JP3436756B2 - 髄膜炎菌のクラスｉの外膜タンパク質のワクチン - Google Patents

髄膜炎菌のクラスｉの外膜タンパク質のワクチン

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 バクテリアの髄膜炎は、軟膜炎の中またはそれに隣接
するバクテリアの生長により引き起こされる中枢神経系
の炎症の病気である。髄膜炎は、子供および若い大人に
影響を与える急性感染症であり、そして他の因子のなか
でも、他のバクテリアおよびウイルスの病原体を包含す
る髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）により引き起
こされる。
髄膜炎菌は、莢膜または細胞壁の抗原の存在に依存し
て、血清学の群に細分される。現在認識されている血清
群は、血清凝集により分離されるように、Ａ、Ｂ、Ｃ、
Ｄ、Ｗ−１、Ｘ、Ｙ、Ｚ、および29Eを包含する。群
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ−135およびＹの血清群の特異性の原因
となる多糖類は精製された。
髄膜炎菌についての保菌者の割合は、病気の発生より
非常に高い。ある人は一時的保菌者であるが、他の人は
慢性の保菌者であり、多少連続的にあるいは時々の方法
で髄膜炎菌を放出する。髄膜炎菌の保菌者の状態は、免
疫化のプロセスであり、そしてコロニー化の２週以内
に、髄膜炎菌に対する抗体の産生は同定することができ
る。バクテリアの抗体は莢膜の多糖類および他の細胞壁
の抗原の両者に対する向けられるように思われる。
研究において、髄膜炎菌の外膜は３〜５の主要なタン
パク質を有し、主な41,000Mrまたは38,000Mrのタンパク
質は血清型特異的抗原決定基を有することが示された。
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドの電気泳
動ゲル（SDS−PAGE）上の外膜タンパク質のプロフィル
において、かなりな程度の菌株間の異質性が存在する。
ペプチドのマッピングの鎖により定められるように、タ
ンパク質は普通のペプチド構造に基づいて５つのクラ
ス、１〜５と表示する、からなる。異なる血清型の構造
の間である程度共有される46,000MrのクラスＩのタンパ
ク質に対して、バクテリアのモノクローナル抗体が産生
された。［フラッシ（Frasch）、C.E.ら（1985）p.63
3、「髄膜炎菌のワクチンにおける新しい発展（New De
velopments in Meningococcal Vaccines）」、G.K.
スクーッルニク（Schoolnik）ら（編）、病原性ナイセ
リア属（The Pathogenic Nisseria）アメリカン・ソ
サイアティ・フォー・マイクロバイオロジー（American
Society for Microbiology）、ワシントンD.C］。
群Ａ、Ｃ、Ｗ−135またはＹの骨髄炎菌の莢膜多糖類
を使用して、有機体に対するワクチンが開発された。こ
れらのワクチンは短い期間有効であったが、それらは免
疫学的メモリーを誘発せず、そして被検体はほぼ３年以
内に再びワクチン接種してそれらの抵抗性を維持しなく
てはならなかった。群Ｂの多糖類は免疫原性に劣り、そ
して首尾よいワクチンは産生されなかった。低い活性に
ついての可能な説明は、ヒトの組織、例えば、脳におい
て見いだされた交差反応性抗原により誘発される群Ｂの
多糖類に対する耐性であった。さらに、研究において、
群Ｂの骨髄炎菌の病気を有した患者の回復期の血清中の
バクテリアの抗体の大部分は外膜タンパク質に対して向
けられる。
群Ｂの髄膜炎菌の病気に対して保護するためのワクチ
ンは開発され、ここで外膜タンパク質（OMP）の非共有
結合の複合体および群Ｂの多糖類が投与された。ベウベ
リイ（Beuvery）ら（1983）インフェクション・アンド
・イミュニイー（Infect.Immun.）40:369−380。しかし
ながら、Ｂ多糖類は一時的IgM抗原の応答を誘発し、こ
の応答は免疫保護を与えない。さらに、菌株毎に髄膜炎
菌の外膜タンパク質において大きい抗原の多様性および
変動性が存在する。さらに、リポ多糖類はOMPの中に存
在し、そして同様によく抗原の変動性を示す。
とくに乳児および大人において、感染からの免疫性を
提供する髄膜炎菌の病気に対して、安全なかつ有効なワ
クチンが要求されている。
発明の要約 本発明は、分離した外膜の小胞（OMV）、髄膜炎菌（N
eisseria meningitidis）の実質的に純粋なされたクラ
スＩの外膜タンパク質（OMP）、クラスＩのOMPの断片お
よび髄膜炎菌（N.meningitidis）に対するバクテリアの
抗体の反応性の連続または不連続の、免疫原性および保
護的エピトープを含有する、クラスＩのOMPから誘導さ
れたオリゴペプチド、および髄膜炎菌（N.meningitidi
s）に対するワクチン接種のための分離したOMV、髄膜炎
菌のクラスＩのOMP、断片またはオリゴペプチドに関す
る。
分離したOMV、髄膜炎菌のクラスＩのOMP、それから誘
導された断片またはオリゴペプチドは、１価または多価
のサブユニットのワクチンを単独で、混合物で、あるい
は化学的接合体または遺伝子の融合体として使用するこ
とができる。好ましいワクチンにおいて、異なる疫学的
に関連する髄膜炎菌株を使用する。さらに、分離したOM
V、クラスＩのOMP、断片またはオリゴペプチドは髄膜炎
菌（N.meningitidis）の他の抗原と組み合わせて（混合
物、融合体または接合体として）使用することができ
る。例えば、それらは髄膜炎菌（N.meningitidis）の莢
膜のポリマーまたはオリゴマー（またはそれらの断片）
と組み合わせるか、あるいは異なるサブタイプのクラス
Ｉの外膜タンパク質（またはそれらのエピトープ）と組
み合わせて使用することができる。さらに、それらは他
の感染性バクテリア、ウイルス、真菌または寄生体の抗
原とともに用途することができる。クラスＩのOMPのＴ
細胞のエピトープは、また、定められ、そしてこれらは
他のワクチン成分と組み合わせて使用して、ワクチンに
対する保護的免疫応答を増強することができる。
本発明は、分離したOMV、クラスＩのOMP、断片および
オリゴペプチドを産生する方法、およびそれらを含有す
る種々のワクチン配合物に関する。分離したOMVのクラ
スＩのOMPは、クラス2/3の外膜タンパク質を発現しな
い、突然変異の髄膜炎菌株により産生することができ
る。断片は臭化シアンの切断および引き続く精製により
産生することができる。分離したOMV、クラスＩのOMP、
断片およびオリゴペプチドは、組み換えDNA技術、化学
的合成または化学的または酵素的切断により産生するこ
とができる。これらの材料は、引き続いて、キャリヤー
のペプチドまたはタンパク質に、髄膜炎菌（N.meningit
idis）の他の抗原に、あるいは他の微生物の抗原に、化
学的または遺伝子的カップリングにより接合または融合
して、多価の抗原の接合体または融合ペプチドまたはタ
ンパク質を産生することができる。それらは接合のため
に、例えば、アミノ酸の付加または他のカップリング基
により修飾することができる。ワクチン接種のために、
分離したOMV、クラスＩのOMP、断片またはオリゴペプチ
ドを記載した任意の形態で、必要に応じて添加剤、例え
ば、アジュバントとともに製剤学的に許容されうる賦形
剤中で配合することができる。
本発明は、また、クラスＩのOMP、断片またはオリゴ
ペプチドをエンコードする、分離した核酸に関する。核
酸は、分離したOMV、クラスＩのOMP、断片またはそれら
から誘導された任意のオリゴペプチドを産生する、適当
な発現系の中に組み込むことができる。これらの核酸
は、発現された融合ポリペプチドを含有するワクチン配
合物に対する免疫応答を増強するとき有用な、追加のポ
リペプチドをエンコードする配列を含有するように、遺
伝子の融合体として修飾することができる。さらに、髄
膜炎菌（N.meningitidis）のクラスＩのOMPは、他のグ
ラム陰性病原体のポリン（porin）タンパク質に対して
アミノ酸配列および構造が相同性であり、こうして本発
明のクラスＩのOMP、断片およびオリゴペプチドは他の
グラム陰性病原体のためのワクチンの開発を可能とす
る。
図面の簡単な説明 第１図。PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）により髄膜炎
菌のクラスＩの外膜タンパク質をエンコードする遺伝子
の増幅の概要。
第２図。いくつかの髄膜炎菌（N.meningitidis）のサ
ブタイプのクラスＩの外膜タンパク質のVR1（第１可変
領域）をエンコードする5'遺伝子配列。
第３図。いくつかの髄膜炎菌（N.meningitidis）のサ
ブタイプのクラスＩの外膜タンパク質のVR2（第２可変
領域）をエンコードする3'遺伝子配列。
第４図。菌株P1.7.16、P1.16およびP1.15からのクラ
スＩのタンパク質の予測したアミノ酸配列をスパニング
（spanning）する、固体のデカペプチドとモノクローナ
ル抗体との反応によるエピトープの走査。隣接するデカ
ペプチドは５アミノ酸残基だけ異なる。注解は、配列を
誘導した菌株、使用したmABおよびそのサブタイプの特
異性を示す。
第５図。可変領域VR1およびVR2に相当するオーバーラ
ッピングするデカペプチドの系列とモノクローナル抗体
との反応、隣接するペプチドは単一のアミノ酸残基だけ
異なる。注解は、配列を誘導した菌株、使用したmABお
よびそのサブタイプの特異性を示す。
第６図。髄膜炎菌（N.meningitidis）のクラスＩのOM
PサブタイプP1.7.16の可変領域のエピトープを発現する
組み換えフラジェリンの構成。
第７図。髄膜炎菌（N.meningitidis）のクラスＩのOM
PサブタイプP1.7.16の可変領域のエピトープを発現する
組み換えフラジェリンの構造。
第８図。組み換えフラジェリンの高性能液体クロマト
グラフィーの代表的なクロマトグラム。
第９図。組み換えフラジェリンのSDS−PAGEによる代
表的な分析。
第10図。CRM197に接合した髄膜炎菌（N.meningitidi
s）のクラスＩのOMPのエピトープからなる接合体の代表
的なウェスタンブロット分析。
第11図。髄膜炎菌（N.meningitidis）のクラスＩのOM
PサブタイプP1.7.16の推定上のコンフォメーション。
発明の詳細な説明 本発明は、分離したOMV、髄膜炎菌のクラスＩのOMP、
OPMの断片（例えば、臭化シアンの適用により調製し
た）および外膜タンパク質のエピトープを有するオリゴ
ペプチドからなるワクチン；クラス2/3の外膜タンパク
質を発現しない突然変異株を使用する、分離したOMV、
純粋なクラスＩの外膜タンパク質の調製；組み換えDNA
発現ベクター中のクローニングしたDNAの助けにより分
離した分かけての純粋なクラスＩの外膜タンパク質の調
製に関する。本発明は、また、分離したOMV、クラスＩ
のOMPまたはその一部分、クラスＩのOMPの遺伝子の融合
体、そのタンパク質またはエピトープを産生する目的で
遺伝子工学の適用；および短いペプチドをもつエピトー
プは合成的に調製することができるので、ペプチド合成
により多価のクラスＩの外膜ワクチンの調製に関する。
髄膜炎菌のクラスＩの外膜タンパク質は、適当なサブ
タイプのエピトープを含有する菌株が群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ
−135およびＹ菌株からのものであるどうかに無関係
に、菌株に対して強いバクテリアの免疫応答誘発ことが
明らかにされた。多糖類のワクチンは、ほとんどの血清
型に対して広い、広範な作用をもつワクチンとして、本
発明によるワクチンにより増強または置換することがで
きる。クラスＩの外膜タンパク質に対して特異的な保護
的バクテリアのモノクローナル抗体は、切断された断片
と、およびクラスＩの外膜タンパク質のアミノ酸配列を
使用して調製された短い合成ペプチドと強く反応する。
髄膜炎菌の病気は現在おもに群Ｂの髄膜炎菌により引き
起こされるので、そして群Ｂの髄膜炎菌の中に存在する
クラスＩの外膜タンパク質は、また、群Ａ、Ｃ、Ｗ−13
5、Ｙ髄膜炎菌の中に存在するので、髄膜炎菌（N.menin
gitidis）の群Ｂから誘導された１または２以上のクラ
スＩのOMPからなる本発明のワクチンは群Ａ、Ｃ、Ｗ−1
35およびＹにより引き起こされる病気を防止するとき有
効であるべきである。好ましくは、このようなワクチン
の調製は、疫学的基盤に基づいて選択した、少なくとも
２つの異なる免疫原性および保護的エピトープから出発
する。本発明によるワクチンは、例えば、OMV配合物中
にまたは１または２以上の仔ウシ腸ホスファターゼを産
生する突然変異株からの精製により得られる、少なくと
も１つのタンパク質、あるいは臭化シアンの断片化によ
り調製された少なくとも２つの断片、あるいは約10の主
要なエピトープ、または組み換えDNA技術を経る遺伝子
の発現により得られ、所望のエピトープを含有する、産
生物から選択した、少なくとも２つの合成ペプチドから
なる。広い領域の髄膜炎菌株に対する効能を最大とする
ために、異なる保護的エピトープの数が大きくなればな
るほど、ワクチンはよりよくなる。さらに、本発明によ
るワクチンは有利には髄膜炎菌ＡおよびＣまたは必要に
応じてＷ−135およびＹの多糖類および／または洗浄剤
を含有することができる。好ましくは、ＡおよびＣの多
糖類はタンパク質またはポリペプチドのキャリヤーに共
有結合でカップリングされる。これらのキャリヤーは、
例えば、次のものを包含する：分離したOMV、クラスＩ
のOMPのタンパク質、無毒の突然変異（CRM）、組み換え
サルモネラ属（Salmonella）フラジェリンおよびウイル
スの粒子、例えば、レトロウイルスのVP6タンパク質、
肝炎Ｂの表面抗原またはレトロウイルスのVR1およびVR2
のタンパク質。両者の両性イオン、カチオン、アニオン
および非イオンを発生する洗浄剤を使用することができ
る。このような洗浄剤の例は、ツビッタージェント（Zw
ittergent）３−10、ツビッタージェント（Zwittergen
t）３−14（Ｎ−テトラデシル−N,N−ジメチル−３−ア
ンモニア−１−プロパンスルホネート）、ツイーン（Tw
een）−20、デオキシ塩素酸ナトリウム、塩素酸ナトリ
ウムおよびオクチルグルコシドである。本発明によるワ
クチンは、また、吸収剤、例えば、水酸化アルミニウ
ム、リン酸カルシウム；または有利にはリン酸アルミニ
ウムを含有することができる。断片、タンパク質、ペプ
チドは、また、放出のために免疫刺激性複合体（ISCOM
S）、リポソームまたは微小球で処理することができる
および／またはアジュバントとしてまたは他のアジュバ
ントと組み合わせて使用することができ、こうしてより
大きい免疫原性が得られる。
本発明は、分離したOMV、実質的に純粋な髄膜炎菌の
クラスＩの外膜タンパク質（任意のサブタイプの）およ
びそのエピトープを含有するタンパク質の断片を包含す
る。断片は、髄膜炎菌（N.meningitidis）に対する保護
的バクテリアの抗体により境界されるエピトープを含有
する、25kD以下の分子量の部分であることができる。こ
れらは、少なくとも一部分がクラスＩのOMPのエピトー
プに相当するアミノ酸配列から構成される、タンパク質
分解の断片および合成オリゴペプチドを包含する。
分離したOMV、クラスＩのOMP、断片またはそれらから
誘導されたエピトープ含有オリゴペプチドは、自然の配
列と異なるが、本質的に生物学的に同等である、アミノ
酸配列から成ることができる。これらの配列は、機能的
に同等のアミノ酸残基が配列内の残基と置換されてサイ
レントの変化を生ずる配列を包含する。例えば、配列内
の１または２以上のアミノ酸残基は、機能的同等体とし
て作用し、サイレントの変更を生ずる、同様な極性の他
のアミノ酸により置換することができる。配列内のアミ
ノ酸のための置換基はアミノ酸が属するクラスの他の構
成員から選択することができる。例えば、非極性（疎水
性）のアミノ酸は、グリシン、アラニン、ロイシン、イ
ソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、ト
リプトファンおよびメチオニンを包含する。極性中性の
アミノ酸は、セリン、スレオニン、システイン、チロシ
ン、アスパラギン、およびグルタミンを包含する。帯電
した（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リジンおよび
ヒスチジンを包含する。負に帯電した（酸性）アミノ酸
は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を包含する。
さらに、分離したOMV、クラスＩのOMP、断片またはオ
リゴペプチドは、異なるサブタイプの他のクラスのクラ
スＩのOMP、Ｔ細胞のエピトープ、Ｂ細胞のエピトー
プ、キャリヤーのペプチドまたはタンパク質またはアジ
ュバントの分子を包含する他の分子へ接合するために修
飾することができる（例えば、カップリング基、例え
ば、アミノ酸のシステインおよび／またはリジンまたは
他の連鎖基および／またはスペーサー基の取り付けによ
り）。
詳細に下に記載するように、クラスＩのOMP、断片ま
たはオリゴペプチドはワクチンにおいて異なる形態（例
えば、単独で、混合物で、あるいは接合体および組み換
えDNAベクターから産生された遺伝子融合体として）で
使用することができる。これらの精製のために、材料は
髄膜炎菌（N.meningitidis）からの分離により、タンパ
ク質分解の消化により、化学的合成により、あるいは組
み換え分子としての発現により産生することができる。
分離したOMV、クラスＩのOMPおよび断片およびクラスＩ
のOMPのオリゴペプチドの産生の方法および使用を下に
記載する。
クラスＩのOMPのタンパク質のモデル化および構造の
分析は、いくつかのE.coliの外膜タンパク質についての
原理を使用して実施した。［ボウゲル（Vogel）、H.
ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー
（J.Mol.Biol.）、190:191（1986）；フェレンス（Fere
nce）、T.ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイ
オロジー（J.Mol.Biol.）、201、493（1988）およびト
マッセン（Tommassen）、J.、「メンブレン・バイオゲ
ネシス（Membrane Biogenesis）」、NATO ASIシリー
ズ（Series）H16、pp351、ニューヨーク州スプリンガー
−フェルラーグ（1988）］。クラスＩのOMPの誘導され
たアミノ酸配列を、モデル化の研究および比較のために
使用した。アミノ酸配列の相同性を他のグラム陰性バク
テリアと比較し、そして類似性をタンパク質の構造につ
いて確立した。露出した表面ループおよびトランスメン
ブレン構造は、これらのタンパク質と非常に類似した。
髄膜炎菌（N.meningitidis）の変動性および一定の領域
の保護的エピトープおよびに関する情報を使用して、ア
ミノ酸配列に基づいて、評価しそしてそれにについての
ワクチンの中に含めるべき病原性グラム陰性バクテリア
のための保護的エピトープが存在する場所を予測するこ
とができる。
分離したOMVの産生 OMVは、ベウベリー（Beuvery）ら（1983）、インフェ
クション・アンド・イミュニイー（Infect.Immun.）40:
369−380に記載されている断片化後、培養物の上澄み液
またはバクテリアの細胞から産生することができる。１
より多い髄膜炎菌からのタンパク質を有するOMVは、異
種タンパク質を発現するように操作した菌株から分離す
ることができる。
クラスＩのOMPおよびそのCNBr断片の産生および精製 クラスＩおよびクラス３の外膜タンパク質は、ベウベ
リー（Beuvery）E.C.ら、アントニエ・ワン・リーウベ
ンヘク・ジャーナル・オブ・マイクロバイオロジー（An
tonie wan Leeuvenhoek J.Microbiol.）52:232（198
6）に記載されているように、分離することができる。
クラス２または３のOMPを含有しない実質的に純粋なク
ラスＩのOMPの産生は、この方法により、クラス2/3のOM
Pを発現しない突然変異の髄膜炎菌株を使用して達成さ
れる。クラスＩのOMPの産生のための好ましい菌株は、C
BS 636.89として受託されたHIII5である。
断片は、淋菌のタンパク質についてティーアリンク
（Teerlink）T.ら、ジャーナル・オブ・イクスペリメン
タル・メディシン（J.Exp.Med.）、166:63（1987）に記
載されているように、臭化シアンの断片により産生する
ことができる。Ｎ−末端の断片はCB−１と呼び、そして
Ｃ−末端の断片はCB−２と呼ぶ。これらのCNBr断片は、
ビィダックス（VydaxR）またはアクアポル（AquaporR）
Ｒ−300カラムの逆相HPLCを経て、水／アセトニトリル
の勾配を使用して精製することができる。あるいは、断
片は多数の冷時のトリクロロ酢酸の沈澱により精製する
ことができる。これらの手順は妨害汚染物質（例えば、
緩衝液の塩、洗浄剤および断片の汚染物質）の95％より
多くを除去する。
クラスＩのOMPのエピトープを含有する断片およびオリ
ゴペプチドの調製 A.タンパク質分解の消化の調製 髄膜炎菌（N.meningitidis）に対するバクテリアの抗
体と反応性のエピトープを含有するオリゴペプチドは、
クラスＩのOMP、CB−１またはCB−２の断片をプロテア
ーゼ、例えば、エンドLys−Ｃ、エンドGlu−Ｃおよびブ
ドウ球菌属（staphylococcins）noV8−プロテアーゼで
消化することによって産生することができる。消化した
断片は、例えば、高性能液体クロマトグラフィー（HPL
C）技術により精製することができる。
B.化学的合成による調製 本発明のオリゴペプチドは、標準の固相ペプチド合成
［バラニイ（Barany）、G.およびメリフィールド（Merr
ifield）、R.B.、ザ・ペプチド（The Peptides）２:1
−284、グロス（Gross）、E.およびメイエンホウファー
（Meienhofer）、J.編、アカデミック・プレス（Academ
ic Press）、ニューヨーク］により、ｔ−ブチルオキ
シカルボニルアミノ酸およびフェニルアセトアミドメチ
ル樹脂［ミッチェル（Mitchell）、A.R.ら、ジャーナル
・オブ・オーガニック・ケミストリー（J.Org.Chem.）4
3:2845−2852（1978）］またはポリアミド支持体上の９
−フルオレニルメチルオキシカルボニルアミノ酸［ドリ
ランド（dryland）、A.およびシェパード（Sheppar
d）、R.C.、ジャーナル・オブ・ケミカル・ソサイアテ
ィー（J.Chem.Soc.）Perkin Trans.I、125−137（198
6）］を使用して合成することができる。あるいは、合
成ペプチドはペプスカン（pepscan）合成［ゲイセン（G
eysen）、H.M.ら、ジャーナル・オブ・イムノロジカル
・メソッズ（J.Immunol.Methods）03:259（1987）：プ
ロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、81:399
8（1984）］、ケンブリッジ・リサーチ・バイオケミカ
ルス（Cambridge Research Biochemicals）、英国ケ
ンブリッジによるか、あるいは標準の液相ペプチド合成
により調製することができる。オリゴペプチドの免疫学
的性質を実質的に低下させない他の方法においてアミノ
酸の欠失または置換（および伸長およびアミノ酸への付
加を包含する）。
C.組み換えDNA技術による調製 クラスＩのOMP、およびクラスＩのOMPのエピトープを
示す断片およびオリゴペプチドは、組み換えDNA技術に
より産生することができる。一般に、これらは、所望の
OMP、［バーロウ（Barlow）ら、（1989）モレキュラー
・マイクロバイオロジー（Mol.Micro.）、３:131］断片
またはオリゴペプチドの配列をエンコードするDNA配列
を得ること、および適当なベクター／宿主の発現系の中
にクラスＩのOMPの１または２以上の同様なまたは異な
るDNA配列を導入し、そこでそれを発現することを伴
う。DNAは、クラスＩのOMPをエンコードする遺伝子また
はOMPの機能的エピトープをエンコードする遺伝子のセ
グメントから成ることができる。DNAは、髄膜炎菌（N.m
eningitidis）の他の抗原（例えば、同一のまたは異な
る他のクラスの外膜タンパク質）、あるいは他のバクテ
リア、ウイルス、寄生体または真菌の抗原をエンコード
するDNAに融合して、遺伝子的に融合した（共通のペプ
チド主鎖を共有する）多価の抗原をつくることができ
る。例えば、クラスＩのOMPの断片は、髄膜炎菌（N.men
ingitidis）の異なるサブタイプの他のクラスＩの外膜
タンパク質（または断片またはそのエピトープ）に融合
して、多数のクラスＩの外膜タンパク質の安定性の抗原
決定基からなる融合タンパク質を生成することができ
る。
遺伝子操作技術を、また、使用して、エンコードされ
たペプチドまたはタンパク質を特性決定し、修飾しおよ
び／または適合させることができる。例えば、部位特異
的突然変異誘発は、OMP断片を保護的ドメインの外側の
領域において修飾して、例えば、下位断片の溶解性を増
加して精製を容易にすることができる。DNAは、また、
種々の有機体中のOMP断片の過度の産生またはそれらの
組み合わせを行うように操作することができる。
クラスＩのOMP、断片またはオリゴペプチドをエンコ
ードするDNAは、バーロウ（Barlow）、A.K.ら、インフ
ェクション・アンド・イミュニイー（Infect.Immun.）5
5:2734−40（1987）および［バーロウ（Barlow）ら、モ
レキュラー・マイクロバイオロジー（Mol.Micro.）、
３:131（1989）］に記載されているように、合成または
分離しそして配列決定することができる。クラスＩのOM
Pの遺伝子は、バクテリアのDNAから、ムリス（Mullis）
およびファルーナ（Faloona）、（1987）Method.Enzym.
155:335−350の方法により、その中に開示されているプ
ライマー配列を使用して増幅することができる。異なる
サブタイプのクラスＩのOMPのための関係するDNA配列
は、記載される手順により得ることができ、そしてアミ
ノ酸配列を推定することができる。
種々の宿主−ベクターの系を使用して、本発明のオリ
ゴペプチドを発現することができる。主として、ベクタ
ー系は使用する宿主細胞と適合しなくてはならない。宿
主−ベクターの系は、は次のものを包含するが、これら
に限定されない：バクテリオファージDNA、プラスミドD
NAまたはコスミドDNAで形質転換されたバクテリア；微
生物、例えば、酵母菌のベクター系を含有する酵母菌；
ウイルス（例えば、ワクシニアのウイルス、アデノウイ
ルスなど）が感染した哺乳動物の細胞系；ウイルス（例
えば、バクロウイルス）が感染した昆虫の細胞系。これ
らのベクター系の発現要素は、それらの強さおよび特異
性が変化する。利用する宿主−ベクター系に依存して、
ある数の適当な転写および翻訳の要素のいずれをも使用
することができる。
クローニングしたDNAの効率よい発現を得るために、
プロモーターは発現系中に存在しなくてはならない。RN
Aポリメラーゼは、通常、プロモーターに結合し、そし
て遺伝子または連鎖した遺伝子の群および調節要素（オ
ペロンと呼ぶ）の転写を開始する。プロモーターはそれ
らの「強さ」、すなわち、転写を促進するそれらの能力
を変化する。強いプロモーターを使用して転写を高いレ
ベルにし、それゆえ、DNAの発現を高いレベルにするこ
とが望ましい。宿主細胞系に依存して、適当なプロモー
ターの任意の１つを使用することができる。例えば、E.
coli、そのバクテリオファージまたはプラスミド、プロ
モーター、例えば、lacプロモーター、trpプロモータ
ー、recAプロモーター、リボソームのRNAプロモータ
ー、およびコリファージアムダのPRまたはPLプロモータ
ー、およびは次のものを包含するが、これらに限定され
ない他のもの:lacUV5、ompF、bla、lppなど、を使用し
て、隣接するDNAセグメントの高いレベルの転写を指令
することができる。さらに、ハイブリッドのtrp−lacUV
5（tac）プロモーターまたは他の合成DNA技術を使用し
て、挿入されたDNAを転写することができる。
特異的に誘発されないかぎり、プロモーターの作用を
阻害しない、バクテリアの宿主細胞および発現ベクター
を選択することができる。ある種のオペロンにおいて、
特異的インデューサーの添加は挿入されたDNAの効率よ
い転写のために必要である；例えば、lacオペロンはラ
クトースまたはIPTG（イソプロピルオチオ−ベータ−Ｄ
−ガラクトシド）の添加により誘発される。種々のオペ
ロン、例えば、trpなどは異なる制御下にある。トリプ
トファンが生長培地中に存在しないとき、trpオペロン
は誘発される；そしてラムダのPLプロモーターは、温度
感受性ラムダのレセプターを含有する宿主細胞、例え
ば、cI857において温度を増加することによって誘発す
ることができる。このようにして、プロモーター−指令
の転写の95％より多くは非誘発細胞において阻害するこ
とができる。こうして、組み換えペプチドまたはタンパ
ク質の発現はコントロールすることができる。これは、
DNAの発現産生物が宿主細胞に対して致死的であるか、
あるいは有害である場合、重要である。このような場合
において、形質転換体はプロモーターが誘発されないよ
うな条件下に培養することができる；次いで、細胞が生
長培地中で適当な密度に到達したとき、プロモーターは
タンパク質の産生のために誘発することができる。
１つのこのようなプロモーター／オペレーター系は、
「tac」またはtrp−lacプロモーター／オペレーター系
である［ラッセル（Russell）およびベンネット（Benne
t）、1982、遺伝子（Gene）20:2312−243;デベル（DeBo
er）、欧州特許出願第67,540号、1982年５月18日］。こ
のハイブリッドのプロモーターは、−35bo（−35領域）
のtrpプロモーターおよび−10bp［−10領域またはプリ
ブナウ・ボックス（Pribnow box）］のlacプロモータ
ー（RNAポリメラーゼ結合部位であるDNAの配列）を組み
合わせることによって構成される。トリプトファンのプ
ロモーターの強いプロモーター特性を維持することに加
えて、tacはまたlacリプレッサーによりコントロールさ
れる。
真核生物の宿主細胞中でクローニングするとき、エン
ハンサー配列（例えば、SV40 DNAの72bpの直列の反復
またはレトロウイルスの長い末端反復またはLTRなど）
を挿入して、転写効率を増加することができる。エンハ
ンサー配列は１組の真核生物のDNA要素であり、これら
の要素は付近の遺伝子に関するそれらの位置および向き
に対して比較的無関係の方法で転写の効率を増加するよ
うに思われる。遺伝子に対して直ぐ5'に位置しなくては
ならない古典的なプロモーター要素［例えば、ポリメラ
ーゼ結合部位およびゴウルドバーグ−ホグネス（Goldbe
rg−Hogness）の「TATA」ボックス］と異なり、エンハ
ンサー配列は真核生物の遺伝子から上流、その内部でま
たはそれより下流で機能する顕著な機能を有する；した
がって、挿入されたDNAに関するエンハンサー配列の位
置はそれほど臨界的ではない。
特異的開始シグナルは、また、原核生物の細胞中の効
率よい遺伝子の転写および翻訳に要求される。これらの
転写および翻訳の開始シグナルは、それぞれ、遺伝子特
異的メッセンジャーRNAおよび合成されるタンパク質の
量により測定したとき、「強さ」が変化することがあ
る。プロモーターを含有するDNA発現ベクターは、ま
た、種々の「強い」転写および／または翻訳の開始シグ
ナルの任意の組み合わせを含有することができる。例え
ば、E.coli中の効率よい翻訳は、リボソーム結合部位を
提供するために、開始コドン（ATG）に対して約７〜９
塩基5'のシャイン−ダルガルノ（Shine−Dalgarno）配
列を必要とする。こうして、宿主細胞のリボソームによ
り利用されうるSD−ATGの組み合わせを使用することが
できる。このような組み合わせは、は次のものを包含す
るが、これらに限定されない：コリファージラムダのcr
o遺伝子またはｎ遺伝子からか、あるいはE.coliのトリ
プトファンＥ、Ｄ、Ｃ、ＢまたはＡ遺伝子からのSD−AT
Gの組み合わせ。さらに、組み換えDNAにより産生された
SD−ATGの組み合わせまたは合成ヌクレオチドの組み込
みを包含する他の技術を使用することができる。
発現ベクター中へのDNAの挿入について記載されてい
る方法の任意のものを使用して、プロモーターおよび他
の遺伝子の制御要素をベクター内の特異的部位の中に結
合することができる。発現のための髄膜炎菌（N.mening
itidis）の配列をベクターのプロモーターおよび制御要
素に関して発現ベクター中の特定の部位に挿入すること
ができ、こうして減少DNA分子が宿主細胞の中に導入さ
れるとき、外来遺伝子の配列は宿主細胞により発現（す
なわち、転写および翻訳）されるようにすることができ
る。
組み換えDNAベクターは適当な宿主細胞（バクテリ
ア、ウイルス、酵母菌、哺乳動物細胞など）の中に形質
転換、形質導入またはトランスフェクション（ベクター
／宿主細胞の系に依存する）により導入することができ
る。ベクターを含有する宿主細胞は、ベクターの中に通
常依存する１または２以上の適当な遺伝子マーカー、例
えば、pBR322中のアンピシリン抵抗性またはテトラサイ
クリン抵抗性、または真核生物の宿主系中のチミジンキ
ナーゼ活性の発現に基づいて選択する。発現ベクターは
クローニングベクターは、通造マーカー機能を含有す
る、クローニングベクターから誘導することができる。
このようなクローニングベクターは、は次のものを包含
することができるが、これらに限定されない:SV40およ
びアデノウイルス、ワクシニアのウイルスのベクター、
昆虫のウイルス、例えば、バクロウイルス、酵母菌のベ
クター、バクテリオフォージのベクター、例えば、ラム
ダgt−WES−ラムダＢ、シャロン28、シャロン4A、ラム
ダ4A、ラムダgt−１−ラムダBC、ラムダgt−１−ラムダ
Ｂ、M13mp7、M13mp8、M13mp9、またはプラスミドDNAベ
クター、例えば、pBR322、pAC105、pVA51、pACYC177、p
KH47、pACYC184、pUB110、pMB9、pBR325、ColE1、pSC10
1、pBR313、pML21、RSF2124、pCR1、RP4、pBR328など。
DNAインサートを含有する発現ベクターは、３つの一
般的アプローチにより同定することができる：（１）挿
入された遺伝子に対する相同性の配列からなるDNA−DNA
のハイブリダイゼーション；（２）「マーカー」遺伝子
機能（例えば、抗生物質に対する抵抗性、形質転換表現
型、チミジンキナーゼ活性など）の存在または不存在；
および（３）遺伝子産生物の生理学的免疫学的または機
能的性質に基づく挿入された配列の発現。
所望のクラスＩのOMPのアミノ酸配列を発現する推定
上の組み換えクローンがいったん同定されたなら、遺伝
子産生物は次のようにして分析することができる。免疫
学的分析は本質的に重要である。なぜなら、究極の目標
は遺伝子産生物をワクチン配合物中でおよび／または診
断のイムノアッセイにおいて抗原として使用することで
あるからである。を発現するされたペプチドまたはタン
パク質は髄膜炎菌（N.meningitidis）に対するバクテリ
アの抗体と免疫反応性であるべきである。この反応性は
標準の免疫学的技術、例えば、ラジオイムノ沈澱、ラジ
オイムノ競争、ELISAまたはイムノブロットにより実証
することができる。
いったん遺伝子産生物がクラスＩのOMPの断片または
その機能的エピトープを含有するオリゴペプチドと同定
されると、それは標準の方法、例えば、クロマトグラフ
ィー（例えば、イオン交換、親和性および大きさ決定の
カラムクロマトグラフィー）、遠心、示差的溶解度によ
るか、あるいは精製またはタンパク質についての任意の
他の標準の技術により分離および精製することができ
る。原核生物の細胞からの異種タンパク質の精製のため
のいくつかの技術が存在する。参照、例えば、オルソン
（Olson）、米国特許第4,518,526号、ウェツェル（Wetz
el）、米国特許第4,599,197号およびハング（Hung）
ら、米国特許第4,734,362号。しかしながら、産生し精
製した調製物は、ヒトに対して有害でありうる宿主の毒
素を実質的に含有べきではない。とくに、グラム陰性バ
クテリアの宿主細胞、例えば、E.coliまたはサルモネラ
属（Salmonella）中で発現されるとき、精製されたペプ
チドまたはタンパク質はエンドトキシンの汚染物質を実
質的に含有してはならない。
本発明のクラスＩのOMP、断片およびオリゴペプチド
は１価または多価のワクチンとして配合することができ
る。これらの材料は前述の方法により産生または分離さ
れたままで使用することができる。それらは、他の抗
原、例えば、他の抗原のＢ細胞またはＴ細胞のエピトー
プと混合、接合または融合することができる。さらに、
それらはオリゴペプチドについて後述するようにキャリ
ヤーのタンパク質に接合することができる。
ハプテンのオリゴペプチドを使用する（すなわち、同
種の抗体と反応するが、それ自体で免疫応答を引き出す
ことができないペプチド）とき、それは免疫原性のキャ
リヤー分子に接合することができる。免疫原性んキャリ
ヤーへの接合はオリゴペプチドを免疫原性とする。接合
は標準の手順により実施することができる。ハプテンの
オリゴペプチドのために好ましいキャリヤータンパク質
は、毒素、トキソイド、または破傷風、ジフテリア、百
日咳、シュードモナス属（Pseudomonas）、E.coli、ブ
ドウ球菌属（Staphylococcus）、および連鎖球菌属（St
reptococcus）の突然変異交差反応性物質（CRM）であ
る。とくに好ましいキャリヤーは、CRM197タンパク質を
産生するP.diphtheriae株C7（β197）から誘導された、
ジフテリア毒素のXRM197である。この菌株はATCC受け入
れ番号53281を有する。あるいは、キャリヤータンパク
質または他の免疫原性タンパク質の断片またはエピトー
プを使用することができる。例えば、ハプテンはバクテ
リアの毒素、トキソイドまたはCRMのＴ細胞エピトープ
にカップリングすることができる。参照、米国特許出願
第150,688号、1988年２月１日提出、発明の名称「接合
体ワクチンのためのキャリヤー分子としてのＴ細胞エピ
トープを表す合成ペプチド」、そのの教示を引用によっ
てここに加える。他のキャリヤーは、ロタウイルスVP
6、肝炎Ｂ表面抗原またはパルボウイルスVP1およびVP2
を包含する。
本発明のペプチドまたはタンパク質は、髄膜炎菌（N.
meningitidis）の抗原または他の有機体の抗原と組み合
わせて、多価のサブユニットのワクチンとして投与する
ことができる。他の有機体のあるものは、次のものを包
含する：インフルエンザ菌（H.influenzae）、髄膜炎菌
（N.meningitidis）、B.catarrhalis、淋菌（N.gonorrh
oeae）、E.coli、肺炎連鎖球菌（S.pneumoniae）など。
例えば、それらは髄膜炎菌（N.meningitidis）のオリゴ
サッカリドまたは多糖類の莢膜成分と組み合わせて投与
することができる。莢膜成分は血清学の群、例えば、
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、29EおよびW135の任意の
ものから誘導することができる。
異なるサブタイプのクラスＩの外膜タンパク質を使用
することができる。これらは組み合わせて使用して髄膜
炎菌（N.meningitidis）に対するバクテリアの抗体を引
き出すことができる。例えば、P1.7.16サブタイプのク
ラスＩの外膜タンパク質から誘導された断片を、多のサ
ブタイプ、例えば、P1.1、P1.1、16;P1.2;P1.6;P1.9;P
1.15;P.16;またはP1.4［アブディラヒ（Abdillahi）、
H.ら、1988 マイクロバイアル・パソゲネシス（Micro.
Pathog.）、４:27］の外膜タンパク質または外膜タンパ
ク質の断片と一緒に、あるいは髄膜炎菌の多糖類と混合
物の形態でまたは化学的接合体として一緒に使用するこ
とができる。他の外膜タンパク質のエピトープと組み合
わせた投与のために、それらは、別々に、混合物として
または接合体または遺伝子の融合ペプチドまたはタンパ
ク質として投与することができる。接合体は、タンパク
質の物質をカップリングする標準の技術またはサッカリ
ドのポリマーをタンパク質にカップリングする技術によ
り形成することができる。融合体は、記載したように、
組み換えDNA技術により調製した融合した遺伝子構成体
から発現させることができる。
前述したように、クラスＩのOMP、断片またはそれら
から誘導された任意のオリゴペプチドを他の病原性有機
体［例えば、バクテリア（マイクロカプセル化または非
マイクロカプセル化）、ウイルス、真菌および寄生体］
の抗原と組み合わせて使用することができる。他の有機
体の追加の例は、RSウイルス、ロタウイルス、マラリア
寄生中、およびクリプトコッカス・ネオフォルマンス
（Cryptococcus neoformans）を包含する。
ペプチドまたはタンパク質を単独でまたは記載した種
々の組み合わせでを有するワクチン組成物の配合におい
て、免疫原を適当な濃度に調節し、そして任意の適当な
ワクチンアジュバントを使用して配合する。適当なアジ
ュバントは、は次のものを包含するが、これらに限定さ
れない：表面活性物質、例えば、ヘキサデシルアミン、
オクタデシルアミン、オクタデシルアミノ酸エステル、
リソレシチン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブ
ロミド、メトキシヘキサデシルグリセロール、およびプ
ルロニックポリオール；ポリアミン、例えば、ピラン、
デキストラサルフェート、ポリIC、カルボポール；ペプ
チド、例えば、ムラミルペプチドおよび誘導体、ジメチ
ルグリシン、ツフトシン；油乳濁液；および鉱物ゲル、
例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムな
ど、リンフォカインおよび免疫刺激複合体（ISCOMS）。
免疫原は、また、リポソーム、微小球の中に組み込むこ
とができるか、あるいは多糖類および／またはワクチン
配合において使用する他のポリマーに接合することがで
きる。
ワクチンはヒトまたは動物に種々の方法で投与するこ
とができる。これらは、皮膚内、筋肉内、腹腔内、静脈
内、皮下、経口的および鼻内の投与のルートを包含す
る。
生ワクチン 本発明のペプチドおよびタンパク質は、生ワクチンと
して投与することができる。ワクチンの受容体に組み換
え微生物を接種し、この組み換え微生物は受容体におい
て増殖し、クラスＩのOMP、その断片またはオリゴペプ
チドを発現し、そして髄膜炎菌（N.meningitidis）に対
する免疫応答を引き出す。生ワクチンは次のものを包含
する：アデノウイルス、サイトメガロウイルスおよび好
ましくは、ポックスウイルス、例えば、ワクシニア［パ
オレッチ（Paoletti）およびパニカリ（Panicali）、米
国特許第4,603,112号］および弱毒化サルモネラ属（Sal
monella）株［ストッカー（Stocker）、米国特許第4,55
0,081号およびカーチス（Curtiss）ら、ワクチン（Vacc
ine）６:155−160（1988）］。さらに、クラスＩのOMP
のエピトープは弱毒化バクテリア株の鞭毛の中に組み込
むことができる。
生ワクチンはとくに有利である。なぜなら、それらは
実質的に長く持続する免疫性を与えることができる、延
長した刺激に導くからである。免疫応答が引き続く髄膜
炎菌（N.meningitidis）の感染に対して保護的であると
き、生ワクチンそれ自体は髄膜炎菌（N.meningitidis）
に対する予防的ワクチンにおいて使用ことができる。
多価生ワクチンは、髄膜炎菌（N.meningitidis）の異
なるエピトープ（例えば、他のサブタイプまたはそのエ
ピトープからの外膜タンパク質）を発現する、１つまた
はいくつかの組み換え微生物から調製することができ
る。さらに、他の病原性微生物のエピトープはワクチン
の中に組み込むことができる。例えば、ワクシニアのウ
イルスは髄膜炎菌（N.meningitidis）のものに加えて他
のエピトープのための解読配列を含有するように操作す
ることができる。このような組み換えウイルスそれ自体
は多価ワクチンにおける免疫原として使用できる。ある
いは、各々が髄膜炎菌（N.meningitidis）の外膜タンパ
ク質の異なるエピトープおよび／または他の病気を引き
起こす微生物のエピトープの遺伝情報を指定する異なる
遺伝子の混合物を、多価ワクチンとして配合することが
できる。
不活性化ウイルスのワクチンを調製することができ
る。不活性化したワクチンは、通常化学的処理（例え
ば、ホルムルデヒドの処理）により、「殺されてい
る」、すなわち、感染性は破壊されている。理想的に
は、ウイルスの感染性は、ウイルスの免疫原性を有する
タンパク質に影響を与えないで、破壊される。不活性化
したワクチンをタンパク質を調製するために、所望のエ
ピトープを発現する組み換えウイルスを大量に培養によ
り増殖して、必要な量の関連する抗原を提供する。異な
るエピトープを発現する活性化したウイルスの混合物
は、「多価」ワクチンの配合のために使用することがで
きる。ある場合において、これらの「多価」の不活性化
ワクチンは好ましくは生ワクチン配合物である。なぜな
ら、潜在的な困難が一緒に投与した生ワクチンの相互の
干渉から生ずるからである。いずれの場合においても、
不活性化したウイルスまたはウイルスの混合物を適当な
アジュバント中で配合して、抗原に対する免疫応答を増
強することができる。適当なアジュバントは次のものを
包含する：表面活性物質、例えば、ヘキサデシルアミ
ン、オクタデシルアミノ酸エステル、オクタデシルアミ
ン、リソレシチン、ジメチル−ジオクタデシルアンモニ
ウムブロミド、N,N−ジコクタデシル−N',N'−ビス（２
−ヒドロキシエチル−プロパンジアミン）、メトキシヘ
キサデシルグリセロール、およびプロンポリオール；ポ
リアミン、例えば、ピラン、デクストランサルフェー
ト、ポリIC、カルボポル；ペプチド、例えば、ムラミル
ペプチドおよびその誘導体、ジメチルグリシン、ツフチ
シン；油乳濁液；および鉱物ゲル、例えば、水酸化アル
ミニウム、リン酸アルミニウム、およびリンフォカイ
ン。
例示 実施例1:クラスＩのOMPに対するモノクローナル抗体お
よびそれらの活性 種々の髄膜炎菌のクラスＩの外膜タンパク質に対する
タイプ特異的モノクローナル抗体を調製した。これらの
モノクローナル抗体は、次のサブタイプを認識する:P1.
1;P1.2;P1.6;P1.7;P1.9;P1.10;P1.15;P.16;およびP1.17
（ここでP1.14と呼ぶ）。モノクローナル抗体は、RIV
M、オランダ国ビルトウベン、から「髄膜炎菌の血清型
決定のモノクローナルキット（Monolonal Kit Seroty
ping Meningococci）」として入手可能である。すべて
のこれらのモノクローナル抗体は、ウェスタンブロッテ
ィングにより試験したとき、SDS（ドデシル硫酸ナトリ
ウム）変性タンパク質と反応する。また、ある数のこれ
らのモノクローナル抗体は42kDのクラスＩの外膜タンパ
ク質の25kDのCNBr断片と反応することが明らかになっ
た。この結果が意味するように、クラスＩの外膜タンパ
ク質のエピトープは主として直線のタイプであり、した
がって合成ペプチドでコピーすることができる。出願人
が実施した試験の疫学の結果により、記載したモノクロ
ーナル抗体は群Ａ、Ｂ、Ｃの髄膜炎菌の大部分をサブタ
イピングすることができことを示し、これは制限された
異質性を示唆する。各クラスＩの外膜タンパク質は、ま
た、２つの個々のタイプ特異的エピトープを含有するよ
うに思われる［アブディラヒ（Abdillahi）およびプー
ルマン（Poolman）、マイクロバイアル・パソゲネシス
（Micro.Pathog.）、1988、４:pp.27−32;同上、FEMS
マイクロバイオロジー・イムノロジー（Micorobiol.Imm
unol.）47:pp.139−144］。
クラス2/3のを含有しない突然変異（HIII5）の培養か
ら由来する、精製したクラスＩの外膜タンパク質（下を
参照）サブタイプP1.7.16は、マウスにおいて2.5μｇの
投与量で1:64の血清の希釈物のバクテリアの抗体の応答
を誘発するように思われた。髄膜炎菌のクラスＩの外膜
タンパク質、クラス2/3の外膜タンパク質およびリポ多
糖類に対するモノクローナル抗体をバクテリアの作用に
関して比較した。クラスＩの外膜タンパク質に対するモ
ノクローナル抗体は、最強のバクテリアを有するように
思われた（参照、表１）。殺バクテリア性応答は、プー
ルマン（Poolman）、J.T.（1985）、スクールニック（S
choolnik,G.K.ら（編）、「病原性ナイセリア属」（Pat
hogenic Neisseriae）」ASNパブリケーション（Public
ation）、ワシントンD.C.、p.562。
これらのモノクローナル抗体の殺バクテリア活性は、サ
ウコウネン（Saukkonen）ら、1987、マイクロバイアル
・パソゲネシス（Microbial Pathoggen.）３:261のラ
ットの髄膜炎のモデルにおいて測定した生体内の保護的
活性とよく相関関係をもつように思われる。
実施例1A:多数のクラスＩの遺伝子を有する髄膜炎菌株
の構成 クローンにより染色体遺伝子の置換、わずかに異なる
変法、は、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）について記
載された。［ステイン（Stein）、D.C.、Clin.Microbio
l.Rev.２（Suppl.）、S146−S149（1989）］。この方法
は髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）においてクラ
スＩの遺伝子に適用することができることを、われわれ
は発見した。これは次の方法で実施した： （ｉ）株2996（サブタイプP1.2）のクラスＩの遺伝子を
ベクターpTZ19Rの中にクローニングした。［メッド（Me
ad）、D.A.ら、プロテイン・エンジニアリング（Protei
n Engineering）１、67（1986）］。完全な遺伝子は、
Xba I消化したベクターDNAに結合した2.2kbのXba I断片
上に位置する。
（ii）生ずるプラスミドを株H44−76（サプタイプP1.7.
16）の形質転換に使用した。アクセプターの株ん細胞を
プラスミドDNAとともにMg2+および通常の髄膜炎菌の培
地の存在下にインキュベーションした；それらを引き続
いて希釈し、そしてプレイティングし、そして生ずるコ
ロニーをP1.2特異的モノクローナル抗体に結合するそれ
らの能力について試験した。このような形質転換体はほ
ぼ10-3の頻度で見いだされた。それ以上の特性決定によ
り、H44/76クラスＩの遺伝子の置換が事実起こったこと
が示された。この方法の本質的特徴は、髄膜炎菌（N.me
ningitidis）中で複製することができない円形のプラス
ミドDNA分子上のドナー遺伝子の存在である。なぜな
ら、直線化DNAの使用は形質転換体をまったく産生しな
かったからである。
２つのクラスＩの遺伝子をもつ株の構成は、前述の方
法の変更により実施した。この目的で、P1.2クラスＩの
遺伝子をクローンのクラス５の遺伝子の中に挿入した。
クラス５の遺伝子の族は２つの特徴を有し、これらの特
徴はその遺伝子をこの構成にとくに適当なものとする。
［メイアー（Meyer）、T.F.およびバン・プッテン（Van
Putten）、J.P.M.、Clin.Microbiol.Rev.２（Supp
l.）、S139−S145（1989）：（ｉ）髄膜炎菌のゲノムの
中に４または５つのクラス５の遺伝子が存在する、およ
び（ii）これらの遺伝子の発現は実験室の条件下におい
て生長は不必要である。クラス５の遺伝子をH44/76株か
らクローニングし、そしてP1.2遺伝子をクラス５の遺伝
子の中にまたはそれに非常に密接して位置するSph I部
位の中に挿入した。生ずるハイブリッドのプラスミド、
pMC22、を株HIII5、H44.76のクラス３欠損突然変異、の
形質転換に使用した。P1.2特異的モノクローナル抗体と
反応するコロニーを分離し、そして特性決定した。10の
このような形質転換体のうちの９は、アクセプター株の
P1.16エピトープを失なっていることが発見された。こ
れが示すように、すべてのこれらのクラスの組み換えは
クラスＩの遺伝子の間でのみ起こって、サブタイプの置
換を生ずる。しかしながら、両者のクラスＩのサブタイ
プ、すなわち、P1.7.16およびp1.2を作った、１つの形
質転換体が発見され、プラスミドおよび染色体上のクラ
ス５の遺伝子の配列の間の組み換えが起こったにちかい
ないことを示唆する。これはウェスタンブロッティング
およびサザンブロッティングにより確証され、ここでウ
ェスタンブロッティングは両者のタイプのクラスＩのタ
ンパク質の存在を明らかにし、そしてサザンブロッティ
ングは第２のクラスＩの遺伝子の獲得を実証した。
この構成を他のクラスＩのサブタイプを使用して続け
ることによって、４または５つの異なるクラスＩの遺伝
子をもつ株をつくることができる。同一のクラス５の遺
伝子は各引き続く形質転換工程において使用ことがで
き、異なるクラス５の遺伝子は別々にクローニングし、
そして使用することができる。これらの組み換え株を使
用して、異なる精製したクラスＩのOMPの混合物を調製
することができる。
実施例1B:細菌学的培養物からの分離したOMVの精製 精製は、ベウベリイ（Beuvery）ら（1983）インフェ
クション・アンド・イミュニイー（Infect.Immun.）40:
369−380に従い実施する。
この培養は所望の野生型菌株、クラス2/3の外膜タン
パク質をもたない突然変異の髄膜炎菌株および／または
相同性および異種の組み換え微生物を使用して実施する
ことができ、前記組み換え微生物は、存在するオープン
リーディングフレームによるか、あるいはよらないでベ
クターを過度に産生することによって１または２以上の
所望の髄膜炎菌のクラスＩの外膜タンパク質および／ま
たはエピトープを発現するので、融合タンパク質または
交換したエピトープをもつタンパク質を調製することが
できる。
野生型菌株の容易に入手可能なものは、次の通りであ
る:H44/76（B:15:P1、7.16）［ホルテン（Holten）E.、
ノルウェー国、受け入れ番号CBS635−89］；187（B:4:P
1.7）［エチエンネ（Etienne）J.、フランス国］；M108
0（B:1:P1、1.7）［フラッシ（Frasch）、米国］；Swis
s4（B:4:P1、15）［ヒルシェル（Hirschel）B.、スイス
国］;B2106I（B:4:P1、２）［バーガー（Berger）U.、
西ドイツ国］；395（B:NT:P1、９）［ジョンスドッチル
（Jonsdottir）K.、アイスランド国］；M990（B:6:P1、
６）［フラッシュ（Frasch）C.、米国］；2996（B:2b:P
1、２）RIVM、オランダ国；M982（B:9:P1、９）［フラ
ッシュ（Frasch）C.、米国］；H355（B:15:P1、15）
［ホルテン（Holten）E.、ノルウェー国］；6557（B:1
7:P1、17）［ゾリンゲル（Zollinger）W.、米国］およ
びB40（A:4:P1、10）［アチトマン（Achtman）M.、西ド
イツ国］。クラス３の陰性突然変異の１例は、HIII5
（B:−:P1.16）受け入れ番号CBS636.89である。
これらの菌株は−70℃において予備培養物から震盪フ
ラスコの中に接種し、そしてこれらから40、150または3
50リットルの発酵培養物の中に移された。半合成培地は
次の組成を有した:L−グルタミン酸 1.3g/l、Ｌ−シス
テイン・HCl 0.02g/l、Na2HPO4・2H2O 10g/l、KCl
0.09g/l、NaCl 6g/l、NH4Cl 1.25g/l、MgSO4・7H2O
0.6g/l、グルコース 5g/l、Fe（NO3）３ 100μモル、
酵母透析物。
発酵槽中の培養の間、pHおよびPO2を監視し、そして
自動的にpH7.0〜7.2および空気飽和10％に調節した。細
胞を初期の定常期に生長させ、遠心および無菌の0.1モ
ルのNaClで洗浄することによって収穫し、そして−20℃
において貯蔵するか、あるいは凍結乾燥した。
実施例2:細菌学的培養物からのクラスＩの外膜タンパク
質の精製 この培養は所望の野生型菌株、クラス2/3の外膜タン
パク質を含まない突然変異の髄膜炎菌株および／または
相同性および異種の組み換え微生物を使用して実施する
ことができ、前記微生物は存在するオープンリーディン
グフレームおよび／または操作されたリーディングフレ
ームによるか、あるいはよらないでベクターを過度に産
生することによって、１または２以上の所望の髄膜炎菌
のクラスＩの外膜タンパク質および／またはエピトープ
を発現するので、融合タンパク質または交換されたエピ
トープをもつタンパク質を調製することができる。
野生型菌株の容易に入手可能なものは、次の通りであ
る:H44/76（B:15:P1、7.16）［ホルテン（Holten）E.、
ノルウェー国、受け入れ番号CBS635−89］；187（B:4:P
1.7）［エチエンネ（Etienne）J.、フランス国］；M108
0（B:1:P1、1.7）［フラッシ（Frasch）、米国］；Swis
s4（B:4:P1、15）［ヒルシェル（Hirschel）B.、スイス
国］;B2106I（B:4:P1、２）［バーガー（Berger）U.、
西ドイツ国］；395（B:NT:P1、９）［ジョンスドッチル
（Jonsdottir）K.、アイスランド国］；M990（B:6:P1、
６）［フラッシュ（Frasch）C.、米国］；2996（B:2b:P
1、２）RIVM、オランダ国；M982（B:9:P1、９）［フラ
ッシュ（Frasch）C.、米国］；H355（B:15:P1、15）
［ホルテン（Holten）E.、ノルウェー国］；6557（B:1
7:P1、17）［ゾリンゲル（Zollinger）W.、米国］およ
びB40（A:4:P1、10）［アチトマン（Achtman）M.、西ド
イツ国］。クラス３の陰性突然変異の１例は、HIII5
（B:−:P1.16）受け入れ番号CBS636.89である。
これらの菌株は−70℃において予備培養物から震盪フ
ラスコの中に接種し、そしてこれらから40、150または3
50リットルの発酵培養物の中に移された。半合成培地は
次の組成を有した:L−グルタミン酸 1.3g/l、Ｌ−シス
テイン・HCl 0.02g/l、Na2HPO4・2H2O 10g/l、KCl
0.09g/l、NaCl 6g/l、NH4Cl 1.25g/l、MgSO4・7H2O
0.6g/l、グルコース 5g/l、Fe（NO3）３ 100μモル、
酵母透析物。
発酵槽中の培養の間、pHおよびPO2を監視し、そして
自動的にpH7.0〜7.2および空気飽和10％に調節した。細
胞を初期の定常期に生長させ、遠心および無菌の0.1モ
ルのNaClで洗浄することによって収穫し、そして−20℃
において貯蔵するか、あるいは凍結乾燥した。
バクテリアの塊を、例えば、0.5モルのCaCl2、１％
（w/v）ツビッタージェント（Zwittergent）３−14（Zw
3−14）および0.14モルのNaCl、pH4.0の助けにより、10
0/gの凍結乾燥したバクテリアの塊を使用して抽出し
た。この懸濁液を室温において１時間撹拌し、次いで遠
心（１時間、3000×ｇ）し、その後懸濁液を無菌の方法
で収集した。20％（v/v）のエタノールを上澄み液に添
加し、次いで30分間撹拌し、産生物を遠心（30分、10,0
00×ｇ）、その後懸濁液を無菌的に収集した。次いで、
上澄み液をアミコン・ホロウ・ファイバー・システム
（Amicon Hollow Fiber System）（HID×50、カット
オフ50,000）中で透析濾過により濃縮し、そしてCaCl2
およびエタノールを除去した。濃縮物を0.1モルの酢酸
ナトリウム、25ミリモルのEDTA、0.05％のZw3−14、pH
6.0をもとの体積に希釈し、次いで希釈濾過により濃縮
した。この手順を再び５回反復した。最終濃縮物のpHを
4.0の値に調節した。20％（v/v）のエタノールを濃縮物
に添加し、そして30分間撹拌後、産生物を遠心した（30
分、10,000×ｇ）。全タンパク質をカラムクロマトグラ
フィーにより洗浄剤、例えば、Zw3−14の存在下に精製
する。しばしばセファローズ（Sepharose）Ｓ−300のゲ
ル濾過ならびにDEAEセファローズ（Sepharose）のイオ
ン交換を適用する［ベウベリイ（Beuvery）ら（1986）s
upra］。使用した方法、洗浄剤、カラムクロマトグラフ
ィーは唯一の適用可能な方法ではなく、しかも例であ
り、そして限定として見なしてはならない。
実施例3:クラスＩのOMPのペプチド断片の調製および特
性決定 臭化シアンを使用して、髄膜炎菌のクラスＩの外膜タ
ンパク質を調製した。精製したクラスＩまたはクラスＩ
または３の外膜タンパク質を70％（v/v）のギ酸中に取
り、そして室温において16時間10倍過剰のCNBrで処理し
た。CNBrおよびギ酸を蒸発により除去し、そして0.2モ
ルのトリスHCl、６モルの尿素溶液、pH7.2により置換し
た。上澄み液をセファクリル（Sephacryl）Ｓ−2000の
ゲル濾過により精製した。ベウベリイ（Beuvery）ら（1
986）supra。
CB2断片の酵素の消化 エピトープをさらに描写するために、髄膜炎菌のCB2
断片をエンドArg−Ｃ、エンドGlu−ＣまたはＶ−８で消
化し、そして生ずる断片をHPLCにより分離した。簡単に
述べると、３モルの尿素を含有する25ミリモルのホスフ
ェート/0.1ミリモルのトリス緩衝液（pH8.0）の1ml中の
20ナノモルのCB2断片を、37℃において14〜18時間、0.2
ナノモルのエンドArg−Ｃ（蒸留水中の14〜18mg/ml）ま
たは0.22ナノモルのエンドGlu−Ｃ（蒸留水中の14〜18m
g/ml）で消化した。生ずる消化した断片を逆相HPLCによ
りバイダク（Vydac）−C4カラムおよびトリフルオロ酢
酸−アセトニトリルの勾配を使用して分離した。エンド
Arg−Ｃ消化から溶離された主なピークは７〜9Kdalの見
掛けの分子量を有したが、エンドGlu−Ｖ−８後に観測
された主なピークは４〜6Kdalの見掛けの分子量を有し
た。分離したピークは、引き続いてウェスタンブロット
により、モノクローナル抗体のプール［アダム（Adam）
Ｉ、62−D12−８、MN5−C11GおよびMN14−C116）と反応
することが示された。
P1.16エピトープは、H44/76（B:15:P1、7.16）のクラ
スＩの外膜タンパク質のＣ末端のCNBr断片上に存在する
ように思われる。P1、16エピトープのさらに特性決定
は、17Kd（Ｎ末端）および25Kd（Ｃ末端）のアミノ酸配
列の決定により実施した。Ｃ末端の25KdをさらにVRプロ
テアーゼ、エンドLysC、エンドGlu−ＣおよびエンドArg
−Ｃで断片化した。P1、16モルクローナル抗体で陽性で
あった断片を出来るだけ配列決定した。得られた配列
は、次の通りである： 全タンパク質のＮ末端： 25KdのＣ末端のCNBr断片のＮ末端： P1、16モノクローナル抗体と反応する断片を、それぞ
れ、７〜9Kdおよび４〜6KdをもつV8プロテアーゼおよび
エンドArg−Ｃの断片を使用して分離した。ここのＮ末
端サザン分析は、次の通りである： V8 ７−9Kdの断片： Arg−Ｃ ４−6Kd断片 実施例4:クラスＩのOMP遺伝子のDNA配列 クラスＩのOMPのアミノ酸配列を、種々のサブタイプ
をもつ４つの髄膜炎菌のクラスＩのOMPの構造遺伝子の
ヌクレオチド配列から推定した。４つのアミノ酸配列と
の比較により、これらのエピトープの組成および位置を
予測することができた。さらに、P1、７およびP1、16エ
ピトープは、ペプチドの合成およびそれぞれのモノクロ
ーナル抗体の結合の実証により確証された。
クラスＩのOMPをラムダgt11の中にクローニングし［P
1、16について、ベウベリイ（Beuvery）ら（1987）イン
フェクション・アンド・イミュニイー（Infect.Immu
n.）55:2743−2740］そしてM13配列決定ベクター中でサ
ブクローニングし、そしてDNA配列を標準の連鎖停止ジ
デオキシヌクレオチド技術により決定した。
P1、16;P1、15、P1、7.16およびP1,2タンパク質につ
いての完全な誘導されたアミノ酸配列は、次の通りであ
る： 実施例5:異なる髄膜炎菌（N.meningitidis）血清型から
のクラスＩのOMP遺伝子のDNA配列決定 ムリス（Mullis）およびファローナ（Faloona）［メ
ソッズ・イン・エンジモロジー（Methods in Enzymol
ogy）155:335−50、1987］のポリメラーゼ連鎖反応（PC
R）技術を使用して、第１図に示す概要に従い、全体の
クラスＩのOMP遺伝子の特異的断片を増幅した。
プライマーをアプライド・バイオシステムス（Applie
d Biosystems）380BのDNA合成装置で合成し、そして標
準のPCRの30サイクルの増幅反応において、Taqポリメラ
ーゼを使用してサーマル・サイクラー（Thermal Cycle
r）［パーキン・エリマー・セツス（Perkin−Elmer Ce
tus）、コネチカット州ノーウォーク］において供給会
社の推奨に従い使用した。約1300、900および450bpの増
幅した断片を、第１図に示すプライマーの組み合わせか
らの各血清型のゲノムのDNA調製物から発生させた。使
用したプライマーは、次の配列を有した： 「非対称のPCR」の増幅において、370A型の自動化DNA
配列決定装置［アプライド・バイオシステムス（Applie
d Biosystems）、カリフォルニア州ふぉすたーして
ぃ］で使用した普遍蛍光配列決定プライマーに相当する
5'末端に18塩基の伸長を有するプライマーの100×過剰
を使用して、配列決定のための過剰の一本鎖の鋳型を合
成した。鋳型としてPCR発生した一本鎖のクラスＩの遺
伝子の断片との標準のジデオキシヌクレオチド連鎖停止
配列決定反応において、Taqポリメラーゼを使用した。
菌株H44/76（P1.7、16）、M1080（P1.1、７）、H355（P
1.15）、6940（P1.6）、6557（P1.14）、870227（P1.1
0）およびB40（P1.10）の遺伝子断片について誘導され
た配列を、第２図および第３図に示す。
実施例6:クラスＩのOMPのサブタイプのエピトープのア
ミノ酸配列の確証 クラスＩのOMP遺伝子の直接配列決定により確証され
たこれらの遺伝子から、アミノ酸24−34および176−187
に相当する配列は４つのクラスＩのOMP配列において顕
著に可変であることが推定された。これらの位置からの
３つのアミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端は、また、自
然のタンパク質配列におけるエピトープの安定性の表示
および予期せざる挿入または欠失を最大にさせる、これ
らのエピトープにおける可能な包含について考えられ
た。さらに、他のクラスＩのOMPのDNAおよびアミノ酸配
列をP1.7、16配列と比較して、最大の整列およびエピト
ープの予測を可能とすべきである。第１の可変領域のエ
ピトープおよび第２の可変領域のエピトープを、それぞ
れ、VR1およびVR2と呼ぶ。これらの領域はサブタイプの
エピトープをエンコードする。これはペプチドの合成お
よびペプチドとp1.2;P1.7;P1.15およびP1.16特異的モノ
クローナル抗体との反応により確証された。
５アミノ酸により食い違うオーバーラッピングするデ
カペプチドの完全な組を、P1.16タンパク質配列を使用
して調製した。抗P1.16モノクローナル抗体は、期待す
るように反応したP1.16からのデカペプチドYYTKDSTNNNL
と反応し、そして他のデカペプチドと反応しなかった。
（第４図）。
菌株H44/76（P1.7、16）、M50（P1.16）およびMC51
（P1.15）のクラスＩのOMPの領域24−34および176−187
において１つ（１）のアミノ酸配列をもつオーバーラッ
ピングするデカペプチドのちで、１より多いペプチドは
サブタイプ特異的モノクローナル抗体と反応した。たい
ていの場合において、これらのオーバーラッピングする
ペプチドの１または２以上の群は、サブタイプ特異的モ
ノクローナル抗体と、他のものより強く反応した（第５
図）。
これらのペプチドをVR1およびVR2エピトープとして表
示する。P1.7、16菌株において、配列YYTKNTNNNLが存在
し、残基180におけるＤのＮへの変化は抗体結合の減少
に多少の作用を有する。P1.15中の配列HYTRQNNTDVFは、
タンパク質中でP1.16エピトープと同一の相対的位置に
存在し、そして抗P1.15モノクローナル抗体への結合の
原因となる。AQAANGGASGはある結合を示し、そして１〜
３アミノ酸だけ下流のペプチドは、p1.7モノクローナル
抗体に対してさらにより大きい結合を示す。VR2の配列H
FVQQTPQSQPは抗P1.2モノクローナル抗体への結合の原因
となる。P1.16およびP1.15中のタンパク質の配列QPQVTN
GVQGNおよびPPSKSQPは、また、エピトープを表すと思わ
れる。
実施例6B:クラスＩのOMPの一定領域のエピトープの同定 表面のループを形成するペプチドを調製し、そして破
傷風トキソイドに接合した。バイオリンクス（Biolyn
x）4170自動化ペプチド合成装置［ファーマシア（Pharm
acia）/LKB］を、次の例外を除外して、連続的流れの固
相合成のために使用した。合成の最後のサイクルにおい
て、SAMA−OPfp（0.5ミリモル）［ドリジフォウト）J.
W.（1989）、Ph.D.Thesis、オランダ国レイデン］を１
−ヒドロキシベンゾトリアゾール（0.5ミリモル）の存
在下に30分間、ピペリジン処理の省略する標準のプロト
コル（すなわち、「Fmoc−脱ブロッキング工程」、これ
はこの場合において望ましくないＳ−脱アセチル反応を
引き起こすであろう）を使用してカップリングした。こ
れらをSAMA−ペプチドと呼ぶ。
TTに接合されたペプチドおよびそれらの表面領域の位置
は、次の通りである： 破傷風トキソイドへのSAMA−ペプチドの接合は、次の
ようにして実施した。DMF（100μｌ）中のＮ−スクシニ
ミジルブロモアセテート（4.7mg、10μモル）の溶液
を、0.1モルのリン酸ナトリウム緩衝液pH7.8（3.5ml）
中の破傷風トキソイド（TT）（20mg）の溶液と混合し
た。１時間後、1.8mlの反応混合物を、５ミリモルのEDT
Aを含有する0.1モルのリン酸ナトリウム（PE緩衝液）pH
6.1中で平衡化したセファデックス（Sephadex）PD−10
カラム［ファーマシア（Hharmacia）］を使用してゲル
濾過した。ブロモアセチル破傷風トキソイドを同一の緩
衝液で溶離し、そして3.5mlで集めた。。ブロモアセチ
ル化破傷風トキソイドの溶液を、SAMAペプチド（4.5m
g、３μモル）に添加し、そしてヘリウムで脱気した。
次に、150μｌの0.2モルのヒドロキシルアミン（PE緩衝
液中、pH6.1）を添加した。16時間後、残るブロモアセ
チル基を緩衝液、pH6.1（150μｌ）中の２−アミノエタ
ンチオール塩酸塩（４μモル）の添加によりブロッキン
グした。さらに16時間後、ペプチド−TT接合体をPD−10
カラムのゲル濾過により精製し、PE緩衝液、pH6.1で溶
離した。適当な分画を一緒にし、そして４℃において貯
蔵した。
免疫学的活性を決定するために、25μｇ（合計のタン
パク質）／投与のペプチド−TT接合体を、第０週および
第４週に６〜８週齢のNIH異系交配のマウスに皮下注射
した。（注：ワクチンLBV 017−TTおよびLBV 018−TT
を10μｇの合計のタンパク質／投与）で使用した。血清
を第１投与後６週で収集し、そしてELISAアッセイにお
いて抗体の応答について評価した［ベウベリイ（Beuver
y）ら（1983）インフェクション・アンド・イミュニイ
ー（Infect.immun.）40:369−380］。次の抗原をマイク
ロタイターのウェルの中にコーティングした：外膜タン
パク質（OMP）、精製したクラスＩのOMP［ポールマン
（Poolman）、J.T.ら（1989）インフェクション・アン
ド・イミュニイー（Infect.Immun.）57:1005］および非
接合ペプチド。血清のバクテリアの活性（BC）を、ま
た、測定した［［ポールマン（Poolman）、J.T.ら（198
5）supra］。
結果を下表２に表す。
これらのデータが示唆するように、髄膜炎菌（N.meni
ngitidis）のクラス１および２のOMPの試験した一定の
表面ループのうちで、ループ５は、髄膜炎菌（N.mening
itidis）の多数の菌株のクラス１および２と交差反応す
る抗体を産生する少なくとも１つの領域を表すように思
われる。
実施例7:髄膜炎菌のエピトープを発現する組み換えフラ
ジェリンの構成 クラスＩの髄膜炎菌のエピトープを含有するハイブリ
ッドのフラジェリンをつくるために、１系列のオリゴヌ
クレオチドを一次のタンパク質配列のデータおよびエピ
トープのマッピングのデータに基づいて表示した。外膜
P1.7.16のVR1およびVR2に基づく２つのオリゴヌクレオ
チドは、それらが単一または多数のコピーでサルモネラ
・ムエンヘン（S.muenchen）フラジェリンのための遺伝
子内のクローニング領域の中にクローニングすることが
できるように設計した。翻訳停止シグナルをオリゴヌク
レオチドの非解読鎖上に含めて、クローニングされたイ
ンサートのを発現するによるスクリーニングを促進し
た。
サルモネラ・メウンヘン（Salmonella meuchen）の
フラジェリンH1−ｄ（ATCCに受託された、受け入れ番号
67685）のための構造遺伝子の全体の解読領域およびプ
ロモーター領域を含有するプラスミドベクターpPX1650
を、フラジェリン遺伝子の３つのリーディングフレーム
の各々におけるオリゴヌクレオチドまたは遺伝子断片の
挿入に適する、いくつかの独特クローニング部位を含有
するように修飾した。まず、pPX1650をEcoR Vで消化
し、EcoR VはpPX1650を２回切断し、48塩基対を分離
し、そして再結合してプラスミドpPX1651を産生し、こ
のプラスミドは独特EcoR Vクローニング部位を有し、そ
してフラジェリンタンパク質において16アミノ酸の欠失
を生ずる。pPX1651は、H1−ｄフラジェリンに対して向
けられたポリクローナル抗体でプロービングしたウェス
タンブロット上のE.coliの組み換え体をスクリーニング
することによって同定した。pPX1651は、野生型のフラ
ジェリン（1650の）より小さいフラジェリンを有する、
いくつかの候補の間で同定され、そして配列決定により
評価した。第２に、pPX1651をBamH Iで制限し、オーバ
ーラッピングする末端をクレノー酵素でフィリングアウ
トしてえ、ベクターのポリリンカー領域におけるBamH I
制限酵素を除去した後、再結合した。最終の工程とし
て、生ずるベクターをEcoR Vで消化し、そして次のオリ
ゴヌクレオチドリンカーを挿入した： 候補を新しくつくられたBamH I部位についてスクリーニ
ングし、そしてBamH I部位を有するいくつかの候補を、
二本鎖DNA配列決定方法によりリンカーの向きについて
スクリーニングした。上の向きのリンカーを有する１つ
の候補は、pPX1647として保持された： プラスミドpPX1647（第７図）をBamH Iで消化し、そ
してVR1またはVR2のためにいずれかのオリゴヌクレオチ
ドをE.coli細胞の中にクローニングした。所望の組み換
え体についてのスクリーニングは、プラスミドのミニリ
ゼイトのDNAを適当な診断制限酵素で消化し、そしてSDS
−PAGE上の減少した移動度について特異鞭毛抗血清（H1
−ｄ）でハイブリッドの鞭毛をプロービングして発現に
ついてスクリーニングすることによって達成された。あ
る数の生ずるクローンはSDS−PAGE上の移動度の減少を
示し、VR1またはVR2のためのオリゴヌクレオチドの１ま
たは２以上の適切な挿入を示した。各々のいくつかをDN
Aの配列決定による分析のために保持した。クローンCB1
−２はVR1のオリゴヌクレオチドの２つのコピーの直列
の挿入から生じ、そしてクローンCB1−４は４つのオリ
ゴヌクレオチドの挿入から生ずる。同様に、CB2 ＰはV
R2オリゴヌクレオチドの単一のインサートを含有し、そ
してCB2 Ｗは期待したトリマーのインサートを示し、C
B2 Ｐクローンは単一の塩基対の変化を含有し、これは
発現されたVR2融合タンパク質中のLeuからPheへの変化
を生じ、そしてそれ以上の研究ために保持しなかった。
E.coli中の組み換えフラジェリンのクローンを、いずれ
かのVR1またはVR2のエピトープと反応することが知られ
ているモノクローナル抗体［アブディラヒ（Abdillah
i）およびプールマン（Poolman）、マイクロバイアル・
パソゲネシス（Micro.pathogenesis）4:27−32,1988;RI
VM、オランダ国］でプロービングしたモノクローナルAd
am−１（P1.7）およびMn14−C11−６（P1.7）は、VR1の
２または４の直列のインサートを含有するハイブリッド
のフラジェリンと反応するが、VR2を含有するクローン
と反応しない。両者のモノクローナルのCB1−４より弱
いCB1−２との反応は、エピトープの密度のためである
ようである。同様に、モノクローナル62（P1、16）およ
びMn14−c11−Ｇ（P1.16）は、CB2クローンと反応する
が、VR1インサートと反応しない。CB2 Ｐクローンは、
多分LeuのPheへの変化のために、いずれのVR2抗体とも
反応しない。
これらのクローンの各々を、H1−ｄ位置にTn10挿入を
有する、aroA S.dublin株（SL5927）の中に形質転換し
て、ハイブリッドの鞭毛の機能を検査した。４つのクロ
ーンの各々は運動性のバクテリアを生じた；形質転換体
の運動性は、クローンCB2 Ｐを包含する、対応するモ
ノクローナル抗体により阻害され、完全な鞭毛中のエピ
トープに対するVR2モノクローナルの親和性を示した。
この結果が示すように、エピトープは細胞の表面に露出
され、そして抗体はエピトープに対して接近可能であ
る。
両者のVR1およびVR2エピトープを含有するハイブリッ
ドのフラジェリンは、CB1−４またはCB2 ＷをBamH Iで
切断し、そして異種エピトープをクローニングすること
によってつくった。クローンCB12−７およびCB12−10
は、それぞれ、２または４のVR1の直列のインサートの
背後のVR2オリゴヌクレオチドの単一のコピーのインフ
レームの挿入から生ずる；クローンCB21−ＦはVR2の３
直列のコピーの背後のVR1エピトープの１つのコピーの
挿入から生ずる。CB12−７およびCB12−10はVR1モノク
ローナル抗体によってのみ認識され、そしてCB21−Ｆは
VR2モノクローナルによってのみ認識される。これらの
結果は、予測した配列を明らかにするDNAの分析と一緒
に、エピトープの密度が組み合わせたハイブリッドにお
いて低すぎることを示す。VR1およびVR2の両者のエピト
ープの密度が増加したハイブリッドのフラジェリンをつ
くるために、CB12−10をBamH Iで消化し、そしてVR2を
エンコードするオリゴヌクレオチドを挿入した。クロー
ン12−10−６はVR2エピトープの２つのそれ以上の直列
のインサートを含有し、VR1の４つの直列のコピーに引
き続いてVR2の３つのコピーが存在するハイブリッドの
フラジェリン分子を生ずる。第３図ａおよびｂに示すよ
うに、３つのハイブリッドのフラジェリンのワクチンの
候補は期待する分子の性質を有する。VR1の４つのコピ
ーを含有するフラジェリン（pCB1×４）は抗H1−ｄ（抗
フラジェリン）および抗VR1のモノクローナル抗体と反
応するが、抗VR2モノクローナル抗体と反応しない;VR2
の３つの直列のコピーを含有するフラジェリン（pCB2−
Ｗ）は抗H1−ｄおよび抗VR2抗体と反応するが、抗VR1と
反応しない;VR1のコピーおよびVR2の３コピーを含有す
る組み合わせ他ハイブリッドは両者の抗VR1および抗VR2
のモノクローナル抗体と反応する。組み合わせたハイブ
リッドは、非運動性の受容体S.dublin株の中に導入した
とき、運動性を特定した。
サブユニットのワクチンとして、目標は適当な最初の
ワクチンの候補を高い量および高い純度で得ることであ
る。適当なワクチンの候補は、モノクローナル抗体に対
する反応性および非運動性のサルモネラ属（Salmonell
a）宿主株の機能に基づいて、上のタイプの構成体から
選択することができる。サブユニットのフラジェリンの
ワクチンは親のフラジェリンのすべての機能の面を保持
することは必要ではないが、精製の目的で表面の局在化
を少なくとも保持すべきである。いくつかのサブユニッ
トのフラジェリンの髄膜炎菌のワクチンを、モノクロー
ナル抗体に対する反応性に基づいて前述のハイブリッド
の分子から選択し、そしてバクテリアの運動性の回復に
基づく表面の局在化を意味する。３つのフラジェリンの
ワクチン候補は、VR1の４つの直列のインサート、VR2の
３つの直列のインサート、または４つのVR1のインサー
トおよび引き続く３つのVR2のインサートを含有した。
フラジェリンはサルモネラ属（Salmonella）の主要なタ
ンパク質であるので、フラジェリンについて確立された
技術を使用するワクチン接種のための十分な材料を容易
に精製することができる［ロウガン（Logan）ら、ジャ
ーナル・オブ・バクテリオロジー（J.Bactriology）16
9:5072−5077、1987］。
実施例8:組み換えフラジェリン分子の初期の精製 ３つのハイブリッドのフラジェリンのワクチン候補お
よび野生型（pPX1650から誘導された）を、１リットル
のLBブロスを含有する４リットルのバッフル付きフェー
ンバッチ（Fernbach）フラスコの中に接種した。バクテ
リアの培養物を37℃において震盪（200rpm）しながら22
〜24時間インキュベーションした。これらの培養条件下
に、鞭毛の大部分をバクテリアの細胞表面からはぎ落と
し、そして上澄み液の培地中で局在化した。表面の物質
を得るために、鞭毛を６〜８リットルの培地から分離し
た。ワクチン接種のための精製したフラジェリン調製物
を得るために、鞭毛のフィラメントをバクテリアの培養
上澄み液から次の手順により収穫した：硫酸アンモニウ
ムを培養物の上澄み液に添加して、最終の溶液を50％の
飽和にした；この溶液を４℃においておだやかに数時間
撹拌し、そして沈澱した物質をGSAローター中で5000rpm
で30分間遠心することによって収集した。収集した硫酸
アンモニウム沈澱した物質をPBS中で再構成し、そしてP
BSに対する４℃において12〜15時間透析した。透析した
物質を100,000×ｇで１時間SW−27ローター中で高速度
の遠心にかけて、鞭毛のフィラメントを沈降させた。沈
降した物質は、主としてフラジェリンから成り、次の方
法によりさらに沈澱させた。
実施例9:組み換えフラジェリンのHPLC精製 高度に精製されたフラジェリンを調製するために、構
成体、とくにpCB12−10−６を発現するサルモネラ属（S
almonella）を前述したように生長させ、そして細胞を1
0,000Gにおいて沈澱させた。次いで、培養物の上澄み液
を50％の硫酸アンモニウムで沈澱させ、10,000Gで遠心
し、そして30mlのPBSの中に再懸濁した。再懸濁した沈
澱を６モルの尿素、１ミリモルのPMSF、２ミリモルのNE
M、および５ミリモルのEDTAを含有する10ミリモルのト
リス緩衝液（pH＝8.0）に対して４℃において一夜透析
した。次いで、透析した物質を２つのセファローズ（Se
pharose）のミニカラム（各々3.0mlの体積、4.0mlの溶
離液）に通過させた。カラムを６モルの尿素を含有する
10ミリモルのトリス（pH＝8.0）中の50ミリモルのNaCl
で、次いで６モルの尿素を含有する10ミリモルのトリス
（pH＝8.0）中の１モルのNaClで溶離（５×）した。50
ミリモルのNaClの最初の４つの溶離収集物（20ml）をプ
ールし、そして1.0mlの６モルの尿素中のアセテート緩
衝液（pH＝4.0）に対して室温において透析した。次い
で、透析した分画をTSK SP PWカチオン交換HPLCカラ
ム（75mm×300mm）上に適用した。カラムを６モルの尿
素を含有する10ミリモルのアセテート（pH＝4.0）から
成る移動相で溶離した。勾配０〜300ミリモルのNaClを
６モルの尿素を含有する10ミリモルのアセテート（pH＝
4.0）中で５〜30分の間隔で確立した。30分後、勾配は
次の５分にわたって６モルの尿素を含有する10ミリモル
のアセテート中の300ミリモルのから１モルのNaClまで
になった。フラジェリン構成体はほぼ24分で集められ、
これは約200ミリモルのNaClに相当する。分画をPBSに対
して透析し、そして物質について決定した純度は抗フラ
ジェリン抗体を使用するウェスタンブロットにより確立
された。代表的なHPLC分析およびSDS−PAGEは、それぞ
れ、第８図および第９図示されている。
実施例10:髄膜炎菌−フラジェリン糖接合体の調製 群Ｃの髄膜炎菌の莢膜多糖類（GCM CPS:ロット＃86
NM01）は、本質的にバンドル（Bundle）ら、ジャーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Che
m.）、249:4797−801、1974に従い調製した。
髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）株C11は、ウォ
ルター・リード・アーミイ・インスチチュート（Walter
Reed Army Institute）（ワシントD.C.）から入手
した。菌株をヒツジ血液寒天プレート上で２回予備培養
物し、次いで液状種培地ナイセリア属（Neisseria）化
学的に定められた培地、NCDM［ケンネイ（Kenney）ら、
Bull.W.H.O.37:469−73、1967］の接種に使用した。最
後に、発酵槽内の40lの液体培地を液体の予備培養物で
接種した。菌株の純度を各段階において検査した。遠心
後、上澄み液をセタブロン（Cetavlon）を0.1％の最終
濃度に添加することによって沈澱させ、そして不溶性複
合体は冷たい１モルの塩化カルシウム（CaCl2）の中に
再溶解した［ゴットシュリッヒ（Gotschlich）ら、ジャ
ーナル・オブ・イクスペリメンタル・メディシン（J.Ex
p.Med.）129:1349−65、1969］。エタノール（96％）を
25％（v/v）の最終濃度に添加した。１時間後、懸濁液
を集め、そしてその濃度を80％（v/v）に増加した。１
時間後、遠心（20分、5,000g）により沈澱が得られ、こ
れを連続的に無水エタノール、アセトン、およびジエチ
ルエーテルで洗浄し、次いで真空デシケーター内で五酸
化リン（P2O5）の存在下に一定重量に乾燥した。この粗
製CPSを−20℃において貯蔵した。
純粋な調製物を得るために、次いでCPSを酢酸ナトリ
ウムの緩衝液（飽和溶液の1.10希釈物、pH7.0）中に溶
解し、そして熱フェノールで４回抽出した［ウェストフ
ァル（Westphal）ら、Z.Naturforsch.7b:148−55、195
2］。0.1モルのCaCl2に対して一緒にした水性相の透析
および引き続く遠心（３〜５時間、100,000g）後、前述
したように、最終のエタノール沈澱は透明な上澄み液に
ついて実施し、そして生ずる沈澱を有機溶媒で洗浄し、
そして乾燥した。次いで、純粋なCPSを−20℃において
貯蔵した。
精製の各段階後、CPSを炭水化物のＮ−アセチルノイ
ラミン酸、NANA［スベンネルホルド（Svennerhold）、
バイオヒミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ（Biochi
m.Biophys.Acta）、24:604、957］、Ｏ−アセチル（ヘ
ストリン（Hesrtin）、ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）、180:249、194
9］、およびタンパク質（260nm）含量について分析し、
そしてその分子量をゲル濾過により検査した。
群Ｃの髄膜炎菌の莢膜多糖類（GCM CPS）を同時に解
重合し、そして水性緩衝液中の過ヨウ素酸ナトリウム
（NaIO4）の酸化を経て活性化した［アンダーソン（And
erson）ら、ジャーナル・オブ・イムノロジー（J.Immun
ol）、137:1181−６、1986;エビイ（Eby）ら、Pediat.R
es.20:308A、1986;アンダーソン（Anderson）ら、J.Ped
iatr.111（５）:644−50、1987;アンダーソン（Anderso
n）、米国特許第4,762,713号;1988］。反応を水性溶離
液中の高性能ゲル透過クロマトグラフィー（HPGPC）に
より、紫外線（UV）および屈折率（RI）の検出を使用し
て監視した。反応は停止し、そして活性化したオリゴサ
ッカリド（GCM OS）を水中の低圧ゲル透過（GPC）によ
り脱塩し、次いで凍結乾燥した。次いで、溶液を水中で
調製し、引き続いて一次的貯蔵のために凍結した。GCM
OSおよびフラジェリンpCB12−10−６を水性の中性の
緩衝液中で混合し、そして接合をシアノホウ水素化ナト
リウム（NaBH3CN）の添加により開始した［アンダーソ
ン（Anderson）、米国特許第4,762,713号;1988;米国特
許第4,673,547号、1987;米国特許第4,761,283号、198
8］。この反応は５日間実施し、その間HPGPCにより監視
した。それを最後に透析／遠心のマイクロコンセントレ
ーターにより停止した。最後の調製物は冷時にチメロサ
ルの存在下に貯蔵してバクテリアの生長を防止した。生
ずる糖接合体は発現されたVR1およびVR2の髄膜炎菌のエ
ピトープを免疫系に提示する機構を提供するばかりでな
く、かつまた髄膜炎菌のオリゴサッカリドのプレゼンテ
ーションのためのキャリヤー分子として働く。
接合体の調製において、次の条件を使用した。精製し
たフラジェリンのpCB12−10−６を15％のスクロース
（3.5mg/ml）中に溶解し、次いで−20℃において貯蔵し
た。GCM CPS（9.7mg;最終濃度:5mg/ml）を、暗所で撹
拌しながら、0.50モルのリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.
2〜6.5）中の100ミリモルのNaIO4により室温において酸
化した。アリコート（100μｌ）を規則的な間隔で取り
出し、反応をエチレングリコール（10μｌ）の添加によ
り停止し、そして分析は0.2モルのホスフェート−生理
的塩類緩衝液（PBS;0.2モルのリン酸ナトリウム、0.9％
のNaCl、pH7.8）中のウォーターズ（Waters）（マサチ
ュセッツ州ミルフォード）ウルトラヒドロゲル（Ultrah
ydrozelR）250＋120（カップリングされた２カラム;2×
300mm×7.8mm）のHPGPCにより、0.8ml/分の流速で、紫
外線（206nm）およびRI検出を使用して実施した。2.5時
間後、反応はエチレングリコール（反応体積の1/10）の
添加により停止し、そしてGCM OSを水中のバイオ−ラ
ド（Bio−Rad）（カリフォルニア州リッチモンド）のバ
イオ−ゲル（Bio−GelR）Ｐ−２（200〜400メッシュ、3
0cm×1.5cm）により約18ml/時間で脱塩した。分画を集
め（1.2m）そしてNANA炭水化物Ｎ−アセチルノイラミン
酸（NANA）［バリー（Barry）ら、ジャーナル・オブ・
ジェネラル・マイクロバイオロジー（J.Gen.Microbi
l.）29:335−52、1962］およびアルデヒド［ポロ（Porr
o）ら、アナリティカル・バイオケミストリー（Analyt.
Biochem.）118:301−306、1981］について分析した。陽
性の分画をプールし、そして凍結乾燥した。次いで、脱
塩したGMC OS（4.7mg）を水中に溶解し（10mg/ml）そ
して−20℃において凍結した。
GCM OSおよびpCB12−10−６の溶液を、HPGPC（それ
ぞれ、206および289nmにおける紫外線）により、凍結の
前および接合の前に分析した。溶離のプロフィルの正確
な類似性により確証して、貯蔵の間に消化は起こらなか
った。
GCM OS（2mg;最終濃度:2.6mg/ml）およびフラジェリ
ンpCB12−10−６（2.3mg;最終濃度:3mg/ml）をポリプロ
ピレン管内で0.4モルのリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.
0）中の混合し、そしてNaBH3CNを添加（12μモル）して
接合を開始した［アンダーソン（Anderson）、米国特許
第4,762,713号;1988;米国特許第4,673,547号；米国特許
第4,761,283号］。反応混合物は室温において１日間、
次いで35℃において４日間撹拌しないで放置した。この
反応はHPGPC（280nmにおける紫外線）異なる段階におい
て監視し、最後に透析／濃縮によりマイクロコンセント
レーターで停止した。最終濃度をNANA［バリー（Barr
y）ら、ジャーナル・オブ・ジェネラル・マイクロバイ
オロジー（J.Gen.Microbil.）29:335−52、1962］およ
び（0.12mg/mlにおいて0.09mg）およびタンパク質［ロ
ウリイ（Lowry）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）193:265−275、195
1］（1.12mg;1.45mg/ml）含量について分析した。次い
で、それを４℃においてチメロサル（0.01％、w/v）の
存在下に貯蔵してバクテリアの生長を防止した。
接合体の調製は、また、SDS−PAGE（硝酸銀の染色）
およびウェスタンブロット分析により検査した。いくつ
かの高分子量のバンドはゲル上に純粋なpCB12−10−６
のバンドより上にかつ積み重なったウェル付近に現れ、
後者は接合の間に交差連鎖が起こった証拠であった。ウ
ェスタンブロット分析において、各バンドは使用した抗
血清（抗GCM−VR1およびVR2）と反応性であることが示
され、接合の共有結合を証明した。
実施例11:CRMおよびウシ血清アルブミンへの髄膜炎菌の
ペプチドの接合 M20およびM21と表示するペプチドをABI型のペプチド
合成装置で固相合成によりtBoc化学を使用して産生し、
２官能性交差剤、スルフォスクシニミジル（４−ヨウド
アセチル）アミノベンゾエート［スルフォ（Sulfo）SIA
B;ピアース（Pierce）から購入した］を使用して発表さ
れた手順［ウェルトマン（Weltman）J.K.ら（1983）バ
イオ・テクニークス（Bio Technigues）１、148−15
2］の変更法に従い、CRM197［アンダーソン（Anderso
n）、米国特許第4,762,713号］にカップリングした。簡
単に述べると、CRM197をスルフォSIABにより活性化し、
SIABとCRM197のアミノ基との間のアミド結合を生じた。
活性化したCRM197から反応しなかった架橋剤をゲル濾過
により除去した後、カルボキシ末端のシステイン残基を
もつ連続スペーサー（下線をした文字で表されている）
を含有するペプチド（M20またはM21）を活性化CRMと混
合し、そして室温において２〜４時間インキュベーショ
ンした。反応後、接合した物質をPBSに対して４℃にお
いて広範に透析した。
M20ペプチド（VR2エピトープ）の配列は、次の通りで
ある： M21ペプチド（VR1エピトープ）の配列は、次の通りで
ある： 接合した物質をSDS−PAGEにかけ、PVDF膜［インモビ
リン（Immobilon）、ミリポア（Millipore）］に移し、
そしてVR1およびVR2エピトープを認識する特異的モノク
ローナル抗体と反応した。第10図ａおよび第10図ｂは、
VR1およびVR2特異的モノクローナル抗体（Adam Ｉ、G2
−D12−８（P1.7）、MN5−C11−Ｇ（P1.16）およびMN14
−C11−６（P1.7）］のプールに対して、M20およびM21
のCRM197接合体のウェスタンブロット分析を示す。
M20およびM21ペプチドに対する抗体の応答を酵素連鎖
イムノアッセイ手順によりアッセイするために、BSA接
合体は、ベルナトウィズ（Bernatowicz）およびマツエ
ダ（Matsueda）［アナリティカル・バイオケミストリー
（Analyt.Biochem.）155、95−102（1986）］に記載さ
れているように、異なる２官能性の架橋剤、Ｎ−スクシ
ニミジルブロモアセテートを使用することによって調製
した。タンパク質へのペプチドの共有結合のカップリン
グは、CRM197接合体について記載したように、電気泳動
にかけた試料のウェスタンブロッティングにより確証さ
れた。
実施例12:M20およびM21−CRM197接合体によるＴ細胞の
活性の保持 CRM197へのVR1およびVR2のエピトープの接合がCRM197
のＴ細胞の認識に悪影響を及ぼすかどうかを決定するた
めに、ビクスラー（Bixler）およびアタッシ（Atassi）
［Immunol.Commun.12:593、1983］に前に記載されたよ
うに、Ｔ細胞の増殖のアッセイを実施した。簡単に述べ
ると、SJL/jマウスをCFA中で乳化した50μｇの自然CRM1
97で免疫化した。７日後、リンパ節を取り出し、RPMI中
で培養し、そして種々の濃度のタンパク質（0.05〜100.
0μg/ml）およびペプチドで対抗した。３日間インキュ
ベーションした後、培養物を［3H］−チミジンで16時間
パルシングし、次いで計数のために収穫した。
表３に示すように、CRM197とCRM197−偽接合体とを比
較すると、接合手順それ自体はタンパク質のＴ細胞の認
識を変更しないことが示される。M20およびM21−CRM197
接合体により誘発されたＴ細胞の応答は、CRM197それ自
体により引き出される応答に本質的に等しいか、あるい
はそれより大きく、CRM197上のＴ細胞のエピトープの認
識はペプチドの接合により悪影響を及ぼされないことが
示される。対照物質のConA、LPSおよび破傷風トキソイ
ドに対する応答は期待される通りであった。
実施例13:接合体および組み換え髄膜炎菌のｂワクチン
の免疫原性 髄膜炎菌のVR1および／またはVR2のエピトープを発現
する組み換えフラジェリンを、実施例７、８および９に
記載するように、調製しそして精製した。さらに、髄膜
炎菌のエピトープのVR1およびVR2を表す合成ペプチド
を、実施例12におけるように、合成し、キャリヤー分子
のCRM197にカップリングし、そして精製した。これらの
物質の各を成分の各々について10または100μg/mlのタ
ンパク質濃度で、ワクチンを配合した。ワクチン組成物
は、また、リン酸アルミニウムを1mg/mlで含有するか、
あるいは特記しない限り、フロインド完全アジュバント
と配合したか、あるいは補助物質を含有しなかった。
免疫原性を評価するために、異系交配のスイスウェブ
スター（Swiss Webster）マウスを第０週および第２週
において１または10μｇのタンパク質／投与で筋肉内で
免疫化した。血清を２週の間隔で収集し、アッセイのた
めにプールし、そしてELISAにより外膜複合体（OMC）、
精製したOMP（M21−BSA）、BSAにカップリングしたVR2
ペプチド（M20−BSA）、野生型フラジェリン、およびCR
M197に対する抗体の活性についてスクリーニングした。
第６週に得られた血清について実施されたELISAの結果
を表４に示す。
11/100希釈のアッセイの下限またはそれより低いすべ
ての採血前の値。
２すべてのワクチンは、特記しない限り、1mg/mlのリ
ン酸アルミニウムを使用して配合した。
あるいは、種々のワクチンを６〜８週齢のNIH異系交
配のマウスにおいて免疫原性について評価した。マウス
を100μｇ（合計のタンパク質）／投与で第０週および
第４週にワクチンで皮下的に免疫化し、そして血清を第
６週に集めた。血清を、実施例６に記載するように、EL
ISAのアッセイにより抗原を使用して評価した。殺バク
テリア活性を実施例６におけるように測定した。結果を
表５に記載する。
VR1、VR2または両者のVR1およびVR2のカセットを含有
する組み換えフラジェリンは、精製したP1.16に対し
て、そしてより低い程度にOMCに対して交差反応性であ
る、抗体の応答を引き出すことにおいて有効であった。
10μｇのpCB1−４またはpCB2−ｗで免疫化した動物から
の血清は、それらのそれぞれのペプチド−BSA接合体に
結合しならびにP1.16およびOMCと交差反応する抗体を誘
発した。両者の髄膜炎菌のエピトープを含有する構成し
たpCB12−10−６を使用して、同様な結果が得られた。
さらに、各構成体は有意の抗フラジェリンの力価を同様
によく誘発した。対照的に、対照の野生型フラジェリン
はフラジェリンそれ自体に対して応答性の抗体のみを誘
発した。免疫化前に集めた血清は、評価した物質に対す
る前以て存在する応答を示さなかった。
データは、また、明礬または他のアジュバント、例え
ば、CFAを使用する組み換えフラジェリンの配合の有益
性を実証する。構成体pCB12−10−６をリン酸アルミニ
ウムを添加して、あるいは添加しないで配合した。表２
に示すように、pCB12−10−６は、単独で、ペプチドの
接合体ならびに精製したP1.16ならびにOMCと反応性の抗
体の応答を誘発することができた。対照的に、同一の構
成体は、明礬と配合したとき、等しい投与量でより大き
い抗体の応答を引き出すことができた。同様に、組み換
えフラジェリンpCB1−４およびpCB2−ｗは、また、CFA
と配合した。再び、等しいまたはより高い抗体力価はGP
Aの存在下に観測された。
髄膜炎菌のVR1およびVR2接合体を使用する免疫原性の
研究の結果を、また、表４に示す。両者のM20およびM21
−CRM197接合体ならびに等しい量の両者を含有する混合
物は、抗CRM197の応答ならびに抗クラスＩのOMPの応答
を誘発することができた。
これらの予備的データが示すように、キャリヤーに化
学的に接合しているか、あるいはキャリヤーに遺伝子的
に融合した、クラスＩのOMPの可変領域のエピトープは
免疫応答を引き出すことができる。新しいエピトープ−
キャリヤー接合体を、標準の技術を使用して、つくっ
て、ワクチン、例えば、１）より大きいエピトープ、
２）多数のエピトープの反復をもつペプチドおよび／ま
たは３）異なるキャリヤーの使用、に対する免疫応答を
増強することができる。
実施例14:髄膜炎菌ヒト−血清アルブミン糖接合体の調
製 GCM CPSを酸加水分解により解重合させ、そして得ら
れたGCM OSを引き続いて水性緩衝液中でNaIO4酸化を経
て活性化した。反応は水性溶離液中でHPGPCにより、紫
外線およびRIの検出を使用して監視した。反応の各々を
水中のGPC脱塩により追跡した。GPC OSおよびヒトアル
ブミン（HA）を混合し、そして本質的に実施例10におい
て髄膜炎菌−フラジェリン糖接合体について記載したよ
うに接合した。最後の調製物をバクテリアの生長を防止
するためにチメロサルの存在下で冷所で貯蔵した。
接合体の調製において、次の実験の条件使用した。ヒ
トアルブミン［HA;シグマ（SigmaR）、ミゾリー州セン
トルイス］を15％のスクロース中に溶解し（10mg/m
l）、次いで−20℃において貯蔵した。GCM CPS（ロッ
ト＃86 NM 01;106mg;最終濃度:10mg/ml）を0.1NのHCl
中で撹拌しながら50℃において加水分解した。アリコー
ト（25μｌ）を規則的な間隔で取り出し、反応を水酸化
ナトリウム（NaOH）の添加により停止し、そして記載し
たようにHPGPCにより分析した。３時間40分後、反応をN
aOHの添加により停止し、そしてGCM OSをGPCにより脱
塩した。分画を集め（1.2ml）、そして前述のように分
析した。陽性の分画をプールし、そして凍結乾燥した。
次いで、脱塩したGCM OS（89mg）を−20℃において貯
蔵した。GCM OS（11.8mg;最終濃度:5mg/ml）を0.05モ
ルのリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.2−6.5）中の２ミリ
モルのNaIO4で室温において暗所において撹拌しながら
酸化することによって、活性化したOSを調製した。30分
後、エチレングリコールの添加により反応を停止した。
HPGPCの分析は、活性化の間にOSの分子量の減少を示さ
なかった。次いで、脱塩および比色分析を前述したよう
に実施した。生ずる活性化GCM OS（8.8mg）を水中に溶
解し（10mg/ml）、そして−20℃で凍結した。
GCM OSおよびHAの両者の溶液を、凍結前および接合
の前に、HPGPC（それぞれ、206および280nmの紫外線）
により分析した。正確に類似する溶離のプロフィルによ
り確認されるように、貯蔵の間に劣化は起こらなかっ
た。
GCM OS（6mg;最終濃度:2.5mg/ml）およびHA（12mg;
最終濃度:5mg/ml）をポリプロピレン管内で0.4モルのリ
ン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）中で混合し、そしてNaB
H3CN（60μモル）を添加して接合を開始した［アンダー
ソン（Anderson）、米国特許第4,762,713号;1988;米国
特許第4,673,547号、1987;米国特許第4,761,283号、198
8］。反応混合物を、撹拌せずに、室温において１日
間、次いで15 35℃において４日間放置した。この反応
はHPGPC（28nmにおける紫外線）異なる段階において監
視し、最後に透析／濃縮によりマイクロコンセントレー
ターで停止した。最終濃度をNANA［バリー（Barry）
ら、ジャーナル・オブ・ジェネラル・マイクロバイオロ
ジー（J.Gen.Microbil.）29:335−51、1962］（2.07m
g、0.86mg/mlにおいて）および（0.12mg/mlにおいて0.0
9mg）およびタンパク質［ロウリイ（Lowry）ら、ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.C
hem.）193:265−275、1951］（9.51mg;3.96mg/mlにおい
て）の含量について分析した。次いで、それを４℃にお
いてチメロサル（0.01％、w/v）の存在下に貯蔵してバ
クテリアの生長を防止した。
接合体の調製は、また、SDS−PAGE（硝酸銀の染色）
およびウェスタンブロット分析により検査した。拡散の
バンドはゲル上に現れ、純粋なHAより有意に広い分子量
の範囲をカバーした。ウェスタンブロット分析におい
て、このバンドは使用した抗血清（抗GCM）と反応性で
あることが示され、接合の共有結合を証明した。
実施例15:髄膜炎菌のオリゴサッカリド−組み換えフラ
ジェリンのワクチンの免疫原性 髄膜炎菌のオリゴサッカリド−組み換えフラジェリン
のワクチンを、前述したように調製し、そして100μｇ
のタンパク質/mlで配合した。また、糖接合体に加え
て、リン酸アルミニウムを1mg/mlまたはフロインド完全
アジュバントを含有するワクチン組成物を調製した。
免疫原性を評価するために、異系交配のスイスウェブ
スター（Swiss Webster）マウスを第０週および第２週
において10μｇのタンパク質で筋肉内で免疫化した。血
清を第０、２週で集め、次いで１週の間隔で第６週まで
集めた。収集後、プールした血清試料をELISAによりヒ
ト血清アルブミン、OMC、P1.16、CB1およびCB2−BSA接
合体およびフラジェリンに対する髄膜炎菌Ｃオリゴサッ
カリド接合に対する抗体の活性についてアッセイした。
MenC−CB12−106糖接合体は、組み換えフラジェリン
中で発現されたオリゴサッカリドおよび髄膜炎菌のＢ
OMPエピトープの両者と反応性の免疫応答を引き出すこ
とにおいて有効であった。表5Bに示すように、研究に入
ってから３週程度に短い期間で、完全フロインドアジュ
バント中の１μｇのMenC−CB12−106で免疫化したマウ
スはMenC−HSA、OMPおよび両者のCB1およびCB2のエピト
ープに対する検出可能な抗体を有した。さらに、すべて
のMenC−CB12−106の調製物は、アジュバントに無関係
に、MenC−CRM197で免疫化後観測される応答より大き
い、MenC−HSAに対する抗体の応答を引き出した。
１ 初期の採血前の（第０週）試料についての力価は＜
100であった。
２ リン酸アルミニウムを1mg/mlでアジュバントとして
使用した。
実施例16:クラスＩのOMPのＴ細胞のエピトープおよびそ
れらの同定 有効なワクチンは１または２以上のＴ細胞のエピトー
プを含有しなくてはならない。タンパク質内のＴ細胞の
エピトープは、マーガリット（Margalit）ら、ジャーナ
ル・オブ・イムノロジー（J.Immunol）138:2213（198
7）またはロスバード（Rothbard）およびタイラー（Tay
lor）、EMBO ジャーナル（J.）７:93（1988）に記載さ
れているように、予測することができる。これらの予測
方法は、髄膜炎菌（N.meningitidis）株P1.7、16、P1.6
およびP1.5のクラスＩのOMPのアミノ酸配列に適用し
た。これらの方法により同定される潜在的Ｔ細胞のエピ
トープを含有する配列のセグメントは、表６および７示
されている。予測されたペプチドを標準のFMOC手順によ
り合成し、標準の方法により精製し、そして表８に示す
ように同定された。
予測されたペプチドが実際にＴ細胞のエピトープを含
有するかどうかを決定するために、ヒト末梢血液のリン
パ球（PBL）を刺激するそれらの能力をリンパ球の増殖
アッセイにより試験した。簡単に述べると、末梢血液を
HLA型別正常のボランティアからか、あるいはMPC−２
［プールマン（Poolman）、J.T.ら、アントニエ・ヴァ
ン・リーウウェンヘク（Antonie van Leeuwenhoek）5
3:413−419、1987］、これはP1.16、15、クラス４のOMP
および群Ｃの多糖類を含有した、で前以て免疫化したボ
ランティアから集めた。リンパ球を末梢血液からフィコ
ル−ハイパーク（Ficoll−Hypaque）［ファーマシア・
ファイン・ケミカルス（Pharmacia Fine Chemicals）
AB、スウェーデン国ウップサラ］で分離し、そして10％
の熱不活性化しプールしたヒトAB血清を含有する、補充
したRPMI1640［ギブコ・ラボラトリーズ（Gibco Labor
atories）、スコットランド国パイスリイ］中の１×105
細胞／ウェルで培養した。培養物を種々の濃度の予測さ
れたＴ細胞のエピトープ（0.05〜10μg/ml）で対抗し
た。生体外の対抗後、培養物を６日間インキュベーショ
ンし、次いで0.5μCiの［3H］−チミジンでパルシング
（18時間）した。次いで、培養物を収穫し、そして液体
シンチレーションにより計数した。データを刺激指数と
して表し、ここで指数は抗原の存在下に得られたCPM対
抗原のの不存在下に得られたCPMの比として計算した。
表９に示すように、16の予測されたペプチドのうち10
はＴ細胞を刺激する多少の能力を示した。これらは、16
−34、47−59、78−90、103−121、124−137、151−15
8、176−185、223−245、276−291および304−322に同
定されたペプチドを包含する。ある場合において、ペプ
チドは両者の免疫化したならびに非免疫の個体において
応答を刺激した。非免疫の個体における応答は、前の無
症候性の感染に帰属させることができる。
領域176−185として同定されたＴ細胞のエピトープの
場合において、Ｔ細胞の応答の増強はモノクローナル抗
体MN5C11G（P1.16）の添加後観測された。簡単に述べる
と、PBLを生体外で領域175−185を含有する合成ペプチ
ドで対抗するか、あるいはMN5C11Gの変化する希釈物と
混合したこのペプチドで対抗した。表10に示すように、
Ｔ細胞の応答の増強はMN5C11Gの添加後に観測され、モ
ノクローナル抗体は領域176−185を認識したことが示さ
れ、そして免疫系へのペプチドのプレゼンテーションを
促進する。こうして、ＴおよびＢ細胞のエピトープは、
一致するか、あるいはクラスＩのOMP内の隣接する配列
上に見いだされることが確立された。
いくつかの場合においてＴ細胞系およびクローンは種
々のペプチドに対して応答する個体から確立された。簡
単に述べると、Ｔ細胞系は、分離したリンパ球を24ウェ
ルのプレート中で１×106細胞/mlで培養することによっ
て得られた。10％のヒト血清を補充したRPMI−1640の培
地は、また、12U/mlの組み換えIL−２［ベーリンガー
（Boehringer）］を含有した。さらに、５×104の相同
性の照射した（3,000R）抗原を表す細胞（APC）を、ま
た、各ウェルに添加した。ある場合において、APCはHLA
適合性ドナーから得た。系統から、Ｔ細胞のクローンを
制限希釈により0.5細胞／ウェルの頻度で分離した。ク
ローンは照射したAPCおよびIL−２（2U/ml）の存在下に
抗原による２週の刺激により維持した。クローンは本質
的に前述したようにリンパ球の増殖のアッセイにより試
験したがただしクローンは照射したAPCの存在下に１×1
04細胞／ウェルで培養した。
記載したようにして得られたクローンを、生体外で、
７つの異なる髄膜炎菌の株からのOMPで対抗した。表11
に示すように、クローンはＴ細胞のエピトープまたは検
査した７つのOMPに対して共通のエピトープを認識し
た。種々のペプチドに対するこれらのクローンの反応性
はまだ決定されていないが、それにもかかわらず、種々
の菌株の間のＴ細胞のエピトープの共通性を示す。ここ
でこれらのクローンは確立されそして同定されたので、
それらのペプチドの反応性は種々の用途のためのＴ細胞
のエピトープを示すであろう。
応答は次のようなスコアを有する：−、SI＜2;±、２＜
SI＜及び＋、SI＞３。
下線の領域はモノクローナル抗体MN5C11Gにより認識さ
れる配列を示す。
実施例17:クラスＩのOMPの膜のトポロジーのためのタン
パク質モデルの構成およびワクチンの開発のための他の
病原性グラム陰性ポリンタンパク質に対する比較 いくつかの大腸菌の外膜タンパク質の構造について認
識された原理を使用してモデルを構成した［ボウゲル
（Vogel）、H.ら（1986）supra;フェレンチ（Ferenc
i）,T.ら（1988）supra;およびトマッセン（Tommasse
n）、J.（1988）supra］。中心の仮定は、他の膜をスパ
ニングするタンパク質のセグメントはベータ−シートを
形成するということである。詳しくは、クラス１のタン
パク質の場合において、露出したトランスメンブレンの
セグメントにおける分割は、次の方法において到達し
た： １、 クラス１のタンパク質（サブタイプP1.16）のア
ミノ酸と淋菌のPIAおよびPIBタンパク質のアミノ酸配列
との比較［カボネッチ（Carbonetti）、N.H.ら（1987）
PNAS 84:9094;カボネッチ（Carbonetti）、N.H.ら（19
88）PNAS 85:6841;およびゴットシュリチ（Gotschlic
h）E.C.ら（1987）PNAS 84:8135］は34％の同一性を明
らかにする。このモデルにおいて、可変配列は表面の露
出された部分を形成し、これに対して保存された領域は
ほとんど外膜および周辺質の中に位置する。こうして、
後者の２つの領域はすべてのタンパク質の間に保存され
る残基の58％を構成する。
２、 親水性の最大はヒドロパシーのプロフィル［カイ
ト（Kyte）、J.ら（1982）ジャーナル・オブ・モレキュ
ラー・バイオロジー（J.Mol.Biol.）157:105］において
露出された領域に相当することが観測された。
３、 トランスメンブレンのセグメントは９−12塩基の
両極性のベータ−鎖を優先的に形成することができ、少
なくとも１つの側は完全に疎水性残基から成る。これら
の条件は、16の膜−スパニングセグメントのうちで12に
おいて満足される。
４、 周辺質の側における残基の数は最小となる。
第11図は、外膜中のクラス１のタンパク質のフォルデ
ィング（folding）のためのモデルを示す。示した配列
はサブタイプP1.16のためのものである。図面の上部は
表面の露出された領域を示すが、これに対して中央部分
は仮定したトランスメンブレンのセグメントを示し、そ
の長さは10に設定される。アミノ酸は交互することが示
されており、ここでそれらは両極性のベータ−鎖を形成
することができる。このモデルは８つの表面ループを含
有し、ここで第１および第４のループはタイプ特異的お
よび保護的可変領域のエピトープを含有する。これらの
エピトープは、ワクチンに配合するとき示されたよう
に、保護的免疫応答を引き出すことができる。ループ５
は一定であり、そして他のOMPに対する交差反応性抗体
を引き出すことが示され、そしてワクチンの配合に有用
である。
個々のタンパク質の１または２つの可変エピトープ領
域は、これらの膜タンパク質のいわゆる表面ループ上に
位置する。このようなポリンの疎塗膜タンパク質は２よ
り多い表面ループを含有する。これが意味するように、
異なるクラス１の外膜タンパク質の中にほぼ同一のアミ
ノ酸配列を有する表面ループが同様によく存在する。こ
れは、ワクチンの目的にクラス１の外膜タンパク質の共
通のペプチドを同様によく使用する道を開く。さらに詳
しくは、髄膜炎菌のクラス１の外膜タンパク質P1.16の
概略的二次元のモデルは第11図に図解されている。この
モデルは８つの表面ループを含有し、ここで第１および
代４のループは、菌株のサブダイプの結果に基づいて示
したように、タイプ特異的エピトープを含有する。第１
の表面ループは、前述の一定の領域を表す。ループ５の
一定領域に対する対抗は、髄膜炎菌（N.meningitidis）
OMP複合体と反応するように思われる。誘導されたばか
りの、クラス１のOMPのアミノ酸配列を髄膜炎菌（N.men
ingitidis）のクラスのOMP［ムラカミ、K.ら、（1989）
インフェクション・アンド・イミュニイー（Infect.Imm
un.）57:2318］そして淋菌（Neisseria gonorrhaeae）
のポリンPIAおよびPIBタンパク質と比較した。クラスＩ
のOMPのモデルについて使用したのと同様な原理で、配
列は次のように整列された： 構造の類似性はトランスメンブレンおよび表面ループ
の領域で示される。クラスＩのOMPについてここで入手
可能な情報および特定のポリンタンパク質のループ領域
のループの大きさ、位置、種間のアミノ酸の相同性また
は異質性に基づく情報を使用して、淋菌（N.gonorrhaea
e）を包含する他の病原性グラム陰性バクテリアのため
のワクチンの中に組み込むエピトープの予測は可能であ
る。クラスＩのOMPについて使用したのと同一の方法を
使用して、これらのエピトープはワクチンの目的につい
て評価することができる。
微生物の受託 髄膜炎菌（N.meningitidis）株H4476（B:15;P1.7、1
6）は、1989年12月11日にセントラール・ビューロウ・
ブーア・シンメルカルツレン（Centraal Bureau voor
Schimmelculturen）（CBS）、オランダ国バールンに
受託され、そして受入れ番号CBS 635.89を有する。髄
膜炎菌（N.meningitidis）クラス2/3のOMP欠乏突然変異
HIII−５は、1989年12月11日にCBS、オランダ国バール
ンに受託され、そして受入れ番号CBS 636.89を有す
る。
同等の実施態様 当業者は、ここに記載した発明の特定の実施態様と同
等の多くの実施態様を認識するか、あるいは日常の実験
を越えない実験を使用して確証することができるであろ
う。このような同等の実施態様は次の請求の範囲により
包含されることを意図する。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:36 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 1:42 Ｃ１２Ｒ 1:36） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:42） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:36） (31)優先権主張番号 ８９．０１６１２ (32)優先日 平成１年６月26日(1989．6．26) (33)優先権主張国 オランダ（ＮＬ） 微生物の受託番号 ＣＢＳ ６３５．８９ 前置審査 (73)特許権者 502272309 デ・スタート・デル・ネデルランデン・ ヴエルテゲンウールデイジ・ドール・ デ・ミニスター・ヴアン・ウエルジー ン、ボルクスゲゾンドハイド・エン・ク ルツール オランダ国3720ビーエイビルトホーベ ン・ピーオーボツクス１・アントニーバ ンレーウウエンホクラーン９ (72)発明者 セイド，ロバート・シー，ジユニア アメリカ合衆国カリフオルニア州94121 サンフランシスコ・ツウエンテイフイ フスアベニユー590 (72)発明者 パラデイソ，ピーター・アール アメリカ合衆国ニユーヨーク州14534 ピツツフオード・ギルフオードウエイ６ (72)発明者 ポールマン，ヤン・テイ オランダ国1151エイケイブレクインウオ ーターランド・レーテインデ８ (72)発明者 ホーゲルホウト，ペーター オランダ国2805エスゼツドゴウダ・イデ ンブルグストラート13 (72)発明者 ウイールツ，エマニユエル・ジエイ・エ イチ・ジエイ オランダ国3583エイチダブリユーユトレ ヒト・マウリツストラート106 (72)発明者 バン・デル・レイ，ペーター オランダ国3583エイエムユトレヒト・ア ドリアーンバンオスタデラーン124 (72)発明者 ヘツケルズ，ジヨン・エドワード イギリス国ハンプシヤーエスオー51 ６ ジーテイ・ロムゼイ・ウエストウエロ ウ・アランウエイ６ (72)発明者 クラーク，イアン・ニコラス イギリス国ハンプシヤー・サウサンプト ンエスオー１ ８デイアール・ロウナム ズ・フアーニイハースト アベニユー15 (56)参考文献 ＩＮＦＥＣＴＩＯＮ ＡＮＤ ＩＭＭ ＵＮＩＴＹ（1987）Ｖｏｌ．55，Ｎｏ. 11，ｐ．2734−2740 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 A61K 39/095 A61P 31/04 A07K 14/22 C12N 1/21 C12P 21/00 - 21/08

Claims (28)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】クラス2/3外膜タンパク質に対して陰性で
    ある組換えまたは突然変異髄膜炎菌株から単離された外
    膜小胞を含んでなり、該小胞が少なくとも１種の髄膜炎
    菌性クラスＩ外膜タンパク質を含んでなり、該髄膜炎菌
    性クラスＩ外膜タンパク質が で示されるアミノ酸配列のいずれか１つからなることを
    特徴とする髄膜炎菌性疾患に対して有効なワクチン。
  2. 【請求項２】髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）のク
    ラスＩ外膜タンパク質の実質的に純粋なフラグメントで
    あって、該タンパク質が請求項１に記載のアミノ酸配列
    のいずれか１つからなり、CNBr切断により製造され且つ
    約25kDの分子量を有することを特徴とするフラグメン
    ト。
  3. 【請求項３】髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）のク
    ラスＩ外膜タンパク質の実質的に純粋なフラグメントで
    あって、該タンパク質が請求項１に記載のアミノ酸配列
    のいずれか１つからなるCNBr切断により製造され且つ約
    17kDの分子量を有することを特徴とするフラグメント。
  4. 【請求項４】YYTKNTNNNL,NFVQQTPQSQP,YYTKDTNNNL,YTKD
    TNNNLT,TKDTNNNLTL,KDTNNNLTLV,AQAANGGASG,QAANGGASG
    Q,AANGGASGQV,ANGGASGQVK,NGGASGQVKV,GGASGQVKVT,GASG
    QVKVTK,ASGQVKVTKV,SGQVKVTKVT,PAHYTRQNNT,AHYTRQNNT
    D,HYTRQNNTDVF,TRQNNTDVFV,RQNNTDVFVP,QNNTDVFVP,QNNT
    DVFVPA,NNTDVFVPAV,ANVGRNAFELFLIGSATSDEAKG,NIQAQLTE
    QPQVTNGVQGN,TKISDFGSFIGFK,VSVAGGGASQWGN,TLRAGRVANQ
    FDDASQAIN,DSNNDVASQLGIFK,GGFSGFSG,LSENGDKAKTKNSTTE
    およびVPRISYAHGFDLIERGKKGよりなる群から選ばれるア
    ミノ酸配列を有する実質的に純粋なオリゴペプチド。
  5. 【請求項５】請求項１に記載のアミノ酸配列のいずれか
    １つからなることを特徴とする実質的に純粋な髄膜炎菌
    性クラスＩ外膜タンパク質。
  6. 【請求項６】キヤリヤーポリペプチドに融合した、抗髄
    膜炎菌性外膜タンパク質抗体が結合するペプチドを含ん
    でなり、該ペプチドがYYTKNTNNNL,HFVQQTPQSQP,YYTKDTN
    NNL,YTKDTNNNLT,TKDTNNNLTL,KDTNNNLTLV,AQAANGGASG,QA
    ANGGASGQ,AANGGASGQV,ANGGASGQVK,NGGASGQVKV,GGASGQVK
    VT,GASGQVKVTK,ASGQVKVTKV,SGQVKVTKVT,PAHYTRQNNT,AHY
    TRQNNTD,HYTRQNNTDVF,TRQNNTDVFV,RQNNTDVFVP,QNNTDVFV
    P,QNNTDVFVPA,NNTDVFVPAV,ANVGRNAFELFLIGSATSDEAKG,NI
    QAQLTEQPQVTNGVQGN,TKISDFGSFIGFK,VSVAGGGASQWGN,TQRA
    GRVANQFDDASQAIN,DSNNDVASQLGIFK,GGFSGFSG,LSENGDKAKT
    KNSTTEおよびVPRISYAHGFDLIERGKKGよりなる群から選ば
    れることを特徴とする遺伝子融合ペプチドまたはタンパ
    ク質。
  7. 【請求項７】クラス2/3外膜タンパク質に対して陰性で
    あり且つ１つより多いサブタイプの髄膜炎菌性クラスＩ
    外膜タンパク質を発現する組換えまたは突然変異髄膜炎
    菌株から単離された外膜小胞を含んでなり、該小胞が１
    つより多いサブタイプの髄膜炎菌性クラスＩ外膜タンパ
    ク質を含んでなり、該髄膜炎菌クラスＩ外膜タンパク質
    が請求項１に記載のアミノ酸配列のいずれか１つからな
    ることを特徴とする髄膜炎菌性疾患に対して有効なワク
    チン。
  8. 【請求項８】ａ）請求項１に記載のアミノ酸配列のいず
    れか１つからなる実質的に純粋な髄膜炎菌性クラスＩ外
    膜タンパク質、 ｂ）CNBr、endoLys−Ｃ、endoAgr−Ｃまたはスタフイロ
    コツカスVR−プロテアーゼを用いて髄膜炎菌性クラスＩ
    外膜タンパク質を切断することにより製造される請求項
    １に記載の髄膜炎菌性クラスＩ外膜タンパク質のフラグ
    メント、および ｃ）YYTKNTNNNL,YYTKDTNNNLおよびHYTRQNNTDVFよりなる
    群から選ばれるアミノ酸配列を含んでなるペプチド よりなる群から選ばれる成分を含んでなることを特徴と
    する髄膜炎性疾患に対するワクチン。
  9. 【請求項９】クラスＩ外膜タンパク質、フラグメントま
    たはペプチドが、Ａ、Ｂ、Ｗ−135およびＹ多糖よりな
    る群から選ばれる髄膜炎菌性多糖と複合化している（co
    njugate）請求項８に記載のワクチン。
  10. 【請求項１０】クラスＩ外膜タンパク質、フラグメント
    またはペプチドが、キヤリヤータンパク質のＴ細胞エピ
    トープを含んでなるキヤリヤー分子に複合化している請
    求項８または９に記載のワクチン。
  11. 【請求項１１】製薬学的に許容しうる賦形剤中の、保護
    免疫応答を誘発するための請求項７〜10のいずれかに記
    載のワクチン。
  12. 【請求項１２】抗原性キヤリヤーポリペプチドと、 ａ）請求項１に記載のアミノ酸配列のいずれか１つから
    なる髄膜炎菌性クラスＩ外膜タンパク質、 ｂ）CNBr、endoLys−Ｃ、endoArg−Ｃまたはスタフイロ
    コツカスV8−プロテアーゼを用いて髄膜炎菌性クラスＩ
    外膜タンパク質を切断することにより製造される請求項
    １に記載の髄膜炎菌性クラスＩ外膜タンパク質のフラグ
    メント、および ｃ）YYTKNTNNNL,HFVQQTPQSQP,YYTKDTNNNL,YTKDTNNNLT,T
    KDTNNNLTL,KDTNNNLTLV,AQAANGGASG,QAANGGASGQ,AANGGAS
    GQV,ANGGASGQVK,NGGASGQVKV,GGASGQVKVT,GASGQVKVTK,AS
    GQVKVTKV,SGQVKVTKVT,PAHYTRQNNT,AHYTRQNNTD,HYTRQNNT
    DVF,TRQNNTDVFV,RQNNTDVFVP,QNNTDVFVP,QNNTDVFVPA,NNT
    DVFVPAV,ANVGRNAFELFLIGSATSDEAKG,NIQAQLTEQPQVTNGVQG
    N,TKISDFGSFIGFK,VSVAGGGASQWGN,TLRAGRVANQFDDASQAIN,
    DSNNDVASQLGIFK,GGFSGFSG,LSENGDKAKTKNSTTEおよびVPRI
    SYAHGFDLIERGKKGよりなる群から選ばれるアミノ酸配列
    を含んでなるペプチド よりなる群から選ばれるポリペプチドを含んでなること
    を特徴とする抗原性複合体。
  13. 【請求項１３】請求項１に記載のアミノ酸配列のいずれ
    か１つからなる髄膜炎菌の１つより多いクラスＩ外膜タ
    ンパク質を発現しうる組換え微生物。
  14. 【請求項１４】YYTKNTNNNL,HFVQQTPQSQP,YYTKDTNNNL,YT
    KDTNNNLT,TKDTNNNLTL,KDTNNNLTLV,AQAANGGASG,QAANGGAS
    GQ,AANGGASGQV,ANGGASGQVK,NGGASGQVKV,GGASGQVKVT,GAS
    GQVKVTK,ASGQVKVTKV,SGQVKVTKVT,PAHYTRQNNT,AHYTRQNNT
    D,HYTRQNNTDVF,TRQNNTDVFV,RQNNTDVFVP,QNNTDVFVP,QNNT
    DVFVPA,NNTDVFVPAV,ANVGRNAFELFLIGSATSDEAKG,NIQAQLTE
    QPQVTNGVQGN,TKISDFGSFIGFK,VSVAGGGASQWGN,TLRAGRVANQ
    FDDASQAIN,DSNNDVASQLGIFK,GGFSGFSG,LSENGDKAKTKNSTTE
    およびVPRISYAHGFDLIERGKKGよりなる群から選ばれるペ
    プチドを発現しうる組換え微生物。
  15. 【請求項１５】請求項１に記載のアミノ酸配列のいずれ
    か１つからなる髄膜炎菌の完全なクラスＩ外膜タンパク
    質またはその融合タンパク質を発現しうる髄膜炎菌の組
    換え菌株。
  16. 【請求項１６】請求項１に記載のアミノ酸配列のいずれ
    か１つからなる髄膜炎菌クラスＩ外膜タンパク質の全長
    をコードしている単離された核酸。
  17. 【請求項１７】髄膜炎菌クラスＩ外膜タンパク質が で示されるアミノ酸配列からなる請求項16に記載の単離
    された核酸。
  18. 【請求項１８】下記のヌクレオチド配列： のいずれか１つからなる単離された核酸。
  19. 【請求項１９】下記のヌクレオチド配列： のいずれか１つからなる単離された核酸。
  20. 【請求項２０】請求項19に記載の単離された核酸を含ん
    でなる核酸ベクター。
  21. 【請求項２１】請求項１に記載のアミノ酸配列のいずれ
    か１つからなる髄膜炎菌の完全なクラスＩ外膜タンパク
    質またはその融合タンパク質をコードする核酸を含んで
    なり、該核酸が髄膜炎菌クラスＩ外膜タンパク質をコー
    ドする配列の全部を含んでなり、該コードする配列が転
    写シグナルのコントロール下にあり且つ適当な宿主細胞
    内での発現のための適切な翻訳シグナルに結合されてい
    ることを特徴とする発現ベクター。
  22. 【請求項２２】請求項21に記載の発現ベクターを含有す
    る宿主細胞。
  23. 【請求項２３】請求項21に記載の発現ベクターを適当な
    宿主細胞中に導入し、コードする配列の発現を可能にす
    る条件下に宿主細胞を培養することを特徴とする、請求
    項１に記載のアミノ酸配列のいずれか１つからなる髄膜
    炎菌の完全なクラスＩ外膜タンパク質またはその融合タ
    ンパク質の生産方法。
  24. 【請求項２４】請求項１に記載のアミノ酸配列のいずれ
    か１つからなる髄膜炎菌クラスＩ外膜タンパク質または
    その免疫原性タンパク質をコードする組換え核酸を含有
    する宿主細胞を、該核酸の発現に適する条件下に維持
    し、それによってコードされた髄膜炎菌クラスＩ外膜タ
    ンパク質またはその免疫原性タンパク質を発現させ且つ
    それにより生産させることを特徴とする、髄膜炎菌クラ
    スＩ外膜タンパク質またはその免疫原性タンパク質の生
    産方法。
  25. 【請求項２５】請求項１に記載のアミノ酸配列のいずれ
    か１つからなる実質的に精製された未変性の髄膜炎菌
    （Neisseria meningitidis）クラスＩ外膜タンパク質を
    含んでなるワクチン。
  26. 【請求項２６】髄膜炎菌クラス２又はクラス３外膜タン
    パク質を含まない請求項25に記載のワクチン。
  27. 【請求項２７】脂質又は表面活性物質をさらに含んでな
    る請求項25に記載のワクチン。
  28. 【請求項２８】請求項１に記載のアミノ酸配列のいずれ
    か１つからなる、１種もしくはそれ以上の実質的に精製
    された未変性の髄膜炎菌クラスＩ外膜タンパク質をリポ
    ソームまたは微小球内に含んでなるワクチン。
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