CZ20004066A3 - Deriváty pneumokokových proteinů vázajících cholin pro vakciny - Google Patents

Abstract

Řešení poskytuje bakteriální imunogenní činidla pro podávání lidem a zvířatům pro stimulaci imunitní odpovědi. Zejména se řešení týká vakcinace savčích druhů polypeptidy odvozenými z pneumokoků, kde tyto polypeptidy obsahují alfa helix, ale neobsahují cholin vázající oblast, jakožto mechanismu pro stimulaci tvorby protilátek, které chrání příjemce vakciny proti infekci patogenními bakteriálními druhy. Řešení dále poskytuje protilátky proti takovým proteinům a proteinovým komplexům, které mohou být použity k diagnóze a/nebo jako ochranná/léčebná činidla proti patogenním bakteriálním druhům.

Description

Deriváty pneumokokových proteinů vázajících cholin pro vakcíny

Oblast techniky

Tato přihláška nárokuje výhodu U.S. Prov. ΑρρΙ’η Seriál No. 60/085 743, podáno15.května, 1998, a U.S. Prov. Appťn Seriál No. 60/080, 878, založeno April 7, 1998.

Vynález se obecně týká oblasti bakteriálních antigenů a jejich použití například jako imunogenních činidel u lidí a zvířat ke stimulaci imunitní odpovědi. Přesněji se vynález týká vakcinace savčích druhů polypeptidem obsahujícím polypeptid vytvářející alfa helix získaného z polypeptidu vázajícího cholin; tato vakcinace působí jako mechanismus stimulující tvorbu protilátek, které chrání příjemce vakcíny proti infekci patogenními bakteriálními druhy. Dále se vynález týká protilátek a antagonistů proti takovým polypeptidům, které jsou užitečné v diagnostice a pasivní imunizační terapii s ohledem na diagnostikování a léčení takových pneumokokálních infekcí.

Konkrétně se vynález týká prevence a léčby pneumokokálních infekcí, jako jsou třeba infekce středního ucha, nosohltanu, plic a průdušek, krve, mozkomíšního moku apod., které jsou způsobeny pneumokokální bakterií. Z tohoto hlediska jsou obzvlášť zajímavé určité typy Streptococcus pneumoniae.

S. pneumoniae je gram-pozitivní bakterie, které jsou hlavní příčionou invazivních infekcí u zvířat a lidí, jako jsou například sepse, meningitidy, zánět středního ucha a lobární pneumonie (Tuomanen, a kol. NEJM 322:1280 až 1284 (1995)). Jako část průběhu infekce se pneumokoky snadno vážou na nezanícené lidské epitelární buňky horních a dolních cest dýchacích vazbou na eukaryotické uhlohydráty stejným způsobem jako lectin (Cundell a kol., Micro. Path. 17: 361 až 374 (1994)). Konverze na invazivní pneumokokální infekce pro vázané bakterie může zahrnovat lokální vývoj zánětiivých faktorů, které mohou aktivovat epitelární buňky ke změně počtu a typu receptorů na jejich povrchu (Cundell a kol. Nátuře 377: 435 až 438 (1995)). Je zřejmé, že jeden takový receptor, činitel aktivující destičky (platelet activating factor PAF), je upoután pneumokokální bakterií a ve velmi krátkém časovém úseku (minuty) od objevení PAF vykazují pneumokoky silně zvýšenou adherenci a invazi tkáně. Ukázalo se, že jisté rozpustné analogy receptoru zabraňují vývoji pneumokokální infekce (Idanpaan - Heikkila a kol., J. Inf. Dis., 176/704 až 712 (1997)).

Proteiny z rodiny proteinů vázajících cholin (choline binding proteins - CBPs), které jsou nekovalentně vázány na fosforylcholin, jsou přítomny na povrchu pneumo-

koků a mají nekovalentní vazbu s íeichoovou kyselinou nebo lipoteichoovou kyselinou. Příkladem takové rodiny proteinů je cholin vázající protein A (CbpA), přibližně 75 kD hmotnostní typ Cbp, který zahrnuje jedinečnou doménu na N-konci, oblast bohatou na prolin a doménu na C-konci obsahující mnohonásobné repetice 20 aminokyselin zodpovědné za vázání cholinu. Úsek části N-konce CbpA proteinu tvoří alfa helix, jako část jeho terciální struktury.

Předmětem vynálezu je tedy poskytnout polypeptid mající širokou obrannou schopnost proti pneumokokální infekci.

Dosavadní stav techniky

Pro lepší pochopení dále uvedeného popisu a příkladů, které následují, budou popsány běžně používané metody a/nebo pojmy.

„Plazmidy“ jsou označeny posloupností malých písmen, která začíná písmenem p a/nebo následují velká písmena a/nebo čísla. Zde uváděné výchozí plazmidy jsou buď komerčně dostupné, neomezeně veřejně dostupné, nebo mohou být vyrobeny z dostupných plazmidů podle známých postupů. Kromě toho jsou plazmidy ekvivalentní k popsaným plazmidům známé v oboru a jsou zřejmé průměrnému odborníkovi.

„Digescí“ DNA je míněno katalytické štěpení DNA restrikčními enzymy, které probíhá pouze na určitých sekvencích DNA. Různé zde použité restrikční enzymy jsou komerčně dostupné a jejich reakční podmínky, kofaktory a další vybavení jsou použity tak, jak je známo odborníkům v dané oblasti. Pro účely analýzy se obvykle používá 1 μρ plazmidů nebo fragmentu DNA s asi 2 jednotkami enzymů v asi 20 μΙ pufrového roztoku. Za účelem izolace DNA fragmentů pro výrobu plazmidů je obvykle digerováno 5 až 50 μg DNA s 20 až 250 jednotkami enzymu ve větším objemu. Vhodná množství pufrů a substrátů pro částečnou restrikci enzymů jsou určena výrobcem. Jsou obvykle používány inkubační doby asi kolem 1 hodiny při 37 °C, ale mohou se měnit podle přiloženého návodu výrobce. Po digescí se reakční směs podrobí elektroforéze přímo na polyakrylamidovém gelu, čímž se izoluje požadovaný fragment.

Rozdělení štěpených fragmentů podle velikosti se provádí s použitím 8procentního polyakrylamidového gelu, který je popsán v Goeddel, D. a kol., Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980).

„Oligonukleotidy“ se vztahují buď na jednořetězcový polydeoxynukleotid nebo dva komplementární polydeoxynukleotidové řetězce, které mohou být chemicky syntetizovány. Takové syntetické oligonukleotidy nemají žádný 5' fosfátový konec a nemohou • · · · · · * · · · • » · ♦ · · · · ··· · · · · * • · · · · · · ·· ···· ·· ··· tedy být připojeny k jinému oligonukleotidu bez přidání fosfátu sATP v přítomnosti kinázy. Syntetický oligonukleotid se připojí k fragmentu, který nebyl defosforylován.

„Ligace“ znamená proces tvorby fosfodiesterových vazeb mezi dvěma dvouřetězcovými fragmenty nukleové kyseliny (Maniatis, T., a kol. Id., str. 146). Pokud není uvedeno jinak, může být ligace provedena s použitím známých pufrů a za známých podmínek s 10 jednotkami T4 DNA ligázy na 0,5 pg přibližně ekvimolárního množství DNA fragmentů, které mají být připojeny.

Termín „úsek HPS“ zde znamená sekvenci aminokyselin, která je uvedena v SEQ ID č. 2 pro cholin vázající protein (CBP) pneumokokálních bakterií, který může být umístěn na aminokonci s ohledem na prolin bohatou část celé sekvence aminokyselin pro takový CBP.

Pojem „shodnost“, „% shodnosti“ v této přihlášce znamená výpočet rozdílu mezi dvěma spojitými sekvencemi, které byly zarovnány optimálně (k získání největšího počtu zarovnaných identických odpovídajících sekvencí základních úseků, kde základní úseky jsou buď nukleotidy nebo aminokyseliny) a všechny jednotlivé rozdíly jsou považovány za jednotlivý rozdíl s ohledem na shodnost. S tímto ohledem na shodnost jsou všechny jednotlivé mezery v základních úsecích (způsobené inzercemi a delecemi s ohledem na počáteční sekvenci („referenční sekvence“) po celé délce referenční sekvence a jednotlivé substituce různých základních úseků (pro jednotlivé základní úseky referenční sekvence) považovány za jednotlivé rozdíly ve výpočtu celkového počtu rozdílů mezi dvěma sekvencemi. Jednotlivé rozdíly mohou být srovnávány mezi dvěma sekvencemi, kde počáteční sekvence (referenční sekvence) byla upravena, aby byla získána variantní sekvence (srovnávací sekvence), nebo kde je nová sekvence (srovnávací sekvence) jednoduše zarovnána a srovnána s referenční sekvenci. Při srovnávání dvou zarovnaných sekvencí jsou všechny jednotlivé mezery v obou sekvencích, které byly způsobeny optimálním zarovnáním po celé délce referenční sekvence, považovány za jednotlivé rozdíly pro určení shodnosti. Pokud existují taková zarovnání, která splňují stanovenou minimální shodnost, pak má sekvence stanovenou minimální shodnost s referenční sekvencí. Jako příklad uvedeme hypotetické srovnání dvou sekvencí , které mají 100 základních úseků, z nichž každý je zarovnán optimálně, kde jedna sekvence je považována za referenční sekvenci a druhá za srovnávací sekvenci. Všechny jednotlivé zarovnávací mezery jsou sečteny po celé délce referenční sekvence a přidány k počtu jednotlivých substitučních změn v základním úseku (zarovnané elementy, které jsou rozdílné) srovnávací sekvence pro získání celkového počtu rozdílů • ···9 9 9 9 · ·· • •9 9 9·· 999

9999 99 9 9« « 9 9 9 9 9 9

9999 99 999 v základních úsecích. Celkový počet rozdílů (například 7 mezer a 3 substituce) je vydělen celkovým množstvím základních úseků v délce referenční sekvence (100 základních úseků) pro „procentuální rozdíl“ (10/100). Výsledný procentuální rozdíl (10 %) je odečten od 100 % shodnosti aby byla získána „% shodnosti“ o velikosti 90 % shodnosti. Pro výpočet shodnosti jsou uvažovány všechny jednotlivé rozdíly v obou sekvencích, jak bylo uvedeno dříve, přes celou individuální srovnávací délku (délka referenční sekvence) dvou optimálně zarovnaných sekvencí jejichž shodnost je zjišťována. Není tedy potřebný žádný algoritmus pro výpočet shodnosti.

Pojem „Izolovaný“ v této přihlášce s ohledem na polypeptidy a/nebo polynukleotidy znamená, že materiál je odstraněn z jeho původního prostředí (například přírodní prostředí, pokud se zde přirozeně vyskytuje). Například přírodní polynukleotid nebo polypeptid přítomný v živém organizmu není izolován, ale tentýž polynukleotid nebo polypeptid, získaný z některého nebo všech spolu existujících materiálů v přírodním systému je izolován. Takové polynukleotidy mohou být částí vektoru a/nebo takové polynukleotidy nebo polypeptidy mohou být částí kompozice a přesto jsou izolovány, takže takový vektor nebo kompozice není část přírodního prostředí. Polypeptidy a polynukleotidy podle vynálezu jsou s výhodou poskytovány v izolované formě a s výhodou jsou přečištěny tak, aby byly homogenní.

Podstata vynálezu

Z jednoho hlediska se vynález týká vakcíny pro léčbu infekce pneumokokálními bakteriemi, kde se užívá jako imunogen alespoň jeden polypeptid, který je částí proteinu vázajícího se na povrch pneumokoků, jeho analogu nebo varianty, která má vysoce chráněnou imunogenní část alfa helixu (obecně odpovídající aminokyselinové sekvenci uvedené v SEQ ID č.:1) s ohledem na rozdílné typy pneumokokálních bakterií, jejichž polypeptid neobsahuje cholin vázající část. U takových polypeptidu s výhodou chybí C-koncová část vázající cholin. S výhodou také chybí HPS aminokyselinová sekvence. Polypeptidy jsou s výhodou dále ty, které mají vysoce chráněnou imunogenickou část alfa helixu obecně odpovídající aminokyselinové sekvenci, která je uvedena v SEQ ID č.:1, a také obecně odpovídají aminokyselinové sekvenci, která je uvedena v SEQ ID č.:19 (aminokyseliny 1 až 103 SEQ ID č.:19 jsou shodné s aminokyselinami 1 až 103 SEQ ID č.:1). Vakcíny jsou také s výhodou rekombinantně vyrobené, izolované polypeptidy, u kterých chybí HPS část a také cholin vázající část.

Vakcíny jsou s výhodou jeden nebo více polypeptidů, které jsou částí proteinů vázajících se na povrch pneumokoků, jejich analogů nebo variant zahrnujících jednu vysoce chráněnou imunogenní část alfa helixu s ohledem na rozdílné typy pneumokoků, jejichž polypeptidy neobsahují cholin vázající C-koncovou část. Izolované polypeptidy jsou s výhodou také ty, které mají stejnou strukturu a jsou rekombinantně vyrobené. Dále jsou s výhodou izolovány rekombinantně vyrobené polypeptidy, které mají takovou strukturu. Polypeptidy dále s výhodou neobsahují ani cholin vázající C-koncovou část, ani HPS část.

Vynález se dále týká vakcíny obsahující polypeptid, který obsahuje imunogenní část, která je schopná tvořit alfa helix, kde tento polypeptid zahrnuje sekvenci, která je alespoň z 80 % shodná a s výhodou alespoň z 87 % shodná s aminokyselinovou sekvencí podle SEQ ID č.:1, kde izolovaný polypeptid neobsahuje C-koncovou část vázající cholin. Dále jsou výhodné takové polypeptidy, které obsahují polypeptidovou sekvenci, která má alespoň 85% shodnost, s výhodou alespoň 87% shodnost se sekvencí aminokyselin podle SEQ IDč.:19. Sekvence izolovaného polypeptidu s výhodou neobsahuje ani HPS část (SEQ ID č.:2), ani C-koncovou část vázající cholin. Dále jsou výhodné izolované rekombinantně vyrobené polypeptidy, které mají takovouto strukturu. Především jsou míněny takové polypeptidy, které odpovídají strukturám alfa helixu různých typů bakterie S. pneumoniae. Obzvlášť výhodné jsou serotypy 1 až 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19F, 19A, 20, 22F, 23F a 33F bakterií S. pneumoniae. Příklady takových serotypů bakterií jsou snadno dostupné ze standartních ATCC katalogů.

Z dalšího hlediska poskytuje vynález vakcínu proti S. pneumoniae obsahující syntetické rekombinantní polypeptidy, které obsahují určité množství alfa helikálních částí, z nichž každá je odvozena z jiného v přírodě se vyskytujícího cholin vázajícího polypeptidu S. pneumoniae, kde tyto alfa helikální části jsou alespoň z 85 % shodné s aminokyselinovou sekvencí podle SEQ ID č.:1 a kde izolovaný polypeptid neobsahuje cholin vázající část. Dále jsou výhodné ty, kde aminokyselinová sekvence pro oblast alfa helixu je alespoň z 85 % shodná s aminokyselinovou sekvencí podle SEQ ID č.:19. Takové syntetické polypeptidy neobsahují s výhodou ani HPS část, ani cholin vázající část. Vynález také zahrnuje analogy a varianty takových polypeptidů s řetězovou strukturou, jejichž alfa helikální části mohou být syntetickou variantou aminokyselinové sekvence (nebo mohou být směsí přírodně získaných a variantních sekvencí). Vynález s výhodou poskytuje vakcínové řetězcové polypeptidy, které mají alespoň 10 různých « ·«·· »3 · · ·· a * · · · · · a a a • a a · a · · a a • a a a a a a aa ···· aa aaa alfa helikálních struktur odpovídajících S. pneumoniae serotypům 1 až 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11 A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19F, 19A, 20, 22F, 23F a 33F. Výhodnými polypeptidy jsou dále ty, ve kterých se vyskytuje alespoň 15 alfa helikálních struktur, výhodněji ty polypeptidy, ve kterých se vyskytuje alespoň 20 alfa helikálních struktur a a ještě výhodnějšími polypeptidy jsou ty, v nichž se vyskytuje alespoň jedna alfa helikální struktura odpovídající každému ze serotypů S. pneumoniae 1 až 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11 A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19F, 19A, 20, 22F, 23F a 33F. Další výhodný polypeptid obsahuje každou z alfa helikálních struktur aminokyselinových sekvencí ze SEQ ID čísla:3 až 18, které odpovídají SEQ ID č.:1.

Z dalšího hlediska se vynález týká pasivních imunizačních vakcín formulovaných z protilátek proti polypeptidu, který obsahuje vysoce chráněnou imunogenní část s ohledem na různé typy pneumokokálních bakterií, jejichž část je schopna tvořit alfa helix, který je shodný dříve uvedeným způsobem s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID č.: 1, kde polypeptid neobsahuje C-koncovou část vázající cholin, kde uvedené protilátky se budou vázat nejméně na jeden druh S. pneumoniae. Je-li polypeptid zkrácenou částí přírodního pneumokokálního proteinu vázajícího se na povrchy, s výhodou neobsahuje HPS část (kde je to vhodné) a cholin vázající část. Takové pasivní imunizační vakcíny mohou být použity pro ochranu a/nebo léčbu pneumokokálních infekcí u imunokompromisních pacientů, pacientů s nevyspělým imunitním systémem (např. malé děti) nebo u pacientů, kteří již mají rozvíjející se infekci. Tímto způsobem podle dalšího hlediska vynálezu může být vyráběna vakcína ze syntetického nebo rekombinantního polypeptidu, kde polypeptid obsahuje chráněné alfa helikální části dvou nebo více různých cholin vázajících polypeptidů S. pneumoniae.

Vynález se dále obecně týká použití izolovaného polypeptidu, který má vysoce chráněnou imunogenní část s ohledem na různé typy pneumokokálních bakterií, jejichž část je schopna tvořit alfa helix (odpovídající obecně SEQ ID č.:1 nebo SEQ ID č.:19), kde izolovaný polypeptid neobsahuje cholin vázající část, zlepší se tak vhodnost protilátek pro savčí druhy vyjma člověka, například jako diagnostická činidla a vakcíny.

Z dalšího hlediska se vynález týká výroby polypeptidu obsahujícího vysoce chráněnou imunogenní část s ohledem na různé typy pneumokokálních bakterií, jejichž část je schopna tvořit alfa helix, jehož sekvence obecně odpovídají aminokyselinové sekvenci podle SEQ ID č.:1 nebo SEQ ID č.:19, kde izolovaný polypeptid neobsahuje cholin vázající část. Tento rekombinantní výsledek je zkrácenou částí přírodního pneumoφφφφ φ

φφφ

Ί • ΦΦΦ · φ φ φφφφ kokálního polypeptidu vázajícího se na povrchy a s výhodou neobsahuje HPS část (kde je to vhodné) a cholin vázající část.

Z dalšího hlediska vynález poskytuje izolovaný cholin vázající polypeptid, kde oblast, která neváže cholin má alespoň 90% shodu s odpovídající částí aminokyselinové sekvence přírodního pneumokokálního proteinu vázajícího se na povrchy, který je členem vybraným ze skupiny sestávající ze SEQ ID č.:3 až18. Vynález se týká fragmentů takových poiypeptidů, které zahrnují alespoň chráněnou alfa helikální část obecně odpovídající SEQ ID č.:1, a která má ktomu alespoň 85% shodnost, izolovaný polypeptid s výhodou neobsahuje cholin vázající oblast.

Z dalšího hlediska vynález poskytuje izolovaný polypeptid sestávající z aminokyselinové sekvence, která má alespoň 90% shodnost s jednou z aminokyselinových sekvencí vybraných ze skupiny SEQ ID č.:3 až 18. Izolovaný polypeptid obsahuje s výhodou aminokyselinovou sekvenci, která má alespoň 95% shodnost a výhodněji 97% shodnost s jednou z aminokyselinových sekvencí vybraných ze skupiny sestávající ze SEQ ID č.:3 až 18. Vynález se dále týká fragmentů takových polypeptidů.

Z dalšího hlediska vynález poskytuje S. pneumoniae CBP polypeptid kódovaný polynukleotidem, který hybridizuje za přísných podmínek na komplement polynukleotidu kódujícího polypeptid, který má aminokyseliny vybrané ze skupiny sestávající ze SEQ ID č.:1 a SEQ ID č.:3 až 18. Obzvlášť výhodné jsou polypeptidy, které obsahují úsek obsahující sekvenci aminokyselin, který má alespoň 90% shodnost s aminokyselinovaou sekvenci SEQ ID č.:1. Dále jsou výhodné takové polypeptidy, které obsahují spojitou aminokyselinovou sekvenci, která má alespoň 95% shodnost s ohledem na aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č.:1. A dokonce ještě výhodnější jsou polypeptidy obsahující aminokyselinovou sekvenci, která má alespoň 97% shodnost vzhledem k aminokyselinové sekvenci SEQ ID č.:1.

Z dalšího hlediska vynález poskytuje polynukleotidy, které kódují dříve popsané polypeptidy podle vynálezu. Polynukleotid podle vynálezu může být ve formě RNA nebo ve formě DNA, přičemž DNA zahrnuje cDNA, genomovou DNA a syntetickou DNA. DNA může být dvouřetězcová nebo jednořetězcová a pokud je jednořetězcová, může jít o kódující řetězec nebo nekódující řetězec (anti-sense). Polynukleotidy, které kódují polypeptidy obsahující aminokyselinové sekvence, z nichž alespoň jedna je ze SEQ ID č.:3 až 18 (nebo polypeptidy, které mají alespoň 90% shodnost s aminokyselinovými sekvencemi takových poiypeptidů), mohou mít jednu z kódujících sekvencí uvedených v SEQ ID č.20-35 nebo mohou mít různé kódujících sekvence, jejichž kódující sekvence, v důsledku redundance nebo degenerace genetického kódu, kóduje tentýž polypeptid jako DNA ze SEQ ID č.:20 až 35.

Polynukleodity, které kódují polypeptidy SEQ ID č.:3 až 18, mohou obsahovat: pouze kódující sekvenci pro polypeptid; kódující sekvenci pro polypeptid (a volitelně přídavné kódující sekvence) a nekódující sekvence, jako jsou například introny nebo nekódující sekvence 5' a/nebo 3' konce sekvence kódující polypeptid. Kódované polypeptidy mohou obsahovat pouze jednu alfa helikální část nebo mnohonásobnou alfa helikální část a mohou nezávisle nebo společně obsahovat N-koncovou sekvenci 5' takových alfa helikálních oblastí a/nebo sekvence odpovídající „X“ strukturám nebo na prolin bohaté oblasti (jak je uvedeno například na obrázku 1).

Vynález se dále týká polynukleotidu, který má polynukleotidovou sekvenci, která vykazuje alespoň 95% shodnost a s výhodou alespoň 97% shodnost se SEQ ID č.3 až

18. Vynález se dále týká fragmentů takových polynukleotidů, které obsahují alespoň část polynukleotidu kódujícího sekvenci polypeptidu dpovídající SEQ ID č.:1.

Pojem „polynukleotid kódující polypeptid“ tedy znamená polynukleotid, který zahrnuje pouze kódující sekvenci pro polypeptid, stejně jako polynukleotid, který obsahuje přídavnou kódující a/nebo nekódující sekvenci. Polypeptidy mohou především obsahovat nějaké nebo všechny typy struktur které jsou schematicky uvedeny na obrázku 1.

Vynález se dále týká variant dříve popsaných polynukleotidů, které kódují fragmenty, analogy a deriváty polypeptidů, které obsahují aminokyselinové sekvence SEQ ID č.:3 až 18. Varianty polynukleotidů mohou být přirozeně se vyskytující alelické varianty polynukleotidů nebo nepřirozené varianty polynukleotidů. Komplemety k těmto kódujícím polynukleotidům mohou být použity k izolaci polynukleotidů kódujících stejné nebo podobné polypeptidy. Takové postupy jsou především užívané k získání segmentů kódujících alfa helix z různých serotypů S. pneumoniae, což je zejména užíváno pro výrobu „řetězových“ polypeptidových vakcín, které obsahují vícenásobné alfa helikální úseky.

Vynález tedy zahrnuje polynukleotidy kódující polypeptidy včetně stejných polypeptidů, jako bylo uvedeno v seznamu sekvencí SEQ ID č.:3 až 18, stejně jako varianty takových polynukleotidů, které kódují fragment, derivát nebo analog polypeptidů SEQ ID č.:3 až 18. Takové varianty polynukleotidů zahrnují deleční varianty, substituční varianty a adiční nebo inzertní varianty.

9 tttt 9 9 99 9

Jak bylo dříve uvedeno, polynukleotidy mohou mít kódující sekvenci, která je přirozeně se vyskytující, alelická varianta kódující sekvence, která je uvedena v seznamu sekvencí SEQ ID č.:20 až 35. Jak je v tomto oboru známo, je alelická varianta alternativní formou polynukleotidové sekvence, ve které se může vyskytovat substituce, delece nebo adice jednoho nebo více nukleotidů, které podstatně nemění funkci kódovaného polypeptidu.

Polynukleotidy podle vynálezu mohou mít také kódující sekvenci zajištěnou v rámci značkovací sekvence, což umožňuje čištění polypeptidů podle vynálezu. Značkovací sekvence může být například hexa-histidinový volný konec opatřený vektorem pQE-9 pro umožnění čištění maturovaných polypeptidů zajištěných na značkovací sekvenci v případě bakteriálního hostitele nebo například značkovací sekvence může být hemagglutininový (HA) volný konec, kde je použit savčí hostitel, například COS-7 buňky. HA volný konec odpovídá epitopu odvozenému z chřipkového hemagglutininového proteinu (Wilson, I., a kol., Cell, 37:767 (1984)).

Vynález se dále týká polynukleotidů (cílových sekvencí hybridizace), které hybridizují na komplementy dříve popsaných sekvencí, pokud je zde alespoň 70% a s výhodou 80% shodnost mezi cílovou sekvencí a komplementem sekvence, na kterou cílová sekvence hybridizuje, s výhodou alespoň 85% shodnost. Výhodnějšími sekvencemi jsou ty, které mají alespoň 90% shodu, výhodněji alespoň 95% shodu a nejlépe 97% shodu mezi cílovou sekvencí a sekvencí komplementu polynukleotidu, na který hybridizuje. Vynález se dále týká komplementů cílové sekvence a polynukleotidové sekvence, která kóduje aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny sestávající ze SEQ ID č.:3 až 18. Vynález se částečně týká polynukleotidů, které hybridizují za přísných podmínek na komplementy dříve popsaných polynukleotidů, stejně jako na jejich komplementy. Zde používaný pojem „přísné podmínky“ znamená, že hybridizace probíhá s komplementem polynukleotidu a odpovídající sekvencí pouze pokud existuje alespoň 95% a s výhodou alespoň 97% shoda mezi cílovou sekvencí a sekvencí komplementu polynukleotidu, na který hybridizuje. Polynukleotidy, které hybridizují na komplementy z dříve popsaných polynukleotidů, ve výhodném provedení vynálezu kódují polypeptidy, které si udrží imunogenní část, která bude křížově reagovat s protilátkou na alespoň jeden z polypeptidů majících sekvenci podle SEQ ID č.:3 až 18 nebo na polypeptid, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která má alespoň 85% shodu se sekvencí SEQ ID č.:1.

Z dalšího hlediska vynález zajišťuje výrobu takových polypeptidů a vakcín, jak bylo uvedeno výše, které mají histidinové označení (nebo jiné vhodné označení) takové, že celé proteiny, zkrácené proteiny, analogy nebo varianty, které byly uvedeny dříve, mohou být izolovány díky svým značkám.

Z dalšího hlediska se vynález týká postupu profylaxe a/nebo léčení nemocí, které jsou přenášené pneumokokálními bakteriemi, které mají CBP proteiny vázající se na povrchy. Vynález se především týká způsobu pro profylaxi a/nebo léčení infekčních nemocí, které jsou přenášeny S. pneumoniae obsahujícíCBP protein vázající se na povrch a tvořící strukturu alfa helixu (obsahující sekvenci, která má alespoň 85% shodu s aminokyselinovou sekvencí ze SEQ ID č.:1). V ještě dalším výhodném hledisku se vynález týká způsobu pro profylaxi a/nebo léčbu takových infekcí u lidí.

Z dalšího hlediska se vynález týká způsobu použití jedné nebo více protilátek (monoklonální, polyklonální nebo séra) proti dříve uvedeným polypeptidům podle vynálezu pro profylaxi nebo a/nebo léčbu nemocí, které jsou přenášeny pneumokokálními bakteriemi, které mají CBP protein vázající se na povrchy. Vynález se především týká způsobu pro profylaxi a/nebo léčbu infekčních nemocí, které jsou přenášeny CBP proteiny z S. pneumoniae, které obsahují alfa helikální část mající dříve uvedenou shodnost s konvenční sekvencí SEQ ID č.:1. Z dalšího hlediska se vynález týká způsobu pro profylaxi a/nebo léčbu zánětu středního ucha, infekcí nosohltanu, bronchiálních infekcí a podobných nemocí u lidí, s použitím protilátek proti imunogenním polypeptidům, které obsahují alfa helix podle vynálezu, jak bylo uvedeno dříve.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 je diagram pneumokokálního CBP proteinu, který ukazuje od N-konce do C-konce (a) N-koncové sekvenci (b) jeden z potenciálních chráněných segmentů (R1) s oblastí tvořící alfa helix, který nemusí být v některých polypeptidech přítomen, (c) volitelnou malou spojovací sekvenci aminokyselin, která může spojovat dva chráněné alfa helikální segmenty (X), (d) druhou z potenciálních konvenčních sekvencí (R2) s oblastí tvořící alfa helix související s první konvenční sekvencí (která odpovídá SEQ ID č.:1), (e) na prolin bohatou oblast sekvence, (f) cholin vázající repetici, (e) Ckoncovou sekvenci. U příslušné HPS sekvence se případně může přirozeně vyskytnout konec 5' na prolin bohaté sekvence a konec 3' R1, X a/nebo R2 oblastí.

···· ·· · · ·« · • · · · · · « · · • · · ·· · ·· · • · · · · · · ♦ ·· ·· · · ·· ·· ·· ·

Obr. 2 uvádí výsledky pasivní imunitní ochrany proti 1600 cfu virulentnímu serotypu 6B S. pneumoniae SP317 (u myší), kterému bylo poskytnuto králičí antisérum z 31. dne vůči pneumokokálnímu CBP zkrácenému polypeptidů a NR1XR2 (zkrácená část, u které chybí jak prolin tak cholin vázající oblasti, ale obsahuje dvě chráněné alfa helikální oblasti R1 a R2). Osmdesát procent myší imunizovaných zkráceným úsekem antiséra před nakažením přežilo 14denní pozorovací období. Naproti tomu všechny myši imunizované kontrolním sérem (preimunitní králičí sérum) byly mrtvé do 7. dne.

Obr. 3 uvádí výsledky pasivní imunitní ochrany proti 3450 cfu virulentnímu serotypu 6B S. pneumoniae SP317 (u myší), kterému bylo poskytnuto králičí antisérum z 52. dne vůči pneumokokálnímu CBP zkrácenému polypeptidů a NR1XR2 (zkrácená část, u které chybí jak oblast vázající prolin, tak oblast vázající cholin, ale obsahuje dvě chráněné alfa helikální oblasti R1 a R2). Sto procent myší imunizovaných zkráceným úsekem antiséra před nakažením přežil 10denní pozorovací období. Naproti tomu devadesát procent myší imunizovaných kontrolním sérem (preimunitní králičí sérum) bylo mrtvých 10. dne.

Obr. 4 uvádí výsledky pasivní imunitní ochrany proti 580 cfu virulentnímu serotypu 6B S. pneumoniae SPSJ2 (u myší), kterému bylo poskytnuto králičí antisérum z 31. dne vůči pneumokokálnímu CBP zkrácenému polypeptidů a NR1XR2 (zkrácená část, u které chybí jak oblast vázající prolin, tak oblast vázající cholin, ale obsahuje dvě chráněné alfa helikální oblasti R1 a R2). Padesát procent myší imunizovaných zkráceným úsekem antiséra před nakažením přežilo 10denní pozorovací období. Naproti tomu všechny myši imunizované kontrolním sérem (preimunitní králičí sérum) byly mrtvé 8. dne.

Obr. 5 uvádí výsledky aktivní imunitní ochrany proti 560 cfu virulentnímu serotypu 6B S. pneumoniae SPSJ2 (u myší), kterému bylo poskytnuta imunizace pneumokokálním CBP zkráceným polypeptidem NR1X (zkrácená část, u které chybí druhá chráněná alfa helikální oblast R2, stejně jako prolin a cholin vázající oblasti). Osmdesát procent myší aktivně imunizovaných NR1X CBP zkráceným úsekem před nakažením přežilo 14denní pozorovací období. Naproti tomu všechny myši imunizované kontrolou (kontrolní myši) PBS a pomocnou látkou byly mrtvé 8. dne.

Obr. 6 uvádí výsledky aktivní imunitní ochrany proti 680 cfu virulentnímu serotypu

6B S. pneumoniae SPSJ2 (u myší), kterému byla poskytnuta imunizace pneumokokálním CBP zkráceným polypeptidem NR1X (zkrácená část, u které chybí jak prolin, tak cholin vázající oblasti, ale obsahuje dvě chráněné alfa helikální oblasti R1 a R2). Páde12 • · 9 9 ·· ·· ·« • · · · 9 · · · ··· 9 9 9 · · sát procent myší aktivně imunizovaných NR1XR2 CBP zkráceným úsekem před nakažením přežilo 14denní pozorovací období. Naproti tomu všechny myši imunizované kontrolou (SP90) proteinem a pomocnou látkou byly mrtvé 9. dne.

Obr. 7 obsahuje záznam seřazení aminokonce CPB polypeptidů z různých typů S. pneumoniae a konvenční sekvence je uvedena nad každou srovnávací řadou (skupinou řádků). Konvenční sekvence pro srovnání je zapsána jako „majoritní sekvence“ (SEQ ID č. : 36). Jednopísmenné kódy jsou užívány pro sekvence, které jsou seřazeny pro nejvhodnější srovnání, kde pomlčky v sekvenci znamenají velikost mezer sousedních sekvencí.

Obr. 8 ukazuje vzdálenosti sekvenčních párů pro aminokyselinové sekvence, jak bylo popsáno a vysvětleno u obr. 7. Byla použita clustální metoda s tabulkou, která ukazuje shodnostní zbytkovou hmotnost. Procentuální podobnost pro takové srovnání je zaznamenána pro aminokyselinové sekvence uvedené na obr. 7.

Na obr. 9 je záznam zarovnání pro první helikální oblast v aminokyselinových sekvencích CBP polypeptidů z různých typů S. pneumoniae a konvenční sekvence je uvedena nahoře nad každou srovnávací řadou (skupinami řádků). Konvenční sekvence pro srovnání je označena jako „většinová“ sekvence (SEQ ID č.: 38). Jednopísmenné kódy představují sekvence, které jsou zarovnány optimálně, a pomlčky v sekvenci ukazují mezery mezi sousedními sekvencemi.

Obr. 10 ukazuje vzdálenosti sekvenčních párů pro aminokyselinové sekvence, jak bylo uvedeno u obrázku 9 a to, co bude uvedeno dále. Byla použita clustální metoda s tabulkou, která ukazuje shodnostní zbytkovou hmotnost. Procentuální podobnost pro takové srovnání je uvedena pro aminokyselinové sekvence uvedené na obr. 9.

Na obr. 11 je záznam zarovnání pro oblast X v aminokyselinových sekvencích CBP polypeptidů z různých typů S. pneumoniae a konvenční sekvence je uvedena nahoře nad každou srovnávací řadou (skupinami řádků). Konvenční sekvence pro srovnání je označena jako „většinová“ sekvence (SEQ ID č.: 37). Jednopísmenné kódy představují sekvence, které jsou zarovnány pro nejvhodnější srovnání, a pomlčky v sekvenci ukazují mezery mezi sousedními sekvencemi.

Obr. 12 ukazuje vzdálenosti sekvenčních párů pro aminokyselinové sekvence, jak bylo popsáno a vysvětleno u obr. 11. Byla použita clustální metoda s tabulkou, která ukazuje shodnostní zbytkovou hmotnost. Procentuální podobnost pro takové srovnání je uvedena pro aminokyselinové sekvence uvedené na obr. 11.

• · ··· ·· · · ·· • · · · · · ♦ · · · • · · · · · * ·«

Na obr. 13 je záznam zarovnání pro druhou helikální oblast A v aminokyselinových sekvencích CBP polypeptidu z různých typů S. pneumoniae a konvenční sekvence je uvedena nahoře nad každou srovnávací řadou (skupinou řádků). Konvenční sekvence pro srovnání je označena jako „většinová“ sekvence (SEQ ID č.: 1). Jednopísmenné kódy představují sekvence, které jsou zarovnány pro nejvhodnější srovnání, a pomlčky v sekvenci ukazují mezery mezi sousedními sekvencemi.

Obr. 14 ukazuje vzdálenosti sekvenčních párů pro aminokyselinové sekvence, jak bylo popsáno a vysvětleno u obr. 13. Byla použita clustální metoda s tabulkou, která ukazuje shodnostní zbytkovou hmotnost. Procentuální podobnost pro takové srovnání je uvedena pro aminokyselinové sekvence uvedené na obr. 13.

Na obr. 15 je záznam zarovnání pro druhou helikální oblast B v aminokyselinových sekvencích CBP polypeptidů z různých typů S. pneumoniae a konvenční sekvence je uvedena nahoře nad srovnávací každou řadou (skupinou řádků). Konvenční sekvence pro srovnání je označena jako „většinová“ sekvence (SEQ ID č. : 19). Jednopísmenné kódy představují sekvence, které jsou zarovnány pro nejvhodnější srovnání, a pomlčky v sekvenci ukazují mezery mezi sousedními sekvencemi.

Obr. 16 ukazuje vzdálenosti sekvenčních párů pro aminokyselinové sekvence, jak bylo popsáno a vysvětleno u obr. 15. Byla použita clustální metoda s tabulkou, která ukazuje shodnostní zbytkovou hmotnost. Procentuální podobnost pro takové srovnání je uvedena pro aminokyselinové sekvence uvedené na obr. 15.

Příklady provedení vynálezu

S ohledem na jedno hledisko poskytuje vynález vakcínu, která vytváří ochrannou odpověď proti infekcím S. pneumoniae, které se účastní polypeptid, který obsahuje člen vybraný ze skupiny sestávající z:

(a) aminokyselinové sekvence, která vytváří alfa helikální strukturu a která je alespoň z 85 % shodná s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID č.:1 a která neobsahuje cholin vázající oblast a (b) izolovaného zkráceného úseku přírodně se vyskytujícího polypeptidu S. pneumoniae, který obsahuje alfa helikální část, která je alespoň z 85 %

00 0

0 0 shodná s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID č : 1 a neobsahuje cholin vázající část, (c) izolovaného zkráceného úseku přírodně se vyskytujícího polypeptidu S. pneumoniae, který obsahuje alfa helikální část, která je alespoň z 90 % shodná s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID č.: 19 a neobsahuje cholin vázající oblast. Takový izolovaný zkrácený úsek polypeptidu je s výhodou člen vybraný ze skupiny sestávající ze SEQ ID č.: 3 až 18, a tento izolovaný polypeptid neobsahuje cholin vázající oblast a v příslušných případech HPS oblast; nebo jejich fragment, který obsahuje alespoň alfa helikální úsek, který odpovídá konvenční sekvenci SEQ ID č.: 1. Obzvlášť výhodné jsou vakcíny, které užívají takový zkrácený úsek polypeptidů, který obsahuje alespoň takovou alfa helikální oblast nebo používají rekombinantní imunogenní polypeptid obsahující alespoň dva takové alfa helikální úseky. Takový polypeptid může být rekombinantní polypeptid obsahující vícenásobné alfa helikální oblasti z jednoho nebo více zkrácených úseků. Dále jsou výhodné rekombinantní imunogenní poíypeptidy obsahující alespoň dvě alfa helikální oblasti odpovídající alfa helikálním oblastem dvou nebo více zkrácených úseků z různých typů pneumokokální bakterie. Takový polypeptid může být rekombinantní polypeptid obsahující vícenásobné alfa helikální oblasti z jednoho nebo více různých typů pneumokokální bakterie.

V souladu s vynálezem je zde poskytován izolovaný polypeptid obsahující zkrácený polypeptid vázající se na povrchy, odvozený z S. pneumoniae, kde uvedený izolovaný polypeptid obsahující alfa helikální oblast, jejíž aminokyselinová sekvence obecně odpovídá aminokyselinové sekvence SEQ ID č.: 1, ale neobsahuje cholin vázající oblast. Uvedený izolovaný polypeptid také s výhodou neobsahuje žádné přirozeně se vyskytující repetice oblasti tvořící alfa helix a vypouští HPS aminokyselinovou sekvenci, která by zde mohla být přítomna.

Předmětem vynálezu je použití imunogenní kompozice pro vakcínu (nebo výroba protilátek, které by mohly být použity jako diagnostické látky nebo pro pasivní vakcinaci) obsahující imunogenní polypeptid, který obsahuje pneumokokální polypeptid vázající se na povrchy s alfa helikální oblastí, ze které byla odstraněna cholin vázající část. V jednom příkladu provedení vynálezu jsou uvažovány takové zkrácené proteiny (přírodní, nebo rekombinantně vyrobené, stejně jako funkční analogy) z bakterie S. pneuΦ φφφφ φφ φφ ·« * φ · · · φ 9 ΦΦΦ φφφφ · φ φ · ·

Φ Φ Φ Φ Φ 9 Φ

ΦΦ ΦΦΦΦ ΦΦ ΦΦΦ moniae. Zejména jsou uvažovány polypeptidy S. pneumoniae, které mají jedinou alfa helikální oblast, která neobsahuje žádné HPS oblasti a cholin vázající oblasti přirozeného proteinu.

Obzvláště výhodné provedení vynálezu je imunogenní kompozice pro vakcínu (nebo pro výrobu imunogenu pro výrobu protilátek užívaných pro diagnózu nebo vakcinaci), kde aktivní složkou imunogenní kompozice je izolovaný polypeptid obsahující alespoň jeden člen vybraný ze skupiny sestávající z:

(a) aminokyselinové sekvence, která je vybrána z SEQ ID č. 3 až 19, (b) polypeptidu, který má alespoň 90% shodnost s (a), s výhodou alespoň 95% shodnost s (a) a ještě výhodněji alespoň 97% shodnodt s (a), nebo (c) fragmentu (a) nebo (b), kde takový fragment obsahuje alespoň jednu alfa helikální oblast, která odpovídá konvenční sekvenci SEQ ID č. 1. a uvedený fragment neobsahuje cholin vázající oblast. Takové vakcíny užívají s výhodou polypeptid, který neobsahuje ani cholin vázající oblast, ani HPS oblast, která se objevuje jako část aminokyselinových sekvencí v přírodních proteinech.

Další výhodné provedení vynálezu poskytuje vakcínu, která obsahuje alespoň jeden izolovaný polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci, která má alespoň 85% shodnost (s výhodou 87% shodnost a ještě výhodněji 90% shodnost) se SEQ ID č.: 1, kde izolovaný polypeptid neobsahuje cholin vázající část a tam, kde je to možné, chybí také s výhodou HPS část. Polypeptid může také s výhodou obsahovat jednu nebo více N-koncových sekvencí, které jsou umístěny na 5' konci alfa helikálních oblastí v polypeptidech, které mají aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny sestávající ze SEQ ID č. : 3 až 18 nebo podobných. Zkrácený polypeptid může také obsahovat jednu nebo více prolinových oblastí (oblast „P“ na obr. 1) a/nebo spojovací oblast (oblast „X“ na obr. 1).

Z dalšího hlediska mohou být podle vynálezu použity imunogenní kompozice pro výrobu protilátek pro diagnostiku pneumokokálních infekcí nebo pro výrobu vakcín k profylaxi a/nebo léčbě takových pneumokokálních infekcí, stejně jako posilujících vakcín pro udržení vysokého titru protilátek proti imunogenu (imunogenům) imunogenní kompozice.

Zatímco se uvažovalo o jiných antigenech pro výrobu protilátek k diagnóze a k profylaxi a/nebo léčbě pneumokokálních infekcí, je zde potřeba lepších a účinnějších vakcín. Takové vakcíny by měly mít zlepšený nebo zesílený účinek v prevenci bakteri9 99 9

9 9 • 9 • 9 9

9 9 9 9 9

9999 · 9 999 álních infekcí přenášených pneumokoky, které mají polypeptidy vázající se na povrchy. Dále, abychom se vyhnuli zbytečným výdajům a poskytli širokou ochranu proti širokému spektru pneumokokálních serotypů, je zde potřeba polypeptidů, které obsahují imunogenní aminokyselinovou sekvenci, která odpovídá části pneumokokálních polypeptidů vázajících se na povrchy, která je vysoce chráněnou částí mezi různými typy pneumokoků. Takové polypeptidy s výhodou neobsahují aminokyselinové sekvence odpovídající jiným částem přírodních polypeptidů, jako je například cholin vázající oblast a/nebo HPS oblast.

Přetrvává potřeba zlepšených antigenních kompozic, které obsahují vysoce chráněné oblasti polypeptidů, které se váží k povrchu pneumokokálních bakterií a stimulují tak tvorbu specifického antiséra o vysokém titru, čímž zajistí ochranu proti infekci patogenními pneumokokálními bakteriemi a také je lze použít jako diagnostická činidla.

V tomto ohledu jsou zkrácené polypeptidy, funkční variantní analogy a rekombinantně vyrobené zkrácené polypeptidy podle vynálezu použitelné jako imunogeny pro přípravu vakcínové kompozice, která stimuluje tvorbu protilátek, které dodají imunitu vůči patogenním druhům bakterií. Příprava vakcín, které obsahují přečištěné proteiny jako antigenní složky, je dobře známá v oboru.

Vakcíny se obecně připravují ve formě vhodné pro injekční podávání, ve formě vodných roztoků nebo suspenzí. Vakcíny na bázi oleje jsou také dobře známy například pro inhalování. Mohou také být formulovány pevné formy, které jsou před použitím rozpuštěny nebo suspendovány. Farmaceutické nosiče, které se obecně přidávají, jsou kompatibilní s aktivními složkami a přijatelné pro farmaceutické použití. Příklady takových nosičů zahrnují, ale nejsou omezeny na: vodu, solný roztok, dextrózu nebo glycerol. Mohou být použity také kombinace nosičů.

Kompozice vakcín mohou dále obsahovat přídavné látky pro stabilizaci pH nebo jako pomocné látky, zvlhčující činidla nebo emulgátory, které mohou sloužit ke zlepšení účinnosti vakcíny.

Vakcíny jsou obecně formulovány pro parenterální podávání a jsou injektovány buď subkutaneálně nebo intramuskulárně. Takové vakcíny mohou také být formulovány jako čípky nebo pro orální podávání, s použitím postupů známých v oboru.

Množství vakcíny dostatečné pro dodání imunity vůči patogenním bakteriím je určeno postupy dobře známými odborníkům v oboru. Toto množství bude záviset na charakteristice příjemce vakcíny a požadované úrovni imunity. Obvykle bude množství podávané vakcíny založeno na posouzení odborného lékaře. Když jsou vakcíny podá17 ··«· ·· ·· ·« 9 • · · · · · · 9 9 • · · · · · 9 · 9 ♦ · · · 9 9 9 · « • · · · · · · • 99 · · 9 9 9 9 9 9 9 9 9 vány subkutaneálně nebo intramuskulárně, může být podáno množství přečištěného proteinu v rozsahu 50 až 500 μς .

Pojem „potřebný pacient“ znamená člověka, který je infikován nebo by mohl být infikován patogenní pneumokokální bakterií, která vytváří CbpA apod., s výhodou bakterií S. pneumoniae (pro simulaci pacienta za určitých okolností může být použit myší model).

Kromě využití polypeptidů tohoto vynálezu ve formě vakcín je lze použít jako imunogeny ke stimulaci tvorby protilátek v pasivní imunoterapii, jako diagnostická činidla a jako činidla v jiných procesech, např. v afinitní chromatografií.

Polynukleotidy kódující imunogenní polypeptidy popsané výše mohou také mít kódující sekvence zajištěné v rámci značkovací sekvence, což umožňuje přečištění polypeptidů podle vynálezu. Značkovací sekvence může být například hexahistidinová značka poskytovaná vektorem pQE-9 umožňující přečištění dospělých polypeptidů, které jsou napojeny na značku v případě bakteriálního hostitele, nebo značkovací sekvence může být například hemaglutininová (HA) značka v případě savčího hostitele, např. buňky COS-7. Značka HA odpovídá epitopu odvozenému z chřipkového hemaglutininového proteinu (Wilson, I., a kol., Cell, 37: 767 (1984)).

Identifikace vícenásobných spirálovitých struktur alfa helikálních aminokyselinových úseků v polypeptidech S. pneumoniae podle vynálezu může být provedena určením pozic oblastí bohatých na prolin s ohledem na jejich vzájemnou pozici. Oblast „X“, která může být volitelně umístěna mezi dvěma nebo více alfa helikálními strukturami, může hrát roli v tvorbě spirály v rámci spirálové struktury. Pro určení relativního tvaru takovýchto struktur může být použito standardní třírozměrné modelování proteinů. Příkladem je počítačový program Paircoií Scoring Form Program (program „PairCoil“) používaný pro tento typ třírozměrného modelování proteinů, který je popsán v Berger a kol., Proč. Nati. Acad. of Sci. (USA), 92:8259 až 8263 (srpen 1995). Program PairCoil je popsán jako počítačový program, který používá matematický algoritmus k předpovědi umístění svinutých spirálovitých oblastí v aminokyselinových sekvencích. Další příklad takového počítačového programu je popsán ve Wolf a kol., Protein Science 6:1179 až 1189 (červen 1997), který se jmenuje Multicoil Scoring Form Program (program „MultiCoil“). Program MultiCoil je založen na algoritmu PairCoil a je užitečný pro nalezení dimerických a trimerických svinutých spirál.

Z výhodného hlediska poskytuje vynález rekombinantní tvorbu takových polypeptidů v hostitelské bakteriální buňce, která nepatří k druhům S. pneumoniae, aby se vyloučila možnost zahrnutí přírodních polypeptidu vázající se na povrchy, které mají cholin vázající oblast. Výhodným hostitelem je druh takové bakterie, která může být kultivována za takových podmínek, že polypeptid podle vynálezu je vylučován z buňky.

Vynález se také týká vektorů, které zahrnují polynukleotidy kódující jeden nebo více polypeptidů podle vynálezu, které obsahují vysoce chráněnou alfa helikálni aminokyselinovou sekvenci a současně neobsahují oblast kódující cholin vázající aminokyselinovou sekvenci, hostitelské buňky, které jsou geneticky upravené pomocí vektorů podle vynálezu, a výroby takových imunogenních polypeptidů rekombinantními technikami v izolované a podstatně imunogenicky čisté formě.

Hostitelské buňky jsou geneticky upravené (transdukované nebo transformované nebo transfektované) pomocí vektorů, které obsahují polynukleotid, který kóduje polypeptid obsahující vysoce chráněnou alfa helikálni oblast, ale neobsahuje cholin vázající oblast, nebo vektorů podobných vektorům podle vynálezu, což může být například klonovací vektor nebo expresní vektor. Vektor může být například ve formě plazmidu, virové částice, fágu atd. Upravené hostitelské buňky mohou být kultivovány v konvenčním živném médiu upraveném tak, aby bylo vhodné k aktivaci promotorů, výběru transformantů nebo amplifikaci polynukleotidů, které kódují takové polypeptidy. Takové kultivační podmínky, jako je například teplota, pH, apod., jsou ty, které byly dříve použity pro hostitelskou buňku vybranou pro expresi a budou dobře známy běžnému odborníku.

Vektory obsahují chromozomální, nechromozomální a syntetické DNA sekvence, například deriváty SV40; bakteriální plazmidy; fágy DNA; bacilovirus; kvasinkové plazmidy; vektory odvozené od kombinací plazmidů a fágy DNA, virovou DNA jako jsou například kravské neštovice, adenovirus, virus planých neštovic a pseudovzteklina. Může být však použit jakýkoliv jiný vektor, pokud je replikovatelný a životaschopný v hostiteli.

Vhodná DNA sekvence může být vložena do vektoru mnoha různými postupy. Obvykle je DNA sekvence insertována do místa (míst) pro vhodnou restrikční endonukleázu pomocí postupů dobře známých v oboru. Takové a další postupy se jsou v rámci odborných znalostí odborníkům.

DNA sekvence v expresním vektoru je operativně připojena k vhodné expresní řídící sekvenci (sekvencím) (promotoru) pro řízení syntézy mRNA. Jako reprezentativní příklady takových promotorů zde mohou být zmíněny: LTR nebo SV40 promotor, E. coli lac nebo trp, fágový promotor lambda P_L a další promotory známé v řízené expresi genů v prokaryotických nebo eukaryotických buňkách nebo v jejich virech. Expresní • ♦··· ·· ·♦ c« • · · · · · · 4 · · • ··· «· · · · • · · · · · · »· ·*·· *♦ 999 vektor také obsahuje ribozom vázající místo pro iniciaci translace a ukončení transkripce. Vektor může také obsahovat vhodné sekvence pro amplifikaci exprese.

Expresní vektory navíc s výhodou obsahují jeden nebo více volitelných značkovacích genů, které určují fenotypový znak pro výběr transformovaných hostitelských buněk, jako je např. dihydrofolátreduktáza nebo odolnost vůči neomycinu u kultury eukaryotíckých buněk nebo např. odolnost vůči tetracyklinu nebo ampicilinu u E. coli.

Vektor obsahující vhodnou DNA sekvenci, jak byla popsána výše, stejně jako vhodný promotor nebo kontrolní sekvenci, může být použit k transformaci vhodného hostitele, aby tento hostitel mohl exprimovat proteiny.

Jako reprezentativní příklady takových vhodných hostitelů lze uvést: buňky bakterií jako je nap. E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium; buňky hub, jako jsou např. kvasinky; buňky hmyzu jako je Drozofila S2 a Spodoptera Sf9; buňky zvířat jako jsou např. buňky melanomů CHO, COS nebo Bowesova melanomu; adenoviry; buňky rostlin atd. Má se za to, že výběr vhodného hostitele je v rámci znalostí odborníků podle toho, co zde bylo řečeno.

Konkrétněji, vynález také obsahuje rekombinantní konstrukce zahrnující jednu nebo více sekvencí, jak bylo široce popsáno dříve. Konstrukce obsahují vektor, jako např. plazmid nebo virový vektor, do kterého byla insertována sekvence podle vynálezu, v původní nebo opačné orientaci. Ve výhodném aspektu tohoto provedení konstrukce dále obsahuje regulační sekvence, včetně například promotorů operativně připojených k sekvenci. Velké množství vhodných vektorů a promotorů je známo odborníkům a je komerčně dostupné. Následující vektory jsou poskytnuty ve formě příkladu. Bakteriální: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen, lne.), pbs, pD10, phageseript, psiX174, pblueseript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia). Eukaryotické: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia). Může být však použit jakýkoliv jiný plazmid nebo vektor, pokud je replikovatelný a životaschopný v hostiteli.

Oblasti promotorů mohou být vybrány z jakéhokoli žádaného genu s použitím CAT (chloramfenikolová transferáza) vektoru nebo jiných vektorů s volitelnými značkami. Dvěma vhodnými vektory jsou pKK232-8 a pCM7. Uvedené bakteriální promotory zejména obsahují láci, lacZ, T3, T7, gpt, lamda P_R , P_L a TRP. Eukaryotické promotory obsahují CMV bezprostřední raný, HSV thymidinovou kinázu, rané a zpožděné SV40, < ···· 19 11 11 1

II 1 19 9 1 w · «· • · · > · » · » « 4» · 9119 9119 1

2U · 9 · 9 · 9 1 9

III ·«· 11 9991 9*

LTRs z retrovirů a metalothionein-I z myší. Výběr vhodného vektoru a promotoru je v rozsahu schopností průměrného odborníka.

V dalším příkladu provedení se vynález týká hostitelských buněk obsahujících výše popsané konstrukce. Hostitelskou buňkou může být vyšší eukaryotická buňka, jako je např. savčí buňka, nebo nižší eukaryotická buňka, jako je např. buňka kvasinek, nebo může být hostitelská buňka prokaryotická jako je např. bakteriální buňka. Vložení konstrukce do hostitelské buňky může být provedeno pomocí kalciumfosfátové transfekce, DEAE-Dextranem zprostředkované transfekce nebo elektroporace (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)).

Konstrukce v hostitelských buňkách mohou být použity konvenčním způsobem k tvorbě genových produktů kódovaných rekombinantní sekvencí. Jiná možnost spočívá v tom, že polypeptidy podle vynálezu mohou být vyráběny synteticky pomocí konvenčních peptidových syntetizátorů.

Vyzrálé proteiny mohou být exprímovány v savčích buňkách, kvasinkách, nebo bakteriích, nebo jiných buňkách pod kontrolou vhodných promotorů. K výrobě takových proteinů může také být použit bezbuněčné translační systémy, které využívají RNA řetězce odvozené od DNA konstrukcí podle vynálezu. Vhodné klonovací a expresní vektory pro použití v prokaryotickém a eukaryotickém hostiteli jsou popsány v Sambrook, a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), jejich popis je zde zahrnut tímto odkazem.

Transkripce DNA kódující polypeptidy podle vynálezu u vyšších eukaryot může být zvýšena vložením zesilovací sekvence do vektoru. Zesilovače jsou cis-aktivní elementy DNA, většinou asi od 10 do 300 párů bází, které působí na promotor pro zvýšení jeho transkripce. Příklady zahrnují zesilovač SV40 na pozdní straně replikačního konce o 100 až 270 párech baží, cytomegalovirový zesilovač raného promotoru, polyomavirový zesilovač pozdního konce replikace a adenovirový zesilovač.

Rekombinantní expresní vektory budou obecně zahrnovat počátky replikace a volitelné značky umožňující transformaci hostitelské buňky, např. gen pro odolnost vůči ampicilinu u E. coli a gen TRP1 S. cerevisiae a promotor odvozený z vysoce exprimovaného genu pro řízení transkripce ve směru strukturální sekvence. Takové promotory mohou být odvozeny od operonů kódujících glykolytické enzymy, jako je například 3-fosfoglycerátkináza (PGK), α-faktor, kyselá fosfatáza, nebo proteiny tepelného šoku, a další. Heterologní strukturální sekvence je uvedena do správné fáze se sekvencemi iniciace translace a terminace. Heterologní sekvence mohou volitelně • · · · kódovat fúzní protein včetně N-koncového identifikačního peptidu, který má požadované charakteristiky, například stabilizaci nebo zjednodušené přečištění exprimovaného rekombinantního produktu.

Vhodné expresní vektory pro použití u bakterií jsou konstruovány pomocí inzerce strukturální sekvence DNA, která kóduje požadovaný protein společně s vhodnou sekvencí iniciace translace a terminační sekvencí ve vhodné čtecí fázi s funkčním promotorem. Vektor bude zahrnovat jednu nebo více fenotypových výběrových značek a počátek replikace, který zajistí uchování vektoru a, je-li to žádoucí, i amplifikaci vektoru v hostiteli. Vhodnými prokaryotickými hostiteli pro transformaci jsou: E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium a různé druhy rodů Pseudomonas, Streptomyces a Staphylococcus, ačkoli mohou být použiti také mnozí jiní.

Jako reprezentativní, ale neolimitující příklad mohou být uvedeny expresní vektory pro použití v bakteriích, které mohou obsahovat volitelnou značku a bakteriální počátek replikace, odvozené od komerčně dostupných plazmidů, které obsahují genetické elementy známého klonovacího vektoru pBR322 (ATCC 37017). Takové komerční vektory obsahují např. pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Upsala, Švédsko) and GEM1 (Promega Biotec, Madison, Wl, USA). Tyto pBR322 „páteřní“ úseky jsou kombinovány s vhodným promotorem a strukturální sekvencí, která má být exprimována.

Po transformaci vhodného rodu hostitele a po nárůstu rodu hostitele do vhodné hustoty buněk je zvolený promotor indukován vhodnými prostředky (změnou teploty nebo chemicky) a buňky jsou dále kultivovány.

Buňky jsou obvykle sklizeny centrifugací, roztrhány fyzikálními nebo chemickými prostředky a výsledný surový extrakt je dále čištěn.

Mikrobiální buňky používané pro expresi proteinů mohou být roztrhány jakoukoliv konvenční metodou včetně cyklického zmražování, sonikace, metodou „french press“, mechanicky nebo s použitím činidel pro lýzu buněk, tyto postupy jsou dobře známé odborníkům v dané oblasti. Avšak hostitelské buňky jsou s výhodou ty, které vylučují polypeptidy a umožní tak získat polypeptidy z kultivačního média.

Pro expresi rekombinantních proteinů mohou být také použity různé systémy savčích buněčných kultur. Příklady savčích expresních systémů jsou: COS-7 linie buněk zfibroblastů opičích ledvin, což je popsáno v Gluzman, Cell, 23:175 (1981) a jiné buněčné linie schopné exprimovat kompatibilní vektor, např. C127, 3T3, CHO, HeLa a BHK buněčné linie. Savčí expresní vektory budou obsahovat počátek replikace a vhodný promotor a zesilovač a také jakákoli potřebná vazebná místa pro ribozom, póly22

adenylační místo, spojená donorová a akceptorová místa, sekvence ukončení transkripce a 5' lemující netranskribované sekvence. DNA sekvence odvozené z SV40 vazby a polyadenylační místa mohou být použity k získání požadovaných netranskribovaných genetických elementů.

Polypeptidy mohou být znovu získány a/nebo přečištěny z rekombinantních buněčných kultur známými metodami regenerace a přečištění proteinů. Takové metody mohou zahrnovat vysrážení ze síranu amonného nebo etanolu, kyselou extrakci, anionovou nebo kationovou výměnnou chromatografií, fosfocelulózovou chromatografií, hydrofobní interakční chromatografií, afinitní chromatografií, hydroxylapatitovou chromatografii a lecitinovou chromatografií. Kroky opětovného svinutí proteinu mohou být použity, je-li to potřebné, k dokončení konfigurace zralé bílkoviny. S ohledem na to mohou být v takovém procesu opětovného svinutí použity chaperony. Pro výsledné přečištění nakonec může být použita vysoce výkonná kapalinová chromatografie (HPLC).

Polypeptidy, které jsou užitečné jako imunogeny v tomto vynálezu, mohou být přírodně přečištěný produkt nebo produkt chemické syntézy nebo mohou být vyrobeny rekombinantními technikami z prokaryotického nebo eukaryotického hostitele (například buněčnými kulturami bakteriálními, kvasinkovými, vyššími rostlinami, hmyzem a savčími buněčnými kulturami). V závislosti na hostiteli, který byl použit k výrobě rekombinantních polypeptidů, mohou být polypeptidy podle vynálezu glykosylované nebo mohou být neglykosylované. Obzvláště výhodnými imunogeny jsou zkrácené pneumokokální polypeptidy, které obsahují jednu vysoce chráněnou alfa helikální oblast, ale neobsahují cholin vázající oblast nebi HPS oblast. Protilátky proti takovým polypeptidům se tedy vážou na jiné pneumokokální bakteriální druhy (vedle druhů S. pneumoniae, z nichž takové polypeptidy byly odvozeny) a vakcíny proti takovým S. pneumoniae mohou vytvořit ochranu proti jiným pneumokokálním bakteriálním infekcím.

Postupy pro izolaci individuálně exprimovaných alfa helix obsahujících polypeptidů mohou zahrnovat metody rekombinantní exprese/izolace, což jsou postupy známé v oboru. V typických příkladech takové izolace může být použita protilátka k chráněné oblasti proteinu nebo k His značce nebo v sekvenci začínající nebo končící štěpení, která je exprimována jako část proteinové struktury.

Polyeptidy, jejich fragmenty nebo jiné deriváty nebo jejich analogy nebo buňky, které je exprimují, mohou být použity jako imunogen pro tvorbu protilátek k nim. Tyto protilátky mohou být například polyklonální nebo monoklonální protilátky. Vynález také zahrnuje chimérický, jednoduchý řetězec a humanizované protilátky, stejně jako Fab • · · · • · $

fragmenty nebo tvorbu Fab expresní knihovny. Pro výrobu takových protilátek a fragmentů mohou být použity různé postupy známé v oboru.

Protilátek vytvořené proti polypeptidům, které odpovídají sekvenci podle vynálezu, lze získat přímým injektováním polypeptidů do zvířete nebo podáváním polypeptidů zvířeti, s výhodou mimo člověka. Takto získaná protilátka se pak bude vázat na polypeptidy sama. Tímto způsobem může být použita dokonce sekvence kódující pouze fragment polypeptidů k tvorbě protilátek, které váží celé přírodní polypeptidy.

Pro přípravu monoklonálních protilátek může být použita jakákoli technika, která poskytuje protilátky tvořené kulturami kontinuálních buněčných linií. Příklady zahrnují hybridomový způsob (Kohler a Milstein, 1975, Nátuře, 256: 495 až 497), triomový způsob (Kozbor a kol., 1983, Immunology Today 4: 72), a způsob EBV hybridomů k produkci lidských monoklonálních protilátek (Cole, a kol., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, lne., str. 77 až 96).

Způsoby popsané pro výrobu jednořetězcových protilátek (U.S. Patent 4 946 778) mohou být upraveny na výrobu jednořetězcových protilátek proti imunogennímu polypeptidu vyráběnému podle vynálezu. Pro exprimování humanizovaných protilátek proti imunogenním polypeptidovým produktům podle vynálezu také mohou být použity transgenické myši.

Pro snadnější pochopení uvedeného popisu a následujících příkladů níže, stejně jako přiložených obrázků, jsou v tabulce 1 níže uvedeny bakteriální zdroje pro polypeptidy ze SEQ ID č. : 3 až 18 a polynukleotidy, které je kódují (SEQ ID č. : 20 až 35 v odpovídajícím pořadí). Je uveden název a/nebo typ bakterie a zdroj, odkud pochází. Sekvence těchto typů bakterií jsou uvedeny pouze pro ilustrativní účely, protože použitím genových sond a/nebo primerů zde popsaných mohou být získány jiné sekvence podobného typu použitím běžné odbornosti v oboru.

• · · 9 9

9 · 99 9 9 9

Tabulka 1

SEQ ID č.	Typ pneumokoka	Zdroj bakterie nebo číslo ATCC
3	1	ATCC 33400
4	2	SPATCC 11733
5	2	ATCC2 (katalog #6302)
6	4	ATCC4 (katalog #6304)
7	6B	ATCC 6B (katalog #6326)
8	18C	SPATCC 18C (ATCC katalog #10356)
9	4	Norský typ 4; Nati. Inst. of Public Health, Norsko Ingeborg Aagerge
10	nezapouzdřený	R6X; Rockefeller Univ., Rob Masure (z D39, typ 2)
11	6B	SBP 105; Boston Univ., Steve Pelton
12	23F	SBP 328; Boston Univ., Steve Pelton
13	14	SBP 331; Boston Univ., Steve Pelton
14	23F	SBP 365; Boston Univ. Steve Pelton
15	9V	SPR 332;Rockefeller Univ., Rob Masure
16	6B	SPSJ 2p; St.Jude Children's Research Hospital, Pat Flynn (klinicky izolovaná látka prošla 1x přes myši kvůli virulenci)
17	14	SPJS 9; St. Jude Children's Research Hospital, Pat Flynn (klinicky izolovaná látka - nosní dírky, pneumonia)
18	19A	SPJS 12; St. Jude Children's Research Hospital, Pat Flynn (klinicky izolovaná látka)

Vynález bude dále popsán pomocí příkladů, které jsou však uvedeny pouze pro lepší porozumění a vynález jimi tedy není limitován. Všechny části nebo množství, není-li uvedeno jinak, jsou hmotnostní.

• · · · · · · ··· • · · · ·· · · ·

Příklad 1

Vytvoření CbpA zkrácených proteinových vektorů

A. Vektor pro CbpA (NR1XR2PC) plné délky

Virulentní serotyp 4 kmene S. pneumoniae, Norsko 4 (získaný od I. Aaberge, National Institute of Public Health, Oslo, Norsko) byl použit jako zdroj šablony genomové DNA pro namnožení polynukleotidu, který kóduje CbpA plné délky. CbpA byl namnožen pomocí PCR s pomocí primerů SJ533 a SJ537, které budou dále popsány.

Degenerovaný dopředný primer SJ533 byl navržen tak, že je založen na CbpA N-koncové sekvenci XENEG poskytnuté H.R. Masure (St. Jude Children's Research Hospital, Memphis, TN). Primer SJ533 = 5' GGC GGA TCC ATG GA(A,G) AA(C,T) GA(A,G) GG 3'. Zahrnuje jak BamHI, tak Ncol restrikční místa a ATG počáteční kodon.

3' reverzní primer SJ37 = 5' GCC GTC GAC TTA GTT TAC CCA TTC ACC ATT GGC 3'. Tento primer obsahuje Sáli restrikční místo pro účely klonování a přírodní stop kodon z CbpA a je založen na typu 4 a sekvenci R6X vytvořené interně.

Výsledek PCR vytvořený z genomové DNA šablony s použitím primerů SJ533 a SJ537 byl digerován s BamHI a Sáli a klonován do expresního vektoru pQE30 (Qiagen, lne.), digerován s BamHI, Xbal a Smál. Z typu R6X šablony vznikl vektor plné délky PMI581 a z typu 4 šablony DNA vznikl vektor plné délky PMI580.

B. Vektor pro zkrácený CbpA protein (NR1XR2)

Přirozeně se vyskytující místo PvuII na konci druhé amino repetice (sekvence nukleové kyseliny 1228 typu 4) bylo využito pro vytvoření zkrácené verze CbpA, která obsahuje pouze aminokonec genu. K vytvoření zkráceného klonu byl digerován klon PMI580 plné délky (typ 4) nebo PMI581 (R6X) s PvuII a Xbal, a aminokonec spolu s částí expresního vektoru byl izolován podle velikosti na agarózovém gelu. pQE30 byl digerován s Xbal a Smál a řetězec odpovídající druhé polovině vektoru byl také izolován podle velikosti na agarózovém gelu. Obě poloviny byly spojeny a klony identifikovány restrikční digerací a poté exprimovány. V tomto případě je použitý stop kodon v expresním vektoru, takže exprimovaný protein je větší než předpokládaná velikost, což je způsobeno přidánými aminokyselinami na 5' a 3' konec klonového místa.

C. Vektor pro zkrácený CbpA protein (NR1X) ···· · · · · • · · · · • · · · · ·

Podobný postup byl použit pro expresi pouze první aminorepetice CbpA. Bylo zde použito přirozeně se vyskytující XmnI místo mezi dvěma aminorepeticemi (sekvence nukleové kyseliny 856 typu 4). Cbpa klon plné PMI580 plné délky byl digerován s XmnI a AatlI. Expresní vektor pQE30 byl digerován s AatlI a Smál. Dva různé fragmeny byly opět spojeny a klony byly vytříděny restrikční digescí a exprimovány.

Příklad 2

Exprese zkráceného proteinu CbpA z expresních vektorů

Všechny proteiny jsou exprimovány z vektorů popsaných v příkladech 1A až 1C v expresním systému Qia (Qiagen) s použitím expresního vektoru pQE30 E. coli a označené proteiny His6 amino konce jsou detekovány pomocí Westernblotové analýzy s použitím jak antihistidinových protilátek, tak genově specifických protilátek.

Exprimované zkrácené CBP byly přečištěny, jak je popsáno dále. Z destičky s bakteriemi byla vybrána jedna kolonie bakterií obsahující rekombinantní plazmid a nechala se růst přes noc při teplotě 37 °C v 6,0 ml LB pufru s 50 μg/ml kanamycinu a 100 pg/ml ampicilinu. Těchto 6,0 ml LB pufru bylo přidáno do 1 litru LB s antibiotiky ve výše uvedených koncentracích. Kultura byla míchána při 37 °C až do Asoo = ~0,400. Do 1 litru kultury bylo přidáno 1M IPTG, aby bylo dosaženo konečné koncentrace 1 mM. Kultura byla poté třepána při 37 °C po dobu 3 až 4 hodiny. 1 litr kultury byl umístěn na 15 minut do odstředivky typu J-6B v 250 ml kónických zkumavkách při 4000 ot./min. Supernatant byl odstraněn a zbytek byl uskladněn při teplotě -20 °C do dalšího použití.

Tento 11 zbytek byl znovu suspendován v 25 ml 50 mM NaFfePO^ 10 ml Tris, 6M GuCI, 300 mM NaCI, pH 8,0 (Pufr A). Tato směs se poté nechala rotovat při pokojové teplotě po dobu 30 minut. Poté byla směs dvakrát podrobena ultrazvukové vibraci (VibraCell Sonicator, Sonics and Materials, lne., Danbury, CT) s užitím mikrotipu, po dobu 30 s, s 50% pracovním cyklem a s výstupem nastaveným na 7. Směs se nechala rotovat v rotoru JA20 po dobu 5 minut při 10 K a supernatant byl odstraněn a vyhozen. Supernatant byl umístěn na 10 ml Talon (Clonetech, Palo Alto, CA) sloupec pryskyřice zařazený do GradiFrac systému (Pharmacia Biotech, Upsala, Sweden). Sloupec byl vyvážen 100 ml pufru A a promyt 200 ml tohoto pufru. Objemový pH gradient s použitím 100% 50mM NahhPCU, 8M močoviny, 20mM MES, pH 6,0 (pufr B) jako konečného

cílového pufru překročil celkový objem 100 ml. Protein byl promyt 30% pufrem B. Promytý materiál byl sesbírán a sloučen.

Pro opětovné svinutí byla provedena dialýza objemem 2 I PBS při pokojové teplotě po dobu přibližně 3 hodiny s využitím dializačních hadic s molekulární hmotností přerušenou na 14 000. Vzorek byl potom dialyzován přes noc ve 2 I PBS při teplotě 4 °C. Další změna pufru byla dokončena v průběhu koncentrování proteinů s použitím cenírifugačních 30otáčkových kolon přidáním PBS při udrženíotáčení a opětovného otáčení. Koncentrace proteinů byla určena pomocí proteinové analýzy BCA a čistota byla zviditelněna pomocí Coomassie barveného 4 až 20% SDS - PAGE gelu.

Příklad 3

Pasivní ochrana anti-CbpA zkráceným antisérem

A. Vytvoření králičího imunitního séra

Králičí imunitní sérum proti zkrácenému CbpA bylo vytvořeno v Covance (Denver, PA). Po získání preimunitního séra byl novozélandský bílý králík (#ME101) imunizován 250 pg CbpA zkráceného NR1XR2 (obsahující jak alfa helix I, tak alfa helix II aminokyselinové repetice N-konce, které se připravují z 483:58) v úplném Freundově adjuvans. Králíku byla podána dávka 125 pg zkráceného CbpA v neúplném Freundově adjuvans 21. dne, krev mu byla odebrána 31. a 52, dne.

B. Pasivní ochrana u myší

Myši C3H/HeJ (5 myší ve skupině) bylo pasivně imunizováno intraperitoneálně 100 pl králičího séra v ředění 1:2 ve sterilním PBS (preimunitním sérem nebo imunitním sérem 31. dne). Hodinu po podání séra byly myši vystaveny 1600 cfu virulentnímu serotypu 6B S. pneumoniae, kmen SP317 (získáno z H.R. Masure). Myši byly sledovány po dobu 14 dní na přežití.

Osmdesát procent myší imunizovaných králičím imunitním sérem vytvořeným proti zkrácenému CbpA NR1XR2 proteinu přežilo nákazu 14 dní (obr. 2). Všechny myši imunizované preimunitním králičím sérem zemřely do 7. dne.

C. Pasivní ochrana u myší (silnější nákaza)

Myši C3H/HeJ (10 myší ve skupině) byly pasivně imunizovány intraperitoneálně

100 pl králičího séra v ředění 1:2 ve sterilním PBS (preimunitním sérem nebo imunitním

sérem 52. dne). Hodinu po podání séra byly myši vystaveny 3450 cfu virulentnímu serotypu 6B S. pneumoniae, kmen SP317. Myši byly sledovány po dobu 10 dní na přežití.

Sto procent myší imunizovaných králičím imunitním sérem vytvořeným proti zkrácenému CbpA NR1XR2 proteinu přežilo nákazu 10 dní (obr. 3). Devadesát procent myší imunizovaných preimunitním králičím sérem bylo 10. dne mrtvých.

D. Pasivní ochrana u myší (vůči silné virulenci)

Myši C3H/HeJ (10 myší ve skupině) byly pasivně imunizovány intraperitoneálně 100 μΙ králičího séra v ředění 1:2 ve sterilním PBS (preimunitním sérem nebo imunitním sérem 52. dne). Hodinu po podání séra byly myši vystaveny 580 cfu virulentnímu serotypu 6B S. pneumoniae, kmen SPSJ2 (poskytl P. Flynn, St. Jude Children's Research Hospital, Memphis, TN). Myši byly sledovány po dobu 10 dní na přežití.

Padesát procent myší imunizovaných králičím imunitním sérem vytvořeným proti zkrácenému CbpA NR1XR2 proteinu přežilo nákazu 10 dní (obr. 4). Všechny myši imunizované preimunitním králičím sérem byly mrtvé 8. dne.

Tyto údaje ukazují, že protilátky specifické pro CbpA jsou ochranou proti systémové pneumokokální infekci. Z údajů dále plyne, že cholin vázající oblast není nezbytná pro ochranu, protože protilátka specifická pro zkrácený protein NR1XR2 s chybějícími repeticemi vázajícími cholin byla postačující pro ochranu. Nadto bylo sérum zaměřené proti rekombinantnímu proteinu CbpA založené na sekvenci serotypu 4 ochranou i proti napadení dvěma odlišnými kmeny serotypu 6B.

Příklad 4

Aktivní ochrana zkráceným anti-CbpA NR1X a NR1XR2

A. Aktivní ochrana vakcínou se zkráceným NR1X

Myši C3H/HeJ (10 myší ve skupině) byly imunizovány intraperitoneálně CbpA zkráceným proteinem NR1X (15 μς v 50 μΙ PBS, plus 50 μΙ úplného Freundova adjuvans). Kontrolní skupině 10 myší bylo podáno jen PBS a adjuvans. Druhá imunizace byla provedena o 4 týdny později, 15μρ proteinu intraperitoneálně s neúplným Freundovým adjuvans (kontrolní skupině bylo podáno PBS plus IFA). Krev byla odebrána (žilná periferní krev) v týdnech 3, 6 a 9 pro analýzu imunitní odpovědi. Výsledek testu ELISA ukázal, že titr zkráceného anti-CbpA testovaného séra z konce testu z 10

myší imunizovaných CbpA 9 týdnů je 4 096 000. V séru kontrolních myší nebyly zjištěny žádné protilátky. Myši byly v 10. týdnu vystaveny 560 cfu serotypu 6B S. pneumoniae kmen SPSJ2. Myši byly sledovány 14 dní na přežití.

Osmdesát procent myší imunizovaných CbpA zkráceným proteinem NR1X přežilo nákazu 14 dní (výsledky jsou na obr. 5). Všechny myši kontrolní skupiny byly mrtvé

8. dne.

B. Aktivní ochrana vakcínou se zkráceným NR1XR2

Myši C3H/HeJ (10 myší ve skupině) byly imunizovány intraperitoneálně CbpA zkráceným proteinem NR1XR2 (15 pg v 50 μΙ PBS, plus 50 μΙ úplného Freundova adjuvans). Kontrolní skupině 10 myší byl podán pneumokokální rekombinantní protein SP90 a adjuvans. Druhá imunizace byla provedena o 4 týdny později, 15 pg proteinu intraperitoneálně s neúplným Freundovým adjuvans. Krev byla odebrána (žílná periferní krev) v týdnech 3, 6 a 9 pro analýzu imunitní odpovědi. Výsledek testu ELISA ukázal, že titr zkráceného anti-CbpA testovaného séra z 10 myší imunizovaných CbpA v 9, týdnu je 4 096 000. Myši byly v 10. týdnu vystaveny 680 cfu serotypu 6B S. pneumoniae kmen SPSJ2. Myši byly sledovány 14 dní na přežití.

Padesát procent myší imunizovaných CbpA zkráceným proteinem NR1XR2 přežilo nákazu 14 dní (výsledky jsou na obr. 6). Všechny myši kontrolní skupiny byly mrtvé

9. dne.

Tyto výsledky ukazují, že imunizace rekombinantními CbpA zkrácenými proteiny vyvolává tvorbu specifických protilátek pro ochranu proti systémové pneumokokální infekci a následné smrti. Z údajů dále plyne, že cholin vázející oblast není nezbytná pro ochranu, protože imunogeny byly zkrácené proteiny NR1X a NR1XR2. Kromě toho můžeme na základě výsledků usuzovat, že jedna amino koncová repetice může být postačující pro vyvolání ochranné odpovědi. Ukazuje se zde i křížová ochrana, protože rekombinantní pneumokokální protein byl vytvořen na základě DNA sekvence serotypu 4 a ochrana byla pozorována po nakažení izolovaným serotypem 6B.

Jsou možné početné modifikace a variace podle vynálezu s ohledem na dříve uvedené postupy a ve shodě s patentovými nároky je možné vynález uvádět do praxe také jinak, než zde bylo popsáno.

0 000 0 0 ·* 00 0

000 0 00 0 0 000 0000 00 0 00 0 0 0000 0000 0 0 0000 000 • 00000 00 0000 00 00 ·. » Z Z

Claims (21)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Vakcína proti bakteriálním infekcím obsahující imunogen, který je zkrácený polypeptid pneumokokálního proteinu vázajícího se na povrchy, analog nebo varianta mající vysoce chráněnou imunogenní alfa helikální část s ohledem na různé typy pneumokokálních bakterií, kde polypeptid neobsahuje cholin vázající část.
2. 2. Vakcína podle nároku 1,vyznačující se tím, Že aminokyselinová sekvence uvedené alfa helikální části má alespoň 75% shodnost s aminokyselinovou sekvencí ze SEQ ID č.: 1.
3. 3. Vakcína podle nároku 1,vyznačující se tím, Že aminokyselinová sekvence uvedené alfa helikální části má alespoň 85% shodnost s aminokyselinovou sekvencí ze SEQ ID č.: 1.
4. 4. Vakcína podle nároku 1,vyznačující se tím, Že aminokyselinová sekvence uvedené alfa helikální části má alespoň 90% shodnost s aminokyselinovou sekvencí členu, který se skládá z:

   a) aminokyselinové sekvence ze SEQ ID č.: 1 a

   b) aminokyselinové sekvence ze SEQ ID č.: 19
5. 5. Vakcína podle nároku 1,vyznačující S θ tím, Že aminokyselinová sekvence uvedené alfa helikální části má alespoň 95% shodnost s aminokyselinovou sekvencí členu vybraného ze skupiny sestávající z:

   a) aminokyselinové sekvence ze SEQ ID č.: 1 a

   b) aminokyselinové sekvence ze SEQ ID č.: 19
6. 6. Vakcína podle nároku 1,vyznačující se tím, Že uvedená vakcína slouží k prevenci nebo léčbě infekcí zánětu středního ucha, sepse, meningitdy a lobární pneumonie.
7. 7. Vakcína podle nároku 6, vyznačující se tím, Že uvedená vakcína je proti invazní infekci.
8. 8. Vakcína podle nároku 6, vyznačující se tím, Že uvedená vakcína je proti infekcím zánětu středního ucha způsobeným S. pneumoniae.
9. 9. Vakcína podle nároku 1,vyznačující se tím, Že uvedený zkrácený polypeptid obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která má alespoň 90% • 99 · 9 9 9 9 99 • · · · · 9 9

   999 9 9 9 9 9

   9 9 9 9 9 9

   9 9 9 99 999« 99 shodnost s členem vybraným ze skupiny sestávající z aminokyselinových sekvencí ze SEQ ID č.: 3 až 18.
10. 10. Vakcína podle nároku 1,vyznačující se tím, Že uvedený zkrácený polypeptid obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která má alespoň 95% shodnost s členem vybraným ze skupiny sestávající z aminokyselinových sekvencí ze SEQ ID č.: 3 až 18.
11. 11. Protilátka vytvořená proti imunogenu, kterou je zkrácený polypeptid pneumokokálního proteinu vázajícího se na povrchy, analog nebo varianta mající vysoce chráněnou imunogenní alfa helikální část s ohledem na různé typy pneumokokálních bakterií, kde polypeptid neobsahuje cholin vázající část.
12. 12. Protilátka podle nároku 11, V y Z n a Č U j í C í se tím, že aminokyselinová sekvence uvedené alfa helikální části má alespoň 85% shodnost s aminokyselinovou sekvencí ze SEQ ID č.: 1.
13. 13. Protilátka podle nároku 11, V y Z n a Č U j í C í se t í m , že aminokyselinová sekvence uvedené alfa helikální části má alespoň 90% shodnost s aminokyselinovou sekvencí členu vybraného ze skupiny sestávající z:

    a) aminokyselinové sekvence ze SEQ ID č.: 1 a

    b) aminokyselinové sekvence ze SEQ ID č.: 19
14. 14. Protilátka podle nároku 11,vyznačující se tím, že aminokyselinová sekvence uvedené alfa helikální části má alespoň 95% shodnost s aminokyselinovou sekvencí členu vybraného ze skupiny sestávající z:

    a) aminokyselinové sekvence ze SEQ ID č.: 1 a

    b) aminokyselinové sekvence ze SEQ ID č.: 19
15. 15. Protilátka podle nároku 11,vyznačující se tím, Že aminokyselinová sekvence uvedené alfa helikální části má alespoň 95% shodnost s aminokyselinovou sekvencí členu vybraného ze skupiny sestávající z aminokyselinových sekvencí ze SEQ ID č.: 3 až 18.
16. 16. Protilátka podle nároku 11, vyznačující se tím, že uvedená protilátka bude detekovat infekce S. pneumoniae.
17. 17. Protilátka podle nároku 15, vyznačující se tím, Že uvedená protilátka je účinná při prevenci a/nebo léčbě infekcí S. pneumoniae.
18. 18. Protilátka podle nároku 15, vyznačující se tím, že uvedená protilátka je účinná při prevenci a/nebo léčbě pneumokokálních infekcí způ32 • ··· Μ ·>

    • · · · · ··· · ♦ · • · · · ·· · tt ···· ·· • · » · sobených typy 1 až 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11 A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19F, 19A, 20, 22F, 23F a 33F bakterie S. pneumoniae.
19. 19. Způsob prevence a/nebo léčby pneumokokálních infekcí v hostiteli zahrnující imunizaci uvedeného hostitele členem vybraným ze skupiny sestávající z:

    a) vakciny podle nároku 2

    b) alespoň jedné protilátky působící proti imunogenu, kterou je zkrácený polypeptid pneumokokálního proteinu vázajícího se na povrchy, analog nebo varianta obsahující aminokyselinovou sekvenci, která má alespoň 90% shodnost s aminokyselinovou sekvencí členu vybraného ze skupiny sestávající ze SEQ ID č.: 3 až 18, kde polypeptid neobsahuje choil vázající část.
20. 20. Polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci, která má alespoň 90% shodnost s členem vybraným ze skupiny sestávající z aminokyselinových sekvencí SEQ ID č.: 3 až 18.
21. 21. Izolovaný polynukleotid obsahující polynukleotidovou sekvenci mající alespoň 90% shodnost s členem vybraným ze skupiny sestávající z :

    a) polynukleotidové kódující sekvence kódující polypeptid obsahující člen vybraný ze skupiny sestávající z aminokyselinových sekvencí každé ze SEQ ID č.: 3 až 18 a