BRPI0612656A2 - composição imunogênica, vacina, e, kit de vacina para a administração concomitante ou seqüencial - Google Patents

Abstract

COMPOSIçãO IMUNOGêNICA, VACINA, E, KIT DE VACINA PARA A ADMINISTRAçãO CONCOMITANTE OU SEQUENCIAL O presente pedido expõe uma composição imunogênica, quecompreende pelo menos 2 sacarídeos capsulares N. meningitidis diferentes, em que um ou mais é/são selecionados a partir de um primeiro grupo, que consiste de MenA, MenC, MenY e MenW, que é/são conjugados a um(uns) carreador(es) de proteína, em que a razão de sacarídeo :proteína (p/p) está entre 1:2 - 1:5, e um ou mais sacarídeos diferentes é/são selecionados a partir de um segundo grupo, que consiste de MenA, MenC e Men W, que é/são conjugados a um(uns) carreador(es) de proteína, em que a razão de sacarídeo:proteína (p/p) está entre 5:1 - 1:1,99.

Description

"COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, VACINA, E, KIT DE VACINA PARAA ADMINISTRAÇÃO CONCOMITANTE OU SEQÜENCIAL"

A presente invenção refere-se a composições imunogênicas,que compreendem sacarídeos capsulares bacterianos conjugados a umaproteína carreadora, em particular àqueles sacarídeos N. meningitidis. Emadição, ela refere-se a vacinas e a kits de vacina que compreendem taisconjugados de sacarídeos, a processos para a produção das composiçõesimunogênicas e a vacinas e ao uso de vacinas e de composições imunogênicasda invenção em terapia. Ela refere-se também a métodos de imunizaçãocontra a infecção usando os conjugados de sacarídeo e ao uso dos conjugadosde sacarídeo na manufatura de um medicamento.

Neisseria meningitidis é um patógeno humano Gram-negativo, que causa meningite bacteriana. Com base no polissacarídeocapsular do organismo, doze sorogrupos de N. meningitidis foramidentificados (A, B, C, H, I, K, L, 29E, W 135, X, Y, e Z). O sorogrupo A(MenA) é a causa mais comum da doença epidêmica na África subsaariana.Os sorogrupos B e C são responsáveis pela maioria de casos em países emdesenvolvimento, os casos remanescentes sendo causados por W 135 e Y.

As composições imunogênicas, que compreendem sacarídeosN. meningitidis conjugados a proteínas carreadoras são conhecidos na arte; aproteína carreadora tendo o efeito conhecido de transformar o antígeno depolissacarídeo independente de T em um antígeno dependente de T, capaz deprovocar uma resposta de memória imune. Por exemplo, o WO 02/58737expõe uma vacina, que compreende polissacarídeos capsulares purificadosdos sorogrupos de N. meningiditis A, C5 Wl36 e Y, conjugados a umaproteína carreadora. No entanto, este pedido ensina que todos ospolissacarídeos devem ser essencialmente conjugados do mesmo modo(através do mesmo agente de ligação à mesma proteína carreadora).

Permanece uma necessidade para que sejam desenvolvidasvacinas conjugadas aperfeiçoadas contra a meningite neisseriana. A presenteinvenção refere-se à provisão de uma vacina conjugada de polissacarídeomeningocócico, em que a conjugação de cada polissacarídeo é adaptada(preferivelmente a que seja uniforme) de modo a alcançar uma vacinacombinada eficaz. Em particular, é vantajoso combinar certos sacarídeosmeningocócicos conjugados a seus carreadores de proteína em uma alta razãode sacarídeo:proteína, com outros em uma baixa razão.

Deste modo, em um aspecto da presente invenção, é providauma composição imunogênica, que compreende pelo menos 2 sacarídeoscapsulares N. meningitidis, em que um ou mais é/são selecionados a partir deum primeiro grupo, que consiste de MenA, MenC, Men Y e Men W, queé/são conjugados a um(uns) carreador(es) de proteína, em que a razão desacarídeo:proteína (p/p) está entre 1:2 -1:5, e um ou mais sacarídeosdiferentes é/s/ao selecionados a partir de um segundo grupo, que consiste deMenA, MenC, MenY e MenW, que é/são conjugado (s) a um(uns)carreador(es) de proteína, em que a razão de sacarídeo:proteína (p/p) estáentre 5:1 - 1:1,99.

Em uma vacina de MenW, a razão de sacarídeo MenW para aproteína carreadora pode estar entre 5:1-1:1,99, 2:1 - 1:1,99, 1,5:1-1:1,8, 1:1-1:1,7, 1:1,2 -1:16 ou 1:1,4-1:1,5 (p/p). Em uma vacina de MenY, a razão desacarídeo MenY para a proteína carreadora pode estar entre 5:1- 1:1,99, 2:1-1:1,99, 1,5:1-1:1,9, 1:1-1:1,8, 1:1,1-1:1,6 ou 1,13- 1:1,4 (p/p). Em uma vacinade MenA, a razão de sacarídeo MenA para a proteína carreadora pode estarentre 1:1 - 1:5, 1:2,4- 1:4, 1:2,7- 1:3,5, ou 1:2,9-1:3,1 (p/p). Emuma vacinade Men C, a razão do sacarídeo Men C para a proteína carreadora pode estarentre 5:1- 1:1,99,2:1 - 1:1,99, 1,5- 1-1:1,8, 1,3:1 -1:1,6, 1,21 - 1:1,4, ou 1,1:1-1:1,2 (p/p), ou entre 1:2 - 1:5, 1:2,5- 1:4,5, 1:2,7- 1:4,3, 1:3-1:4, ou 1:3,3 -1:3,5 (p/p).

A razão de sacarídeo para a proteína carreadora (p/p) em umconjugado pode ser determinada através do uso do conjugado esterilizado. Aquantidade de proteína é determinada através do uso de um ensaio de Lowry(por exemplo, Lowry et al. (1951), J. Biol. Chem. 193, 265-275 ou Peterson etal. Analytical Biochemistry 100, 201-220 (1979)) e a quantidade de sacarídeoé determinada através do uso de ICP - OES (espectroscopia de emissão deplasma óptico acoplada indutivamente) para MenA, ensaio de DMAP paraMenC e ensaio de Resorcinol para Men W e MenY (Monsigny et al. (1988)Anal. Biochem. 175, 525 - 530).

Muitas vezes, sacarídeos conjugados através de um agente deligação apresentam uma incorporação mais alta da proteína carreadora do quequando ligados diretamente à proteína carreadora. Em uma vacina de MenACda invenção, por exemplo, o sacarídeo MenA pode ser conjugado a umaproteína portadora através de um agente de ligação e MenC diretamente. Emuma vacina de MenCY, MenC pode ser conjugado através de um agente deligação e MenY diretamente. Em uma vacina de MenACWY, Men A pode serconjugado através de um agente de ligação e MenCWY diretamente, ouMenAC pode ser diretamente conjugado através de um agente de ligação eMenWY diretamente.

Em um outro aspecto da invenção, é provida uma composiçãoimunogênica, que compreende pelo menos 2 sacarídeos diferentes,conjugados separadamente ao mesmo tipo de proteína carreadora (porexemplo, DT, CRM197, Proteína D ou TT), em que um ou mais sacarídeo(s)é/são conjugados à proteína carreadora, em que a razão de sacarídeo:proteína(p/p) está entre 1:2 - 1:5, e um ou mais sacarídeos diferentes é/são conjugadoscom a proteína carreadora, em que a razão de sacarídeo :proteína (p/p) estáentre 5:1 - 1:1,99.

Por exemplo, em uma vacina de MenAC, MenA pode serconjugado à proteína carreadora com uma razão de sacarídeo:proteína (p/p) deentre 1:1 -1:5 e MenC conjugado à proteína carreadora com uma razão desacarídeo:proteína (p/p) de entre 5:1- 1:1,99. Em uma vacina de MenCY,MenC pode ser conjugado à proteína carreadora com uma razão desacarídeo:proteína (p/p) de entre 1:2 - 1:5 e MenY conjugado à proteínacarreadora com uma razão de sacarídeo:proteína (p/p) de entre 5:1 - 1:1, 99.Em uma vacina de MenACWY, MenAC pode ser conjugado à proteínacarreadora com uma razão de sacarídeo:proteína (p/p) de entre 1:1 - 1:5 eMenWY conjugado à proteína carreadora com uma razão desacarídeo:proteína (p/p) de entre 5:1 - 1:1,99, ou MenA pode ser conjugado àproteína carreadora com uma razão de sacarídeo:proteína (p/p) de entre 1:2-1:5 e MenCWY conjugado à proteína carreadora com uma razão desacarídeo:proteína (p/p) de entre 5:1 - 1:1,99.

De acordo com um aspecto adicional da invenção, é providoum método de imunização de um hospedeiro humano contra a doença causadapor Neisseria meningitidis, que compreende administrar ao hospedeiro umadose imunoprotetora da composição imunogênica ou vacina da invenção.

De acordo com um outro aspecto da invenção, é provida umacomposição imunogênica da invenção para o uso no tratamento ou prevençãoe doença causada por Neisseria Meningitidis.

De acordo com um aspecto adicional da invenção, é provido ouso de uma composição imunogênica ou vacina da invenção na manufatura deum medicamento para o tratamento ou a prevenção de doenças causadas porNeisseria meningitidis.

Descrição das figuras:

Figura 1- A - é um gráfico de barras que apresenta respostasde GMC em um ELISA anti- MenY. ENYTTO12 é um conjugado de MenY-TT, preparado a partir do polissacarídeo MenY nativo. ENYTTO14 é umconjugado MenY- TT, preparado a partir do polissacarídeo MenYmicrofluidizado, que foi submetido a 40 ciclos de microfluidização.ENYTTO15 é um conjugado de MenY- TT, preparado a partir dopolissacarídeo MenY microfluidizado, que foi submetido a 20 ciclos demicrofluidização.

- B - é um gráfico de barras, que mostra as respostas de GMTem um ensaio de SBA anti- MenY. ENYTTO12 é um conjugado de MenY-TTpreparado a partir do polissacarídeo MenY nativo. ENYTTO14 é umconjugado de MenY- TT, preparado a partir do polissacarídeo MenYmicrofluidizado, que foi submetido a 40 ciclos de microfluidização.ENYTT015bis é um conjugado de MenY- TT, preparado a partir dopolissacarídeo MenY microfluidizado, que foi submetido a 20 ciclos demicrofluidização.

Descrição Detalhada

Em um aspecto da presente invenção, é provida umacomposição imunogênica, que compreende pelo menos 2 sacarídeoscapsulares N. meningitidis, em que um ou mais é/são selecionados a partir d eum primeiro grupo, que consiste de MenA (sacarídeo capsular do sorogrupoA de N. meningitidis), MenC (sacarídeo capsular do sorogrupo C de N.meningitidis), MenY (sacarídeo capsular do sorogrupo Y de N. meningitidis),e MenW (sacarídeo capsular do sorogrupo Wl35 de N. meningitidis) queé/são conjugados a um(uns) carreador(es) de proteína, em que a razão desacarídeoiproteína (p/p) está entre 1:2 - 1:5, e em que um ou mais sacarídeosdiferentes é/são selecionados a partir de um segundo grupo, que consiste deMenA, MenC, menY e MenW, que é/são conjugado(s) a um carreador deproteína, em que a razão de sacarídeo :proteína (p/p) está entre 5:1- 1:1,99.

De modo mais específico, a composição compreende pelomenos 2 sacarídeos capsulares N. meningitidis diferentes, em que um ou maisé/são selecionados a partir de um primeiro grupo, que consiste de MenA e deMenC, que é/são conjugados a um(uns) carreador(es) de proteína, em que arazão de sacarídeo:proteína (p/p) está entre 1:2 - 1:5, e em que um ou maissacarídeos diferentes é/são selecionados a partir de um segundo grupo, queconsiste de MenA, MenC, MenY e MenW, que é/são conjugados a um(uns)carreador(es) de proteína, em que a razão de sacarídeo:proteína (P/p) estáentre 5:1 - 1:1,99.

Em um aspecto, a composição imunogênica possui o sacarídeoMenW, em que a razão de sacarídeo MenW para a proteína carreadora estáentre 5:1- 1:1,99, 2:1- 1:1,99, 1,5:1-1:1,8, 1:1- 1:1,7, 1:1,2 - 1:1,6, ou 1:1,4 -1:1,5 (p/p). Em um outro aspecto, a composição imunogênica possui osacarídeo MenY, em que a razão do sacarídeo MenY para a proteínacarreadora está entre 5:1- 1,99, 2:1 - 1:1,99, 1,5:1- 1:1,9, 1:1,1 - 1:1,6, ou1:1,3 - 1:1,4 (p/p). Em um aspecto adicional, a composição imuunogênicacompreende o sacarídeo MenA, em que a razão de sacarídeo MenA para aproteína carreadora está entre 1:2 - 1:5, 1:2, 4 - 1:4, 1:2,7 - 1:3,5 ou 1:2,9 -1:3,1 (p/p) ou entre 5:1 - 1:1,99,2:1- 1:1,99, 1,5:1 - 1:1,8, 1,3:1 - 1:1,6, 1,2:1-1:1,4, ou de 1,1:1- 1:1,2 (p/p). Em um aspecto adicional, a composiçãoimunogênica compreende o sacarídeo MenC, em que a razão do sacarídeoMenC para a proteína carreadora está entre 5:1 - 1:1,99, 2:1 - 1:1,99, 1,5:1-1:1,8, 1,3:1- 1:1,6, 1,2:1- 1:1,4, ou 1,1:1 - 1:1,2 (p/p), ou entre 1:2 - 1:5, 1:2,5- 1:4,5, 1:2,7 - 1:4,3, 1:3 -1:4, ou 1:3, 3- 1:3,5 (p/p).

De modo mais específico, o primeiro grupo pode consistir deMenA e de MenC, e o segundo grupo pode consistir de MenC, MenY eMenW. Modalidades particulares da invenção são composiçõesimunogênicas, que compreendem:o sacarídeo capsular MenA, em que a razãodo sacarídeo MenA para a proteína carreadora está entre 1:2 - 1:5, 1:2,4- 1:4,1:2, 7 -1:3,5, ou 1:2, 9 - 1:3,1 (p/p) [ que pode ser opcionalmente conjugadoatravés de um agente de ligação à proteína carreadora] e o sacarídeo capsularMenC, em que a razão do sacarídeo MenC para a proteína carreadora estáentre 5:1 - 1:1, 99, 2:1 - 1:1,99, 1, 5:1- 1:1, 8, 1,3:1-1:1,6, 1,2:1- 1:1,4, ou1,1:1 -1:1,2 (p/p) [que pode ser opcionalmente diretamente conjugado àproteína carreadora]; o sacarídeo capsular MenC, em que a razão do sacarídeoMenC para a proteína carreadora está entre 1:2- 1:5, 1:2,4 -1:4, 1:2,7 - 1:3,5,ou 1:2,9 - 1:3,1 (p/p) [que pode ser opcionalmente conjugado através de umagente de ligação à proteína carreadora] e o sacarídeo capsular MenY, em quea razão do sacarídeo Men Y para a proteína carreadora está entre 5:1- 1:1,99,2:1 - 1:1,99, 1, 5:1- 1:1,8, 1,3:1 - 1:1,6, 1,2:1- 1:1, 4, ou 1,1:1 - 1:1, 2(p/p)[que pode ser opcionalmente conjugado à proteína carreadora];sacarídeos capsulares MenA e MenC, em que a razão de sacarídeo Men AeCpara a (a) proteína(s) carreadora(s) está entre 1:2 - 1:5, 1:2,4- 1:4, 1:2,7 -1:3,5, ou 1:2,9 - 1:3,1 (p/p)[ e que pode ser opcionalmente conjugado atravésde um agente de ligação à (s) proteína(s) carreadora(s)] e sacarídeoscapsulares Men Y e Men W, em que a razão de sacarídeo Men YeW para aproteína carreadora está entre 5:1 - 1:1,99, 2:1- 1:1, 99, 1,5:1- 1:1,8, 1,3:1-1:1,6, 1,2:1 -1:1,4, ou 1,1:1 - 1:1,2 (p/p) [ e que pode ser opcionalmentediretamente conjugado à (s) proteína(s) carreadora(s); o sacarídeo capsularMenA, em que a razão do sacarídeo MenA para a proteína carreadora estáentre 1:2,5 - 1:5,1:2,4 - 1:4, 1:2,7 - 1:3,5, ou 1:2,9-1:3,1 (p/p) [ que pode seropcionalmente conjugado através de um agente de ligação à proteínacarreadora] e os sacarídeos capsulares MenC, MenY e MenW, em que a razãodo sacarídeo Men YeWeC para a proteína carreadora está entre 5:1 -1:1,99, 2:1 - 1:1,99, 1,5:1 - 1:1,8, 1,3:1 - 1:1,6, 1,2:1 - 1:1,4, ou 1,1:1 - 1:1, 2(p/p) [e que pode ser opcionalmente diretamente conjugado à (s) proteína(s)carreadora(s)]. Em qualquer uma destas modalidades um conjugado Hib podeser também incluído, que está ligado a uma proteína carreadora (vide lista decarreadoras acima e abaixo, por exemplo TT, e quanto a razões desacarídeo:proteína) diretamente ou através de um agente de ligação.O termo "sacarídeo "em todo este relatório pode indicarpolissacarídeo ou oligossacarídeo e inclui ambos. Os polissacarídeos sãoisolados a partir de bactérias ou isolados a partir de bactérias e encolados emalgum grau através de métodos conhecidos (vide, por exemplo, EP 497524 eEO 497525) e opcionalmente através de microfluidização. Os polissacarídeospodem ser encolados de modo a reduzir a sua viscosidade em amostras depolissacarídeo e/ou de modo a aperfeiçoar a sua capacidade de filtraçãoquanto a produtos conjugados. Os oligossacarídeos possuam um baixonúmero de unidades de repetição (de modo típico de 5-30 unidades derepetição) e são, de modo típico, polissacarídeos hidrolisados.

Cada sacarídeo capsular N. meningitidis (e/ou Hib) pode serconjugado a uma proteína carreadora, independentemente selecionadas apartir do grupo, que consiste de TT, DT, CRM 197, fragmento C de TT eproteína D. Uma lista mais completa de carreadores de proteína, que podemser usadas nos conjugados da invenção, é apresentada abaixo. Embora um oumais sacarídeos capsulares N. meningitidis (e/ou Hib) possa ser conjugado aproteínas carreadoras diferentes umas das outras, em uma modalidade eles sãotodos conjugados à mesma proteína carreadora. Por exemplo, eles podem sertodos conjugados à mesma proteína carreadora, selecionada a partir do grupoque consiste de TT, DT, CRM 197, fragmento C de TT e proteína D. Nestecontexto, CRM 197 e DT podem ser considerados como sendo a mesmaproteína carreadora pelo fato de que eles diferem em apenas um aminoácido.Em uma modalidade, todos os sacarídeos capsulares N.meningitidis (e/ouHib) presentes são conjugados a TT.

Se a proteína carreadora for a mesma para 2 ou maissacarídeos na composição, os sacarídeos podem ser conjugados à mesmamolécula do carreador de proteína (moléculas de carreador tendo mais 2sacarídeos diferentes conjugados a ela) [vide, por exemplo, WO 04/083251;por exemplo, uma única proteína carreadora pode ser conjugada a MenA e aMenC; MenA e MenW; Men A e MenY; Men C e MenW; MenC e MenY;MenW e MenY; MenA, MenC e MenW; MenA5 MenC e MenY; MenA5MenW e MenY; Men C5 MenW e MenY; Men A5 MenC5 MenW e MenY;Hib e MenA; Hib e MenC; Hib e MenW; ou Hib e MenY]. De modoalternativo, os sacarídeos podem, cada qual separadamente, ser conjugados adiferentes moléculas do carreador de proteína (cada molécula do carreador deproteína tendo apenas um tipo de sacarídeo conjugado a ela).

As composições imunogênicas de acordo com o primeiroaspecto da invenção podem também apresentar qualquer ou todas ascaracterísticas adicionais do segundo aspecto da invenção e vice versa.

Em um segundo aspecto da invenção, é apresentada umacomposição imunogênica, que compreende pelo menos 2 sacarídeosdiferentes, conjugados separadamente ao mesmo tipo de proteína carreadora,em que um ou mais sacarídeos) é/são conjugados à proteína carreadora, emque a razão de sacarídeo:proteína (p/p) está entre 1:2 - 1:5, [uma razãoelevada], e um ou mais sacarídeos diferentes é/são conjugados à proteínacarreadora, em que a razão de sacarídeo:proteína (p/p) está entre 5:1 - 1:1, 99[ uma razão baixa].

Por " separadamente conjugado ao mesmo tipo de proteínacarreadora" é compreendido que os sacarídeos são conjugados ao mesmocarreador individualmente (isto é, diferentes sacarídeos não são conjugados àmesma molécula do mesmo carreador de proteína).

O (s) sacarídeo (s) capsular(es) podem ser conjugados aomesmo tipo de proteína carreadora, independentemente selecionados a partirdo grupo, que consiste de TT, DT, CRM 197, fragmento C de TT e proteínaD. Uma lista mais completa de carreadores de proteína, que podem ser usadosnos conjugados da invenção, é apresentada abaixo. Neste contexto, CRM 197e DT podem ser considerados como a mesma proteína carreadora, pois elesdiferem em apenas um aminoácido. Em uma modalidade, todos os sacarídeoscapsulares presentes são conjugados a TT.

Sacarídeos em alta razão (1:2 - 1:5) e em baixa razão (5:1-1:1,99) podem ser selecionados a partir de um grupo que consistede:sacarídeo capsular do sorogrupo A de N. meningitidis (MenA)5 sacarídeocapsular do sorogrupo C de N. meningitidis (MenC), sacarídeo capsular dosorogrupo Y de N. meningitidis (MenY), sacarídeo capsular do sorogrupo Wde N. meningitidis (MenW). Sacarídeo capsular do tipo b de H. Influenzae(Hib), sacarídeo capsular do grupo I de Streptococcus do Grupo B, sacarídeocapsular do grupo II de Streptococcus do Grupo B, sacarídeo capsular dogrupo III de Streptoeoceus do Grupo N, sacarídeo capsular do grupo IV deStreptocoeeus do Grupo B, sacarídeo capsular do grupo V de Streptoeoceusdo Grupo B, sacarídeo capsular do tipo 5 de Staphylocoeeus aureus, sacarídeocapsular do tipo 8 de Staphylocoeeus aureus, sacarídeo Vi de Salmonellatyphi, N. meningitidis LPS (tal que L3 e/ou L2), M. catarrhalis LPs, H.influenzae LPS, e de qualquer dos sacarídeos pneumocócicos capsulares, taisque do sorotipo:l, 2, 3, 4, 5, 6 A, 6B, 7F, 8, 9 N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B,17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23 F ou 33 F. Em uma modalidade, acomposição imunogênica da invenção consiste de ou compreende dois oumais sacarídeos diferentes a partir do mesmo gênero de bactéria (porexemplo, Neisseria, Streptoeoceus, Staphylococcus, ou Haemophilus).

Em uma modalidade, MenA é um sacarídeo de alta razão; emoutra, MenW é um sacarídeo de baixa razão; em outra, MenY é um sacarídeode baixa razão; em outra MenC é um sacarídeo de alta razão; em outra, MenCé um sacarídeo de baixa razão; em outra, Hib é um sacarídeo de alta razão.Vacinas, que compreendem MenA/C podem ser de alta/baixa razão,respectivamente, vacinas que compreendem MenCAf podem ser de alta/baixarazão, respectivamente, vacinas que compreendem MenA/C/W/Y podem serde alta/alta/baixa/baixa razão, respectivamente, e vacinas que compreendemMenA/C/W/Y podem ser de alta/baixa/baixa/baixa razão, respectivamente.Considerações gerais em aspectos da invenção:

Os sacarídeos da invenção (em particular os sacarídeos deN.meningitidis e/ou o sacarídeo capsular de Hib), incluídos nas composiçõesfarmacêuticas (imunogênicas) da invenção, são conjugados a uma proteínacarreadora, tal que o toxóide de tétano (TT), o fragmento C de toxóide detétano, mutantes não- tóxicos da toxina de tétano [observe-se que todas taisvariantes de TT são consideradas como sendo do mesmo tipo de proteínacarreadora para os propósitos desta invenção], toxóide de difteria (DT), CRM197, outros mutantes não- tóxicos da toxina de difteria [tais que CRM 176,CRM 197, CRM 228, CRM 45 (Uchida et al. J. Biol Chem., 218; 3838-3844,1973); CRM 9, CRM 45, CRM 102, CRM 103 e CRM 107 e outras mutaçõesdescritas por Nicholls e Youle em Geneticallly Engineered Toxins, Ed.Frankel, Mareei Dekker Inc.,1992; deleção ou mutação de Glu-148 para Asp,Gln ou Ser e/ou Ala 158 para Gly e outras mutações expostas na US47009017 ou US 4950740; mutação de pelo menos um ou mais resíduos Lys516, Lys 526, Phe 530 e/ou Lys 534 e outras mutações expostas na US5917017 ou US 6455673; ou fragmento exposto na US 5843711] (observe-seque todas tais variantes de DT são consideradas como sendo o mesmo tipo deproteína carreadora para os propósitos desta invenção), penumolisinapneumocócica (kuo et al. (1995), Infect. Immun. 63; 2706- 13), OMPC(proteína da membrana externa meningocócica - usualmente extraída a partirdo sorogrupo B de N- meningitidis - EP 00372501), peptídeos sintéticos (EP0378881, EP 0427347), proteínas de choque térmico (WO 93/17712, WO94/03208), proteínas pertussis (WO 98/58668, EP 0471177), citoquinas,linfoquinas, fatores de crescimento ou hormônios (WO 91/01146), proteínasartificiais, que compreendem epítopos da célula CD4 + T humana múltipla devários antígenos derivados de patógeno (Falugi et al. (2001) Eur. J. Immunol.31:3816 - 3824), tais que a proteína Nl9 (Baraldoi et al. (2004) Infect.Immun. 72; 4884 -7) proteína superficial penumocócica PspA (WO02/091998), proteínas de absorção de ferro (WO 01/72337), toxina A ou B deC. difficile (WO 00/61761) ou Proteína D (EP 594610 e WO 00/56360).

Em uma modalidade, a composição imunogênica da invençãousa o mesmo tipo de proteína carreadora (independentemente), em pelomenos dois, três, quatro ou cada um dos sacarídeos (por exemplo sacarídeoscapsulares de N. meningitidis e/ou Hib) contidos na mesma. Em umamodalidade, em que os sacarídeos capsulares Hib e N. meningitidis estãopresentes, Hib pode ser conjugado à mesma proteína carreadora que os pelomenos dois, três, quatro ou cada um dos sacarídeos de N. meningitidis. Porexemplo, 2, 3, ou 4 dos sacarídeos de N. meningitidis (MenA, C, Y, W) sãoindependentemente conjugados ao toxóide de tétano de modo a produzir 2, 3,ou 4 conjugados, e opcionalmente Hib é também conjugado a TT.

Em uma modalidade, a composição imunogênica da invençãocompreende um sacarídeo de N. meningitidis conjugado a uma proteínacarreadora selecionada a partir do grupo, que consiste de TT, DT, CRM 197,fragmento C de TT e proteína D. Em uma modalidade, a composiçãoimunogênica da invenção compreende um sacarídeo Hib conjugado a umaproteína carreadora, selecionada a partir do grupo que consiste de TT, DT,CRM 197, fragmento C de TT e proteína D.

A composição imunogênica da invenção compreende, demodo opcional, pelo menos um conjugado de sacarídeo meningocócico (porexemplo, MenA; MenC; MenW; MenY; MenA e MenC; MenA e MenW;MenA e MenY; MenC e MenW; MenC e MenY; MenW e MenY; MenA,MenC e MenW; MenA, MenC e MenY; MenA, MenW e MenY; MenC,MenW e MenY ou MenA, MenC, MenW e MenY), tendo uma razão desacarídeo de Men para a proteína carreadora de entre 1:5 a 5:1, entre 1:2 e5:1, entre 1:0,5 e 1:2,5 ou de entre 1:1, 25 (p/p).

A composição imunogênica da invenção compreende, demodo opcional, um conjugado de sacarídeo de Hib tendo uma razão de Hibpara a proteína carreadora de entre 1:5 e 5:1, 1:2 e 2:1, 1:1 e 1:4, 1:2 e 1:3,5,ou em torno de ou exatamente de 1:2,5 ou 1:3 (p/p).

Em uma modalidade, a composição imunogênica da invençãodo(s) sacarídeo (s) N. meningitidis e/ou o sacarídeo Hib é conjugado àproteína carreadora por meio de um agente de ligação, por exemplo umagente de ligação bifuncional. O agente de ligação é, de modo opcional,heterobifuncional ou homobifuncional, tendo, por exemplo, um grupo aminoreativo e um grupo de ácido carboxílico reativo, 2 grupos amino reativos oudois grupos de ácido carboxílico reativos. O agente de ligação possui, porexemplo, entre 4 e 20, 4 e 12, 5 e 10 átomos de carbono. Um agente deligação possível é ADH. Outros agentes de ligação incluem B-propionamido(WO 00/10599), nitrofenil-etilamina (Gever et al. (1979) Med. Microbiol.Immunol. 165; 171- 288), halogenetos de haloalquila (US 4057685), ligaçõesglicosídicas (US 4673574, US 4808700), hexano diamina e ácido 6-amnocapróico (US 44 59 286).

Os conjugados de sacarídeo presentes nas composiçõesimunogênicas da invenção podem ser preparados através de qualquer técnicade acoplamento conhecida. O método de conjugação pode ser baseado naativação do sacarídeo com tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilaminopiridínio (CDAP) de modo a formar um éster de cianato. O sacarídeo ativadopode ser deste modo acoplado diretamente ou através de um grupo espaçador(agente de ligação) e um grupo amino na proteína carreadora. Por exemplo, oespaçador poderia ser cistamina ou cisteamina, de modo a formar umpolisasacarídeo tiolado, que poderia ser acoplado ao carreador através de umaligação tioéter, obtida após a reação com uma proteína carreadora ativada pormaleimida (por exemplo, usando GMBS) ou uma proteína carreadoraholoacetilada (por exemplo, usando iodoacetimida oubromoacetatobromoacetato de N-succinimidila). De modo opcional, o éster decianato (opcionalmente produzido através da química de CDAP) é acopladocom hexano diamina ou ADH e o sacarídeo aminoderivado é conjugado coma proteína carreadora usando carbodiimida (por exemplo, EDAC ou EDC),por meio de um grupo carboxila na proteína carreadora. Tais conjugados sãodescritos no pedido publicado PCT WO 93/15760 Uniformed ServicesUniversity e WO 95/08348 e WO 96/29094.

Outras técnicas adequadas utilizam carbinidas, hidrazidas,ésteres ativos, norborano, ácido p-nitrobenzóico, N-hidroxissuccinimida, S-NHS, EDC, TSTU. Muitos são descritos no WO 98/42721. A conjugaçãopode envolver um agente de ligação carbonila, que pode ser formado atravésda reação de um grupo hidroxila livre do sacarídeo com CDI (Bethell et al., J.Biol. Chem. 1979, 254; 2571 - 4, Heam et al. Chromatogr., 1981, 218; 508-18) seguido pela reação do mesmo com uma proteína, de modo a formar umaligação carbamato. Isto pode envolver a redução do terminal anomérico paraum grupo hidroxila primário, a proteção/desproteção opcional da reação dogrupo hidroxila primário do grupo hidroxila primário com CDI, de modo aformar um intermediário de carbamato de CDI e acoplar o intermediário decarbamato de CDI com um grupo amino em uma proteína.

Os conjugados podem ser também preparados através demétodos de aminação redutiva direta, conforme descrito na US 4365170(Jennnings) e na US 4673574 (Anderson). Outros métodos são descritos naEP- 0-161-188, EP -208375 e na EP- 0- 477508.

Um outro método envolve o acoplamento de um sacarídeoativado por brometo de cianogênio (ou CDAP) com diidrazida de ácidoadípico (ADH) na proteína carreadora através da condensação deCarbodiimida (Chu C. et al. Infect. Immunity, 1983 245 256), por exemplousando EDAC.

Em uma modalidade, um grupo hidroxila (opcionalmente umgrupo hidroxila ativado, por exemplo um grupo hidroxila ativado por um ésterde cianato) em um sacarídeo é ligado a um grupo amino ou carboxílico emuma proteína, seja diretamente ou indiretamente (através de um agente deligação). Quando um agente de ligação está presente, um grupo hidroxila emum sacarídeo é opcionalmente ligado a um grupo amino em um agente deligação, por exemplo através do uso de conjugação de CDAP. Um outrogrupo amino no agente de ligação, por exemplo ADH, pode ser conjugado aum grupo de ácido carboxílico em uma proteína, por exemplo através do usode química de carbodiimida, por exemplo através do uso de EDAC. Em umamodalidade, o(s) sacarídeo(s) capsular(es) de N. meningitidis ou de Hib (ousacarídeo em geral) (é conjugado ao agente de ligação antes de ser conjugadocom a proteína carreadora. De modo alternativo, o agente de ligação pode serconjugado ao carreador antes da conjugação ao sacarídeo.

De modo geral, os seguintes tipos de grupos químicos em umcarreador de proteína podem ser usados para o acoplamento/conjugação.

A) Carboxila (por exemplo, através de ácido aspártico ouácido glutâmico). Em uma modalidade, este grupo é ligado a grupos aminoem sacarídeos diretamente a um grupo amino em um agente de ligação comquímica de carbodiimida, por exemplo com EDAC.

B) Grupo amino (por exemplo através de lisina). Em umamodalidade, este grupo é ligado a grupos caboxila em sacarídeos diretamenteou a um grupo carboxila em um agente de ligação com química decarbodiimida, por exemplo com EDAC. Em outra modalidade, este grupo éligado a grupos hidroxila ativados com CDAP ou CNBr em sacarídeosdiretamente ou a tais grupos em um agente de ligação; a sacarídeos ou aagentes de ligação tendo um grupo aldeído; a sacarídeos ou a agentes deligação tendo um grupo de éster de succinimida.

C) Sulfidrila (por exemplo através de cisteína). Em umamodalidade, este grupo é ligado a um sacarídeo bromo ou cloroacetilado ouagente de ligação com química de maleimida. Em uma modaldiade, estegrupo é ativado/modificado com bis diazobenzidina.D) Grupo hidroxila (por exemplo através de tirosina). Em umamodalidade, este grupo é ativado/modificado com bis diazobenzidina.

E) Grupo Imidazolila (por exemplo, através de histidina). Emuma modalidade, este grupo é ativado/modificado com bis diazobenzidina.

F) Grupo Guanidila (por exemplo através de arginina).

G) Grupo indolila (por exemplo através de triptofano).

Em um sacarídeo, de modo geral, os grupos que se seguempodem ser usados para um acoplamento:OH, COOH ou NH2. Grupos aldeídopodem ser gerados após diferentes tratamentos, conhecidos na arte, taisque:periodato, hidrólise ácida, peróxido de hidrogênio, etc.

Abordagens de acoplamento direto:

Sacarídeo -OH + CNBr ou CDAP -» éster de cianato + NH2-Prot —» conjugado

Sacarídeo - aldeído + NH2 - Prot -» base de Schiff +NaCNBH3 -» conjugado

Sacarídeo -COOH + NH2 - Prot + EDAC conjugadoSacarídeo- NH2 + COOH - Prot + EDAC -» conjugadoAcoplamento indireto através de abordagens de espaçador(agente de ligação):

Sacarídeo -OH + CNBr ou CDAP éster de cianato + NH2 -

— NH2 sacarídeo -— NH2 + COOH- Prot + EDAC -> conjugado

Sacarídeo -OH + CNBr ou CDAP éster de cianato + NH2 -

— SH —> sacarídeo-----SH + SH- Prot (Proteína nativa com uma cisteína

exposta ou obtida após a modificação de grupos amino da proteína por SPDPpor exemplo) —» sacarídeo-S-S-Prot

Sacarídeo - OH + CNBr ou CDAP -> éster de cianato + NH2 -

— SH —> sacarídeo ----- SH + maleimida - prot (modificação de grupos

amino) —> conjugado

Sacarídeo- COOH + EDAC + Nffi — Nffi sacarídeo —NH2 + EDAC + COOH - Prot conjugado

Sacarídeo- COOH + EDAC + NH2 — SH -> sacarídeo — SH+ SH- Prot (Proteína nativa com uma cisteína exposta ou obtida após amodificação de grupos amino da proteína por SPDP por exemplo) —»sacarídeo - S- S- Prot

Sacarídeo - COOH + EDAC + NH2 — SH -» sacarídeo —SH + maleimida -Prot (modificação de grupos amino) —>• conjugado

Sacarídeo - Aldeído + NH2 — NH2 sacarídeo — NH2 +EDAC + COOH- Prot conjugado

Nota:Em vez de EDAC acima, qualquer carbodiimidaadequada pode ser usada.

Em resumo, os tipos de grupo químico do carreador deproteína, que podem ser geralmente suados para o acoplamento com umsacarídeo são grupos amino (por exemplo em resíduos lisina), grupos COOH(por exemplo em resíduos de ácido glutâmico e aspártico) e grupos SH (seacessível), por exemplo em resíduos cisteína.

Em uma modalidade, o sacarídeo Hib, quando presente, éconjugado com a proteína carreadora usando CNBr, ou CDAP, ou umacombinação de CDAP e química de carbodiiimida (tal que EDAC), ou umacombinação de CNBr e química de carbodiimida (tal que EDAC). De modoopcional, Hib é conjugado usando NBr e química de carbodiimida, de modoopcional EDAC. Por exemplo, CNBr é usado para unir o sacarídeo e o agentede ligação e então a química de carbodiimida é usada para unir o agente deligação ao carreador de proteína.

Em uma modalidade, pelo menos um dos sacarídeoscapsulares de N. meningitidis (ou sacarídeo em geral) está diretamenteconjugado a uma proteína carreadora; de modo opcional, o(s) sacarídeo (s)MenW e/ou MenY e/ou MenW está(ão) diretamente conjugados a umaproteína carreadora. Por exemplo, MenW; MenY; MenC; MenW e MenY;MenW e MenC; MenY e MenC; ou MenW, MenY e MenC estão diretamenteligados à proteína carreadora. De modo opcional, pelo menos um dossacarídeos capsulares d e N.meningitidis está diretamente conjugado atravésde CDAP. Por exemplo, MenW; MenY; MenC; MenW e MenY; MenW eMenC; MenY e MenC; ou MenW, MenY e MenC estão diretamente ligados àproteína carreadora através de CDAP (vide WO 95/088348 e WO 96/29024).Em uma modalidade, todos os sacarídeos capsulares N.menigitidis são estãoconjugados ao toxóide de tétano.

De modo opcional, a razão do sacarídeo Men W e/ou Y para aproteína carreadora está entre 1:0,5 e 1:2 (p/p) e/ou a razão do sacarídeoMenC para a proteína carreadora está entre 1:0,5 e 1:4 ou 1:0,5 e 1:1, 5 (p/p),em especial quando estes sacarídeos estão diretamente ligados à proteína, demodo opcional usando CDAP.

Em uma modalidade, pelo menos um dos sacarídeo (s)capsular (es) N.meningitidis (ou sacarídeo em geral) é conjugado à proteínacarreadora através de um agente de ligação, por exemplo um agente deligação bifuncional. O agente de ligação é, de modo opcional,heterobifuncional ou homobifuncional, tendo, por exemplo, um grupo aminareativo e um grupo de ácido carboxílico reativo, 2 grupos amina reativos ou 2grupos de ácido carboxílico reativos. O agente de ligação possui, porexemplo, entre 4 e 20, 4 e 12, 5 e 10 átomos de carbono. Um agente deligação possível é ADH.

Em uma modalidade, MenA; MenC; ou MenA e MenC éconjugado a uma proteína carreadora (por exemplo, toxóide de tétano) atravésde um agente de ligação.

Em uma modalidade, pelo menos um sacarídeo N. meningitidisé conjugado a uma proteína carreadora através de um agente de ligaçãousando CDAP e EDAC. Por exemplo, MenA; MenC; ou MenA e MenC sãoconjugados a uma proteína através de um agente de ligação (por exemplo,aqueles com dois grupos hidrazino em suas terminações, tais que ADH)usando CDAP e EDAC, tal como acima descrito. Por exemplo, CDAP éusado para conjugar o sacarídeo a um agente de ligação e EDAC é usado paraconjugar o agente de ligação a uma-proteína. De modo opcional, a conjugaçãotravés de um agente de ligação resulta em uma razão de sacarídeo para aproteína carreadora de entre 1:0,5 e 1:6, de 1:1 e 1:5 ou de 1:2 e 1:4, paraMenA; MenC; ou MenA e MenC.

Uma consideração adicional em uma vacina combinada, quecompreende vários sacarídeos conjugados ao mesmo carreador, é a questão dasupressão imune do carreador:carreador demais pode ser usado e a respostaimune pode ser impedida. Com uma abordagem uniforme à conjugação, ocarreador irá apresentar uma mistura similar de epítopos de célula B e T aosistema imune. No entanto, se a conjugação ocorrer em diferentes gruposquímicos dentro da proteína carreadora para um sacarídeo contra o outro, oscarreadores de proteína provavelmente serão diferentes em alguma extensãono modo em que eles são apresentados, em si mesmos, ao sistema imune.

De acordo com todos os aspectos da invenção neste, é tambémprovida uma composição imunogênica, que compreende pelo menos 2sacarídeos diferentes, conjugados de modo separado ao mesmo tipo deproteína carreadora (por exemplo, toxóide do tétano), em que um ou maissacarídeo (s) é/são conjugados à proteína carreadora através de um primeirotipo de grupo químico no carreador da proteína, e um ou mais sacarídeo (s)é/são conjugado(s) à proteína carreadora através de um segundo tipo de grupoquímico (diferente) no carreador de proteína.

O primeiro e o segundo tipos de grupo químico podem estarpresentes no carreador de proteína

em um primeiro e segundo conjuntos de aminoácidosmutuamente exclusivos do carreador de proteína (por exemplo, certosresíduos do ácido aspártico/ácido glutâmico em um conjunto e certos resíduosde lisina/arginina no segundo). Um sacarídeo pode ser conjugado a um grupocarboxila no carreador, e outro em um grupo amino, por exemplo. Uma talconjugação pode envolver a conjugação em epítopos da célula B e/ou Tseparados para cada conjugado diferente.

Por exemplo, em uma vacina de MenAC, MenA pode serligado a um primeiro tipo de grupo químico (tal que carboxila) na proteínacarreadora e MenC pode ser ligado a um segundo (tal que amino). Em umavacina de MenCY5 MenC pode ser ligado a um primeiro tipo de grupoquímico (tal que carbonila na proteína carreadora e MenY ligado a umsegundo (tal que amino). Em uma vacina de MenACWY5 MenAC pode serligado a um primeiro tipo de grupo químico (tal que carboxila) na proteínacarreadora e MenWY ligado a um segundo (tal que amino), ou MenA podeser ligado a um primeiro tipo de grupo químico (tal que carboxila) na proteínacarreadora e MenCWY ligado a um segundo (tal que amino).

Em uma modalidade, os 2 conjugados podem envolver omesmo tipo de sacarídeo ligado ao mesmo tipo de carreador, mas través dediferentes químicas de conjugação. Em uma modalidade alternativa, 2sacarídeos diferentes são conjugados a diferentes grupos no carreador deproteína. Por " conjugado separadamente ao mesmo tipo de proteínacarreadora" é compreendido que os sacarídeos são conjugados ao mesmocarreador individualmente (isto é, tanto o primeiro e o segundo gruposquímicos na mesma molécula do carreador de proteína não são usados paraconjugar as porções de sacarídeo, de modo preferido o primeiro grupoquímico é usado em uma primeira alíquota de carreador de proteína comrelação à conjugação de um primeiro sacarídeo, e um segundo grupo químicoem uma segunda alíquota do carreador de proteína é suado em relação àconjugação de um segundo sacarídeo.

Em uma modalidade, o primeiro e o segundo tipo de grupoquímico no carreador de proteína estão presentes em epítopos da célula B e/ouT na proteína do carreador. Ou seja, eles estão presentes em um conjuntodiferentes, um do outro, de epítopos da célula B e/ou T. Para prever epítoposda célula B para um carreador, métodos conhecidos podem ser usados, taisque cada qual ou ambos dos dois métodos que se seguem:Previsão deestrutura 2D e/ou previsão de índice antigênico. A previsão da estrutura 2Dpode ser feita através do uso do programa PSIPRED (de David Jones, BrunelBioinformatics Gorup, Dept. Biological Sciences, Brunel University,Uxbridge UB8 3PH, UK). O índice antigênico pode ser calculado com baseno método descrito por Jameson e Wolf (CABIOS 4:181- 186 [ 1988]). Osparâmetros usados neste programa são o índice antigênico e o comprimentomínimo para um peptídeo antigênico. Um índice antigênico de 0,9 para ummínimo de 5 aminoácidos consecutivos pode ser usado como o limiar noprograma. Epítopos de célula auxiliares de T são os peptídeos ligados àmoléculas da classe II HLA e reconhecidos por células que auxiliam T. Aprevisão de epítopos de célula que auxiliam T úteis pode ser baseada emtécnicas conhecidas, tais que o método TEPITOPE descrito por Sturmiolo etai. (Nature Biotech. 17:555 - 561 [ 1999]).

O primeiro e o segundo grupos, presentes no carreador deproteína, são opcionalmente diferentes um do outro e são, de modo ideal,grupos químicos naturais, que podem ser prontamente suados para propósitosde conjugação. Eles podem ser selecionados independentemente a partir dogrupo que consiste de:grupos carboxila, grupos amino, grupos sulfidrila,grupos hidroxila, grupos imidazolila, grupos guanidila, e grupos indolila. Emuma modalidade, o primeiro grupo químico é carboxila e o segundo é amino,ou vice- versa. Estes grupos são explicados em maiores detalhes acima.

Em uma modalidade específica, a composição imunogênicacompreende pelo menos dois sacarídeos capsulares N. meningitidis diferentes,em que um ou mais é/são selecionados a partir de um primeiro grupo, queconsiste de MenA e MenC, que é/são conjugados à proteína carreadoraatravés do primeiro tipo de grupo químico no carreador de proteína (porexemplo carboxila), e um ou mais sacarídeos diferentes é/são selecionados apartir de um segundo grupo, que consiste de MenC, MenY e MenW, queé/são conjugados à proteína carreadora através do segundo tipo de grupoquímico no carreador de proteína (por exemplo, amino).

Em uma modalidade adicional, a composição imunogênica dainvenção compreende MenA conjugado através do primeiro tipo de grupoquímico (por exemplo, carboxila), e MenC conjugado através do segundo tipode grupo químico (por exemplo, amino).

Em uma outra modalidade, a composição imunogênicacompreende MenC conjugado através do primeiro tipo de gruo químico (porexemplo, carboxila), e MenY conjugado através do segundo tipo de grupoquímico (por exemplo, amino).

Em uma outra modalidade, a composição imunogênicacompreende MenA conjugado através do primeiro tipo de grupo químico (porexemplo, carboxila), e MenC, MenY e MenW conjugados através do segundotipo de grupo químico (por exemplo, amino).

Em ainda uma outra modalidade, a composição imunogênicacompreende MenA e MenC conjugados através do primeiro tipo de grupoquímico (por exemplo, carboxila), e MenY e MenW conjugados através dosegundo tipo de grupo químico (por exemplo, amino).

Em qualquer das modalidades, Hib pode estar tambémpresente também conjugado com o mesmo tipo de carreador de proteína. Hibpode ser conjugado ao carreador através do primeiro ou segundo tipo degrupo químico. Em uma modalidade, ele é conjugado através de um grupocarboxila.

Em uma modalidade, o sacarídeo capsular MenA, quandopresente, é pelo menos parcialmente O-acetilado, de tal modo que pelo menos50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% das unidades de repetição sejamacetiladas em pelo menos uma posição. O-acetilação está presente, porexemplo, pelo menos na posição 0-3 de pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%,90%, 95% ou 98% das unidades de repetição NeuNAc (a2 —»• 9)- ligadassejam O-acetiladas em pelo menos uma ou duas posições. A O-acetilaçãoestá, por exemplo, presente na posição 0-7 e/ou 0-8 de pelo menos 30%,40%, 50%, 60 %, 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% das unidades de repetição.

Em uma modalidade, o sacarídeo capsular MenW, quandopresente, é pelo menos parcialmente O- acetilado, de tal modo que pelomenos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% das unidades derepetição sejam O-acetiladas em pelo menos uma ou duas posições. A O-acetilação está presente, por exemplo, na posição O-I e/ou 0-9 de pelo menos30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% das unidades derepetição.

Em uma modalidade, o sacarídeo capsular MenY, quandopresente, é pelo menos parcialmente O-acetilado, de tal modo que pelo menos20%, 30%, 40%, 50%, 60 %, 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% das unidades derepetição sejam O- acetiladas em pelo menos uma ou duas posições. A O-acetilação está presente na posição 7 e/ou 9 de pelo menos 20%, 30%, 40%,50%, 60 %, 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% das unidades de repetição.

O percentual de O-acetilação refere-se ao percentual dasunidades de repetição contendo O-acetilação. Este pode ser medido nosacarídeo antes de que seja conjugado e/ou após a conjugação.

Em uma modalidade da invenção, a composição imunogênicaé tal que, cada sacarídeo presente, ou cada tipo de sacarídeo capsular N.meningitidis presente, seja conjugado a TT. Em uma outra modalidade, cadatipo de sacarídeo capsular N. mengitidis presente é conjugado separadamentea um tipo separado de proteína carreadora. Em uma modalidade adicional,cada conjugado de sacarídeo capsular N. meningitidis possui uma razão desacarídeo:carreador de 1:5- 5:1 ou de 1:1- 1:4 (p/p). Em uma modalidadeadicional, pelo menos um, dois ou três conjugado(s) de sacarídeo capsular deN. mengitidis é diretamente conjugado a uma proteína carreadora. Em umaoutra modalidade, Men W e/ou Men Y, Men W e/ou Men C, Men Y e/ou MenC, ou Men W e Men C e Men Y são diretamente conjugados a uma proteínacarreadora. Em uma modalidade adicional, pelo menos um, dois ou trêsconjugado(s) de sacarídeo N-meningitidis é diretamente conjugado através dequímica de CDAP. Em uma outra modalidade, a razão de sacarídeo Men We/ou sacarídeo Y para a proteína carreadora está entre 1:0,5 e 1:2 (p/p). Emuma modalidade adicional, a razão de sacarídeo Men C para a proteínacarreadora está entre 1:0,5 e 1:2 (p/p). Em ainda uma outra modalidade, pelomenos um, dois ou três sacarídeo (s) capsular(es) N. meningitidis é (são)conjugados à proteína carreadora através de um agente de ligação (que podeser bifuncional, tal que tendo dois grupos amino reativos (tais que ADH) oudois grupos carboxila reativos, ou um grupo aminorreativo em umaextremidade e um grupo carboxila reativo na outra). O agente de ligação podepossuir entre 4 e 12 átomos de carbono. Em uma outra modalidade, o cadasacarídeo (s) capsular (es) N. meningitidis conjugado através de um agente deligação é(são) conjugado (s) ao agente de ligação através de química deCDAP. Em uma outra modalidade, a proteína carreadora é conjugada aoagente de ligação através do uso de química de carbodiimida, de modoopcional usando EDAC. Em uma modalidade adicional, o ou cada sacarídeocapsular N. meningitidis é conjugado ao agente de ligação antes que aproteína carreadora seja conjugada ao agente de ligação. Em uma outramodalidade, Men A é conjugado à proteína carreadora através de um agentede ligação (a razão de sacarídeo Men A para a proteína carreadora podendoestar entre 1:2 e 1:5 (p/p). Em ainda uma modalidade adicional, Men C éconjugado a uma proteína carreadora através de um agente de ligação (a razãode sacarídeo Men C para á proteína podendo estar entre 1:2 e 1:5 (p/p).

A composição imunogênica da invenção compreende, demodo opcional, um ou mais conjugados de sacarídeo, em que o tamanhomédio de cada sacarídeo antes da conjugação está acima de 50 kDa, 75 kDa,100 kDsa, 110 kDa, 120 kDa ou 130 kDA. Em uma modalidade, o conjugado,após a conjugação, deve ser prontamente filtrável através de um filtro de 0,2mícrons, de tal modo que seja obtido um rendimento de mais do que 50, 60,70, 80, 90 ou 95% após a filtração, comparado com a amostra previamentefiltrada.

Em particular, a composição imunogênica da invençãocompreende sacarídeos capsulares N. meningitidis de pelo menos um, dois,três ou quatro dos sorogrupos A, C, W e Y, conjugados a uma proteínacarreadora, em que o tamanho médio (peso molecular médio em peso; Mw)de pelo menos um, dois, três ou quatro de cada sacarídeo N. meningitidis estáacima de 50 kDa, 60 kDa, 75 kDa, 100 kDa, 110 kDa, 120 kDa ou 130 kDa.

A composição imunogênica pode compreender sacarídeoscapsulares N. meningitidis a partir de pelo um, dois, três ou quatro dossorogrupos A, C, W e Y é conjugado a uma proteína carreadora, em que pelomenos um, dois, três ou quatro de cada sacarídeo N. meningitidis é ou umsacarídeo nativo ou é dimensionado em um fator de 1,5 x, 2 x, 3 x, 4 x, 5 x, 6x, 7 x, 8 x, 9 x, ou 10 x, em relação ao peso molecular médio em peso dopolissacarídeo nativo.

Para os propósitos da invenção, "polissacarídeo nativo" refere-se a um sacarídeo que não foi submetido a um processo, cujo propósito é o dereduzir o tamanho do sacarídeo. Um polissacarídeo pode ter o seu tamanholigeiramente reduzido durante procedimentos de purificação normais. Um talsacarídeo é ainda nativo. Apenas se o polissacarídeo tiver sido submetidotécnicas de dimensionamento, então o polissacarídeo não seria consideradonativo.

Para os propósitos da invenção, "dimensionado em um fator deaté 2 x" significa que o sacarídeo é submetido a um processo para reduzir otamanho do sacarídeo mas de modo a manter um tamanho de mais do que ametade do tamanho do polissacarídeo nativo. 3 X, 4 X, etc. devem serinterpretados do mesmo modo, isto é, o sacarídeo é submetido a um processopara reduzir o tamanho do polissacarídeo, mas de modo a manter mais do queum terço, um quarto etc. do tamanho do polissacarídeo nativo.

Em um aspecto da invenção, a composição imunogênicacompreende sacarídeos capsulares N. meningitidis de pelo menos um, dois,três ou quatro dos sorogrupos A, C, W e Y, conjugados a uma proteínacarreadora, em que pelo menos um, dois, três ou quatro de cada sacarídeo N.meningitidis é um polissacarídeo nativo.

Em um aspecto da invenção, a composição imunogênicacompreende sacarídeos capsulares N. meningitidis a partir de pelo menos um,dois, três ou quatro dos sorogrupos A, C, W e Y, conjugados a uma proteínacarreadora, em que pelo menos um, dois, três ou quatro de cada sacarídeo N.meningitidis é dimensionado (s) em um fator de até 2 x, 3 x, 4 x, 5 x, 6 x, 7 x,8 x, 9 x, ou 10 x.

As composições imunogênicas da invenção compreendem, demodo opcional, conjugados de:sacarídeo capsular do sorogrupo C de N.menigitidis (MenC), sacarídeo capsular do sorogrupo A (MenA), sacarídeocapsular do sorogrupo W 135 (MenW), sacarídeo capsular do sorogrupo Y(MenY(, sacarídeos capsulares do sorogrupo CeY (MenCY(sacarídeoscapsulares do sorogrupo CeA (MenAC), sacarídeos capsulares do sorogrupoCeW (MenCW), sacarídeo capsular do sorogrupo AeY (MenAY),sacarídeos capsulares do sororupo AeW (MenAW), sacarídeos capsulares dosorogrupo WeY (Men WY), sacarídeo capsular do sorogrupo A, C e Y(MenACY); sacarídeos capsulares do sorogrupo A, Wl 35 e Y (Men AWY),sacarídeos capsulares do sorogrupo C, Wl35 e Y (Men CWY); ou sacarídeoscapsulares A, C, Wl35 e Y (MenACWY). Esta é definição de "um, dois, trêsou quatro " ou de "pelo menos um de" dos sorogrupos A, C, W e Y, ou decada sacarídeo de N. meningitidis, quando aqui mencionado.

Em uma modalidade, o tamanho médio de pelo menos um,dois, três, quatro ou de cada sacarídeo N. meningitidis está entre 50 Kda e1500 kDa, 50 kDa e 500 kDa, 50 kDa e 300 kDa, 101 kDa e 1500 kDa, 101kDa e 500 kDa, 101 kDa e 300 kDa, conforme determinado por MALLS.

Em uma modalidade, o sacarídeo MenA, quando presente,possui um peso molecular de 50- 500 kDa, 50- 100 kDa, 55 - 90 kDa, 60-70kDa ou 70-80 kDa ou 60-80 kDa por MALLS.

Em uma modalidade, o sacarídeo MenC, quando presente,possui um peso molecular de 100- 200 kDa, 50- 100 kDa, 100- 150 kDa, 101-130 kDa, 150-210 kDa ou 180-210 kDa por MALLS.

Em uma modalidade, o sacarídeo MenY, quando presente,possui um peso molecular de 60- 190 kDa, 70- 180 kDa, 90 -160 kDa, 100-150 kDa, 110 - 140 kDa, 50- 100 kDa, 100- 140 kDa, 140 - 10 kDa, ou 150 -160 kDa por MALLS.

Em uma modalidade, o sacarídeo MenW, quando presente,possui um peso molecular de 60- 190 kDa, 70 - 180 kDa, 80 - 170 kDa, 90-160 kDa, 100- 150 kDa, 110 - 140 kDa, 50- 100 kDa ou de 120- 140 kDa porMALLS.

O peso molecular ou o peso molecular médio de um sacarídeoneste caso refere-se ao peso molecular médio em peso (Mw) do sacarídeo,medido antes da conjugação e é medido por MALLS.

A técnica de MALLS é bem conhecida na arte e é executada,de modo típico, tal como descrito no Exemplo 2. Para a análise de MALLS desacarídeos menigocócicos, duas colunas (TSKG6000 e 5OOOWxl TOSOHBioscience) podem ser usadas em combinação e os sacarídeos são eluídos emágua. Os sacarídeos são detectados usando um detector de dispersão luminosa(por exemplo Wyatt Dawn DSP equipado com um laser de argônio de 10 mWa 488 nm) e um refractômetro inferométrico (por exemplo Wyatt Otilab DSPequipado com uma célula P 100 e um filtro vermelho a 498 nm).

Em uma modalidade, os sacarídeos N.meningitidis sãopolissacarídeos nativos ou polissacarídeos nativos, que são reduzidos emtamanho durante um processo de extração normal.

Em uma modalidade, os sacarídeos N.meningitidis sãodimensionados através de clivagem mecânica, por exemplo através demicrofluidização ou de tratamento sônico. A microfluidização e o tratamentosônico possuem a vantagem de diminuir o tamanho dos polissacarídeosnativos maiores, o suficiente para prover um conjugado filtrável. Odimensionamento ocorre em um fator de não mais do que 20 x, 10 x, 8 x, 6 x,5 x, 4 x, 3x ou 2 x.

Em uma modalidade, a composição imunogênica cpompreendeconjugados de N-menigitidis, que são produzidos a partir de uma mistura depolissacarídeos e sacarídos nativos, que são dimenionados em um fator de nãomais do que 20 x. Por exemplo, sacarídeos de MenC e/ou MenA são nativos.Por exemplo, os sacarídeos de MenY e/ou MenW são dimensioandos em umfator de não mais do que 20 x, 10 x, 8 x, 6 x, 5 x, 4 x, 3 x ou 2 x. Porexemplo, uma composição imunogênica contém um conjugado produzido apartir de MenY e/ou MenW e/ou MenC e/ou MenA, que é dimensionado emum fator de não mais do que IOx e/ou é microfluidizado. Por exemplo, umacomposição imunogênica contém um conjugado produzido a partir de MenAe/ou MenC e/ou MenW e/ou MenY. Por exemplo, uma composiçãoimunogênica compreende um conjugado produzido a partir de MenC nativo.Por exemplo, uma composição imunogênica compreende um conjugadoproduzido a partir de MenA e MenC nativo, que é dimensionado em um fatorde não mais do que 10 x e/ou é microfluidizado. Por exemplo, umacomposição imunogênica compreende um conjugado produzido a partir deMenY e MenC nativo, que é dimensionado em um fator de não mais do queIOx e/ou é microfluidizado.Em uma modalidade, a polidispersividade do sacarídeo é de 1-1, 5, 1- 1,3, 1-1,2, 1-1,1 ou 1-1,05 w, Após a conjugação a uma proteínacarreador, a polidispersividade do conjugado é de 1,0- 2, 5, 1,0- 2,0, 1,0- 1,5,1,0- 1,2, 1,5- 2,5, 1,7-2,2 ou 1,5 - 2,0. Todas as medições depolidispersividade são efetuadas através de MALLS.

Os sacarídeos são opcionalmente dimensionados em até 1,5,2,4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 ou 20 vezes a partir do tamanho do polissacarídeoisolado a partir de bactérias.

Em uma modalidade, cada sacarídeo N. meningitidis é ou umpolissacarídeo nativo ou é dimensionado e um fator de não mais do que 10 x.Em uma outra modalidade, cada sacarídeo capsular N. meningitidis é umpolissacarídeo nativo. Em uma modalidade adicional, pelo menos um, dois,três ou quatro sacarídeo(s) capsular(es) N. meningitidis é dimensionadoatravés de microfluidização. Em uma outra modalidade, cada sacarídeocapsular é dimensionado em um fator de não mais do que 10 x. Em umaoutra modalidade, os conjugados de N. meningitidis são dimensionados em umfator de não mais do que 10 x. Em uma modalidade adicional, o sacarídeocapsular a partir do sorogrupo Y é dimensionado em um fator de não mais doque 10 x. Em uma modalidade adicional, sacarídeos capsulares a partir dossorogrupos AeC são polissacarídeos nativos e sacarídeos a partir dossorogrupos W135 e Y são dimensionados em um fator de não mais do que 10x. Em uma modalidade adicional, o tamanho médio de cada sacarídeocapsular N. meningitidis está entre 50 kDa e 300 kDa ou de 50 kDa a 200kDa. Em uma outra modalidade, a composição imunogênica compreende umsacarídeo capsular MenA tendo um tamanho médio acima de 50 kDa, 75 kDa,100 kDa ou um tamanho médio de entre 50 - 100 kDa ou 55-90 kDa ou 60-80kDa. Em uma modalidade adicional, a composição imunogênica compreendeum sacarídeo capsular MenC tendo um tamanho médio acima de 50 kDa, 75kDa, 100 kDa ou entre 100- 200 kDa, 100- 150 kDa, 80 -120 kDa, 90- 110kDa, 150- 200 kDa, 120- 240 kDa, 140- 220 kDa, 160 - 200 kDa ou 190- 200kDa. Em uma outra modalidade, a composição imunogênica compreende umsacarídeo capsular MenY tendo um tamanho médio acima de 50 kDa, 75 kDa,100 kDa ou entre 60- 190 kDa ou 70- 180 kDa ou 80- 170 kDa ou 90- 160kDa ou 100-150 kDa, 110- 145 kDa ou 120- 140 kDa. Em uma modalidadeadicional, a composição imunogênica compreende um sacarídeo capsularMenW tendo um tamanho médio acima de 50 kDa, 75 kDa, 100 kDa ou entre60 -190 kDa ou 70- 180 kDa ou 80- 170 kDa ou 90-160 kDa ou 100- 150kDa, 140-180 kDa, 150- 170 kDa ou 110 - 140 kDa.

A composição imunogênica da invenção pode compreenderum sacarídeo capsular H. influenzae b (Hib) conjugado a uma proteínacarreador. Esta pode ser conjugada a uma proteína carreador selecionada apartir do grupo, que consiste de TT, DT, CRM 197, fragmento C de TT eproteína D, por exemplo TT. O sacarídeo Hib pode ser conjugado à mesmaproteína carreador que para pelo menos um, dois, três ou todos os conjugadosde sacarídeo capsulares N. meningitidis, por exemplo TT. A razão de Hib paraa proteína carreador no conjugado de sacarídeo capsular Hib pode estar entre1:5 e 5:1 (p/p), por exemplo entre 1:1 e 1:4, 1:2 e 1:3,5 ou cerca de 1:3 (p/p).

O sacarídeo capsular Hib pode ser conjugado a proteína carreador através deum agente de ligação (vide acima). O agente de ligação pode ser bifuncional(com dois grupos amino reativos, tais que ADH, ou dois grupos de ácidocarboxílico reativos, ou um grupo amino reativo em uma extremidade e umgrupo de ácido carboxílico reativo na outra extremidade). Ele pode ter entre 4e 12 átomos de carbono. O sacarídeo Hib pode ser conjugado à proteínacarreador ou agente de ligação usando CNBr ou CDAP. A proteína carreadorpode ser conjugada ao sacarídeo Hib através do agente de ligação usando ummétodo que compreende química de carbodiimida, opcionalmente química deEDAC (deste modo usando o grupo químico carboxila no carreador). A dosedo conjugado de sacarídeo Hib pode estar entre 0,1 e 9 jxg, 1 e 5 jig ou 2 e 3ug de sacarídeo.

Em uma outra modalidade, a composição imunogênica dainvenção compreende um conjugado de sacarídeo Hib e pelo menos doisconjugados de sacarídeo N. meningitidis, em que o conjugado Hib estápresente em uma dose de sacarídeo mais baixa do que a dose de sacarídeomédia dos pelo menos dois conjugados de sacarídeo N. meningitidis. Emalternativa, o conjugado Hib está presente em uma dose de sacarídeo maisbaixa do que a dose de sacarídeo de cada um dos pelo menos dois conjugadosde sacarídeo N. meningitidis. Por exemplo, a dose do conjugado Hib pode serde pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50 %, 60 %, 70%, ou 80% mais baixado que a média ou do que a dose de sacarídeo mais baixa dos pelo menos doisconjugados de sacarídeo N.meningitidis adicionais.

A dose média é determinada através da adição das doses detodos os outros sacarídeos e pela divisão pelo número de sacarídeosadicionais. Outros sacarídeos são todos os sacarídeos dentro da composiçãoimunogênica, à parte de Hib, e podem incluir sacarídeos capsulares N.meningitidis. A "dose" é a quantidade de composição imunogênica ou vacina,que é administrada a um humano.

Um sacarídeo Hib é o polissacarídeo capsular de fosfato depolirribosila (PRP) do tipo b de Haemophilus influenzae ou umoligossacarídeo derivado a partir do mesmo.

"Pelo menos dois conjugados de sacarídeo bacterianosadicionais" deve ser tomado como significando dois conjugados de sacarídeobacterianos adicionais, em adição a um conjugado Hib. Os dois outrosconjugados bacterianos podem incluir conjugados de sacarídeo capsulares N.meningitidis.

As composições imunogênicas da invenção podemcompreender outros conjugados de sacarídeo derivados a partir de um ou maisde Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Streptococci do GrupoA, Streptococci do Grupo B, S. Typhi, Staphylocoeeus aureus ouStaphyloeoeeus epidermis. Em uma modalidade, a composição imunogênicacompreende saearídeos eapsulares, derivados a partir de um ou mais dossorogrupos A, C, Wl35 eY de Neisseria meningitidis. Uma outra modalidadecompreende saearídeos eapsulares derivados a partir de Streptococcuspneumoniae. Os antígenos do sacarídeo capsular pneumocócico capsular sãoselecionados, de modo opcional, a partir dos sorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B,7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F 333F (opcionalmente a partir dos sorotipos 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19 F3 23 F). Uma modalidade adicional compreende os saearídeos eapsulares doTipo 5, Tipo 8 ou 336 de Staphyloeoeeus aureus. Uma outra modalidadecompreende os saearídeos eapsulares do Tipo I, Tipo II ou Tipo III deStaphyloeoeeus epidermis. Uma modalidade adicional compreende osacarídeo Vi de S. typhi. Uma outra modalidade compreende os saearídeoseapsulares do Tipo Ia, Tipo Ic, Tipo II, Tipo III ou Tipo V de Streptoeoeeusdo Grupo B. Uma modalidade adicional compreende os saearídeos eapsularesde Streptoeoeeus do Grupo A, opcionalmente compreendendo pelo menosuma proteína M e de modo mais opcional múltiplos tipos de proteína M.

As composições imunogênicas da invenção podem tambémcompreender uma vacina de DTPa ou DTPw (por exemplo uma contendo DT,TT e ou uma vacina pertussis de célula inteira (Pw) ou uma vacina pertussisacelular (Pa) (que compreende, por exemplo, pertussis toxóide, FHA,pertactina, e, de modo opcional aglutinoginas 2 e 3). Tais combinações podemtambém compreender uma vacina contra hepatite BN (por exemplo, ela podecompreender um antígeno superficial de hepatite B [HepB], opcionalmenteadsorvido sobre fosfato de alumínio). Em uma modalidade, a composiçãoimunogênica da invenção compreende uma vacina deDTPwHepBHibMenAC, em que o compoennte MenAC é aqui descrito.

Em uma modalidade, a composição imunogênica da invençãocompreende ainda um antígeno do sorogrupo B de N. meningitidis. Oantígeno é, de modo opcional, um polissacarídeo capsular do sorogrupo deN. meningitidis B (MenB)(ou um polissacarídeo ou oligossacarídeodimensionado derivado a partir do mesmo, que pode ser conjugado a umaproteína carreador. O antígeno é, de modo opcional, uma preparação devesícula de membrana externa a partir do sorogrupo de N. meningitidisconforme descrito na EP 301992, WO 01/09350, WO 04/14417, WO04/14418 e WO 04/14419.

De modo geral, a composição imunogênica da invenção podecompreender uma dose de cada conjugado de sacarídeo entre 2 e 20 (ig, 3 e10 (ig ou 4 e 7 |ig de sacarídeo.

Em uma modalidade, a composição imunogênica da invençãocontém, cada qual, o sacarídeo capsular N. meningitidis em uma dose de entre0,1 - 20 |ig; 1-10 |ig, 2-10 ng, 2,5- 5 jig, em torno exatamente de 5 fxg; ou emtorno exatamente de 2,5 |ig.

Em uma modalidade, a composição imunogênica da invençãocontém, por exemplo, o conjugado de sacarídeo Hib em uma dose desacarídeo de entre 0,1 e 9 |ig; de 1 e 5 jig ou de 2 e 3 |ig ou em tornoexatamente de 2,5 |ig. Em uma modalidade adicional, a composiçãoimunogênica da invenção, por exemplo, contém o conjugado de sacarídeo Hibem uma dose de sacarídeo de entre 0,1 e 9 ng ou 2 e 3 (ig ou em torno de ouexatamente de 2,5 jxg e cada um dos conjugados de polissacarídeo N.meningitidis em uma dose de sacarídeo de entre 2 e 20 (ig, 3 e 10 (ig, ou entre4 e 7 |ig ou em torno de ou exatamente de 5 |ig.

"Em torno de " ou "aproximadamente " são definidos comodentro de 10% mais ou menos do valor para os propósitos da invenção.

Em uma modalidade, a composição imunogênica da invençãopode conter uma dose de sacarídeo do conjugado de sacarídeo Hib, que é, porexemplo, inferior a 90%, 80 %, 75%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30 %, 20 % ou10% da dose de sacarídeo média em pelo menos dois, três, quatro ou cada umdos conjugados de sacarídeo N. meningitidis. A dose de sacarídeo dosacarídeo Hib está, por exemplo, entre 20% e 60 %, 30% e 60%, 40% e 60%ou em torno de ou exatamente 50% da dose de sacarídeo média de pelo menosdois, três, quatro ou cada um dos conjugados de sacarídeo N. meningitidis.

Em uma modalidade, a composição imunogênica da invençãocontém uma dose de sacarídeo do conjugado de sacarídeo Hib, que é, porexemplo, inferior a 90%, 80%, 75%, 70%, 60 %, 50 %, 40 %, 30%, 20% ou10% da dose de sacarídeo mais baixa dos pelo menos dois, três, quatro ou decada um dos conjugados de sacarídeo N. meningitidis. A dose de sacarídeo dosacarídeo Hib está, por exemplo, entre 20% e 60%, 30% e 60%, 40% e 60%ou em torno de ou exatamente de 50% da dose de sacarídeo mais baixa dospelo menos dois três, quatro ou cada um dos conjugados de sacarídeo N.meningitidis.

Em uma modalidade da invenção, a dose de sacarídeo de cadaum dos pelo menos dois, três, quatro ou de cada um dos conjugados desacarídeo N. meningitidis é opcionalmente a mesma, ou aproximadamente amesma.

Exemplos de composições imunogênicas da invenção sãocomposições que consistem de ou que compreendem:

Conjugado Hib e conjugado MenA e conjugado MenC, demodo opcional em razões de dose de sacarídeo de 1:2:2, 1:2:1, 1:4:2, 1:6:3,1:3:3, 1:4:4, 1:5:5, 1:6:6 (p/p). De modo opcional, a dose de sacarídeo deMenA é maior do que a dose de sacarídeo de MenC.

Conjugado Hib e conjugado MenC e conjugado MenY, demodo opcional em razões de dose de sacarídeo de 1:2:2, 1:2:1, 1:4:2, 1:4:1,1:8:4, 1:6:3, 1:3:3, 1:4:4, 1:5:5, 1:6:6 (p/p). De modo opcional, a dose desacarídeo de MenC é maior do que a dose de sacarídeo de MenY.

Conjugado Hib e conjugado MenC e conjugado MenW, demodo opcional em razões de dose de sacarídeo de 1:2:2, 1:2:1, 1:4:2, 1:4:1,1:8:4, 1:6:3, 1:3:1, 1:4:4, 1:5:5, 1:6:6 (p/p). De modo opcional, a dose desacarídeo de MenC é maior do que a dose de sacarídeo de MenW.

Conjugado Hib e conjugado MenA e conjugado MenW, demodo opcional em razões de dose de sacarídeo de 1:2:2, 1:2:1, 1:4:2, 1:4:1,1:8:4, 1:6:3, 1:3:3, 1:4:4, 1:5:5, 1:6:6 (p/p). De modo opcional, a dose desacarídeo de MenA é maior do que a dose de sacarídeo de MenW.

Conjugado Hib e conjugado MenA e conjugado MenY, demodo opcional em razões de dose de sacarídeo de 1:2:2, 1:2:1, 1:4:2, 1:4:1,1:8:4, 1:6:3, 1:3:3, 1:4:4, 1:5:5, 1:6:6 (p/p). De modo opcional, a dose desacarídeo de MenA é maior do que a dose de sacarídeo de MenY.

Conjugado Hib e conjugado MenW e conjugado MenY, demodo opcional em razões de dose de sacarídeo de 1:2:1, 1:2:1, 1:1:2, 1:4:2,1:2:4, 1:4:1, 1:1:4, 1:3:6, 1:1:3, 1:6:3, 1:3:3, 1; 4:4, 1:5:5, 1:6:6 (p/p). Demodo opcional, a dose de sacarídeo de MenY é maior do que a dose desacarídeo de MenW.

MenA, MenC5 MenW e MenY em razões de dose de sacarídeode 1:1:1:1 ou 1:2:1:1 ou 2:1:1:1 ou 2:2:1:1 ou 1:3:1:1 ou 1:4:1:1 (p/p).

Um aspecto adicional da invenção consiste em uma vacina,que compreende a composição imunogênica da invenção e um excipientefarmaceuticamente aceitável.

Em uma modalidade, a composição imunogênica da invençãoé tamponada em, ou ajustada a um pH de entre 7,0 e 8,0, a um pH de 7,2 e 7,6ou em torno ou exatamente em um pH de 7,4.

A composição imunogênica ou as vacinas da invenção sãoopcionalmente liofilizadas na presença de um agente de estabilização, porexemplo um poliol, tal que sacarose ou trealose.

De modo opcional, a composição imunogênica ou vacina dainvenção contém uma quantidade de um adjuvante suficiente para aumentar aresposta imune ao imunógeno. Adjuvantes adequados incluem, mas não estãolimitados a, sais de alumínio (fosfato de alumínio ou hidróxido de alumínio),misturas de esqualeno (SAF-1), peptídeo de muramila, derivados de saponina,preparações de parede celular de micobactéria, lipídeo de monofosforila A,derivados do ácido micótico, tensoativos de copolímero em bloco não iônicos,Quil A, subunidade de toxina B de cólera, polifosfazeno e derivados, ecomplexos imunoestimulantes (ISCOMs), tais que aqueles descritos porTakahashi et al. (1990) Nature 344:873- 875.

Para as combinações de N. meningitidis ou Hibmen acimadiscutidas, pode ser vantajoso não usar qualquer adjuvante de sal de alumínioou nenhum adjuvante.

Como no caso com todas as composições imunogênicas ouvacinas, as quantidades imunologicamente efetivas dos imunógenos precisamser determinadas empiricamente. Os fatores a serem considerados incluem aimunogenicidade, se o imunógeno será ou não complexado com ou ligado aum adjuvante ou proteína carreador ou outro carreador, a via de administraçãoe o número de dosagens de imunização a serem administradas.

O agente ativo pode esta presente em concentrações variáveisna composição farmacêutica ou vacina da invenção. De modo típico, aconcentração mínima da substância é uma quantidade necessária para que sejaalcançado o seu uso objetivado, enquanto que a concentração máxima é aquantidade máxima que irá permanecer em soluções ou homogeneamentesuspensa dentro da mistura inicial. Por exemplo, a quantidade mínima de umagente terapêutico é, de modo opcional, aquela que irá prover uma únicadosagem terapeuticamente efetiva. Para substâncias bioativas, a concentraçãomínima é a quantidade necessária para a bioatividade mediante areconstituição e a concentração máxima é naquele ponto, em que umasuspensão homogênea não pode ser mantida. No caso de unidades de doseúnica, a quantidade é aquela de uma aplicação terapêutica única. De modogeral, é esperado que cada dose irá compreender de 1-100 jig de antígeno deproteína, de modo opcional de 5- 50 }j.g ou 5- 25 jig. Exemplos de doses desacarídeos bacterianos são de 10-20 |ig, 5-10 pig, 2,5- 5 jig ou 1- 2,5 |ag desacarídeo no conjugado.

As preparações de vacina da presente invenção podem serusadas para proteger ou tratar um mamífero (por exemplo um pacientehumano) suscetível à infecção, através da administração da referida vacinapor via sistêmica ou através da mucosa. Um paciente humano é, de modoopcional, um infante (menor do que 12 meses), uma criança pequena (12-24,12-16 ou 12- 14 meses), uma criança (2-12, 3- 8 ou 3-5 anos), um adolescente(12-20, 14-20, ou 15-19 anos) ou um adulto. Estas administrações podemincluir a injeção através da via intramuscular, intraperitonial, intradérmica ousubcutâneas; ou a administração através da mucosa aos tratos oral/alimentar,respiratório, ou genitourinário. A administração intranasal de vacinas para otratamento de pneumonia ou otite média é preferida (pois o transportenasofaríngeo de pneumococos pode ser mais efetivamente evitado, destemodo atenuando a infecção em seu estágio mais precoce). Embora a vacinada invenção possa ser administrada como uma dose única, os componentes damesma podem ser também administrados de um modo conjunto, ao mesmotempo ou em um períodos de tempo diferentes (por exemplo, se os sacarídeosestiverem presentes em uma vacina, estes podem ser administradosseparadamente ao mesmo tempo ou 1-2 semanas após a administração de umavacina proteína bacteriana para a coordenação ótima da resposta imune, umaem relação à outra). Em adição a uma única via de administração, 2 vias deadministração diferentes podem ser usadas. Por exemplo, antígenos viraispodem ser administrados ID (por via intradérmica), enquanto que as proteínasbacterianas pode ser administradas IM (por via intramuscular) ou IN (por viaintranasal). Se os sacarídeos estiverem presentes, eles podem seradministrados IM (ou ID e as proteínas bacterianas podem ser administradasIN (ou ID). Em adição, as vacinas da invenção podem ser administradas IMpara doses de base e In para doses de reforço.

A preparação da vacina é descrita, de modo genérico, emVaccine Design (" The subunit and adjuvant approach" (Eds. Powell M. F. &Newman M. J.) (1995) Plenum Press, Nova Iorque). A encapsulação comlipossomas é descrita por Fullerton, Patente US 4.235.877.

Um outro aspecto da invenção consiste em um kit de vacinapara a administração concomitante ou seqüencial, compreendendo duascomposições imunogênicas multivalentes para conferir proteção a umhospedeiro contra doença causada por Bordetella pertussis, Clostridiumtetani, Corynebacterium diphteriae e Neisseria meningitidis e, de modoopcional, Haemophilus influenzae. Por exemplo, o kit compreende, de modoopcional, um primeiro recipiente, que compreende um ou mais de:Toxóide do tétano (TT),

Toxóide de difteria (DT), e componentes de peturssis de célulainteira ou acelular;

e um segundo recipiente, que compreende:uma composição imunogênica da invenção como acimadescrita (por exemplo aquela que compreende combinações de conjugado desacarídeo Men ou Hibmen).

Um outro aspecto da invenção consiste em um kit de vacinapara a administração concomitante ou seqüencial, que compreendecomposições imunogênicas mutivalentes para conferir proteção a umhospedeiro contra doença causada por Streptococcus pneumoniae e Neisseriamengingitidis e opcionalmente Haemophilus influenzae. Por exemplo, o kitcompreende, de modo opcional, um primeiro recipiente compreendendo:

um ou mais conjugados de proteína carreador e um sacarídeocapsular de Streptococcus pneumoniae (em que o sacarídeo capsular éopcionalmente de um sorotipo selecionado a partir do grupo, que consiste de1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9 N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A,19F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23 F, e 33 F].

e um segundo recipiente, que compreende:uma composição imunogênica da invenção como acimadescrito (por exemplo, aquelas compreendendo combinações do conjugado desacarídeo Men ou Hibmen).

Exemplos do conjugado Hib e dos conjugados depolissacarídeo N. meningitidis são como acima descritos.

De modo típico, a vacina de Streptococcus pneumoniae no kitde vacina da presente invenção (ou em qualquer das composiçõesimunogênicas da invenção acima descritas) irá compreender antígenos desacarídeo (opcionalmente conjugados), em que os sacarídeos são derivados apartir de pelo menos quatro sorotipos de pneumococcus selecionados a partirdo grupo, que consiste de 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 1 IA, 12F,14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F e 33 F. De modo opcional, osquatro sorotipos incluem 6B, 14, 19F e 23F. De modo mais opcional, pelomenos 7 sorotipos são incluídos na composição, por exemplo aquelesderivados a partir dos sorotipos 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, e 23F. De modoopcional, mais do que 7 sorotipos são incluídos na composição, por exemplopelo menos 10, 11, 12, 13 ou 14 sorotipos. Por exemplo, a composição inclui,em uma modalidade, 10 ou 11 sacarídeos capsulares derivados a partir dossorotipos 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18 C, 19F e 23 F, e de modo opcional 3(todos opcionalmente conjugados). Em uma modalidade da invenção, pelomenos 13 antígenos de sacarídeo (opcionalmente conjugados) são incluídos,embora outros antígenos de sacarídeo, por exemplo 23 valentes (tais que ossorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6B,7F, 8, 9 N, 9V, 10 A, 11 A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23 F e 33 F) são também contemplados pela invenção.

Os sacarídeos pneumocócicos são independentementeconjugados a qualquer proteína carreador conhecida, por exemplo CRM 197,toxóide do tétano, toxóide de difteria, proteína D ou outras proteínascarreador, tais como acima mencionado.

De modo opcional, os kits de vacina da invençãocompreendem um terceiro componente. Por exemplo, o kit compreende, demodo opcional, um primeiro recipiente, que compreende um ou mais de:

toxóide do tétano (TT),

toxóide de difteria (DT), e

componentes de pertussis de célula inteira ou acelulares;e um segundo recipiente, que compreende:um ou mais conjugados de uma proteína carreador e de umsacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae [em que o sacarídeocapsular é opcionalmente de um sorotipo penumocócico selecionado a partirdo grupo, que consiste de 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 1 IA, 12F,14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19 F, 20, 22 F, 23F e 33 F].e um terceiro recipiente, que compreende:

uma composição imunogênica da invenção como acimadescrito (por exemplo, aquelas que compreendem combinações de conjugadode sacarídeo Men ou Hibmen).

Um outro aspecto da invenção consiste em um processo para aprodução da composição imunogênica ou vacina da invenção, quecompreende o estágio de misturar os sacarídeos da invenção, por exemploatravés da mistura de sacarídeos capsulares N. meningitidis a partir de pelomenos um, dois, três ou todos os quatro sorogrupos A, C, W e Y, conjugadosa uma proteína carreador com um excipiente farmaceuticamente aceitável.

Um outro aspecto da invenção consiste em um método deimunização de um hospedeiro humano contra doença causada por N.meningitidis e opcionalmente infecção de Haemophilus influenzae, quecompreende administrar ao hospedeiro uma dose imunoprotetora dacomposição imunogênica ou vacina ou kit da invenção, de modo opcionalusando uma dose única.

Um aspecto independente da invenção consiste em um métodode imunização de um hospedeiro humano com uma composição imunogênica,que compreende pelo menos 2 conjugados de sacarídeo capsulares de N.meningitidis diferentes, selecionados a partir de um grupo, que consiste dosorogrupo A, C, W e Y (de modo opcional MenA, C, W e Y), em que umaadministração de dose única (opcionalmente a adolescentes, adultos oucrianças) resulta em um teste sangüíneo tomado um mês após a administraçãofornecendo acima de 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% de respostas em umensaio de SBA, que mede os níveis de resposta contra MenA, MenC, MenWe/ou MenY. De modo opcional, o ensaio de SBA é como descrito noExemplo 9, com a resposta sendo determinada conforme descrito no Exemplo 9.

Um outro aspecto independente da invenção consiste em umacomposição imunogênica, que compreende os conjugados MenA, MenC,MenW e/ou MenY, que é capaz de provocar uma resposta imune após umaúnica dose, de tal modo que acima de 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% depacientes humanos (crianças, adolescentes ou adultos) inoculados, sejaclassificados como produzindo resposta em um ensaio de SBA em sangueextraído um mês após a inoculação (opcionalmente usando os critériosdescritos no Exemplo 9).

Uma tal composição imunogênica possui, de modo opcional,as características estruturais adicionais aqui descritas.

Um outro aspecto da invenção refere-se a uma composiçãoimunogênica da invenção para o uso no tratamento ou prevenção de umadoença causada por N.meningitidis e opcionalmente infecção de Haemophilusinfluenzae.

Um outro aspecto da invenção consiste no uso da composiçãoimunogênica ou vacina ou kit da invenção na manufatura de um medicamentopara o tratamento ou a prevenção de doenças causadas por N. meningitidis e,de modo opcional, infecção por Haemophilus influenzae.

Os termos " compreendendo", " compreendem" e "compreende", neste caso, são objetivados pelos inventores como sendoopcionalmente substituíveis pelos termos "consistindo de ", "consistem de" e"consiste de", respectivamente, em cada caso.

Todas as referências ou pedidos de patente citados nesterelatório de patente são incorporados a este, a título referencial.

A invenção é ilustrada nos exemplos anexos. Os exemplosabaixo são executados usando técnicas convencionais, que são bemconhecidas e rotineiras para aqueles versados na arte, exceto quando descritosde outro modo em detalhe. Os exemplos são ilustrativos, mas não limitam ainvenção.

Exemplos

Exemplo 1 - Preparação de conjugados de polissacarídeo

A ligação covalente do polissacarídeo PRP de Haemophilusinfluenzae (Hib) a TT foi executada através de uma química de acoplamentodesenvolvida por Chu et al. (Infection and Immunity 1983, 40 (1); 245-256).O polissacarídeo PRP de Hib foi ativado através da adição de CNBr eincubação em pH de 10,5 durante 6 minutos. O pH foi reduzido para o pH de8,75 e diidrazida de ácido adípico (ADH) foi adicionado e a incubaçãocontinuou durante um período adicional de 90 minutos. O PRP ativado foiacoplado ao toxóide de tétano purificado através de condensação decarbodiimida usando l-etil-3-(3-dimetil-aminopropil) carbodiimida (EDAC).EDAC foi adicionado ao PRP ativado de modo a alcançar uma razão final de0, 6 mg de EDAC/mg de PRP ativado. O pH foi ajustado para 5,0 e o toxóidede tétano purificado foi adicionado de modo a que fossem alcançados 2 mg deTT/mg de PRP ativado. A solução resultante foi deixada durante três diascom agitação branda. Após a filtração através de uma membrana de 0, 45μm, ο conjugado foi purificado em uma coluna Sephacryl S 500 HR(Pharmacia, Suécia), equilibrada em NaCl 0, 2 M.

Foram produzidos conjugados de MenC - TT usandopolissacarídeos nativos (acima de 150 kDa, conforme medido por MALLS)ou foram ligeiramente microfluidizados. Os conjugados de MenA- TT foramproduzidos usando ou polissacarídeo nativo ou polissacarídeo ligeiramentemicrofluidizado de mais do que 60 kDa, conforme medido pelo métodos deMALLS do Exemplo 2. Foram produzidos conjugados de MenW e MenY_TTusando polissacarídeos dimensionados de em torno de 100- 200 kDAA,conforme medido por MALLS (vide Exemplo 2). O dimensionamento foiefetuado através de microfluidização, usando um aparelho homogeneizadorEmulsiflex C-50. Os polissaacarídeos foram então filtrados através de umfiltro de 0,2 μπι.

A ativação e o acoplamento foram efetuados conformedescrito na WO 96/29094 e na WO 00/56260. Em resumo, o polissacarídeoem uma concentração de 10-20 mg/ml em NaCl 2 M, pH de 5,5- 6,0 foimisturado com solução de CDAP (100 mg/ml, recém preparada emacetonitrila/WFI, 50/50) em uma razão final de CDAP/polissacarídeo de0,75/1 a 1,5/1. Após 1,5 minutos, o pH foi elevado com hidróxido de sódiopara o pH de 10,0. Após três minutos, o toxóide de tétano foi adicionado, demodo a que fosse alcançada uma razão de proteína/polisssacarídeo de 1,5/1para MenW, 1,2/1 parta MenY, 1,5/1 para MenA ou 1, 5/1 para MenC. Areação foi continuada durante uma a duas horas.

Após o estágio de acoplamento, glicina foi adicionada em umarazão final de glicina/PS (p/p) de 7,5/1 eopH foi ajustado para o pH de 9,0.A mistura foi deixada durante 30 minutos. O conjugado foi clarificado usandoum filtro Kleenpak de 10 μιη e foi então carregado sobre uma colunaSephacryl S400 HR usando um tampão de eluição de NaCl 150 mM, Tris 10mM ou 5 mM, pH 7, 5. Os lotes clínicos foram filtrados em uma membranade esterilização Opticap 4. Os conjugados resultantes apresentaram uma razãode polissacarídeo:proteína média de 1:1- 1:5 (p/p).

Exemplo 1a - Preparação de conjugados de polissacarídeoMenA e MenC da invenção

Os conjugados MenC - TT foram produzidos usandopolissacarídeos nativos (de mais do que 150 kDa, conforme medido porMALLS) ou foram ligeiramente microfluidizados. Os conjugados de MenA-TT foram produzidos usando ou polissacarídeo nativo ou polissacarídeoligeiramente microfluidizado de mais do que 60 kDA, conforme medido pelométodo de MALLS do Exemplo 2. O dimensionamento foi efetuado atravésde microfluidização usando um aparelho homogeneizador Emulsiflex C-50.Os polissacarídeos foram então filtrados através de um filtro de 0,2 μηι.

De modo a conjugar o polissacarídeo capsular MenA aotoxóide do tétano através de um espaçador, foi usado o método que se segue.A ligação covalente do polissacarídeo e do espaçador (ADH) é executadaatravés de química de acoplamento, através da qual o polissacarídeo éativado, sob condições controladas, através de um agente de cianalação,tetrafluoroborato de l-ciano-4-dimetilamino-piridínio (CDAP). O espaçadorreage com o PS cianilado através de seus grupos hidrazino, de modo a formaruma ligação isouréia estável entre o espaçador e o polissacarídeo.

Uma solução de 10 mg/ml de MenA (pH 6,0) [3,5 g] foitratada com uma solução recém preparada de 100 mg/ml de CDAP eacetonitrila/água (50/50 (v/v) de modo a obter uma razão de CDAP/MenA de0,75 (p/p). Após 1,5 minutos, o pH foi elevado para o pH de 10,0. Trêsminutos após, o ADH foi adicionado de modo a obter uma razão deADH/MenA de 8,9. O pH da solução foi diminuído para 8,75 e a reaçãoprosseguiu durante 2 horas mantendo este pH(com a temperatura mantida a25°C).

A solução de PSAAH foi concentrada a um quarto de seuvolume inicial e então diafiltrada com 30 volumes de NaCl 0,2 M usando umamembrana Filtron Omega com um corte de 10 kDa, e o produto retido foifiltrado.

Antes da reação de conjugação (condensação decarbodiimida), a solução de TT purificada e a solução de PSAAH foramdiluídas, de modo a que fosse alcançada uma concentração de 10 mg/ml paraPSAAH e 10 mg/ml para TT.

EDAC (1- etil-3-(3-diemtil-aminopropil) carbodiimida) foiadicionado à solução de PSAH (2 g de sacarídeo) de modo a alcançar umarazão final de 0,9 mg de EDAC/mg de PSAAH. O pH foi ajustado para 5,0.

O toxóide de tétano purificado foi adicionado com uma bomba peristáltica(em 60 minutos) de modo a alcançar 2 mg de TT/mg de PSAAH. A soluçãoresultante foi deixada 60 minutos em + 25°C, sob agitação, de modo a quefosse obtido um tempo de acoplamento final de 120 minutos. A solução foineutralizada através da adição de Tris-HCl 1 M, pH 7, 5 (1/10 do volumefinal) e deixada 30 minutos a + 25°C, e então durante a noite a de + 2°C a +_8 0C.

O conjugado foi clarificado usando um filtro de 10 μηι e foipurificado usando uma coluna Sephacryl S 400 HR (Pharmacia, Suécia). Acoluna foi equilibrada em Tris-HCl 10 mM (pH 7,0) NaCl 0,075 Meoconjugado (aprox. 660 ml) foi carregado sobre a coluna (+ 2°C a + 8°C). Oreservatório de eluição foi selecionado como uma função da densidade ópticaa 280 nm. A coleta foi iniciada quando a absorção foi aumentada para 0,05. Acoleta foi continuada até que o Kd alcançasse 0,30. O conjugado foiesterilizado por meio de filtro a + 20°C, e então armazenado a + 2°C a + 8°C.

O conjugado resultante apresentou uma razão de polissacarídeo:proteína de1:2-1:4 (p/p).

De modo a conjugar o polissacarídeo capsular MenC aotoxóide de tétano através de um espaçador, foi usado o método que se segue.A ligação covalente do polissacarídeo e do espaçador (ADH) é executadaatravés de uma química de acoplamento, através da qual o polissacarídeo éativado sob condições controlada por um agente de cianilação,tetrafluoroborato de l-ciano-4-dimetilamino-piridínio (CDAP). O espaçadorreage com o PS cianilado através de seus grupos hidrazino, de modo a formaruma ligação isouréia estável entre o espaçador e o polissacarídeo.

Uma solução de 20 mg/ml de MenC (pH 6,0) (3, 5 g) foitratada com uma solução recém preparada de 100 mg/ml de CDAP emacetonitrila/água (50/50 (v/v) de modo a obter uma razão de CDAP/MenC de1,5 (p/p). Após 1,5 minutos, o pH foi elevado para o pH de 10,0. Na ativaçãodo pH, NaCl 5 M foi adicionado, de modo a que fosse alcançada umaconcentração final de NaCl 2 M. Três minutos após, ADH foi adicionado, demodo a que fosse obtida uma razão de ADH/MenC de 8,9. O pH da soluçãofoi diminuído para 8,75 e a reação prosseguiu durante 2 horas (retida a 25°C).

A solução de PSCAH foi concentrada a um mínimo de 150 mle então diafiltrada com 30 volumes de NaCl 0,23 M usando uma membranaFiltron Omega com um corte de 10 kDa, e o produto retido foi filtrado.

Antes da reação de conjugação, a solução de TT purificada e asolução de PSCAH (escala de 2 g) foram diluídas em NaCl 0,2 M, de modo aalcançar uma concentração de 15 mg/ml para PSCAH e de 20 mg/ml para TT.

O toxóide de tétano purificado foi adicionado à solução dePSCAH, de modo a alcançar 2 mg de TT/mg de PSCAH. O pH foi ajustadopara 5,0. EDAC (16,7 mg/ml em Tris 0,1 M, pH 7,5) foi adicionado com umabomba peristáltica (em 10 minutos), e modo a que fosse alcançada uma razãofinal de 0,5 mg de EDAC/mg de PSCAH. A solução resultante foi deixadadurante 110 minutos a + 25°C, sob agitação e regulação de pH, de modo a quefosse obtido um tempo de acoplamento final de 120 minutos. A solução foientão neutralizada através da adição de Tris-HCl 1 M, pH 9,0 (1/10 dovolume final) e deixada durante 30 minutos a + 25°C e então durante a noite ade + 2°C a + 8o C.

O conjugado foi clarificado usando um filtro de 10 μηι e foipurificado usando uma coluna Sephacryl S 400 HR (Pharmacia, Suécia). Acoluna foi equilibrada em Tris-HCl 10 mM (pH 7, 0), NaCl 0,075 Meoconjugado (aproximadamente 460 ml) foi carregado sobre a coluna (+ 2°C a +8°C). O reservatório de eluição foi selecionado como uma função dadensidade óptica a 280 nm. A coleta foi iniciada quando a absorçãoaumentou para 0,05. A coleta continuou até que o Kd alcançasse 0, 20. Oconjugado foi esterilizado através de filtro a + 20°C, e então armazenado a +2°C a + 8°C. O conjugado resultante tinha uma razão depolissacarídeo:proteína de 1:2 - 1:4 (p/p).

Exemplo 2- Determinação do peso molecular usando MALLS

Os detectores foram acoplados a uma coluna de exclusão detamanho de HPLC, a partir da qual as amostras foram eluídas. Por um lado, odetector de dispersão luminosa a laser mediu as intensidades luminosasdispersadas em 16 ângulos pela solução macromolecular e, por outro lado, umrefractômetro interferométrico, colocado em linha, permitiu a determinaçãoda quantidade de amostra eluída. A partir destas intensidades, o tamanho e aforma das macromoléculas em solução podem ser determinados.

O peso molecular médio em peso (Mw) é definido como asoma dos pesos de todas as espécies, multiplicado pelo seu respectivo pesomolecular e dividido pela soma dos pesos de todas as espécies.

a) peso molecular médio em peso:Mw

<formula>formula see original document page 48</formula>

b) peso molecular médio numérico :Mn

<formula>formula see original document page 48</formula>

c) Raio quadrado médio da raiz:-Rw- e R2W é o raio quadradodefinido por:

<formula>formula see original document page 49</formula>

(- m1- é a massa de um centro de dispersão i e -rr é a distânciaentre o

centro de dispersão i e o centro de gravidade damacromolécula).

d) A polidispersividade é definida como a razão -Mw/Mn

Polissacarídeos meningocócicos foram analisados através deMALLS através de carregamento sobre duas colunas de HPLC (TSKG 6000 e5000 PWxl), usadas em combinação. 25 μΐ do polissacarídeo foramcarregados sobre a coluna e foram eluídos com 0,75 ml de água filtrada. Ospolissacarídeos foram detectados usando um detector de dispersão luminosa(Wyatt Dawn DSP equipado com laser de argônio de 10 mW a 488 nm) e umrefratômetro inferométrico (Wyatt Otilab DSP, equipado com uma célula P100 e um filtro vermelho a 498 nm).

As polidispersividades do peso molecular e as recuperações detodas as amostras foram calculados pelo método de Debye usando uma ordemde ajuste polinomial de 1 no software Astra 4.72.

Exemplo 3 - Ensaio clínico comparando a imunização comMeningitec ou um conjugado deMenC- TT de dimensionado em tamanhomaior.

Um estudo controlado, aberto, de fase II foi executado demodo a comparar a vacina de conjugado do sorogrupo C meningocócico(MenC) de GSK Biologicals com a vacina de conjugado do sorogrupo Cmeningocócico de Haemophilus inflenzae b (Hib- MenC) ou Meningitec® deGSK Biologicals. Cada dose de Meningitec® contém 10 μg deoligossacarídeo do sorogrupo C meningocócico conjugado com 15 μg deCRM 197 e é produzido por Wyeth. Os conjugados de MenC de GSKcontinham polissacarídeos nativos de cerca de 200 kDa, conjugados aotoxóide do tétano (TT).

O estudo consistiu de cinco grupos, cada qual planejado paraconter 100 pacientes, alocados em dois braços paralelos, como se segue:

Neste presente estudo, todos os pacientes receberam, emambos os braços, um quinto (1/5) de uma dose de Mencevax® CWY e umadose concomitante de Infanrix™ hexa em 12- 15 meses de idade (mês doestudo 0). As duas amostras de sangue foram coletadas a partir de todos ospacientes (mês do Estudo 0 e Mês do Estudo 1). O braço 1 consistiu de quatrogrupos a partir de um estudo de vacinação primário, os quais haviamrecebido, em sua idade de 3, 4 e 5 meses, as seguintes vacinas:

• Grupo K:MenC (10 μg), não adsorvidos em sais de alumínio(não- ads), conjugado de toxóide de tétano (TT) e Infanrix™ hexa (MenC 10-TT + Infanrix™ hexa);

· Grupo L:Hib (10 μg)-MenC(10 μg), conjugado de TT não-ads e Infanrix™ penta

(HiblO -MenClO-TT + Infanrix™penta)

• Grupo M:Hib (5 μg) - MenC (5 μg), não- ads, conjugado deTT e Infanrix™ penta

(Hib5- Men5 - TT + Infanrix™ penta)

• Grupo N:Meningitec™ e Infanrix™ hexa (Menigitec™ +Infanrix™ hexa)

Os dois grupos de vacina Hib-MenC- TT (grupos L e M)foram mantidos cegos no estudo de reforço, em relação à formulação exata davacina candidata.

O braço 2- (Grupo O) consistiu de pacientes conjugados poridade, que não haviam sido previamente vacinados com uma vacina do sorogrupoC meningocócico (simples), mas que haviam recebido vacinas pediátricas derotina de acordo com a German Permanent Commision on Immunization.Critérios para a avaliação:

Imunogenicidade:Oetenmnação de titulações de anticorpobactericidas contra (SBA- MenC) meningocócico C através de um testebactericida (corte:uma diluição de 1:8) e medição por ELISA de anticorposcontra o sorogrupo meningocócico (corte do ensaio:0,3 μg/ml), opolissacarídeo Hib PRP (corte do ensaio:0, 15 μg/ml) e o toxóide de tétano(corte do ensaio:0,1 IU/ml) nas amostras de sangue obtidas antes da vacinaçãoe aproximadamente um mês após a vacinação em todos os pacientes.

Métodos Estatísticos:

Demografia:Determmâção da idade média em meses (comdesvio médio, faixa e padrão [ SD] e composição racial e de gênero do ATP ecoortes vacinadas totais.

Imunogenicidade:

Duas análises de imunogenicidade foram executadas com basena coorte de ATP quanto à imunogenicidade (para análises de memória imunee resposta de reforço) na coorte de ATP quanto à segurança (para a análise depersistência). Estas incluíram:

Avaliação da memória imune para MenC e resposta doreforço para Hib e Tétano:

(antes e um mês após a administração de 1/5 da dose da vacinade polissacarídeo simples):

• Determinação das titulações e concentrações médiasgeométricas (GMTs e GMCs) com 95% de intervalos de segurança (95% deCl);

• Determinação do percentual de pacientes comtitulação/concentração de anticorpo acima dos cortes propostos com exatos95% de Cl (taxas de soropositividade/soroproteção);

• Investigação de titulações/concentração de anticorpo após avacinação usando curvas cumulativas reversas;

• Computação de 95% de Cl assintótico padronizado quanto àdiferença na taxa de soropositividade/soroproteção;

• entre o grupo que recebeu imunização prévia (Grupos K, LM e N) e o grupo não recebeu imunização (Grupo O);

• Determinação da média geométrica da razão individual detitulação de SBA- MenC em relação à concentração anti-PSC, com 95% Cl;

• Determinação de 95% de Cl para a razão de pós-vacinaçãoGMT/C entre os grupos K, L e M e o grupo de controle N para anti- PRP eantitétano e entre cada grupo imunizado (Grupos K, L, M e N) e o grupo não-imunizado (Grupo O) para SBA- MenC e anti-PSC usando um modelo ANOVA;

Resultados:

Tabela 1, titulações de SBA-MenC e concentração deanticorpo anti-PSC após vacinação com reforço <table>table see original document page 56</column></row><table>

Grupo K:pacientes imunizados com MenClO- TT + Infanrix.hexa; Grupo L:pacientes imunizados com Hib-IO-MenC - TT + Infanrix.Penta; Grupo M:pacientes imunizados com Hib5-MenC5- TT + Infanrix.penta; Grupo N:pacientes imunizados com Menigitec + Infanrix. hexa; GrupoO:pacientes de controle (isto é, pacientes não-imunizados com vacina deconjugado de MenC)

N:número de pacientes com resultados disponíveisTitulações mais altas de anticorpos contra MenC e titulações deSBA mais altas foram alcançadas através da imunização com as vacinas deconjugado de polissacarídeo MenC dimensionadas em tamanho maior (grupos K,LeM) comparadas com a vacina de conjugado de oligossacarídeo Meningitec.

Tabela 2:Razão de média geométrica para a titulação deSBA MenC/concentração de anti- PSC

<table>table see original document page 53</column></row><table>

Em todos os grupos imunizados (Grupos K, L, M e Ν), o GMRaumentou de modo significativo da vacinação pré para pós, indicando apresença de maturação de anticorpo e a funcionalidade. GMR no grupo M(imunizado com Hib5-MenC5- TT) foi mais alta do que no Grupo N(imunizado com Meningitec™).

Tabela 3:Persistência em 12- 15 meses de idade justo antesda administração das vacinas de reforço

<table>table see original document page 53</column></row><table>Grupo K:pacientes imunizados com MenClO- TT + Infanrix™hexa; Grupo L:pacientes imunizados com HiblO-MenClO- TT +Infanrix™penta; Grupo M:pacientes imunizados com Hib5-MenC5- TT +Infanrix™ penta; Grupo N:pacientes imunizados com Meningitec™ +Infanrix™hexa; N:número de pacientes com resultados disponíveis.

Titulações de SBA mais altas contra MenC foram alcançadaspela imunização com um tamanho maior de MenC (grupos K, L e M)comparados à imunização com Meningitec de conjugado de oligossacarídeoMenC.

Memória imune (Coorte de ATP quanto àimunogenicidade)

A administração de 1/5 da dose de polissacarídeo puroACWY provocou uma titulação de SBA- MenC muito alta em todos os quatrogrupos imunizados com 98,7- 100% e 97,5 - 100% de pacientes imunizadoscom um regime de vacina candidato exibindo titulações > 1:128 (91, 8%). Emcomparação, 17,6% de pacientes não-imunizados apresentaram titulações deSBAMenC > 1:128 (91, 8%).

Exemplo 4:Ensaio clínico da Fase II em vacina de conjugadode HibMenAC- TT misturado com DTPw- HepB

Projeto de Estudo:Estudo de centro único, aleatório(1:1:1:1:1), aberto com cinco grupos. Os cinco grupos receberam o regime devacinação que se segue, respectivamente, em 6, IOe 14 semanas de idade.

• Tritanrix™ -HepB/Hib- menAC 2, 5/2, 5/2,5 :e assim pordiante, referido como 2, 5/2,5/2,5:

• Tritanrix™- HepB/Hib-MenAC 2,5/5/5:a seguir referidocomo 2,5/5/5

• Tritanrix™ -HepB/Hib-MenAC 5/5/5:a seguir referido como5/5/5

• Tritanrix™-HepB + Hiberix™:a seguir referido comoHiberix

• Tritanrix- HepB/Hiberix™ + Meningitec™:a seguir referidocomo amostras de sangue Menigitec foram tomados no momento da primeiradose de vacina (Pre) e um mês após a terceira dose de vacina (Pós- dose 3).

Tritanrix é uma vacina DTPw comercializada porGlaxoSmithKline Biologicals S. A.

105 pacientes foram usados em cada um dos cinco grupos,dando um total de 525 pacientes no estudo.

Tabela 4:Conteúdo das formulações de vacina de GSK

<table>table see original document page 55</column></row><table>

* A vacina 2, 5/2, 5/2,5 foi uma diluição de dose da vacina deHib-MenAC 5/5/5 de GSK Biologicals a 5/5/5 contendo 2, 5 μg de cada umde PRP-TT, MenA- TT e MenC- TT

As formulações de vacina Hib-MenAC foram misturadasextemporaneamente com Tritanix - HepB. A vacina de Bordetella pertussis decélula inteira de difteria - tétano- hepatite B combinada (DTPw-HB) Tritanix-HepB) contém não menos do que 30 Unidades Internacionais (IU) de toxóidede difteria, não menos do que 60 IU de toxóide de tétano, não menos do que4IU de perturssis Bordetella exterminada e 10 μg de antígeno superficial dehepatite B recombinante.

Terapia de referência, dose, modo de administração, lote n°:

Programação de vacinação/sítio:um grupo recebeu a vacinaTritanrix™- HepB por via intramuscular na coxa esquerda e Hiberix™ por viaintramuscular na coxa direita em 6, 10 e 14 semanas de idade. Um outrogrupo recebeu a vacina Tritanrix™-HepB/Hiberix™ por via intramuscular nacoxa esquerda e a vacina Meningitec por via intramuscular na coxa direita em6, 10 e 14 semanas de idade.

Vacina/composição/dose/número do lote:A vacinaTritanix™-HepB usada foi como acima descrito.

Uma dose (0,5 ml) de vacina de conjugado do tipo b deHaemophilus influenzae de GSK Biologicals:Hiberix™ continha 10 μg dePRP conjugado a toxóide do tétano. No grupo Hiberix™, ele foi misturadocom diluente estéril e no Grupo Meningitec™, ele foi misturado comTritanix™- HepB.

Uma dose (0,5 ml) da vacina MENINGITEC™de WyethLederle continha: 10 μg de oligossacarídeo capsular do grupo meningocócicoC, conjugado a 15 μg da proteína Corynebacterium diphteria CRM 197 ealumínio como sais.

Resultados- respostas imunes geradas contra Hib, MenA e MenC

Tabela 5a Anti- PRP (ug/ml)

<table>table see original document page 56</column></row><table>

Tabela 5b SBA - MenC

<table>table see original document page 56</column></row><table>

Tabela 5 c SBA- MenA

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Tabela 5d Anti- PSC (με/ml)

<table>table see original document page 56</column></row><table>Tabela 5e Anti-PSA (>g/ml)

<table>table see original document page 57</column></row><table>

Conclusão

Uma comparação dos resultados de imunogenicidadealcançados com o uso da vacina de conjugado MenC- CRM 197 e as trêsformulações de GSK, que contêm os conjugados de polissacarídeo MenA-TTe MenC- TT3 demonstraram que os conjugados de polissacarídeo Men foramcapazes de provocar uma boa resposta imune, similar àquela alcançadausando a vacina de conjugado de oligossacarídeo Meningitec. Todas asformulações testadas forneceram uma resposta para MenC em 100% dospacientes.

Exemplo 5- Ensaio clínico da Fase II administrando HibMenCY concomitantemente com Infanrix™ penta de acordo com umaprogramação de 2,3 e 4 meses

Projeto de Estudo:Um estudo multicêntrico controlado demodo aleatório, aberto (parcialmente duplo- cego*), de Fase II, com 5 gruposrecebendo uma programação primária de três doses com vacinas como sesegue:

Grupo Hib-MenCY 2,5/5/5 :Hib-MenCY (2,5/5/5) + Infanrix™penta

Grupo Hib-MenCY 5/10/10:Hib-MenCY (5/10/10) +Infanrix™ penta

Grupo Hib-MenCY 5/5/5: Hib-MenCY (5/5/5) +Infanrix™penta

Grupo Hib-MenC:Hib-MenC (5/5) + Infanrix™ pentaGrupo Menjugate:Menjugate™** + Infanrix™ hexa (controle)

* Hib-MenCY 2, 5/5/5, Hib-MenCY 5/10/10 e Hib-MenCforam administrados em um modo duplo cego, enquanto que o grupo Hib-MenCY 5/5/5 e o grupo Menjugate™ foram abertos.

As formulações a 2,5/5/5, 5/10/10 e 5/5/5 de Hib-MenCYcontêm polissacarídeos nativos MenC e polissacarídeos MenY que sãomicrofluidizados.

** Menjugate™ contém 10 μg de oligossacarídeos MenCconjugados a 12, 5- 25 μg de CRM por dose e é produzido por Chiron.

A vacinação em +/- 2, 3, 4 meses de idade (Mês de Estudo 0,Mês 1 e Mês 2), e amostras de sangue (3, 5 ml) de todos os pacientes antes dee um mês após a vacinação primária (Estudo no Mês 0 e no Mês 3).

Vacina de estudo, dose, modo de administração, número dolote:Três doses injetadas por via intramuscular em intervalos de um mês, emaproximadamente 2, 3 e 4 meses de idade, como se segue:

Tabela 6:Vacinas administradas (estudo e controle), grupo,programação/sítio e dose:

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ImunogenicidaderMedição de titulações deanticorpo/concentrações contra cada antígeno da vacina:

Antes da primeira dose (Mês 0) e aproximadamente um mêsapós a terceira dose (Mês 3) em todos os pacientes para:SBA-MenC e SBA-MenY, anti-PSC e anti-PSY, anti- PRP, anti-T, anti-FHA, anti- PRN e anti-PT. O uso de atividade bactericida do soro contra os sorogrupos C e Y de N.meningitidis (corte de SBA- MenC e SBA- MenY: 1:8 e 1:128); ensaios deELISA com cortes:> 0, 3 μg/ml e > 2 μg/ml para sorogrupos C deN.meningitidis e polissacarídeos Y (IgG de anti- PSC e IgG de anti-PSY); > 0,15 μg/ml e > 1, O μ g/ml para o polissacarídeo Hib polirribosil- ribitol- fosfato(IgG de anti- PRP; 5EL.U/ml para anti- FHA, anti- PRN< anti-PT; > 0, 1IU/ml de toxóide antitétano (anti- TT). Apenas um mês após a terceira dose(Mês 3) em todos os pacientes para:anti- D, anti-HBs e antipólio 1, 2, e 3.Usando ensaios ELISA com cortes:0,l IU/ml para antidifteria (anti- D); > 10ml U/ml para anti-hepatite (anti-HBs); e corte de teste demicroneutralização:l:8 para o tipo antipólio 1, 2 e 3 (antipólio 1, 2 e 3).

Métodos Estatísticos:

As taxas de soroproteção/soropositividade e asconcentrações/titulações médias geométricas (GMCs/GMTs) com 95% deintervalos de segurança (95% de Cl) foram computados por grupo, para SBA- MenC, anti- PSC5 SBA- MenY5 anti- PSY, anti-PRP, antitétano, anti- PT,anti- FHA e anti- PRN antes de e um mês após a vacinação; para antidifteria,anti-HBs, antipólio 1, antipólio 2 e antipólio 3, um mês após a vacinação. Aresposta da vacina (aparência de anticorpos em pacientes inicialmentesoronegativos ou pelo menos a manutenção das concentrações de anticorpoem pacientes inicialmente soropositivos) com 95% de Cl para anti-PT, anti-PRN e anti- FHA foram também computados um mês após a vacinação. Ascurvas cumulativas reversas para cada anticorpo no Mês 3 foram tambémapresentadas. As diferenças entre os grupos Hib- MenCY e Hib-MenC,comparadas com o grupo de controle Menjugate™ foram avaliadas em ummodo exploratório para cada anticorpo, exceto para SBA- MenY e anti-PSY,em termos de (1) a diferença entre o grupo Menjugate™ (menos) os gruposHib-MenCY e Hib-MenC quanto ao percentual de pacientes acima dos cortesespecificados ou com uma resposta de vacina com os seus 95% de CLassintótico padronizado, (2) as razões de GMC ou de GMT do grupoMenjugate™ em relação aos grupos Hib-MenCy e Hib-MenC com os seus95% de Cl. Foram efetuadas as mesmas comparações para avaliar a diferençaentre cada par de formulações de Hib- MenCY para os anticorpos anti-PRP,SBA-MenC, anti- PSC, SBA-MenY5 anti- PSY e anti- TT.

As incidências totais dos sintomas solicitados locais e geraisforam computadas por grupo de acordo com o tipo de sintoma, suaintensidade e relação para a vacinação (como percentuais de pacientesrelatando sintomas gerais, locais e quaisquer sintomas solicitados dentro de 8dias seguindo-se à vacinação e seus exatos 95% de Cl). As incidências desintomas não- solicitados foram computadas por grupo. Para sintomas deGrau 3, foram providos o início < 48 horas, atenção médica, duração, relaçãopara a vacinação e os resultados. Eventos Adversos Sérios foram inteiramentedescritos.

Taxas de Soroproteção/soropositividade & GMT/Ts(Coorte de ATP quanto à imunogenicidade)

Tabela 7a Anti- PRP (ue/ml)

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Tabela 7b SBA - MenC (Título)

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Tabela 7c Anti-PSC (ug/ml)

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Tabela 7d SBA-MenY (Título)

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Tabela 7e Anti-PSY

<table>table see original document page 60</column></row><table>Tabela 7f Antitétano (IU/ml)

Tabela 7f Antitétano (IU/ml)

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Grupo Hib- MenCY 2,5/5/5 :Hib-MenCY (2, 5/5/5) +Infanrix™ penta

Grupo Hib-MenCY 5/10/10:Hib-MenCY (5/10/10) +Infanrix™ penta

Grupo Hib-MenCY 5/5/5 :Hib-MenCY (5/5/5) + Infanrix™ penta

Grupo Hib-MenCcHib -Men (5/5) + Infanrix™hexaGrupo Menjugate:Menjugate™ + Infanrix™ pentaN = número de pacientes com % de resultados disponíveis =percentual de pacientes com concentração/titulação dentro da faixaespecificada

GMC/T:concentração/titulação média geométrica 95% Cl =95% de intervalo de segurança; LL = Limite Inferior; UL = Limite Superior

Conclusão:

Os conjugados de polissacarídeo MenC e Y produziram umaboa resposta imune em todos os pacientes, com 100% dos pacientesproduzindo respostas acima de 0,3 μg/ml contra MenC e MenY.

Exemplo 6- Ensaio clínico da Fase II comparando trêsformulações de MenACWY - TT com a vacina de conjugado deoligossacarídeo MenC- CRM 197 Meningitec

Este exemplo relata um estudo de faixa de dose controlada,aleatória, aberta (parcialmente cega, de fase II, de modo a avaliar aimunogenicidade de três diferentes formulações da vacina de conjugado detoxóide de tétano, A, C, W-135, Y dos sorogrupos meningocócicos(MenACWY-TT) de GalxoSmithKline Biologicals em comparação com umavacina de conjugado de oligossacarídeo MenC - CRM197 (Meningitec™)quando fornecida como uma dose única a crianças na idade de 12-14 meses.

O ensaio clínico foi um estudo multicêntrico, controlado,aberto (parcialmente duplo cego*), no qual pacientes elegíveis de 12-14meses foram colocados, de modo aleatório (1:1:1:1) em de um a quatrogrupos paralelos de 50 pacientes para receber uma dose primária única naVisita 1, como se segue:

Forma lT:MenACWY- TT em uma dose de 2,5 μg depolissacarídeo MenA conjugado a toxóide de tétano (TT), 2, 5 μg depolissacarídeo MenC conjugado TT, 2,5 μg de polissacarídeo MenWconjugado a TT e 2,5 μg de polissacarídeo MenY conjugado a TT.

Forma 2T:MenACWT-TT em uma dose de 5μg depolissacarídeo MenA conjugado a TT, 5 μg de polissacarídeo MenCconjugado a TT, 5 μg de polissacarídeo MenW conjugado a TT e 5 depolissacarídeo MenY conjugado a TT.

Forma 3T:MenACWY-TT em uma dose de 2,5 μg depolissacarídeo MenA conjugado a TT, 10 μg de polissacarídeo MenCconjugado a TT, 2,5 μg de polissacarídeo MenW conjugado a TT e 2, 5 μg depolissacarídeo menY conjugado a TT.

Ctrl T:10 μg e oligossacarídeo MenC conjugado a 1,25- 25 μgde CRM 197 (Meningitec).

*As três diferentes formulações de MenACWY- TT foramadministradas em um modo duplo cego.

Programação de vacinação/sítio: Uma única dose de vacinafoi administrada por via intramuscular no deltóide esquerdo na Visita 1 (Mêsde Estudo 0) de acordo com um designação aleatória. Todas as vacinascandidatas foram supridas sob a forma de uma pelota liofilizada em um frascode dose única (0, 5 ml após a reconstituição com o diluente salino suprido).

Imunogenicidade.Medição de titulações/concentrações deanticorpos contra componentes de antígeno de vacina meningocócicos emamostras de sangue obtidas antes da dose de vacina de estudo (Mês 0) eaproximadamente um mês após a dose de vacina do estudo (Mês 1) em todosos pacientes. A determinação de titulações de anticorpo bactericida contra ossorogrupos de N-menigitidis A, C, W- 135 e Y (SBA-MenA5 SBA-MenC,SBA -MenW e SBA-MenY) através de um teste bactericida (cortes deensaio:uma diluição de 1:8 e 1:128) e medição por ELISA de anticorposcontra os sorogrupos de N.meningitidis A, C, W-135 e Y (anti- PSA, anti-PSC, anti-PSW e anti-PSY, cortes de ensaio > 0, 3 μ^πιΐ e > 2 μ§/ιη1), etoxóide do tétano (antitétano, corte de ensaio 0,1 IU/ml).

Resultados

Resposta do anticorpo em termos de percentual de respostas deSBA-MenA, SBA- MenC, SBA- MenW e SBA-MenY um mês após avacinação (o ponto terminal primário) é apresentada na Tabela 8. Umaresposta é definida como maio do que ou igual a 4 vezes o aumento quanto apacientes soropositivos ou soroconversão quanto a pacientes soronegativosantes da vacinação.

Tabela 8;Respostas de vacina para anticorpo de SBA ummês após a vacinação

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A Tabela 9 apresenta os números de pacientes que alcançamtitulações de SBA acima dos pontos de corte de 1:8 e 1:128, assim como GMTs.

Tabela 9:Taxas de Soropositividade e GMTs para anticorposde SBA um mês após a vacinação

<table>table see original document page 64</column></row><table>

A vacinação com todas as três formulações do conjugado depolissacarídeo ACWY- TT conduziu a boas respostas de SBA contra MenA,MenC, MenW e MenY com 95- 100% de pacientes com titulações superes a1:8. Em particular, as formulações 5/5/5/5 e 2,5/10/2,5/2,5 dos conjugados depolisssacarídeo produziram uma resposta mais alta contra MenC do que avacina de oligossacarídeo Meningitec®, conforme observado em umaproporção mais alta de indivíduos tendo uma titulação superior a 1:128 e asleituras de GMT.Tabela 10. Taxas de soropositividade e GMCs paraanticorpos de polissacarídeo um mês após a vacinação

<table>table see original document page 65</column></row><table>

Todas as três formulações da vacina de conjugado depolissacarídeo ACWY- TT produziram boas respostas imunes contra MenA,MenC, MenW e MenY com entre 93% e 100% de pacientes alcançandotitulações superiores a 0,3 μ§/ηι1. Leituras de GMC superiores foramalcançadas usando as formulações 5/5/5/5 e 2/5/10/2, 5/2,5 da vacina deconjugado de polissacarídeo ACWY-TT em comparação com Meningitec.

Exemplo 7- Comparação de imunogenicidade deconjugados de polissacarídeo MenY nativos e dimensionados

Camundongos (fêmeas DBA/2 de 6-8 semanas) receberamduas injeções, com intervalo de 2 semanas, de PSY- TT, através de viasubcutânea. As amostras de sangue foram tomadas 14 dias após a segundainjeção, de modo a executar um ELISA anti-PSY e SBA usando a cepa MenYS 1975. Através de injeção, os camundongos receberam 1 μg de PSY- TT(formulação lio não-ads).

Foram usados os conjugados descritos na Tabela 11.Tabela 11

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Resultados

Os resultados (Figura 1) apresentam uma tendência em relaçãoa uma imunogenicidade mais alta para conjugados preparados usando PSYdimensionado. A Figura IA apresenta os resultados de GMC obtidos em umELISA quanto a antisoros produzidos contra conjugados preparados a partirde MenY nativo (ENYTT012) MenY microfluidizado - 40 ciclos(ENYTT014) e MenY microfluidizado - 20 ciclos (ENYTT) 15). GMCs maisaltos foram obtidos quando o MenY -TT foi preparado a partir de MenYmicrofluidizado.

Resultados similares foram obtidos quando os anti- sorosforam avaliados através de um ensaio de SBA (Figura 1 B). De novo, osvalores de GMT mais altos foram alcançados usando conjugados preparados apartir de MenY microfluidizado.

Exemplo 8- Ensaio clínico determinando o efeito de umagente de ligação em MenA em uma vacina de conjugado MenACWY

Uma única dose de diferentes formulações da vacinaMenACWY foi administrada a adolescentes de 15-19 anos em 5 grupos de 25pacientes em um ensaio aleatório a 1:1:1:1:1. As formulações testadas foram:Fl- MenACWY conjugado a toxóide de tétano com oconjugado MenA contendo um espaçador AH - 5/5/5/5^g

F2- MenACWY conjugado a toxóide de tétano com oconjugado MenA contendo um espaçador AH - 2, 5/5/2,5/2,5 μg

F3- Men ACWY conjugado a um toxóide de tétano com oconjugado MenA contendo um espaçador AH - 5/5/2,5/2,5 μg

F4- MenACWY conjugado a um toxóide de tétano semespaçador em qualquer conjugado -5/5/5/5 μg

Grupo de Controle - Mencevax ACWY

No trigésimo dia após a inoculação, uma amostra de sangue foitomada a partir dos pacientes.

As amostras de sangue foram usadas para avaliar o percentualde respostas de SBA-MenA, SBA - MenC, SBA-MenW 135 e SBA-MenY5um mês após a dose da vacina. Uma resposta da vacina foi definida como 1)para pacientes inicialmente soronegativos - uma titulação de anticorpo pósvacinação > 1/32 em e Mês ou 2) para pacientes inicialmente soropositivos -titulação de anticorpo de > 4 vezes a titulação e anticorpo pré- vacinação.

Resultados

Como mostrado na Tabela 13, o uso de um espaçador noconjugado MenA conduziu a uma resposta imune aumentada contra MenA. Opercentual de resposta foi elevado de 66% a 90- 95% quando o espaçador AHfoi adicionado. Isto foi refletido em um aumento em SBA GMT de 4335 a 10000 e em um aumento em GMC de 5 a 20-40. De modo surpreendente, o usode um espaçador AH também conduziu a uma resposta imune aumentadacontra MenC, conforme observado por um aumento no percentual derespostas e um aumento em SBA GMT. Um aumento poderia ser tambémobservado em SBA- GMT contra MenY (6742- 7122) e contra MenW (4621-5418) quando um espaçador foi introduzido.

Tabela 12

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Exemplo 9- Ensaio clínico determinando o efeito de umagente de ligação em conjugados de MenA e MenC em vacina deconjugado MenACWY

Uma única dose de diferentes formulações da vacinaMenACWY foi administrada a adolescentes de 15- 19 anos em 5 grupos de25 pacientes em um ensaio aleatório a 1:1:1:1:1. As formulações testadasforam:

Fl- MenACWY conjugado a um toxóide de tétano com osconjugados MenA e MenC contendo um espaçador AH - 2, 5/2, 5/2,5/2, 5 μgF2 - MenACWY conjugado a toxóide de tétano com osconjugados MenA e MenC contendo um espaçador AH -5/5/2,5/2,5 μg

F3 - MenACWY conjugado a toxóide de tétano com osconjugados MenA e MenC conendo um espaçador AH - 5/5/5/5 μg

F4- MenACWY conjugado a um toxóide de tétano com oconjugado MenA contendo um espaçador AH - 5/5/5/5 μgGrupo de Controle - Mencevax ACWYNo trigésimo dia após a inoculação, uma amostra de sangue foitomada a partir dos pacientes.

As amostras de sangue foram usadas para avaliar o percentualde respostas de SBA- MenA5 SBA- MenC, SBA-MenWl35 e SBA-MenY ummês após a dose da vacina. Uma resposta de vacina foi definida como 1) parapacientes inicialmente soronegativos - uma titulação de anticorpo pós-vacinação > 1/32 em 1 mês ou 2) para pacientes inicialmente soropositivos -titulação de anticorpo de > 4 vezes a titulação de anticorpo pré- vacinação.

Resultados:

A introdução de um espaçador AH no interior do conjugadoMenC conduziu a um aumento na resposta imune contra MenC5 tal comomostrado na Tabela 14. Isto é demonstrado através de um aumento em SBAGMT de 1943 a 4329 e um aumento em anti-PSC GMC de 7,65 a 13,13.Foram mantidas boas respostas imunes contra MenA, MenW e MenY.

Tabela 13

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Claims (29)

1. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de quecompreende pelo menos 2 sacarídeos capsulares N. meningitidis diferentes,em que um ou mais é/são selecionados a partir de um primeiro grupo, queconsiste de MenA, MenC, MenY e MenW, que é/são conjugados a um(uns)carreador(es) de proteína, em que a razão de sacarídeo:proteína (p/p) estáentre 1:2 - 1:5, e um ou mais sacarídeos diferentes é/são selecionados a partirde um segundo grupo, que consiste de MenA, MenC, MenY e Men W, queé/são conjugados a um(uns) carreador(es) de proteína, em que a razão desacarídeo:proteína (p/p) está entre 5:1 - 1:1,99.

2. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos 2 sacarídeoscapsulares N. meningitidis diferentes, em que um ou mais é/são selecionadosa partir de um primeiro grupo, que consiste de MenA e MenC, que é/sãoconjugado(s) a um(uns) carreador(es) de proteína, em que a razão desacarídeo-.proteína (p/p) está entre 1:2 - 1:5, e em que um ou mais sacarídeosdiferentes é/são selecionados a partir de um segundo grupo, que consiste deMenC, MenY e MenW, que é/são conjugado(s) a um(uns) carreador(es) deproteína, em que a razão de sacarídeo:proteína (p/p) está entre 5:1 - 1:1, 99.

3. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1ou reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que MenW está presente e arazão do sacarídeo MenW para a proteína carreadora está entre 5:1 - 1:1,99,-2:1 - 1:1, 99, 1, 5:1- 1:1, 8, 1:1 -1:1, 7,1:1,2 - 1:1,6, ou 1:1,4-1:1,5 (p/p).

4. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que MenY está presente e arazão do sacarídeo MenY para a proteína carreadora está entre 5:1 - 1:1,99,-2:1- 1:1,99, 1, 5:1-1:1,9, 1:1-1:1,8, 1:1,1- 1:1,6, ou 1:1,3- 1:1,4 (p/p).

5. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que MenA está presente e arazão do sacarídeo MenA para a proteína carreadora está entre 1:2- 1;5, 1:2,-4- 1:4, 1:2, 7- 1:3,5, ou 1:2,9-1:3,1 (p/p).

6. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que MenC está presente e arazão do sacarídeo MenC para a proteína carreadora está entre 5:1- 1:1, 9,-2:1- 1:1,99, 1,5:1- 1:1,8, 1,3:1 - 1 :1,6, 1,2:1- 1:1,4, ou 1,1:1 - 1:1,2 (p/p).

7. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que MenC está presente e emque a razão de sacarídeo MenC para a proteína carreadora está entre 1:2 - 1:5,-1:2,5-1:4,5,1:2,7 -1:4,3, 1:3-1:4, ou 1:3,3-1:3,5 (p/p).

8. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos 2sacarídeos capsulares N. menigitidis diferentes, em que um ou mais é/sãoselecionados a partir de um primeiro grupo, que consiste de MenA, MenC,MenY e MenW, que é/são conjugado(s) através de um agente de ligação auma(s) proteína(s) portadora(s), e um ou mais sacarídeos diferentes é/sãoselecionados a partir de um segundo grupo, que consiste de MenA, MenC,MenY e Men W, que é/são diretamente conjugados a uma(s) proteína(s)portadora(s).

9. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 8,caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos 2 sacarídeoscapsulares N. meningitidis diferentes, em que um ou mais é/são selecionadosa partir de um primeiro grupo, que consiste de MenA e MenC, que é/sãoconjugados através de um agente de ligação a uma(s) proteína(s) portadora(s),e em que um ou mais sacarídeos diferentes é/são selecionados a partir de umsegundo grupo, que consiste de MenC, MenY e MenW, que é/são diretamenteconjugados a uma proteína carreadora.

10. Composição imunogênica caracterizada pelo fato de quecompreende pelo menos 2 sacarídeos diferentes separadamente conjugados aomesmo tipo de proteína carreadora, em que um ou mais sacarídeo(s) é/sãoconjugados a proteína carreadora em que a razão sacarídeo:proteína (p/p) estáentre 1:2-1:5, e um ou mais sacarídeos diferentes é/são conjugados a proteínacarreadora em que a razão sacarídeo:proteína (p/p) está entre 5:1-1:1,99.

11. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação-10, caracterizada pelo fato de que um ou mais sacarídeo(s) é/são conjugados aproteína carreadora via um primeiro tipo de grupo químico na proteínacarreadora, e um ou mais sacarídeo(s) é/são conjugados a proteína carreadoravia um segundo tipo de grupo químico na proteína carreadora.

12. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação-11, caracterizada pelo fato de que um ou mais sacarídeos conjugados aproteína carreadora via o primeiro tipo de grupo químico na proteínacarreadora, são diferentes de um ou mais sacarídeo(s) conjugados a proteínacarreadora via o segundo tipo de grupo químico na proteína carreadora.

13. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação-11 ou 12. caracterizada pelo fato de que um ou mais sacarídeo(s) é/sãoconjugados a proteína carreadora via um grupo carboxil da proteínacarreadora, e um ou mais sacarídeo(s) é/são conjugados a proteína carreadoravia um grupo amino na proteína carreadora.

14. Composição imunogênica de acordo com qualquer umadas reivindicações 11 a 13, caracterizada pelo fato de que o primeiro e osegundo tipos de grupo químico na proteína carreadora são presentes emepítopos separados de células B e/ou T na proteína carreadora.

15. Composição imunogênica de acordo com qualquer umadas reivindicações 10 a 14, caracterizada pelo fato de que os sacarídeos sãoselecionados a partir de um grupo, que consiste de sacarídeo capsular dosorogrupo A de N. meningitidis (MenA), sacarídeo capsular do sorogrupo Cde N. meningitidis (MenC), sacarídeo capsular do sorogrupo Y de N.meningitidis (MenY), sacarídeo capsular do sorogrupo W de N. meningitidis(MenW), sacarídeo capsular do grupo I de Streptococcus do Grupo B,sacarídeo capsular do grupo II de Streptoeoeeus do Grupo B5 sacarídeocapsular do grupo III de Streptoeoeeus do Grupo B, sacarídeo capsular dogrupo IV de Streptoeoeeus do Grupo B, sacarídeo capsular do grupo V deStreptoeoeeus do Grupo B, sacarídeo capsular do tipo 5 de Staphylocoeeusaureus, sacarídeo capsular do tipo 8 de Staphylocoeeus aureus, sacarídeo Vide Salmonella typhi, LPS de N.meningitidis (tal que L3 e/ou L2), LPS de Meatarrhalis, LPS de H. influenzae, e de quaisquer dos sacarídeospneumocócicos capsulares, tais que do sorotipo:l,2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8,- 9N, 9V, 10 A, 11A, 12 F, 14, 15B, 17F, 18 C, 19A, 19 F, 20, 22F, 23F ou 33F.

16. Composição imunogênica de acordo com qualquer umadas reivindicações 1 a 15, caracterizada pelo fato de que cada sacarídeocapsular de N. meningitidis é conjugado a proteína carreadoraindependentemente selecionada a partir do grupo que consiste de TT, DT,CRMl97, fragmento C de TT e proteína D.

17. Composição imunogênica de acordo com qualquer umadas reivindicações 1 a 16, caracterizada pelo fato de que cada sacarídeocapsular de N. meningitidis é conjugado a mesma proteína carreadoraselecionada a partir do grupo que consiste de TT, DT, CRMl 97, fragmento Cde TT e proteína D.

18. Composição imunogênica de acordo com qualquer umadas reivindicações 1 a 17, caracterizada pelo fato de que cada sacarídeocapsular de N. meningitidis é separadamente conjugado a uma proteínacarreadora separada.

19. Composição imunogênica de acordo com qualquer umadas reivindicações 1 a 18, caracterizada pelo fato de que pelo menos um, doisou três conjugado(s) de sacarídeo capsular N. meningitidis estão diretamenteconjugados a uma proteína carreadora.

20. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação-19, caracterizada pelo fato de que MenW e/ou MenY, MenW e/ou MenC,MenY e/ou MenC, ou MenW e MenC e MenY são diretamente conjugados auma proteína carreadora.

21. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação-19 ou 20, caracterizada pelo fato de que pelo menos um, dois ou trêsconjugado(s) de sacarídeo N. meningitidis está diretamente conjugado porquímica de CDAP.

22. Composição imunogênica de acordo com qualquer umadas reivindicações 1 a 21, caracterizada pelo fato de que pelo menos um, dois,ou três sacarídeo(s) capsulares N. meningitidis são conjugados à proteínacarreadora através de um agente de ligação.

23. Composição imunogênica de acordo com qualquer umadas reivindicações 1 a 22, caracterizada pelo fato de que compreendesacarídeos capsulares N. meningitidis de pelo menos dois sorogrupos A, C,W135 e Y conjugados a uma proteína carreadora, de modo a produzir umconjugado de sacarídeo capsular N. meningitidis, em que o tamanho médio decada sacarídeo N. meningitidis está acima de 50 kDa, 75 kDa, 100 kDa, 110kDa, 120 kDa ou 130 kDa.

24. Composição imunogênica de acordo com qualquer umadas reivindicações 1 a 23, caracterizada pelo fato de compreender umsacarídeo capsular de H. influenzae b conjugado a uma proteína carreadoraselecionada a partir do grupo, que consiste de TT, DT, CRM 197, fragmentoC de TT e proteína D.

25. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação-24, caracterizada pelo fato de que o conjugado de Hib está presente em umadose inferior àquela dose de cada um dos pelo menos dois outros conjugadosde sacarídeo bacterianos.

26. Composição imunogênica de acordo com qualquer umadas reivindicações 1 a 25, caracterizada pelo fato de que compreende umapreparação de vesícula de membrana externa do sorogrupo B de N.meningitidis ou sacarídeo capsular.

27. Vacina, caracterizada pelo fato de que compreende acomposição imunogênica como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 26 e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

28. Kit de vacina para a administração concomitante ouseqüencial, caracterizada pelo fato de que compreende duas composiçõesimunogênicas multivalentes para conferir proteção em um hospedeiro contradoença causada por Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Corynebaceriumdiphteriae, Haemophilus influenzae e Neisseria meningitidis, o referido kitcompreendendo um primeiro recipiente compreendendo:toxóide do tétano (TT),toxóide de difteria (DT), ecomponentes de pertussis acelulares ou inteiramente celulares,e um segundo recipiente compreendendo:a composição imunogênica como definida em qualquer umadas reivindicações 1 a 26.

29. Composição imunogênica de acordo com qualquer umadas reivindicações 1 a 26, caracterizada pelo fato de ser para o uso notratamento ou na prevenção de doença causada pela infecção de Neisseriameningitidis.