BRPI0612656B1

BRPI0612656B1 - Composição imunogênica, vacina, e, kit de vacina para a administração concomitante ou sequencial

Info

Publication number: BRPI0612656B1
Application number: BRPI0612656-1A
Authority: BR
Inventors: Ralph Leon Biemans; Carine Capiau; Philippe Denoel; Pierre Duvivier; Jan Poolman; Dominique Boutriau
Original assignee: Glaxosmithkline Biologicals S. A.
Priority date: 2005-06-27
Filing date: 2006-06-23
Publication date: 2021-09-08
Also published as: PL1896061T3; US9789179B2; HUE031380T2; IL188072A; HK1116414A1; WO2007000343A3; JP5965512B2; AU2006263963A1; MA29569B1; MA29603B1; CA2612980A1; EP3009146B1; BRPI0612656A2; US10166287B2; US9486515B2; BRPI0612654A2; NO20076302L; PL2878307T3; BRPI0612670A2; DK1896061T3

Abstract

composição imunogênica, vacina, e, kit de vacina para a administração concomitante ou seqüencial o presente pedido expõe uma composição imunogênica, que compreende pelo menos 2 sacarídeos capsulares n. meningitidis diferentes, em que um ou mais é/são selecionados a partir de um primeiro grupo, que consiste de mena, menc, meny e menw, que é/são conjugados a um(uns) carreador(es) de proteína, em que a razão de sacarídeo:proteína (p/p) está entre 1:2 - 1:5, e um ou mais sacarídeos diferentes é/são selecionados a partir de um segundo grupo, que consiste de mena, menc e men w, que é/são conjugados a um(uns) carreador(es) de proteína, em que a razão de sacarídeo:proteína (p/p) está entre 5:1 - 1:1,99.

Description

[001] A presente invenção refere-se a composições imunogênicas, que compreendem sacarídeos capsulares bacterianos conjugados a uma proteína carreadora, em particular àqueles sacarídeos N. meningitidis. Em adição, ela refere-se a vacinas e a kits de vacina que compreendem tais conjugados de sacarídeos, a processos para a produção das composições imunogênicas e a vacinas e ao uso de vacinas e de composições imunogênicas da invenção em terapia. Ela refere-se também a métodos de imunização contra a infecção usando os conjugados de sacarídeo e ao uso dos conjugados de sacarídeo na manufatura de um medicamento.

[002] Neisseria meningitidis é um patógeno humano Gram- negativo, que causa meningite bacteriana. Com base no polissacarídeo capsular do organismo, doze sorogrupos de N. meningitidis foram identificados (A, B, C, H, I, K, L, 29E, W 135, X, Y, e Z). O sorogrupo A (MenA) é a causa mais comum da doença epidêmica na África subsaariana. Os sorogrupos B e C são responsáveis pela maioria de casos em países em desenvolvimento, os casos remanescentes sendo causados por W 135 e Y.

[003] As composições imunogênicas, que compreendem sacarídeos N. meningitidis conjugados a proteínas carreadoras são conhecidos na arte; a proteína carreadora tendo o efeito conhecido de transformar o antígeno de polissacarídeo independente de T em um antígeno dependente de T, capaz de provocar uma resposta de memória imune. Por exemplo, o WO 02/58737 expõe uma vacina, que compreende polissacarídeos capsulares purificados dos sorogrupos de N. meningiditis A, C, W136 e Y, conjugados a uma proteína carreadora. No entanto, este pedido ensina que todos os polissacarídeos devem ser essencialmente conjugados do mesmo modo (através do mesmo agente de ligação à mesma proteína carreadora).

[004] Permanece uma necessidade para que sejam desenvolvidas vacinas conjugadas aperfeiçoadas contra a meningite neisseriana. A presente invenção refere-se à provisão de uma vacina conjugada de polissacarídeo meningocócico, em que a conjugação de cada polissacarídeo é adaptada (preferivelmente a que seja uniforme) de modo a alcançar uma vacina combinada eficaz. Em particular, é vantajoso combinar certos sacarídeos meningocócicos conjugados a seus carreadores de proteína em uma alta razão de sacarídeo:proteína, com outros em uma baixa razão.

[005] Deste modo, em um aspecto da presente invenção, é provida uma composição imunogênica, que compreende pelo menos 2 sacarídeos capsulares N. meningitidis, em que um ou mais é/são selecionados a partir de um primeiro grupo, que consiste de MenA, MenC, Men Y e Men W, que é/são conjugados a um(uns) carreador(es) de proteína, em que a razão de sacarídeo:proteína (p/p) está entre 1:2 -1:5, e um ou mais sacarídeos diferentes é/s/ao selecionados a partir de um segundo grupo, que consiste de MenA, MenC, MenY e MenW, que é/são conjugado (s) a um(uns) carreador(es) de proteína, em que a razão de sacarídeo:proteína (p/p) está entre 5:1 - 1:1,99.

[006] Em uma vacina de MenW, a razão de sacarídeo MenW para a proteína carreadora pode estar entre 5:1-1:1,99, 2:1 - 1:1,99, 1,5:1-1:1,8, 1:1-1:1,7, 1:1,2 -1:16 ou 1:1,4-1:1,5 (p/p). Em uma vacina de MenY, a razão de sacarídeo MenY para a proteína carreadora pode estar entre 5:1- 1:1,99, 2:1- 1:1,99, 1,5:1-1:1,9, 1:1-1:1,8, 1:1,1-1:1,6 ou 1,13- 1:1,4 (p/p). Em uma vacina de MenA, a razão de sacarídeo MenA para a proteína carreadora pode estar entre 1:1 - 1:5, 1:2, 4- 1:4, 1:2,7- 1:3,5, ou 1:2,9 - 1:3,1 (p/p). Em uma vacina de Men C, a razão do sacarídeo Men C para a proteína carreadora pode estar entre 5:1- 1:1,99, 2:1 - 1:1,99, 1,5- 1-1:1, 8, 1,3:1 - 1:1,6, 1,21 - 1:1,4, ou 1,1:1 -1:1,2 (p/p), ou entre 1:2 - 1:5, 1:2,5- 1:4,5, 1:2,71:4,3, 1:3-1:4, ou 1:3,3 - 1:3,5 (p/p).

[007] A razão de sacarídeo para a proteína carreadora (p/p) em um conjugado pode ser determinada através do uso do conjugado esterilizado. A quantidade de proteína é determinada através do uso de um ensaio de Lowry (por exemplo, Lowry et al. (1951), J. Biol. Chem. 193, 265275 ou Peterson et al. Analytical Biochemistry 100, 201-220 (1979)) e a quantidade de sacarídeo é determinada através do uso de ICP - OES (espectroscopia de emissão de plasma óptico acoplada indutivamente) para MenA, ensaio de DMAP para MenC e ensaio de Resorcinol para Men W e MenY (Monsigny et al. (1988) Anal. Biochem. 175, 525 - 530).

[008] Muitas vezes, sacarídeos conjugados através de um agente de ligação apresentam uma incorporação mais alta da proteína carreadora do que quando ligados diretamente à proteína carreadora. Em uma vacina de MenAC da invenção, por exemplo, o sacarídeo MenA pode ser conjugado a uma proteína portadora através de um agente de ligação e MenC diretamente. Em uma vacina de MenCY, MenC pode ser conjugado através de um agente de ligação e MenY diretamente. Em uma vacina de MenACWY, Men A pode ser conjugado através de um agente de ligação e MenCWY diretamente, ou MenAC pode ser diretamente conjugado através de um agente de ligação e MenWY diretamente.

[009] Em um outro aspecto da invenção, é provida uma composição imunogênica, que compreende pelo menos 2 sacarídeos diferentes, conjugados separadamente ao mesmo tipo de proteína carreadora (por exemplo, DT, CRM197, Proteína D ou TT), em que um ou mais sacarídeo(s) é/são conjugados à proteína carreadora, em que a razão de sacarídeo:proteína (p/p) está entre 1:2 - 1:5, e um ou mais sacarídeos diferentes é/são conjugados com a proteína carreadora, em que a razão de sacarídeo:proteína (p/p) está entre 5:1 - 1:1,99.

[010] Por exemplo, em uma vacina de MenAC, MenA pode ser conjugado à proteína carreadora com uma razão de sacarídeo:proteína (p/p) de entre 1:1 -1:5 e MenC conjugado à proteína carreadora com uma razão de sacarídeo:proteína (p/p) de entre 5:1- 1:1,99. Em uma vacina de MenCY, MenC pode ser conjugado à proteína carreadora com uma razão de sacarídeo:proteína (p/p) de entre 1:2 - 1:5 e MenY conjugado à proteína carreadora com uma razão de sacarídeo:proteína (p/p) de entre 5:1 - 1:1, 99. Em uma vacina de MenACWY, MenAC pode ser conjugado à proteína carreadora com uma razão de sacarídeo:proteína (p/p) de entre 1:1 - 1:5 e MenWY conjugado à proteína carreadora com uma razão de sacarídeo:proteína (p/p) de entre 5:1 - 1:1,99, ou MenA pode ser conjugado à proteína carreadora com uma razão de sacarídeo:proteína (p/p) de entre 1:2 - 1:5 e MenCWY conjugado à proteína carreadora com uma razão de sacarídeo:proteína (p/p) de entre 5:1 - 1:1,99.

[011] De acordo com um aspecto adicional da invenção, é provido um método de imunização de um hospedeiro humano contra a doença causada por Neisseria meningitidis, que compreende administrar ao hospedeiro uma dose imunoprotetora da composição imunogênica ou vacina da invenção.

[012] De acordo com um outro aspecto da invenção, é provida uma composição imunogênica da invenção para o uso no tratamento ou prevenção e doença causada por Neisseria Meningitidis.

[013] De acordo com um aspecto adicional da invenção, é provido o uso de uma composição imunogênica ou vacina da invenção na manufatura de um medicamento para o tratamento ou a prevenção de doenças causadas por Neisseria meningitidis.

Descrição das figuras:

[014] Figura 1- A - é um gráfico de barras que apresenta respostas de GMC em um ELISA anti- MenY. ENYTT012 é um conjugado de MenY-TT, preparado a partir do polissacarídeo MenY nativo. ENYTT014 é um conjugado MenY- TT, preparado a partir do polissacarídeo MenY microfluidizado, que foi submetido a 40 ciclos de microfluidização. ENYTT015 é um conjugado de MenY- TT, preparado a partir do polissacarídeo MenY microfluidizado, que foi submetido a 20 ciclos de microfluidização.

[015] - B - é um gráfico de barras, que mostra as respostas de GMT em um ensaio de SBA anti- MenY. ENYTT012 é um conjugado de MenY-TT preparado a partir do polissacarídeo MenY nativo. ENYTT014 é um conjugado de MenY- TT, preparado a partir do polissacarídeo MenY microfluidizado, que foi submetido a 40 ciclos de microfluidização. ENYTT015bis é um conjugado de MenY- TT, preparado a partir do polissacarídeo MenY microfluidizado, que foi submetido a 20 ciclos de microfluidização.

Descrição Detalhada

[016] Em um aspecto da presente invenção, é provida uma composição imunogênica, que compreende pelo menos 2 sacarídeos capsulares N. meningitidis, em que um ou mais é/são selecionados a partir d e um primeiro grupo, que consiste de MenA (sacarídeo capsular do sorogrupo A de N. meningitidis), MenC (sacarídeo capsular do sorogrupo C de N. meningitidis), MenY (sacarídeo capsular do sorogrupo Y de N. meningitidis), e MenW (sacarídeo capsular do sorogrupo W135 de N. meningitidis) que é/são conjugados a um(uns) carreador(es) de proteína, em que a razão de sacarídeo:proteína (p/p) está entre 1:2 - 1:5, e em que um ou mais sacarídeos diferentes é/são selecionados a partir de um segundo grupo, que consiste de MenA, MenC, menY e MenW, que é/são conjugado(s) a um carreador de proteína, em que a razão de sacarídeo:proteína (p/p) está entre 5:1- 1:1,99.

[017] De modo mais específico, a composição compreende pelo menos 2 sacarídeos capsulares N. meningitidis diferentes, em que um ou mais é/são selecionados a partir de um primeiro grupo, que consiste de MenA e de MenC, que é/são conjugados a um(uns) carreador(es) de proteína, em que a razão de sacarídeo:proteína (p/p) está entre 1:2 - 1:5, e em que um ou mais sacarídeos diferentes é/são selecionados a partir de um segundo grupo, que consiste de MenA, MenC, MenY e MenW, que é/são conjugados a um(uns) carreador(es) de proteína, em que a razão de sacarídeo:proteína (P/p) está entre 5:1 - 1:1, 99.

[018] Em um aspecto, a composição imunogênica possui o sacarídeo MenW, em que a razão de sacarídeo MenW para a proteína carreadora está entre 5:1- 1:1,99, 2:1- 1:1,99, 1,5:1-1:1,8, 1:1- 1:1,7, 1:1,2 - 1:1,6, ou 1:1,4 - 1:1,5 (p/p). Em um outro aspecto, a composição imunogênica possui o sacarídeo MenY, em que a razão do sacarídeo MenY para a proteína carreadora está entre 5:1- 1,99, 2:1 - 1:1,99, 1,5:1- 1:1,9, 1:1,1 - 1:1,6, ou 1:1,3 - 1:1,4 (p/p). Em um aspecto adicional, a composição imuunogênica compreende o sacarídeo MenA, em que a razão de sacarídeo MenA para a proteína carreadora está entre 1:2 - 1:5, 1:2, 4 - 1:4, 1:2,7 - 1:3,5 ou 1:2,9 - 1:3,1 (p/p) ou entre 5:1 - 1:1,99, 2:1- 1:1, 99, 1,5:1 - 1:1,8, 1,3:1 - 1:1,6, 1,2:1 -1:1,4, ou de 1,1:1- 1:1,2 (p/p). Em um aspecto adicional, a composição imunogênica compreende o sacarídeo MenC, em que a razão do sacarídeo MenC para a proteína carreadora está entre 5:1 - 1:1,99, 2:1 - 1:1,99, 1,5:11:1,8, 1,3:1- 1:1,6, 1,2:1- 1:1,4, ou 1,1:1 - 1:1,2 (p/p), ou entre 1:2 - 1:5, 1:2,5 - 1:4,5, 1:2,7 - 1:4,3, 1:3 -1:4, ou 1:3, 3- 1:3,5 (p/p).

[019] De modo mais específico, o primeiro grupo pode consistir de MenA e de MenC, e o segundo grupo pode consistir de MenC, MenY e MenW. Modalidades particulares da invenção são composições imunogênicas, que compreendem:o sacarídeo capsular MenA, em que a razão do sacarídeo MenA para a proteína carreadora está entre 1:2 - 1:5, 1:2,4- 1:4, 1:2, 7 -1:3,5, ou 1:2, 9 - 1:3,1 (p/p) [ que pode ser opcionalmente conjugado através de um agente de ligação à proteína carreadora] e o sacarídeo capsular MenC, em que a razão do sacarídeo MenC para a proteína carreadora está entre 5:1 - 1:1, 99, 2:1 - 1:1,99, 1, 5:1- 1:1, 8, 1,3:1-1:1,6, 1,2:1- 1:1,4, ou 1,1:1 -1:1,2 (p/p) [que pode ser opcionalmente diretamente conjugado à proteína carreadora]; o sacarídeo capsular MenC, em que a razão do sacarídeo MenC para a proteína carreadora está entre 1:2- 1:5, 1:2,4 -1:4, 1:2,7 - 1:3,5, ou 1:2,9 - 1:3,1 (p/p) [que pode ser opcionalmente conjugado através de um agente de ligação à proteína carreadora] e o sacarídeo capsular MenY, em que a razão do sacarídeo Men Y para a proteína carreadora está entre 5:1- 1:1,99, 2:1 - 1:1,99, 1, 5:1- 1:1,8, 1,3:1 - 1:1,6, 1,2:1- 1:1, 4, ou 1,1:1 - 1:1, 2 (p/p)[que pode ser opcionalmente conjugado à proteína carreadora]; sacarídeos capsulares MenA e MenC, em que a razão de sacarídeo Men A e C para a (a) proteína(s) carreadora(s) está entre 1:2 - 1:5, 1:2,4- 1:4, 1:2,7 - 1:3,5, ou 1:2,9 - 1:3,1 (p/p)[ e que pode ser opcionalmente conjugado através de um agente de ligação à (s) proteína(s) carreadora(s)] e sacarídeos capsulares Men Y e Men W, em que a razão de sacarídeo Men Y e W para a proteína carreadora está entre 5:1 - 1:1,99, 2:1- 1:1, 99, 1,5:1- 1:1,8, 1,3:11:1,6, 1,2:1 -1:1,4, ou 1,1:1 - 1:1,2 (p/p) [ e que pode ser opcionalmente diretamente conjugado à (s) proteína(s) carreadora(s); o sacarídeo capsular MenA, em que a razão do sacarídeo MenA para a proteína carreadora está entre 1:2,5 - 1:5,1:2,4 - 1:4, 1:2,7 - 1:3,5, ou 1:2,9-1:3,1 (p/p) [ que pode ser opcionalmente conjugado através de um agente de ligação à proteína carreadora] e os sacarídeos capsulares MenC, MenY e MenW, em que a razão do sacarídeo Men Y e W e C para a proteína carreadora está entre 5:1 - 1:1,99, 2:1 - 1:1,99, 1,5:1 - 1:1,8, 1,3:1 - 1:1,6, 1,2:1 - 1:1,4, ou 1,1:1 - 1:1, 2 (p/p) [e que pode ser opcionalmente diretamente conjugado à (s) proteína(s) carreadora(s)]. Em qualquer uma destas modalidades um conjugado Hib pode ser também incluído, que está ligado a uma proteína carreadora (vide lista de carreadoras acima e abaixo, por exemplo TT, e quanto a razões de sacarídeo:proteína) diretamente ou através de um agente de ligação.

[020] O termo “sacarídeo “em todo este relatório pode indicar polissacarídeo ou oligossacarídeo e inclui ambos. Os polissacarídeos são isolados a partir de bactérias ou isolados a partir de bactérias e encolados em algum grau através de métodos conhecidos (vide, por exemplo, EP 497524 e EO 497525) e opcionalmente através de microfluidização. Os polissacarídeos podem ser encolados de modo a reduzir a sua viscosidade em amostras de polissacarídeo e/ou de modo a aperfeiçoar a sua capacidade de filtração quanto a produtos conjugados. Os oligossacarídeos possuam um baixo número de unidades de repetição (de modo típico de 5-30 unidades de repetição) e são, de modo típico, polissacarídeos hidrolisados.

[021] Cada sacarídeo capsular N. meningitidis (e/ou Hib) pode ser conjugado a uma proteína carreadora, independentemente selecionadas a partir do grupo, que consiste de TT, DT, CRM 197, fragmento C de TT e proteína D. Uma lista mais completa de carreadores de proteína, que podem ser usadas nos conjugados da invenção, é apresentada abaixo. Embora um ou mais sacarídeos capsulares N. meningitidis (e/ou Hib) possa ser conjugado a proteínas carreadoras diferentes umas das outras, em uma modalidade eles são todos conjugados à mesma proteína carreadora. Por exemplo, eles podem ser todos conjugados à mesma proteína carreadora, selecionada a partir do grupo que consiste de TT, DT, CRM 197, fragmento C de TT e proteína D. Neste contexto, CRM 197 e DT podem ser considerados como sendo a mesma proteína carreadora pelo fato de que eles diferem em apenas um aminoácido. Em uma modalidade, todos os sacarídeos capsulares N.meningitidis (e/ou Hib) presentes são conjugados a TT.

[022] Se a proteína carreadora for a mesma para 2 ou mais sacarídeos na composição, os sacarídeos podem ser conjugados à mesma molécula do carreador de proteína (moléculas de carreador tendo mais 2 sacarídeos diferentes conjugados a ela) [vide, por exemplo, WO 04/083251; por exemplo, uma única proteína carreadora pode ser conjugada a MenA e a MenC; MenA e MenW; Men A e MenY; Men C e MenW; MenC e MenY; MenW e MenY; MenA, MenC e MenW; MenA, MenC e MenY; MenA, MenW e MenY; Men C, MenW e MenY; Men A, MenC, MenW e MenY; Hib e MenA; Hib e MenC; Hib e MenW; ou Hib e MenY]. De modo alternativo, os sacarídeos podem, cada qual separadamente, ser conjugados a diferentes moléculas do carreador de proteína (cada molécula do carreador de proteína tendo apenas um tipo de sacarídeo conjugado a ela).

[023] As composições imunogênicas de acordo com o primeiro aspecto da invenção podem também apresentar qualquer ou todas as características adicionais do segundo aspecto da invenção e vice versa.

[024] Em um segundo aspecto da invenção, é apresentada uma composição imunogênica, que compreende pelo menos 2 sacarídeos diferentes, conjugados separadamente ao mesmo tipo de proteína carreadora, em que um ou mais sacarídeos) é/são conjugados à proteína carreadora, em que a razão de sacarídeo:proteína (p/p) está entre 1:2 - 1:5, [uma razão elevada], e um ou mais sacarídeos diferentes é/são conjugados à proteína carreadora, em que a razão de sacarídeo:proteína (p/p) está entre 5:1 - 1:1, 99 [ uma razão baixa].

[025] Por “ separadamente conjugado ao mesmo tipo de proteína carreadora” é compreendido que os sacarídeos são conjugados ao mesmo carreador individualmente (isto é, diferentes sacarídeos não são conjugados à mesma molécula do mesmo carreador de proteína).

[026] O (s) sacarídeo (s) capsular(es) podem ser conjugados ao mesmo tipo de proteína carreadora, independentemente selecionados a partir do grupo, que consiste de TT, DT, CRM 197, fragmento C de TT e proteína D. Uma lista mais completa de carreadores de proteína, que podem ser usados nos conjugados da invenção, é apresentada abaixo. Neste contexto, CRM 197 e DT podem ser considerados como a mesma proteína carreadora, pois eles diferem em apenas um aminoácido. Em uma modalidade, todos os sacarídeos capsulares presentes são conjugados a TT.

[027] Sacarídeos em alta razão (1:2 - 1:5) e em baixa razão (5:1- 1:1,99) podem ser selecionados a partir de um grupo que consiste de:sacarídeo capsular do sorogrupo A de N. meningitidis (MenA), sacarídeo capsular do sorogrupo C de N. meningitidis (MenC), sacarídeo capsular do sorogrupo Y de N. meningitidis (MenY), sacarídeo capsular do sorogrupo W de N. meningitidis (MenW). Sacarídeo capsular do tipo b de H. Influenzae (Hib), sacarídeo capsular do grupo I de Streptococcus do Grupo B, sacarídeo capsular do grupo II de Streptococcus do Grupo B, sacarídeo capsular do grupo III de Streptococcus do Grupo N, sacarídeo capsular do grupo IV de Streptococcus do Grupo B, sacarídeo capsular do grupo V de Streptococcus do Grupo B, sacarídeo capsular do tipo 5 de Staphylococcus aureus, sacarídeo capsular do tipo 8 de Staphylococcus aureus, sacarídeo Vi de Salmonella typhi, N. meningitidis LPS (tal que L3 e/ou L2), M. catarrhalis LPs, H. influenzae LPS, e de qualquer dos sacarídeos pneumocócicos capsulares, tais que do sorotipo:1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9 N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23 F ou 33 F. Em uma modalidade, a composição imunogênica da invenção consiste de ou compreende dois ou mais sacarídeos diferentes a partir do mesmo gênero de bactéria (por exemplo, Neisseria, Streptococcus, Staphylococcus, ou Haemophilus).

[028] Em uma modalidade, MenA é um sacarídeo de alta razão; em outra, MenW é um sacarídeo de baixa razão; em outra, MenY é um sacarídeo de baixa razão; em outra MenC é um sacarídeo de alta razão; em outra, MenC é um sacarídeo de baixa razão; em outra, Hib é um sacarídeo de alta razão. Vacinas, que compreendem MenA/C podem ser de alta/baixa razão, respectivamente, vacinas que compreendem MenC/Y podem ser de alta/baixa razão, respectivamente, vacinas que compreendem MenA/C/W/Y podem ser de alta/alta/baixa/baixa razão, respectivamente, e vacinas que compreendem MenA/C/W/Y podem ser de alta/baixa/baixa/baixa razão, respectivamente.

Considerações gerais em aspectos da invenção:

[029] Os sacarídeos da invenção (em particular os sacarídeos de N.meningitidis e/ou o sacarídeo capsular de Hib), incluídos nas composições farmacêuticas (imunogênicas) da invenção, são conjugados a uma proteína carreadora, tal que o toxóide de tétano (TT), o fragmento C de toxóide de tétano, mutantes não- tóxicos da toxina de tétano [observe-se que todas tais variantes de TT são consideradas como sendo do mesmo tipo de proteína carreadora para os propósitos desta invenção], toxóide de difteria (DT), CRM 197, outros mutantes não- tóxicos da toxina de difteria [tais que CRM 176, CRM 197, CRM 228, CRM 45 (Uchida et al. J. Biol. Chem., 218; 3838-3844, 1973); CRM 9, CRM 45, CRM 102, CRM 103 e CRM 107 e outras mutações descritas por Nicholls e Youle em Geneticallly Engineered Toxins, Ed. Frankel, Marcel Dekker Inc.,1992; deleção ou mutação de Glu- 148 para Asp, Gln ou Ser e/ou Ala 158 para Gly e outras mutações expostas na US 47009017 ou US 4950740; mutação de pelo menos um ou mais resíduos Lys 516, Lys 526, Phe 530 e/ou Lys 534 e outras mutações expostas na US 5917017 ou US 6455673; ou fragmento exposto na US 5843711] (observe-se que todas tais variantes de DT são consideradas como sendo o mesmo tipo de proteína carreadora para os propósitos desta invenção), penumolisina pneumocócica (kuo et al. (1995), Infect. Immun. 63; 2706- 13), OMPC (proteína da membrana externa meningocócica - usualmente extraída a partir do sorogrupo B de N- meningitidis - EP 00372501), peptídeos sintéticos (EP 0378881, EP 0427347), proteínas de choque térmico (WO 93/17712, WO 94/03208), proteínas pertussis (WO 98/58668, EP 0471177), citoquinas, linfoquinas, fatores de crescimento ou hormônios (WO 91/01146), proteínas artificiais, que compreendem epítopos da célula CD4 + T humana múltipla de vários antígenos derivados de patógeno (Falugi et al. (2001) Eur. J. Immunol. 31:3816 - 3824), tais que a proteína N19 (Baraldoi et al. (2004) Infect. Immun. 72; 4884 -7) proteína superficial penumocócica PspA (WO 02/091998), proteínas de absorção de ferro (WO 01/72337), toxina A ou B de C. difficile (WO 00/61761) ou Proteína D (EP 594610 e WO 00/56360).

[030] Em uma modalidade, a composição imunogênica da invenção usa o mesmo tipo de proteína carreadora (independentemente), em pelo menos dois, três, quatro ou cada um dos sacarídeos (por exemplo sacarídeos capsulares de N. meningitidis e/ou Hib) contidos na mesma. Em uma modalidade, em que os sacarídeos capsulares Hib e N. meningitidis estão presentes, Hib pode ser conjugado à mesma proteína carreadora que os pelo menos dois, três, quatro ou cada um dos sacarídeos de N. meningitidis. Por exemplo, 2, 3, ou 4 dos sacarídeos de N. meningitidis (MenA, C, Y, W) são independentemente conjugados ao toxóide de tétano de modo a produzir 2, 3, ou 4 conjugados, e opcionalmente Hib é também conjugado a TT.

[031] Em uma modalidade, a composição imunogênica da invenção compreende um sacarídeo de N. meningitidis conjugado a uma proteína carreadora selecionada a partir do grupo, que consiste de TT, DT, CRM 197, fragmento C de TT e proteína D. Em uma modalidade, a composição imunogênica da invenção compreende um sacarídeo Hib conjugado a uma proteína carreadora, selecionada a partir do grupo que consiste de TT, DT, CRM 197, fragmento C de TT e proteína D.

[032] A composição imunogênica da invenção compreende, de modo opcional, pelo menos um conjugado de sacarídeo meningocócico (por exemplo, MenA; MenC; MenW; MenY; MenA e MenC; MenA e MenW; MenA e MenY; MenC e MenW; MenC e MenY; MenW e MenY; MenA, MenC e MenW; MenA, MenC e MenY; MenA, MenW e MenY; MenC, MenW e MenY ou MenA, MenC, MenW e MenY), tendo uma razão de sacarídeo de Men para a proteína carreadora de entre 1:5 a 5:1, entre 1:2 e 5:1, entre 1:0,5 e 1:2,5 ou de entre 1:1, 25 (p/p).

[033] A composição imunogênica da invenção compreende, de modo opcional, um conjugado de sacarídeo de Hib tendo uma razão de Hib para a proteína carreadora de entre 1:5 e 5:1, 1:2 e 2:1, 1:1 e 1:4, 1:2 e 1:3,5, ou em torno de ou exatamente de 1:2,5 ou 1:3 (p/p).

[034] Em uma modalidade, a composição imunogênica da invenção do(s) sacarídeo (s) N. meningitidis e/ou o sacarídeo Hib é conjugado à proteína carreadora por meio de um agente de ligação, por exemplo um agente de ligação bifuncional. O agente de ligação é, de modo opcional, heterobifuncional ou homobifuncional, tendo, por exemplo, um grupo amino reativo e um grupo de ácido carboxílico reativo, 2 grupos amino reativos ou dois grupos de ácido carboxílico reativos. O agente de ligação possui, por exemplo, entre 4 e 20, 4 e 12, 5 e 10 átomos de carbono. Um agente de ligação possível é ADH. Outros agentes de ligação incluem B-propionamido (WO 00/10599), nitrofenil-etilamina (Gever et al. (1979) Med. Microbiol. Immunol. 165; 171- 288), halogenetos de haloalquila (US 4057685), ligações glicosídicas (US 4673574, US 4808700), hexano diamina e ácido 6- amnocapróico (US 44 59 286).

[035] Os conjugados de sacarídeo presentes nas composições imunogênicas da invenção podem ser preparados através de qualquer técnica de acoplamento conhecida. O método de conjugação pode ser baseado na ativação do sacarídeo com tetrafluoroborato de 1-ciano-4- dimetilamino piridínio (CDAP) de modo a formar um éster de cianato. O sacarídeo ativado pode ser deste modo acoplado diretamente ou através de um grupo espaçador (agente de ligação) e um grupo amino na proteína carreadora. Por exemplo, o espaçador poderia ser cistamina ou cisteamina, de modo a formar um polisasacarídeo tiolado, que poderia ser acoplado ao carreador através de uma ligação tioéter, obtida após a reação com uma proteína carreadora ativada por maleimida (por exemplo, usando GMBS) ou uma proteína carreadora holoacetilada (por exemplo, usando iodoacetimida ou bromoacetatobromoacetato de N-succinimidila). De modo opcional, o éster de cianato (opcionalmente produzido através da química de CDAP) é acoplado com hexano diamina ou ADH e o sacarídeo aminoderivado é conjugado com a proteína carreadora usando carbodiimida (por exemplo, EDAC ou EDC), por meio de um grupo carboxila na proteína carreadora. Tais conjugados são descritos no pedido publicado PCT WO 93/15760 Uniformed Services University e WO 95/08348 e WO 96/29094.

[036] Outras técnicas adequadas utilizam carbinidas, hidrazidas, ésteres ativos, norborano, ácido p-nitrobenzóico, N- hidroxissuccinimida, S-NHS, EDC, TSTU. Muitos são descritos no WO 98/42721. A conjugação pode envolver um agente de ligação carbonila, que pode ser formado através da reação de um grupo hidroxila livre do sacarídeo com CDI (Bethell et al., J. Biol. Chem. 1979, 254; 2571 - 4, Heam et al. Chromatogr., 1981, 218; 508- 18) seguido pela reação do mesmo com uma proteína, de modo a formar uma ligação carbamato. Isto pode envolver a redução do terminal anomérico para um grupo hidroxila primário, a proteção/desproteção opcional da reação do grupo hidroxila primário do grupo hidroxila primário com CDI, de modo a formar um intermediário de carbamato de CDI e acoplar o intermediário de carbamato de CDI com um grupo amino em uma proteína.

[037] Os conjugados podem ser também preparados através de métodos de aminação redutiva direta, conforme descrito na US 4365170 (Jennnings) e na US 4673574 (Anderson). Outros métodos são descritos na EP- 0-161-188, EP -208375 e na EP- 0- 477508.

[038] Um outro método envolve o acoplamento de um sacarídeo ativado por brometo de cianogênio (ou CDAP) com diidrazida de ácido adípico (ADH) na proteína carreadora através da condensação de Carbodiimida (Chu C. et al. Infect. Immunity, 1983 245 256), por exemplo usando EDAC.

[039] Em uma modalidade, um grupo hidroxila (opcionalmente um grupo hidroxila ativado, por exemplo um grupo hidroxila ativado por um éster de cianato) em um sacarídeo é ligado a um grupo amino ou carboxílico em uma proteína, seja diretamente ou indiretamente (através de um agente de ligação). Quando um agente de ligação está presente, um grupo hidroxila em um sacarídeo é opcionalmente ligado a um grupo amino em um agente de ligação, por exemplo através do uso de conjugação de CDAP. Um outro grupo amino no agente de ligação, por exemplo ADH, pode ser conjugado a um grupo de ácido carboxílico em uma proteína, por exemplo através do uso de química de carbodiimida, por exemplo através do uso de EDAC. Em uma modalidade, o(s) sacarídeo(s) capsular(es) de N. meningitidis ou de Hib (ou sacarídeo em geral) (é conjugado ao agente de ligação antes de ser conjugado com a proteína carreadora. De modo alternativo, o agente de ligação pode ser conjugado ao carreador antes da conjugação ao sacarídeo.

[040] De modo geral, os seguintes tipos de grupos químicos em um carreador de proteína podem ser usados para o acoplamento/conjugação.A) Carboxila (por exemplo, através de ácido aspártico ou ácido glutâmico). Em uma modalidade, este grupo é ligado a grupos amino em sacarídeos diretamente a um grupo amino em um agente de ligação com química de carbodiimida, por exemplo com EDAC.B) Grupo amino (por exemplo através de lisina). Em uma modalidade, este grupo é ligado a grupos caboxila em sacarídeos diretamente ou a um grupo carboxila em um agente de ligação com química de carbodiimida, por exemplo com EDAC. Em outra modalidade, este grupo é ligado a grupos hidroxila ativados com CDAP ou CNBr em sacarídeos diretamente ou a tais grupos em um agente de ligação; a sacarídeos ou a agentes de ligação tendo um grupo aldeído; a sacarídeos ou a agentes de ligação tendo um grupo de éster de succinimida.C) Sulfidrila (por exemplo através de cisteína). Em uma modalidade, este grupo é ligado a um sacarídeo bromo ou cloroacetilado ou agente de ligação com química de maleimida. Em uma modaldiade, este grupo é ativado/modificado com bis diazobenzidina. D) Grupo hidroxila (por exemplo através de tirosina). Em uma modalidade, este grupo é ativado/modificado com bis diazobenzidina.E) Grupo Imidazolila (por exemplo, através de histidina). Em uma modalidade, este grupo é ativado/modificado com bis diazobenzidina.F) Grupo Guanidila (por exemplo através de arginina).G) Grupo indolila (por exemplo através de triptofano).

[041] Em um sacarídeo, de modo geral, os grupos que se seguem podem ser usados para um acoplamento:OH, COOH ou NH2. Grupos aldeído podem ser gerados após diferentes tratamentos, conhecidos na arte, tais que:periodato, hidrólise ácida, peróxido de hidrogênio, etc.Abordagens de acoplamento direto:Sacarídeo -OH + CNBr ou CDAP ^ éster de cianato + NH2- Prot ^ conjugadoSacarídeo - aldeído + NH2 - Prot ^ base de Schiff + NaCNBH3 ^ conjugadoSacarídeo -COOH + NH2 - Prot + EDAC ^ conjugadoSacarídeo- NH2 + COOH - Prot + EDAC ^ conjugadoAcoplamento indireto através de abordagens de espaçador (agente de ligação):Sacarídeo -OH + CNBr ou CDAP ^ éster de cianato + NH2 - — NH2 ^ sacarídeo NH2 + COOH- Prot + EDAC ^ conjugadoSacarídeo -OH + CNBr ou CDAP ^ éster de cianato + NH2 - — SH ^ sacarídeo SH + SH- Prot (Proteína nativa com uma cisteínaexposta ou obtida após a modificação de grupos amino da proteína por SPDP por exemplo) ^ sacarídeo-S-S-ProtSacarídeo - OH + CNBr ou CDAP ^ éster de cianato + NH2 - — SH ^ sacarídeo SH + maleimida - prot (modificação de gruposamino) ^ conjugadoSacarídeo- COOH + EDAC + NH2 — NH2 ^ sacarídeo — NH2 + EDAC + COOH - Prot ^ conjugadoSacarídeo- COOH + EDAC + NH2 --- SH ^ sacarídeo — SH + SH- Prot (Proteína nativa com uma cisteína exposta ou obtida após a modificação de grupos amino da proteína por SPDP por exemplo) ^ sacarídeo - S- S- ProtSacarídeo - COOH + EDAC + NH2 --- SH ^ sacarídeo --- SH + maleimida -Prot (modificação de grupos amino) ^ conjugadoSacarídeo - Aldeído + NH2 — NH2 ^ sacarídeo — NH2 + EDAC + COOH- Prot ^ conjugado

[042] Nota:Em vez de EDAC acima, qualquer carbodiimida adequada pode ser usada.

[043] Em resumo, os tipos de grupo químico do carreador de proteína, que podem ser geralmente suados para o acoplamento com um sacarídeo são grupos amino (por exemplo em resíduos lisina), grupos COOH (por exemplo em resíduos de ácido glutâmico e aspártico) e grupos SH (se acessível), por exemplo em resíduos cisteína.

[044] Em uma modalidade, o sacarídeo Hib, quando presente, é conjugado com a proteína carreadora usando CNBr, ou CDAP, ou uma combinação de CDAP e química de carbodiiimida (tal que EDAC), ou uma combinação de CNBr e química de carbodiimida (tal que EDAC). De modo opcional, Hib é conjugado usando NBr e química de carbodiimida, de modo opcional EDAC. Por exemplo, CNBr é usado para unir o sacarídeo e o agente de ligação e então a química de carbodiimida é usada para unir o agente de ligação ao carreador de proteína.

[045] Em uma modalidade, pelo menos um dos sacarídeos capsulares de N. meningitidis (ou sacarídeo em geral) está diretamente conjugado a uma proteína carreadora; de modo opcional, o(s) sacarídeo (s) MenW e/ou MenY e/ou MenW está(ão) diretamente conjugados a uma proteína carreadora. Por exemplo, MenW; MenY; MenC; MenW e MenY; MenW e MenC; MenY e MenC; ou MenW, MenY e MenC estão diretamente ligados à proteína carreadora. De modo opcional, pelo menos um dos sacarídeos capsulares d e N.meningitidis está diretamente conjugado através de CDAP. Por exemplo, MenW; MenY; MenC; MenW e MenY; MenW e MenC; MenY e MenC; ou MenW, MenY e MenC estão diretamente ligados à proteína carreadora através de CDAP (vide WO 95/088348 e WO 96/29024). Em uma modalidade, todos os sacarídeos capsulares N.menigitidis são estão conjugados ao toxóide de tétano.

[046] De modo opcional, a razão do sacarídeo Men W e/ou Y para a proteína carreadora está entre 1:0,5 e 1:2 (p/p) e/ou a razão do sacarídeo MenC para a proteína carreadora está entre 1:0,5 e 1:4 ou 1:0,5 e 1:1, 5 (p/p), em especial quando estes sacarídeos estão diretamente ligados à proteína, de modo opcional usando CDAP.

[047] Em uma modalidade, pelo menos um dos sacarídeo (s) capsular (es) N.meningitidis (ou sacarídeo em geral) é conjugado à proteína carreadora através de um agente de ligação, por exemplo um agente de ligação bifuncional. O agente de ligação é, de modo opcional, heterobifuncional ou homobifuncional, tendo, por exemplo, um grupo amina reativo e um grupo de ácido carboxílico reativo, 2 grupos amina reativos ou 2 grupos de ácido carboxílico reativos. O agente de ligação possui, por exemplo, entre 4 e 20, 4 e 12, 5 e 10 átomos de carbono. Um agente de ligação possível é ADH.

[048] Em uma modalidade, MenA; MenC; ou MenA e MenC é conjugado a uma proteína carreadora (por exemplo, toxóide de tétano) através de um agente de ligação.

[049] Em uma modalidade, pelo menos um sacarídeo N. meningitidis é conjugado a uma proteína carreadora através de um agente de ligação usando CDAP e EDAC. Por exemplo, MenA; MenC; ou MenA e MenC são conjugados a uma proteína através de um agente de ligação (por exemplo, aqueles com dois grupos hidrazino em suas terminações, tais que ADH) usando CDAP e EDAC, tal como acima descrito. Por exemplo, CDAP é usado para conjugar o sacarídeo a um agente de ligação e EDAC é usado para conjugar o agente de ligação a uma proteína. De modo opcional, a conjugação través de um agente de ligação resulta em uma razão de sacarídeo para a proteína carreadora de entre 1:0,5 e 1:6, de 1:1 e 1:5 ou de 1:2 e 1:4, para MenA; MenC; ou MenA e MenC.

[050] Uma consideração adicional em uma vacina combinada, que compreende vários sacarídeos conjugados ao mesmo carreador, é a questão da supressão imune do carreador:carreador demais pode ser usado e a resposta imune pode ser impedida. Com uma abordagem uniforme à conjugação, o carreador irá apresentar uma mistura similar de epítopos de célula B e T ao sistema imune. No entanto, se a conjugação ocorrer em diferentes grupos químicos dentro da proteína carreadora para um sacarídeo contra o outro, os carreadores de proteína provavelmente serão diferentes em alguma extensão no modo em que eles são apresentados, em si mesmos, ao sistema imune.

[051] De acordo com todos os aspectos da invenção neste, é também provida uma composição imunogênica, que compreende pelo menos 2 sacarídeos diferentes, conjugados de modo separado ao mesmo tipo de proteína carreadora (por exemplo, toxóide do tétano), em que um ou mais sacarídeo (s) é/são conjugados à proteína carreadora através de um primeiro tipo de grupo químico no carreador da proteína, e um ou mais sacarídeo (s) é/são conjugado(s) à proteína carreadora através de um segundo tipo de grupo químico (diferente) no carreador de proteína.

[052] O primeiro e o segundo tipos de grupo químico podem estar presentes no carreador de proteínaem um primeiro e segundo conjuntos de aminoácidos mutuamente exclusivos do carreador de proteína (por exemplo, certos resíduos do ácido aspártico/ácido glutâmico em um conjunto e certos resíduos de lisina/arginina no segundo). Um sacarídeo pode ser conjugado a um grupo carboxila no carreador, e outro em um grupo amino, por exemplo. Uma tal conjugação pode envolver a conjugação em epítopos da célula B e/ou T separados para cada conjugado diferente.

[053] Por exemplo, em uma vacina de MenAC, MenA pode ser ligado a um primeiro tipo de grupo químico (tal que carboxila) na proteína carreadora e MenC pode ser ligado a um segundo (tal que amino). Em uma vacina de MenCY, MenC pode ser ligado a um primeiro tipo de grupo químico (tal que carbonila na proteína carreadora e MenY ligado a um segundo (tal que amino). Em uma vacina de MenACWY, MenAC pode ser ligado a um primeiro tipo de grupo químico (tal que carboxila) na proteína carreadora e MenWY ligado a um segundo (tal que amino), ou MenA pode ser ligado a um primeiro tipo de grupo químico (tal que carboxila) na proteína carreadora e MenCWY ligado a um segundo (tal que amino).

[054] Em uma modalidade, os 2 conjugados podem envolver o mesmo tipo de sacarídeo ligado ao mesmo tipo de carreador, mas través de diferentes químicas de conjugação. Em uma modalidade alternativa, 2 sacarídeos diferentes são conjugados a diferentes grupos no carreador de proteína. Por “ conjugado separadamente ao mesmo tipo de proteína carreadora” é compreendido que os sacarídeos são conjugados ao mesmo carreador individualmente (isto é, tanto o primeiro e o segundo grupos químicos na mesma molécula do carreador de proteína não são usados para conjugar as porções de sacarídeo, de modo preferido o primeiro grupo químico é usado em uma primeira alíquota de carreador de proteína com relação à conjugação de um primeiro sacarídeo, e um segundo grupo químico em uma segunda alíquota do carreador de proteína é suado em relação à conjugação de um segundo sacarídeo.

[055] Em uma modalidade, o primeiro e o segundo tipo de grupo químico no carreador de proteína estão presentes em epítopos da célula B e/ou T na proteína do carreador. Ou seja, eles estão presentes em um conjunto diferentes, um do outro, de epítopos da célula B e/ou T. Para prever epítopos da célula B para um carreador, métodos conhecidos podem ser usados, tais que cada qual ou ambos dos dois métodos que se seguem:Previsão de estrutura 2D e/ou previsão de índice antigênico. A previsão da estrutura 2D pode ser feita através do uso do programa PSIPRED (de David Jones, Brunel Bioinformatics Gorup, Dept. Biological Sciences, Brunel University, Uxbridge UB8 3PH, UK). O índice antigênico pode ser calculado com base no método descrito por Jameson e Wolf (CABIOS 4:181186 [ 1988]). Os parâmetros usados neste programa são o índice antigênico e o comprimento mínimo para um peptídeo antigênico. Um índice antigênico de 0,9 para um mínimo de 5 aminoácidos consecutivos pode ser usado como o limiar no programa. Epítopos de célula auxiliares de T são os peptídeos ligados à moléculas da classe II HLA e reconhecidos por células que auxiliam T. A previsão de epítopos de célula que auxiliam T úteis pode ser baseada em técnicas conhecidas, tais que o método TEPITOPE descrito por Sturmiolo et al. (Nature Biotech. 17:555 - 561 [ 1999]).

[056] O primeiro e o segundo grupos, presentes no carreador de proteína, são opcionalmente diferentes um do outro e são, de modo ideal, grupos químicos naturais, que podem ser prontamente suados para propósitos de conjugação. Eles podem ser selecionados independentemente a partir do grupo que consiste de:grupos carboxila, grupos amino, grupos sulfidrila, grupos hidroxila, grupos imidazolila, grupos guanidila, e grupos indolila. Em uma modalidade, o primeiro grupo químico é carboxila e o segundo é amino, ou vice- versa. Estes grupos são explicados em maiores detalhes acima.

[057] Em uma modalidade específica, a composição imunogênica compreende pelo menos dois sacarídeos capsulares N. meningitidis diferentes, em que um ou mais é/são selecionados a partir de um primeiro grupo, que consiste de MenA e MenC, que é/são conjugados à proteína carreadora através do primeiro tipo de grupo químico no carreador de proteína (por exemplo carboxila), e um ou mais sacarídeos diferentes é/são selecionados a partir de um segundo grupo, que consiste de MenC, MenY e MenW, que é/são conjugados à proteína carreadora através do segundo tipo de grupo químico no carreador de proteína (por exemplo, amino).

[058] Em uma modalidade adicional, a composição imunogênica da invenção compreende MenA conjugado através do primeiro tipo de grupo químico (por exemplo, carboxila), e MenC conjugado através do segundo tipo de grupo químico (por exemplo, amino).

[059] Em uma outra modalidade, a composição imunogênica compreende MenC conjugado através do primeiro tipo de gruo químico (por exemplo, carboxila), e MenY conjugado através do segundo tipo de grupo químico (por exemplo, amino).

[060] Em uma outra modalidade, a composição imunogênica compreende MenA conjugado através do primeiro tipo de grupo químico (por exemplo, carboxila), e MenC, MenY e MenW conjugados através do segundo tipo de grupo químico (por exemplo, amino).

[061] Em ainda uma outra modalidade, a composição imunogênica compreende MenA e MenC conjugados através do primeiro tipo de grupo químico (por exemplo, carboxila), e MenY e MenW conjugados através do segundo tipo de grupo químico (por exemplo, amino).

[062] Em qualquer das modalidades, Hib pode estar também presente também conjugado com o mesmo tipo de carreador de proteína. Hib pode ser conjugado ao carreador através do primeiro ou segundo tipo de grupo químico. Em uma modalidade, ele é conjugado através de um grupo carboxila.

[063] Em uma modalidade, o sacarídeo capsular MenA, quando presente, é pelo menos parcialmente O-acetilado, de tal modo que pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% das unidades de repetição sejam acetiladas em pelo menos uma posição. O-acetilação está presente, por exemplo, pelo menos na posição O-3 de pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% das unidades de repetição NeuNAc (α2 ^ 9)- ligadas sejam O-acetiladas em pelo menos uma ou duas posições. A O- acetilação está, por exemplo, presente na posição O-7 e/ou O-8 de pelo menos 30%, 40%, 50%, 60 %, 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% das unidades de repetição.

[064] Em uma modalidade, o sacarídeo capsular MenW, quando presente, é pelo menos parcialmente O- acetilado, de tal modo que pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% das unidades de repetição sejam O-acetiladas em pelo menos uma ou duas posições. A O-acetilação está presente, por exemplo, na posição O-7 e/ou O- 9 de pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% das unidades de repetição.

[065] Em uma modalidade, o sacarídeo capsular MenY, quando presente, é pelo menos parcialmente O-acetilado, de tal modo que pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60 %, 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% das unidades de repetição sejam O- acetiladas em pelo menos uma ou duas posições. A O-acetilação está presente na posição 7 e/ou 9 de pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60 %, 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% das unidades de repetição.

[066] O percentual de O-acetilação refere-se ao percentual das unidades de repetição contendo O-acetilação. Este pode ser medido no sacarídeo antes de que seja conjugado e/ou após a conjugação.

[067] Em uma modalidade da invenção, a composição imunogênica é tal que, cada sacarídeo presente, ou cada tipo de sacarídeo capsular N. meningitidis presente, seja conjugado a TT. Em uma outra modalidade, cada tipo de sacarídeo capsular N. mengitidis presente é conjugado separadamente a um tipo separado de proteína carreadora. Em uma modalidade adicional, cada conjugado de sacarídeo capsular N. meningitidis possui uma razão de sacarídeo:carreador de 1:5- 5:1 ou de 1:1- 1:4 (p/p). Em uma modalidade adicional, pelo menos um, dois ou três conjugado(s) de sacarídeo capsular de N. mengitidis é diretamente conjugado a uma proteína carreadora. Em uma outra modalidade, Men W e/ou Men Y, Men W e/ou Men C, Men Y e/ou Men C, ou Men W e Men C e Men Y são diretamente conjugados a uma proteína carreadora. Em uma modalidade adicional, pelo menos um, dois ou três conjugado(s) de sacarídeo N-meningitidis é diretamente conjugado através de química de CDAP. Em uma outra modalidade, a razão de sacarídeo Men W e/ou sacarídeo Y para a proteína carreadora está entre 1:0,5 e 1:2 (p/p). Em uma modalidade adicional, a razão de sacarídeo Men C para a proteína carreadora está entre 1:0,5 e 1:2 (p/p). Em ainda uma outra modalidade, pelo menos um, dois ou três sacarídeo (s) capsular(es) N. meningitidis é (são) conjugados à proteína carreadora através de um agente de ligação (que pode ser bifuncional, tal que tendo dois grupos amino reativos (tais que ADH) ou dois grupos carboxila reativos, ou um grupo aminorreativo em uma extremidade e um grupo carboxila reativo na outra). O agente de ligação pode possuir entre 4 e 12 átomos de carbono. Em uma outra modalidade, o cada sacarídeo (s) capsular (es) N. meningitidis conjugado através de um agente de ligação é(são) conjugado (s) ao agente de ligação através de química de CDAP. Em uma outra modalidade, a proteína carreadora é conjugada ao agente de ligação através do uso de química de carbodiimida, de modo opcional usando EDAC. Em uma modalidade adicional, o ou cada sacarídeo capsular N. meningitidis é conjugado ao agente de ligação antes que a proteína carreadora seja conjugada ao agente de ligação. Em uma outra modalidade, Men A é conjugado à proteína carreadora através de um agente de ligação (a razão de sacarídeo Men A para a proteína carreadora podendo estar entre 1:2 e 1:5 (p/p). Em ainda uma modalidade adicional, Men C é conjugado a uma proteína carreadora através de um agente de ligação (a razão de sacarídeo Men C para a proteína podendo estar entre 1:2 e 1:5 (p/p).

[068] A composição imunogênica da invenção compreende, de modo opcional, um ou mais conjugados de sacarídeo, em que o tamanho médio de cada sacarídeo antes da conjugação está acima de 50 kDa, 75 kDa, 100 kDsa, 110 kDa, 120 kDa ou 130 kDA. Em uma modalidade, o conjugado, após a conjugação, deve ser prontamente filtrável através de um filtro de 0,2 mícrons, de tal modo que seja obtido um rendimento de mais do que 50, 60, 70, 80, 90 ou 95% após a filtração, comparado com a amostra previamente filtrada.

[069] Em particular, a composição imunogênica da invenção compreende sacarídeos capsulares N. meningitidis de pelo menos um, dois, três ou quatro dos sorogrupos A, C, W e Y, conjugados a uma proteína carreadora, em que o tamanho médio (peso molecular médio em peso; Mw) de pelo menos um, dois, três ou quatro de cada sacarídeo N.meningitidis está acima de 50 kDa, 60 kDa, 75 kDa, 100 kDa, 110 kDa, 120 kDa ou 130 kDa.

[070] A composição imunogênica pode compreender sacarídeos capsulares N. meningitidis a partir de pelo um, dois, três ou quatro dos sorogrupos A, C, W e Y é conjugado a uma proteína carreadora, em que pelo menos um, dois, três ou quatro de cada sacarídeo N. meningitidis é ou um sacarídeo nativo ou é dimensionado em um fator de 1,5 x, 2 x, 3 x, 4 x, 5 x, 6 x, 7 x, 8 x, 9 x, ou 10 x, em relação ao peso molecular médio em peso do polissacarídeo nativo.

[071] Para os propósitos da invenção, “polissacarídeo nativo” refere-se a um sacarídeo que não foi submetido a um processo, cujo propósito é o de reduzir o tamanho do sacarídeo. Um polissacarídeo pode ter o seu tamanho ligeiramente reduzido durante procedimentos de purificação normais. Um tal sacarídeo é ainda nativo. Apenas se o polissacarídeo tiver sido submetido técnicas de dimensionamento, então o polissacarídeo não seria considerado nativo.

[072] Para os propósitos da invenção, “dimensionado em um fator de até 2 x” significa que o sacarídeo é submetido a um processo para reduzir o tamanho do sacarídeo mas de modo a manter um tamanho de mais do que a metade do tamanho do polissacarídeo nativo. 3 X, 4 X, etc. devem ser interpretados do mesmo modo, isto é, o sacarídeo é submetido a um processo para reduzir o tamanho do polissacarídeo, mas de modo a manter mais do que um terço, um quarto etc. do tamanho do polissacarídeo nativo.

[073] Em um aspecto da invenção, a composição imunogênica compreende sacarídeos capsulares N. meningitidis de pelo menos um, dois, três ou quatro dos sorogrupos A, C, W e Y, conjugados a uma proteína carreadora, em que pelo menos um, dois, três ou quatro de cada sacarídeo N. meningitidis é um polissacarídeo nativo.

[074] Em um aspecto da invenção, a composição imunogênica compreende sacarídeos capsulares N. meningitidis a partir de pelo menos um, dois, três ou quatro dos sorogrupos A, C, W e Y, conjugados a uma proteína carreadora, em que pelo menos um, dois, três ou quatro de cada sacarídeo N. meningitidis é dimensionado (s) em um fator de até 2 x, 3 x, 4 x, 5 x, 6 x, 7 x, 8 x, 9 x, ou 10 x.

[075] As composições imunogênicas da invenção compreendem, de modo opcional, conjugados de:sacarídeo capsular do sorogrupo C de N. menigitidis (MenC), sacarídeo capsular do sorogrupo A (MenA), sacarídeo capsular do sorogrupo W 135 (MenW), sacarídeo capsular do sorogrupo Y (MenY(, sacarídeos capsulares do sorogrupo C e Y (MenCY(sacarídeos capsulares do sorogrupo C e A (MenAC), sacarídeos capsulares do sorogrupo C e W (MenCW), sacarídeo capsular do sorogrupo A e Y (MenAY), sacarídeos capsulares do sororupo A e W (MenAW), sacarídeos capsulares do sorogrupo W e Y (Men WY), sacarídeo capsular do sorogrupo A, C e Y (MenACY); sacarídeos capsulares do sorogrupo A, W135 e Y (Men AWY), sacarídeos capsulares do sorogrupo C, W135 e Y (Men CWY); ou sacarídeos capsulares A, C, W135 e Y (MenACWY). Esta é definição de “um, dois, três ou quatro “ ou de “pelo menos um de” dos sorogrupos A, C, W e Y, ou de cada sacarídeo de N. meningitidis, quando aqui mencionado.

[076] Em uma modalidade, o tamanho médio de pelo menos um, dois, três, quatro ou de cada sacarídeo N. meningitidis está entre 50 Kda e 1500 kDa, 50 kDa e 500 kDa, 50 kDa e 300 kDa, 101 kDa e 1500 kDa, 101 kDa e 500 kDa, 101 kDa e 300 kDa, conforme determinado por MALLS.

[077] Em uma modalidade, o sacarídeo MenA, quando presente, possui um peso molecular de 50- 500 kDa, 50- 100 kDa, 55 - 90 kDa, 60-70 kDa ou 70-80 kDa ou 60-80 kDa por MALLS.

[078] Em uma modalidade, o sacarídeo MenC, quando presente, possui um peso molecular de 100- 200 kDa, 50- 100 kDa, 100- 150 kDa, 101 -130 kDa, 150- 210 kDa ou 180- 210 kDa por MALLS.

[079] Em uma modalidade, o sacarídeo MenY, quando presente, possui um peso molecular de 60- 190 kDa, 70 - 180 kDa, 90 -160 kDa, 100- 150 kDa, 110 - 140 kDa, 50- 100 kDa, 100- 140 kDa, 140 - 10 kDa, ou 150 - 160 kDa por MALLS.

[080] Em uma modalidade, o sacarídeo MenW, quando presente, possui um peso molecular de 60- 190 kDa, 70 - 180 kDa, 80 - 170 kDa, 90- 160 kDa, 100- 150 kDa, 110 - 140 kDa, 50- 100 kDa ou de 120- 140 kDa por MALLS.

[081] O peso molecular ou o peso molecular médio de um sacarídeo neste caso refere-se ao peso molecular médio em peso (Mw) do sacarídeo, medido antes da conjugação e é medido por MALLS.

[082] A técnica de MALLS é bem conhecida na arte e é executada, de modo típico, tal como descrito no Exemplo 2. Para a análise de MALLS de sacarídeos menigocócicos, duas colunas (TSKG6000 e 5000Wx1 TOSOH Bioscience) podem ser usadas em combinação e os sacarídeos são eluídos em água. Os sacarídeos são detectados usando um detector de dispersão luminosa (por exemplo Wyatt Dawn DSP equipado com um laser de argônio de 10 mW a 488 nm) e um refractômetro inferométrico (por exemplo Wyatt Otilab DSP equipado com uma célula P 100 e um filtro vermelho a 498 nm).

[083] Em uma modalidade, os sacarídeos N.meningitidis são polissacarídeos nativos ou polissacarídeos nativos, que são reduzidos em tamanho durante um processo de extração normal.

[084] Em uma modalidade, os sacarídeos N.meningitidis são dimensionados através de clivagem mecânica, por exemplo através de microfluidização ou de tratamento sônico. A microfluidização e o tratamento sônico possuem a vantagem de diminuir o tamanho dos polissacarídeos nativos maiores, o suficiente para prover um conjugado filtrável. O dimensionamento ocorre em um fator de não mais do que 20 x, 10 x, 8 x, 6 x, 5 x, 4 x, 3x ou 2 x.

[085] Em uma modalidade, a composição imunogênica cpompreende conjugados de N-menigitidis, que são produzidos a partir de uma mistura de polissacarídeos e sacarídos nativos, que são dimenionados em um fator de não mais do que 20 x. Por exemplo, sacarídeos de MenC e/ou MenA são nativos. Por exemplo, os sacarídeos de MenY e/ou MenW são dimensioandos em um fator de não mais do que 20 x, 10 x, 8 x, 6 x, 5 x, 4 x, 3 x ou 2 x. Por exemplo, uma composição imunogênica contém um conjugado produzido a partir de MenY e/ou MenW e/ou MenC e/ou MenA, que é dimensionado em um fator de não mais do que 10 x e/ou é microfluidizado. Por exemplo, uma composição imunogênica contém um conjugado produzido a partir de MenA e/ou MenC e/ou MenW e/ou MenY. Por exemplo, uma composição imunogênica compreende um conjugado produzido a partir de MenC nativo. Por exemplo, uma composição imunogênica compreende um conjugado produzido a partir de MenA e MenC nativo, que é dimensionado em um fator de não mais do que 10 x e/ou é microfluidizado. Por exemplo, uma composição imunogênica compreende um conjugado produzido a partir de MenY e MenC nativo, que é dimensionado em um fator de não mais do que 10 x e/ou é microfluidizado.

[086] Em uma modalidade, a polidispersividade do sacarídeo é de 1-1, 5, 1- 1,3, 1-1,2, 1-1,1 ou 1-1,05 w, Após a conjugação a uma proteína carreador, a polidispersividade do conjugado é de 1,0- 2, 5, 1,02,0, 1,0- 1,5, 1,0- 1,2, 1,5- 2,5, 1,7-2,2 ou 1,5 - 2,0. Todas as medições de polidispersividade são efetuadas através de MALLS.

[087] Os sacarídeos são opcionalmente dimensionados em até 1,5, 2,4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 ou 20 vezes a partir do tamanho do polissacarídeo isolado a partir de bactérias.

[088] Em uma modalidade, cada sacarídeo N. meningitidis é ou um polissacarídeo nativo ou é dimensionado e um fator de não mais do que 10 x. Em uma outra modalidade, cada sacarídeo capsular N. meningitidis é um polissacarídeo nativo. Em uma modalidade adicional, pelo menos um, dois, três ou quatro sacarídeo(s) capsular(es) N. meningitidis é dimensionado através de microfluidização. Em uma outra modalidade, cada sacarídeo capsular é dimensionado em um fator de não mais do que 10 x. Em uma outra modalidade, os conjugados de N.meningitidis são dimensionados em um fator de não mais do que 10 x. Em uma modalidade adicional, o sacarídeo capsular a partir do sorogrupo Y é dimensionado em um fator de não mais do que 10 x. Em uma modalidade adicional, sacarídeos capsulares a partir dos sorogrupos A e C são polissacarídeos nativos e sacarídeos a partir dos sorogrupos W135 e Y são dimensionados em um fator de não mais do que 10 x. Em uma modalidade adicional, o tamanho médio de cada sacarídeo capsular N. meningitidis está entre 50 kDa e 300 kDa ou de 50 kDa a 200 kDa. Em uma outra modalidade, a composição imunogênica compreende um sacarídeo capsular MenA tendo um tamanho médio acima de 50 kDa, 75 kDa, 100 kDa ou um tamanho médio de entre 50 - 100 kDa ou 55-90 kDa ou 60-80 kDa. Em uma modalidade adicional, a composição imunogênica compreende um sacarídeo capsular MenC tendo um tamanho médio acima de 50 kDa, 75 kDa, 100 kDa ou entre 100- 200 kDa, 100- 150 kDa, 80 -120 kDa, 90- 110 kDa, 150- 200 kDa, 120- 240 kDa, 140- 220 kDa, 160 - 200 kDa ou 190- 200 kDa. Em uma outra modalidade, a composição imunogênica compreende um sacarídeo capsular MenY tendo um tamanho médio acima de 50 kDa, 75 kDa, 100 kDa ou entre 60 - 190 kDa ou 70- 180 kDa ou 80- 170 kDa ou 90- 160 kDa ou 100-150 kDa, 110- 145 kDa ou 120- 140 kDa. Em uma modalidade adicional, a composição imunogênica compreende um sacarídeo capsular MenW tendo um tamanho médio acima de 50 kDa, 75 kDa, 100 kDa ou entre 60 -190 kDa ou 70- 180 kDa ou 80- 170 kDa ou 90-160 kDa ou 100- 150 kDa, 140-180 kDa, 150- 170 kDa ou 110 - 140 kDa.

[089] A composição imunogênica da invenção pode compreender um sacarídeo capsular H. influenzae b (Hib) conjugado a uma proteína carreador. Esta pode ser conjugada a uma proteína carreador selecionada a partir do grupo, que consiste de TT, DT, CRM 197, fragmento C de TT e proteína D, por exemplo TT. O sacarídeo Hib pode ser conjugado à mesma proteína carreador que para pelo menos um, dois, três ou todos os conjugados de sacarídeo capsulares N. meningitidis, por exemplo TT. A razão de Hib para a proteína carreador no conjugado de sacarídeo capsular Hib pode estar entre 1:5 e 5:1 (p/p), por exemplo entre 1:1 e 1:4, 1:2 e 1:3,5 ou cerca de 1:3 (p/p). O sacarídeo capsular Hib pode ser conjugado a proteína carreador através de um agente de ligação (vide acima). O agente de ligação pode ser bifuncional (com dois grupos amino reativos, tais que ADH, ou dois grupos de ácido carboxílico reativos, ou um grupo amino reativo em uma extremidade e um grupo de ácido carboxílico reativo na outra extremidade). Ele pode ter entre 4 e 12 átomos de carbono. O sacarídeo Hib pode ser conjugado à proteína carreador ou agente de ligação usando CNBr ou CDAP. A proteína carreador pode ser conjugada ao sacarídeo Hib através do agente de ligação usando um método que compreende química de carbodiimida, opcionalmente química de EDAC (deste modo usando o grupo químico carboxila no carreador). A dose do conjugado de sacarídeo Hib pode estar entre 0,1 e 9 μg, 1 e 5 μg ou 2 e 3 μg de sacarídeo.

[090] Em uma outra modalidade, a composição imunogênica da invenção compreende um conjugado de sacarídeo Hib e pelo menos dois conjugados de sacarídeo N. meningitidis, em que o conjugado Hib está presente em uma dose de sacarídeo mais baixa do que a dose de sacarídeo média dos pelo menos dois conjugados de sacarídeo N. meningitidis. Em alternativa, o conjugado Hib está presente em uma dose de sacarídeo mais baixa do que a dose de sacarídeo de cada um dos pelo menos dois conjugados de sacarídeo N. meningitidis. Por exemplo, a dose do conjugado Hib pode ser de pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50 %, 60 %, 70%, ou 80% mais baixa do que a média ou do que a dose de sacarídeo mais baixa dos pelo menos dois conjugados de sacarídeo N.meningitidis adicionais.

[091] A dose média é determinada através da adição das doses de todos os outros sacarídeos e pela divisão pelo número de sacarídeos adicionais. Outros sacarídeos são todos os sacarídeos dentro da composição imunogênica, à parte de Hib, e podem incluir sacarídeos capsulares N. meningitidis. A “dose” é a quantidade de composição imunogênica ou vacina, que é administrada a um humano.

[092] Um sacarídeo Hib é o polissacarídeo capsular de fosfato de polirribosila (PRP) do tipo b de Haemophilus influenzae ou um oligossacarídeo derivado a partir do mesmo.

[093] “Pelo menos dois conjugados de sacarídeo bacterianos adicionais” deve ser tomado como significando dois conjugados de sacarídeo bacterianos adicionais, em adição a um conjugado Hib. Os dois outros conjugados bacterianos podem incluir conjugados de sacarídeo capsulares N. meningitidis.

[094] As composições imunogênicas da invenção podem compreender outros conjugados de sacarídeo derivados a partir de um ou mais de Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Streptococci do Grupo A, Streptococci do Grupo B, S. Typhi, Staphylococcus aureus ou Staphylococcus epidermis. Em uma modalidade, a composição imunogênica compreende sacarídeos capsulares, derivados a partir de um ou mais dos sorogrupos A, C, W135 e Y de Neisseria meningitidis. Uma outra modalidade compreende sacarídeos capsulares derivados a partir de Streptococcus pneumoniae. Os antígenos do sacarídeo capsular pneumocócico capsular são selecionados, de modo opcional, a partir dos sorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F 3 33F (opcionalmente a partir dos sorotipos 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19 F 3 23 F). Uma modalidade adicional compreende os sacarídeos capsulares do Tipo 5, Tipo 8 ou 336 de Staphylococcus aureus. Uma outra modalidade compreende os sacarídeos capsulares do Tipo I, Tipo II ou Tipo III de Staphylococcus epidermis. Uma modalidade adicional compreende o sacarídeo Vi de S. typhi. Uma outra modalidade compreende os sacarídeos capsulares do Tipo Ia, Tipo Ic, Tipo II, Tipo III ou Tipo V de Streptococcus do Grupo B. Uma modalidade adicional compreende os sacarídeos capsulares de Streptococcus do Grupo A, opcionalmente compreendendo pelo menos uma proteína M e de modo mais opcional múltiplos tipos de proteína M.

[095] As composições imunogênicas da invenção podem também compreender uma vacina de DTPa ou DTPw (por exemplo uma contendo DT, TT e ou uma vacina pertussis de célula inteira (Pw) ou uma vacina pertussis acelular (Pa) (que compreende, por exemplo, pertussis toxóide, FHA, pertactina, e, de modo opcional aglutinoginas 2 e 3). Tais combinações podem também compreender uma vacina contra hepatite BN (por exemplo, ela pode compreender um antígeno superficial de hepatite B [HepB], opcionalmente adsorvido sobre fosfato de alumínio). Em uma modalidade, a composição imunogênica da invenção compreende uma vacina de DTPwHepBHibMenAC, em que o compoennte MenAC é aqui descrito.

[096] Em uma modalidade, a composição imunogênica da invenção compreende ainda um antígeno do sorogrupo B de N. meningitidis. O antígeno é, de modo opcional, um polissacarídeo capsular do sorogrupo de N.meningitidis B (MenB)(ou um polissacarídeo ou oligossacarídeo dimensionado derivado a partir do mesmo, que pode ser conjugado a uma proteína carreador. O antígeno é, de modo opcional, uma preparação de vesícula de membrana externa a partir do sorogrupo de N. meningitidis conforme descrito na EP 301992, WO 01/09350, WO 04/14417, WO 04/14418 e WO 04/14419.

[097] De modo geral, a composição imunogênica da invenção pode compreender uma dose de cada conjugado de sacarídeo entre 2 e 20 μg, 3 e 10 μg ou 4 e 7 μg de sacarídeo.

[098] Em uma modalidade, a composição imunogênica da invenção contém, cada qual, o sacarídeo capsular N. meningitidis em uma dose de entre 0,1 - 20 μg; 1-10 μg, 2-10 μg, 2,5- 5 μg, em torno exatamente de 5 μg; ou em torno exatamente de 2,5 μg.

[099] Em uma modalidade, a composição imunogênica da invenção contém, por exemplo, o conjugado de sacarídeo Hib em uma dose de sacarídeo de entre 0,1 e 9 μg; de 1 e 5 μg ou de 2 e 3 μg ou em torno exatamente de 2,5 μg. Em uma modalidade adicional, a composição imunogênica da invenção, por exemplo, contém o conjugado de sacarídeo Hib em uma dose de sacarídeo de entre 0,1 e 9 μg ou 2 e 3 μg ou em torno de ou exatamente de 2,5 μg e cada um dos conjugados de polissacarídeo N. meningitidis em uma dose de sacarídeo de entre 2 e 20 μg, 3 e 10 μg, ou entre 4 e 7 μg ou em torno de ou exatamente de 5 μg.

[0100] “Em torno de “ ou “aproximadamente “ são definidos como dentro de 10% mais ou menos do valor para os propósitos da invenção.

[0101] Em uma modalidade, a composição imunogênica da invenção pode conter uma dose de sacarídeo do conjugado de sacarídeo Hib, que é, por exemplo, inferior a 90%, 80 %, 75%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30 %, 20 % ou 10% da dose de sacarídeo média em pelo menos dois, três, quatro ou cada um dos conjugados de sacarídeo N. meningitidis. A dose de sacarídeo do sacarídeo Hib está, por exemplo, entre 20% e 60 %, 30% e 60%, 40% e 60% ou em torno de ou exatamente 50% da dose de sacarídeo média de pelo menos dois, três, quatro ou cada um dos conjugados de sacarídeo N. meningitidis.

[0102] Em uma modalidade, a composição imunogênica da invenção contém uma dose de sacarídeo do conjugado de sacarídeo Hib, que é, por exemplo, inferior a 90%, 80%, 75%, 70%, 60 %, 50 %, 40 %, 30%, 20% ou 10% da dose de sacarídeo mais baixa dos pelo menos dois, três, quatro ou de cada um dos conjugados de sacarídeo N. meningitidis. A dose de sacarídeo do sacarídeo Hib está, por exemplo, entre 20% e 60%, 30% e 60%, 40% e 60% ou em torno de ou exatamente de 50% da dose de sacarídeo mais baixa dos pelo menos dois três, quatro ou cada um dos conjugados de sacarídeo N. meningitidis.

[0103] Em uma modalidade da invenção, a dose de sacarídeo de cada um dos pelo menos dois, três, quatro ou de cada um dos conjugados de sacarídeo N. meningitidis é opcionalmente a mesma, ou aproximadamente a mesma.

[0104] Exemplos de composições imunogênicas da invenção são composições que consistem de ou que compreendem:

[0105] Conjugado Hib e conjugado MenA e conjugado MenC, de modo opcional em razões de dose de sacarídeo de 1:2:2, 1:2:1, 1:4:2, 1:6:3, 1:3:3, 1:4:4, 1:5:5, 1:6:6 (p/p). De modo opcional, a dose de sacarídeo de MenA é maior do que a dose de sacarídeo de MenC.

[0106] Conjugado Hib e conjugado MenC e conjugado MenY, de modo opcional em razões de dose de sacarídeo de 1:2:2, 1:2:1, 1:4:2, 1:4:1, 1:8:4, 1:6:3, 1:3:3, 1:4:4, 1:5:5, 1:6:6 (p/p). De modo opcional, a dose de sacarídeo de MenC é maior do que a dose de sacarídeo de MenY.

[0107] Conjugado Hib e conjugado MenC e conjugado MenW, de modo opcional em razões de dose de sacarídeo de 1:2:2, 1:2:1, 1:4:2, 1:4:1, 1:8:4, 1:6:3, 1:3:1, 1:4:4, 1:5:5, 1:6:6 (p/p). De modo opcional, a dose de sacarídeo de MenC é maior do que a dose de sacarídeo de MenW.

[0108] Conjugado Hib e conjugado MenA e conjugado MenW, de modo opcional em razões de dose de sacarídeo de 1:2:2, 1:2:1, 1:4:2, 1:4:1, 1:8:4, 1:6:3, 1:3:3, 1:4:4, 1:5:5, 1:6:6 (p/p). De modo opcional, a dose de sacarídeo de MenA é maior do que a dose de sacarídeo de MenW.

[0109] Conjugado Hib e conjugado MenA e conjugado MenY, de modo opcional em razões de dose de sacarídeo de 1:2:2, 1:2:1, 1:4:2, 1:4:1, 1:8:4, 1:6:3, 1:3:3, 1:4:4, 1:5:5, 1:6:6 (p/p). De modo opcional, a dose de sacarídeo de MenA é maior do que a dose de sacarídeo de MenY.

[0110] Conjugado Hib e conjugado MenW e conjugado MenY, de modo opcional em razões de dose de sacarídeo de 1:2:1, 1:2:1, 1:1:2, 1:4:2, 1:2:4, 1:4:1, 1:1:4, 1:3:6, 1:1:3, 1:6:3, 1:3:3, 1; 4:4, 1:5:5, 1:6:6 (p/p). De modo opcional, a dose de sacarídeo de MenY é maior do que a dose de sacarídeo de MenW.

[0111] MenA, MenC, MenW e MenY em razões de dose de sacarídeo de 1:1:1:1 ou 1:2:1:1 ou 2:1:1:1 ou 2:2:1:1 ou 1:3:1:1 ou 1:4:1:1 (p/p).

[0112] Um aspecto adicional da invenção consiste em uma vacina, que compreende a composição imunogênica da invenção e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0113] Em uma modalidade, a composição imunogênica da invenção é tamponada em, ou ajustada a um pH de entre 7,0 e 8,0, a um pH de 7,2 e 7,6 ou em torno ou exatamente em um pH de 7,4.

[0114] A composição imunogênica ou as vacinas da invenção são opcionalmente liofilizadas na presença de um agente de estabilização, por exemplo um poliol, tal que sacarose ou trealose.

[0115] De modo opcional, a composição imunogênica ou vacina da invenção contém uma quantidade de um adjuvante suficiente para aumentar a resposta imune ao imunógeno. Adjuvantes adequados incluem, mas não estão limitados a, sais de alumínio (fosfato de alumínio ou hidróxido de alumínio), misturas de esqualeno (SAF-1), peptídeo de muramila, derivados de saponina, preparações de parede celular de micobactéria, lipídeo de monofosforila A, derivados do ácido micótico, tensoativos de copolímero em bloco não iônicos, Quil A, subunidade de toxina B de cólera, polifosfazeno e derivados, e complexos imunoestimulantes (ISCOMs), tais que aqueles descritos por Takahashi et al. (1990) Nature 344:873- 875.

[0116] Para as combinações de N. meningitidis ou Hibmen acima discutidas, pode ser vantajoso não usar qualquer adjuvante de sal de alumínio ou nenhum adjuvante.

[0117] Como no caso com todas as composições imunogênicas ou vacinas, as quantidades imunologicamente efetivas dos imunógenos precisam ser determinadas empiricamente. Os fatores a serem considerados incluem a imunogenicidade, se o imunógeno será ou não complexado com ou ligado a um adjuvante ou proteína carreador ou outro carreador, a via de administração e o número de dosagens de imunização a serem administradas.

[0118] O agente ativo pode esta presente em concentrações variáveis na composição farmacêutica ou vacina da invenção. De modo típico, a concentração mínima da substância é uma quantidade necessária para que seja alcançado o seu uso objetivado, enquanto que a concentração máxima é a quantidade máxima que irá permanecer em soluções ou homogeneamente suspensa dentro da mistura inicial. Por exemplo, a quantidade mínima de um agente terapêutico é, de modo opcional, aquela que irá prover uma única dosagem terapeuticamente efetiva. Para substâncias bioativas, a concentração mínima é a quantidade necessária para a bioatividade mediante a reconstituição e a concentração máxima é naquele ponto, em que uma suspensão homogênea não pode ser mantida. No caso de unidades de dose única, a quantidade é aquela de uma aplicação terapêutica única. De modo geral, é esperado que cada dose irá compreender de 1-100 μg de antígeno de proteína, de modo opcional de 5- 50 μg ou 5- 25 μg. Exemplos de doses de sacarídeos bacterianos são de 10-20 μg, 5-10 μg, 2,5- 5 μg ou 1- 2,5 μg de sacarídeo no conjugado.

[0119] As preparações de vacina da presente invenção podem ser usadas para proteger ou tratar um mamífero (por exemplo um paciente humano) suscetível à infecção, através da administração da referida vacina por via sistêmica ou através da mucosa. Um paciente humano é, de modo opcional, um infante (menor do que 12 meses), uma criança pequena (12-24, 12-16 ou 12- 14 meses), uma criança (2-12, 3- 8 ou 3-5 anos), um adolescente (12-20, 14-20, ou 15-19 anos) ou um adulto. Estas administrações podem incluir a injeção através da via intramuscular, intraperitonial, intradérmica ou subcutâneas; ou a administração através da mucosa aos tratos oral/alimentar, respiratório, ou genitourinário. A administração intranasal de vacinas para o tratamento de pneumonia ou otite média é preferida (pois o transporte nasofaríngeo de pneumococos pode ser mais efetivamente evitado, deste modo atenuando a infecção em seu estágio mais precoce). Embora a vacina da invenção possa ser administrada como uma dose única, os componentes da mesma podem ser também administrados de um modo conjunto, ao mesmo tempo ou em um períodos de tempo diferentes (por exemplo, se os sacarídeos estiverem presentes em uma vacina, estes podem ser administrados separadamente ao mesmo tempo ou 1-2 semanas após a administração de uma vacina proteína bacteriana para a coordenação ótima da resposta imune, uma em relação à outra). Em adição a uma única via de administração, 2 vias de administração diferentes podem ser usadas. Por exemplo, antígenos virais podem ser administrados ID (por via intradérmica), enquanto que as proteínas bacterianas pode ser administradas IM (por via intramuscular) ou IN (por via intranasal). Se os sacarídeos estiverem presentes, eles podem ser administrados IM (ou ID e as proteínas bacterianas podem ser administradas IN (ou ID). Em adição, as vacinas da invenção podem ser administradas IM para doses de base e In para doses de reforço.

[0120] A preparação da vacina é descrita, de modo genérico, em Vaccine Design (“ The subunit and adjuvant approach” (Eds. Powell M. F. & Newman M. J.) (1995) Plenum Press, Nova Iorque). A encapsulação com lipossomas é descrita por Fullerton, Patente US 4.235.877.

[0121] Um outro aspecto da invenção consiste em um kit de vacina para a administração concomitante ou seqüencial, compreendendo duas composições imunogênicas multivalentes para conferir proteção a um hospedeiro contra doença causada por Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Corynebacterium diphteriae e Neisseria meningitidis e, de modo opcional, Haemophilus influenzae. Por exemplo, o kit compreende, de modo opcional, um primeiro recipiente, que compreende um ou mais de:Toxóide do tétano (TT),Toxóide de difteria (DT), e componentes de peturssis de célula inteira ou acelular;e um segundo recipiente, que compreende: uma composição imunogênica da invenção como acima descrita (por exemplo aquela que compreende combinações de conjugado de sacarídeo Men ou Hibmen).

[0122] Um outro aspecto da invenção consiste em um kit de vacina para a administração concomitante ou seqüencial, que compreende composições imunogênicas mutivalentes para conferir proteção a um hospedeiro contra doença causada por Streptococcus pneumoniae e Neisseria mengingitidis e opcionalmente Haemophilus influenzae. Por exemplo, o kit compreende, de modo opcional, um primeiro recipiente compreendendo:um ou mais conjugados de proteína carreador e um sacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae (em que o sacarídeo capsular é opcionalmente de um sorotipo selecionado a partir do grupo, que consiste de 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9 N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23 F, e 33 F].e um segundo recipiente, que compreende:uma composição imunogênica da invenção como acima descrito (por exemplo, aquelas compreendendo combinações do conjugado de sacarídeo Men ou Hibmen).

[0123] Exemplos do conjugado Hib e dos conjugados de polissacarídeo N. meningitidis são como acima descritos.

[0124] De modo típico, a vacina de Streptococcus pneumoniae no kit de vacina da presente invenção (ou em qualquer das composições imunogênicas da invenção acima descritas) irá compreender antígenos de sacarídeo (opcionalmente conjugados), em que os sacarídeos são derivados a partir de pelo menos quatro sorotipos de pneumococcus selecionados a partir do grupo, que consiste de 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F e 33 F. De modo opcional, os quatro sorotipos incluem 6B, 14, 19F e 23F. De modo mais opcional, pelo menos 7 sorotipos são incluídos na composição, por exemplo aqueles derivados a partir dos sorotipos 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, e 23F. De modo opcional, mais do que 7 sorotipos são incluídos na composição, por exemplo pelo menos 10, 11, 12, 13 ou 14 sorotipos. Por exemplo, a composição inclui, em uma modalidade, 10 ou 11 sacarídeos capsulares derivados a partir dos sorotipos 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18 C, 19F e 23 F, e de modo opcional 3 (todos opcionalmente conjugados). Em uma modalidade da invenção, pelo menos 13 antígenos de sacarídeo (opcionalmente conjugados) são incluídos, embora outros antígenos de sacarídeo, por exemplo 23 valentes (tais que os sorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6B,7F, 8, 9 N, 9V, 10A, 11 A, 12F, 14, 15B, 17F, 18 C, 19A, 19F, 20, 22F, 23 F e 33 F) são também contemplados pela invenção.

[0125] Os sacarídeos pneumocócicos são independentemente conjugados a qualquer proteína carreador conhecida, por exemplo CRM 197, toxóide do tétano, toxóide de difteria, proteína D ou outras proteínas carreador, tais como acima mencionado.

[0126] De modo opcional, os kits de vacina da invenção compreendem um terceiro componente. Por exemplo, o kit compreende, de modo opcional, um primeiro recipiente, que compreende um ou mais de:toxóide do tétano (TT), toxóide de difteria (DT), e componentes de pertussis de célula inteira ou acelulares; e um segundo recipiente, que compreende:um ou mais conjugados de uma proteína carreador e de um sacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae [em que o sacarídeo capsular é opcionalmente de um sorotipo penumocócico selecionado a partir do grupo, que consiste de 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19 F, 20, 22 F, 23F e 33 F].e um terceiro recipiente, que compreende:uma composição imunogênica da invenção como acima descrito (por exemplo, aquelas que compreendem combinações de conjugado de sacarídeo Men ou Hibmen).

[0127] Um outro aspecto da invenção consiste em um processo para a produção da composição imunogênica ou vacina da invenção, que compreende o estágio de misturar os sacarídeos da invenção, por exemplo através da mistura de sacarídeos capsulares N. meningitidis a partir de pelo menos um, dois, três ou todos os quatro sorogrupos A, C, W e Y, conjugados a uma proteína carreador com um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0128] Um outro aspecto da invenção consiste em um método de imunização de um hospedeiro humano contra doença causada por N. meningitidis e opcionalmente infecção de Haemophilus influenzae, que compreende administrar ao hospedeiro uma dose imunoprotetora da composição imunogênica ou vacina ou kit da invenção, de modo opcional usando uma dose única.

[0129] Um aspecto independente da invenção consiste em um método de imunização de um hospedeiro humano com uma composição imunogênica, que compreende pelo menos 2 conjugados de sacarídeo capsulares de N. meningitidis diferentes, selecionados a partir de um grupo, que consiste do sorogrupo A, C, W e Y (de modo opcional MenA, C, W e Y), em que uma administração de dose única (opcionalmente a adolescentes, adultos ou crianças) resulta em um teste sangüíneo tomado um mês após a administração fornecendo acima de 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% de respostas em um ensaio de SBA, que mede os níveis de resposta contra MenA, MenC, MenW e/ou MenY. De modo opcional, o ensaio de SBA é como descrito no Exemplo 9, com a resposta sendo determinada conforme descrito no Exemplo 9.

[0130] Um outro aspecto independente da invenção consiste em uma composição imunogênica, que compreende os conjugados MenA, MenC, MenW e/ou MenY, que é capaz de provocar uma resposta imune após uma única dose, de tal modo que acima de 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% de pacientes humanos (crianças, adolescentes ou adultos) inoculados, seja classificados como produzindo resposta em um ensaio de SBA em sangue extraído um mês após a inoculação (opcionalmente usando os critérios descritos no Exemplo 9).

[0131] Uma tal composição imunogênica possui, de modo opcional, as características estruturais adicionais aqui descritas.

[0132] Um outro aspecto da invenção refere-se a uma composição imunogênica da invenção para o uso no tratamento ou prevenção de uma doença causada por N.meningitidis e opcionalmente infecção de Haemophilus influenzae.

[0133] Um outro aspecto da invenção consiste no uso da composição imunogênica ou vacina ou kit da invenção na manufatura de um medicamento para o tratamento ou a prevenção de doenças causadas por N. meningitidis e, de modo opcional, infecção por Haemophilus influenzae.

[0134] Os termos “ compreendendo”, “ compreendem” e “ compreende”, neste caso, são objetivados pelos inventores como sendo opcionalmente substituíveis pelos termos “consistindo de “, “consistem de” e “consiste de”, respectivamente, em cada caso.

[0135] Todas as referências ou pedidos de patente citados neste relatório de patente são incorporados a este, a título referencial.

[0136] A invenção é ilustrada nos exemplos anexos. Os exemplos abaixo são executados usando técnicas convencionais, que são bem conhecidas e rotineiras para aqueles versados na arte, exceto quando descritos de outro modo em detalhe. Os exemplos são ilustrativos, mas não limitam a invenção.

Exemplos Exemplo 1 - Preparação de conjugados de polissacarídeo

[0137] A ligação covalente do polissacarídeo PRP de Haemophilus influenzae (Hib) a TT foi executada através de uma química de acoplamento desenvolvida por Chu et al. (Infection and Immunity 1983, 40 (1); 245-256). O polissacarídeo PRP de Hib foi ativado através da adição de CNBr e incubação em pH de 10,5 durante 6 minutos. O pH foi reduzido para o pH de 8,75 e diidrazida de ácido adípico (ADH) foi adicionado e a incubação continuou durante um período adicional de 90 minutos. O PRP ativado foi acoplado ao toxóide de tétano purificado através de condensação de carbodiimida usando 1-etil-3-(3-dimetil-aminopropil) carbodiimida (EDAC). EDAC foi adicionado ao PRP ativado de modo a alcançar uma razão final de 0, 6 mg de EDAC/mg de PRP ativado. O pH foi ajustado para 5,0 e o toxóide de tétano purificado foi adicionado de modo a que fossem alcançados 2 mg de TT/mg de PRP ativado. A solução resultante foi deixada durante três dias com agitação branda. Após a filtração através de uma membrana de 0, 45 μm, o conjugado foi purificado em uma coluna Sephacryl S 500 HR (Pharmacia, Suécia), equilibrada em NaCl 0, 2 M.

[0138] Foram produzidos conjugados de MenC - TT usando polissacarídeos nativos (acima de 150 kDa, conforme medido por MALLS) ou foram ligeiramente microfluidizados. Os conjugados de MenA- TT foram produzidos usando ou polissacarídeo nativo ou polissacarídeo ligeiramente microfluidizado de mais do que 60 kDa, conforme medido pelo métodos de MALLS do Exemplo 2. Foram produzidos conjugados de MenW e MenY_TT usando polissacarídeos dimensionados de em torno de 100- 200 kDAA, conforme medido por MALLS (vide Exemplo 2). O dimensionamento foi efetuado através de microfluidização, usando um aparelho homogeneizador Emulsiflex C-50. Os polissaacarídeos foram então filtrados através de um filtro de 0,2 μm.

[0139] A ativação e o acoplamento foram efetuados conforme descrito na WO 96/29094 e na WO 00/56260. Em resumo, o polissacarídeo em uma concentração de 10-20 mg/ml em NaCl 2 M, pH de 5,5- 6,0 foi misturado com solução de CDAP (100 mg/ml, recém preparada em acetonitrila/WFI, 50/50) em uma razão final de CDAP/polissacarídeo de 0,75/1 a 1,5/1. Após 1,5 minutos, o pH foi elevado com hidróxido de sódio para o pH de 10,0. Após três minutos, o toxóide de tétano foi adicionado, de modo a que fosse alcançada uma razão de proteína/polisssacarídeo de 1,5/1 para MenW, 1,2/1 parta MenY, 1,5/1 para MenA ou 1, 5/1 para MenC. A reação foi continuada durante uma a duas horas.

[0140] Após o estágio de acoplamento, glicina foi adicionada em uma razão final de glicina/PS (p/p) de 7,5/1 e o pH foi ajustado para o pH de 9,0. A mistura foi deixada durante 30 minutos. O conjugado foi clarificado usando um filtro Kleenpak de 10 μm e foi então carregado sobre uma coluna Sephacryl S400 HR usando um tampão de eluição de NaCl 150 mM, Tris 10 mM ou 5 mM, pH 7, 5. Os lotes clínicos foram filtrados em uma membrana de esterilização Opticap 4. Os conjugados resultantes apresentaram uma razão de polissacarídeo:proteína média de 1:1- 1:5 (p/p).

Exemplo 1a - Preparação de conjugados de polissacarídeo MenA e MenC da invenção

[0141] Os conjugados MenC - TT foram produzidos usando polissacarídeos nativos (de mais do que 150 kDa, conforme medido por MALLS) ou foram ligeiramente microfluidizados. Os conjugados de MenA- TT foram produzidos usando ou polissacarídeo nativo ou polissacarídeo ligeiramente microfluidizado de mais do que 60 kDA, conforme medido pelo método de MALLS do Exemplo 2. O dimensionamento foi efetuado através de microfluidização usando um aparelho homogeneizador Emulsiflex C-50. Os polissacarídeos foram então filtrados através de um filtro de 0,2 μm.

[0142] De modo a conjugar o polissacarídeo capsular MenA ao toxóide do tétano através de um espaçador, foi usado o método que se segue. A ligação covalente do polissacarídeo e do espaçador (ADH) é executada através de química de acoplamento, através da qual o polissacarídeo é ativado, sob condições controladas, através de um agente de cianalação, tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilamino-piridínio (CDAP). O espaçador reage com o PS cianilado através de seus grupos hidrazino, de modo a formar uma ligação isouréia estável entre o espaçador e o polissacarídeo.

[0143] Uma solução de 10 mg/ml de MenA (pH 6,0) [3,5 g] foi tratada com uma solução recém preparada de 100 mg/ml de CDAP e acetonitrila/água (50/50 (v/v) de modo a obter uma razão de CDAP/MenA de 0,75 (p/p). Após 1,5 minutos, o pH foi elevado para o pH de 10,0. Três minutos após, o ADH foi adicionado de modo a obter uma razão de ADH/MenA de 8,9. O pH da solução foi diminuído para 8,75 e a reação prosseguiu durante 2 horas mantendo este pH(com a temperatura mantida a 25°C).

[0144] A solução de PSAAH foi concentrada a um quarto de seu volume inicial e então diafiltrada com 30 volumes de NaCl 0,2 M usando uma membrana Filtron Omega com um corte de 10 kDa, e o produto retido foi filtrado.

[0145] Antes da reação de conjugação (condensação de carbodiimida), a solução de TT purificada e a solução de PSAAH foram diluídas, de modo a que fosse alcançada uma concentração de 10 mg/ml para PSAAH e 10 mg/ml para TT.

[0146] EDAC (1- etil-3-(3-diemtil-aminopropil) carbodiimida) foi adicionado à solução de PSAH (2 g de sacarídeo) de modo a alcançar uma razão final de 0,9 mg de EDAC/mg de PSAAH. O pH foi ajustado para 5,0. O toxóide de tétano purificado foi adicionado com uma bomba peristáltica (em 60 minutos) de modo a alcançar 2 mg de TT/mg de PSAAH. A solução resultante foi deixada 60 minutos em + 25°C, sob agitação, de modo a que fosse obtido um tempo de acoplamento final de 120 minutos. A solução foi neutralizada através da adição de Tris-HCl 1 M, pH 7, 5 (1/10 do volume final) e deixada 30 minutos a + 25°C, e então durante a noite a de + 2°C a +_ 8 °C.

[0147] O conjugado foi clarificado usando um filtro de 10 μm e foi purificado usando uma coluna Sephacryl S 400 HR (Pharmacia, Suécia). A coluna foi equilibrada em Tris-HCl 10 mM (pH 7,0) NaCl 0,075 M e o conjugado (aprox. 660 ml) foi carregado sobre a coluna (+ 2°C a + 8°C). O reservatório de eluição foi selecionado como uma função da densidade óptica a 280 nm. A coleta foi iniciada quando a absorção foi aumentada para 0,05. A coleta foi continuada até que o Kd alcançasse 0,30. O conjugado foi esterilizado por meio de filtro a + 20°C, e então armazenado a + 2°C a + 8°C. O conjugado resultante apresentou uma razão de polissacarídeo:proteína de 1:2 - 1:4 (p/p).

[0148] De modo a conjugar o polissacarídeo capsular MenC ao toxóide de tétano através de um espaçador, foi usado o método que se segue. A ligação covalente do polissacarídeo e do espaçador (ADH) é executada através de uma química de acoplamento, através da qual o polissacarídeo é ativado sob condições controlada por um agente de cianilação, tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilamino-piridínio (CDAP). O espaçador reage com o PS cianilado através de seus grupos hidrazino, de modo a formar uma ligação isouréia estável entre o espaçador e o polissacarídeo.

[0149] Uma solução de 20 mg/ml de MenC (pH 6,0) (3, 5 g) foi tratada com uma solução recém preparada de 100 mg/ml de CDAP em acetonitrila/água (50/50 (v/v) de modo a obter uma razão de CDAP/MenC de 1,5 (p/p). Após 1,5 minutos, o pH foi elevado para o pH de 10,0. Na ativação do pH, NaCl 5 M foi adicionado, de modo a que fosse alcançada uma concentração final de NaCl 2 M. Três minutos após, ADH foi adicionado, de modo a que fosse obtida uma razão de ADH/MenC de 8,9. O pH da solução foi diminuído para 8,75 e a reação prosseguiu durante 2 horas (retida a 25°C).

[0150] A solução de PSCAH foi concentrada a um mínimo de 150 ml e então diafiltrada com 30 volumes de NaCl 0,23 M usando uma membrana Filtron Omega com um corte de 10 kDa, e o produto retido foi filtrado.

[0151] Antes da reação de conjugação, a solução de TT purificada e a solução de PSCAH (escala de 2 g) foram diluídas em NaCl 0,2 M, de modo a alcançar uma concentração de 15 mg/ml para PSCAH e de 20 mg/ml para TT.

[0152] O toxóide de tétano purificado foi adicionado à solução de PSCAH, de modo a alcançar 2 mg de TT/mg de PSCAH. O pH foi ajustado para 5,0. EDAC (16,7 mg/ml em Tris 0,1 M, pH 7,5) foi adicionado com uma bomba peristáltica (em 10 minutos), e modo a que fosse alcançada uma razão final de 0,5 mg de EDAC/mg de PSCAH. A solução resultante foi deixada durante 110 minutos a + 25°C, sob agitação e regulação de pH, de modo a que fosse obtido um tempo de acoplamento final de 120 minutos. A solução foi então neutralizada através da adição de Tris-HCl 1 M, pH 9,0 (1/10 do volume final) e deixada durante 30 minutos a + 25°C e então durante a noite a de + 2°C a + 8° C.

[0153] O conjugado foi clarificado usando um filtro de 10 μm e foi purificado usando uma coluna Sephacryl S 400 HR (Pharmacia, Suécia). A coluna foi equilibrada em Tris-HCl 10 mM (pH 7, 0), NaCl 0,075 M e o conjugado (aproximadamente 460 ml) foi carregado sobre a coluna (+ 2°C a + 8°C). O reservatório de eluição foi selecionado como uma função da densidade óptica a 280 nm. A coleta foi iniciada quando a absorção aumentou para 0,05. A coleta continuou até que o Kd alcançasse 0, 20. O conjugado foi esterilizado através de filtro a + 20°C, e então armazenado a + 2°C a + 8°C. O conjugado resultante tinha uma razão de polissacarídeo:proteína de 1:2 - 1:4 (p/p).

Exemplo 2- Determinação do peso molecular usando MALLS

[0154] Os detectores foram acoplados a uma coluna de exclusão de tamanho de HPLC, a partir da qual as amostras foram eluídas. Por um lado, o detector de dispersão luminosa a laser mediu as intensidades luminosas dispersadas em 16 ângulos pela solução macromolecular e, por outro lado, um refractômetro interferométrico, colocado em linha, permitiu a determinação da quantidade de amostra eluída. A partir destas intensidades, o tamanho e a forma das macromoléculas em solução podem ser determinados.

[0155] O peso molecular médio em peso (Mw) é definido como a soma dos pesos de todas as espécies, multiplicado pelo seu respectivo peso molecular e dividido pela soma dos pesos de todas as espécies.a) peso molecular médio em peso:Mw

b) peso molecular médio numérico:Mn

c) Raio quadrado médio da raiz:-Rw- e R2w é o raio quadrado definido por:

(- mi- é a massa de um centro de dispersão i e -ri- é a distância entre ocentro de dispersão i e o centro de gravidade da macromolécula).d) A polidispersividade é definida como a razão -Mw/Mn -.

[0156] Polissacarídeos meningocócicos foram analisados através de MALLS através de carregamento sobre duas colunas de HPLC (TSKG 6000 e 5000 PWxl), usadas em combinação. 25 μl do polissacarídeo foram carregados sobre a coluna e foram eluídos com 0,75 ml de água filtrada. Os polissacarídeos foram detectados usando um detector de dispersão luminosa (Wyatt Dawn DSP equipado com laser de argônio de 10 mW a 488 nm) e um refratômetro inferométrico (Wyatt Otilab DSP, equipado com uma célula P 100 e um filtro vermelho a 498 nm).

[0157] As polidispersividades do peso molecular e as recuperações de todas as amostras foram calculados pelo método de Debye usando uma ordem de ajuste polinomial de 1 no software Astra 4.72.

Exemplo 3 - Ensaio clínico comparando a imunização com Meningitec ou um conjugado deMenC- TT de dimensionado em tamanho maior.

[0158] Um estudo controlado, aberto, de fase II foi executado de modo a comparar a vacina de conjugado do sorogrupo C meningocócico (MenC) de GSK Biologicals com a vacina de conjugado do sorogrupo C meningocócico de Haemophilus inflenzae b (Hib- MenC) ou Meningitec® de GSK Biologicals. Cada dose de Meningitec® contém 10 μg de oligossacarídeo do sorogrupo C meningocócico conjugado com 15 μg de CRM 197 e é produzido por Wyeth. Os conjugados de MenC de GSK continham polissacarídeos nativos de cerca de 200 kDa, conjugados ao toxóide do tétano (TT).

[0159] O estudo consistiu de cinco grupos, cada qual planejado para conter 100 pacientes, alocados em dois braços paralelos, como se segue:

[0160] Neste presente estudo, todos os pacientes receberam, em ambos os braços, um quinto (1/5) de uma dose de Mencevax® CWY e uma dose concomitante de Infanrix™ hexa em 12- 15 meses de idade (mês do estudo 0). As duas amostras de sangue foram coletadas a partir de todos os pacientes (mês do Estudo 0 e Mês do Estudo 1). O braço 1 consistiu de quatro grupos a partir de um estudo de vacinação primário, os quais haviam recebido, em sua idade de 3, 4 e 5 meses, as seguintes vacinas: • Grupo K:MenC (10 μg), não adsorvidos em sais de alumínio (não- ads), conjugado de toxóide de tétano (TT) e Infanrix™ hexa (MenC10- TT + Infanrix™ hexa);• Grupo L:Hib (10 μg)-MenC(10 μg), conjugado de TT não- ads e Infanrix™ penta(Hib10 -MenC10-TT + Infanrix™penta)• Grupo M:Hib (5 μg) - MenC (5 μg), não- ads, conjugado de TT e Infanrix™ penta(Hib5- Men5 - TT + Infanrix™ penta)• Grupo N:Meningitec™ e Infanrix™ hexa (Menigitec™ + Infanrix™ hexa)

[0161] Os dois grupos de vacina Hib-MenC- TT (grupos L e M) foram mantidos cegos no estudo de reforço, em relação à formulação exata da vacina candidata.

[0162] O braço 2- (Grupo O) consistiu de pacientes conjugados por idade, que não haviam sido previamente vacinados com uma vacina do sorogrupo C meningocócico (simples), mas que haviam recebido vacinas pediátricas de rotina de acordo com a German Permanent Commision on Immunization.

Critérios para a avaliação:

[0163] Imunogenicidade:Determinação de titulações de anticorpo bactericidas contra (SBA- MenC) meningocócico C através de um teste bactericida (corte:uma diluição de 1:8) e medição por ELISA de anticorpos contra o sorogrupo meningocócico (corte do ensaio:0,3 μg/ml), o polissacarídeo Hib PRP (corte do ensaio:0, 15 μg/ml) e o toxóide de tétano (corte do ensaio:0,1 IU/ml) nas amostras de sangue obtidas antes da vacinação e aproximadamente um mês após a vacinação em todos os pacientes.

Métodos Estatísticos:

[0164] Demografia:Determinação da idade média em meses (com desvio médio, faixa e padrão [ SD] e composição racial e de gênero do ATP e coortes vacinadas totais.

Imunogenicidade:

[0165] Duas análises de imunogenicidade foram executadas com base na coorte de ATP quanto à imunogenicidade (para análises de memória imune e resposta de reforço) na coorte de ATP quanto à segurança (para a análise de persistência). Estas incluíram:

[0166] Avaliação da memória imune para MenC e resposta do reforço para Hib e Tétano:(antes e um mês após a administração de 1/5 da dose da vacina de polissacarídeo simples):• Determinação das titulações e concentrações médias geométricas (GMTs e GMCs) com 95% de intervalos de segurança (95% de Cl);• Determinação do percentual de pacientes com titulação/concentração de anticorpo acima dos cortes propostos com exatos 95% de Cl (taxas de soropositividade/soroproteção);• Investigação de titulações/concentração de anticorpo após a vacinação usando curvas cumulativas reversas;• Computação de 95% de Cl assintótico padronizado quanto à diferença na taxa de soropositividade/soroproteção;• entre o grupo que recebeu imunização prévia (Grupos K, L M e N) e o grupo não recebeu imunização (Grupo O);• Determinação da média geométrica da razão individual de titulação de SBA- MenC em relação à concentração anti-PSC, com 95% Cl;• Determinação de 95% de Cl para a razão de pós-vacinação GMT/C entre os grupos K, L e M e o grupo de controle N para anti- PRP e antitétano e entre cada grupo imunizado (Grupos K, L, M e N) e o grupo não- imunizado (Grupo O) para SBA- MenC e anti-PSC usando um modelo ANOVA;Resultados:Tabela 1, titulações de SBA-MenC e concentração de anticorpo anti-PSC após vacinação com reforço

[0167] Grupo K:pacientes imunizados com MenC10- TT + Infanrix. hexa; Grupo L:pacientes imunizados com Hib-10-MenC - TT + Infanrix. Penta; Grupo M:pacientes imunizados com Hib5-MenC5- TT + Infanrix. penta; Grupo N:pacientes imunizados com Menigitec + Infanrix. hexa; Grupo O:pacientes de controle (isto é, pacientes não-imunizados com vacina de conjugado de MenC)

[0168] N:número de pacientes com resultados disponíveis

[0169] Titulações mais altas de anticorpos contra MenC e titulações de SBA mais altas foram alcançadas através da imunização com as vacinas de conjugado de polissacarídeo MenC dimensionadas em tamanho maior (grupos K, L e M) comparadas com a vacina de conjugado de oligossacarídeo Meningitec.Tabela 2:Razão de média geométrica para a titulação de SBA MenC/concentração de anti- PSC

[0170] Em todos os grupos imunizados (Grupos K, L, M e N), o GMR aumentou de modo significativo da vacinação pré para pós, indicando a presença de maturação de anticorpo e a funcionalidade. GMR no grupo M (imunizado com Hib5-MenC5- TT) foi mais alta do que no Grupo N (imunizado com Meningitec™).Tabela 3:Persistência em 12- 15 meses de idade justo antes da administração das vacinas de reforço

[0171] Grupo K:pacientes imunizados com MenC10- TT + Infanrix™ hexa; Grupo L:pacientes imunizados com Hib10-MenC10- TT + Infanrix™penta; Grupo M:pacientes imunizados com Hib5-MenC5- TT + Infanrix™ penta; Grupo N:pacientes imunizados com Meningitec™ + Infanrix™hexa; N:número de pacientes com resultados disponíveis.

[0172] Titulações de SBA mais altas contra MenC foram alcançadas pela imunização com um tamanho maior de MenC (grupos K, L e M) comparados à imunização com Meningitec de conjugado de oligossacarídeo MenC.

Memória imune (Coorte de ATP quanto à imunogenicidade)

[0173] A administração de 1/5 da dose de polissacarídeo puro ACWY provocou uma titulação de SBA- MenC muito alta em todos os quatro grupos imunizados com 98,7- 100% e 97,5 - 100% de pacientes imunizados com um regime de vacina candidato exibindo titulações > 1:128 (91, 8%). Em comparação, 17,6% de pacientes não-imunizados apresentaram titulações de SBA MenC > 1:128 (91, 8%).

Exemplo 4:Ensaio clínico da Fase II em vacina de conjugado de HibMenAC- TT misturado com DTPw- HepB

[0174] Projeto de Estudo:Estudo de centro único, aleatório (1:1:1:1:1), aberto com cinco grupos. Os cinco grupos receberam o regime de vacinação que se segue, respectivamente, em 6, 10 e 14 semanas de idade.• Tritanrix™ -HepB/Hib- menAC 2, 5/2, 5/2,5:e assim por diante, referido como 2, 5/2,5/2,5:• Tritanrix™- HepB/Hib-MenAC 2,5/5/5:a seguir referido como 2,5/5/5• Tritanrix™ -HepB/Hib-MenAC 5/5/5:a seguir referido como 5/5/5• Tritanrix™-HepB + Hiberix™:a seguir referido como Hiberix• Tritanrix- HepB/Hiberix™ + Meningitec™:a seguir referido como amostras de sangue Menigitec foram tomados no momento da primeira dose de vacina (Pre) e um mês após a terceira dose de vacina (Pós- dose 3).

[0175] Tritanrix é uma vacina DTPw comercializada por GlaxoSmithKline Biologicals S. A.

[0176] 105 pacientes foram usados em cada um dos cinco grupos, dando um total de 525 pacientes no estudo. Tabela 4:Conteúdo das formulações de vacina de GSK

* A vacina 2, 5/2, 5/2,5 foi uma diluição de dose da vacina de Hib-MenAC 5/5/5 de GSK Biologicals a 5/5/5 contendo 2, 5 μg de cada um de PRP-TT, MenA- TT e MenC- TT

[0177] As formulações de vacina Hib-MenAC foram misturadas extemporaneamente com Tritanix - HepB. A vacina de Bordetella pertussis de célula inteira de difteria - tétano- hepatite B combinada (DTPw- HB) Tritanix-HepB) contém não menos do que 30 Unidades Internacionais (IU) de toxóide de difteria, não menos do que 60 IU de toxóide de tétano, não menos do que 4IU de perturssis Bordetella exterminada e 10 μg de antígeno superficial de hepatite B recombinante.

Terapia de referência, dose, modo de administração, lote n°:

[0178] Programação de vacinação/sítio:um grupo recebeu a vacina Tritanrix™- HepB por via intramuscular na coxa esquerda e Hiberix™ por via intramuscular na coxa direita em 6, 10 e 14 semanas de idade. Um outro grupo recebeu a vacina Tritanrix™-HepB/Hiberix™ por via intramuscular na coxa esquerda e a vacina Meningitec por via intramuscular na coxa direita em 6, 10 e 14 semanas de idade.

[0179] Vacina/composição/dose/número do lote:A vacina Tritanix™-HepB usada foi como acima descrito.

[0180] Uma dose (0,5 ml) de vacina de conjugado do tipo b de Haemophilus influenzae de GSK Biologicals:Hiberix™ continha 10 μg de PRP conjugado a toxóide do tétano. No grupo Hiberix™, ele foi misturado com diluente estéril e no Grupo Meningitec™, ele foi misturado com Tritanix™- HepB.

[0181] Uma dose (0,5 ml) da vacina MENINGITEC™de Wyeth Lederle continha:10 μg de oligossacarídeo capsular do grupo meningocócico C, conjugado a 15 μg da proteína Corynebacterium diphteria CRM 197 e alumínio como sais. Resultados- respostas imunes geradas contra Hib, MenA e MenC Tabela 5 a Anti- PRP (μg/ml)

Tabela 5b SBA – MenC

Tabela 5c SBA- MenA

Tabela 5d Anti- PSC (μg/ml)

Tabela 5e Anti-PSA (μg/ml)

Conclusão

[0182] Uma comparação dos resultados de imunogenicidade alcançados com o uso da vacina de conjugado MenC- CRM 197 e as três formulações de GSK, que contêm os conjugados de polissacarídeo MenA-TT e MenC- TT, demonstraram que os conjugados de polissacarídeo Men foram capazes de provocar uma boa resposta imune, similar àquela alcançada usando a vacina de conjugado de oligossacarídeo Meningitec. Todas as formulações testadas forneceram uma resposta para MenC em 100% dos pacientes.

Exemplo 5- Ensaio clínico da Fase II administrando Hib MenCY concomitantemente com Infanrix™ penta de acordo com uma programação de 2, 3 e 4 meses

[0183] Projeto de Estudo:Um estudo multicêntrico controlado de modo aleatório, aberto (parcialmente duplo- cego*), de Fase II, com 5 grupos recebendo uma programação primária de três doses com vacinas como se segue:Grupo Hib-MenCY 2,5/5/5:Hib-MenCY (2,5/5/5) + Infanrix™ pentaGrupo Hib-MenCY 5/10/10:Hib-MenCY (5/10/10) +Infanrix™ pentaGrupo Hib-MenCY 5/5/5: Hib-MenCY (5/5/5) +Infanrix™pentaGrupo Hib-MenC:Hib-MenC (5/5) + Infanrix™ pentaGrupo Menjugate:Menjugate™** + Infanrix™ hexa (controle)* Hib-MenCY 2, 5/5/5, Hib-MenCY 5/10/10 e Hib-MenC foram administrados em um modo duplo cego, enquanto que o grupo Hib- MenCY 5/5/5 e o grupo Menjugate™ foram abertos.

[0184] As formulações a 2,5/5/5, 5/10/10 e 5/5/5 de Hib- MenCY contêm polissacarídeos nativos MenC e polissacarídeos MenY que são microfluidizados.** Menjugate™ contém 10 μg de oligossacarídeos MenC conjugados a 12, 5- 25 μg de CRM por dose e é produzido por Chiron.

[0185] A vacinação em +/- 2, 3, 4 meses de idade (Mês de Estudo 0, Mês 1 e Mês 2), e amostras de sangue (3, 5 ml) de todos os pacientes antes de e um mês após a vacinação primária (Estudo no Mês 0 e no Mês 3).

[0186] Vacina de estudo, dose, modo de administração, número do lote:Três doses injetadas por via intramuscular em intervalos de um mês, em aproximadamente 2, 3 e 4 meses de idade, como se segue:Tabela 6:Vacinas administradas (estudo e controle), grupo, programação/sítio e dose:

[0187] Imunogenicidade:Medição de titulações de anticorpo/concentrações contra cada antígeno da vacina:

[0188] Antes da primeira dose (Mês 0) e aproximadamente um mês após a terceira dose (Mês 3) em todos os pacientes para:SBA-MenC e SBA-MenY, anti-PSC e anti-PSY, anti- PRP, anti-T, anti-FHA, anti- PRN e anti-PT. O uso de atividade bactericida do soro contra os sorogrupos C e Y de N. meningitidis (corte de SBA- MenC e SBA- MenY:1:8 e 1:128); ensaios de ELISA com cortes:> 0, 3 μg/ml e > 2 μg/ml para sorogrupos C de N.meningitidis e polissacarídeos Y (IgG de anti- PSC e IgG de anti-PSY); > 0, 15 μg/ml e > 1, 0 μg/ml para o polissacarídeo Hib polirribosil- ribitol- fosfato (IgG de anti- PRP; 5EL.U/ml para anti- FHA, anti- PRN< anti-PT; > 0, 1 IU/ml de toxóide antitétano (anti- TT). Apenas um mês após a terceira dose (Mês 3) em todos os pacientes para:anti- D, anti-HBs e antipólio 1, 2, e 3. Usando ensaios ELISA com cortes:0,1 IU/ml para antidifteria (anti- D); > 10 ml U/ml para anti-hepatite (anti-HBs); e corte de teste de microneutralização:1:8 para o tipo antipólio 1, 2 e 3 (antipólio 1, 2 e 3).

Métodos Estatísticos:

[0189] As taxas de soroproteção/soropositividade e as concentrações/titulações médias geométricas (GMCs/GMTs) com 95% de intervalos de segurança (95% de CI) foram computados por grupo, para SBA - MenC, anti- PSC, SBA- MenY, anti- PSY, anti-PRP, antitétano, anti- PT, anti- FHA e anti- PRN antes de e um mês após a vacinação; para antidifteria, anti-HBs, antipólio 1, antipólio 2 e antipólio 3, um mês após a vacinação. A resposta da vacina (aparência de anticorpos em pacientes inicialmente soronegativos ou pelo menos a manutenção das concentrações de anticorpo em pacientes inicialmente soropositivos) com 95% de Cl para anti-PT, anti- PRN e anti- FHA foram também computados um mês após a vacinação. As curvas cumulativas reversas para cada anticorpo no Mês 3 foram também apresentadas. As diferenças entre os grupos Hib- MenCY e Hib-MenC, comparadas com o grupo de controle Menjugate™ foram avaliadas em um modo exploratório para cada anticorpo, exceto para SBA- MenY e anti-PSY, em termos de (1) a diferença entre o grupo Menjugate™ (menos) os grupos Hib-MenCY e Hib-MenC quanto ao percentual de pacientes acima dos cortes especificados ou com uma resposta de vacina com os seus 95% de CL assintótico padronizado, (2) as razões de GMC ou de GMT do grupo Menjugate™ em relação aos grupos Hib-MenCy e Hib-MenC com os seus 95% de Cl. Foram efetuadas as mesmas comparações para avaliar a diferença entre cada par de formulações de Hib- MenCY para os anticorpos anti-PRP, SBA-MenC, anti- PSC, SBA-MenY, anti- PSY e anti- TT.

[0190] As incidências totais dos sintomas solicitados locais e gerais foram computadas por grupo de acordo com o tipo de sintoma, sua intensidade e relação para a vacinação (como percentuais de pacientes relatando sintomas gerais, locais e quaisquer sintomas solicitados dentro de 8 dias seguindo-se à vacinação e seus exatos 95% de Cl). As incidências de sintomas não- solicitados foram computadas por grupo. Para sintomas de Grau 3, foram providos o início < 48 horas, atenção médica, duração, relação para a vacinação e os resultados. Eventos Adversos Sérios foram inteiramente descritos.Taxas de Soroproteção/soropositividade & GMT/Ts (Coorte de ATP quanto à imunogenicidade) Tabela 7a Anti- PRP (μg/ml)

Tabela 7b SBA - MenC (Título)

Tabela 7c Anti-PSC (μg/ml)

Tabela 7d SBA-MenY (Título)

Tabela 7e Anti-PSY (μ1g/ml)

Tabela 7f Antitétano (IU/ml) Tabela 7f Antitétano (IU/ml)

[0191] N = número de pacientes com % de resultados disponíveis = percentual de pacientes com concentração/titulação dentro da faixa especificada

[0192] GMC/T:concentração/titulação média geométrica 95% Cl = 95% de intervalo de segurança; LL = Limite Inferior; UL = Limite Superior

Conclusão:

[0193] Os conjugados de polissacarídeo MenC e Y produziram uma boa resposta imune em todos os pacientes, com 100% dos pacientes produzindo respostas acima de 0,3 μg/ml contra MenC e MenY.

Exemplo 6- Ensaio clínico da Fase II comparando três formulações de MenACWY - TT com a vacina de conjugado de oligossacarídeo MenC- CRM 197 Meningitec

[0194] Este exemplo relata um estudo de faixa de dose controlada, aleatória, aberta (parcialmente cega, de fase II, de modo a avaliar a imunogenicidade de três diferentes formulações da vacina de conjugado de toxóide de tétano, A, C, W-135, Y dos sorogrupos meningocócicos (MenACWY-TT) de GalxoSmithKline Biologicals em comparação com uma vacina de conjugado de oligossacarídeo MenC - CRM197 (Meningitec™) quando fornecida como uma dose única a crianças na idade de 12-14 meses.

[0195] O ensaio clínico foi um estudo multicêntrico, controlado, aberto (parcialmente duplo cego*), no qual pacientes elegíveis de 12-14 meses foram colocados, de modo aleatório (1:1:1:1) em de um a quatro grupos paralelos de 50 pacientes para receber uma dose primária única na Visita 1, como se segue:

[0196] Forma 1T:MenACWY- TT em uma dose de 2,5 μg de polissacarídeo MenA conjugado a toxóide de tétano (TT), 2, 5 μg de polissacarídeo MenC conjugado TT, 2,5 μg de polissacarídeo MenW conjugado a TT e 2,5 μg de polissacarídeo MenY conjugado a TT.

[0197] Forma 2T:MenACWT-TT em uma dose de 5μg de polissacarídeo MenA conjugado a TT, 5 μg de polissacarídeo MenC conjugado a TT, 5 μg de polissacarídeo MenW conjugado a TT e 5 μg de polissacarídeo MenY conjugado a TT.

[0198] Forma 3T:MenACWY-TT em uma dose de 2,5 μg de polissacarídeo MenA conjugado a TT, 10 μg de polissacarídeo MenC conjugado a TT, 2,5 μg de polissacarídeo MenW conjugado a TT e 2, 5 μg de polissacarídeo menY conjugado a TT.

[0199] Ctrl T:10 μg e oligossacarídeo MenC conjugado a 1,25- 25 μg de CRM 197 (Meningitec).*As três diferentes formulações de MenACWY- TT foram administradas em um modo duplo cego.

[0200] Programação de vacinação/sítio: Uma única dose de vacina foi administrada por via intramuscular no deltóide esquerdo na Visita 1 (Mês de Estudo 0) de acordo com um designação aleatória. Todas as vacinas candidatas foram supridas sob a forma de uma pelota liofilizada em um frasco de dose única (0, 5 ml após a reconstituição com o diluente salino suprido).

[0201] Imunogenicidade:Medição de titulações/concentrações de anticorpos contra componentes de antígeno de vacina meningocócicos em amostras de sangue obtidas antes da dose de vacina de estudo (Mês 0) e aproximadamente um mês após a dose de vacina do estudo (Mês 1) em todos os pacientes. A determinação de titulações de anticorpo bactericida contra os sorogrupos de N-menigitidis A, C, W- 135 e Y (SBA-MenA, SBA-MenC, SBA -MenW e SBA-MenY) através de um teste bactericida (cortes de ensaio:uma diluição de 1:8 e 1:128) e medição por ELISA de anticorpos contra os sorogrupos de N.meningitidis A, C, W-135 e Y (anti- PSA, anti- PSC, anti-PSW e anti-PSY, cortes de ensaio > 0, 3 μg/ml e > 2 μg/ml), e toxóide do tétano (antitétano, corte de ensaio 0,1 IU/ml).

Resultados

[0202] Resposta do anticorpo em termos de percentual de respostas de SBA-MenA, SBA- MenC, SBA- MenW e SBA-MenY um mês após a vacinação (o ponto terminal primário) é apresentada na Tabela 8. Uma resposta é definida como maio do que ou igual a 4 vezes o aumento quanto a pacientes soropositivos ou soroconversão quanto a pacientes soronegativos antes da vacinação. Tabela 8:Respostas de vacina para anticorpo de SBA um mês após a vacinação

[0203] A Tabela 9 apresenta os números de pacientes que alcançam titulações de SBA acima dos pontos de corte de 1:8 e 1:128, assim como GMTs. Tabela 9:Taxas de Soropositividade e GMTs para anticorpos de SBA um mês após a vacinação

[0204] A vacinação com todas as três formulações do conjugado de polissacarídeo ACWY- TT conduziu a boas respostas de SBA contra MenA, MenC, MenW e MenY com 95- 100% de pacientes com titulações superes a 1:8. Em particular, as formulações 5/5/5/5 e 2,5/10/2,5/2,5 dos conjugados de polisssacarídeo produziram uma resposta mais alta contra MenC do que a vacina de oligossacarídeo Meningitec®, conforme observado em uma proporção mais alta de indivíduos tendo uma titulação superior a 1:128 e as leituras de GMT. Tabela 10. Taxas de soropositividade e GMCs para anticorpos de polissacarídeo um mês após a vacinação

Todas as três formulações da vacina de conjugado de polissacarídeo ACWY- TT produziram boas respostas imunes contra MenA, MenC, MenW e MenY com entre 93% e 100% de pacientes alcançando titulações superiores a 0,3 μg/ml. Leituras de GMC superiores foram alcançadas usando as formulações 5/5/5/5 e 2/5/10/2, 5/2,5 da vacina de conjugado de polissacarídeo ACWY-TT em comparação com Meningitec.Exemplo 7- Comparação de imunogenicidade de conjugados de polissacarídeo MenY nativos e dimensionadosCamundongos (fêmeas DBA/2 de 6-8 semanas) receberam duas injeções, com intervalo de 2 semanas, de PSY- TT, através de via subcutânea. As amostras de sangue foram tomadas 14 dias após a segunda injeção, de modo a executar um ELISA anti-PSY e SBA usando a cepa MenY S 1975. Através de injeção, os camundongos receberam 1 μg de PSY- TT (formulação lio não-ads).Foram usados os conjugados descritos na Tabela 11. Tabela 11

ResultadosOs resultados (Figura 1) apresentam uma tendência em relaçãoa uma imunogenicidade mais alta para conjugados preparados usando PSY dimensionado. A Figura 1A apresenta os resultados de GMC obtidos em um ELISA quanto a antisoros produzidos contra conjugados preparados a partir de MenY nativo (ENYTT012) MenY microfluidizado - 40 ciclos (ENYTT014) e MenY microfluidizado - 20 ciclos (ENYTT)15). GMCs mais altos foram obtidos quando o MenY -TT foi preparado a partir de MenY microfluidizado.Resultados similares foram obtidos quando os anti- soros foram avaliados através de um ensaio de SBA (Figura 1 B). De novo, os valores de GMT mais altos foram alcançados usando conjugados preparados a partir de MenY microfluidizado.Exemplo 8- Ensaio clínico determinando o efeito de um agente de ligação em MenA em uma vacina de conjugado MenACWYUma única dose de diferentes formulações da vacina MenACWY foi administrada a adolescentes de 15-19 anos em 5 grupos de 25 pacientes em um ensaio aleatório a 1:1:1:1:1. As formulações testadas foram:F1- MenACWY conjugado a toxóide de tétano com o conjugado MenA contendo um espaçador AH - 5/5/5/5/μgF2- MenACWY conjugado a toxóide de tétano com o conjugado MenA contendo um espaçador AH - 2, 5/5/2,5/2,5 μgF3- Men ACWY conjugado a um toxóide de tétano com o conjugado MenA contendo um espaçador AH - 5/5/2,5/2,5 μgF4- MenACWY conjugado a um toxóide de tétano sem espaçador em qualquer conjugado - 5/5/5Z5 μgGrupo de Controle - Mencevax ACWYNo trigésimo dia após a inoculação, uma amostra de sangue foi tomada a partir dos pacientes.As amostras de sangue foram usadas para avaliar o percentual de respostas de SBA-MenA, SBA - MenC, SBA-MenW 135 e SBA-MenY, um mês após a dose da vacina. Uma resposta da vacina foi definida como 1) para pacientes inicialmente soronegativos - uma titulação de anticorpo pós vacinação > 1/32 em e Mês ou 2) para pacientes inicialmente soropositivos - titulação de anticorpo de > 4 vezes a titulação e anticorpo pré- vacinação.ResultadosComo mostrado na Tabela 13, o uso de um espaçador no conjugado MenA conduziu a uma resposta imune aumentada contra MenA. O percentual de resposta foi elevado de 66% a 90- 95% quando o espaçador AH foi adicionado. Isto foi refletido em um aumento em SBA GMT de 4335 a 10 000 e em um aumento em GMC de 5 a 20-40. De modo surpreendente, o uso de um espaçador AH também conduziu a uma resposta imune aumentada contra MenC, conforme observado por um aumento no percentual de respostas e um aumento em SBA GMT. Um aumento poderia ser também observado em SBA- GMT contra MenY (6742- 7122) e contra MenW (46215418) quando um espaçador foi introduzido.Tabela 12

Exemplo 9- Ensaio clínico determinando o efeito de um agente de ligação em conjugados de MenA e MenC em vacina de conjugado MenACWYUma única dose de diferentes formulações da vacina MenACWY foi administrada a adolescentes de 15- 19 anos em 5 grupos de 25 pacientes em um ensaio aleatório a 1:1:1:1:1. As formulações testadas foram:F1- MenACWY conjugado a um toxóide de tétano com os conjugados MenA e MenC contendo um espaçador AH - 2, 5/2, 5/2,5/2, 5 μgF2 - MenACWY conjugado a toxóide de tétano com os conjugados MenA e MenC contendo um espaçador AH -5/5/2,5/2,5 μgF3 - MenACWY conjugado a toxóide de tétano com os conjugados MenA e MenC conendo um espaçador AH - 5/5/5/5 μgF4- MenACWY conjugado a um toxóide de tétano com o conjugado MenA contendo um espaçador AH - 5/5/5/5 μgGrupo de Controle - Mencevax ACWYNo trigésimo dia após a inoculação, uma amostra de sangue foi tomada a partir dos pacientes.As amostras de sangue foram usadas para avaliar o percentual de respostas de SBA- MenA, SBA- MenC, SBA-MenW135 e SBA-MenY um mês após a dose da vacina. Uma resposta de vacina foi definida como 1) para pacientes inicialmente soronegativos - uma titulação de anticorpo pós- vacinação > 1/32 em 1 mês ou 2) para pacientes inicialmente soropositivos - titulação de anticorpo de > 4 vezes a titulação de anticorpo pré- vacinação.Resultados:A introdução de um espaçador AH no interior do conjugado MenC conduziu a um aumento na resposta imune contra MenC, tal como mostrado na Tabela 14. Isto é demonstrado através de um aumento em SBA GMT de 1943 a 4329 e um aumento em anti-PSC GMC de 7,65 a 13,13. Foram mantidas boas respostas imunes contra MenA, MenW e MenY.Tabela 13

Claims

1. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende conjugados de uma pluralidade de sacarídeos capsulares de N. meningitidis e uma proteína carreadora, em que o referido conjugado compreende um primeiro sacarídeo capsular de N. meningitidis que é um sacarídeo capsular do sorogrupo A de N. meningitidis (MenA) ou um sacarídeo capsular do sorogrupo C de N. meningitidis (MenC), em que o primeiro sacarídeo capsular de N. meningitidis é conjugado com uma primeira proteína carreadora com uma razão sacarídeo para proteína carreadora variando de 1:2 a 1:5, e um segundo sacarídeo capsular de N. meningitidis diferente conjugado a uma segunda proteína carreadora com uma razão sacarídeo para proteína carreadora variando de 5:1 a 1:1.99, em que o segundo sacarídeo capsular de N. meningitidis diferente é um um sacarídeo capsular do sorogrupo Y de N. meningitidis (MenY), um sacarídeo capsular do sorogrupo W de N. meningitidis (MenW) ou um um sacarídeo capsular do sorogrupo C de N. meningitidis (MenC), em que o primeiro sacarídeo capsular de N. meningitidis é conjugado a uma ligante com tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilamino piridínio (CDAP), em que a primeira proteína carreadora é conjugada ao ligante com carbodiimida, opcionalmente usando 1-etil-3-(3-dimetil-aminopropil) carbodiimida (EDAC), e em que a composição não inclui um adjuvante.

2. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o primeiro sacarídeo capsular de N. meningitidis é o sacarídeo capsular do sorogrupo A de N. meningitidis (MenA) e o segundo sacarídeo capsular de N. meningitidis diferente é o sacarídeo capsular do sorogrupo W de N. meningitidis (MenW) e o a razão do sacarídeo capsular MenW para a proteína transportadora varia de 5:1 a 1:1,99, 2:1 a 1: 1,99, 1,5:1 a 1:1,8, 1:1 a 1:1,7, 1:1,2 a 1:1,6 ou 1:1,4 a 1:1,5 (p/p).

3. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o segundo sacarídeo capsular de N. meningitidis é sacarídeo capsular do sorogrupo Y de N. meningitidis (MenY) e a proporção do sacarídeo capsular de MenY para a proteína transportadora varia de 5:1 a 1:1,99, 2:1 a 1:1,99, 1,5:1 a 1:1,9, 1:1 a 1:1,8, 1:1,1 a 1:1,6 ou 1:1,3 a 1:1,4 (p/p).

4. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a proporção do sacarídeo capsular do sorogrupo A de N. meningitidis (MenA) para a proteína transportadora varia de 1:2 a 1:5, 1:2,4 a 1:4, 1:2,7 a 1:3,5 ou 1:2,9 a 1:3,1 (p/p).

5. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o primeiro sacarídeo capsular de N. meningitidis é o sacarídeo capsular do sorogrupo A de N. meningitidis (MenA) e o segundo sacarídeo capsular diferente de N. meningitidis é sacarídeo capsular do sorogrupo C de N. meningitidis (MenC) e a razão do sacarídeo capsular MenC para a proteína transportadora varia de 5:1 a 1:1,99, 2:1 a 1:1,99, 1,5;1 a 1:1,8, 1,3:1 a 1:1,6, 1,2:1 a 1:1,4 ou 1,1:1 a 1:1,2 (p/p).

6. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o primeiro sacarídeo capsular de N. meningitidis é sacarídeo capsular do sorogrupo C de N. meningitidis (MenC) e a razão do sacarídeo capsular de MenC para a proteína transportadora varia de 1:2 a 1:5, 1:2,5 a 1:4,5, 1:2,7 a 1:4,3, 1:3 a 1:4 ou 1:3,3 a 1:3,5 (p/p).

7. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o segundo sacarídeo capsular de N. meningitidis diferente é diretamente conjugado à segunda proteína transportadora.

8. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a primeira e a segunda proteínas transportadoras são selecionadas independentemente do grupo que consiste em toxóide tetânico (TT), toxóide difteria (DT), material de reação cruzada 197 (CRM197), fragmento C do toxóide tetânico (TT) e proteína D.

9. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o primeiro sacarídeo capsular de N. meningitidis é conjugado à primeira proteína transportadora e o segundo sacarídeo capsular de N. meningitidis diferente é conjugado à segunda proteína transportadora, em que a primeira e a segunda proteínas transportadoras são as mesmas proteínas transportadoras.

10. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o primeiro sacarídeo capsular de N. meningitidis é conjugado separadamente à primeira proteína transportadora e o segundo sacarídeo capsular de N. meningitidis diferente é conjugado separadamente à segunda proteína transportadora.

11. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um sacarídeo capsular de H. influenzae b (Hib) conjugado a uma proteína transportadora.

12. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que o conjugado de sacarídeo capsular de H. influenzae b (Hib) está presente em uma dose mais baixa do que a dose de cada um dos conjugados dos primeiro sacarídeo capsular e segundo primeiro sacarídeo capsular diferentes.

13. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende uma preparação de vesícula da membrana externa do N. meningitidis do serogrupo B ou sacarídeo capsular.

14. Vacina caracterizada pelo fato de que compreende a composição imunogênica da reivindicação 1 e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

15. Kit de vacina para administração concomitante ou sequencial caracterizada pelo fato de que compreende duas composições imunogênicas multivalentes para conferir proteção em um hospedeiro contra doenças causadas por Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, Haemophilus influenzae e Neisseria meningitidis, o referido kit compreendendo:um primeiro recipiente compreendendo tétano componentes de toxóide (TT), toxóide de difteria (DT) e pertussis de células inteiras ou acelulares eum segundo recipiente compreendendo a composição imunogênica da reivindicação 1.

16. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de ser para o uso no tratamento ou na prevenção de doença causada pela infecção de Neisseria meningitidis.