンを製造するための方法を含み、この方法は、
(a)13の乾燥担体タンパク質組成物、および1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、および23Fから選択された肺炎球菌血清型由来の乾燥した活性化多糖類を各々が含む13の乾燥した活性化多糖類組成物を提供する工程(該13の乾燥した活性化多糖類組成物は、いずれも同一の肺炎球菌血清型由来の活性化多糖類を含まない);
(b)前記13の乾燥担体タンパク質組成物および前記13の乾燥した活性化多糖類組成物を、別々有機溶媒中において再構成し、混合して、各々が担体タンパク質を含む13の均質な担体タンパク質溶液および各々が特定の肺炎球菌血清型の活性化多糖類を含む13の均質な担体タンパク質溶液を提供する工程(該13の均質な溶液は、いずれもが同一の肺炎球菌血清型由来の活性化多糖類を含まない);
(c)13の均質な担体タンパク質溶液の各々を、Tee-混合によって13の活性化多糖類均質溶液のうちの1つと組み合わせて、各々特定の肺炎球菌血清型の担体タンパク質および活性化多糖類を含む13の混合物を生成する工程(該13の混合物は、いずれも同一の肺炎球菌血清型由来の活性化多糖類を含まない);
(d)前記13の混合物の各々に還元剤を加えて、各々が特定の肺炎球菌血清型の多糖類に結合した担体タンパク質を含む13の複合体溶液を提供する工程(該13の複合体溶液は、いずれも同一の肺炎球菌血清型由来の活性化多糖類を含まない);および
(e)前記13の複合体溶液を組み合わせて、担体タンパク質に結合した肺炎球菌血清型多糖類1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、および23Fを含む多価肺炎球菌結合型ワクチンを提供する工程、を含む。
(a)13の乾燥担体タンパク質組成物、および1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、および23Fから選択された肺炎球菌血清型由来の乾燥した活性化多糖類を各々が含む13の乾燥した活性化多糖類組成物を提供する工程(該13の乾燥した活性化多糖類組成物は、いずれも同一の肺炎球菌血清型由来の活性化多糖類を含まない);
(b)前記13の乾燥担体タンパク質組成物および前記13の乾燥した活性化多糖類組成物を、別々有機溶媒中において再構成し、混合して、各々が担体タンパク質を含む13の均質な担体タンパク質溶液および各々が特定の肺炎球菌血清型の活性化多糖類を含む13の均質な担体タンパク質溶液を提供する工程(該13の均質な溶液は、いずれもが同一の肺炎球菌血清型由来の活性化多糖類を含まない);
(c)13の均質な担体タンパク質溶液の各々を、Tee-混合によって13の活性化多糖類均質溶液のうちの1つと組み合わせて、各々特定の肺炎球菌血清型の担体タンパク質および活性化多糖類を含む13の混合物を生成する工程(該13の混合物は、いずれも同一の肺炎球菌血清型由来の活性化多糖類を含まない);
(d)前記13の混合物の各々に還元剤を加えて、各々が特定の肺炎球菌血清型の多糖類に結合した担体タンパク質を含む13の複合体溶液を提供する工程(該13の複合体溶液は、いずれも同一の肺炎球菌血清型由来の活性化多糖類を含まない);および
(e)前記13の複合体溶液を組み合わせて、担体タンパク質に結合した肺炎球菌血清型多糖類1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、および23Fを含む多価肺炎球菌結合型ワクチンを提供する工程、を含む。
本発明は、さらに、担体タンパク質に結合した肺炎球菌血清型多糖類1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F、および23Fを含む多価肺炎球菌結合型ワクチンを製造するための方法を提供し、この方法は
(a)10の乾燥担体タンパク質組成物、および1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F、および23Fから選択された肺炎球菌血清型由来の乾燥した活性化多糖類を各々が含む10の乾燥した活性化多糖類組成物を提供する工程(該10の乾燥した活性化多糖類組成物は、いずれも同一の肺炎球菌血清型由来の活性化多糖類を含まない);
(b)前記10の乾燥担体タンパク質組成物および前記10の乾燥した活性化多糖類組成物を、別々に有機溶媒中において再構成し、混和して、各々が担体タンパク質を含む10の均質な担体タンパク質溶液および各々が特定の肺炎球菌血清型の活性化多糖類を含む10の均質な活性化多糖類溶液を提供する工程(該10の均質溶液は、いずれも同一の肺炎球菌血清型由来の活性化多糖類を含まない);
(c)前記10の均質な担体タンパク質溶液の各々を、Tee-混合によって前記10の均質な活性化多糖類溶液の1つと組み合わせて、各々が担体タンパク質および特定の肺炎球菌血清型の活性化多糖類を含む10の混合物を製造する工程(該10の混合物は、いずれも同一の肺炎球菌血清型由来の活性化多糖類を含まない);
(d)前記10の混合物の各々に還元剤を加えて、各々が特定の肺炎球菌血清型の多糖類に結合した担体タンパク質を含む10の複合体溶液を製造する工程(該10の複合体溶液は、いずれも同一の肺炎球菌血清型由来の活性化多糖類を含まない);および
(e)前記10の複合体溶液を組み合わせて、担体蛋白に結合した肺炎球菌血清型多糖類1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F、および23Fを含む多価肺炎球菌結合型ワクチンを提供する工程、を含む。
(a)10の乾燥担体タンパク質組成物、および1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F、および23Fから選択された肺炎球菌血清型由来の乾燥した活性化多糖類を各々が含む10の乾燥した活性化多糖類組成物を提供する工程(該10の乾燥した活性化多糖類組成物は、いずれも同一の肺炎球菌血清型由来の活性化多糖類を含まない);
(b)前記10の乾燥担体タンパク質組成物および前記10の乾燥した活性化多糖類組成物を、別々に有機溶媒中において再構成し、混和して、各々が担体タンパク質を含む10の均質な担体タンパク質溶液および各々が特定の肺炎球菌血清型の活性化多糖類を含む10の均質な活性化多糖類溶液を提供する工程(該10の均質溶液は、いずれも同一の肺炎球菌血清型由来の活性化多糖類を含まない);
(c)前記10の均質な担体タンパク質溶液の各々を、Tee-混合によって前記10の均質な活性化多糖類溶液の1つと組み合わせて、各々が担体タンパク質および特定の肺炎球菌血清型の活性化多糖類を含む10の混合物を製造する工程(該10の混合物は、いずれも同一の肺炎球菌血清型由来の活性化多糖類を含まない);
(d)前記10の混合物の各々に還元剤を加えて、各々が特定の肺炎球菌血清型の多糖類に結合した担体タンパク質を含む10の複合体溶液を製造する工程(該10の複合体溶液は、いずれも同一の肺炎球菌血清型由来の活性化多糖類を含まない);および
(e)前記10の複合体溶液を組み合わせて、担体蛋白に結合した肺炎球菌血清型多糖類1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F、および23Fを含む多価肺炎球菌結合型ワクチンを提供する工程、を含む。
特定の実施形態において、乾燥された担体タンパク質組成物の各々は、6%以下の最終水分含量を有し、乾燥された多糖類組成物の各々は、約6%以下の最終水分含量を有する。
この方法の特定の実施形態において、乾燥担体タンパク質および乾燥した多糖類組成物の各々は、凍結乾燥または放射エネルギー真空(REV)脱水を含む昇華乾燥工程によって調製される。別の実施形態では、昇華乾燥は、金属トレイ、プラスチックトレイ、ビニール袋、およびクラスIチューブバイアルからなる群から選択される容器で実施されるバルク乾燥である。さらなる実施形態において、昇華乾燥工程は、担体タンパク質を含む各水溶液、およびケーキまたはリオスフェアビーズの形態の多糖類を含む各水溶液を別々に凍結することを含む。
特定の実施態様において、乾燥した担体および乾燥した多糖類組成物は、複数の別々の水性多糖類溶液(該水溶性多糖類溶液は、上記の特定の肺炎球菌血清型由来の活性化肺炎球菌多糖類を含む)ならびに複数の水性担体タンパク質溶液(該水性担体タンパク質溶液は、各々が担体タンパク質および緩衝液を含む)の昇華乾燥によって調製され、ここで、水性担体タンパク質溶液の数は少なくとも水性多糖類溶液の数に対応し、水性多糖類および担体タンパク質溶液はそれぞれ約0.5% (w/v)以上のショ糖を含み、昇華乾燥は凍結乾燥および放射エネルギー真空(REV)脱水から選択される。
特定の実施態様において、水性多糖類および担体タンパク質溶液は、それぞれ約0.5% (w/v)またはそれ以上のショ糖を含む。特定の実施形態において、多糖類水溶液は、各々、約4%~6% (w/v)ショ糖を含み、水性担体タンパク質溶液は、各々、約4%~8% (w/v)ショ糖を含む。
特定の実施形態において、水性多糖類溶液は、各々、約6~9mg/mLの濃度で多糖類を含み、水性担体タンパク質溶液は、各々、約6~12mg/mLの濃度で担体タンパク質を含む。特定の実施態様において、水性多糖類溶液は、それぞれ約6または9mg/mLの濃度で多糖類を含み、水性担体タンパク質溶液は、それぞれ約6、9、10、または12mg/mLの濃度で担体タンパク質を含む。
特定の実施態様において、有機溶媒は非プロトン性溶媒である。特定の実施態様において、非プロトン性溶媒は、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、酢酸エチルアセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド(DMSO)、アセトン、またはヘキサメチルリン酸トリアミドである。特定の実施形態において、有機溶媒はDMSOである。
この方法の特定の実施形態において、工程(b)における再構成は8分以内で行われる。特定の実施形態では、工程(b)における再構成は6分以内で行われる。特定の実施形態では、工程(b)における再構成は4分以内で行われる。特定の実施形態では、工程(b)における再構成は2分以内で行われる。特定の実施形態において、再構成は約2分を含む。特定の実施形態において、工程(b)における再構成は1分以内で行われる。
特定の実施形態では、工程(b)における第1および第2の均質溶液を作るための混合は、120分以内で行われる。特定の実施形態では、工程(b)における混合は90分以内で行われる。特定の実施形態では、工程(b)における混合は60分以内で行われる。特定の実施形態では、工程(b)における混合は30分以内で行われる。特定の実施形態では、工程(b)における混合は15分以内で行われる。特定の実施形態では、工程(b)における混合は10分以内で行われる。特定の実施態様において、担体タンパク質を含む第二均質溶液は、Tee-混合によって多糖類を含む第1の均質溶液と組み合わせる前に、約6時間以内、DMSO溶液中にある。
特定の実施形態では、各複合体溶液は、重量基準で、担体タンパク質に対して比率約0.6~約1.3で担体タンパク質に複合した多糖類を含む。特定の実施形態では、各複合体溶液は、重量基準で、担体タンパク質に対して約0.9~約1.5の比率で担体タンパク質に複合した多糖類を含む。特定の実施形態では、各複合体溶液は、重量基準で、担体タンパク質に対して約0.6~約1.5の比率で担体タンパク質に複合した多糖類を含む。
特定の実施態様において、複合体溶液は、溶液中の全多糖類の約15%未満である遊離多糖類濃度を含む。特定の実施態様において、複合体溶液は、溶液中の全多糖類の約10%未満である遊離多糖類濃度を含む。
特定の実施形態において、複合体は、5(mol/mol)を超える担体タンパク質リジン損失値を有する。
特定の実施形態では、各複合体溶液は、重量基準で担体タンパク質に対した約0.6~約1.の比率で担体タンパク質に複合した多糖類および溶液中の全多糖類の約15%未満である遊離多糖類濃度を含み、複合体は5(mol/mol)を超える担体タンパク質リジン損失値を有する。
特定の実施態様において、肺炎球菌多糖類は、酸化剤と反応することによって活性化される。
特定の実施形態において、複合体溶液は滅菌濾過される。
図面の簡単な説明
図1は、成分の組合せとPs溶液のPr溶液への添加中における多糖類(Ps)濃度、CRM197(Pr)濃度およびPs対Pr比率(Pr:Pr)における組成物濃度の影響を示す(成分は当初6mg/mlで無水DMSOに溶解し、最終的に1:1のPs:Pr比で組み合わされる)。
図2は、成分の組合せとPr溶液のPs溶液への添加中における多糖類(Ps)濃度、CRM197(Pr)濃度およびPs対Pr比率(Pr:Pr)における組成物濃度の影響を示す(成分は当初6mg/mlで無水DMSOに溶解し、最終的に1:1のPs:Pr比で組み合わされる)。
図3は、成分の組合せと凍結乾燥させたPsのPr溶液への添加中における多糖類(Ps)濃度、CRM197(Pr)濃度およびPs対Pr比率(Pr:Pr)における組成物濃度の影響を示す(Prは当初3mg/mlで無水DMSOに溶解し、Psを溶解するのに使用される)。
図4は、成分の組合せと別々の複合化容器にPr溶液とPs溶液を同時添加したときの多糖類(Ps)濃度、CRM197(Pr)濃度およびPs対Pr比率(Pr:Pr)における組成物濃度の影響を示す(成分は当初6mg/mlで無水DMSOに溶解し、成分容量添加速度は同じである)。
図5は、無水DMSO中での速い(2分)再構成対遅い(8分)再構成によるCRM197のFTIRスペクトルを示す。
図6は、無水DMSO中での中間再構成とそれに続く保持時間の増加(30分; 60分; 120分; 180分; 240分; 300分)によるCRM197のFTIRスペクトルを示す。
図7は、異なる濃度(10mg/mL; 30mg/mL; 50mg/mL)の無水DMSO中での速い再構成のCRM197のFTIRスペクトルを示す。
図8Aおよび8Bは、無水DMSO中で10mg/mL (図8A)および30mg/mL(図8B)での速い再構成(2分間)を伴うCRM197の動的光散乱(DLS)プロファイルを示す。各試料について3回の測定値を得た(3回のトレース)。
図9は、異なるレベルの水(無水DMSO; 99% DMSO/水; 97% DMSO/水; 95% DMSO/水)を用いた、DMSO 中での速い再構成(2分間)のCRM197のFTIRスペクトルを示す。
図10は、無水DMSO中での速い(2分間)再構成対遅い(8分間)再構成の特別な乾燥凍結乾燥CRM197のFTIRスペクトルを示す(速い(2分間);遅い(8分間)。
図11は、CRM197:多糖類血清型6B (CRM197-6B)複合体のFTIRスペクトルを示し、ここでは、CRM197が、多糖類6B結合の前に速く(2分)、または遅く(8分)再構成された。また、水性条件下で多糖類6Bに結合したCRM197を示す。
図12は、担体タンパク質(Pr)多糖類(Ps)複合体をつくるための一般的なスキームを示している。
図13は、大きさが増す多糖類を用いた反応から得られる複合体の大きさを示している。グラフから、ゆっくりとした無水DMSO添加は、同じサイズの多糖類から、無水DMSOの速い添加よりもさらに大きな複合体を生じることがわかる。
図1は、成分の組合せとPs溶液のPr溶液への添加中における多糖類(Ps)濃度、CRM197(Pr)濃度およびPs対Pr比率(Pr:Pr)における組成物濃度の影響を示す(成分は当初6mg/mlで無水DMSOに溶解し、最終的に1:1のPs:Pr比で組み合わされる)。
図2は、成分の組合せとPr溶液のPs溶液への添加中における多糖類(Ps)濃度、CRM197(Pr)濃度およびPs対Pr比率(Pr:Pr)における組成物濃度の影響を示す(成分は当初6mg/mlで無水DMSOに溶解し、最終的に1:1のPs:Pr比で組み合わされる)。
図3は、成分の組合せと凍結乾燥させたPsのPr溶液への添加中における多糖類(Ps)濃度、CRM197(Pr)濃度およびPs対Pr比率(Pr:Pr)における組成物濃度の影響を示す(Prは当初3mg/mlで無水DMSOに溶解し、Psを溶解するのに使用される)。
図4は、成分の組合せと別々の複合化容器にPr溶液とPs溶液を同時添加したときの多糖類(Ps)濃度、CRM197(Pr)濃度およびPs対Pr比率(Pr:Pr)における組成物濃度の影響を示す(成分は当初6mg/mlで無水DMSOに溶解し、成分容量添加速度は同じである)。
図5は、無水DMSO中での速い(2分)再構成対遅い(8分)再構成によるCRM197のFTIRスペクトルを示す。
図6は、無水DMSO中での中間再構成とそれに続く保持時間の増加(30分; 60分; 120分; 180分; 240分; 300分)によるCRM197のFTIRスペクトルを示す。
図7は、異なる濃度(10mg/mL; 30mg/mL; 50mg/mL)の無水DMSO中での速い再構成のCRM197のFTIRスペクトルを示す。
図8Aおよび8Bは、無水DMSO中で10mg/mL (図8A)および30mg/mL(図8B)での速い再構成(2分間)を伴うCRM197の動的光散乱(DLS)プロファイルを示す。各試料について3回の測定値を得た(3回のトレース)。
図9は、異なるレベルの水(無水DMSO; 99% DMSO/水; 97% DMSO/水; 95% DMSO/水)を用いた、DMSO 中での速い再構成(2分間)のCRM197のFTIRスペクトルを示す。
図10は、無水DMSO中での速い(2分間)再構成対遅い(8分間)再構成の特別な乾燥凍結乾燥CRM197のFTIRスペクトルを示す(速い(2分間);遅い(8分間)。
図11は、CRM197:多糖類血清型6B (CRM197-6B)複合体のFTIRスペクトルを示し、ここでは、CRM197が、多糖類6B結合の前に速く(2分)、または遅く(8分)再構成された。また、水性条件下で多糖類6Bに結合したCRM197を示す。
図12は、担体タンパク質(Pr)多糖類(Ps)複合体をつくるための一般的なスキームを示している。
図13は、大きさが増す多糖類を用いた反応から得られる複合体の大きさを示している。グラフから、ゆっくりとした無水DMSO添加は、同じサイズの多糖類から、無水DMSOの速い添加よりもさらに大きな複合体を生じることがわかる。
発明の詳細な説明
I. 定義
本明細書中で使用される場合、用語「多糖類」(Ps)は、限定されるわけではないが、「糖類」、「オリゴ糖」、「多糖類」、「リポ糖」、「リポオリゴ糖(LOS)」、「リポ多糖類(LPS)」、「グリコシル酸塩」、「複合糖質」などを含む、免疫学的および細菌ワクチン技術において一般的に使用される任意の抗原性糖要素(または抗原単位)を含むことを意味する。状況に応じて、Psは特異的なことも複数のこともある。
本明細書中で使用される場合、用語「多糖類」(Ps)は、限定されるわけではないが、「糖類」、「オリゴ糖」、「多糖類」、「リポ糖」、「リポオリゴ糖(LOS)」、「リポ多糖類(LPS)」、「グリコシル酸塩」、「複合糖質」などを含む、免疫学的および細菌ワクチン技術において一般的に使用される任意の抗原性糖要素(または抗原単位)を含むことを意味する。状況に応じて、Psは特異的なことも複数のこともある。
本明細書中で使用される場合、用語「含む(comprise)」は、本発明の免疫原性組成物と共に使用する場合、アジュバントおよび賦形剤のような任意の他の成分(抗原混合物に対する表現「からなる(consisting of)」によって制限されるもの)を含むことを意味する。多価多糖類-タンパク質複合体混合物と共に使用する場合、「からなる」という用語は、特定の肺炎球菌多糖類タンパク質複合体を有し、かつ異なる血清型由来の他の肺炎球菌多糖類タンパク質複合体を含まない混合物を意味する。
本明細書で定義される場合、用語「沈殿物」、「沈殿」、「粒子形成」、「混濁」、および「凝集」は、互換的に使用されることでき、多糖類-タンパク質複合体の凝集をもたらす任意の物理的相互作用または化学反応を指すことを意味する。凝集の過程(例えば、タンパク質凝集)は、熱、圧力、pH、撹拌、剪断力、凍結融解、脱水、重金属、フェノール化合物、シリコンオイル、変性剤などを含む多数の物理化学的ストレスによって誘導され得る。
本明細書中で使用される場合、用語「再構成する」または「再構成」は、乾燥した材料に液体を添加して、乾燥した材料を溶解させて、その中に材料が溶解された溶液を提供することを指す。しかしながら、再構成によって提供される溶液は、その中に溶解された物質の濃度勾配または層を有する可能性がある。したがって、再構成後、溶液を物理的に撹拌して、再構成された材料の均質な溶液を提供する。
本明細書中で使用される場合、用語「混和(mixing)」は、振る、撹拌、揺すり、回転などによる溶液の物理的撹拌を意味する。
本明細書中で用いる場合、用語「均質溶液」は、すべての成分が完全に混合されているため、溶液中の成分間に濃度勾配または層が存在しない溶液を意味する。
本明細書で使用される場合、「リオスフェア(lyospere)」は、例えば、ビーズあるいは球または他の形状の形態をとる凍結乾燥材料の別個の粒子である。リオスフェアは、リオパーティクルスフェア(lyoparticle spheron)、またはリオビーズ(lyobead)とも呼ばれることがある。いくつかの実施形態において、リオスフェアの直径は、2.5~6mmまたは2.5~5mmなどの約2~約12mm、好ましくは2~8mmである。いくつかの実施形態において、リオスフェアの容積は、約20~550μL、好ましくは20~100μL、例えば20~50μLである。リオスフェアが実質的に球形ではない実施形態では、リオスフェアのサイズは、より短い寸法に対するより長い寸法の比である、そのアスペクト比に関して記述することができる。リオスフェアのアスペクト比は0.5~2.5、好ましくは0.75~2、例えば1~1.5とすることができる。
本明細書中で使用される場合、「免疫原性組成物」は、1つ以上の担体タンパク質に結合された1つ以上の抗原を含む多価組成物であってもよい。本発明の特定の実施形態において、抗原は、莢膜を有する細菌由来の糖である。このような組成物では、糖はある種の細菌の表面に似た糖分子の長い鎖からできている。莢膜を有する細菌には、ストレプトコッカスニューモニアエ、ナイセリア髄膜炎菌およびヘモフィルス・インフルエンザb型が含まれるが、これらに限定されない。抗原は同一の生物由来であっても、異なる生物由来であってもよい。本発明の好ましい態様において、抗原は、肺炎球菌莢膜多糖類である。
本明細書中で使用される場合、用語「放射エネルギー真空(REV)脱水」は、マイクロ波減圧乾燥(MVD)をも意味する。
II. 工程
本発明は、抗肺炎球菌ワクチンとして使用され得る多価肺炎球菌多糖類タンパク質複合体を産生するための方法または工程を提供し、この方法では、様々な昇華工程を用いて、肺炎球菌多糖類および担体タンパク質の個別の(または別々の)凍結乾燥に続き、低レベルの遊離多糖類(例えば、15%未満の遊離多糖類)を有する複合体組成物の形成をもたらす条件下で、個別の凍結乾燥多糖類および担体タンパク質を混合する。
本発明は、抗肺炎球菌ワクチンとして使用され得る多価肺炎球菌多糖類タンパク質複合体を産生するための方法または工程を提供し、この方法では、様々な昇華工程を用いて、肺炎球菌多糖類および担体タンパク質の個別の(または別々の)凍結乾燥に続き、低レベルの遊離多糖類(例えば、15%未満の遊離多糖類)を有する複合体組成物の形成をもたらす条件下で、個別の凍結乾燥多糖類および担体タンパク質を混合する。
本発明は、低レベルの遊離多糖類を有する多価肺炎球菌多糖類タンパク質複合体を産生するための従来技術の方法に対する改良である。米国特許第7,709,001号および米国特許公開第20110201791号に開示されているような先行技術の方法は、担体タンパク質と多糖類の共凍結乾燥を使用するが、その理由は、多糖類と担体タンパク質の共凍結乾燥が低遊離多糖類(18%未満)を有する複合体組成物をもたらすことが示されたが、他方、別々に凍結乾燥された多糖類と担体タンパク質とを組み合わせることによって調製された複合体組成物は、米国特許公開第20110201791号明細書の表に示される結果によって示されるように、約31%の遊離多糖類を有する組成物をもたらすからである。
しかしながら、本発明の発明者らは、特定の条件下では、個別(別々)に凍結乾燥担体タンパク質および活性化多糖類を結合して、高分子量複合体を含む組成物が得られるが、米国特許公報第20110201791号とは異なり、該組成物は低レベルの遊離多糖類を含むことを見出した。これらの特定の条件には、有機溶媒中の担体タンパク質の溶液と、有機溶媒中の1つまたは複数の多糖類を含む溶液とを提供し(特定の実施態様においては該有機溶媒はジメチルスルホキシド(DMSO)である)、Tee-混合によって2つの溶液を同時に結合することが含まれる。図4に示すように、Tee-混合によって2つの溶液を同時に組み合わせると、典型的には1つの溶液を他の溶液に加えるか、または溶液中に乾燥物質を溶解することによって2つの溶液を組み合わた場合に生じる濃度勾配が実質的に減少または消失し(図1、2、または3参照)、また、実施例10の血清型19F多糖類によって例示されるように、様々な血清型から得られる多糖類についてゲル形成が減少または消失し得る。本発明は、単一組成物中における多糖類および担体タンパク質の共凍結乾燥に比較して様々な利点を提供するところ、これらには、個々の製剤およびサイクルパラメーターを最適化し得ること、便利な取り扱い、ならびに所望の溶液サイズを有する個々の多糖類および担体タンパク質調製物を産生し得ることが含まれるが、これらに限定されるものではない。
本発明者らは、さらに、モデルとしてCRM197を使用して、乾燥担体タンパク質の再構成の間において、DMSOなどの有機溶媒が乾燥担体タンパク質に添加され際の時間の長さと、次いで、再構成された担体タンパク質が結合前に保存される時間の長さが、担体タンパク質の二次構造に影響を及ぼし、よって、所望の分子量および担体タンパク質に結合した多糖類に対する担体タンパク質の所望の比率を有する複合体の収率に影響を及ぼすことを発見した。図5-11に示すように、無水DMSOなどの有機溶媒中において速い添加条件下で乾燥担体タンパク質を再構成する場合、例えば、8分以内または約2分未満で有機溶媒を乾燥担体タンパク質に添加する場合には、担体タンパク質が完全にほどけ、フーリエ変換赤外分光法(FTIR)または動的光散乱法(DLS)によって決定されるような検出可能なβシート形成がない再構成担体タンパク質溶液が提供される。さらに、有機溶媒中に検出可能な水を有する場合、および/または最終濃度で12mg/mLを超える担体タンパク質を有する場合には、βシート媒介凝集をもたらすことが発見された。したがって、本発明の好ましい実施形態では、有機溶媒は100%の有機溶媒であり、検出可能な水を含まず(例えば、無水有機溶媒)、有機溶媒は、8分未満、好ましくは5分未満、より好ましくは2分以内の時間にわたって乾燥担体タンパク質に加えられ、担体タンパク質は、濃度が10mg/mL以下または12mg/mL以下、特に実施態様では、約6mg/mLで維持される。
特定の実施形態では、乾燥担体タンパク質および多糖類の完全な溶解を保証するために、第1および第2の均質溶液を120分以内で混合してもよい。特定の実施形態では、混合は90分以内であってもよい。特定の実施形態では、混合は60分以内であってもよい。特定の実施形態では、混合は30分以内であってもよい。特定の実施形態では、混合は10分以内であってもよい。特定の実施形態において、担体タンパク質を含む第2の均質溶液は、Tee-混合によって多糖類を含む第1の均質溶液と組み合わせる前に、約6時間以下維持される。本発明者らは、担体タンパク質を無水有機溶媒中で6時間以上維持すると、担体タンパク質の検出可能なβシート媒介凝集が形成される可能性があることを発見した。したがって、特定の実施形態では、担体タンパク質はDMSO中で6時間以内で維持される。
図12は、担体タンパク質の均質溶液が本明細書に教示されるように調製され、担体タンパク質および多糖類の均質溶液が本明細書に教示されるようにTee-混合によって組み合わされる、担体タンパク質多糖類複合体を作製するための一般的なスキームを示す。
一般に、精製した肺炎球菌莢膜多糖類(Ps)粉末を別々に水に溶解し、血清型19Aを除くすべての血清型を0.45ミクロンで濾過する。血清型19Aを除くすべての血清型を均質化し、Psの分子量を減少させる。血清型18Cは90℃以上で酸加水分解によりサイズを小さくする。血清型19Aは、開始時のサイズが比較的小さいため、サイズを小さくしない。均質化圧力およびホモジナイザーを通過する数を血清型特異的な標的にコントロールして、血清型特異的な分子量を達成する。多糖類をそれぞれ0.22ミクロン濾過し、その後濃縮し、開口チャネル付き10 kD限外濾過膜(5型)を用いた限外濾過工程1で水に対して透析濾過し、透析濾過液1を製造する。
次いで、透析濾過液1を、例えば酢酸ナトリウムの緩衝液で血清型特定温度(4~22℃)およびpH (4~5)に調整して、活性化段階において、多糖類サイズ減少を最小にしてもよい。多糖類の活性化は過ヨウ素酸酸化を介して行われる。血清型4については、活性化前に、溶液を約50℃およびpH 4でインキュベートして、多糖類を部分的に脱ケタール化する。多糖類の活性化はメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加で開始される。メタ過ヨウ素酸ナトリウムの添加量は、血清型特異的であり、多糖類反復単位1mol当たりメタ過ヨウ素酸ナトリウム約0.1~0.5molの範囲である。メタ過ヨウ素酸ナトリウムの血清型特異的電荷は、多糖類活性化の目標レベル(多糖類反復単位1モル当たりのモルアルデヒド)を達成するために選択される。
限外濾過工程2では、全ての血清型について、活性化多糖類を透析濾過し、続いて、開口チャネルを有する10 kD限外濾過膜を用いて接線流限外濾過により濃縮して、透析濾過液2を産生することができる。透析濾過の終了時には、透析濾過液2を15g Ps/Lの目標値まで濃縮してもよい。好ましくは、全ての血清型に対する限外濾過は2~8℃で行う。
次に透析濾過液2をショ糖を加えた水で希釈し、最終濃度約4~12mg/mL多糖類及び0.5~6% (w/v)ショ糖とし、昇華乾燥工程を行い、最終含水率が6%以下の乾燥多糖類とする。特定の実施態様において、組成物は、約5%以下の最終水分含量を有する。特定の実施態様において、組成物は、約4%以下の最終水分含量を有する。特定の実施態様において、組成物は、約3%以下の最終水分含量を有する。特定の実施態様において、組成物は、約2%以下の最終水分含量を有する。凍結乾燥前に溶液に添加されるショ糖の量は血清型特異的であり、凍結乾燥前の3.0~5.0% (w/v)の範囲であり得る。特定の実施形態では、2つ以上の多糖類を一緒に乾燥させて、乾燥多糖類混合物を製造することができる。
精製担体タンパク質は、5kDa接線流限外濾過膜を用いてpH 7.0緩衝液、2mMリン酸塩に対して透析濾過され、次いで0.22ミクロンフィルターを通して濾過される。濾過した液をショ糖を含む水で最終濃度約6~12mg/mL担体タンパク質と4~10% (v/v)ショ糖に希釈し、1工程で昇華乾燥し、最終含水率6%以下の乾燥担体タンパク質とする。特定の実施態様において、組成物は、約5%以下の最終水分含量を有する。特定の実施態様において、組成物は、約4%以下の最終水分含量を有する。特定の実施態様において、組成物は、約3%以下の最終水分含量を有する。特定の実施態様において、組成物は、約2%以下の最終水分含量を有する。昇華乾燥工程には、凍結乾燥または放射エネルギー真空(REV)脱水が含まれ得る。
乾燥多糖類又は乾燥多糖類混合物と乾燥担体タンパク質を別々に、例えばジメチルスルホキシド(DMSO)のような有機溶媒中に溶解又は再溶解する。特定の実施形態では、担体タンパク質は、約10~20mg/mLまたは約10mg/mL以下の濃度で再構成される。本発明者らは、DMSO中の1% (v/v)以上の水分がβシートを介した凝集をもたらすことを発見した(図9参照)。したがって、本発明は、有機溶媒の水分含有量が1% (v/v)未満である実施形態、または有機溶媒が検出可能な水分を含まない実施形態、例えば、無水有機溶媒または100% (v/v)有機溶媒である実施形態を提供する。乾燥担体タンパク質に無水有機溶媒を加えて8分以内、できれば6分以内、4分以内、あるいは2分以内、あるいは1分以内で再構成する。
本発明者らはまた、乾燥担体タンパク質に無水有機溶媒を添加するための添加時間が短いほど、フーリエ変換赤外分光法(FTIR)および動的光散乱(DLS)分析に基づく不可逆βシート媒介凝集の形成が少ないことをモデルとしてCRM197を用いて発見した。図5に示すように、2分間の無水DMSO添加時間は、βシート媒介凝集の検出可能な形成をもたらさない。したがって、特定の実施態様において、本発明は、有機溶媒、例えばDMSOであって1%未満の水分を含むもの、あるいは、検出可能な水分を含まない有機溶媒、例えば無水または100%(v/v)有機溶媒中における担体タンパク質の再構成であって、該有機溶媒を乾燥担体タンパク質に2分または10分未満の時間をかけて添加して、20mg/mL以下または約12mg/mL、または約10mg/mL以下の濃度で再構成担体タンパク質を提供することを特徴とする担体タンパク質の再構成を提供する。特定の実施形態において、再構成後、混合物を30分まで混和して、担体タンパク質の均質溶液および多糖類の均質溶液を提供し得る。しかしながら、特定の実施形態では、混合は、120分以内、90分以内、60分以内、30分以内、または10分以内の時間期間にわたって起こり得る。特定の実施態様において、pH 7.2の500mMリン酸ナトリウム緩衝液を、リン酸ナトリウムの最終濃度が1.0mMになるまで、担体タンパク質を含む均質溶液に加えることでができる。
担体タンパク質の均質溶液と1つの多糖類または2つ以上の多糖類の均質溶液を、Tee-混合により組み合わせて、担体タンパク質と1つの多糖類または2つ以上の多糖類の両方を含む複合体溶液を提供する。Tee-混合速度にはばらつきがあり得るが、一般に10分以内で完全に混合する速度が設定されている。Tee-混合は、例えば室温、または4℃もしくは18℃から23℃の間の任意の温度で行うことができる。無水有機溶媒中で再構成または再溶解した後、血清型特異的な多糖類最終濃度および多糖類対担体タンパク質比を標的として、多糖類および担体タンパク質均質溶液を組み合わせる。一般に、担体タンパク質および多糖類は、約0.6~1.3(w/w)の最終的な共役多糖類:担体タンパク質比を提供する量で混合される。
複合反応を行うために、水中のシアノ水素化ホウ素ナトリウムの溶液を調製し、複合体溶液に1.0 meqのシアノ水素化ホウ素ナトリウム(多糖類反復単位のモルあたり1.0 molのシアノ水素化ホウ素ナトリウム)を添加する。シアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液のモル濃度は、複合体化反応の間における溶液の総水分量の目標量約0.5%に基づく。複合体溶液は、血清型特異的な時間、血清型特異的な温度で反応させ、担体タンパク質:多糖類複合体中間体を産生する。
次に水素化ホウ素ナトリウムの水溶液を調製し、複合体溶液に水素化ホウ素ナトリウム2.0 meq(多糖類反復単位に対する)を加える。水素化ホウ素ナトリウム溶液のモル濃度は、水素化ホウ素添加後の複合体溶液中の総水分量の目標量約1.0%に基づく。複合体溶液は常温で3時間(血清型7Fのようなある種の血清型を除き、2時間反応させる)反応させ、担体タンパク質:多糖類複合体を産生させる。
結合反応をクエンチするために、20%(v/v)以下の無水DMSOへの希釈工程において、複合体溶液を、特定の血清型由来の多糖類を含む複合体について、150mM塩化ナトリウム(0.025% (w/v)ポリソルベート20を含む150mM塩化ナトリウム)の溶液にゆっくりと添加して、クエンチされた複合体溶液を生成する。特定の実施態様において、希釈段階の間、温度は15℃以下で維持される。約1時間後、pH 6.0の1.5Mリン酸カリウム溶液を加えて、25mMリン酸カリウムとする。結合性能は、全体的な多糖類および担体タンパク質消費、複合体多糖類対担体タンパク質比、および複合体分子量によって評価され得る。
限外濾過工程3では、クエンチした複合体溶液を約2.5g/Lまで濃縮し、30kDa接線流限外濾過膜を使用して、2~8℃で約10倍量以下の150mM塩化ナトリウムまたは150mM塩化ナトリウム中の25mMリン酸カリウムに対して透析濾過して、透析濾過液3を生成することができる。限外濾過工程3からの透析濾過液3中の多糖類濃度は、高速サイズ排除クロマトグラフィー(HPSEC)紫外多角光散乱屈折率(UV‐MALS‐RI)により測定できる。血清型19Fのようないくつかの血清型由来の多糖類を含む複合体については、透析濾過液3を0.22-ミクロンフィルターで濾過して、濾液を生成し、続いて22℃で約120時間インキュベートする。
限外濾過工程4では、限外濾過工程3からの透析濾過液3又は濾過液を多糖類濃度約2.5g/Lに濃縮し、300kDaの接線流限外濾過膜を用いて、20透析容量(diavolume)の150mM塩化ナトリウム、pH 7.0、2~8℃中の10mM L-ヒスチジンに対して透析濾過して、透析濾過液4を生成させることができる。特定の血清型、例えば血清型7F由来の多糖類を含む複合体については、100kDa接線流限外濾過膜に対して複合体を透析濾過することができる;例えば、血清型6A、6B、および18C多糖類を含む複合体を、約3.5g/Lまで濃縮し、150mM塩化ナトリウムおよび0.03% (w/v)ポリソルベート20、pH 7.0を含む緩衝液に対して、300kDa接線流限外濾過膜を用いて2~8℃で透析濾過することで、透析濾過液4を生成することができる。血清型7F、19A、19Fおよび23F多糖類を含む複合体を約2.0g/Lまで濃縮し、300kDa再生セルロース接線流限外濾過膜を用いて2~8℃で150mM塩化ナトリウムおよび0.015% (w/v)ポリソルベート20、pH 7.0を含む緩衝液に対して透析濾過して、透析濾過液4を製造することができる。透析濾過液2中の多糖類濃度はHPSEC UV-MALS-RIにより測定することができる。緩衝液は、10~50mMの酢酸塩、リン酸塩、TRIS、HEPES、またはヒスチジンのようなアミノ酸緩衝液でよい。特定の実施形態では、緩衝液は10mMのL-ヒスチジンである。
限外濾過工程4からの透析濾過液4を22ミクロンフィルターで濾過することで第2の濾液を得ることができる。第2の濾液の多糖類濃度は、HPSEC UV-MALS-RIによって測定してもよい。第2の濾液の多糖類濃度が1.0g/Lを超える場合は、第2の濾液を、pH 7.0の150mM塩化ナトリウム中10mMのL-ヒスチジンで、多糖類濃度1.0g/Lに希釈してもよい。これは、単価バルク複合体中間体(Monovalent Bulk Conjugate Intermediate)(MBC)または単価の原薬を提供するものである。MBCはアリコートに分注し、-60℃~-80℃で凍結することができる。
血清型6A、6B、および18C多糖類を含む複合体についての限外濾過工程4からの透析濾過液4は、二重膜0.5/0.2ミクロンフィルターを通して濾過されて、第2の濾液を生成することができる。第2の濾液の多糖類濃度は、HPSEC UV-MALS-RIによって測定してもよい。第2の濾液の多糖類濃度が1.0g/Lを超える場合、第2の濾液を150mM塩化ナトリウム、0.03% (w/v)ポリソルベート20、pH 7.0中の10mMのL-ヒスチジンで多糖類濃度1.0g/Lに更に希釈し得る。これはMBC又は単価の原薬を提供するものである。MBCはアリコートに分注し、-60℃~-80℃で凍結することができる。
血清型7F、19A、19F、および23F多糖類を含む複合体についての透析濾過液4は、0.22-ミクロンフィルターを通して濾過されて、第2の濾液を生成することができる。第2の濾液の多糖類濃度は、HPSEC UV-MALS-RIによって測定してもよい。第2の濾液の多糖類濃度が1.0g/Lを超える場合、第2の濾液を150mM塩化ナトリウム、0.015% (w/v)ポリソルベート20、pH 7.0中の10mMのL-ヒスチジンで多糖類濃度1.0g/Lに更に希釈し得る。これはMBC又は単価の原薬を提供するものである。MBCはアリコートに分注し、-60℃~-80℃で凍結することができる。
III. 多糖類
肺炎球菌由来の莢膜多糖類は、当業者に公知の標準技術により調製することができる。例えば、多糖類は、細菌から単離することができ、既知の方法(例えば、欧州特許EP497524号およびEP497525号を参照のこと)によって、および特定の実施形態では、ホモジナイザーを使用してまたは化学的加水分解によって達成される微小流動化によって、ある程度のサイズにすることができる。1つの実施形態において、各多糖類血清型に対応する肺炎球菌株を、ダイズベースの培地中で増殖させる。次に、遠心分離、沈殿、限外濾過などの標準的な段階を経て、個々の多糖類を精製する。例えば、米国特許出願公開第2008/0286838号および米国特許第5,847,112号を参照のこと。多糖類は、粘度を低下させるため、および/または後続の複合化生成物の濾過性を改善するためにサイズを設定することができる。本発明において、莢膜多糖類は、血清型1、2、3、4、5、6A、6B、6C、6D、7B、7C、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、15C、16F、17F、18C、19A、19F、20、21、22A、22F、23A、23B、23F、24F、27、28A、31、33F、34、35A、35B、35F、および38のうちの1つ以上から調製される。
肺炎球菌由来の莢膜多糖類は、当業者に公知の標準技術により調製することができる。例えば、多糖類は、細菌から単離することができ、既知の方法(例えば、欧州特許EP497524号およびEP497525号を参照のこと)によって、および特定の実施形態では、ホモジナイザーを使用してまたは化学的加水分解によって達成される微小流動化によって、ある程度のサイズにすることができる。1つの実施形態において、各多糖類血清型に対応する肺炎球菌株を、ダイズベースの培地中で増殖させる。次に、遠心分離、沈殿、限外濾過などの標準的な段階を経て、個々の多糖類を精製する。例えば、米国特許出願公開第2008/0286838号および米国特許第5,847,112号を参照のこと。多糖類は、粘度を低下させるため、および/または後続の複合化生成物の濾過性を改善するためにサイズを設定することができる。本発明において、莢膜多糖類は、血清型1、2、3、4、5、6A、6B、6C、6D、7B、7C、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、15C、16F、17F、18C、19A、19F、20、21、22A、22F、23A、23B、23F、24F、27、28A、31、33F、34、35A、35B、35F、および38のうちの1つ以上から調製される。
IV. 担体タンパク質
本発明の特定の実施形態では、CRM197が担体タンパク質として使用される。CRM197は、ジフテリア毒素の非毒性変異体(すなわち、トキソイド)である。1つの実施形態において、カサミノ酸(casamino acids)および酵母エキスベースの培地で増殖させたCorynebacterium diphtheria株C7(β197)の培養物から単離される。別の実施形態では、CRM197は、米国特許第5,614,382号に記載された方法に従って遺伝子組み換えにより調製される。典型的には、CRM197は限外濾過、硫酸アンモニウム沈殿、イオン交換クロマトグラフィーの組み合わせによって精製される。いくつかの実施形態において、CRM197は、PFENEX EXPRESSION TECHNOLOGY (Pfenex Inc., San Diego, CA)を使用して、Pseudomonas fluorescens中で調製される。
本発明の特定の実施形態では、CRM197が担体タンパク質として使用される。CRM197は、ジフテリア毒素の非毒性変異体(すなわち、トキソイド)である。1つの実施形態において、カサミノ酸(casamino acids)および酵母エキスベースの培地で増殖させたCorynebacterium diphtheria株C7(β197)の培養物から単離される。別の実施形態では、CRM197は、米国特許第5,614,382号に記載された方法に従って遺伝子組み換えにより調製される。典型的には、CRM197は限外濾過、硫酸アンモニウム沈殿、イオン交換クロマトグラフィーの組み合わせによって精製される。いくつかの実施形態において、CRM197は、PFENEX EXPRESSION TECHNOLOGY (Pfenex Inc., San Diego, CA)を使用して、Pseudomonas fluorescens中で調製される。
他の適切な担体タンパク質には、(例えば、国際特許出願公開第WO 2004/083251号に記載されているような)コレラトキソイド、DT (ジフテリア毒素)、TT (破傷風毒素)またはTTのフラグメントC、百日咳トキソイド、大腸菌LT、大腸菌ST、および緑膿菌由来の外毒素Aのようなさらなる不活化細菌毒素が含まれる。外膜複合体c (OMPC)、ポリン、トランスフェリン結合タンパク質、肺炎球菌表面タンパク質A (PspA;国際特許出願公開公報第WO 02/091998号参照)、肺炎球菌付着タンパク質(PsaA)、A群もしくはB群連鎖球菌由来のC5aペプチダーゼ、または、インフルエンザ菌タンパク質D、dPLY-GMBS (国際特許出願公開公報第WO 04/081515号参照)またはdPLY-formolなどの何らかの方法で解毒されたply、PhtA、PhtB、PhtD、PhtEおよび例えばPhtDE融合体、PhtBE融合体(国際特許出願公開公報第01/98334号およびWO 03/54007号参照)等のPhtタンパク質の融合体を含むPhtXを含む肺炎球菌ニューモリシン(Kuoら、1995、Infect Immun 63; 2706-13)などの細菌外膜タンパク質も使用することができる。卵白アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、牛血清アルブミン(BSA)または精製ツベルクリンタンパク質(PPD)、PorB(N. meningitidis由来)、PD (インフルエンザ菌タンパク質D)(例えば、欧州特許第0594610B参照)またはそれらの免疫学的に機能的な等価物、合成ペプチド(欧州特許第0378881号およびEP0427347号参照)、熱ショックタンパク質(国際特許出願公開公報第93/17712号および94/03208号参照)、百日咳タンパク質(国際特許出願公開第98/58668号および欧州特許第EP0471177号参照)、サイトカイン、リンホカイン、成長因子またはホルモン(国際特許出願公開公報参照WO 91/01146参照)、N19タンパク質(Baraldoi et al., 2004, Infect Immun 72:4884-7を参照)などの様々な病原体由来抗原由来のヒトCD4+T細胞エピトープ(Falugi et al., 2001, Eur J Immunol 31:3816-3824を参照)を含む人工タンパク質、鉄の取り込みタンパク質(国際特許出願公開公報番号WO 01/72337参照)、C.difficileの毒素AまたはB(国際特許公開公報番号WO 00/61761参照)、およびフラゲリン(Ben-Yedidia et al., 1998, Immunol Lett 64:9参照)などの他のタンパク質も担体タンパク質として用いることができる。
他のDT突然変異、例えば、CRM176、CRM228、CRM45(Uchidaら、1973、J Biol Chem 218:3838-3844); CRM9、CRM45、CRM102、CRM103およびCRM107ならびにGenetically Enginerred Toxins(Frankel編、Maecel Dekker Inc、1992)においてNichollsおよびYouleによって記載されている他の突然変異;Glu-148の欠失またはAsp、GlnまたはSerへの突然変異および/またはAla 158の欠失またはGlyへの突然変異、および米国特許第4,709,017号または米国特許第4,950,740号に記載された他の突然変異;残基Lys 516、Lys 526、Phe 530および/またはLys 534の少なくとも1つ以上の突然変異、および米国特許第5,917,017号または米国特許第6,455,673号に開示されている他の突然変異;または米国特許第5,843,711号に開示されている断片が、使用し得る。
V. 昇華乾燥
特定の肺炎球菌血清型の多糖類を含む組成物および担体タンパク質を含む組成物は、最終含水率が6%以下の乾燥担体タンパク質を含む組成物および約6%以下の最終含水率を有する特定の肺炎球菌血清型の乾燥多糖類を含む組成物を提供するために昇華法を用いて別々に乾燥させてもよい。乾燥組成物は、例えば、凍結乾燥または放射エネルギー真空(REV)脱水(マイクロ波減圧乾燥)により調製され得る。例えば、Encyclopedia of Agriculture, Food, and Biological Engineering.. Marcel Dekker, IncまたはXu & Sunada, Chem Pharm Bull (Tokyo) 55(11):1545-50 (2007)参照。凍結乾燥製剤成分は、ケーキまたは粒子、例えば、凍結乾燥材料のペレット、ビーズまたは球体、例えば、リオスフェアの形態であってもよい。例えば、A. S. Mujumdar (2007).Handbook of Industrial Drying. CRC Press参照。
特定の肺炎球菌血清型の多糖類を含む組成物および担体タンパク質を含む組成物は、最終含水率が6%以下の乾燥担体タンパク質を含む組成物および約6%以下の最終含水率を有する特定の肺炎球菌血清型の乾燥多糖類を含む組成物を提供するために昇華法を用いて別々に乾燥させてもよい。乾燥組成物は、例えば、凍結乾燥または放射エネルギー真空(REV)脱水(マイクロ波減圧乾燥)により調製され得る。例えば、Encyclopedia of Agriculture, Food, and Biological Engineering.. Marcel Dekker, IncまたはXu & Sunada, Chem Pharm Bull (Tokyo) 55(11):1545-50 (2007)参照。凍結乾燥製剤成分は、ケーキまたは粒子、例えば、凍結乾燥材料のペレット、ビーズまたは球体、例えば、リオスフェアの形態であってもよい。例えば、A. S. Mujumdar (2007).Handbook of Industrial Drying. CRC Press参照。
リオスフェアは、例えば、液滴の形態(例えば、約20、50、100または250マイクロリットル)の1つ以上の多糖類血清型を含む水溶液のアリコートを、液滴が無傷のままであるように固体の平坦な表面上に置くことによって作製され得る。本発明の実施態様において、表面は、例えば、約-180℃~約-196℃又は約-180℃~約-273℃の温度でのプレート、例えば金属プレートである。例えば、本発明の実施形態では、水溶液は、分注チップを介して表面上に配置される。本発明の実施形態において、水溶液は、約3ml/分~約75ml/分、約5ml/分~約75ml/分;約3ml/分~約60ml/分、約20ml/分~約75ml/分;および約20ml/分~約60ml/分の分注速度で分注される。本発明の実施形態では、分注される水溶液は250マイクロリットルであり、分注速度は約5mL/分~約75mL/分であるか、またはアリコートは100マイクロリットルであり、分注速度は約3mL/分~約60mL/分である。本発明の実施形態では、分注先端と水溶液が分注される表面との間の間隙は、約0.1cm以上(例えば、約0.5cmまたは0.1cmから1cmの間、または0.1cmから0.75cmの間)である。一旦表面上に置かれると、水溶液は凍結され、次いで凍結乾燥による昇華乾燥に供される。リオスフェアを作製する方法は当該技術分野で公知である。例えば、US5656597; WO2013066769; WO2014093206; WO2015057540; WO2015057541またはWO2015057548を参照。
本発明の実施形態において、水溶液は、放射エネルギー真空(REV)脱水(マイクロ波減圧乾燥)により凍結乾燥される。REV脱水は、水の沸点や大気中の酸素含量が低い減圧下で行う乾燥法である。例えば、本発明の実施態様において、水溶液のアリコートは、固体表面上に単一の液滴として沈着し、ここで、表面の温度は、それが接触し、凍結ペレットとして表面上で凍結する際に液滴を単一の液滴として維持する方法において、約-90℃またはそれ以下であり;そして、マイクロ波放射を、大気圧以下の圧力下で凍結ペレットに適用して、球のような乾燥ペレットを生成する。別の例では、水溶液をトレイ上に提供し、大気圧以下の圧力下でマイクロ波放射にさらし、乾燥ケーキを生成する。米国特許第4,389,794号; 第4,664,924号; 第4,809,596号; 第4,882,851号参照。
VI. 多糖類-タンパク質複合
精製された多糖類は化学的に活性化され、担体タンパク質と反応できる機能が導入される。一旦活性化されると、各莢膜多糖類は、本発明の方法に従って、担体タンパク質に別々に複合化されて、複合糖質を形成する。
精製された多糖類は化学的に活性化され、担体タンパク質と反応できる機能が導入される。一旦活性化されると、各莢膜多糖類は、本発明の方法に従って、担体タンパク質に別々に複合化されて、複合糖質を形成する。
1つの実施形態において、多糖類の化学的活性化は、米国特許第4,365,170号; 第4,673,574号;および第4,902,506号に記載された手段によって達成され得る。簡単に述べると、肺炎球菌多糖類を酸化剤、例えば過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸カリウム、または過ヨウ素酸などの過ヨウ素酸塩ベースの酸化剤と反応させ、その結果、隣接ヒドロキシル基がランダムに酸化的に切断されて反応性アルデヒド基が生成される。
酸化された多糖類のタンパク質担体上の第1級アミン基(主にリシン残基)への直接的なアミノカップリングは、還元的アミノ化によって行われることがある。例えば、結合は水溶液中で、またはジメチルスルホキシド(DMSO)のような有機溶媒中で行うことができる。例えば、US2015/0231270 A1、EP 471 177 B1、US2011/0195086 A1を参照。結合反応の結果、未反応のアルデヒドは水素化ホウ素ナトリウムのような強力な還元剤の付加によってキャップされている。
1つの実施形態において、多糖類の化学的活性化およびその後の担体タンパク質への結合は、米国特許第4,365,170号, 第4,673,574号および第4,902,506号に記載された手段によって達成される。簡潔に言うと、多糖類は過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸カリウム、または過ヨウ素酸のような過ヨウ素酸塩ベースの酸化剤と反応し、その結果隣接ヒドロキシル基がランダムに酸化的に開裂して反応性アルデヒド基を生成する。次いで、酸化された多糖類のタンパク質担体上の第1級アミン基(主にリジン残基)への直接アミノ化カップリングは、還元的アミノ化によって達成され得る。例えば、複合体化は、ニッケルの存在下で、活性化多糖類および担体タンパク質の混合物を、シアノ水素化ホウ素ナトリウムなどの還元剤と反応させることによって実施される。結合反応は水溶液中またはジメチルスルホキシド(DMSO)などの有機溶媒中で行われる。例えば、US2015/0231270 A1、EP 471 177 B1、US2011/0195086 A1を参照。結合反応の結果、未反応のアルデヒドは、水素化ホウ素ナトリウムのような強力な還元剤の添加によって任意に還元される。
1つの実施形態において、製剤化の前に、各肺炎球菌莢膜多糖類を肺炎球菌から個別に精製し、活性化して反応性アルデヒドを形成し、次いでニッケルの存在下でシアノ水素化ホウ素ナトリウムによる還元アミノ化を用いて担体タンパク質に共有結合させる。ニッケルは、還元アミノ化に用いられるシアノ水素化ホウ素ナトリウム還元剤からの残留、妨害シアン化物と複合体を形成する。したがって、ニッケルは、より大きな結合反応効率のために、および遊離シアン化物除去を助けるために、本明細書の方法において使用され得る。
遷移金属はシアン化物と安定な錯体を形成することが知られており、タンパク質アミノ基およびホルムアルデヒドのシアノ水素化ホウ素ナトリウムによる還元メチル化を改善することが知られている。Gidley et al., Biochem J. 1982, 203: 331-334; Jentoft et al. Anal Biochem.1980, 106: 186-190参照。しかしながら、本発明者は驚くべきことに、ニッケルの添加は、残留した干渉シアン化物を錯体化することによって、複合化反応時におけるタンパク質の消費を促進し、より大きく、潜在的により免疫原性の高い複合体の形成をもたらすことを見出した。
市販のシアノ水素化ホウ素ナトリウム試薬ロット中の遊離シアン化物レベルのばらつきは、結合性能の不一致につながり、その結果、分子量および多糖類対タンパク質比を含む様々な結合特性をもたらす可能性がある。結合反応へのニッケルの添加は、遊離シアン化物のレベルを減少させ、したがって、ロット間の結合一貫性の程度を改善する。
別の実施形態では、結合方法は、シアネートエステルを形成するために、1-シアノ-4-ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート(CDAP)による多糖類の活性化を使用し得る。活性化された糖は担体タンパク質上のアミノ基と直接結合していることもある。
代替の実施形態において、反応型ホモバイファンクショナルまたはヘテロバイファンクショナルな基は、いくつかの入手可能なモダリティ(modalities)のいずれかと反応することにより、活性化された多糖類上に導入されるであろう。例えば、マレイミド活性化担体タンパク質(例えば、GMBSを用いる)またはハロアセチル化担体タンパク質(例えば、ヨードアセチミド[例えば、エチルヨードアセチミドHCl]もしくはN-スクシンイミジルブロモアセテートもしくはSIAB、またはSIA、またはSBAPを用いる)との反応後に得られるチオエーテル結合を介して担体にカップリングされ得るチオール化多糖類を調製するために、シスタミンまたはシステアミンを使用してもよい。このような複合体は、国際特許出願公開公報WO 93/15760、WO 95/08348およびWO 96/29094;ならびにChuら、1983、Infect.Immunity 40:245-256に記載されている。
他の適当な結合法は、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、p-ニトロ安息香酸、N-ヒドロキシコハク酸イミド、S--NHS、EDC、および/またはTSTUを用いる。多くは、国際特許出願公開WO98/42721号に記載されている。結合には、糖の遊離ヒドロキシル基とCDIとの反応(Bethellら、1979, J. Biol. Chem.254:2572-4; Hearnら、1981, J. Chromatogr.218:509-18参照)とそれに続く担体タンパク質との反応によってカルバメート結合を形成することによって得られるカルボニルリンカーが含まれ得る。この化学反応は、炭水化物のアノマー末端を還元して第1級ヒドロキシル基を形成し、続いて第1級ヒドロキシルをCDIと反応させてカルバメート中間体を形成し、続いてタンパク質担体アミノ基とカップリングすることからなる。この反応には、糖上の他の第1級ヒドロキシル基の任意の保護/脱保護が必要な場合がある。
以下の実施例は、本発明のさらなる理解を促進することを意図している。
実施例1
肺炎球菌莢膜多糖類6A、6B、7F、18C、19A、19F、23Fの調製
肺炎球菌を培養する方法は、当技術分野ではよく知られている。例えば、Chase, 1967, Methods of Immunology and Immunochemistry 1:52を参照のこと。肺炎球菌莢膜多糖類を調製する方法も当技術分野では周知である。例えば、欧州特許第EP0497524号参照。肺炎球菌サブタイプの分離株はAmerican Type Culture Collection(Manassas,VA)から入手可能である。この細菌は、血液寒天培地上でα溶血性を示す、莢膜を有する非運動性のグラム陽性、ランセット形の双球菌と同定される。サブタイプは、特異的抗血清を用いたQuelling反応に基づいて鑑別できる。米国特許第5,847,112号参照。
肺炎球菌莢膜多糖類6A、6B、7F、18C、19A、19F、23Fの調製
肺炎球菌を培養する方法は、当技術分野ではよく知られている。例えば、Chase, 1967, Methods of Immunology and Immunochemistry 1:52を参照のこと。肺炎球菌莢膜多糖類を調製する方法も当技術分野では周知である。例えば、欧州特許第EP0497524号参照。肺炎球菌サブタイプの分離株はAmerican Type Culture Collection(Manassas,VA)から入手可能である。この細菌は、血液寒天培地上でα溶血性を示す、莢膜を有する非運動性のグラム陽性、ランセット形の双球菌と同定される。サブタイプは、特異的抗血清を用いたQuelling反応に基づいて鑑別できる。米国特許第5,847,112号参照。
存在する肺炎レンサ球菌血清型のそれぞれを代表する細胞バンクは、Merck Culture Collection (Rahway, NJ)から凍結バイアルで入手する。肺炎球菌に適した滅菌前の増殖培地を入れた種子発酵槽に、解凍した種子培養液を移す。培養は温度とpH制御で種子発酵槽内で増殖させる。種子発酵槽の全容量を、あらかじめ滅菌した増殖培地を含む生産用発酵槽に移す。生産発酵は、工程の最終的な細胞増殖段階である。温度、pH、攪拌速度をコントロールする。
発酵工程は不活化剤の添加により終了する。不活化後、溶液を不活化槽に移し、そこで制御された温度および撹拌で保持する。細胞の破片は遠心と濾過を組み合わせて取り除く。溶液を限外濾過し、透析濾過する。次に、不純物を除去し、多糖類を回収する溶媒ベースの分画にこの溶液をさらす。
実施例2
多糖類のサイズ縮小と活性化は以下のように行われる。
精製した肺炎球菌莢膜多糖類(Ps)粉末約6gを、室温で目標濃度約4g/Lになるように注射用水(WFI)に溶解する。次いで、この溶液を0.45ミクロン濾過し、生物汚染度を減少させる。濾過したPs溶液のPs濃度はHPSEC UV-MALS-RIで測定する。
多糖類のサイズ縮小と活性化は以下のように行われる。
精製した肺炎球菌莢膜多糖類(Ps)粉末約6gを、室温で目標濃度約4g/Lになるように注射用水(WFI)に溶解する。次いで、この溶液を0.45ミクロン濾過し、生物汚染度を減少させる。濾過したPs溶液のPs濃度はHPSEC UV-MALS-RIで測定する。
血清型18Cおよび19Aを除くすべての血清型について、溶液を約2.5g/Lに希釈した後、GEA-Niro Soavi Panda 2Kホモジナイザーを用いてPsの分子量を減少させるためにホモジナイズする。血清型19Aを除くすべての血清型をホモジナイズし、多糖類の分子量を減少させた。血清型19Aは、開始時のサイズが比較的小さいためサイズが小さくならなかった。均質化圧力およびホモジナイザーの通過回数を血清型特異的標的(150~1000bar; 4~7pass)にコントロールし、血清型特異的分子量を達成した。サイズ減少多糖類を0.2ミクロン濾過し、次いで濃縮し、10kDaのNMWCO接線流限外濾過膜を用いて水に対して透析濾過した。ホモジナイザーの出口の熱交換器への冷却水供給を用いて、ホモジナイゼーション中に温度を制御する。
血清型18C Psの分子量を減少させるために、ホモジナイゼーションの代わりに酸加水分解を用いる。濾過した血清型18C Ps 液の温度をLot A では約96℃、Lot B では約90℃に上昇させた後、氷酢酸(17.4 M)で最終濃度0.2 M となるように調整し、Lot A では約180 分、Lot B では約160 分間保持し、最終濃度0.46 M にpH 7.0 の1.5 M リン酸カリウムを加え、pH を上昇させて酸加水分解を停止した後、室温に冷却する。
血清型19Aは0.45ミクロンの濾過およびサイズ縮小されていない。比較的開始サイズが小さいため、サイズ縮小は必要ない。溶解後、次段落で述べるように血清型19Aは0.22ミクロン濾過される。
次いで、限外濾過工程1の前に各溶液を0.22ミクロンフィルターを用いて濾過し、生物汚染度を減少させる。濾過されたPsは10kDaのNMWCO接線流限外濾過膜を用いて約10g/Lに濃縮され、その後常温で6浸透圧のWFIに対して透析濾過され、限外濾過工程1中間体(UF1‐FR)が生成される。血清型18Cは、10kDaのNMWCO膜の代わりに5kDaのNMWCO膜を用いて、酸加水分解により生成される低分子量Pを保持することによりPs回収を改善した。UF1-FRのPs濃度はHPSEC UV-MALS-RIにより測定される。WFIをUF1-FRに添加し、Ps活性化前のPs濃度が約10g/Lになるようにする。
次に2M酢酸ナトリウム緩衝液を加え、活性化反応段階のpHを制御する。酢酸ナトリウム濃度とpH、Ps活性化反応中の温度は、各血清型に特異的な値にコントロールされている(表2)。
過ヨウ素酸塩の活性化は、PnPs反復単位(RU)1mol当たりの過ヨウ素酸モル数に基づいて100mMのメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液を溶液に加えることによって開始される。活性化の間、隣接ジオールは血清型特異的反応時間にわたって反応性アルデヒドに酸化される。この反応は活性化産物(AP)過程中間体を生成した。メタ過ヨウ素酸ナトリウムの荷電量と反応時間は、各血清型に特異的な値にコントロールされている(表1)。
Ps活性化に続いて、溶液をpH 6.4の10mMリン酸カリウムの6透析容量に対して透析濾過し、続いて2~8℃で10kDa NMWCO接線流限外濾過膜を用いてWFIの6浸透容量に対して透析濾過を行う。血清型18Cは、10kDaのNMWCO膜の代わりに5kDaのNMWCO膜を用いて、酸加水分解により生成される低分子量Psを保持することによりPs回収を改善した。次に溶液を濃縮し、限外濾過工程2中間体(UF2-FR)を生成する。UF2-FRのPs濃度はHPSEC UV-MALS-RIにより測定される。活性化の程度は、UF2-FR試料をチオセミカルバジドで誘導体化し、次にHPSECによりチオセミカルバゾンをUV検出して測定する。
実施例3
CRM197担体タンパク質の調製は、以下のようにして行うことができる。
CRM197担体タンパク質の調製は、以下のようにして行うことができる。
前述のシュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)(国際特許出願公開第2012/173876号参照)における発現を通して得られた凍結精製CRM197は、5kDaのNMWCO接線流限外濾過膜を用いて、10透析容量の2mMリン酸塩、pH 7.2緩衝液に対して透析濾過され、0.22ミクロン濾過される。特定の実施態様において、5mMリン酸カリウム、pH 6.4(5mMリン酸ナトリウム、pH 7.0)を血清型18Cのために使用する。透析濾過液をショ糖水中で最終濃度1.0~5.3% (w/v)に希釈し、凍結乾燥して最終含水率6%以下の乾燥CRM197とする。下記の表2は、特定の血清型多糖類に対する結合のためのCRM197についての代表的なショ糖濃度を提供する。
実施例4
多糖類(Ps)及びCRM197(Pr)の凍結乾燥は次のとおりである。
多糖類(Ps)及びCRM197(Pr)の凍結乾燥は次のとおりである。
凍結乾燥に先立ち、CRM197およびPs溶液を以下のように希釈する。
いくつかの実施形態において、CRM197溶液は、WFI、5mMリン酸ナトリウム、pH 6.4(血清型18CについてはpH 7.0)、およびWFIにおける新しく調製された30% (w/v)ショ糖溶液を用いて6.0mg/mLのタンパク質濃度に希釈される。UF2-FR Ps溶液をWFIおよびWFI中で新たに調製した30% w/vショ糖溶液を用いてPs濃度6.0mg/mLに希釈する。
いくつかの実施形態において、CRM197溶液は、WFI、pH 7.2の2mMリン酸ナトリウム、およびWFIにおける新たに調製された50% (w/v)ショ糖溶液を用いて6.0mg/mLのタンパク質濃度に希釈される。UF2-FR Ps溶液をWFIおよびWFI中で新たに調製した50% (w/v)ショ糖溶液を用いてPs濃度6.0mg/mLに希釈する。
血清型特異的なショ糖およびリン酸濃度を用いる(例、表2参照)。希釈したCRM197およびUF2-FR溶液をVirtis Genesis Freeze Dryerを用いて凍結乾燥する。
実施例5
この例は、無水DMSO中のCRM197の再構成時間がフーリエ移動赤外分光法(FTIR)で測定した二次構造に影響することを示す。
この例は、無水DMSO中のCRM197の再構成時間がフーリエ移動赤外分光法(FTIR)で測定した二次構造に影響することを示す。
6mg/mL、5% (w/v)ショ糖、1.25mMリン酸ナトリウム、pH 7.2で凍結乾燥した凍結乾燥CRM197を、DMSO(Sigma-Aldrich社製無水DMSO、27655~100mL)に溶解し、10mg/mLの最終濃度に、ゆっくり(8分間)または高速再構成(2分間)のいずれかを用いて溶解した後、混合して均質溶液を調製する。再構成は、時点に達するまで30秒ごとに適切な量のDMSOを加えて行う。FTIRスペクトルは、50mmのCaF2窓を有する透過モードを用いて、制御温度(25℃)でBioTools PROTA-3Sで収集される。50のスキャンを4cm-1の分解能で収集し、平均し、緩衝液を減算し、水蒸気を補正する。
凍結乾燥したCRM197を無水DMSO中に迅速に添加(2分)して再構成を行ったところ、1660cm-1に予想される非結合カルボニルアミドIピークを示し、無水DMSOでCRM197が完全に展開したことが実証された(図5)。CRM197を遅い添加速度(8分)で無水DMSOで再構成した場合、I領域の2番目のピーク(1626cm-1)が存在する。この第2ピークは分子間βシート形成に起因する。
実施例6
この実施例は、中間溶解時間(4分間)で再構成し、300分まで保持するCRM197が、保持時間が長くなるにつれて分子間βシートの割合の増加につながることを示している。
この実施例は、中間溶解時間(4分間)で再構成し、300分まで保持するCRM197が、保持時間が長くなるにつれて分子間βシートの割合の増加につながることを示している。
6mg/mL、5% (w/v)ショ糖、1.25mMリン酸ナトリウム、pH 7.2で凍結乾燥した凍結乾燥CRM197を、DMSO(Sigma-Aldrich社製無水DMSO、27655-100mL)に溶解し、4分間かけて最終濃度10mg/mLとする。再構成は、時点に達するまで30秒ごとに適切な量のDMSOを加えて行う。最初の時点(T0)を採取した後、試料をFTIRに保持し、さらなる時点を採取する(30、60、120,180、240、300分)。FTIRスペクトルは、50mmのCaF2窓を有する透過モードを用いて、制御温度(25℃)でBioTools PROTA-3Sで収集される。50のスキャンを4cm-1の分解能で収集し、平均し、緩衝液を減算し、水蒸気を補正する。
CRM197を無水DMSO中で中間時間(4分)で再構成すると、分子間βシートアミドIピークの存在で示されるように、タンパク質凝集が起こる(図6)。最大300分までの保持時間が長くなると、分子間βシートの量が比例的に増加し、非結合カルボニルアミドIピークの量が減少する(図6)。
実施例7
この例は、分子間βシートの形成が濃度依存性であることを示している。
この例は、分子間βシートの形成が濃度依存性であることを示している。
6mg/mL、5% (w/v)ショ糖、1.25mMリン酸ナトリウム、pH 7.2で凍結乾燥した凍結乾燥CRM197を、DMSO (無水DMSOはSigma-Aldrich社製、27655-100mL)に溶解し、最終濃度を10、30、50mg/mLとし、2分間かけて溶解する。再構成は、時点に達するまで30秒ごとに適切な量のDMSOを加えて行う。FTIRスペクトルは、50mmのCaF2窓を有する透過モードを用いて、制御温度(25℃)でBioTools PROTA-3Sで収集される。50のスキャンを4cm-1の分解能で収集し、平均し、緩衝液を減算し、水蒸気を補正する。ダイナミック光散布(DLS)測定は、1.996cPの粘度を用いて調製された濃度で、管理温度(25℃)でMalvern Zetasizer ZSで収集される。
CRM197を10mg/mLで速やかに再構成すると(図7、分2)、分子間βシート形成の証拠は認められず、これまでの観察結果が確認されている(図5)。より高濃度(30mg/mL,50mg/mL)では、再構成時間が速くても(2分)、分子間βシートが形成される。これは、緩慢な再構成中に存在するCRM197濃度の増加が分子間βシートの形成の原因の一つであるという仮説を支持する。また、この濃度仮説を支持するのはDLSデータであり、CRM197では、より高い濃度で再構成された粒子の割合が、より低い濃度(図8A)と比較して増加したことが示されており、タンパク質凝集と一致している(図8B)。
実施例8
CRM197の再構成に用いるDMSO中の水の濃度を上げると、分子間βシートの形成が増加する。
CRM197の再構成に用いるDMSO中の水の濃度を上げると、分子間βシートの形成が増加する。
6mg/mL、5% (w/v)ショ糖、1.25mMリン酸ナトリウム、pH 7.2で凍結乾燥した凍結乾燥CRM197を、DMSO (無水DMSOはSigma-Aldrich社製、27655-100mL)に溶解し、DMSO/水中で95%、97%、99% (v/v)または無水DMSO中で、2分間かけて最終濃度10mg/mLに戻す。無水DMSOはSigma-Aldrich D2438-50mLでよい。再構成は、時点に達するまで30秒ごとに適切な量のDMSOを加えて行う。FTIRスペクトルは、50mmのCaF2窓を有する透過モードを用いて、制御温度(25℃)でBioTools PROTA-3Sで収集される。分解能4cm‐1、平均、緩衝液減算、水蒸気補正で50回のスキャンを収集する。
CRM197を無水DMSO中で10mg/mLで速やかに再構成すると(図9)、分子間βシート形成の証拠はなく、これまでの観察結果が確認されている(図5、図7)。ごく少量の水(99% DMSO/水)は分子間βシートの小さな肩を示し、その量は水の増加とともに増加する(97%,95% DMSO/水)。これは、再構成中の水分量の増加が分子間ベータシートの量の増加につながるという仮説を支持する。
実施例9
凍結乾燥CRM197中の水分レベルを低下させても、遅い再構成に対する感度は低下しない。
凍結乾燥CRM197中の水分レベルを低下させても、遅い再構成に対する感度は低下しない。
CRM197は、ケーキに存在する水分を減らす方法で凍結乾燥される(より長い乾燥サイクル、より低い充填量)(pH 7.2の1.25mMリン酸塩で1% (w/v)ショ糖中約6mg/mL)。凍結乾燥したCRM197をDMSO(例えば、Sigma-Aldrich由来の無水DMSO D2438-50mL)で2~8分間かけて最終濃度10mg/mLに溶解し、適量のDMSOを30秒ごとに、その時点に達するまで添加して再構成する。FTIRスペクトルは、50mmのCaF2窓を有する透過モードを用いて、制御温度(25℃)でBioTools PROTA-3Sで収集される。分解能4cm-1、平均、緩衝液減算、水蒸気補正で50回のスキャンを収集する。
CRM197のDMSO再構成における水分の増加は、分子間βシート形成の割合の増加につながる(図9)。湿分を減らす方法で凍結乾燥したCRM197を、速い(2分)と遅い(8分)の2つの異なる速度で無水DMSO中に再構成する。凍結乾燥CRM197の水分含量の低下は、分子間βシートの形成の再構成時間に対する感度を低下させない(図10)。
実施例10
複合体の調製において、凍結乾燥多糖類(Ps)および凍結乾燥CRM197タンパク質(Pr)を、上記のように無水DMSOにそれぞれ別々に溶解する。次に、PsとPrの比(Ps:Pr)および最終Ps濃度を標的として、これら2つの溶液を一緒にする。このPs:Pr複合体溶液にシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加し、その溶液を適当な反応時間に必要な結合温度でインキュベートする。いずれもPrに結合されているPs血清型に特異的である。得られた複合体サイズはPs濃度により有意に影響されることが示されている。
複合体の調製において、凍結乾燥多糖類(Ps)および凍結乾燥CRM197タンパク質(Pr)を、上記のように無水DMSOにそれぞれ別々に溶解する。次に、PsとPrの比(Ps:Pr)および最終Ps濃度を標的として、これら2つの溶液を一緒にする。このPs:Pr複合体溶液にシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加し、その溶液を適当な反応時間に必要な結合温度でインキュベートする。いずれもPrに結合されているPs血清型に特異的である。得られた複合体サイズはPs濃度により有意に影響されることが示されている。
複合成分(PsとPr)を組み合わせる方法はいくつかある。図1-4は、いくつかの組合せ戦略および成分が一緒に結合されている間の成分濃度とPs:Prに及ぼすそれらの効果を詳細に示す。PrをPs溶液(図1)に加えたり、Pr溶液(図2)にPsを加えたりすると、もう一方の成分ともう一方の成分を含む溶液に加えようとしている成分の濃度はともに経時的に変化し、特に2つの溶液の境界面で変化する。濃度の経時的変化は、添加過程におけるPs濃度およびPs:Pr比の変化をもたらし、複合体サイズに影響を及ぼす。凍結乾燥したPsをPr溶液に溶解すると(図3)、粉末と液体の界面でのPs濃度とPs:Pr比は高く始まり(Psの溶解限界で)、その後、多糖類が溶解するにつれて目標値に低下する。
しかし、Tee-混合によって2つの成分を別々の複合化容器に同時に加えると(図4)、この濃度勾配が除去され、2つの成分の比は添加を通して一定に保たれ、複合体サイズへの潜在的な影響は著しく減少する。チャンバー(Tee-混合)内の2つの構成要素を組み合わせるためのポンプの使用は、同時移送の他のモードと比較して、高いレベルの制御とスケーラビリティを提供する。
血清型19Fのいくつかの開発用溶液では、表3にまとめたように、複合中に粘性のゲルが形成され、ゲル形成は、大きな、高度にネットワーク化された複合体の形成を示す。これらの溶液では、高いPs濃度が結合の標的となる。ゲル化した溶液では、乾燥したPsをPr溶液に溶解するか、またはPr溶液にPs溶液を加える。これらの組み合わせ戦略はともに、高い初期Ps濃度とPs:Prを伴う添加中のPs濃度勾配を示す(図1と図3)。濃度勾配がないロット(図4)と、初期のPs濃度とPs:Pr比が低い濃度勾配(図2)を有するロットのどちらもゲル形成を示さなかった。このことは、高いPs濃度とPs:Pr比が粘性ゲルの形成をもたらす非常に大きな複合体を生成できるという仮説を支持する。
実施例11
凍結乾燥したPsと凍結乾燥したCRM197(Pr)を等容量の無水DMSOを用いて常温で再溶解し、Ps均質溶液とPr均質溶液とする。CRM197を2分の速い速度で再溶解する。いくつかの実施形態において、500mMリン酸ナトリウム、pH 7.2緩衝液は、DMSO再溶解タンパク質溶液中に、1.0mMリン酸ナトリウムの最終濃度までスパイクされる。DMSOで再溶解した後、血清型特異的な最終Ps濃度及びPs:CRM197比を目標に、上記のとおりTee-混合によりPsとCRM197溶液を混合する(表4)。
凍結乾燥したPsと凍結乾燥したCRM197(Pr)を等容量の無水DMSOを用いて常温で再溶解し、Ps均質溶液とPr均質溶液とする。CRM197を2分の速い速度で再溶解する。いくつかの実施形態において、500mMリン酸ナトリウム、pH 7.2緩衝液は、DMSO再溶解タンパク質溶液中に、1.0mMリン酸ナトリウムの最終濃度までスパイクされる。DMSOで再溶解した後、血清型特異的な最終Ps濃度及びPs:CRM197比を目標に、上記のとおりTee-混合によりPsとCRM197溶液を混合する(表4)。
WFI中のシアノ水素化ホウ素ナトリウムの溶液を調製し、この溶液に1.0 meqのシアノ水素化ホウ素ナトリウム(Ps反復単位のモルあたり1.0moleのシアノ水素化ホウ素ナトリウム)を加える。シアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液のモル濃度(表4)は、共役時の溶液の全水分量の約0.5%を目標とする。血清型特異的持続時間について血清型特異的温度で溶液を反応させ(表4)、結合型生成物中間体(CP)を生成する。
水素化ホウ素ナトリウムのWFI溶液を調製し、この液に水素化ホウ素ナトリウム2.0 meq(Ps反復単位に対する)を加える。水素化ホウ素ナトリウム溶液のモル濃度(表4)は、水素化ホウ素添加後の溶液中の全水分量の約1.0%を目標とする。この溶液を常温で2~3時間反応させ、共役生成物クエンチ中間体(CPQ)を生成させる。
次に、複合体溶液を150mM塩化ナトリウム(いくつかの実施形態では、0.025% w/vポリソルベート20を有する150mM塩化ナトリウム)に徐々に溶液を加えることによって、20%以下(v/v)の無水DMSOに希釈する。希釈段階中、溶液温度を15℃未満に維持する。約1時間後、pH 6.0の1.5Mリン酸カリウムを加えて25mMリン酸カリウムとする。結合能は、全体のPsおよびCRM197消費、Ps対CRM197結合比、および複合体分子量によって評価される。
コンジュゲーション溶液を約2.5g/Lまで濃縮し、30kDa NMWCO接線流限外濾過膜を用いて、150mM塩化ナトリウム中の150mM塩化ナトリウムまたは25mMリン酸カリウム10透析容量に対して2~8℃で透析濾過する。これにより限外濾過-3工程中間体(UF3-FR)が作製された。UF3-FRのPs濃度はHPSEC UV-MALS-RIにより測定される。
いくつかの実施形態において19Fについて、UF3-FRは0.22-ミクロン濾過され、続いて22℃で約120時間インキュベートされる。
UF3-FR溶液は、次いで限外濾過-4工程で処理する。一部の実施例における限外濾過-4工程では、溶液は、300kDa NMWCO Biomax PES接近流超透過膜を用いて、塩化ナトリウム150mM、pH 7.0、2~8℃で10mL-ヒスチジンの20透析容量に対して、約2.5g/LのPs濃度に濃縮し、透析濾過される。血清型7Fは、限外濾過-4工程において100kDaのNMWCO膜を用いた。血清型6A、6B、および18Cについては、UF3-FR溶液を約3.5g/Lまで濃縮し、300kDa NMWCO Biomax PES接線流限外濾過膜を用いて、150mM塩化ナトリウム、0.03% w/v PS-20、pH 7.0、2~8℃で10mM L-ヒスチジンに対して透析濾過する。いくつかの実施形態において、血清型7F、19A、19Fおよび23F UF3-FR溶液を約2.0g/Lまで濃縮し、300kDa NMWCO UltraCel、再生セルロース、接線流限外濾過膜を用いて、150mM塩化ナトリウム中10mM L-ヒスチジン、0.015% w/v PS-20、2~8℃でpH 7.0に対して透析濾過する。これにより限外濾過-4工程中間体(UF4-FR)が調製された。UF4-FRのPs濃度はHPSEC UV-MALS-RIにより測定される。
UF4-FRはPVDFフィルターを通して0.22ミクロン濾過される。濾液のPs濃度はHPSEC UV-MALS-RIにより測定する。濾液のPs濃度が1.0g/Lを超える場合は、濾液をpH 7.0の150mM塩化ナトリウム中10mM L-ヒスチジンで希釈し、Ps濃度1.0g/Lにする。これにより単価バルク複合体中間体(MBC)が作製された。MBCをアリコートに分注し、-60℃~-80℃で凍結する。
血清型6A、6B、18CのUF4-FRは、デュアルメンブレンPESフィルターで0.5/0.2-ミクロン濾過する。濾液のPs濃度はHPSEC UV-MALS-RIにより測定する。濾液のPs濃度が1.0g/Lを超える場合、濾液を、10mMのL-ヒスチジンを含む150mM塩化ナトリウム、0.03% w/v PS-20、pH 7.0で、Ps濃度1.0g/Lに希釈する。これにより単価バルク複合体中間体(MBC)が作製された。MBCをアリコートに分注し、-60℃~-80℃で凍結する。
血清型7F、19A、19F、および23FのUF4-FRは、PVDFフィルターを介して0.22ミクロン濾過される。濾液のPs濃度はHPSEC UV-MALS-RIにより測定する。濾液のPs濃度が1.0g/Lを超える場合、濾液をPs濃度1.0g/Lに希釈し、更に10mMのL-ヒスチジンを150mM塩化ナトリウム、0.015% w/v PS-20、pH 7.0に加える。これにより単価バルク複合体中間体(MBC)が作製された。MBCをアリコートに分注し、-60℃~-80℃で凍結する。
実施例12
CRM197を無水DMSO中でゆっくり(8分)再構成し、続いて6B多糖類に結合させると、結合後に分子間βシートが存在する。
CRM197を無水DMSO中でゆっくり(8分)再構成し、続いて6B多糖類に結合させると、結合後に分子間βシートが存在する。
CRM197を速く(2分間)または遅く(8分間)DMSOで再構成し、先に述べたように精製し、約1mg/mLの濃度(10mMヒスチジン、150mM NaCl pH7)になるように透析濾過する。次に、FTIR測定を可能にするために、サンプルをAmicon Ultra 11K MWCOフィルターで濃縮する。FTIRスペクトルは、50mmのCaF2窓を持つ伝送モードを用いて制御温度(25℃)でBioTools PROTA‐3Sで収集する。分解能4cm-1、平均、緩衝液減算、水蒸気補正で50回のスキャンを収集する。その後、Omicソフトウェア(ThermoFisher)を用いてデータを分析する。
DMSO中でゆっくりと再構成されたCRM197とのCRM197-6B複合体(図11)は、分子間βシート形成の証拠を示し、CRM197の凝集が再構成後でも存在することを実証する。速く再構成されたCRM197を用いて作られたCRM197-6B複合体(図11)は、期待される非結合C=Oアミドを示し、明らかなβシート形成を示さない。
実施例13
この実施例は、無水DMSO中での還元アミノ化(Pr)を使用した、血清型1、2、3、4、5、6A、6B、6C、6D、7B、7C、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、15C、16F、17F、18C、19A、19F、20、21、22A、22F、23A、23B、23F、24F、27、28A、31、33F、34、35A、35B、35F、または38由来のPのCRM197(Pr)への結合のための方法を示す。異なる血清型多糖類は、共通の工程フローを用いて、精製CRM197担体タンパク質に個別に結合される。
この実施例は、無水DMSO中での還元アミノ化(Pr)を使用した、血清型1、2、3、4、5、6A、6B、6C、6D、7B、7C、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、15C、16F、17F、18C、19A、19F、20、21、22A、22F、23A、23B、23F、24F、27、28A、31、33F、34、35A、35B、35F、または38由来のPのCRM197(Pr)への結合のための方法を示す。異なる血清型多糖類は、共通の工程フローを用いて、精製CRM197担体タンパク質に個別に結合される。
先に記載したように調製した乾燥CRM197を、乾燥CRM197に無水DMSOを2分間かけて速やかに加えて無水DMSO中に再構成し、Pを無水DMSO中にそれぞれ別々に再構成してPr均質溶液およびPs均質溶液とする。PsとPrはそれぞれ全結合反応体積の半分に再構成される。したがって、DMSO再構成後のPs濃度は、表3から算出した結合反応中のPs濃度の範囲2.2~7.6g/Lの2倍である。DMSO再構成後のPr濃度は2x(結合反応中のPs濃度/Ps:Pr比)範囲1.5~5.7g/Lである。次にPr均質溶液とPs均質溶液をTee-混合により一緒にする。次いで、シアノ水素化ホウ素ナトリウム(多糖類反復単位1モル当たり1モル)を混合物に加え、結合を血清型特異的な持続時間(1~48時間)にわたって進め、目標とする複合体サイズを得る。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
結合反応および溶液に続いて水素化ホウ素ナトリウム(多糖類反復単位1mol当たり2mol)を加え、22℃で1時間インキュベートする。この溶液を、約4℃で、150mM塩化ナトリウム、0.025%(w/v)ポリソルベート20中に希釈する。次にリン酸カリウム緩衝液を加えてpHを中和する。この溶液を濃縮し、10kDa NMWCO接線流限外濾過膜を用いて、150mM塩化ナトリウムに対して約4℃で透析濾過する。
結合反応および溶液に続いて水素化ホウ素ナトリウム(多糖類反復単位1mol当たり2mol)を加え、22℃で1時間インキュベートする。この溶液を、約4℃で、150mM塩化ナトリウム、0.025%(w/v)ポリソルベート20中に希釈する。次にリン酸カリウム緩衝液を加えてpHを中和する。この溶液を濃縮し、10kDa NMWCO接線流限外濾過膜を用いて、150mM塩化ナトリウムに対して約4℃で透析濾過する。
最終濾過・製品保存
次に各溶液を濃縮し、300kDa NMWCO接線流限外濾過膜を用いてpH 7.0の150mM塩化ナトリウム中10mMヒスチジンに対して4℃で透析濾過する。保持液を0.22ミクロン濾過する。
次に各溶液を濃縮し、300kDa NMWCO接線流限外濾過膜を用いてpH 7.0の150mM塩化ナトリウム中10mMヒスチジンに対して4℃で透析濾過する。保持液を0.22ミクロン濾過する。
血清型19Fを約5日間インキュベートし、300kDa NMWCO接線流限外濾過膜を用いてpH 7.0の150mM塩化ナトリウム中10mMヒスチジンに対して約4℃で透析濾過し、0.22ミクロン濾過する。血清型18Cは、150mM塩化ナトリウム中の10mMヒスチジン、pH 7.0に対して、300kDaのNMWCO接線流限外濾過膜を用いて約4℃で透析濾過し、0.22ミクロン濾過する。
pH 7.0の150mM塩化ナトリウムで更に10mMヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、-60℃以下で凍結する。
実施例14
この実施例は、異なる界面活性剤および安定剤を有する15価肺炎球菌結合型ワクチンの製剤を示す。
この実施例は、異なる界面活性剤および安定剤を有する15価肺炎球菌結合型ワクチンの製剤を示す。
血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F及び33Fを有する15価肺炎球菌結合型ワクチン(以下、「PCV15」)の製剤には、上記のように調製された肺炎球菌多糖類体-タンパク複合体が用いられる。
処方は、前述のように、DMSO中の還元的アミノ化によって生成される肺炎球菌多糖類体-CRM197複合体を用いて調製される。個々の血清型の目標最終濃度を得るのに必要なバルク複合体の必要容量は、溶液容量およびバルク多糖類濃度に基づいて計算する。15の複合体を、塩化ナトリウム、L-ヒスチジン、pH 5.8緩衝液とポリソルベート(PS)-20、PS-80、またはポロキサマー(P)188から選択される賦形剤と組み合わせる。
滅菌した調製バルクは、プロピレングリコール(PG)及びポリエチレングリコール400(PEG400)を併用し、または併用せずに、バルクアルミニウムフォスフェートアジュバン(APA)と組合せ、組合せ中および組合せ後に、緩やかに混合する。様々な製剤において、複合体とAPAの2つの濃度が研究されている。1つは8μg/mLの血清型6B多糖類、他のすべての血清型については多糖類4μg/mL、そして250μg/mLのAPAを含んでいた。もう1つは血清型6B多糖類16μg/mL、他のすべての血清型については多糖類8μg/mL、APA 500μg/mLであった。処方されたワクチンは2~8℃で保存される。
APAは、ヒドロキシリン酸アルミニウムの水性懸濁液である。APAは塩化アルミニウムとリン酸ナトリウムを1:1の容量比で組み合わせて、水酸化アルミニウムを沈殿させて製造する。結合工程の後、高剪断ミキサーで材料をサイズ縮小し、単分散粒子サイズ分布を達成する。その後、生理食塩液で濾過し、蒸気滅菌する。
実施例15
この例では、上述のように調製した6B多糖類(Ps)とCRM197(Pr)をREVによって個別に凍結乾燥して乾燥ケーキを形成する。乾燥ケーキをDMSO中で再構成し、ここに記載するように結合させる。
この例では、上述のように調製した6B多糖類(Ps)とCRM197(Pr)をREVによって個別に凍結乾燥して乾燥ケーキを形成する。乾燥ケーキをDMSO中で再構成し、ここに記載するように結合させる。
標的Ps:Pr比(w/w)は0.9~1.5であり、複合体の標的分子量(MW)は1500~3500kDaである。標的遊離Psは15%以下で、遊離リジン損失は5モル/モルより大きい。結果は表5のとおりであった。本発明により作製されたREV乾燥材料は、標的範囲内の複合体MW、標的範囲内のPs:Pr比、標的範囲内の遊離Ps、および標的範囲内の遊離リジンを有する。
表5の複合体Mw、複合体Mn、複合体Ps:Prのアッセイ
HPSEC/UV/MALS/RIアッセイを用いた複合体の分子量および濃度分析複合体試料を注入し、高速サイズ排除クロマトグラフィー(HPSEC)により分離した。検出は紫外線(UV)、多角光散乱(MALS)および屈折率(RI)検出器を直列に用いて達成した。タンパク質濃度は、UV280から吸光係数を用いて算出した。多糖類濃度は、溶液の屈折率の変化とmL/gで示された溶質濃度の変化であるdn/dc因子を用いて(タンパク質と多糖類の両方が寄与する)RIシグナルからデコンボルートした。試料の平均分子量は、Astraソフトウェア(Wyatt Technology Corporation, Santa Barbara, CA)により、測定濃度および全試料ピークにわたる光散乱情報を用いて算出した。
HPSEC/UV/MALS/RIアッセイを用いた複合体の分子量および濃度分析複合体試料を注入し、高速サイズ排除クロマトグラフィー(HPSEC)により分離した。検出は紫外線(UV)、多角光散乱(MALS)および屈折率(RI)検出器を直列に用いて達成した。タンパク質濃度は、UV280から吸光係数を用いて算出した。多糖類濃度は、溶液の屈折率の変化とmL/gで示された溶質濃度の変化であるdn/dc因子を用いて(タンパク質と多糖類の両方が寄与する)RIシグナルからデコンボルートした。試料の平均分子量は、Astraソフトウェア(Wyatt Technology Corporation, Santa Barbara, CA)により、測定濃度および全試料ピークにわたる光散乱情報を用いて算出した。
表5のリジン喪失のアッセイ
多糖類と担体タンパク質の共有結合数の指標としての結合タンパクのリジン消費量の測定。
多糖類と担体タンパク質の共有結合数の指標としての結合タンパクのリジン消費量の測定。
Waters AccQ-Tagアミノ酸分析(AAA)を用いて、複合体サンプルにおける複合化の程度を測定した。Eldexワークステーションで気相酸加水分解を用いて試料を加水分解し、担体タンパク質を構成アミノ酸に分解した。遊離アミノ酸を6‐アミノキノリル‐N‐ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート(AQC)を用いて誘導体化した。次いで、誘導体化された試料を、C18カラム上のUV検出を伴うUPLCを使用して分析した。リジン以外の代表的アミノ酸を用いて平均タンパク質濃度を求めた。結合時のリジン消費(すなわち、リジン消失)は、複合体中のリジンの平均測定量と出発タンパク質中のリジンの期待量との差によって決定した。
表5の遊離Psの定量法
遊離多糖類(CRM197と結合していない多糖類)は、まず遊離タンパク質とデオキシコール酸(DOC)および塩酸との複合体を沈殿させて測定する。次に沈殿物を濾過し、濾液中の遊離多糖類濃度をHPSEC/UV/MALS/RIで分析する。遊離多糖類は、HPSEC/UV/MALS/RIで測定した総多糖類のパーセンテージとして計算される。
遊離多糖類(CRM197と結合していない多糖類)は、まず遊離タンパク質とデオキシコール酸(DOC)および塩酸との複合体を沈殿させて測定する。次に沈殿物を濾過し、濾液中の遊離多糖類濃度をHPSEC/UV/MALS/RIで分析する。遊離多糖類は、HPSEC/UV/MALS/RIで測定した総多糖類のパーセンテージとして計算される。
表5の遊離Prの定量法
結合試料中の遊離多糖類、多糖類‐CRM197複合体、および遊離CRM197を、ミセル動電クロマトグラフィー(MEKC)モードでキャピラリー電気泳動により分離する。
結合試料中の遊離多糖類、多糖類‐CRM197複合体、および遊離CRM197を、ミセル動電クロマトグラフィー(MEKC)モードでキャピラリー電気泳動により分離する。
簡単に述べると、試料を、25mMホウ酸塩、100mM SDS、pH 9.3を含有するMEKCランニング緩衝液と混合し、予備条件付けされたベアフューズド20シリカキャピラリー中で分離する。分離を200nmでモニターし、遊離CRM197をCRM197標準曲線で定量する。
遊離タンパク質の結果は、HPSEC/UV/MALS/RI手順によって決定された総タンパク質含有量のパーセンテージとして報告される。
実施例16
この実施例では、6A多糖類(Ps)およびCRM197(Pr)試料を調製し、本発明に従って分けて(別々に)凍結乾燥するか、または組み合わせて凍結乾燥する。凍結乾燥された試料は、続いてDMSO中で再構成され、ここに記載されるように複合体化される。
この実施例では、6A多糖類(Ps)およびCRM197(Pr)試料を調製し、本発明に従って分けて(別々に)凍結乾燥するか、または組み合わせて凍結乾燥する。凍結乾燥された試料は、続いてDMSO中で再構成され、ここに記載されるように複合体化される。
ビーズを乾燥させるために2つの異なるMVDサイクルを試験した(表6)。両サイクルとも、圧を50~60mTorrの範囲に保った。温度は、どれだけの電力を加えたかに依存し、25~30℃の範囲に留まった。
予備乾燥サイクル(Lyo1)には、表7に示すように18時間を要した。
乾燥サイクルは、表8に示すように、二次乾燥サイクルを加え、一次乾燥時間を延長することにより修正(Lyo 2)した。
標的Ps:Pr比(w/w)は0.9~1.5であり、複合体の標的分子量(MW)は1500~3500kDaである。結果は表9 のとおりであった。
実施例17
この実施例では、23F多糖類(Ps)およびCRM197(Pr)試料を調製し、本発明に従って分けて(別々に)凍結乾燥するか、または組み合わせて凍結乾燥する。凍結乾燥された試料は、続いてDMSO中で再構成され、ここに記載されるように結合される。
この実施例では、23F多糖類(Ps)およびCRM197(Pr)試料を調製し、本発明に従って分けて(別々に)凍結乾燥するか、または組み合わせて凍結乾燥する。凍結乾燥された試料は、続いてDMSO中で再構成され、ここに記載されるように結合される。
標的Ps:Pr比(w/w)は0.9~1.5であり、複合体の標的分子量(MW)は1500~3500kDaである。その結果は表10のとおりであり、比が2.4であった試料B2を除き、別々に凍結乾燥した試料について、PsおよびPrが期待される目標値にあったことを示している。
実施例18
この例は、6A多糖類(Ps)を用いた複合サイズに対する凍結乾燥担体タンパク質CRM197(Pr)へのDMSO添加時間の影響を示している。前に述べたように、DMSOを凍結乾燥したPrに速く(2分)、遅く(8分)加え、混合した後、DMSOで再構成した活性化Pに結合させた。
この例は、6A多糖類(Ps)を用いた複合サイズに対する凍結乾燥担体タンパク質CRM197(Pr)へのDMSO添加時間の影響を示している。前に述べたように、DMSOを凍結乾燥したPrに速く(2分)、遅く(8分)加え、混合した後、DMSOで再構成した活性化Pに結合させた。
図13は、大きさが増す多糖類を用いた結合反応から生じる複合体の大きさを示している。通常の関係は、結合反応に使われる多糖類(UF2サイズ)が大きいほど、それから生じる複合体が大きくなるということである。各多糖類サイズについて、凍結乾燥後のPrへの遅いDMSO添加速度と速いDMSO添加速度を比較した。グラフは、遅いDMSO添加は速いDMSO添加よりも、同じサイズの多糖類からさらに大きな複合体を生じることを示す。
実施例19
この例は、多糖類(Ps)およびCRM197(Pr; CRM)リオスフェアを生産するための凍結乾燥剤条件の開発を示す。
この例は、多糖類(Ps)およびCRM197(Pr; CRM)リオスフェアを生産するための凍結乾燥剤条件の開発を示す。
実施例3および4に記載されているようにCRMおよび血清型6Aおよび23F由来の活性化多糖類の別個の溶液を調製し、本実施例の表に示すPs、CRM、およびショ糖濃度を有した。
改良型Biomek FXピペッティングロボット(Cryomek)を用いて、溶液の50μLアリコートをCryomekの平らな凍結表面上に分注する。シャベル機構を使って、粉砕を起こすことなく、小さな冷たい容器にビーズを分注できる。各異なる溶液のサイクルを完了した後、ビーズを中間保存容器に移し、凍結乾燥器で昇華乾燥するか、またはマイクロ波減圧乾燥により昇華乾燥するまで-70℃に保つ。凍結乾燥機の乾燥には、ビーズを1層にして乾燥トレーに分注する。キャビネットの圧力、シェルフ温度、サイクルタイムが設定される。ビーズを乾燥させた後、リオスフェアを2~8℃で保存する。(特定のパラメータについては、例5を参照)
予備乾燥サイクル(Lyo1)には、表19.1に示すように18時間を要した。Karl Fisher滴定により測定されたリオスフェアの残留水分含量を表19.2に示す。
その結果、リオスフェア中の水分含量が高いことが分かった。さらに、リオスフェアは非常にもろく、吸水性であった。固体含量は、表20.2に示すように、多糖類、タンパク質、ショ糖濃度の増加によって増加した。乾燥サイクルは、表20.1に示すように、二次乾燥サイクルを加え、一次乾燥時間を長くすることにより修正した(Lyo 2)。
Lyo2からの残留水分含量は乾燥サイクルの改善によりLyo1からより有意に低かった。二次乾燥は、全ての氷が昇華した後でさえ、生成物中に依然として存在する結合水分の除去を改善する。二次乾燥は一次乾燥(15℃)よりも高い温度(30℃)を必要とした。
この時点で、凍結乾燥機総乾燥サイクル時間は45時間であった。乾燥サイクル時間をさらに短縮するため、圧力や温度などいくつかのパラメータを変更した(方法: Lyo 3)表21.1および21.2。
実施例20
この例は、多糖類(Ps)およびCRM197(Pr; CRM)リオスフェアを生産するためのラジアントエネルギー真空(REV)脱水(マイクロ波減圧乾燥(MVD))条件の開発を示す。
この例は、多糖類(Ps)およびCRM197(Pr; CRM)リオスフェアを生産するためのラジアントエネルギー真空(REV)脱水(マイクロ波減圧乾燥(MVD))条件の開発を示す。
CRMおよび血清型6Aおよび23F由来の活性化多糖類の溶液は、実施例3および4に記載されており、表22.1および22.2に示すようにPs、CRM、およびショ糖濃度を有するように調製した。
改良型Biomek FXピペッティングロボット(Cryomek)を用いて、溶液の50μLアリコートをCryomekの平らな凍結表面上に分注する。シャベル機構を使って、粉砕を起こすことなく、小さな冷たい容器にビーズを分注できる。各異なる溶液のサイクルを完了した後、ビーズを中間保存容器に移し、凍結乾燥器で昇華乾燥するか、またはマイクロ波減圧乾燥により昇華乾燥するまで-70℃に保つ。マイクロ波乾燥のため、ビーズを容器に単層分注した。出力、圧力、サイクル時間を設定した。ビーズを乾燥させた後、リオスフェアを2~8℃で保存した。(特定のパラメータについては、例6を参照)。
ビーズを乾燥させるために2つの異なるMVDサイクルを試験した。両サイクルとも、圧を50~60mTorrの範囲に保った。温度は、どれだけの電力を加えたかに依存し、25~30℃の範囲に留まった。
MVD1サイクルには4時間30分を要したが、残留水分含量を2%まで減少させるには不十分であった。MVD2サイクルは、より高いパワーでより長くかかり、したがって、有意に低い残留水分含量を提供した。
本発明はここに示された実施形態を参照して記載されているが、本発明がこれらに限定されないことを理解すべきである。本明細書の記載を読んだ当業者は、その範囲内のさらなる修正および実施形態を認識するであろう。したがって、本発明は、本明細書に添付されるクレームによってのみ限定される。
Claims (15)
- 担体タンパク質に共有結合した肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)多糖類を含む組成物を製造する方法であって、
(a)1つ以上の肺炎球菌血清型由来の化学的に活性化された肺炎球菌多糖類を含む第1の乾燥組成物、
および担体タンパク質を含む第2の乾燥組成物を提供する工程;
(b)前記第1の乾燥組成物および第2の乾燥組成物を有機溶媒中で別々に再構成して混和し、1つ以上の化学的に活性化された多糖類を含む第1の均質溶液および担体タンパク質を含む第2の均質溶液を提供する工程であって、再構成が8分以内であり、混和が120分以内である工程;
(c)前記第1の均質溶液と第2の均質溶液をT字型の混合チャンバーを用いた混合によって組合せて混合物を調製する工程;および
(d)前記混合物に還元剤を加えて、前記肺炎球菌血清型の1つ以上の多糖類に結合した担体タンパク質を含む複合体溶液を生成する工程を含む前記方法。 - 前記第1および第2の乾燥組成物が、凍結乾燥および放射エネルギー真空(REV)脱水から選択される昇華乾燥工程によって調製される、請求項1記載の方法。
- 前記昇華乾燥工程が、第1および第2の水溶液をケーキまたはリオスフェアビーズの形態で凍結することを含む、請求項2記載の方法。
- 前記昇華乾燥が、金属トレイ、プラスチックトレイ、ビニール袋、およびクラスIチューブバイアルからなる群より選択される容器内で実施されるバルク乾燥(bulk drying)である、請求項2記載の方法。
- 1つ以上の肺炎球菌血清型由来の化学的に活性化された肺炎球菌多糖類を含む第1の水溶液ならびに担体タンパク質および緩衝液を含む第2の水溶液を提供すること、および、昇華乾燥工程によって前記第1および第2の乾燥組成物を調製することを含む請求項1記載の方法であって、
凍結乾燥または放射エネルギー真空(REV)脱水を含む昇華乾燥工程によって前記第1および第2の乾燥組成物を調製すること、および、前記第1および第2の水溶液が約0.5% (w/v)以上のショ糖を含むことを特徴とする、前記方法。 - 緩衝液が、pH範囲5.0~7.0のヒスチジン、コハク酸塩、MES、MOPS、HEPES、または酢酸塩緩衝液である、請求項5記載の方法。
- 緩衝液が、pH5.0~7.0の範囲のリン酸塩またはクエン酸塩緩衝液である、請求項5記載の方法。
- 第1および第2の乾燥組成物の含水率が6%未満である、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 有機溶媒がジメチルスルホキシド(DMSO)である、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- 各複合体溶液が、重量対重量基準で担体タンパク質に対して約0.6~約1.3の比率で結合した多糖類を含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- 複合体溶液が、溶液中の全多糖類の約15%未満の量の遊離多糖類を含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- 担体タンパク質が、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、百日咳トキソイド、細菌性細胞溶解素、およびニューモリシンからなる群より選択される不活化細菌性トキソイドである、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- 不活化細菌性トキソイドがCRM197である、請求項12記載の方法。
- 複合体溶液が滅菌濾過される、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
- 肺炎球菌多糖類が、酸化剤と反応することによって化学的に活性化される、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
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