NO344452B1

NO344452B1 - Immunogent preparat, vaksine, vaksinesett samt fremgangsmåte for fremstilling av vaksinen.

Info

Publication number: NO344452B1
Application number: NO20076302A
Authority: NO
Inventors: Carine Capiau; Jan Poolman; Philippe Denoel; Dominique Boutriau; Pierre Duvivier; Ralph Leon Biemans
Original assignee: Glaxosmithkline Biologicals Sa
Priority date: 2005-06-27
Filing date: 2007-12-07
Publication date: 2019-12-09
Also published as: KR101351870B1; LU92085I9; US20130171188A1; EA012506B1; DK1896063T3; JP2008543905A; EP2283857A1; IL213795A; EP1896065B1; ES2340711T3; BRPI0612654B8; CA2612963A1; MA29603B1; WO2007000327A1; CN102218138A; SI2283857T1; AR056396A1; EP2351578B1; PL3009146T3; FR22C1008I1

Description

Foreliggende oppfinnelse angår immunogene preparater omfattende N. meningitidis kapsulære polysakkarider konjugert til et bærerprotein. Den angår i tillegg en vaksine og et vaksinesett omfattende N. meningitidis polysakkarid-konjugater, og en fremgangsmåte for fremstilling av vaksinen ifølge oppfinnelsen. Oppfinnelsen vedører også et immunogent preparat for immunisering mot Neisseria infeksjon.

Neisseria meningitidis er et gram-negativt humant patogen som forårsaker bakteriell meningitt. Basert på organismens kapsulære polysakkarid er tolv serogrupper av N. meningitidis identifisert (A, B, C, H, I, K, L , 29E, W135, X, Y og Z). Serogruppe A (MenA) er den mest vanlige årsak til epidemisk sykdom i sub-Sahara Afrika. Serogrupper B og C er ansvarlige for majoriteten av tilfeller i utviklingsland, idet de resterende tilfeller er forårsaket av W135 og Y).

Immunogene preparater omfattende N. meningitidis sakkarider konjugert til bærerproteiner er kjent på området. For eksempel beskriver WO 02/58737 en vaksine omfattende rensede kapsulære polysakkarider fra N. meningitidis serogrupper A, C, W135 og Y konjugert til et bærerprotein. Imidlertid angir denne søknaden at de ekstraherte N. meningitidis kapsulære polysakkarider må depolymeriseres ved oppvarmning i en hydrogenperoksid-løsning før konjugering.

WO 03/07985 beskriver konjugat-vaksiner omfattende N. meningitidis sakkarid valgt fra serogrupper A, C, W135 og Y. De meningokokke kapsulære polysakkarider blir ekstrahert og deretter hydrolysert slik at en seleksjon av oligosakkarider avledet fra de kapsulære polysakkarider blir anvendt for konjugering til et bærerprotein.

WO 04/103400 beskriver også multivalent meningokokk-avledet polysakkaridprotein-konjugat inneholdende kapsulære polysakkarider avledet fra N. meningitidis serogrupper A, C, W135 og Y. Denne søknad angir at, istedenfor anvendelse av det store native kapsulære polysakkarid, er anvendelse av meningokk-polysakkarider av en mindre størrelse foretrukket. Den angir at kapsulære polysakkarider blir delvis depolymerisert ved anvendelse av milde oksidative betingelser, som gir en gjennomsnittlig størrelse på mindre enn 100.000 dalton, fortrinnsvis 12.000 til 25.000 dalton.

WO 03/080678 beskriver modifiserte N. meningitidis serogruppe A polysakkarider med forbedret stabilitet i vann.

Det er fortsatt et behov for å utvikle forbedrede konjugat-vaksiner mot neisseria-meningitt. Foreliggende oppfinnelse angår tilveiebringelse av en meningokkpolysakkarid-konjugat-vaksine hvor størrelsen av polysakkaridene er større enn den angitt i litteraturen. Fokus på området er å anvende oligosakkarider for letthet av konjugat- produksjon. Oppfinnerene har funnet at ved anvendelse av native eller noe siktede polysakkarid-konjugater, kan én eller flere av de følgende fordeler oppnås: 1) et konjugat som har høy immungenisitet som er filtrerbart; 2) immun-hukommelse kan forbedres (som i eksempel tre); 3) endring av forholdet av polysakkarid til protein i konjugatet slik at forholdet av polysakkarid til protein (vekt/vekt) i konjugatet kan økes (dette kan resultere i en reduksjon av den bærer-undertrykkende effekt); 4) immunogene konjugater tilbøyelige til hydrolyse (så som MenA konjugater) kan stabiliseres ved anvendelse av større polysakkarider for konjugering. Anvendelse av større polysakkarider kan resultere i mer kryssbinding med konjugat-bærer og derfor mindre spaltning av fritt sakkarid fra konjugatet. Konjugat-vaksiner beskrevet i tidligere teknikk tenderer til å depolymerisere polysakkaridene før konjugering for å forbedre konjugering. Foreliggende oppfinnelse angår en annen strategi og viser overraskende at meningokokk konjugat-vaksiner som beholder en større del av polysakkarid gir en god immunrespons mot meningokokk-sykdom.

Følgelig, i ett aspekt av foreliggende oppfinnelse, tilveiebringes et immunogent preparat som enten ikke bruker aluminiumsaltadjuvans eller som ikke bruker adjuvans i det hele tatt, hvor preparatet omfatter N. meningitidis kapsulære polysakkarider fra minst én av serogruppene A, C, W135 og Y konjugert til et bærerprotein for å fremstille et N. meningitidis kapsulært polysakkarid-konjugat, hvor den gjennomsnittlige størrelsen til hvert N. meningitidis polysakkarid er over 50kDa, hvor hvert N. meningitidis polysakkarid er konjugert til tetanustoksoid bærer og er enten et nativt polysakkarid eller er sortert etter størrelse ved mikrofluidisering, hvor nevnte preparat omfatter et MenC kapsulært polysakkarid konjugert til tetanus-toksoid og hvor det MenC kapsulære polysakkaridet har en gjennomsnittlig størrelse på 150-210kDa.

I henhold til et ytterligere aspekt av oppfinnelsen tilveiebringes en vaksine omfattende det immunogene preparat ifølge oppfinnelsen og en farmasøytisk akseptabel bærer.

I henhold til et ytterligere aspekt av oppfinnelsen tilveiebringes et vaksinesett for samtidig eller sekvensiell administrering omfattende to multi-valente immunogene preparater for å gi beskyttelse til en vert mot sykdom forårsaket av Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, Haemophilus influenzae and Neisseria meningitidis, idet nevnte sett omfatter en første beholder omfattende: tetanus-toksoid (TT),

difteri-toksoid (DT) og

helcelle eller acellulære pertussis-komponenter,

og en andre beholder omfattende:

det immunogene preparat ifølge oppfinnelsen.

I henhold til et ytterligere aspekt ifølge oppfinnelsen tilveiebringes en fremgangsmåte for fremstilling av vaksinen ifølge oppfinnelsen omfattende trinnet med blanding av det immunogene preparat ifølge oppfinnelsen med en farmasøytisk akseptabel bærer.

I henhold til et ytterligere aspekt av oppfinnelsen tilveiebringes et immunogent preparat ifølge oppfinnelsen for anvendelse for behandling eller forebygging av sykdom forårsaket av Neisseria meningitidis infeksjon.

Beskrivelse av figurer

Figur 1 – A – Stolpediagram som viser GMC-responser i en anti-MenY ELISA.

ENYTT012 er et MenY-TT konjugat fremstilt fra nativt MenY polysakkarid. ENYTT014 er et MenY-TT konjugat fremstilt fra mikrofluidisert MenY polysakkarid som har gjennomgått 40 cykler av mikrofluidisering. ENYTT015bis er et MenY-TT konjugat fremstilt fra mikrofluidisert MenY polysakkarid som har gjennomgått 20 cykler av mikrofluidisering.

- B – Stolpediagram som viser GMT-responser i et anti-MenY SBA forsøk. ENYTT012 er et MenY-TT konjugat fremstilt fra nativt MenY polysakkarid. ENYTT014 er et MenY-TT konjugat fremstilt fra mikrofluidisert MenY polysakkarid som har gjennomgått 40 cykler av mikrofluidisering. ENYTT015bis er et MenY-TT konjugat fremstilt fra mikrofluidisert MenY polysakkarid som har gjennomgått 20 cykler av mikrofluidisering.

Et immunogent preparat ifølge oppfinnelsen er et som enten ikke bruker aluminiumsaltadjuvans eller som ikke bruker adjuvans i det hele tatt, hvor preparatet omfatter N. meningitidis kapsulære polysakkarider fra minst én av serogruppene A, C, W135 og Y konjugert til et bærerprotein for å fremstille

et N. meningitidis kapsulært polysakkarid-konjugat, hvor den gjennomsnittlige størrelsen til hvert N. meningitidis polysakkarid er over 50kDa, hvor hvert N. meningitidis polysakkarid er konjugert til tetanus-toksoid bærer og er enten et nativt polysakkarid eller er sortert etter størrelse ved mikrofluidisering, hvor nevnte preparat omfatter et MenC kapsulært polysakkarid konjugert til tetanustoksoid og hvor det MenC kapsulære polysakkaridet har en gjennomsnittlig størrelse på 150-210kDa. Det immunogene preparat ifølge oppfinnelsen kan omfatte N. meningitidis kapsulære polysakkarider fra minst én, to, tre eller fire av serogrupper A, C, W og Y konjugert til et bærerprotein, hvor den gjennomsnittlige størrelse (vektgjennomsnittlig molekylvekt; Mv) av minst ett, to, tre eller fire eller hvert N. meningitidis polysakkarid er over 50kDa.

Et immunogent preparat er også omtalt som omfatter N. meningitidis kapsulære polysakkarider fra minst én, to, tre eller fire av serogrupper A, C, W og Y konjugert til et bærerprotein, hvor minst ett, to, tre eller fire eller hvert N. meningitidis polysakkarid er enten et nativt polysakkarid eller er sortert ved en faktor opptil x1,5, x2, x3, x4, x5, x6, x7, x8, x9 eller x10 i forhold til den vektgjennomsnittlige molekylvekt av det native polysakkarid. Et immunogent preparat ifølge oppfinnelsen omfatter et MenC kapsulært polysakkarid konjugert til tetanus-toksoid og hvor nevnte MenC kapsulære polysakkarid har en gjennomsnittlig størrelse på 150-210kDa.

For formålene ved oppfinnelsen angir “nativt polysakkarid” et polysakkarid som ikke er underkastet en prosess, hvor formålet er å redusere størrelsen av polysakkaridet. Et polysakkarid kan bli svakt redusert i størrelse under normale rensingsprosedyrer. Et slikt polysakkarid er fortsatt nativt. Bare hvis polysakkaridet er underkastet siktings- teknikker ville polysakkaridet ikke være betraktet nativt.

For formålene ved oppfinnelsen betyr “sortert med en faktor opptil x2” at polysakkaridet er underkastet en prosess ment å redusere størrelsen av polysakkaridet men å beholde en størrelse mer enn halve størrelsen av det native polysakkarid. X3, x4 etc. skal tolkes på samme måte dvs. polysakkaridet blir underkastet en prosess ment å redusere størrelsen av polysakkaridet men å beholde en størrelse mer enn henholdsvis en tredjedel, en fjerdel etc. av størrelsen av det native polysakkarid.

Et immunogene preparat er også omtalt som omfatter N. meningitidis kapsulære polysakkarider fra minst én, to, tre eller fire av serogrupper A, C, W og Y konjugert til et bærerprotein, hvor minst ett, to, tre eller fire eller hvert N. meningitidis polysakkarid er nativt polysakkarid.

Et immunogene preparat er også omtalt som omfatter N. meningitidis kapsulære polysakkarider fra minst én, to, tre eller fire av serogrupper A, C, W og Y konjugert til et bærerprotein, hvor minst ett, to, tre eller fire eller hvert N. meningitidis polysakkarid er sortert med en faktor opptil x1,5, x2, x3, x4, x5, x6, x7, x8, x9 eller x10.

Immunogene preparater er også omtalt som eventuelt omfatter konjugater av: N. meningitidis serogruppe C kapsulært polysakkarid (MenC), serogruppe A kapsulært polysakkarid (MenA), serogruppe W135 kapsulært polysakkarid (MenW), serogruppe Y kapsulært polysakkarid (MenY), serogruppe C og Y kapsulære polysakkarider (MenCY), serogruppe C og A kapsulære polysakkarider (MenAC), serogruppe C og W kapsulære polysakkarider (MenCW), serogruppe A og Y kapsulære polysakkarider (MenAY), serogruppe A og W kapsulære polysakkarider (MenAW), serogruppe W og Y kapsulære polysakkarider (Men WY), serogruppe A, C og W kapsulære polysakkarider (MenACW), serogruppe A, C og Y kapsulære polysakkarider (MenACY); serogruppe A, W135 og Y kapsulære polysakkarider (MenAWY), serogruppe C, W135 og Y kapsulære polysakkarider (MenCWY); eller serogruppe A, C, W135 og Y kapsulære polysakkarider (MenACWY). Dette er definisjonen av “én , to, tre eller fire” eller “minst én” av serogrupper A, C, W og Y eller av hvert N. meningitidis polysakkarid hvor nevnt her.

I en utførelsesform er den gjennomsnittlige størrelse (eller molekylvekt) av minst ett, to, tre, fire eller hvert N. meningitidis polysakkarid 50KDa - 1500kDa, 50kDa -500kDa, 50 kDa - 300 KDa, 101kDa - 1500kDa, 101kDa - 500kDa eller 101kDa -300kDa som bestemt ved MALLS.

I en utførelsesform har MenA polysakkarid, når til stede, en molekylvekt på 50-500kDa, 50-100kDa, 100-500kDa, 55-90KDa, 60-70kDa eller 70-80kDa eller 60-80kDa som bestemt ved MALLS.

Et immunogent preparat ifølge oppfinnelsen omfatter et MenC kapsulært polysakkarid konjugert til tetatnus-toksoid og hvor nevnte MenC kapsulære polysakkarid har en gjennomsnittlig størrelse på 150-210kDa. I en utførelsesform har MenC polysakkaridet en molekylvekt på 180-210kDa som bestemt ved MALLS.

I en utførelsesform har MenY polysakkarid, når til stede, en molekylvekt på 60-190kDa, 70-180kDa, 80-170kDa, 90-160kDa, 100-150kDa eller 110-140kDa, 50-100kDa, 100-140kDa, 140-170kDa eller 150-160kDa som bestemt ved MALLS.

I en utførelsesform har MenW polysakkarid, når til stede, en molekylvekt på 60-190kDa, 70-180kDa, 80-170kDa, 90-160kDa, 100-150kDa, 110-140kDa, 50-100kDa eller 120-140kDa som bestemt ved MALLS.

Molekylvekten eller gjennomsnittlig molekylvekt av et polysakkarid angir her vekt-gjennomsnittlig molekylvekt (Mv) av polysakkaridet målt før konjugering og blir målt ved MALLS.

MALLS-teknikken er velkjent på området og blir typisk utført som beskrevet i eksempel 2. For MALLS-analyse av meningokokk-sakkarider kan to kolonner (TSKG6000 og 5000PWxl TOSOH Bioscience) anvendes i kombinasjon og sakkaridene elueres i vann. Sakkarider blir detektert ved anvendelse av en lysspredningsdetektor (for eksempel Wyatt Dawn DSP utstyrt med en 10mW argonlaser ved 488 nm) og et inferometrisk refraktometer (for eksempel Wyatt Otilab DSP utstyrt med en P100 celle og et rødt filter ved 498 nm).

I en utførelsesform er N. meningitidis polysakkarider native polysakkarider eller native polysakkarider som har redusert størrelse under en normal ekstraksjonsprosess.

I en utførelsesform blir N. meningitidis polysakkarider sortert ved mekanisk spaltning, for eksempel ved mikrofluidisering eller ultralydbehandling. Mikrofluidisering og ultralydbehandling har fordelen å redusere størrelsen av de større native polysakkarider tilstrekkelig til å gi et filtrerbart konjugat. Sikting skjer med en faktor på ikke mer enn x20, x10, x8, x6, x5, x4, x3 , x2 eller x1,5.

Et immunogent preparat er også beskrevet som omfatter N. meningitidis konjugater som er fremstilt fra en blanding av native polysakkarider og polysakkarider som er sortert med en faktor på ikke mer enn x20. For eksempel er polysakkarider fra MenC og/eller MenA native. For eksempel er polysakkarider fra MenY og/eller MenW sortert med en faktor på ikke mer enn x20, x10, x8, x6, x5, x4, x3 , x2 eller x1,5. For eksempel inneholder et immunogent preparat et konjugat fremstilt fra MenY og/eller MenW og/eller MenC og/eller MenA som er sortert med en faktor på ikke mer enn x20, x10, x8, x6, x5, x4, x3 , x2 eller x1,5 og/eller er mikrofluidisert. For eksempel inneholder et immunogent preparat et konjugat fremstilt fra nativ MenA og/eller MenC og/eller MenW og/eller MenY. For eksempel omfatter et immunogent preparat et konjugat fremstilt fra nativ MenC. For eksempel omfatter et immunogent preparat et konjugat fremstilt fra nativ MenC og MenA som er sortert med en faktor på ikke mer enn x20, x10, x8, x6, x5, x4, x3 , x2 eller x1,5 og/eller er mikrofluidisert. For eksempel omfatter et immunogent preparat et konjugat fremstilt fra nativ MenC og MenY som er sortert med en faktor på ikke mer enn x20, x10, x8, x6, x5, x4, x3 , x2 eller x1,5 og/eller er mikrofluidisert.

I en utførelsesform er polydispersiteten av polysakkaridet 1-1,5, 1-1,3, 1-1,2, 1-1,1 eller 1-1,05 og etter konjugering til et bærerprotein er polydispersiteten av konjugatet 1,0-2,5, 1,0-2,0.1,0-1,5, 1,0-1,2, 1,5-2,5, 1,7-2,2 eller 1,5-2,0. Alle polydispersitet-målinger er ved MALLS.

Polysakkarider blir eventuelt sortert opptil 1,5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 eller 20 ganger fra størrelsen av polysakkaridet isolert fra bakterier.

I en utførelsesform omfatter det immunogene preparat ifølge oppfinnelsen videre et antigen fra N. meningitidis serogruppe B. Antigenet er eventuelt et kapsulært polysakkarid fra N. meningitidis serogruppe B (MenB) eller et sortert polysakkarid eller oligosakkarid avledet derfra. Antigenet er eventuelt et ytre membran vesikkel-preparat fra N. meningitidis serogruppe B som beskrevet i EP301992, WO 01/09350, WO 04/14417, WO 04/14418 og WO 04/14419.

I en utførelsesform omfatter det immunogene preparatet ifølge oppfinnelsen videre et H. influenzae b (Hib) kapsulært sakkarid konjugert til et bærerprotein.

N. meningitidis polysakkarid(er) (og eventuelt Hib kapsulært sakkarid) omfattet i de farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen er konjugert til et bærerprotein så som tetanus-toksoid. Eventuelt kan Hib være konjugert til tetanus-toksoid-fragment C, ikketoksiske mutanter av tetanus-toksin, difteri-toksoid, CRM197, andre ikke-toksiske mutanter av difteri-toksin [så som CRM176, CRM 197, CRM228, CRM 45 (Uchida et al J. Biol. Chem.218; 3838-3844, 1973); CRM 9, CRM 45, CRM102, CRM 103 og CRM107 og andre mutasjoner beskrevet av Nicholls og Youle i Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992; delesjon eller mutasjon av Glu-148 til Asp, Gln eller Ser og/eller Ala 158 til Gly og andre mutasjoner beskrevet i US 4709017 eller US 4950740; mutasjon av minst én eller flere rester Lys 516, Lys 526, Phe 530 og/eller Lys 534 og andre mutasjoner beskrevet i US 5917017 eller US 6455673; eller fragment beskrevet i US 5843711], pneumokokk pneumolysin, OMPC (meningokokk ytre membran protein – vanligvis ekstrahert fra N. meningitidis serogruppe B – EP0372501), syntetiske peptider (EP0378881, EP0427347), varmesjokk-proteiner (WO 93/17712, WO 94/03208), pertussis-proteiner (WO 98/58668, EP0471177), cytokiner, lymfokiner, vekstfaktorer eller hormoner (WO 91/01146), kunstige proteiner omfattende multiple humane CD4+ T-celle-epitoper fra forskjellige patogen- avledede antigener (Falugi et al (2001) Eur J Immunol 31; 3816-3824) så som N19 protein (Baraldoi et al (2004) Infect Immun 72; 4884-7) pneumokokk overflateprotein PspA (WO 02/091998) pneumolysin (Kuo et al (1995) Infect Immun 63; 2706-13), jernopptak-proteiner (WO 01/72337), toksin A eller B av C. difficile (WO 00/61761) eller Protein D (EP594610 og WO 00/56360). I et immunogent preparat ifølge oppfinnelsen er MenC kapsulært polysakkarid konjugert til tetanus-toksoid.

Det immunogene preparat ifølge oppfinnelsen anvender tatanus-toksiod for hvert N. meningitidis polysakkarid (uavhengig). I en utførelsesform hvor Hib er til stede, kan Hib være konjugert til samme bærerprotein.

I en utførelsesform kan et enkelt bærerprotein bære mer enn ett sakkaridantigen (WO 04/083251). For eksempel kan et enkelt bærerprotein være konjugert til MenA og MenC; MenA og MenW; MenA og MenY; MenC og MenW; MenC og MenY; Men W og MenY; MenA, MenC og MenW; MenA, MenC og MenY; MenA, MenW og MenY; MenC, MenW og MenY; MenA, MenC, MenW og MenY; Hib og MenA; Hib og MenC; Hib og MenW; eller Hib og MenY.

I en utførelsesform omfatter det immunogene preparat ifølge oppfinnelsen et Hib-sakkarid konjugert til et bærerprotein valgt fra gruppen bestående av TT, DT, CRM197, fragment C av TT og protein D.

Et immunogene preparat er også omtalt som omfatter minst ett meningokokk sakkarid- (for eksempel MenA; MenC; MenW; MenY; MenA og MenC; MenA og MenW; MenA og MenY; MenC og Men W; Men C og MenY; Men W og MenY; MenA, MenC og MenW; MenA, MenC og MenY; MenA, MenW og MwnY; MenC, MenW og MenY eller MenA, MenC, MenW og MenY) konjugat som har et forhold mellom Men sakkarid og bærerprotein på mellom 1:5 og 5:1, mellom 1:2 og 5:1, mellom 1:0,5 og 1:2,5 eller mellom 1:1,25 og 1:2,5 (vekt/vekt).

Det immunogene preparat ifølge oppfinnelsen omfatter eventuelt et Hib sakkarid-konjugat som har et forhold mellom Hib og bærerprotein på mellom 1:5 og 5:1; 1:2 og 2:1; 1:1 og 1:4; 1:2 og 1:3,5; eller rundt eller nøyaktig 1:2,5 eller 1:3 (vekt/vekt). Med ‘rundt’ menes innen 10% av det angitte forhold.

Forholdet mellom sakkarid og bærerprotein (vekt/vekt) i et konjugat kan bestemmes ved anvendelse av det steriliserte konjugat. Mengden av protein blir bestemt ved anvendelse av et Lowry-forsøk ( for eksempel Lowry et al (1951) J. Biol. Chem.193, 265-275 eller Peterson et al Analytical Biochemistry 100, 201-220 (1979)) og mengden av sakkarid blir bestemt ved anvendelse av ICP-OES (induktivt koblet plasma-optisk emisjons-spektroskopi) for MenA, DMAP-forsøk for MenC og resorcinoforsøk for MenW og MenY (Monsigny et al (1988) Anal. Biochem.175, 525-530).

I en utførelsesform er det immunogene preparat ifølge oppfinnelsen N. meningitidis polysakkarid(er) og/eller Hib sakkarid konjugert til bærerproteinet via en linker, for eksempel en bifunksjonell linker. Linkeren er eventuelt heterobifunksjonell eller homobifunksjonell, har for eksempel en reaktiv aminogruppe og en reaktiv karboksylsyregruppe, 2 reaktive aminogrupper eller to reaktive karboksylsyregrupper. Linkeren har for eksempel mellom 4 og 20, 4 og 12, 5 og 10 karbonatomer. En mulig linker er ADH. Andre linkere omfatter B-propionamido (WO 00/10599), nitrofenyletylamin (Gever et al (1979) Med. Microbiol. Immunol.165; 171-288), halogenalkylhalogenider (US4057685), glykoside bindinger (US4673574, US4808700), heksan-diamin og 6-aminokapronsyre (US4459286).

Polysakkarid-konjugatene til stede i de immunogene preparater ifølge oppfinnelsen kan fremstilles ved hvilken som helst kjent koblingsteknikk.

Konjugeringsmetoden kan være basert på aktivering av sakkaridet med 1-cyano-4-dimetylamino-pyridinium-tetrafluorborat (CDAP) for å danne en cyanatester. Det aktiverte sakkarid kan således være koblet direkte eller via en spacer- (linker) gruppe til en aminogruppe på bærerproteinet. For eksempel kan spaceren være cystamin eller cysteamin, hvilket gir et tiolert polysakkarid som kan kobles til bæreren via en tioeterbinding oppnådd etter omsetning med et maleimid-aktivert bærerprotein (for eksempel ved anvendelse av GMBS) eller et halogenacetylert bærerprotein (for eksempel ved anvendelse av jodacetimid eller N-succinimidyl-bromacetat-bromacetat). Eventuelt blir cyanat-ester (eventuelt fremstilt ved CDAP-kjemi) koblet med heksan-diamin eller ADH og det amino-derivatiserte sakkarid blir konjugert til bærerproteinet ved anvendelse av karbodiimid- (f.eks. EDAC eller EDC) kjemi. Slike konjugater er beskrevet i PCT publisert søknad WO 93/15760 Uniformed Services University og WO 95/08348 og WO 96/29094.

Andre egnede teknikker anvender karbiinider, hydrazider, aktive estere, norboran, p-nitrobenzosyre, N-hydroksysuccinimid, S-NHS, EDC, TSTU. Mange er beskrevet i WO 98/42721. Konjugering kan involvere en karbonyl-linker som kan dannes ved omsetning av en fri hydroksylgruppe i sakkaridet med CDI (Bethell et al J. Biol. Chem.1979, 254; 2572-4, Hearn et al J. Chromatogr.1981.218; 509-18) fulgt av omsetning med et protein for å danne en karbamat-binding. Dette kan involvere reduksjon av anomerisk terminus til en primær hydroksylgruppe, eventuelt beskyttelse/avbeskyttelse av den primære hydroksylgruppe ved omsetning av den primære hydroksylgruppe med CDI for å danne et CDI-karbamat-mellomprodukt og kobling av CDI-karbamat-mellomproduktet med en aminogruppe på et protein.

Konjugatene kan også fremstilles ved direkte reduktive amineringsmetoder som beskrevet i US 4365170 (Jennings) og US 4673574 (Anderson). Andre metoder er beskrevet i EP-0-161-188, EP-208375 og EP-0-477508.

En ytterligere metode involverer kobling av et cyanogen-bromid (eller CDAP) aktivert sakkarid derivatisert med adipinsyrehydrazid (ADH) til proteinbærer ved karbodiimid-kondensering (Chu C. et al Infect. Immunity, 1983245256), for eksempel ved anvendelse av EDAC.

I en utførelsesform er en hydroksylgruppe (eventuelt en aktivert hydroksylgruppe for eksempel en hydroksylgruppe aktivert med en cyanatester) på et sakkarid bundet til en amino- eller karboksylsyregruppe på et protein enten direkte eller indirekte (gjennom en linker). Når en linker er til stede er en hydroksylgruppe på et sakkarid eventuelt bundet til en aminogruppe på en linker, for eksempel ved anvendelse av CDAP-konjugering. En ytterligere aminogruppe i linkeren, for eksempel ADH) kan konjugeres til en karboksylsyregruppe på et protein, for eksempel ved anvendelse av karbodiimid-kjemi, for eksempel ved anvendelse av EDAC. I en utførelsesform blir Hib eller N. meningitidis kapsulære polysakkarid(er) konjugert til linkeren først før linkeren blir konjugert til bærerproteinet.

I en utførelsesform blir Hib-sakkaridet, når til stede, konjugert til bærerproteinet ved anvendelse av CNBr eller CDAP eller en kombinasjon av CDAP og karbodiimidkjemi (så som EDAC) eller en kombinasjon av CNBr og karbodiimid-kjemi (så som EDAC). Eventuelt blir Hib konjugert ved anvendelse av CNBr og karbodiimid-kjemi, eventuelt EDAC. For eksempel blir CNBr anvendt for å binde sakkarid og linker og deretter blir karbodiimidkjemi anvendt for å binde linkeren til proteinbæreren.

I en utførelsesform er minst én av N. meningitidis kapsulære polysakkarider direkte konjugert til et bærerprotein; eventuelt er MenW og/eller MenY og/eller MenC sakkarid(er) direkte konjugert til et bærerprotein. For eksempel er MenW; MenY;

MenC; MenW og MenY; MenW og MenC; MenY og MenC; eller MenW, MenY og MenC direkte bundet til bærerproteinet. Eventuelt er det minst ene av de N. meningitidis kapsulære polysakkarider direkte konjugert av CDAP. For eksempel er MenW; MenY; MenC; MenW og MenY; MenW og MenC; MenY og MenC; eller MenW, MenY og MenC direkte bundet til bærerproteinet av CDAP (se WO 95/08348 og WO 96/29094). I en utførelsesform er alle N. meningitidis kapsulære polysakkarider konjugert til tetanus-toksoid.

Eventuelt er forholdet av MenW og/eller Y sakkarid til bærerprotein mellom 1:0,5 og 1:2 (vekt/vekt) og/eller forholdet av MenC-sakkarid til bærerprotein er mellom 1:0,5 og 1:4 eller 1:1,25-1:1,5 eller 1:0,5 og 1:1,5 (vekt/vekt), spesielt hvor disse sakkarider er direkte bundet til proteinet, eventuelt ved anvendelse av CDAP.

I en utførelsesform er minst ett av N. meningitidis kapsulære polysakkarid(er) konjugert til bærerproteinet via en linker, for eksempel en bifunksjonell linker. Linkeren er eventuelt heterobifunksjonell eller homobifunksjonell, har for eksempel en reaktiv amingruppe og en reativ karboksylsyregruppe, 2 reaktive amingrupper eller 2 reaktive karboksylsyregrupper. Linkeren har for eksempel mellom 4 og 20, 4 og 12, 5 og 10 karbonatomer. En mulig linker er ADH.

I en utførelsesform er MenA; MenC; eller MenA og MenC konjugert til et bærerprotein (for eksempel tetanus-toksoid) via en linker.

I en utførelsesform er minst ett N. meningitidis polysakkarid konjugert til et bærer-protein via en linker ved anvendelse av CDAP og EDAC. For eksempel er MenA; MenC; eller MenA og MenC konjugert til et protein via en linker (for eksempel de med to hydrozino-grupper ved endene så som ADH) ved anvendelse av CDAP og EDAC som beskrevet ovenfor. For eksempel blir CDAP anvendt for å konjugere sakkaridet til en linker og EDAC anvendt for å konjugere linkeren til et protein.

Eventuelt resulterer konjugeringen via en linker i et forhold av polysakkarid til bærerprotein på mellom 1:0,5 og 1:6; 1:1 og 1:5 eller 1:2 og 1:4, for MenA; MenC; eller MenA og MenC.

I en utførelsesform er MenA kapsulært polysakkarid, når til stede, minst delvis O-acetylert slik at minst 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% eller 98% av repetisjonsenhetene er O-acetylert ved minst én stilling. O-acetylering er for eksempel til stede i minst O-3 stilling av minst 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% eller 98% av repetisjonsenhetene.

I en utførelsesform er det MenC kapsulære polysakkarid minst delvis O-acetylert slik at minst 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% eller 98% av (α2 →9)-bundne NeuNAc repetisjonsenheter er O-acetylert ved minst én eller to stillinger. O-acetylering er for eksempel til stede ved O-7 og/eller O-8 stilling av minst 30%.40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% eller 98% av repetisjonsenhetene.

I en utførelsesform er MenW kapsulært polysakkarid, når til stede minst delvis O-acetylert slik at minst 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% eller 98% av repetisjonsenhetene er O-acetylert i minst én eller to stillinger. O-acetylering er for eksempel til stede ved O-7 og/eller O-9 stilling av minst 30%.40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% eller 98% av repetisjonsenhetene.

I en utførelsesform er MenY kapsulært polysakkarid, når til stede minst delvis O-acetylert slik at minst 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% eller 98% av repetisjonsenhetene er O-acetylert ved minst én eller to stillinger. O-acetylering er til stede ved 7- og/eller 9-stilling av minst 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% eller 98% av repetisjonsenhetene.

Prosentdelen av O-acetylering angir prosentdelen av repetisjonsenheter inneholdende O-acetylering. Dette kan måles i polysakkaridet før konjugering og/eller etter konjugering.

I en ytterligere utførelsesform omfatter det immunogene preparat ifølge oppfinnelsen et Hib-sakkarid-konjugat og minst to N. meningitidis polysakkaridkonjugater hvor Hib-konjugatet er til stede i en lavere sakkariddose enn gjennomsnittlig sakkarid-dose av de minst to N. meningitidis polysakkarid-konjugater. Alternativt er Hib-konjugatet til stede i en lavere sakkarid-dose enn sakkarid-dosen av hvert av de minst to N. meningitidis polysakkarid-konjugater. For eksempel kan dosen av Hibkonjugatet være minst 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% eller 80% lavere enn gjennomsnittet eller laveste sakkarid dose av de minst to ytterligere N. meningitidis polysakkarid-konjugater.

Betegnelsen “sakkarid” omfatter polysakkarider eller oligosakkarider.

Polysakkarider blir isolert fra bakterier eller isolert fra bakterier og sortert i noen grad ved kjente metoder (se for eksempel EP497524 og EP497525) og eventuelt ved mikrofluidisering. Polysakkarider kan siktes for å redusere viskositet i polysakkaridprøver og/eller for å forbedre filtrerbarhet av konjugerte produkter.

Oligosakkarider er karakterisert ved typisk å være hydrolyserte polysakkarider med et lavt antall av repetisjonsenheter (typisk 5-30 repetisjonsenheter).

Gjennomsnittlig dose blir bestemt ved addisjon av dosene av alle de ytterligere polysakkarider og divisjon med antallet ytterligere polysakkarider. Ytterligere polysakkarider er alle polysakkaridene innen det immunogene preparat bortsett fra Hib og kan omfatte N. meningitidis kapsulære polysakkarider. “Dosen” er den mengde av immunogent preparat eller vaksine som blir administrert til et menneske.

Et Hib-sakkarid er det polyribosylfosfat (PRP) kapsulære polysakkarid av Haemophilus influenzae type b eller et oligosakkarid avledet derfra.

'Minst to ytterligere bakterielle sakkarid-konjugater’ skal forstås å bety minst to ytterligere bakterielle sakkarid-konjugater i tillegg til et Hib-konjugat. De minst to ytterligere bakterielle konjugater kan omfatte N. meningitidis kapsulære polysakkaridkonjugater.

De immunogene preparater ifølge oppfinnelsen kan omfatte ytterligere sakkarid-konjugater avledet fra én eller flere av Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Gruppe A Streptokokker, Gruppe B Streptokokker, S. typhi, Staphylococcus aureus eller Staphylococcus epidermidis. I en utførelsesform omfatter det immunogene preparat kapsulære polysakkarider eller oligosakkarider avledet fra én eller flere av serogrupper A, C, W135 og Y av Neisseria meningitidis. En ytterligere utførelsesform omfatter kapsulære polysakkarider eller oligosakkarider avledet fra Streptococcus pneumoniae. De pneumokokk kapsulære polysakkarid- eller oligosakkarid-antigener er eventuelt valgt fra serotyper 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F og 33F (eventuelt fra serotyper 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F og 23F). En ytterligere utførelsesform omfatter Type 5, Type 8 eller 336 kapsulære polysakkarider eller oligosakkarider av Staphylococcus aureus. En ytterligere utførelsesform omfatter Type I, Type II eller Type III kapsulære polysakkarider av Staphylococcus epidermidis. En ytterligere utførelsesform omfatter Vi-sakkarid (poly- eller oligosakkarid) fra S. typhi. En ytterligere utførelsesform omfatter Type Ia, Type Ic, Type II, Type III eller Type V kapsulære polysakkarider eller oligosakkarider fra Gruppe B streptokokker. En ytterligere utførelsesform omfatter de kapsulære polysakkarider eller oligosakkarider fra Gruppe A streptococcus, eventuelt ytterligere omfattende minst ett M protein og eventuelt multiple typer av M protein.

I en utførelsesformer inneholder det immunogene preparat ifølge oppfinnelsen hvert N. meningitidis kapsulære polysakkarid i en dose på mellom 0,1-20µg; 1-10µg; 2-10µg, 2,5-5µg, rundt eller nøyaktig 5µg; eller rundt eller nøyaktig 2,5µg.

I en utførelsesform inneholder det immunogene preparat ifølge oppfinnelsen for eksempel Hib-sakkarid-konjugat med en sakkarid-dose mellom 0,1 og 9µg; 1 og 5µg eller 2 og 3µg eller rundt eller nøyaktig 2,5µg og hvert av N. meningitidis polysakkaridkonjugater med en sakkarid-dose på mellom 2 og 20µg, 3 og 10µg eller mellom 4 og 7µg eller rundt eller nøyaktig 5µg.

“Rundt” eller “omtrent” er definert som innen 10% mer eller mindre av det gitte tall for formålene ved oppfinnelsen.

I en utførelsesform inneholder det immunogene preparat ifølge oppfinnelsen en sakkarid-dose av Hib-sakkarid-konjugat som for eksempel er mindre enn 90%, 80%, 75%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% eller 10% av gjennomsnittlig sakkarid dose av minst to, tre, fire eller hvert av N. meningitidis polysakkarid-konjugatene. Sakkariddose av Hib-sakkaridet er for eksempel mellom 20% og 60%, 30% og 60%, 40% og 60% eller rundt eller nøyaktig 50% av gjennomsnittlig sakkarid-dose av minst to, tre, fire eller hvert av N. meningitidis polysakkarid-konjugatene.

I en utførelsesform inneholder det immunogene preparat ifølge oppfinnelsen en sakkarid-dose av Hib sakkarid-konjugatet som for eksempel er mindre enn 90%, 80%, 75%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% eller 10% av den laveste sakkarid-dose av minst to, tre, fire eller hvert av N. meningitidis polysakkarid-konjugatene. Sakkariddosen av Hib-sakkaridet er for eksempel mellom 20% og 60%, 30% og 60%, 40% og 60% eller rundt eller nøyaktig 50% av den laveste sakkarid dose av de minst to, tre, fire eller hvert av N. meningitidis polysakkarid-konjugatene.

I en utførelsesform av oppfinnelsen er sakkarid-dosen av hvert av de minst to, tre, fire eller hvert av N. meningitidis polysakkarid-konjugatene eventuelt samme eller omtrent samme.

Eksempler på immunogene preparater ifølge oppfinnelsen er preparater bestående av eller omfattende:

Hib-konjugat og MenA-konjugat og MenC-konjugat, eventuelt i sakkarid-dose-forhold på 1:2:2, 1:2:1, 1:4:2, 1:6:3, 1:3:3, 1:4:4, 1:5:5, 1:6:6 (vekt/vekt). Eventuelt er sakkariddosen av MenA større enn sakkarid-dosen av MenC.

Hib-konjugat og MenC konjugat og MenY konjugat, eventuelt i sakkarid-dose-forhold på 1:2:2, 1:2:1, 1:4:2, 1:4:1, 1:8;4, 1:6:3, 1:3:3, 1:4:4, 1:5:5, 1:6:6 (vekt/vekt). Eventuelt er sakkarid-dosen av MenC større enn sakkarid-dosen av MenY.

Hib-konjugat og MenC konjugat og MenW konjugat, eventuelt i sakkarid-dose-forhold på 1:2:2, 1:2:1, 1:4:2, 1:4:1, 1:8;4, 1:6:3, 1:3:3, 1:4:4, 1:5:5, 1:6:6 (vekt/vekt). Eventuelt er sakkarid-dosen av MenC større enn sakkarid-dosen av MenW.

Hib-konjugat og MenA konjugat og MenW konjugat, eventuelt i sakkarid-dose-forhold på 1:2:2, 1:2:1, 1:4:2, 1:4:1, 1:8;4, 1:6:3, 1:3:3, 1:4:4, 1:5:5, 1:6:6 (vekt/vekt). Eventuelt er sakkarid-dosen av MenA større enn sakkarid-dosen av MenW.

MenA, MenC, MenW og MenY i sakkarid-dose-forhold av 1:1:1:1 eller 2:1:1:1 eller 1:2:1:1 eller 2:2:1:1 eller 1:3:1:1 eller 1:4:1:1 (vekt/vekt).

Et ytterligere aspekt av oppfinnelsen er en vaksine omfattende det immunogene preparat ifølge oppfinnelsen og et farmasøytisk akseptabelt tilsetningsmiddel.

I en utførelsesform er det immunogene preparat ifølge oppfinnelsen bufret ved eller regulert til, mellom pH 7,0 og 8,0, pH 7,2 og 7,6 eller rundt eller nøyaktig pH 7,4.

Det immunogene preparat eller vaksiner ifølge oppfinnelsen er eventuelt lyofilisert i nærvær av et stabiliseringsmiddel, for eksempel en polyol så som sukrose eller trehalose.

Eventuelt inneholder det immunogene preparat eller vaksine ifølge oppfinnelsen en mengde av et adjuvans tilstrekkelig til å forbedre immunresponsen på immunogenet. Egnede adjuvantia omfatter, men er ikke begrenset til, squalenblandinger (SAF-1), muramyl-peptid, saponin-derivater, mykobakterie celleveggpreparater, monofosforyl lipid A, mykolsyrederivater, ikke-ioniske blokk-kopolymer overflateaktive midler, Quil A, kolera-toksin B subenhet, polyfosfazen og derivater og immunostimulerende komplekser (ISCOM) så som de beskrevet av Takahashi et al. (1990) Nature 344:873-875.

For N. meningitidis eller HibMen kombinasjoner beskrevet ovenfor kan det være fordelaktig ikke å anvende noe adjuvans i det hele tatt.

Som med alle immunogene preparater eller vaksiner må de immunologisk effektive mengder av immunogenene bestemmes empirisk. Faktorer som skal betraktes omfatter immunogenisiteten, hvorvidt eller ikke immunogenet vil bli kompleksert med eller kovalent bundet til et adjuvans eller bærer-protein eller annen bærer, administreringsvei og antallet immuniseringsdoser som skal administreres. Slike faktorer er kjent på vaksine-området og det er innenfor kunnskapen til immunologer å gjøre slike bestemmelser uten unødvendig eksperimentering.

Det aktive midlet kan være til stede i varierende konsentrasjoner i det farmasøytiske preparatet eller vaksinen ifølge oppfinnelsen. Typisk er minimum konsentrasjon av substansen en mengde nødvendig for å oppnå den tilsiktede anvendelse, mens maksimal konsentrasjon er maksimal mengde som vil forbli i løsning eller homogent suspendert i den innledende blanding. For eksempel er minimum mengden av et terapeutisk middel eventuelt én som vil gi en enkel terapeutisk effektiv dose. For bioaktive substanser er minimum konsentrasjon en mengde nødvendig for bioaktivitet ved rekonstituering og maksimal konsentrasjon er ved punktet ved hvilket en homogen suspensjon ikke kan holdes. I tilfellet av enkel-dose enheter, er mengden den for en enkel terapeutisk anvendelse. Generelt er det forventet at hver dose vil omfatte 1-100µg av protein-antigen, eventuelt 5-50µg eller 5-25µg. Eksempler på doser av bakterielle sakkarider er 10-20µg, 5-10µg, 2,5-5µg eller 1-2,5µg. Den foretrukne mengde av substansen varierer fra substans til substans men kan lett bestemmes av fagfolk på området.

Vaksinepreparatene ifølge foreliggende oppfinnelse kan være for anvendelse for å beskytte eller behandle et pattedyr (for eksempel en human pasient) mottagelig for infeksjon, ved hjelp av administrering av nevnte vaksine via systemisk eller mukosal rute. En human pasient er eventuelt et spedbarn (under 12 måneder), et lite barn (12-24, 12-16 eller 12-14 måneder), et barn (2-10, 3-8 eller 3-5 år), en ungdom (12-25, 14-21 eller 15-19 år) eller en voksen (hvilken som helst alder over 12, 15, 18 eller 21). Disse administreringer kan omfatte injeksjon via intramuskulær, intraperitoneal, intradermal eller subkutan rute; eller via mukosal administrering til oral/fordøyelse-, respiratorisk, genitourinær kanal. Intranasal administrering av vaksiner for behandling av lungebetennelse eller otitis media er foretrukket (ettersom nasofaryngeal transport av pneumokokker kan forhindres mer effektivt, og således svekke infeksjonen i dens tidligste stadium). Selv om vaksinen ifølge oppfinnelsen kan administreres som en enkel dose, kan komponenter derav også samadministreres sammen med, samtidig med eller på forskjellige tider (for eksempel hvis sakkarider er til stede i en vaksine kan disse administreres separat, samtidig med eller 1-2 uker etter administrering av en bakteriell protein-vaksine for optimal koordinering av immunresponsene med hensyn til hverandre). I tillegg til en enkel administreringsvei kan 2 forskjellige administreringsmetoder anvendes. For eksempel kan virale antigener administreres ID (intradermalt), mens bakteriell proteiner kan administreres IM (intramuskulært) eller IN (intranasalt). Hvis sakkarider er til stede kan de administreres IM (eller ID) og bakterielle proteiner kan administreres IN (eller ID). I tillegg kan vaksinene ifølge oppfinnelsen administreres IM for primingsdoser og IN for booster-doser.

Vaksinefremstilling er generelt beskrevet i Vaccine Design (“The subunit and adjuvant approach” (ed. Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York). Innkapsling i liposomer er beskrevet av Fullerton, US Patent 4,235,877.

Et ytterligere aspekt ved oppfinnelsen er et vaksinesett for ledsagende eller sekvensiell administrering omfattende to multivalente immunogene preparater for å gi beskyttelse i en vert mot sykdom forårsaket av Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae and Neisseria meningitidis og eventuelt Haemophilus influenzae. For eksempel omfatter settet eventuelt en første beholder omfattende én eller flere av:

tetanus-toksoid (TT),

difteri-toksoid (DT) og

helcelle eller acellulære pertussis-komponenter,

og en andre beholder omfattende enten:

et immunogent preparat ifølge oppfinnelsen som eventuelt er lyofilisert,

eller

Hib-sakkarid-konjugat, og

et immunogent preparat ifølge oppfinnelsen som eventuelt er lyofilisert.

Formuleringseksempler for Hib-konjugat og N. meningitidis polysakkaridkonjugater er som beskrevet ovenfor.

Et ytterligere aspekt ved oppfinnelsen er et vaksinesett for ledsagende eller sekvensiell administrering omfattende to multi-valente immunogene preparater for å gi beskyttelse hos en vert mot sykdom forårsaket av Streptococcus pneumoniae og Neisseria meningitidis og eventuelt Haemophilus influenzae. For eksempel omfatter settet eventuelt en første beholder omfattende:

ett eller flere konjugater av et bærerprotein og et kapsulært sakkarid fra Streptococcus pneumoniae [hvor det kapsulære sakkarid eventuelt er fra en pneumokokk serotype valgt fra gruppen bestående av 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F og 33F],

og en andre beholder omfattende enten:

et immunogent preparat ifølge oppfinnelsen som eventuelt er lyofilisert,

eller

Hib-sakkarid-konjugat, og

et immunogent preparat ifølge oppfinnelsen som eventuelt er lyofilisert.

Eksempler på Hib-konjugat og N. meningitidis polysakkarid-konjugater er som beskrevet ovenfor.

Typisk vil Streptococcus pneumoniae-vaksinen i vaksinesettet ifølge foreliggende oppfinnelse omfatte sakkarid-antigener (eventuelt konjugert), hvor polysakkaridene er avledet fra minst fire serotyper av pneumokokker valgt fra gruppen bestående av 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F og 33F. Eventuelt omfatter de fire serotyper 6B, 14, 19F og 23F. Eventuelt er minst 7 serotyper omfattet i preparatet, for eksempel de avledet fra serotyper 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F og 23F. Eventuelt er mer enn 7 serotyper omfattet i preparatet, for eksempel minst 10, 11, 12, 13 eller 14 serotyper. For eksempel omfatter preparatet i én utførelsesform 11 kapsulære polysakkarider avledet fra serotyper 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F og 23F (eventuelt konjugert). I en utførelsesform av oppfinnelsen er minst 13 polysakkarid-antigener (eventuelt konjugert) inkludert, selv om ytterligere polysakkarid-antigener, for eksempel 23 valente (så som serotyper 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F og 33F) også er omfattet av oppfinnelsen.

Også beskrevet er et vaksinesett omfattende en tredje komponent. For eksempel omfatter settet eventuelt en første beholder omfattende én eller flere av: tetanus-toksoid (TT),

difteri-toksoid (DT) og

helcelle eller acellulære pertussis-komponenter,

og en andre beholder omfattende:

ett eller flere konjugater av et bærerprotein og et kapsulært sakkarid fra Streptococcus pneumoniae [hvor det kapsulære sakkarid eventuelt er fra en pneumokokk serotype valgt fra gruppen bestående av 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F og 33F].

og en tredje beholder omfattende:

et immunogent preparat ifølge oppfinnelsen som eventuelt er lyofilisert,

eller

Hib-sakkarid-konjugat, og

et immunogent preparat ifølge oppfinnelsen som eventuelt er lyofilisert.

Immunogene preparater ifølge oppfinnelsen kan eventuelt ytterligere omfatte antigener fra meslinger og/eller kusma og/eller røde hunder og/eller vannkopper. For eksempel inneholder meningokokk immunogent preparat antigener fra meslinger, kusma og røde hunder eller meslinger, kusma, røde hunder og vannkopper. I en utførelsesform er disse virale antigener eventuelt til stede i samme beholder som meningokokk og/eller Hib sakkarid-konjugat(er). I en utførelsesform er disse virale antigener lyofilisert.

Et ytterligere aspekt ved oppfinnelsen er en fremgangsmåte for fremstilling av vaksinen ifølge oppfinnelsen, omfattende trinnet med blanding av det immunogene preparatet ifølge oppfinnelsen med en farmasøytisk akseptabel bærer.

Et ytterligere aspekt ved oppfinnelsen er et immunogent preparat ifølge oppfinnelsen for anvendelse for immunisering av en human vert mot sykdom forårsaket av N. meningitidis- og eventuelt Haemophilus influenzae-infeksjon omfattende administrering til verten av en immunobeskyttende dose av det immunogene preparat eller vaksine eller sett ifølge oppfinnelsen.

Et ytterligere aspekt ved oppfinnelsen er et immunogent preparat ifølge oppfinnelsen for anvendelse for behandling eller forebygging av sykdom forårsaket av N. meningitidis- og eventuelt Haemophilus influenzae-infeksjon.

Oppfinnelsen er illustrert i de ledsagende eksempler. Eksemplene nedenfor blir utført ved anvendelse av standard teknikker, som er velkjente og rutinemessige for fagfolk på området, bortsett fra hvor på annen måte beskrevet i detalj. Eksemplene er illustrative, men skal ikke begrense oppfinnelsen.

Eksempler

Eksempel 1 – fremstilling av polysakkarid-konjugater

Kovalent binding av Haemophilus influenzae (Hib) PRP-polysakkarid til TT ble utført ved en koblingskjemi utviklet av Chu et al (Infection and Immunity 1983, 40 (1); 245-256). Hib PRP-polysakkarid ble aktivert ved tilsetning av CNBr og inkubering ved pH 10,5 i 6 minutter. pH ble senket til pH 8,75 og adipinsyre-dihyrazid (ADH) ble tilsatt og inkubering fortsatt i ytterligere 90 minutter. Det aktiverte PRP ble koblet til renset tetanus-toksoid via karbodiimid-kondensering ved anvendelse av 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid (EDAC). EDAC ble satt til det aktiverte PRP for å nå et endelig forhold av 0,6 mg EDAC/mg aktivert PRP. pH ble regulert til 5,0 og renset tetanus-toksoid ble tilsatt for å nå 2 mg TT/mg aktivert PRP. Den resulterende løsningen fikk stå i tre dager med svak omrøring. Etter filtrering gjennom en 0,45µm membran ble konjugatet renset på en sephacryl S500HR (Pharmacia, Sverige) kolonne ekvilibrert i 0,2M NaCl.

MenC –TT konjugater ble produsert ved anvendelse av native polysakkarider (på over 150kDa som målt ved MALLS). MenA-TT-konjugater ble produsert ved anvendelse av enten nativt polysakkarid eller noe mikrofluidisert polysakkarid på over 60kDa som målt ved MALLS-metoden i eksempel 2. MenW og MenY-TT-konjugater ble produsert ved anvendelse av siktede polysakkarider på rundt 100-200kDa som målt ved MALLS (se eksempel 2). Sikting ble utført ved mikrofluidisering ved anvendelse av et homogenisator Emulsiflex C-50 apparat. Polysakkaridene ble deretter filtrert gjennom et 0,2µm filter.

Aktivering og kobling ble utført som beskrevet i WO96/29094 og WO 00/56360. Kort angitt ble polysakkaridet i en konsentrasjon på 10-20 mg/ml i 2M NaCl pH 5,5-6,0 blandet med CDAP-løsning (100 mg/ml nyfremstilt i acetonitril/WFI, 50/50) til et endelig CDAP/polysakkarid-forhold på 0,75/1 eller 1,5/1. Etter 1,5 minutter ble pH hevet med natriumhydroksid til pH 10,0. Etter tre minutter ble tetanus-toksoid tilsatt for å nå et protein/polysakkarid-forhold på 1,5/1 for MenW, 1,2/1 for MenY, 1,5/1 for MenA eller 1,5/1 for MenC. Reaksjonen fortsatte i én til to timer.

Etter koblingstrinnet ble glycin tilsatt til et endelig forhold av glycin/PS (vekt/vekt) på 7,5/1 og pH ble regulert til pH 9,0. Blandingen fikk stå i 30 minutter. Konjugatet ble klaret ved anvendelse av et 10µm Kleenpak filter og ble deretter fylt på en Sephacryl S400HR kolonne ved anvendelse av en elueringsbuffer av 150 mM NaCl, 10 mM eller 5 mM Tris pH7,5. Kliniske partier ble filtrert på en Opticap 4 steriliseringsmembran. De resulterende konjugater hadde et gjennomsnittlig polysakkarid:protein-forhold på 1:1-1:5 (vekt/vekt).

For å konjugere MenA kapsulært polysakkarid til tetanus-toksoid via en spacer ble den følgende metode anvendt. Kovalent binding av polysakkarid og spacer (ADH) blir utført ved en koblingskjemi ved hvilken polysakkaridet blir aktivert under kontrollerte betingelser med et cyanyleringsmiddel, 1-cyano-4-dimetylaminopyridinium-tetrafluorborat (CDAP). Spaceren reagerer med cyanylert PS gjennom dens hydrazinogrupper, for å danne en stabil isourinstoff-binding mellom spacer og polysakkarid.

En 10 mg/ml løsning av MenA ble behandlet med en nyfremstilt 100 mg/ml løsning av CDAP i acetonitril/vann (50/50 (volum/volum)) for å oppnå et CDAP/MenA-forhold på 0,75 (vekt/vekt). Etter 1,5 minutter ble pH hevet til pH 10,0. Tre minutter senere ble ADH tilsatt for å oppnå et ADH/MenA-forhold på 8,9. pH i løsningen ble redusert til 8,75 og reaksjonen fortsatte i 2 timer.

Før konjugeringsreaksjonen ble den rensede TT-løsning og PSAAH-løsning fortynnet for å nå en konsentrasjon på 10 mg/ml for PSAAHog 10 mg/ml for TT.

EDAC ble satt til PSAH-løsningen for å nå et endelig forhold på 0,9 mg EDAC/mg PSAAH. pH ble regulert til 5,0. Det rensede tetanus-toksoid ble tilsatt med en peristaltisk pumpe (i 60 minutter) for å nå 2 mg TT/mg PSAAH. Den resulterende løsningen fikk stå 60 min ved 25°C under omrøring for å oppnå en endelig koblingstid på 120 min. Konjugatet ble klaret ved anvendelse av et 10µm filter og ble renset ved anvendelse av en Sephacryl S400HR kolonne.

Eksempel 2 – bestemmelse av molekylvekt ved anvendelse av MALLS

Detektorer ble koblet til en HPLC størrelse-eksklusjonskolonne fra hvilken prøvene ble eluert. På den ene siden målte laser-lysspredningsdetektoren lysintensiteter spredt ved 16 vinkler av den makromolekylære løsning og på den annen side tillot et interferometrisk refraktometer plassert on-line bestemmelse av mengden av prøve eluert. Fra disse intensiteter kan størrelse og form av makromolekylene i løsning bestemmes.

Gjennomsnittlig molekylvekt i vekt (Mw) er definert som summen av vektene av alle artene multiplisert med deres respektive molekylvekt og dividert med summen av vektene av alle artene.

a) Vekt-gjennomsnittlig molekylvekt: -Mw-

b) Nummer-gjennomsnittlig molekylvekt: -Mn-

c) Kvadratisk middelverdi radius: -Rw- og R<2>w er kvadrat radius definert ved:

(-mi- er massen til et spredningssenter i og -ri- er distansen mellom spredningssenteret i og senter av gravitasjon av makromolekylet).

d) Polydispersitet er definert som forholdet -Mw / Mn-.

Meningokokk-polysakkarider ble analysert ved MALLS ved lasting på to HPLC kolonner (TSKG6000 og 5000PWxl) anvendt i kombinasjon. 25 µl av polysakkaridet ble lastet på kolonnen og ble eluert med 0,75 ml filtrert vann. Polysakkaridene blir detektert ved anvendelse av en lyssprednings-detektor (Wyatt Dawn DSP utstyrt med en 10mW argon-laser ved 488nm) og et inferometrisk refraktometer (Wyatt Otilab DSP utstyrt med en P100 celle og et rødt filter ved 498 nm).

Molekylvekt-polydispersiteter og gjenvinning av alle prøver ble beregnet ved Debye-metoden ved anvendelse av en polynomial tilpasning orden på 1 i Astra 4.72 programvare.

Eksempel 3 – klinisk forsøk som sammenligner immunisering med Meningitec eller et større sortert MenC-TT-konjugat

En fase II, åpen, kontrollert studie ble utført for å sammenligne GSK Biologicals meningokokk serogruppe C konjugat-vaksine (MenC) med GSK Biologicals Haemophilus influenzae b-meningokokk serogruppe C konjugatvaksine (Hib-MenC) eller Meningitec ®. Hver dose av Meningitec ® inneholder 10 µg av meningokokk serogruppe C oligosakkarid konjugert til 15 µg av CRM197 og er produsert av Wyeth. GSK MenC-konjugater inneholdt native polysakkarider på ca.200kDa konjugert til tetanus-toksoid (TT).

Undersøkelsen besto av fem grupper, hver planlagt å omfatte 100 individer, fordelt til to parallelle grener som følger:

I denne studien mottok alle individer i begge grener én-femtedel (1/5) av en dose av Mencevax™ ACWY og en ledsagende dose av Infanrix™hexa i 12-15 måneders alder (Studiemåned 0). To blodprøver ble oppsamlet fra alle individer (Studiemåned 0 og Studiemåned 1). Gren 1 besto av fire grupper fra en primær vaksinasjonsstudie som var primet i en alder på 3, 4 og 5 måneder med de følgende vaksiner:

• Gruppe K: MenC (10 μg), ikke-adsorbert på aluminiumsalter (ikke-ads), tetanus- toksoid- (TT) konjugat og Infanrix™hexa (MenC10-TT Infanrix™hexa)

• Gruppe L: Hib (10 μg)-MenC (10 μg), ikke-ads TT konjugat og Infanrix™penta (Hib10-MenC10-TT Infanrix™penta)

• Gruppe M: Hib (5 μg)-MenC (5 μg), ikke-ads, TT-konjugat og Infanrix™penta (Hib5-MenC5-TT Infanrix™penta)

• Gruppe N: Meningitec™ og Infanrix™hexa (Meningitec™ Infanrix™hexa)

De to Hib-MenC-TT vaksine-grupper (Grupper L og M) ble holdt blindet i boosterstudien når det gjalde den nøyaktige formulering av kandidat-vaksinen.

Gren 2-(Gruppe O) besto av alder-matchede individer ikke tidligere vaksinert med en meningokokk serogruppe C vaksine (naïve) men som hadde mottatt rutinemessige pediatriske vaksiner i henhold til German Permanent Commission on Immunization.

Kriterier for evaluering:

Immunogenisitet: Bestemmelse av baktericide antistoff-titere mot meningokokk C (SBA-MenC) ved en baktericid-test (avkutting: fortynning på 1:8) og ELISA-måling av antistoffer mot meningokokk serogruppe C (forsøksavkutting: 0,3 μg/ml), Hib polysakkarid PRP (forsøksavkutting: 0,15 μg/ml) og tetanus-toksoid (forsøksavkutting: 0,1 IU/ml) i blodprøver oppnådd før vaksinasjon og omtrent én måned etter vaksinasjon fra alle individer.

Statistiske metoder:

Demografi: Bestemmelse av gjennomsnittlig alder i måneder (med median, område og standard avvik [SD]) og rase- og kjønn-sammensetning av ATP og totale vaksinerte grupper.

Immunogenisitet:

To analyser av immunogenisitet ble utført basert på ATP-gruppen for immunogenisitet (for analyser av immun-hukommelse og booster-respons) eller ATP-gruppen for sikkerhet (for analyse av persistens). Disse omfattet:

Evaluering av immunhukommelse for MenC and booster-respons for Hib og Tetanus (før og én måned etter administrering av 1/5 dose av den enkle polysakkarid-vaksine):

• Bestemmelse av geometrisk gjennomsnittlige titere og konsentrasjoner (GMT og GMC) med 95% konfidensintervaller (95% CI)

• Bestemmelse av prosentdelen av individer med antistoff titer/konsentrasjon over den foreslåtte avkutting med nøyaktig 95% CI (seropositivitet/serobeskyttelses-grad)

• Undersøkelse av antistoff titer/konsentrasjon etter vaksinasjon ved anvendelse av reverse kumulative kurver

• Beregning av standardisert asymptotisk 95% CI for forskjellen i seropositivitet/serobeskyttelses-grad

• mellom primet gruppe (Grupper K, L, M og N) og uprimet gruppe (Gruppe O) • Bestemmelse av det geometriske gjennomsnitt av individuelle forhold av SBA-MenC titer over anti-PSC konsentrasjon, med 95% CI

• Bestemmelse av 95% CI for post-vaksinasjon GMT/C-forhold mellom gruppene K, L, M og kontrollgruppen N for anti-PRP og anti-tetanus og mellom hver primet gruppe (Grupper K, L, M og N) og uprimet gruppe (Gruppe O) for SBA-MenC og anti-PSC ved anvendelse av en ANOVA-modell

Resultater

Tabell 1. SBA-MenC titere og anti-PSC antistoff-konsentrasjon etter boostervaksinasjon

Gruppe K: individer primet med MenC10-TT Infanrix.hexa; Gruppe L: individer primet med Hib10-MenC10-TT Infanrix.penta; Gruppe M: individer primet med Hib5-MenC5-TT Infanrix.penta; Gruppe N: individer primet med Meningitec. Infanrix.hexa;

Gruppe O: kontrollindivider (dvs. individer ikke primet med MenC konjugat-vaksine) N: antall av individer med tilgjengelige resultater

Høyere titere av antistoffer mot MenC og høyere SBA-titere ble oppnådd ved priming med de større MenC polysakkarid konjugat-vaksiner (grupper K, L og M) sammenlignet med Meningitec oligosakkarid konjugat-vaksine.

Tabell 2: Geometrisk gjennomsnitts-forhold for SBA_MenC titere/anti-PSC konsentrasjon

I alle fire primede grupper (Grupper K, L, M og N) øket GMR betydelig fra pre til post booster vaksinasjon som indikerer tilstedeværelse av antistoff-modning og funksjonalitet. GMR i gruppen M (primet med Hib5-MenC5-TT) var høyere enn i gruppen N (primet med Meningitec™).

Tabell 3: Persistens ved 12-15 måneders alder like før administrering av boostervaksiner

N: antall individer med tilgjengelige resultater

Høyere SBA-titere mot MenC ble oppnådd ved priming med de større MenC (grupper K, L og M) sammenlignet med priming med MenC-oligosakkarid-konjugat Meningitec.

Immun-hukommelse (ATP-gruppe for immunogenisitet)

Administrering av 1/5 dose av den enkle polysakkarid ACWY vaksine fremkalte meget høy SBA-MenC-titer i alle fire primede grupper med 98,7-100% og 97,5-100% av individer primet med et kandidat-vaksine-regime som har titere henholdsvis ≥1:8 og ≥1:128. I gruppen primet med Meningitec™ regimet, var det en trend for en lavere prosentdel av individer med titere ≥1:128 (91,8%). Til sammenligning hadde 17,6% av uprimede individer SBA MenC titere ≥ 1:8 og ≥1:128.

Eksempel 4 Fase II klinisk forsøk på HibMenAC –TT konjugat-vaksine blandet med DTPw-HepB

Studie-utforming: Åpen, randomisert (1:1:1:1:1), enkel-senter studie med fem grupper. De fem grupper mottok det følgende vaksinasjonsregime henholdsvis 6, 10 og 14 uker gamle.

• Tritanrix.-HepB/Hib-MenAC 2,5µg/2,5µg/2,5µg: heretter referert til som 2,5/2,5/2,5

• Tritanrix.-HepB/Hib-MenAC 2,5 µg /5 µg /5 µg: heretter referert til som 2,5/5/5 • Tritanrix.-HepB/Hib-MenAC 5 µg /5 µg /5 µg: heretter referert til som 5/5/5 • Tritanrix.-HepB Hiberix.: heretter referert til som Hiberix

• Tritanrix.-HepB/Hiberix. Meningitec.: heretter referert til som Meningitec Blodprøver ble tatt på tidspunktet for den første vaksine dose (pre) og én måned etter den tredje vaksine dose (post-dose 3).

Tritanrix er en DTPw vaksine markedsført av GlaxoSmithKline Biologicals S.A.

105 individer ble anvendt i hver av de fem grupper hvilket ga totalt 525 individer i undersøkelsen.

Tabell 4 Innhold av GSK vaksine-formuleringer

* 2,5/2,5/2,5 vaksinen var en dose-fortynning av GSK Biologicals Hib-MenAC 5/5/5 vaksine inneholdende 2,5µg av hver av PRP-TT, MenA-TT og MenC-TT.

Hib-MenAC vaksine-formuleringene ble blandet ekstemporant med Tritanirix-HepB. GSK Biologicals kombinerte difteri-tetanus-helcelle Bordetella pertussis – hepatitt B (DTPw-HB) vaksine (Tritanrix-HepB) inneholder ikke mindre enn 30 internasjonale enheter (IU) av difteri-toksoid, ikke mindre enn 60 IU av tetanus-toksoid, ikke mindre enn 4IU av drept Bordetella pertussis og 10µg av rekombinant hepatitt B overflate antigen.

Referanse-terapi, dose, administreringsmetode, parti nr.:

Vaksinasjonsskjema/sted: én gruppe mottok Tritanrix.-HepB vaksine intramuskulært i venstre lår og Hiberix™ intramuskulært i høyre lår 6, 10 og 14 uker gamle. En annen gruppe mottok Tritanrix™-HepB/Hiberix™ vaksine intramuskulært i venstre lår og Meningitec vaksine intramuskulært i høyre lår 6, 10 og 14 uker gamle.

Vaksine/sammensetning/dose/parti-nummer: Tritanrix™-HepB vaksine anvendt var som beskrevet ovenfor.

En dose (0,5 ml) av GSK Biologicals Haemophilus influenzae type b konjugat-vaksine: Hiberix™ inneholdt 10 µg av PRP konjugert til tetanus-toksoid. I Hiberix™ gruppen ble den blandet med sterilt fortynningsmiddel og i Meningitec™ gruppen ble den blandet med Tritanrix™-HepB.

En dose (0,5 ml) av Wyeth Lederle’s MENINGITEC™ vaksine inneholdt: 10 µg av kapsulært oligosakkarid av meningokokk gruppe C konjugert til 15 µg av Corynebacterium diphtheria CRM197 protein og aluminium som salter.

Resultater – immunresponser dannet mot Hib, MenA og MenC

Tabell 5a Anti – PRP (µg/ml)

Tabell 5b SBA –MenC

Tabell 5c SBA MenA

Tabell 5d Anti-PSC (µg/ml)

Tabell 5e Anti – PSA (µg/ml)

Konklusjon

En sammenligning av immunogenisitetsresultater oppnådd ved anvendelse av oligosakkarid MenC-CRM197 konjugat-vaksine og de tre GSK-formuleringer som inneholder polysakkarid MenA-TT og MenC –TT konjugater viste at polysakkarid Men konjugater var i stand til å fremkalle en god immunogen respons lignende den oppnådd ved anvendelse av oligosakkarid konjugat-vaksine Meningitec. Alle formuleringer testet ga en respons på MenC hos 100% av pasientene.

Eksempel 5 – Fase II klinisk forsøk som administrerer Hib MenCY samtidig med Infanrix.penta i henhold til et 2, 3 og 4 måneders skjema

Studieutforming: En Fase II, åpen (delvis dobbel-blind*) randomisert kontrollert multisenter studie med 5 grupper som mottar et tre-dose primært skjema med vaksiner som følger:

Gruppe Hib-MenCY 2,5/5/5: Hib-MenCY (2,5/5/5 ) Infanrix™penta

Gruppe Hib-MenCY 5/10/10: Hib-MenCY (5/10/10) Infanrix™penta

Gruppe Hib-MenCY 5/5/5: Hib-MenCY (5/5/5) Infanrix™penta

Gruppe Hib-MenC: Hib-MenC (5/5) Infanrix™penta

Gruppe Menjugat: Menjugat™** Infanrix™hexa (kontroll).

*Hib-MenCY 2,5/5/5, Hib-MenCY 5/10/10 og Hib-MenC ble administrert på en dobbelblind måte mens Hib-MenCY 5/5/5 gruppen og Menjugat gruppen var åpen.2,5/5/5, 5/10/10 og 5/5/5 formuleringer av Hib-MenCY inneholder MenC native polysakkarider og MenY polysakkarider som er mikrofluidisert.

**Menjugat™ inneholder 10µg av MenC oligosakkarider konjugert til 12,5-25µg av CRM197 pr. dose og er produsert av Chiron.

Vaksinasjon ved /- 2, 3, 4 måneders alder (Studiemåned 0, måned 1 og måned 2) og blodprøver (3,5 ml) fra alle individer før og én måned etter primær vaksinasjon (Studiemåned 0 og måned 3).

Studie-vaksine, dose, administreringsmetode, parti-nummer: Tre doser injisert intramuskulært med én måneds intervaller, ved omtrent 2, 3 og 4 måneders alder som følger:

Tabell 6: Vaksiner administrert (studie og kontroll), gruppe, skjema/sted og dose

Immunogenisitet: Måling av antistoff-titere/konsentrasjoner mot hvert vaksineantigen:

Før den første dosen (måned 0) og omtrent én måned etter den tredje dose (måned 3) i alle individer for: SBA-MenC og SBA-MenY, anti-PSC og anti-PSY, anti-PRP, anti-T, anti-FHA, anti-PRN og anti-PT. Ved anvendelse av serum baktericid aktivitet mot N. meningitidis serogrupper C og Y (SBA-MenC og SBA-MenY avkutting: 1:8 og 1:128); ELISA-forsøk med avkutting: ≥0,3 µg/ml og ≥2µg/ml for anti-N. meningitidis serogrupper C og Y polysakkarider (anti-PSC IgG og anti-PSY IgG); ≥0,15 µg/ml og ≥1,0µg/ml for Hib polysakkarid polyribosil-ribitol-fosfat (anti-PRP IgG); 5EL.U/ml for anti-FHA, anti-PRN, anti-PT; ≥0,1 IU/ml anti-tetanus-toksoid (anti-TT). Bare én måned etter den tredje dose (måned 3) i alle individer for: anti-D, anti-HBs og anti-polio 1, 2 og 3. Ved anvendelse av ELISA-forsøk med avkutting: 0,1 IU/ml for anti-difteri (anti-D); ≥10 mIU/ml for antihepatitt B (anti-HBs); og mikronøytralisering test avkutting: 1:8 for anti-polio type 1, 2 og 3 (anti-polio 1, 2 og 3).

Statistiske metoder:

Serobeskyttelse/seropositivitets-grader og geometrisk gjennomsnittlige konsentrasjoner/titere (GMC/GMT) med 95% konfidensintervaller (95% CI) ble beregnet pr. gruppe, for SBA-MenC, anti-PSC, SBA-MenY, anti-PSY, anti-PRP, antitetanus, anti-PT, anti-FHA og anti-PRN før og én måned etter vaksinasjon; for antidifteri, anti-HBs, anti-Polio 1, anti-Polio 2 og anti-Polio 3 én måned etter vaksinasjon. Vaksine-respons (fremkomst av antistoffer hos individer initielt seronegative eller minst opprettholdelse av antistoff-konsentrasjoner hos individer initielt seropositive) med 95% CI for anti-PT, anti-PRN og anti-FHA ble også beregnet én måned etter vaksinasjon. Reverse kumulative kurver for hvert antistoff på Måned 3 er også presentert.

Forskjellene mellom Hib-MenCY og Hib-MenC grupper, sammenlignet med Menjugat™ kontrollgruppe ble evaluert på en utforskende måte for hvert antistoff, bortsett fra for SBA-MenY og anti-PSY, når det gjelder (1) forskjellen mellom Menjugat™ gruppen (minus) Hib-MenCY og Hib-MenC grupper for prosentdelen av individer over den spesifiserte avkutting eller med en vaksine- respons med standardisert asymptotisk 95% CI, (2) GMC- eller GMT-forhold for Menjugat™ gruppen over Hib-MenCY og Hib-MenC grupper med 95% CI. Samme sammenligninger ble utført for å bedømme forskjellen mellom hvert par av Hib-MenCY formuleringer for anti-PRP, SBA-MenC, anti-PSC, SBA-MenY, anti-PSY og anti-TT antistoffer.

Serobeskyttelse/seropositivitetsgrader &GMC/Ts (ATP gruppe for immunogenisitet)

Tabell 7a Anti – PRP (µg/ml)

Tabell 7b SBA –MenC (Titer)

Tabell 7c Anti-PSC (µg/ml)

Tabell 7d SBA-MenY (Titre)

Tabell 7e Anti – PSY (µg/ml)

Tabell 7f Anti-tetanus (IU/ml)

Gruppe Hib-MenCY 2,5/5/5: Hib-MenCY (2,5/5/5) Infanrix™penta Gruppe Hib-MenCY 5/10/10: Hib-MenCY (5/10/10) Infanrix™penta Gruppe Hib-MenCY 5/5/5: Hib-MenCY (5/5/5) Infanrix™penta

Gruppe Hib-MenC: Hib-Men (5/5)+ Infanrix™hexa

Gruppe Menjugat: Menjugat™ Infanrix™penta

N = antall individer med tilgjengelige resultater.% = prosentdel av individer med konsentrasjon/titere innen det spesifiserte område

GMC/T: geometrisk gjennomsnitt konsentrasjon/titer 95% CI = 95% konfidensintervall; LL = Nedre grense; UL = Øvre grense

Konklusjon

MenC og Y polysakkarid-konjugatene produserte en god immunrespons hos alle individer med 100% av individene som produserte over 0,3 µg/ml responser mot MenC og MenY.

Eksempel 6 – Fase II klinisk forsøk som sammenligner tre formuleringer av MenACWY-TT med Meningitec MenC-CRM197 oligosakkarid-konjugat-vaksine.

Dette eksemplet angir en fase II, åpen (delvis-blind), randomisert, kontrollert dose-område studie for å bedømme immunogenisiteten av tre forskjellige formuleringer av GlaxoSmithKline Biologicals meningokokk serogrupper A, C, W-135, Y tetanustoksoid konjugat- (MenACWY-TT) vaksine sammenlignet med en MenC oligosakkarid-CRM197 konjugat-vaksine (Meningitec) når gitt som én dose til barn i alderen 12-14 måneder.

Det kliniske forsøk var en åpen (delvis dobbel-blind*), kontrollert, multisenter studie hvor valgbare individer på 12-14 måneder ble randomisert (1:1:1:1) til én av fire parallelle grupper av 50 individer for å motta en enkel primær dose ved Visitt 1 som følger:

Form 1T: MenACWY-TT i en dose på 2,5µg av MenA polysakkarid konjugert til tetanus-toksoid (TT), 2,5µg av MenC polysakkarid konjugert til TT, 2,5µg av MenW polysakkarid konjugert til TT og 2,5µg av MenY polysakkarid konjugert til TT.

Form 2T: MenACWY-TT i en dose på 5µg av MenA polysakkarid konjugert til TT, 5µg av MenC polysakkarid konjugert til TT, 5µg av MenW polysakkarid konjugert til TT og 5µg av MenY polysakkarid konjugert til TT.

Form 3T: MenACWY-TT i en dose på 2,5µg av MenA polysakkarid konjugert til TT, 10µg av MenC polysakkarid konjugert til TT, 2,5µg av MenW polysakkarid konjugert til TT og 2,5µg av MenY polysakkarid konjugert til TT.

Ktrl T: 10µg MenC oligosakkarid konjugert til 12,5-25µg CRM197 (Meningitec™).

*De tre forskjellige MenACWY-TT formuleringer ble administrert på en dobbel-blind måte.

Vaksinasjonsskjema /sted: En enkel vaksinedose ble administrert intramuskulært i venstre deltoid ved Visitt 1 (Studiemåned 0) i henhold til randomisert fordeling. Alle kandidat- vaksiner ble levert som lyofilisert pellet i monodose medisinglass (0,5 ml etter rekonstituering med det leverte saltløsnings-fortynningsmiddel).

Immunogenisitet: Måling av titere/konsentrasjoner av antistoffer mot meningokokk vaksine antigen-komponenter i blodprøver oppnådd før undersøkelse-vaksinedose (måned 0) og omtrent én måned etter undersøkelse-vaksinedose (måned 1) for alle individer. Bestemmelse av baktericide antistoff-titere mot N. meningitidis serogrupper A, C, W-135 og Y (SBA-MenA, SBA-MenC, SBA-MenW og SBA-MenY) ved en baktericid test (forsøks-avkutting: fortynning på 1:8 og 1:128) og ELISA måling av antistoffer mot N. meningitidis serogrupper A, C, W-135 og Y (anti-PSA, anti-PSC, anti-PSW og anti-PSY, forsøks-avkutting ≥0,3µg/ml og ≥2µg/ml) og tetanus-toksoid (antitetanus, forsøks-avkutting 0,1 IU/ml).

Resultater

Antistoff respons når det gjelder prosentdelen av SBA-MenA, SBA-MenC, SBA-MenW og SBA-MenY respondere én måned etter vaksinasjon (det primære endepunkt) er vist i Tabell 8. En respons er definert som større enn eller lik en 4 ganger økning for seropositive individer eller serokonversjon for seronegative individer før vaksinasjon.

Tabell 8: Vaksine-responser for SBA antistoff én måned etter vaksinasjon

Tabell 9 viser antallet av individer som oppnår SBA-titere over avkuttingspunkt på 1:8 og 1:128 så vel som GMT.

Tabell 9: Seropositivitetsgrad og GMT for SBA-antistoffer én måned etter vaksinasjon

Vaksinasjon med alle tre formuleringer av ACWY-TT polysakkarid-konjugat førte til gode SBA-responser mot MenA, MenC, MenW og MenY med 95-100% av individene med titere større enn 1:8. Spesielt produserte 5/5/5/5 og 2,5/10/2,5/2,5 formuleringer av polysakkarid-konjugater en høyere respons mot MenC enn oligosakkarid Meningiticvaksine som sett ved en høyere andel av individer som har en titer større enn 1:128 og GMT-avlesninger.

Tabell 10 Seropositivitetsgrad og GMC for anti-polysakkarid-antistoffer én måned etter vaksinasjon

Alle tre formuleringer av ACWY-TT polysakkarid konjugat-vaksine produserte gode immunresponser mot MenA, MenC, MenW og MenY med mellom 93% og 100% av individene som oppnådde titere større enn 0,3µg/ml. Høyere GMC-avlesninger ble oppnådd ved anvendelse av 5/5/5/5 og 2/5/10/2,5/2,5 formuleringer av ACWY-TT polysakkarid konjugat-vaksine sammenlignet med Meningitec™.

Eksempel 7 – sammenligning av immunogenisitet av native og siktede MenY polysakkarid-konjugater

Hunnmus (DBA/2 på 6-8 uker) mottok to injeksjoner, 2 uker fra hverandre, av PSY-TT ved subkutan rute. Blodprøver ble tatt 14 dager etter den andre injeksjon for å utføre anti-PSY ELISA og SBA ved anvendelse av S1975 menY stamme. Pr. injeksjon mottok mus 1 µg av PSY-TT( lyo ikke-ads formulering).

Konjugatene beskrevet i tabell 11 ble anvendt .

Tabell 11

Resultater

Resultatene (Figur 1) viser en trend mot høyere immunogenisitet for konjugater fremstilt ved anvendelse av sortert PSY. Figur 1A viser GMC-resultater oppnådd ved ELISA for antisera fremkalt mot konjugater fremstilt fra nativ MenY (ENYTT012), mikrofluidisert MenY – 40 cykler (ENYTT014) og mikrofluidisert MenY – 20 cykler (ENYTT015 bis). Høyere GMC ble oppnådd når MenY-TT ble fremstilt fra mikrofluidisert MenY.

Lignende resultater ble oppnådd når antisera ble bedømt ved SBA-forsøk (Figur 1B). Igjen ble høyere GMT-verdier oppnådd ved anvendelse av konjugater fremstilt fra mikrofluidisert MenY.

Claims

PATENTKRAV

1. Immunogent preparat som enten ikke bruker aluminiumsaltadjuvans eller som ikke bruker adjuvans i det hele tatt,

k a r a k t e r i s e r t v e d at preparatet omfatter N. meningitidis kapsulære polysakkarider fra minst én av serogruppene A, C, W135 og Y konjugert til et bærerprotein for å fremstille et N. meningitidis kapsulært polysakkarid-konjugat, hvor den gjennomsnittlige størrelsen til hvert N. meningitidis polysakkarid er over 50 kDa, hvor hvert N. meningitidis polysakkarid er konjugert til tetanus-toksoid bærer og er enten et nativt polysakkarid eller er sortert etter størrelse ved mikrofluidisering, hvor nevnte preparat omfatter et MenC kapsulært polysakkarid konjugert til tetanus-toksoid og hvor det MenC kapsulære polysakkaridet har en gjennomsnittlig størrelse på 150-210kDa.

2. Immunogent preparat ifølge krav 1, som videre omfatter et MenA kapsulært polysakkarid konjugert til tetanustoksoid.

3. Immunogent preparat ifølge hvilket som helst av kravene 1-2, hvor det MenC kapsulære polysakkarid har en gjennomsnittlig størrelse på 150-180kDa.

4. Immunogent preparat ifølge et hvilket som helst av kravene 1-3, som omfatter et MenY kapsulært polysakkarid konjugert til tetanustoksoid.

5. Immunogent preparat ifølge et hvilket som helst av kravene 1-4, som omfatter et MenW kapsulært polysakkarid konjugert til tetanustoksoid.

6. Immunogent preparat ifølge hvilket som helst av de foregående krav, hvor hvert N. meningitidis kapsulære polysakkarid-konjugat har et polysakkarid:bærer forhold på 1:5-5:1 eller 1:1-1:4 (vekt/vekt).

7. Immunogent preparat ifølge hvilket som helst av de foregående krav, som videre omfatter et H. influenzae b kapsulært sakkarid konjugert til et bærerprotein.

8. Immunogent preparat ifølge krav 7, hvor H. influenzae b kapselsakkarid er konjugert til et bærerprotein valgt fra gruppen bestående av TT, DT, CRM197, fragment C av TT og protein D.

9. Immunogent preparat ifølge krav 7 eller 8, hvor forholdet mellom Hib og bærerprotein i det Hib kapsulære sakkarid-konjugatet er mellom 1:5 og 5:1 (vekt/vekt) eller mellom 1:1 og 1:4, 1:2 og 1:3,5 eller rundt 1:3 (vekt/vekt).

10. Immunogent preparat ifølge et hvilket som helst av kravene 1-9, som omfatter et N. meningitidis serogruppe B ytre membran vesikkelpreparat eller kapselsakkarid.

11. Vaksine, k a r a k t e r i s e r t v e d at den omfatter det immunogene preparat ifølge hvilket som helst av kravene 1-10 og en farmasøytisk akseptabel bærer.

12. Vaksinesett for samtidig eller sekvensiell administrering,

k a r a k t e r i s e r t v e d at det omfatter to multi-valente immunogene preparater for å gi beskyttelse i en vert mot sykdom forårsaket av Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, Haemophilus influenzae og Neisseria meningitidis, hvor nevnte sett omfatter en første beholder omfattende:

tetanus-toksoid (TT),

difteri-toksoid (DT), og

helcelle eller acellulære pertussis-komponenter

og en andre beholder omfattende:

det immunogene preparat ifølge et hvilket som helst av kravene 1-10.

13. Fremgangsmåte for fremstilling av vaksinen ifølge krav 11,

k a r a k t e r i s e r t v e d at den omfatter trinnet med å blande det immunogene preparat ifølge et hvilket som helst av kravene 1-10 med en farmasøytisk akseptabel bærer.

14. Immunogent preparat ifølge krav 1-10 for anvendelse ved behandling eller forebygging av sykdom forårsaket av Neisseria meningitidis infeksjon.