JP2001514894A

JP2001514894A - ナイセリア・ラクトフェリン結合プロテイン

Info

Publication number: JP2001514894A
Application number: JP2000509840A
Authority: JP
Inventors: マルガレータペテルソン−フェルンホルム，アニカ; ペトルスマリアトマセン，ヨハネス
Original assignee: ユニバーシティオブユトレヒト; テクノロジーファウンデーション（テクノロジスティクティングエスティーダブリュ）
Priority date: 1997-08-15
Filing date: 1998-08-10
Publication date: 2001-09-18
Also published as: EP1003874B1; CN1275164A; BR9811907A; US20040131634A1; NO20000731L; PL194800B1; ES2275314T3; CO4810233A1; AU9261398A; NZ502750A; CA2301332A1; PL338649A1; WO1999009176A1; US7105316B2; TR200000416T2; KR20010022952A; DE69836333D1; EP1003874A1; NO20000731D0; DE69836333T2

Abstract

(57)【要約】 LbpBポリペプチド及びポリヌクレオチド、及び組換え技法によりそのようなポリペプチドを生成するための方法が開示される。また、中でも、ナイセリア疾病の処理のためのプロトコールの企画及びそのような状態についての診断アッセイへのLbpBポリペプチド及びポリヌクレオチドの使用方法が開示される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は、新規同定されたポリヌクレオチド、それらによりコードされるポリ
ペプチド、及びそのようなポリヌクレオチド及びポリペプチドの使用、並びにそ
れらの製造に関する。より具体的には、本発明のポリヌクレオチド及びポリペプ
チドは、ナイセリア外層膜プロテイン（outer-membrane protein）（OMP ）ファ
ミリー、そして特に、ラクトフェリン−結合プロテインB （LbpB）に関する。さ
らに、本発明は、LbpBの療法的使用、たとえばネイセリア疾病に対する予防接種
に関する。

【０００２】発明の背景髄膜炎（Meningitis）は細菌又はウィルス起源のいずれかのものであり、細菌
形がはるかに最も重症である。主な原因細菌は、ナイセリア・メニンギチジス（
Neisseria meningitidis）、ハエモフィラス・インフルエンザエ（Haemophilus
influenzae）及びストレプトコーカス・プネウモニアエ（Streptococcus pneumo
niae）である。H.インフルエンザB 型（Hib ）に対する接合体ワクチン及び通常
の乳児予防接種へのその一体化の開発以来、N.メニンギチジスは世界中の髄膜炎
の主用原因として認識されており、アメリカ合衆国のみにおいてさえ１年当たり
２，６００人の患者が推定される。

【０００３】種ナイセリア・メニンギチジスは、筴膜多糖の組成に従って、１３種の血清グ
ループに細分化される。さらに、個々の血清グループは、細菌の他の成分に基づ
いて、血清型サブタイプ及び免疫型に細分類される。３種の血清グループ（A,B
及びC ）は、髄膜炎患者の９０％以上の原因であり、そして先進工業国において
は、血清グループB が患者の５０〜８０％の原因である。

【０００４】膜（capsular）多糖に基づく効果的なワクチンは、ナイセリア・メニンギジス
血清グループA 及びC により引き起こされる髄膜炎を妨げる。血清グループC 多
糖ワクチンは、２歳以下（進行性髄膜炎の最も高い危険性がある年齢範囲）の幼
児において保護効果をを生成しないが、しかしのがら、この欠点はキャリヤータ
ンパク質にそれらの多糖を接合することにとって克服され得る。接合は、抗原に
対して免疫学的記憶を誘発する追加の利点を有する。

【０００５】対照的に、ナイセリア・メニンギチジス血清グループB の多糖は、接合された
形で存在するか否かに関係なく、ヒトにおいて免疫原生をほとんど又はまったく
示さない。従って、ナイセリア・メニンギチジス（特に、血清グループB ）によ
り誘発されるナイセリア疾病に対するワクチンであって、多糖に基ずくワクチン
以外のワクチンを得ることが、非常に望まれる。有望な種類のワクチン候補体は、ヒト免疫応答に対して免疫原性であり且つ入
手しやすい抗原を供給し得るので、ナイセリア・メニンギチジスの外層膜タンパ
ク質（OMP ）を用いるものである。細胞中への鉄の摂取を担当するOMP は特に有
望である。

【０００６】鉄は、ほとんどの細菌のための必須栄養素である。ヒト身体の細胞外区画にお
いて、鉄は、遊離形での無視できる量を伴って、血清におけるトランスフェリン
、及び粘膜表面上のラクトフェリンに主に複合化される（Finkelstein など.,19
83）。従って、効果的な鉄分獲得は、病原性細菌のための重要な毒性（virulenc
e ）因子である。特にナイセリア・メニンギチジス（ヒトの厳密な病原体）に関
しては、その鉄の必要性は、細胞のヒトの鉄−キレート化タンパク質、たとえば
トランスフェリン又はラクトフェリンのための受容体を用いることによって満た
され、これらのタンパク質は細胞が該タンパク質に結合することを可能にし、そ
してその後、その増殖のために必要な鉄を刺込む。それらの受容体タンパク質の
合成は、細菌が鉄の制限を検知する場合に誘発される。

【０００７】トランスフェリン、すなわちTbpA及びTbpB（Cornelissen など., 1992;Legrai
n など., 1994 ）からの、及びラクトフェリン結合プロテインA （LbpA）（Pett
ersson など., 1993; 1946; Biswas and Sparling, 1995）からの鉄の摂取に関
連する受容体タンパク質が、クローン化され、そして配列決定されている。トラ
ンスフェリン−結合受容体タンパク質は、外層膜において複合体を形成する。ナ
イセリア・メニンギチジスにおいては、TbpA及びTbpBの両者が、鉄輸送のために
必要であると思われる（Irwon など., 1993 ）。

【０００８】 TbpAは膜内在性タンパク質であり、そしてTbpBはリポタンパク質であり、そし
てその脂質成分によってのみ膜に結合される。受容体の機構のための現在のモデ
ルは、鉄負荷されたトランスフェリンが受容体複合体を結合することを示す。こ
の複合体においては、TbpBタンパク質は、鉄酸塩化されたトランスフェリン及び
アポ−トランスフェリン間を識別する。トランスフェリンの結合は、受容体のコ
ンホメーション変化をもたらし、これによりトランスフェリンから鉄が放出され
、そしてTbpAにおいて孔が開口され、そして鉄が外層膜を通して輸送され得る（
Cornelissen and Sparling, 1994; 1996）。

【０００９】ラクトフェリン受容体はまた、ナイセリア・メニンギチジスの重要な毒性因子
であると思われる。ヒト身体中への侵入の主要部位は、ラクトフェリンが主な鉄
源である鼻咽頭である。さらに、予備的報告によれば、ラクトフェリンが急性炎
症において脳−血液関門を通過できる（Gschwentnet など., 1997 ）。ラクト
フェリンはまた、細菌が髄膜に達した場合、感染の後期段階で髄膜炎菌のための
重要な鉄源でもある。アフィニティー単離法を用いることによって、単一のラク
トフェリン−結合タンパク質が同定される（ Schryver and Morris, 1988 ）。

【００１０】 LbpAと称する、この受容体のための構造遺伝子が特徴づけられており（ Pette
rsson など., 1993; 1994b; Biswas and Sparling, 1995 ）、そして外層膜にお
けるタンパク質のためのトポロジーモデルが提案された（Prttersson など., 1
994a ）。前記タンパク質は、TbpAに対する相同性を示す。さらに、可能なオー
プンリーディングフレームの一部がlbpA 遺伝子の上流に同定されえており、そ
してその推定されるアミノ酸配列はTbpBとの相同性を示した（ Pettersson など
., 1994a）。

【００１１】 TbpB及び他の精製された髄膜炎菌OMP は、ナイセリア・メニンギチジスにたい
するワクチンとしてのそれらの使用に関して、これまでの特許出願の主題であっ
た（たとえば、TbpB, WO930717 号; 22kDa の表面タンパク質、WO9629412 号;
ヘモグロビン受容体、WO9612020 号; ポーリンタンパク質、WO9503413 号; ピリ
ンタンパク質、WO948013号；64kDa のOMP, EP474313 −B1）。

【００１２】機能障害又は疾病、たとえばナイセリア疾病（たとえば、髄膜炎）( 但し、そ
れだけには限定されない) の防止、緩和又は矯正において役割を演じ得るOMP フ
ァミリーの更なるメンバーの同定及び特徴化のための必要性が存在する。 LbpAに対する抗体は殺細菌性があるとは思われず、そしてそのために、ワクチ
ン候補体としての制限的に使用される（Petterssonなど., 1993 ）。本発明は、もう１つのトランスフェリン−結合受容体タンパク質、すなわちラ
クトフェリン結合プロテインB （ LbpB ）、トランスフェリンからの鉄の利用に
おけるその役割、及びその治療的使用を同定し、そして特徴づける。

【００１３】 LbpBが他のOMP ワクチン候補体よりも卓越するいくつかの利点が存在する。第
１に、髄膜炎菌性疾病の血液担持段階においては、ヒトラクトフェリンは、ヒト
トランスフェリンよりも300 倍高い鉄を結合するための親和性を有するので、そ
の生物にとって必須であり、そして従って、鉄源としてのラクトフェリンの使用
はその生物にとって必須である。第２に、ラクトフェリンは既知の殺細菌効果を
有し、そして血液におけるその濃度は感染の際に上昇する。従って、この効果に
対するいくらかの耐性を得る手段としてヒトラクトフェリンを結合することが生
物のために重要である。最後に、ヒトラクトフェリンは、ヒト身体への細菌の侵
入の場所（鼻咽頭）でのナイセリア・メニンギチジスへの鉄の主要源である。

【００１４】それらの利点の優意性は、LbpB抗原が身体において大部分の髄膜炎菌の細胞表
面でおそらく発現されること、LbpBの細胞−表面ドメインが、ラクトフェリンを
効果的に結合するので、おそらく非常に保存されること、及びLbpB抗原に対して
向けられた免疫応答が血液における髄膜炎菌の感染を停止できるのみならず、そ
れはまた、鼻咽頭における生物の担持さえ停止せしめることができることである
。

【００１５】発明の要約１つの観点においては、本発明は、LbpBポリペプチド及び組換え材料、並びに
それらの製造方法に関する。本発明のもう１つの観点は、そのようなLbpBポリペ
プチドおよびポリヌクレオチドを用いるための方法に関する。そのような使用は
、中でも、ナイセリア疾病（たとえば髄膜炎）の予防及び治療を包含する。さら
にもう１つの観点においては、本発明は、LbpBの存在に関連する疾病を検出する
ための診断アッセイに関する。

【００１６】発明の記載定義次の定義は、本明細書において時おり使用される一定の用語の理解を促進する
ために提供される。 “LbpB”とは一般に、配列番号２，４，６，８又は１０に示されるアミノ酸配
列、又はその対立遺伝子変異を有するポリペプチド、特異リポタンパク質を意味
する。 “LbpB活性又はLbpBポリペプチド活性”、あるいは“LbpB又はLbpBポリペプチ
ドの生物学的活性”とは、類似する活性を含む前記LbpBの代謝又は生理学的機能
に関する。特に、LbpB活性は、ヒトラクトフェリンに結合する能力である。

【００１７】 LbpBのこの活性は、例６に記載される方法を用いて試験され得る。前記LbpBの
抗原及び免疫原性活性がまた、この定義に包含される。この抗原性は、例９に記
載されるイムノブロット法を用いて、好ましくは例１０A に記載されるような髄
膜炎菌株BNCVのLbpBに対するポリクローナル血清を用いて試験され得る。免疫原
生は、例１０B に記載されるように、髄膜炎菌株BNCVからの精製されたLbpBを用
いて、ELISA における抗体応答（変異体に対して生成されるポリクローナル血清
を用いて）を測定することによって最良に試験され得る。

【００１８】 “lbpB遺伝子”とは、配列番号１に示されるヌクレオチド配列100 〜2274、又
は配列番号３，５，７もしくは９に示される完全なヌクレオチド配列、又はそれ
らの対立遺伝子変異体及び／又はそれらの相補体を有するポリヌクレオチドを意
味する。 “抗体”とは、本明細書において使用される場合、ポリクローナル及びモノク
ローナル抗体、キメラ、一本鎖抗体及びヒト化抗体、並びにFab フラグメント、
たとえばFab 又は他の免疫グロブリン発現ライブラリーの生成物を包含する。

【００１９】 “単離された”とは、天然状態から“ヒトの手により”変更されることを意味
する。“単離された組成物又は物質が天然に存在する場合、それは元の環境から
変更され、又は除去されており、又は元の環境から変更され、そして除去されて
いる。たとえば、生存動物に天然において存在するポリヌクレオチド又はポリペ
プチドは“単離され”ないが、しかしその天然状態の共存する材料から分離され
た同じポリヌクレオチド又はポリペプチドは、その用語が本明細書において使用
される場合、“単離される”。

【００２０】 “ポリヌクレオチド”とは一般的に、修飾されていないRNA もしくはDNA 、又
は修飾されたRNA もしくはDNA であり得るいずれかのポリヌクレオチド又はポリ
デオキシリポリヌクレオチドを意味する。“ポリヌクレオチド”とは、一本鎖及
び二本鎖DNA 、一本鎖と二本鎖領域の混合物であるDNA 、一本鎖及び二本鎖RNA
、並びに一本鎖と二本鎖領域の混合物であるRNA 、一本鎖もしくはより典型的に
は二本鎖、又は一本鎖もしくは二本鎖領域の混合物であり得るDNA 及びRNA を含
んで成るハイブリッド分子を包含するが、但しそれらだけには限定されない。

【００２１】さらに、“ポリヌクレオチド”とは、RNA もしくはDNA 、又はRNA 及びDNA の
両者を含んで成る三本鎖領域をも意味する。用語ポリヌクレオチドはまた、１又
は複数の修飾された塩基を含むDNA 又はRNA 及び安定性又は他の理由のために修
飾された主鎖を有するDNA 又はRna を包含する。“修飾された”塩基とは、たと
えばトリチル化された塩基及び異常塩基、たとえばイノシンを包含する。種々の
修飾がDNA に対して行われており；従って、“ポリヌクレオチド”は、典型的に
は天然において見出されるようなポリヌクレオチドの化学的に、酵素的に又は代
謝的に修飾された形、並びにウィルス及び細胞の特徴を示すDNA 及びRNA の化学
的形包含する。“ポリヌクレオチド”はまた、オリゴヌクレオチドとして、しば
しば言及される、比較的短いポリヌクレオチドも包含する。

【００２２】 “ポリペプチド”とは、ペプチド結合又は修飾されたペプチド結合によりお互
い連結された複数のアミノ酸を含んで成るいずれかのペプチド又はタンパク質、
すなわちペプチド同位体を意味する。“ポリペプチド”とは、ペプチド、オリゴ
マーとして通常言及される短鎖、及びタンパク質として一般的に言及される長鎖
の両者を意味する。ポリペプチドは、２０個の遺伝子によりコードされるアミノ
酸以外のアミノ酸を含むことができる。“ポリペプチド”は、天然の過程、たと
えば翻訳後プロセッシング、又は当業者においてよく知られている化学的修飾技
法のいずれかにより修飾されたアミノ酸配列を包含する。そのような修飾は、基
本テキスト及びより詳細な研究論文、並びに多数の研究文献に十分に記載されて
いる。

【００２３】修飾は、ペプチド、たとえばペプチド主鎖、アミノ酸側鎖、およびアミノ又は
カルボキシル末端におけるいずれの場所においても生じ得る。同じタイプの修飾
は所定のポリペプチドにおけるいくつかの部位で、同じか又は種々の程度で存在
し得ることが理解されるであろう。また、所定のポリペプチドは、多くのタイプ
の修飾を含むことができる。ポリペプチドはユビキチン化の結果として枝分かれ
され得、そしてそれらは枝分かれを伴って又は伴わないで、環状化することがで
きる。環状、枝分かれされた及び枝分かれされた環状ポリペプチドは、翻訳後天
然過程に起因し、又は合成方法により製造され得る。

【００２４】修飾は、アセチル化、アシル化、ADP −リボシル化、アミノ化、フラビンの共
有結合、ヘム成分の共有結合、ヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質成
分の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環状化、ジスルフ
ィド結合形成、脱メルチ化、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン
酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グルコシル化、GPI アンカー形成
、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分
解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、
タンパク質へのアミノ酸のトランスファーRNA 介在性付加、たとえばアルギニル
化、及びユビキチン化を包含する。

【００２５】たとえば、PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T. E.
Creighton, W. H. Freeman and Company, New York, 1993 and Wold, F., Postt
ranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, pgs. 1-1
2 in POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson,
Ed., Academic Press, New York, 1983; Seifter など., "Analysis for prote
in modifications and nonprotein cofactors", Meth Enzymol (1990) 182:626-
646 及びRattan など., "Protein Synthesis: Posttransiational Modificatio
ns and Aging", Ann NY Acad Sci (1992) 663: 48-62を参照のこと。

【００２６】用語“変異体”（variant ）とは、本明細書において使用される場合、それぞ
れ対照ポリヌクレオチド又はポリペプチドとは異なるが、しかし必須の生物学的
性質を保持するポリヌクレオチド又はポリペプチドである。ポリヌクレオチドの
典型的な変異体は、もう１つの対照ポリヌクレオチドとは、ヌクレオチド配列に
おいて異なる。変異体中のヌクレオチド配列の変化は、対照ポリヌクレオチドに
よりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変更しても又はしなくても良い
。

【００２７】ヌクレオチド変化は、下記で論じられるように、対照配列によりコードされる
ポリペプチドにおけるアミノ酸の置換、付加、欠失、融合及び切断をもたらすこ
とができる。ポリペプチドの典型的な変異体は、もう一つの対照ポリペプチドと
は、アミノ酸配列において異なる。一般的に、対照ポリペプチド及び変異体の配
列が全体的に密接して類似し、そして多くの領域において、同一であるように差
異が制限される。変異及び対照ポリペプチドは、１又は複数の置換、付加、欠失
のいずれかの組み合わせにより、アミノ酸配列において異なる。

【００２８】置換された又は挿入されたアミノ酸残基は、遺伝子コードによりコードされる
残基であっても又はなくてもよい。ポリヌクレオチド又はポリペプチドの変異体
、たとえば対立遺伝子変異体は天然に存在することができ（たとえば、配列番号
３，５，７又は９は配列番号１のlbpBポリヌクレオチドの変異体であり；配列番
号４，６，８又は１０は配列番号２のLbpBポリペプチドの変異体である）、又は
それは天然に存在することが知られていない変異体であり得る。ポリヌクレオチ
ド及びポリペプチドの天然に存在しない変異体は、突然変異誘発技法により、又
は直接的な合成により製造され得る。

【００２９】変異体は、LbpBポリペプチドの１又は複数の生物学活性を保持すべきである。
それはヒトラクトフェリンを結合することができ（好ましくは、例６におけるこ
の活性についての試験において記載のようにして）、又はLbpBに類似する抗原性
又は免疫原性活性を有する。抗原性は、例９に記載されるイムノブロット法を用
いて、好ましくはれい１０A に記載のようにして髄膜炎菌株BNCVのLbpBに対する
ポリクローナル血清を用いて最良に試験され得る。抗原性は、例１０B に記載の
ようにして、髄膜炎菌株BNCVからの精製されたLbpBを用いて、ELISA における抗
体応答（変異体に対して生成されたポリクローナル抗体を用いて）を測定するこ
といよって最良に試験され得る。好ましくは、変異体は、上記すべての生物学的
活性を保持する。

【００３０】 “同一性”とは、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の同一の測定である。一
般的に、配列は、最高の程度の調和が得られるよう整列（align ）される。“同
一性”自体は、当業界において認識されている意味を有し、そして公開されてい
る技法を用いて計算され得る。たとえば、COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, L
esk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; BIOCOMPUTING: I
NFORMATICS AND GENOME PROJCTS, Smith, D. W., ed., Academic Press, New Yo
rk, 1993; COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PART 1, Griffin, A. M., an
d Griffin, H. G., eds Humana Press, New Jersey, 1994; SEQUENCE ANALYSIS
IN MOLECULAR BIOLOGY, von Heijne, G., Academic Press, 1987; and SEQUENCE
ANALYSIS PRIMER, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press,
New York, 1991 を参照のこと。

【００３１】２種のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列間の同一性を測定するための多
くの方法が存在するが、用語“同一性”とは当業者によく知られている（Carill
o, H., and Lipton, D., SIAM J Applied Math (1988) 48: 1073）。２種の配列
間の同一性又は類似性を決定するために通常使用される方法は、Guide to Huge
Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, Caril
lo, H., and Lipton, D., SIAM J Applied Math (1988) 48: 1073 に開示される
方法を包含するが、但しそれらだけには限定されない。

【００３２】同一性及び類似性を決定するための方法は、コンピュータープログラムにコー
ドされている。２種の配列間の同一性及び類似性を決定するための好ましいコン
ピュータープログラムは、GCS プログラムパッケージ（Devereux, J., など
., Nucleic Acids Research (1984) 12(1) : 387）BLASTP, BLASTN, FASTA (Ats
chul, S. F. など., J Moles Bio (1990)215:403) を包含するが、但しそれらだ
けには限定されない。

【００３３】例示として、配列番号１の対照ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の
“同一性”を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによれば、ポリ
ヌクレオチドのヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド配列が配列番号１の対照
ヌクレオチド配列の個々の１００個のヌクレオチド当たり平均して５個までの点
突然変異を包含することを除いて対照配列に対して同一であることが意図される
。

【００３４】換言すれば、対照ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一のヌクレオ
チド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、対照配列における５％まで
のヌクレオチドが、欠失され、又は他のヌクレオチドにより置換され得、又は対
照配列における全ヌクレオチドの５％までのヌクレオチドが対照配列中に挿入さ
れ得る。対照配列のそれらの突然変異は、対照ヌクレオチド配列の5'−もしくは
3'−末端位置で、又は対照配列におけるヌクレオチド間で個々に、又は対照配列
内の１又は複数の連続した基において散在されるそれらの末端位置間のいずれか
の位置で存在することができる。

【００３５】同様に、配列番号２の対照アミノ酸配列に対して少なくとも９５％の“同一性
”を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドによれば、ポリペプチドのアミノ
酸配列は、ポリペプチド配列は配列番号２の対照アミノ酸配列の個々の100 個の
アミノ酸当たり平均して５個までの点突然変異を包含することを除き、対照配列
に対して同一であることが意図される。

【００３６】換言すれば、対照アミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一のアミノ酸配列
を有するポリペプチドを得るためには、対照配列における５％までのアミノ酸残
基が、欠失され、又は他のアミノ酸により置換され得、又は対照配列における全
アミノ酸残基の５％までの多くのアミノ酸が対照配列中に挿入され得る。対照配
列のそれらの突然変異は、対照アミノ酸配列のＮ−もしくはＣ−末端位置で、又
は対照配列における残基間で個々に、又は対照配列内の１又は複数の連続した基
において散在されるそれらの末端位置間のいずれかの位置で存在することができ
る。

【００３７】本発明のポリペプチド一つの観点においては、本発明は、LbpBポリペプチド（又はLbpBタンパク質）
に関する。LbpBポリペプチドは、配列番号２，４，６，８又は１０のポリペプチ
ド（残基１〜１８は個々のタンパク質の天然のシグナルペプチドであり、そして
残基Cys は天然の成熟タンパク質において脂質化される（lipidated ）N −末端
アミノ酸である）；配列番号２，４，６，８又は１０のアミノ酸配列を含んで成
るポリペプチド；及びその全体の長さにわたって、配列番号２，４，６，８又は
１０の配列に対して、少なくとも６５％の同一性、より好ましくは少なくとも７
０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも８０％の同一性、及びさらにに
より好ましくは少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るポ
リペプチドを包含する。

【００３８】さらに、少なくとも９５％〜９９％の同一性を有するものが非常に好ましい。
その全体の長さにわたって、配列番号２，４，６，８又は１０のアミノ酸配列を
有するポリペプチドに対してして、少なくとも６５％の同一性、より好ましくは
少なくとも７０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも８０％の同一性、
及びさらににより好ましくは少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を
含んで成るポリペプチドもまた、LbpBポリペプチド内に包含される。さらに、少
なくとも９５％〜９９％の同一性を有するものが非常に好ましい。

【００３９】配列番号2, 4, 6, 8, 及び10により提供されるLbpBポリペプチドは、それぞれ
ナイセリア・メニンギシジス株BNCV, M981, H44/76, M990及び881607からのLbpB
ポリペプチドである。 LbpBポリペプチドは、“成熟”タンパク質の形で存在することができ、または
より大きなタンパク質、たとえば融合タンパク質の一部であり得る。分泌または
リーダー配列（たとえば、天然のLbpBリーダー配列；配列番号２，４，６，８及
び１０における残基１〜１８）、プロ配列、精製を助ける配列、たとえば複数の
ヒスチジン残基、又は組換え生成の間の安定性のための追加の配列を含む追加の
アミノ酸配列を含むことが好都合である。

【００４０】 LbpBポリペプチドのフラグメントもまた、本発明に包含される。フラグメント
は、前記LbpBポリペプチドのアミノ酸配列と、すべてではないが一部に完全に同
じであるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。LbpBポリペプチドに関して
は、“それ自体の自立構造で存在する”（free-standing ）ことができ、又は大
きなポリペプチド内に含まれる一部もしくは領域であることができ、最も好まし
くは、単一の連続した領域として形成することができる。

【００４１】本発明のポリペプチドフラグメントの代表的な例は、たとえばLbpBポリペプチ
ドのおおよそのアミノ酸番号１〜２０，２０〜４０，４１〜６０，６１〜８０，
８１〜１００及び１０１〜末端のフラグメントを包含する。この場合、“おおよ
その”とは、いずれかの末端又は両末端において、いくつかの、５，４，３，２
又は１個のアミノ酸だけ大きいか又は小さい特別に列挙された範囲を包含する。

【００４２】好ましいフラグメントは、末端が切除されたポリペプチドであり、このものは
、LbpBポリペプチドのアミノ酸配列を有するが、但しアミノ末端を含む連続した
一連の残基あるいはカルボキシル末端及び／又はトランスメンブラン領域を含む
連続した一連の残基が欠失しており、あるいはアミノ末端を含む残基とカルボキ
シル末端を含む残基の両方の一連の残基を欠失している。

【００４３】構造的又は機能的特性により特徴付けられる領域、たとえばα−ヘリックス及
びα−ヘリックス形成領域、β−シート形成領域、ターン及びターン形成領域、
コイル及びコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親
媒性領域、柔軟領域、表面形成領域、基質結合領域、及び高い抗原指数領域を含
んで成るフラグメントがまた好ましい。他の好ましいフラグメントは、生物学的
活性フラグメントである。生物学的活性フラグメントは、LbpB活性を仲介するフ
ラグメント、たとえば類似する活性もしくは改良された活性を有するか、又は低
められた不所望の活性を有するそれらのフラグメントである。動物、特にヒトに
おいて抗原性又は免疫原性であるフラグメントもまた包含される。

【００４４】フラグメントは、LbpBポリペプチドの１又は複数の生物学的活性を保持するべ
きである。好ましくは、ポリペプチドフラグメントは、それが由来する十分な長
さのLbpBポリペプチドが有する抗原性又は免疫原性生物学的活性を有する配列番
号２，４，６，８又は１０に由来する連続した範囲（１６個以上のアミノ酸）の
アミノ酸配列であるべきである。

【００４５】定義された配列及びフラグメントの変異体もまた、本発明の一部を形成する。
好ましい変異体は、保存性アミノ酸置換により対照とは異なる変異体、すなわち
１つの残基を同様の特徴のもう１つの残基により置換するそれらの変異体である
。典型的なそのような置換は、Ala, Val, Leu 及びIle 間；Ser 及びThr 間；酸
性残基Asp 及びGlu 間；Asn 及びGln 間；及び塩基性残基Lys 及びArg 間；又は
芳香族残基Phe 及びTyr 間で存在する。いくつかの、５〜１０，１〜５又は１〜
２個のアミノ酸がいずれかの組み合わせで、置換され、欠失され、又は付加され
ている変異体が特に好ましい。

【００４６】最も好ましい変異体は、他のLbpB配列（たとえば、図９に示される５種のLbpB
配列の相同性整列（homology alignment））において構造的に同等の位置（相同
性整列（homology alignment）により示されるような）に見出されるアミノ酸置
換により対照とは異なる変異体である。その全体の長さにわたって、対照配列（
たとえば配列番号２，４，６，７又は１０）のアミノ酸配列に対して少なくとも
６５％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも７０％の同一性、さらにより
好ましくは少なくとも８０％の同一性及びさらにより好ましくは少なくとも９０
％の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成る変異体が特に好ましい。

【００４７】たとえば、図９においては、BNCVからのLbpBが対照配列である場合、変異体は
、株H 44/76 (それぞれ残基305 〜313 ) 、株M 990 （それぞれ残基307 〜315
）、株M 981 （それぞれ残基302 〜310 ）又は株881607（それぞれ残基303 〜31
1 ）のLbpB配列中の同等の位置でのいずれかの残基により置換される残基303 〜
308 を包含する。

【００４８】従って、アミノ酸配列NPDLAKSHA は、STDVATNLA [ST(M 981 の残基302 〜303
からの) 、D （BNCVの残基302 からの）、V （881607の残基306 からの）、A （
M 990 の残基311 からの）、T(H 44／76の残基310 からの）、NLA （M 990 の残
基313 〜315 からの）] により置換され得、そしてその得られるタンパク質は本
発明の変異体又はポリペプチドとして分類され得る。そのような置換はまた欠失を含むことができ、たとえば株M 981 のLbpBの残基
357 〜366 が失欠される場合（株BNCVからのLbpBに同等のアミノ酸位置が存在し
ないように）、そのようなタンパク質は本発明の変異体及びポリペプチドを構成
することができる。

【００４９】さらに、ナイセリア・メニンギチジス及び他のナイセリア株（たとえばナイセ
リア・ゴノルホエアエ（Neisseria gonorrhoeae ））のゲノムがお互いゲノム的
に非常に相同であることはよく知られている。ナイセリア・メニンギチジス及び
モラキセラ・カタルハリス（Moraxella catarrhahalis ）（以前は、ナイセリア
・カタルハリスと呼ばれていた）のゲノムはまた、遺伝子交換の発生を可能にす
るために十分に相同である。ナイセリア株及びモラキセラ・カタルハリス株のLb
pB同等タンパク質（又は、LbpB対立遺伝子変異体）はまた、それらが上記の％配
列同一性基準を満たす場合、本発明のポリペプチドを構成する。

【００５０】さらに、そのような同等タンパク質はまた、それらがプログラムBLAST （Alts
chul, S. F. など., (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389 −3402; Karlin, S.
and Altschul, S. F. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA87: 2264−68; Karl
in, S. and Altschul, S. F. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90; 5873 −
7 ）により測定される場合に、その全体の長さにわたって対照配列（配列番号２
，４，６，８又は１０）の１つに対して少なくとも６５％の配列類似性、より好
ましくは少なくとも７０％の類似性、さらにより好ましくは少なくとも８０％の
類似性及びさらにより好ましくは少なくとも９０％の類似性を共有する場合、本
発明のポリペプチドを構成するであろう。

【００５１】さらに、少なくとも９５〜９９％の類似性を有するものが非常に好ましい。そ
のようなタンパク質は、ヒトラクトフェリンを提供するべきであり、そしてまた
、髄膜炎菌株からのLbpBに対するポリクローナル血清と交差反応できるべきであ
る。そのような変異体の正確なアミノ酸配列は、配列番号１〜１０の髄膜炎菌ポ
リヌクレオチド及びポリペプチド配列からの情報を用いて容易に決定され得る。

【００５２】本発明のLbpBポリペプチドは、いずれかの適切な手段により調製され得る。そ
のようなポリペプチドは、天然に存在する単離されたリポポリペプチド、組換え
的に生成されたポリペプチド又はリポポリペプチド、合成的に生成されたポリペ
プチド、又はそれらの方法の組み合わせにより生成されたポリペプチドを包含す
る。そのようなポリペプチドを調製するための手段は、当業者において十分に理
解されている。

【００５３】本発明のポリヌクレオチド本発明のもう１つの観点は、LbpBポリヌクレオチドに関する。LbpBポリヌクレ
オチドは、LbpBポリペプチド及びフラグメントをコードする単離されたポリヌク
レオチド、及びそれに密接に関連するポリヌクレオチドを包含する。より具体的
には、本発明のLbpBポリヌクレオチドは、それぞれ配列番号２，４，６，８又は
10のLbpBポリペプチドをコードする配列番号１，３，５，７又は9 に含まれるヌ
クレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド、及び配列番号１，３，５，７又
は９の特定の配列を有するポリヌクレオチドを包含する。

【００５４】 LbpBポリヌクレオチドはさらに、配列番号２，４，６，８または１０のLbpBポ
リペプチドをコードするヌクレオチド配列に対して、その全体の長さにわたって
少なくとも６５％同一性を有するヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチ
ド、及び配列番号１のヌクレオチド１００〜ヌクレオチド２２７４の配列に対し
て少なくとも６５％同一であるヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド
、及び配列番号３，５，７又は９の配列に対して少なくとも６５％同一であるヌ
クレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチドを包含する。

【００５５】これに関しては、少なくとも７０％同一であるポリヌクレオチドがより好まし
く、少なくとも８０％同一であるポリヌクレオチドが特に好ましくは、そして少
なくとも９０％同一であるポリヌクレオチドが特に好ましい、さらに、少なくと
も９５％同一であるポリヌクレオチドが非常に好ましく、そして少なくとも９８
〜９９％同一であるポリヌクレオチドがさらに非常に好ましく、そして少なくと
も９９％同一のポリヌクレオチドが最も好ましい。プローブ又はマーカーとして
の増幅のために又は使用のために有用な条件下でハイブリダイズするために、配
列番号１，３，５，７又は９に含まれるヌクレオチド配列に対して十分な同一性
を有するヌクレオチド配列もまた、LbpBポリヌクレオチド下に包含される。本発
明はまた、そのようなLbpBポリヌクレオチドに対して相補的であるポリヌクレオ
チドも提供する。

【００５６】配列番号１，３，５，７及び9 で提供されるLbpBポリヌクレオチドは、それぞ
れ、ナイセリア・メニンギチジス株BNCV、M 981 、H 44／76、M 990 及び881607
からのLbpBポリヌクレオチドである。配列番号２，４，６，８又は１０のLbpBポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチド配列は、番号１のヌクレオチド100 〜2774に含まれるポリペプチドコード
配列、又はそれぞれ配列番号３，５，７又は９に含まれるポリペプチドコード配
列に対して同一であり得、又はそれは、遺伝子コードの冗長（縮重）の結果とし
て、配列番号２，４，６，８又は１０のポリペプチドを又コードする配列であり
得る。

【００５７】本発明のポリヌクレオチドがLbpBポリペプチドの組換え生成のために使用され
る場合、そのポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチド（残基１９から、配列番号
２，４，６，８及び１０のC −末端まで）又はそのフラグメントのためのコード
配列を単独で；あるいは他のコード配列、たとえばリーダー又は分泌配列、プレ
−、もしくはプレプロ−タンパク質配列、又は他の融合ペプチド部分（配列番号
２の残基１〜１８、すなわちLbpBの天然のシグナル配列）をコードする配列とオ
ープンリーディングフレームを整合して存在する成熟ポリペプチド又はフラグメ
ントのためのコード配列を包含することができる。

【００５８】たとえば、融合されたポリペプチドの精製を促進するマーカー配列がコードさ
れ得る。本発明のこの観点の好ましい態様においては、マーカー配列は、ｐQEベ
クター（Qiagen, Inc.）で提供され、そしてGentz など., Pro Natl Acad Sci U
SA (1989) 86: 821 −824 に記載されるように、ヘキサ−ヒスチジンペプチドで
あり、又はHA標識であり、又はグルタチオン−S −トランスフェラーゼである。
その天然のシグナル配列（配列番号２の残基１〜１８）に融合したLbpBもまた好
ましい。ポリヌクレオチドはまた、非コード5'及び3'配列、たとえば転写され、
翻訳されていない配列、スプライシング及びポリアデニル化シグナル、リボソー
ム結合部位、及びｍRNA を安定化する配列も含むことができる。

【００５９】さらに好ましい様態は、はじめに記載されたL ｂｐB ポリペプチド変異体をコ
ードするポリヌクレオチドである。最も好ましくは、それらは、いくつかの、10
〜２５，５〜１０，１〜５，１〜３，１〜２又は１個のアミノ酸残基がいずれか
の組み合わせで置換され、欠失され、又は付加されている配列番号２，４，６，
８又は１０のLbpBポリペプチドのアミノ酸配列を含んで成り、そしてそれらはLb
pBポリペプチドの生物学的活性の少なくとも１つを保持している。

【００６０】本発明はさらに、上記配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。
これに関しては、本発明は特に、上記ポリヌクレオチドに、緊縮条件下でハイブ
リダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書において使用される場合、用
語“緊縮条件”とは、配列間に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％
、より好ましくは少なくとも９５％、そしてさらにより好ましくは９７％〜９９
％の同一性が存在する場合にのみハイブリダイゼーションが生じることを意味す
る。

【００６１】配列番号１，３，５，７又は９に含まれるヌクレオチド配列又はそのフラグメ
ントに対して同一であるか又は十分に同一である本発明のポリヌクレオチドは、
LbpBポリペプチドをコードする十分な長さのｃDNA およびゲノムクローンを単離
するために、及びLbpB遺伝子に対して高い配列類似性を有する他の遺伝子（たと
えば、ナイセリア・メニンギチジス以外の種からの相同体（homolog ）及びオル
ト体（ortholog）をコードする遺伝子）のｃDNA およびゲノムクローンを単離す
るために、ｃDNA およびゲノムDNA のためのハイブリダイゼーションプローブと
して使用され得る。

【００６２】そのようなハイブリダイゼーション技法は、同業者に知られている。典型的に
は、それらのヌクレオチド配列は、対照の配列に対して、８０％同一であリ、好
ましくは９０％同一であり、より好ましくは９５％同一である。プローブは、少
なくとも１５個のヌクレオチドを含むであろう。好ましくは、そのようなプロー
ブは、少なくとも３０個のヌクレオチドを有し、そして少なくとも５０個のヌク
レオチドを有することができる。特に好ましいプローブは、３０〜５０個のヌク
レオチドの範囲であろう。

【００６３】１つの態様においては、ナイセリア・メニンギジチス以外の種からの相同体及
びオルト体を包含する、LbpBポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの獲得
は、配列番号１，３，５，７又は９に含まれるヌクレオチド配列、又はそのフラ
グメントを有するラベルされたプローブにより、緊縮ハイブリダイゼーション条
件下で適切なライブラリーをスクリーニングし；そして前記ポリヌクレオチド配
列を含む十分な長さのDNA 及びゲノムクローンを単離する段階を含んで成る。

【００６４】従って、もう１つの観点においては、本発明のLbpBポリヌクレオチドはさらに
、配列番号１，３，５，７又は９に含まれるヌクレオチド配列又はそのフラグメ
ントを有するヌクレオチド配列に対して、緊縮条件下でハイブリダイズするヌク
レオチド配列を含んで成るヌクレオチド配列を含む。また、上記のハイブリダイ
ゼーション条件により得られるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配
列を含んで成るポリペプチドもまた、LbpBポリペプチドと共に含まれる。そのよ
うなハイブリダイゼーション技法は、当業者によく知られている。

【００６５】緊縮ハイブリダイゼーション条件は、上記で定義された通りであり、あるいは
、５０％ホルムアミド、５×SSC （150mM のクエン酸三ナトリウム）、５０mMの
リン酸ナトリウム（ｐH ７．６）、５×Denhardt's 溶液、１０％の硫酸デキス
トラン、及び２０μg ／mlの変性され剪断されたサケ精子DNA を含んで成る溶液
における４２℃での一晩のインキュベーション、続く約６５℃での０．１×SSC
におけるフィルターの洗浄の条件である。本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドは、動物及びヒト疾病に対する処
理及び診断の発見のための研究試験及び材料として使用され得る。

【００６６】ベクター、宿主細胞、発現本発明または本発明のポリヌクレオチド又はポリペプチドを含んで成るベクタ
ー、及び本発明のベクターにより遺伝子的に構築された宿主細胞、及び組換え技
法による本発明のポリペプチドの製造に関する。無細胞翻訳系はまた、本発明の
DNA 構造体に由来するRNA を用いてのそのようなタンパク質を生成するためにも
使用され得る。

【００６７】組換え製造に関しては、宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドのために発現
系又はその一部を組み込むように遺伝子的に構築され得る。宿主細胞中へのポリ
ヌクレオチドの導入は、多くの標準的実験マニュアル、たとえばDavis ., BASIC
METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY （1986）及びSambrook など., MOLECULAR CLO
NING: A LABOLATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, N.Y. （1989）に記載される方法、たとえばリン酸カルシ
ュウムトランスフェクション、マイクロインジェクション、カチオン性脂質−
介在性トランスフェクション、エレクトロポレーション、トランスダクション、
スクレープ、ローディング、弾道導入（ballistic introduction）又は感染によ
りもたらされ得る。

【００６８】適切な宿主の代表的な例は、細菌細胞、たとえば髄膜炎菌、ストレプトコッカ
ス（Streptococci）、スタフィルコッカス（Staphylococci ）、E.コリ（E.coki
）、ストレプトミセス（Streptomyces）及びバシラス・スブチリス（Bacillus s
ubtilis ）；菌類（fungus）細胞、たとえば酵母細胞及びアスペルギラス（Aspe
rgillus ）細胞；昆虫細胞、たとえばDrosophila S2 及びSpodoptera Sf9細胞；
動物細胞、たとえばCHO 、COS 、HeLa、C 127 、3T 3、BHK 、HEK 293 及びBowe
s 黒色腫細胞；及び植物細胞を包含する。

【００６９】多種の発現系が使用され得る。そのような系は、中でも、染色体、エピソーム
及びウィルス−由来の系、たとえば細菌プラスミド、バクテリオファージ、トラ
ンスポゾン、酵母エピソーム、挿入要素、酵母染色体要素、ウィルス、たとえば
バキュロウィルス、パポーバウィルス、たとえばSV４０、ワクシニアウィルス、
アデノウィルス、鳥ポックスウィルス、仮性狂犬病ウィルス及びレトロウィルス
に由来するベクター、及びそれらの組み合わせに由来するベクター、たとえばプ
ラスミド及びバクテリオファージ遺伝子要素、たとえばコスミド及びファージミ
ドに由来するベクターを包含する。

【００７０】発現系は、発現を調節し、そして生ぜしめる制御領域を含むことができる。一
般的に、宿主においてポリペプチドを生成するためにポリヌクレオチドを維持し
、成長せしめ、又は発現するのに適切ないずれかの系又はベクターが使用され得
る。適切なヌクレオチド配列は、いずれかの種々のよく知られており、且つ通常
の技法、Sambrookなど.,MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL（前記）に示
される技法により、発現系中に挿入され得る。

【００７１】原形質綱状体への、ペリプラズム空間への、又は細胞外環境中への翻訳された
タンパク質の分泌のためには、適切な分泌シグナルが所望のポリペプチド中に導
入され得る。それたのシグナルは、ポリペプチド（配列番号２，４，６，８又は
１０の残基１〜１８）に対して内因性であり得、又はそれらは異種シグナルでも
あり得る。

【００７２】脂質化された組換えLbpBを発現するためには、好ましくは、内因性シグナルペ
プチドが遺伝子構造体にコードされ、そして好ましい宿主系は細菌宿主であろう
。 LbpBポリペプチドがスクリーニングアッセイへの使用のために発現される場合
、一般的に、前記ポリペプチドは細胞の表面で生成されることが好ましい。この
場合、細胞は、スクリーニングアッセイへの使用の前、収穫され得る。LbpBポリ
ペプチドが培地中に分泌される場合、その培地は回収され、ポリペプチドが回収
され、そして精製され得；細胞内生成される場合、細胞はまず細胞溶解され、そ
の後にポリペプチドが回収されるべきである。

【００７３】 LbpBポリペプチドは、よく知られている方法、たとえば硫酸アンモニュウム又
はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホ
スホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和
性クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、及びレクチ
ンクロマトグラフィーにより、組換え細胞培養物から回収され、そして精製され
得る。最も好ましくは、高性能液体クロマトグラフィーが、精製のために使用さ
れる。タンパク質を再生する（refolding ）ためのよく知られている技法が、ポ
リペプチドが単離及び／又は精製の間、変性される場合、活性コンホメーション
を再生するために使用され得る。

【００７４】診断アッセイ本発明はまた、診断試薬としての使用のためのLbpB、LbpBに対する抗体、及び
LbpBに対する抗体を示すファージの使用に関する。LbpBの検出は、中でも、ナイ
セリア疾病の診断に加えられ、又はそれを定義できる診断手段を提供するであろ
う。診断のための材料は、対象細胞、たとえば血液、尿、唾液、組織生検から得ら
れる。

【００７５】従って、もう１つの観点においては、本発明は、疾病、特にナイセリア疾病の
推測のための診断キットに関し、ここで前記キットは：（ａ）ＬbpB ポリヌクレオチド、好ましくは配列番号１，３，５，７又は９の
ヌクレオチド配列、又はそのフラグメント；（ｂ）上記（ａ）の配列に対して相補的なヌクレオチド配列；（ｃ）LbpBポリペプチド、好ましくは配列番号２，４，６，８又は１０のポリ
ペプチド、又はそのフラグメント；（ｄ）LbpBポリペプチド、好ましくは配列番号２，４，６，８又は１０のポリ
ペプチド（そして、より好ましくは、配列番号２，４，６，８又は１０のポリペ
プチドの残基１９〜C −末端）に対する抗体；又は（ｅ）LbpBポリペプチド、好ましくは配列番号２，４，６，８又は１０のポリ
ペプチド（そして、より好ましくは、配列番号２，４，６，８又は１０のポリペ
プチドの残基１９〜Ｃ−末端）に対する抗体を示すファージを含んで成る。

【００７６】いずれかのそのようなキットにおいては、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又
は（ｅ）は実質的な成分を構成することが理解されるであろう。

【００７７】抗体本発明のポリペプチド又はそれらのフラグメントもしくは類似体、あるいはそ
れらを発現する細胞はまた、LbpBポリペプチドに対して免疫特異的な抗体を生成
するために免疫原としても使用され得る。用語“免疫特異的”とは、抗体が従来
技術における他の関連するポリペプチドに対するそれらの親和性よりも、本発明
のポリペプチドに対して実質的に高い親和性を有することを意味する。

【００７８】 LbpBポリペプチドに対して生成された抗体は、通常のプロトコールを用いて、
動物、好ましくは非ヒトに、ポリペプチド、又はエピトープ担持のフラグメント
、類似体又は細胞を投与することによって得られる。モノクローナル抗体の調製
のためには、連続的細胞系培養物により生成される抗体を提供するいずれかの技
法が使用され得る。例としては、ハイブリドーマ技法（Kohler, G. and Milstei
n, C., Nature (1975) 256: 495 −497 ）、トリオーマ技法、ヒトＢ−細胞ハイ
ブリドーマ技法（Kozborなど., Immunology Today (1983) 4: 72）、及びEVB −
ハイブリドーマ技法（Cole など., MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAP
Y, pp.77−96, Alan R. Liss, Inc., 1985）を挙げることができる。

【００７９】単鎖抗体の生成のための技法（アメリカ特許4,946,7778号）はまた、本発明の
ポリペプチドに対する単鎖抗体を生成するために適合され得る。また、トランス
ジェニックマウス又は他の生物、たとえば他の哺乳類が、ヒト化抗体を発現する
ために使用され得る。上記抗体は、ポリペプチドを発現するクローンを単離し、もしくは同定するた
めに、又は親和性クロマトグラフィーによりポリペプチドを精製するために使用
され得る。 LbpBポリペプチドに対する抗体はまた、中でもナイセリア疾病（たとえば髄膜
炎）を治療するためにも使用され得る。

【００８０】ワクチン本発明のもう１つの観点は、哺乳類（好ましくはヒト）において免疫学的応答
を誘発するための方法に関し、ここで前記方法は、中でも、ナイセリア疾病から
前記動物を保護するための抗体及び／又はＴ細胞免疫応答を生じさせるために適
切な、LbpBポリペプチド又はエピトープ−担持のフラグメント、類似体、外層膜
小胞又は細胞（弱毒化されているか又は他のものである）を哺乳類に接種するこ
とも含んで成る。

【００８１】さらに、本発明のもう１つの観点は、哺乳類（好ましくはヒト）において免疫
学的応答を誘発するための方法に関し、ここで前記方法は、疾病から前記動物を
保護するための抗体を生成するためにそのような免疫学的応答を誘発するために
、インビボでのLbpBポリヌクレオチドの発現を指図するベクターを通してLbpBポ
リペプチドを供給することを含んで成る。

【００８２】本発明のさらなる観点は、哺乳類宿主（好ましくはヒト）中に導入される場合
、その哺乳類において、LbpBポリペプチドに対する免疫応答を誘発する免疫学的
組成物又はワクチン製剤に関し、ここで前記組成物はLbpB遺伝子、LbpBポリペプ
チド、又はエピトープ−担持のフラグメント、類似体、外層膜小胞又は細胞（弱
毒化されているか他のものである）を含んで成る。ワクチン配合物はさらに、適
切なキャリアーを含むことができる。LbpBワクチン組成物は好ましくは、経口又
は非経口（たとえば、皮下、筋肉内、静脈内、皮層下、等）投与される。

【００８３】非経口投与のために適切な配合物は、酸化防止剤、緩衝液、静菌剤、及び受容
体の血液と共に配合物を等張性にする溶質を含む水性及び非水性無菌注射用溶液
；及び懸濁剤又は増粘剤を含む水性又は非水性無菌懸濁液を含む。配合物は単位
−用量容器、たとえば密封されたアンプル及びバイアルにおいて提供され得、そ
して使用の直前、無菌液体キャリアーの添加のみを必要とする凍結乾燥条件下で
貯蔵され得る。ワクチン配合物はまた、配合物の免疫原生を増強するためのアジ
ュバント系、たとえば水中油型系及び当業者において知られている他の系を含む
ことができる。投与量は、ワクチンの比活性に依存し、そして通常の実験により
容易に決定され得る。

【００８４】さらにもう１つの観点は、本発明のポリペプチドを含んで成る免疫学的ワクチ
ン配合物に関する。そのような技法は当業界において知られており；たとえば、
Wolff など., Science (1990) 247: 1468 −8 を参照のこと。

【００８５】スクリーニングアッセイ本発明のLbpBポリペプチドは、本発明のLbpBポリペプチドと拮抗する化合物（
アンタゴエスト、又はインヒビターと呼ばれる）についてのスクリーニング方法
に使用され得る。従って、本発明のポリペプチドは又たとえば細胞、細胞フリー
調製物、化学的ライブラリー、及び天然の生成物混合物からアンタゴニストを同
定するためにも使用され得る。

【００８６】それらのアンタゴニストは、本発明のポリペプチドの場合、天然の又は変性さ
れた基質、リガンド、受容体、酵素、等であり得；又は本発明のポリペプチドの
構造的又は機能的擬似物であり得る。Coligan など., Current Protocols in Im
munology 1 (2): Chapter 5 (1991)を参照のこと。LbpBポリペプチドは、多くの
病理学を包含する多くの生物学的機能を担当できる。従って、LbpBポリペプチド
の機能を阻害できる化合物及び薬物を見出すことが所望される。一般的には、ア
ンタゴニストは、ナイセリア疾病のような病状についての種々の治療及び予防目
的のために使用され得る。

【００８７】一般的に、そのようなスクリーニング方法は、LbpBポリペプチドを発現し、又
は本発明のLbpBポリペプチドに応答する適切な細胞の使用を包含する。そのよう
な細胞は、哺乳類、酵母、ショウジョウバエ又はＥ．コリからの細胞を包含する
。次に、LbpBポリペプチド（又は発現されたポリペプチドを含む細胞膜）を発現
し、又はLbpBポリペプチドに応答する細胞が、結合又は機能的応答の阻害を観察
するために試験化合物と接触せしめられる。候補体化合物と接触せしめられた細
胞の能力が、LbpB活性について接触されていない同じ細胞の能力と比較される。

【００８８】アッセイは、候補体化合物の結合を単に試験すればよく、ここでLbpBポリペプ
チドを担持する細胞への付着が、候補体化合物と直接的又は間接的に会合するラ
ベルにより、あるいはラベルされた競争体との競争を包含するアッセイにおいて
検出される。さらに、アッセイは、単純には、LbpBポリペプチドを含む溶液と候補体化合物
とを混合して混合物を形成し、該混合物中のLbpB活性を測定し、そして該混合物
のLbpB活性を標準と比較する段階を含んで成る。

【００８９】 LbpB cDNA,タンパク質、及び前記タンパク質に対する抗体はまた、細胞におけ
るLbpB mRNA 及びタンパク質の生成に対する添加された化合物の効果を検出する
ためのアッセイを構成するためにも使用され得る。たとえば、ELISA は、当業界
において知られている標準的方法によりモノクローナル及びポリクローナル抗体
を用いて、分泌された又は細胞に結合したＬbpB タンパク質のレベルを測定する
ために構成され得、そしてこれは、適切に操作された細胞又は組織からのLbpB（
また、アンタゴニストと呼ばれる）の生成を阻害できる剤を発見するために使用
され得る。

【００９０】可能性あるLbpBポリペプチドアンタゴニストの例は、抗体、又は多くの場合、
LbpBポリペプチドのリガンド又は基質、たとえばリガンド又は基質のフラグメン
トに密接に関係するオリゴヌクレオチド又はタンパク質；又は本発明のポリペプ
チドに結合するが、しかし応答を誘発せず、その結果、ポリペプチドの活性が妨
げられる小分子を包含する。

【００９１】従って、もう１つの観点においては、本発明はLbpBのためのアンタゴニスト、
リガンド又は基質を同定するためのスクリーニングキットに関し、ここで前記キ
ットは：（ａ）LbpBポリペプチド、好ましくは配列番号２，４，６，８又は１０のポリ
ペプチド；（ｂ）LbpBポリペプチド、好ましくは配列番号２，４，６，８又は１０のポリ
ペプチドを発現する組換え細胞；（Ｃ）LbpBポリペプチド、好ましくは配列番号２，４，６，８又は１０のポリ
ペプチドを発現する細胞膜；又は（ｄ）LbpBポリペプチド、好ましくは配列番号２，４，６，８又は１０のポリ
ペプチドに対する抗体；を含んで成る。

【００９２】いずれかのそのようなキッドにおいては、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）
は実質的な成分を含んで成ることが理解されるであろう。

【００９３】配合及び投与ペプチド、たとえば可溶性形のLbpBポリペプチド、及びアンタゴニストペプチ
ド又は小分子は、適切な医薬キャリヤーと組み合せて配合され得る。そのような
配合は、治療的有効量のポリペプチド又は化合物、及び医薬的に許容できるキャ
リヤー又は賦形剤を含んで成る。そのようなキャリヤーは、塩溶液、緩衝された
塩溶液、水、グリセロール、エタノール及びそれらの組み合わせを包含するが、
但しそれらだけには限定されない。配合は、投与の形態を好都合にし、そして十
分に当業者の範囲内である。本発明はさらに、本発明の前記組成物中の１又は複
数の成分により満たされた１又は複数の容器を含んで成る医薬パック及びキット
に関する。

【００９４】本発明のポリペプチド及び他の化合物は、単独で、又は他の化合物、たとえば
治療用化合物と共に使用され得る。医薬組成物の全身性投与の好ましい形は、注射、典型的には静脈内注射である
。他の注射経路、たとえば“皮下、筋肉内、又は腹腔内経路が使用され得る。全
身性投与の他の手段は、浸透剤、たとえば胆汁酸塩又はフシジン酸（fusidic ac
id）又は他の界面活性剤を用いての粘膜及び経皮内投与を包含する。さらに、腸
溶性又は封入された配合物において適切に配合される場合、経口投与も可能であ
る。それらの化合物の投与はまた、軟膏、ペースト、ゲル及び同様のものの形で
、局所及び／又は局部適用され得る。

【００９５】必要とされる投与量範囲は、ペプチドの選択、投与経路、配合物の性質、対象
の状態の性質、及び同伴する実施者の判断に依存する。しかしながら、適切な投
与量は、０．１〜１００μg ／kg対象の範囲である。しかしながら、必要とされ
る投与量の広い変動が、入手できる化合物の種類及び種々の投与経路の異なった
効率の観点から予測されるべきである。たとえば、経口投与は、静脈内注射によ
る投与よりも高い投与量を必要とすることが予測されるであろう。それらの投与
量レベルの変動は、当業者において十分に理解されるように、最適化のための標
準の経験的慣例を用いて調節され得る。

【００９６】例下記例は、当業者によく知られているが、但しここで詳細に記載される標準技
法を用いて実施される。例は例示的であって、本発明を限定されるものではない
。例１：細菌株及び増殖条件使用される細胞株は、表１に列挙される。髄膜炎菌を、Vitox ( Oxoid ) によ
り補充されたＧＣ寒天プレート( Difco ) 上で、湿気のある５％のCO₂雰囲気下
で３７℃で一晩、培養した。鉄−調節されたタンパク質の最適発現を、５μg ／
mlの鉄キレート化剤、エチレンジアミンジ−Ｏ−ヒドロキシフェニル酢酸（EDDA
, Siguma）を添加することによって達成した。

【００９７】 SDS −PAGE、イムノブロットのためのサンプルの調製、及び染色体DNA の単離
のために、細胞を前記（Pettersson など., 1993 ）のようにして増殖した。 λgt II ファージを増殖するために使用されるＥ．コリ株Y1090 （Youg and D
avis, 1983）を、アンピシリン（100 μl/ml）、０．２％のマルトース及び１０
mMの塩化マグネシウムを補充したLuria −Bertoldi (LB) 培地において増殖させ
た。クローニングのために使用される株DH5 αを、組換え体の選択のために必要
とされる場合、100 μl/mlのアンピシリン、25μg/mlのエリトロマイシンを補充
したＬＢ培地において増殖した。

【００９８】 PEMBL １９−誘導体による形質転換の後、細胞を、挿入体を有するプラスミド
についてスクリーンするために、適切な抗生物質、５−ブロモ−４−クロロ−３
−インドイル−β−D −ガラクトシド（40μg/ml）及び0.5mM のイソプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを補充したＬＢプレート上にプレートした。単
鎖DNA を調製するために使用される株ＰＣ２４９４を、５μg ／mlのチアシン及
び０．２％のグルコースを補充した最小培地プレート上で維持した。

【００９９】例２：２Ａ：ペプチドに対するマウス抗血清の調製ペプチド（図３）を、自動複数ペプチド合成機を用いて合成し、そして記載の
ようにして（Van Der Ley など., 1991 ）、破傷風トキソイドと連結したBALB／
C マウスを、５０μg のペプチド及びアジュバンドとしてのQuil A 20 μg によ
り免疫した。２回の追加免疫化が与えられた。血清を、最初の注射の５４日後に
集めた。

【０１００】２Ｂ：lbpB遺伝子生成物の同定推定上のlbpB遺伝子がタンパク質をコードするかどうかを調べるために、抗血
清を、一部のオープンリーディングフレームの推定されるアミノ酸配列に基づく
合成ペプチド（図３においてＡ１−Ｅ１として示される）に対して生じさせた。
抗血清を、鉄−限定下で増殖された株BNCVの完全細胞に対するウェスターンブロ
ット上で試験した。ペプチドＢ１に対する血清は、いずれの反応も示さなかった
（データは示されていない）。他のペプチドに対する抗血清は、約９５kD のバ
ンドを伴って反応した（図１）。

【０１０１】このバンドはlbpB変異体（下記のようにして構成された）においては欠失して
いるので（図１、レーン３及び７）、lbpB遺伝子は野生型株において発現され、
そしてそれは95,000の見掛け分子量（Ｍｒ）を有するタンパク質をコードするこ
とが結論づけられた。ペプチドＤ１及びＥ１に対する抗血清のいくつかは、60,0
00のＭｒを有するバンドを伴って、追加の反応を示した（図１）。それらの両ペ
プチドは、TbpBにも存在する配列VVFGAKを含む（図３）。

【０１０２】従って、６８ＫのバンドがTbpBであろう。この可能性を試験するために、TbpB
変異体、Ｎ９１及びその親株B16B6 をウェスターンブロットにおいて試験した。
血清19-1（ペプチドＥ１に対する）は、株B16B6 において、それぞれ95K 及び68
K の２つのバンドて反応し、そして株N91 において、９５Ｋのバンドと反応した
。この結果は、６８Ｋのバンドが実際、TbpBであることを示す（データは示され
ていない）。

【０１０３】例３：SDS −PAGE及びイムノブロッティング完全な細胞タンパク質のSDS −PAGEを、前に記載したようにして実施した（Pe
tterssonなど., 1990, 1993 ）。LbpBの変性が妨げられた実験においては、次の
修飾が包含された。サンプル緩衝液は、β−メルカプトエタノールを含まなかっ
た。外層膜複合体は、電気泳動の前、サンプル緩衝液において９５℃で加熱され
なかったが、しかし氷上で又は３７℃で１０分間インキュベートした。ラクトフ
ェリン結合実験においては、ポリアクリルアミドゲルは、5%(w/v) の積層ゲル、
及び0.05%(w/v)のSDS を含む8%(w/v) の分解ゲルから構成された。電極緩衝液は
、０．１％の代わりに０．０５％のSDS のみを含んだ。電気分解は、100Vの一定
電圧で２時間４℃で実施された。２％のＳＤＳを含む標準のサンプル緩衝液を使
用した。

【０１０４】 LbpBの折りたたまれた形を検出するための外層膜タンパク質の電気泳動を、Ｓ
ＤＳ緩衝液ストリップと共に7.5%(w/v) の均質ポリアクリルアミドゲルを用いて
、PhastSystem( Pharmacia )の説明書に従って実施した。イムノブロットを前に記載したようにして実施した（Petterssonなど., 1990,
1993 ）。PhastSystem ゲルの場合、ブロット緩衝液は0.05%(w/v)のSDS を含み
、そしてペルオキシダーゼの活性を、製造業者（Amersham）の説明書に従って、
ECL システムにより検出した。マウス抗血清を、1:500 の希釈度で使用した。Lb
pA−特異的モノクローナル抗体mn98K1及びmn98K2 ( Pettersson など., 1993)を
、それぞれ1:2000の希釈度でカクテルとして使用した。

【０１０５】例４：４Ａ：クローニング及び配列決定法株BNCVからのλgt II 遺伝子ライブラリーは、E.C. Gotschlich (The Rockefe
ller University, New York, USA) により提供された。ライブラリーを、Ｅ．コ
リ株Y1090 において増殖せしめ、そしてDNA プローブBE1 及びAP6 によりスクリ
ーニングした（図２）。BE1 は、プラスミドpAM1(Pettersson など, 1993) の３
５５bpのBstEII-EcoRIフラグメントの単離より調製された。AP6 は、プラスミド
pAM6から調製された４１７bpのEcoRI-EcoRV フラグメントであった。

【０１０６】プローブラベリング、プラークブロット及び検出を、DIG DNA Labeling及び
Detection キット（Boehringer Mannheim ）を用いて、記載のようにして（Pett
erssonなど., 1993 ）実施した。λDNA を単離し（Sambrookなど., 1989 ）、そ
して挿入体をファージミドpEMBL19 中にサブクローニングした。プラスミドDNA
を、製造業者により記載されるようにして、Jetstar ミニカラム（Genomed ）上
で単離した。一本鎖DNA を、ヘルパーファージVCSM１３（Stratagene）を用いて
増殖した。

【０１０７】染色体DNA を、記載のようにして単離した（Ausubel など., 1989 ）。DNA を
AccI及びDraIにより消化し、そして１％アガロースゲル上で分離した。サザンブ
ロットを記載のようにして実施した（Petterssonなど, 1993）。プローブES1 （
図２）を、pAM １３からの３２０bpのEcoRI-SalI- フラグメントの単離により調
製し、そして上記のようにしてラベルした。前記プローブは、サザンブロット上
でのAccI／DraI消化された染色体DNA 中の１．５kbのフラグメントと反応した。
１．５kbのフラグメントをゲルから単離し、pEMBL １９中に連結した。連結混合
物を、M13 普遍プライマー（Pharmacia ）及びLB11プライマー（表２）によりＰ
ＣＲ増幅した。Goldstarポリメラーゼ、すなわちTaq ポリメラーゼ誘導体( Euro
gentec )を、製造業者からの説明書に従って、PCR 増幅のために使用した。１．
３kbのPCR 生成物を、アガロースゲルから精製した。

【０１０８】 DNA 配列決定を、deaza G/A T7 Sequencing Mixes (Pharmacia) を用いて手動
的に、又はＡＢＩ Prism 310 Genetic Analyzer (Perkin Elmer)を用いて自動的
に実施した。自動配列決定のためには、ラベリングは、Dye Terminator Cycle配
列決定キット（Perkin Elmer）により行った。内部プライマー（Pharmacia 又は
Gibco BRL ）により合成された）、及びMIS 普遍及び逆方向プライマー（Pharma
cia ）を、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖プラスミドDNA 又はＰＣＲ生成物の配列決定の
ために使用した。類似する方法を用いて、Ｎ．メニンギチジスのH44/76及びM981株からのlbpB遺
伝子を配列決定した。

【０１０９】４Ｂ：lbpB遺伝子のクローニング及び配列決定 lbpB遺伝子の欠失部分をクローン化するために、株BNCVのλgtII遺伝子ライブ
ラリーをDNA プローブによりスクリーニングした。２種の異なるλクローンを見
出した。挿入体をpEMBL19 にサブクローニング化し、プラスミドpAM6及びpAM13
（図２）を生じさせ、そして配列決定した。LbpB遺伝子のプロモーター及び開始
部はこの手段においては見出されなかった。

【０１１０】遺伝子の5'末端をクローン化するためのいくつかの他の試みは失敗に終わり、
このことは、その発現がＥ．コリに対して毒性であることを示唆する。配列の残
りを得るために、富化バンクを、AccI及びDraIにより消化された染色体DNA から
調製した。約１．５kbの染色体DNA フラグメントを、pEMBL19 において連結し、
そしてPCR 増幅を、lbpB配列及びM13 プライマーの既知部分に基づくプライマー
（LB11；図２を参照のこと）を用いて、連結混合物上で直接的に実施した。その
得られるPCR 生成物（図２）を、配列決定のために直接的に使用した。この方法
は、Ｅ．コリにおける可能性ある毒性遺伝子のクローニングを回避する。

【０１１１】種々のlbpBフラグメントの配列決定は、2,175bp のオープンリーディングフレ
ームを示した。それは、79.4kDa の分子質量を有する725 個のアミノ酸残基（図
３）のタンパク質をコードする。Ｎ−末端配列の分析は、シグナルペプチダーゼ
II（von Heijne, 1989）により認識されるシグナル配列の特徴を示した。そのよ
うなシグナル配列は、成熟タンパク質のＮ−末端システイン残基でアシル化され
るリポタンパク質の前駆体に存在する。類似するシグナル配列が、実際、脂質修
飾されることがわかっているTbpBタンパク質に見出された（Andersonなど, 1994
）。

【０１１２】成熟LbpBタンパク質は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳
動(SDS-PAGE)において観察される９５kDa の見掛け分子質量よりも相当に低い、
７７．５kDa の計算された分子質量を有する（図１）。他のタンパク質に対する
類似性についてのSwiss Protデータベースのスクリーニングは、ナイセリア及び
アクチノバチルス・プレウロプネウモニアエ（Actinobacillus pleuropneumonia
e ）のTbpBに対する相同性を示した。最高の相同性、すなわち３３％の同一性（
PALIGNプログラムを用いての）が、Ｎ．メニンギチジス株B16B6 （Legrain など
., 1993 ）のTbpBに対して見出された（図３）。

【０１１３】 TbpBタンパク質において、いくつかの内部反復体が見出され、そしてその分子
が、内部倍化の後に生成される２−葉構造を有することが提案されている（Full
erなど., 1996; Renauld-Mongenie など,1996 ）。成熟lbpBタンパク質のＮ−末
端の354 個のアミノ酸がそのＣ−末端の３５３個のアミノ酸と共に整列される場
合、３０％の同一性及び１０％の類似性が見出された（データは示されていない
）。この結果は又、LbpBが二葉構造で存在することができることを示す。タンパ
ク質の等電点は４．５である。酸性残基に富んでいる２つの長い延長部がその配
列において識別され得る（図３）。それらの延長部はTbpBを欠いているので、そ
れらは、トランスフェリンに比較して、正に荷電された分子であるラクトフェリ
ンの結合のために重要である。

【０１１４】プロモーター領域に、典型的なShine-Dalgarno 配列が認識され得た。さらに
、推定上の−１０及び−３５ボックスが見出された（図４）。Fur −結合部位の
特徴を示す配列は−１０ボックスとオーバーラップする。Fur は、Ｆe²⁺と共に
、プロモーター領域における１９bpの配列に結合することによって、鉄−調節さ
れた遺伝子のリプレッサーとして作用する（Bagg and Neilands, 1987 ）。その
ようなFur −ボックスのコンセンサス配列はGATAATGATAATCATTATC であり、そし
て前記整列の１９bpのうち１６bpがlbpBプロモーターにおけるこの要素に保存さ
れる。

【０１１５】さらに、プロモーターの上流に、B1bpの直接的な反復体が見出された（データ
は示されていない）。この配列は、この位置で少なくとも２度、存在する。同じ
直接的な反復体がlbpA遺伝子の下流に見出された（Prinz など, 公開されていな
い観察）。FASTA 相同性調査は、ほとんどがオープンリーディングフレームを挟
む多くのナイセリア配列への前記反復体の相同性を示した。ナイセリア・メニンギチジスのBNCV株とM981株のLbpBタンパク質間の、及びナ
イセリア・メニンギチジスのBNCV株とh44/76株のLbpBタンパク質間の配列相同体
は、それぞれ７２．７％及び７８．５％である。

【０１１６】例５：５Ａ: 同系変異体（isogenic mutant ）の作製プラスミドpAM23 及びpAN6を、それぞれ、lbpA及びlbpBの挿入不活性化のため
に使用した。pER2(Jennings など, 1993) からのエリトロマイシン耐性(Erm^r)
カセットを、ClaI及びHindIII により切除した。フラグメントをT4 DNAポリメラ
ーゼにより処理し、そしてEcoRV により消化されたpAM23 に連結し、プラスミド
pAN23E をもたらした。pUC4K(Phamrmacia) からのカナマイシン耐性（Km^r）カ
セットをHincIIにより切除した。

【０１１７】プラスミドpAM6をBglII により線状化し、そしてT4 DNAポリメラーゼにより処
理した。Km^r- カセットをこの部位において連結し、プラスミドpAM6K をもたら
した。ナイセリア取り込み配列（GCCGTCTGAA）及びKpnI- 適合性−本鎖末端を含
む、オリゴヌクレオチドnus1 及びnus2（表２）から構成されるリンカーを、pA
B6K のKpnI−部位においてクローン化し、プラスミドpAM6K-nus をもたらした。
構成物質耐性遺伝子は、それぞれ、プラスミドpAM23E及びpAM6K(-nus) において
LbpA及びlbpBと同じ方向に存在した。KpnIにより線状化されたプラスミドpAM23E
を、前記のようにして株H44/76を形質転換するために使用した（van der Ley an
d Poolman, 1992 ）。

【０１１８】形質転換体を、１ml当たり５μg のエリトモイシンを含むＧＣプレート上で選
択した。CE1449と称する、形質転換体の１つにおける正しい遺伝子置換を、プラ
イマーＦＷ５及びDVAS2(表２) を用いて、PCR により、及びプローブAP23 (図２
；pAM23 karano 184bpのSspI-Hind III フラグメントとして単離される) を用い
て、サザンブロット分析により評価した。サザンブロットのためには、染色体DN
A をClaI及びSalIにより消化した。この株が形質転換できると思われないので、
同系変異体はエレクトロポレーションにより調製された（Genco など., 1991 ）
。

【０１１９】 CE1449からの染色体DNA を用いて、lbpA変異体を製造した。形質転換体を、エ
リトロマイシンを含むＧＣプレート上で選択しそして上記のようにして確証した
。プラスミドpAM6K-nus を用いて、lbpB変異体を製造した。形質転換体を、１０
０μg/mlのカナマイシンを含むＧＣプレート上で選択した。正しい遺伝子置換を
、プライマーSDA1及びPR1(表２) を用いて、PCR により、及びプローブAP23E を
用いて、サザンブロットにより確証した。

【０１２０】５Ｂ: 同系変異体の構造９４kDa のタンパク質の同一性を確かめるため、及びラクトフェリン結合及び
利用における個々のラクトフェリン−結合タンパク質の役害を調べるために、Lb
pA又はLbpBのいずれかを欠いているBNCVの同系誘導体を、例５Ａに記載のように
して構成した。正しい遺伝子置換を、PCR 反応において、及びサザンブロットに
より確かめた（データは示されていない）。変異体におけるLbpA及びLbpBの発現
を、ウェスターンブロット上で調べた（図５）。LbpA変異体CE1452はLbpAを発現
せず（図５Ａ、レーン４）、そしてlbpB変異体CE1454は94kDa のタンパク質を発
現しなかった（図５Ｂ，レーン６）。

【０１２１】この結果は、lbpB遺伝子が実際、野生型において発現され、そしてそれが77.5
kDa のその計算された分子質量よりも相当に高い94,000のＭｒを有するタンパク
質をコードすることを確かめた。さらに、図４からの結果は、lbpBの不活性化が
lbpA発現に対して極性効果（polar effect）を有さないことを示す（図５Ａ、レ
ーン６）。これは、lbpBにおいて挿入されたカナマイシン耐性カセットが転写タ
ーミネーターを含まないので、予測されたことである。前に記載された自発的lb
pA変異体CE1402 (Petterssonなど., 1994b) は、lbpB発現を欠いているように見
えた（図５Ｂ，レーン８）。

【０１２２】この変異体及びBNCVの両者は株Ｍ986 の誘導体であるので、その遺伝子バック
グラウンドは他の変異体のバックグラウンドと同じである。LbpA及びLbpBの両者
の発現は、鉄−調節されているように思えた（図５）。LbpAの弱い発現は、細胞
が鉄キレート化剤なしで増殖する場合でさえ、株CE1454において見出された（図
５Ａ，レーン５）。この発現はたぶん、lbpBにおけるカナマイシン耐性遺伝子の
プロモーターからの転写による。しかしながら、この場合もやはり、LbpAの発現
は、株が鉄キレート代剤の存在下で増殖する場合、数倍高められた（図５Ａ，レ
ーン６）。

【０１２３】例６：６Ａ：ラクトフェリン結合アッセイ完全細胞に結合するラクトフェリンを、ELISA −型アッセイにより評価した。
アスペルギラス・アワモリ（Aspergillus awamori ）により生成された組換えヒ
トラクトフェリンは、Agennix Inc., Houston, Texas, USA により提供された。
ラックトフェリンを、記載のようにして鉄により飽和し（van Berkelなど., 199
5 ）、続いて修飾した。FeCl₃を、Fe(NO₃)₃の代わりに使用し、そして透析を、
５mMのNa₂HPO₄/NaH₂PO₄-緩衝液（pH7.7 ）に対して4 時間、実施した。

【０１２４】プレートからのコロニーを、トリス−緩衝溶液（pH7.5 ）(TBS) に懸濁しそし
て56℃で30分間、加熱することによって殺した。６２０nmで0.05の光学密度を有
するサンプル（100 μl ）を、マイクロタイタープレートのウェル中に分配した
。サンプルを37℃で一晩、乾燥せしめた。アッセイを37℃で実施した。非特異的
な結合を、ＴＢＳ中、0.5 ％Protifar (Nutricia) 及び0.1 ％Tween 20を含むブ
ロッキング溶解100 μl により1 時間、ブロックした。

【０１２５】ブロッキングの後、ウェルを、ブロッキング溶液中、種々の濃度のラクトフェ
リンにより満たした。ウェル中のラクトフェリンの濃度は、3.125 〜200ng/mlで
あった。1 時間のインキュベーション及び水道水による3 回の洗浄の後、ヒトラ
クトフェリン（ICN Biomedicals ）に対するペルオキシダーゼ−結合されたウサ
ギポリクローナル抗血清を、ウェルに添加した。抗体は、ブロッキング緩衝液に
おいて1:5000の希釈度で使用された。1 時間のインキュベーション及び水道水に
よる3 回の洗浄の後、ペルオキシダーゼの量を検出した（Abdillahi and Poolma
n, 1987 ）。

【０１２６】ブロット上でのラクトフェリン結合を、次の通りに実施した。特異的でない結
合を、0.1 ％のTween-20及び0.5% Protifar (Nutricia)を含む0.2 ＭのNa₂HPO₄/
NaH₂PO₄緩衝液（pH5.7 ）中で膜を2 時間インキュベートすることによってブロ
ックした。ブロットを、ブロッキング緩衝溶液中で、1.2 μg/mlのペルオキシダ
ーゼに接合されたヒトラクトフェリン（Petterssonなど, 1993）と共に1 時間イ
ンキュベートし、そしてブロッキング緩衝液により３度洗浄した。ペルオキシダ
ーゼの活性を、製造業者(Amersham)の説明書に従って、ＥＣＬシステムにより検
出した。

【０１２７】６Ｂ：プレート供給アッセイ髄膜炎菌を、例１に記載のようにして、Vitox を補充したTBS において一晩、
増殖せしめた。一晩の培養物の300 μl を、３mlの上部寒天（42℃に冷却された
、１ml当たり20μg のEDDAを有する1 ％ＧＣ寒天）に懸濁し、そしてすぐに、１
ml当たり２０μg のEDDA及びVitox を補充したＧＣ寒天プレート上にプレートし
た。組換えヒトラクトフェリン（11％の鉄飽和されているか、又は上記のように
して飽和されている）の液滴（10μl ）を、プレート上に添加した。液滴中のラ
クトフェリンの濃度は、それぞれ10及び２０mg/ml であった。プレートを一晩、
増殖させた。

【０１２８】６Ｃ：ブロット上での折りたたまれたLbpBへのラクトフェリンの結合ラクトフェリンがブロット上のLbpBに結合できるかどうかを調べるために、Lb
pBを変性させないSDS −PAGEの条件を調べた（例６Ａを参照のこと）。電気泳動
に先立って、サンプル緩衝液中でサンプルが加熱されない場合、LbpBタンパク質
のより早い移動形が検出され、これは多分、タンパク質の生来の折りたたまれた
形を表す（図６Ａ）。これは、約８０kDa のMrを有した。

【０１２９】９５℃で１０分間の加熱の後、LbpBタンパク質は十分に変性し、そしてこれは
９４kDa の位置で移動した（図６Ａ, レーン２）。興味あることには、ペプチド
Ａ１に対する血清のみが（図２）、タンパク質のより早く移動する形と反応した
。このペプチドは、負に荷電されたアミノ酸に富んでおり、そして多分、ラクト
フェリン結合に関与している、２種の延長部の１つを含む。折りたたまれたタン
パク質への抗体の結合は、タンパク質のこの部分が暴露され、そしてすべての他
のペプチドエピトープがLbpBの折りたたまれた構造に隠されていることを示唆す
る。

【０１３０】続いて、折りたたまれたLbpBタンパク質へのラクトフェリンの結合を評価した
。株BNCVの外層膜タンパク質を、ニトロセルロース膜にブロットし、そしてペル
オキシダーゼ−結合されたヒトラクトフェリンと共にインキュベートした。ラク
トフェリン結合の特異性は、インキュベーション条件、最も重要なことには、ｐ
Ｈに対して非常に敏感であるように思えた。最適化された条件下で、ラクトフェ
リンは80kDa のＭｒを有するタンパク質バンドに特異的に結合した（図６Ｂ、レ
ーン１及び２）。SDS-PAGEの前、サンプルが９５℃で１０分間加熱される場合、
結合は観察されなかった（図６Ｂ、レーン３）。バンドは、lbpB変異体CE1454の
サンプルにおいては検出されなかった（データは示されていない）。従って、タ
ンパク質の折りたたまれた形をおそらく表す、LbpBタンパク質のより速く移動す
る形はラクトフェリン結合できることが結論づけられる。

【０１３１】６Ｄ：ラクトフェリン結合及び完全細胞における利用完全細胞に結合するラクトフェリンを、ELISA-型アッセイにおいて調べた。EL
ISA プレートを、同系突然変異体の株BNCVの完全細胞により被覆し、そしてラク
トフェリンを、種々の濃度で、ウェルに添加した。細胞へのラクトフェリンの結
合を、ヒトラクトフェリンに対するぺルオキシダーゼ−接合された抗体によりプ
ローブした（図７）。LbpB変異体では、ラクトフェリンを結合するその能力がわ
ずかに低い。LbpA変異体はlbpB変異体よりもラクトフェリンを効果的に結合しな
かったが、他方二重変異体はラクトフェリンを実質的にまったく結合しなかった
（図７）。

【０１３２】鉄の唯一の供給源としてラックトフェリンを利用する能力を、プレート供給ア
ッセイにおいて調べた。髄膜炎菌をプレートで鉄−制限下で増殖せしめ、組換え
ヒトラクトフェリンの液滴をプレート上に添加し、そして増殖刺激をモニターし
た。LbpB変異体はラクトフェリン上で増殖することができたが、しかしLbpA変異
体はできなかった（図８）。トランスフェリンを１１％の鉄飽和した。同じ実験
を、実質的に同じ結果を伴って、鉄−負荷されたラクトフェリンにより実施した
（データは示されていない）。それらのデータは、LbpAタンパク質がラクトフェ
リンを通しての鉄摂取のために必要であるが、lbpBは必要であるとは思われない
ことを示す。

【０１３３】例７：骨髄膜炎菌LbpBタンパク質の変異性を研究するために、次の４種の追加の株か
らのlbpB遺伝子を配列決定した：H44/76, M990, M981, 881607（表１を参照のこ
と）。７Ａ: ４種の追加の骨髄膜炎菌株からのlbpBの配列決定−方法細菌を、例１に記載されるのと同じ手段で培養した。髄膜炎DNA を、プレート
上で増殖された細菌から単離した。一晩の増殖の後細菌をプレートから剥離し、
そして１０mMのトリス−Hcl 、１０mMのEDTA(pH8) の溶液１．５mlにおいて懸濁
し、そして10μl のリゾチーム（10mg/ml ）を添加した。

【０１３４】その懸濁液を室温で１５分間インキュベートし、その後、２％のTriton X-100
, 50mMのトリス−HCl,１０mMのEDTA(pH8) の溶液1.5ml を添加した。１５分間の
インキュベーションの後、10μl のプロテイナーゼＫ（１０mg/ml ）を添加した
。管を室温で３０分間インキュベートした。その混合物を、フェノール、クロロ
ホルム、イソアミルアルコール（２４：２４：１の比で混合されている）溶液に
より１回、水により飽和されたクロロホルムにより１回、抽出した。染色体DNA
をエタノールにより沈殿せしめた。

【０１３５】染色体DNA を用いて、lbpB遺伝子をPCR 増幅した。プライマーLB20及びREV2（
表３）を、株H44/M76, M990 及び881607に対して使用した。プライマーLB20及び
LB23を、株M981に対して使用した。プライマーは、株BNCVからのlbpBの配列に基
づく。LB20は、lbpB遺伝子の上流、及びlbpA遺伝子の開始でLB23及びREV2を結合
する。LB23はその５' 末端で特別なBamHI 部位を有する。Goldstarポリメラーゼ
、すなわちTaq ポリメラーゼ誘導体（Eurogentec）を、製造業者からの説明書に
従って、PCR 増幅のために使用した。アニーリング温度は、すべての場合、５０
℃であり、そして３０個のサイクルが行われた。PCR 生成物は、製造業者の説明
書に従って、β−アガラーゼ（New England Biolabs ）を用いてアガロースゲル
から精製された。

【０１３６】 DNA 配列決定を、lbpB遺伝子のために企画されたプライマーを用いての遺伝子
移動（gene walking）により行なった。配列決定は、ABI Prism 310 Genetic An
alyser（Perklmer）を用いて自動的に行われた。ソフトウエアーパッケージPC Gene 6.70（IntelliGenetics ）からのコンピ
ュタープログラムTRANSL, PALIGN及びCLUSTAL を用いて、それぞれ配列の対整列
及び複数の整列のために、ヌクレオチド配列をアミノ酸配列に翻訳した。

【０１３７】７Ｂ：さらなる４種の髄膜炎菌株からのlbpBの配列決定−結果４種の株のlbpB遺伝子のヌクレオチド配列が、配列番号３，５，７及び９に示
される。それらのヌクレオチド配列はアミノ酸配列に翻訳され、そしてLbpBタン
パク質の５種の既知配列の一列配列が図９に示される。アミノ酸レベルに基づけ
ば、異なった形質のLbpBタンパク質間の同一性は７０〜８０％であった。同一性
の対様（pairwise) 比較が表４に要約される。

【０１３８】例８：ナイセリア・メニンギチジスにおけるlbpBの発現レベルは非常に低く；タンパ
ク質は、外層膜タンパク質パターンがSDS-PAGEにより分析される場合、検出され
得なかった。LbpBタンパク質の免疫学的及び構造的／機能的研究のために、Ｅ．
コリにおけるタンパク質の発現のための構造体を製造した。組換えタンパク質の
精製を促進するために、前記構造体によりコードされるタンパク質はHis-tag を
含み、そしてＮ−末端の脂質修飾が成熟ドメイン中の生来のシグナル配列及び最
初の２つのアミノ酸残基の置換により妨げられた。

【０１３９】８Ａ：組換えLbpBの発現−細菌株及び増殖条件髄膜炎菌株BNCV (-:2a:P1.2)を、Vitox (Oxoid) により補充されたＧＣ寒天プ
レート（Difco ）上で、湿気のある85%CO₂雰囲気下で３７℃で一晩培養した。組
換えLbpBタンパク質をコードする構造体を、株CE1224（Tommassem など, 1983）
のhtrA ampT 誘導体である、Ｅ．コリ株CE1448（C.Jansenにより供給された）に
おいて発現せしめた。株を、栄養要求性突然変異のための増殖必要条件により、
及び1.32mMのK₂HPO₄（リン酸塩飽和条件）を補充したHepes −緩衝化された合成
培地（Tommassen and Lugtenberg, 1980）において３７℃で増殖した。一晩の増
殖の後、培養物を同じ培地（但し、K₂HPO₄（リン酸炎飽和条件）を有さない）に
1:13.5で希釈し、そして３７℃で６時間、増殖せしめた。

【０１４０】８Ｂ：組換えLbpBの発現−Ｅ．コリにおけるクローニング染色体DNA を、プレート上で一晩増殖した髄膜炎菌細胞から単離した。細菌を
プレートから剥離し、10mMのトリス−HCl,10mM EDTA(pH8)ｋを添加した。その懸
濁液を室温にて１５分間インキュベートし、その後、２％Triton X-100、50mMの
トリス−HCl,10mMのEDTA( ｐＨ８) の溶液1.5ml を添加した。１５分間のインキ
ュベーションの後、10μl のプロティナーゼＫ（10mg/ml)を添加した。管を室温
で３０分間インキュベートした。DNA を、フェノール／クロロホルム／イソアル
ミアルコール（２４: ２４: １; 体積比）を添加することによって、混合物から
抽出し、そしてさらに、水により飽和されたクロロホルムによる抽出により精製
した。染色体DNA をエタノールによ離沈殿せしめた。

【０１４１】染色体DNA を、LB22及びLB23（表５）を用いてのPCK により、成熟lbpBに対応
するLbpB遺伝子の一部を増殖するために鋳型として使用した。LB22は、LbpBのＮ
−末端部分に対応する部位でプライムし、そしてPCR 生成物にPstI−部位を導入
する。LB23は、lbpA遺伝子の開始点のlbpBのすぐ下流をプライムし、そしてBamH
I −部位を導入する。Pwo ポリメラーゼ（Boehringer Mannheim ）、すなわちプ
ルーフリーディング酵素が、製造業者により提供される説明書に従って、PCR 反
応において使用された。アニーリング温度は６０℃であり、そして３０回のサイ
クルが行われた。

【０１４２】 PCR 生成物を、製造業者の説明書に従って、β−アガラーゼ（New England Bi
olabs ）を用いて、ゲルから単離した。PCR 生成物をPstI及びBam HIにより消化
し、そしてPstI及びBglII により又消化したpJＰ２９（図10A)中に連結した。得
られる構造体pAM ３１においては、BamHI 及びBglII 部位が失われている。LbpB
タンパク質がphoEプロモーターからこの構造体において発現され、そしてそれは
、真正のシグナル配列の代わりにPhoEシグナル配列を含む。

【０１４３】さらに、Ｎ−末端からの最初の２つの残基は、それぞれ、Cys 及びIle からAl
a 及びVal に変更された。タンパク質の精製を促進するためにＨｉｓ−ｔａｇを
、シグナル配列とLbpBの成熟部分との間に挿入した。pAM31 をPstIにより消化し
、そしてオリゴヌクレオチドVGO12a及びVGO13a（表５）から構成されるリンカー
に連結し、プラスミドpAM32 （図10A)を得た。Pst-部位は、連結の後失われる。
リンカーは、６個のHis 残基及び第Ｘａ因子切断部位をコードする（図10B)。

【０１４４】８Ｃ：組換えLbpBの精製組換えLbpB を、pAM32 を含む株CE1448において生成した。５Ｌの培養物から
のリン酸塩を制限された細胞を、６時間の増殖の後に収穫した。細胞を、500ml
の生理食塩水により１回洗浄し、そして10mMのトリス−HCl 、５ｍＭのEDTA (pH
8)の溶液150ml に再懸した。その懸濁液を−２０℃で一晩凍結した。細胞を融解
し、そして３種のプロテアーゼインヒビターカクテル錠剤（Complete (tm),Boeh
ringer Mannheim ）を添加した。

【０１４５】細胞を、8000psi の圧力で、フレンチプレスを通して２回圧縮した。破壊され
なかった細胞を、5000rpm でのSorvall GSA ローターによる２０分間の遠心分離
により除去した。上清液を、40,000rpm でBeckman Ti60ローターにより９０分間
、遠心分離した。細胞エンベロープを、5mM のNa₂HPO₄-NaH₂PO₄-緩衝液（pH7.6)
に溶解した。

【０１４６】細胞エンペロープを、２％ｎ−オクチル−オリゴ−オキシエチレン（オクチル
−POE)により３７℃で２回、抽出した。最初の抽出は１時間行われ、そして第２
の抽出は３時間行われた。抽出の間、及び抽出の後、不溶性たんぱく質を、100,
000rpmで１時間、Beckman TLA100.2ローターによる遠心分離によりペレット化し
た。LbpBタンパク質を含む上清液を一緒にし、そしてNi-NTAアガロースに添加し
た。タンパク質の精製を、製造業者（Qiagen）により提供される説明書に従って
、生来の条件下でバッチにより行った。

【０１４７】イミダゾール及びNaClの濃度は、結合及び洗浄の間、それぞれ20mM及び300mM
であった。全体的には、２ｍｌのNi-NTAアガロースが使用され、１０以上の管に
分けられた。溶出を、それぞれ、100mM 及び250mM のイミダゾール３ｍｌにより
段階的に行った。溶出の後、たんぱく質を、2.5lのリン酸緩衝溶液に対して、Sp
ectra/ Por２透析バック（Spectrum）により２回、透析した。タンパク質を、10
kDa のカットオフを有するFugisept Maxi Centrifugal Concentrator (Intersep
t)により濃縮した。遠心分離を、合計体積が１〜1.5ml になるまで、5000rpm で
Sorvall GSA ローターにより行った。

【０１４８】ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）を、少々の変更を伴って、Lugtenbe
rgなど.,（1975）により記載のようにして行われた。ポリアクリルアミドゲルは
、５％の積層ゲル、およびSDS を含まない、１１％の分解ゲルから構成された。
LbpBの変性が妨げられるべきである場合、サンプル緩衝液（Lugtenbergなど, 19
75）はβ−メルカプトエタノールを含まず、そしてサンプルは、PAGEの前、０℃
で維持された。LbpBを変性するためには、サンプル緩衝液はβ−メルカプトエタ
ノールにより補充され、そしてサンプルは５分間煮沸された。電気泳動を20mAの
一定電流で、４℃で行った。ゲルをクーマシーブリリアントブルーにより染色し
た。

【０１４９】８Ｄ：組換えLbpBの発現及び精製−結果Ｎ．メニンギチジス株BNCVの LbpB の組換え形を、Ｅ．コリ株CE1448において
発現した。PhoEのシグナル配列、His −標識及び成熟LbpBタンパク質から成る組
換えタンパク質をコードする構造体pAM32 を製造した（図10A)。タンパク質は、
リン酸塩制限下でphoEプロモーターから発現された。LbpBの真正のタイプIIシグ
ナル配列を、タイプＩシグナル配列により置換し、そしてHis −標識を、続いて
第Ｘａ因子分解部位を、シグナル配列と成熟LbpBとの間に挿入した。さらに、成
熟LbpBの最初の２つのアミノ酸、すなわちCys 及びIle を、Ale 及びVal に変更
した（図10B)。

【０１５０】結果的に、組換えタンパク質はＮ−末端Cys で脂質−修飾され得ない。組換え
LbpBタンパク質は膜に分別され、そして可溶性タンパク質に分別されなかった（
データは示されていない）。従って、それは界面活性剤により膜から抽出される
べきであった。オクチル−POE は、膜から合計量の組換えLbpBの約５０％を溶解
するので、それを使用した。さらに、抽出されたタンパク質がサンプル緩衝液中
での煮沸によって変成されない場合、それは変性されたタンパク質よりもPAGEに
おいてより早く移動し（データは示されていない）、このことは、タンパク質が
正しく折りたたまれたことを示唆した。

【０１５１】抽出の後、His −標識されたたんぱく質を、Ｎｉ−親和性クロマトグラフィー
により精製した。タンパク質のほとんどは、100mM 及び200mM のイミダゾール画
分に溶出した。しかしながら、すべての画分を、透析の前に一緒にした。タンパ
ク質は、クーマシーブリリアントブルー染色されたゲル上で評価される場合、純
粋であり（図１１）、そしてそのほとんどは、変性された形よりも、PAGEの間、
より早く移動する折りたたまれた形で存在した。変性された形ではないが、LbpB
の折りたたまれた形が、ブロット上でラクトフェリンを結合することが例６にお
いて示された。

【０１５２】例９：ヒトにおけるLbpBタンパク質の免疫原生を研究するために、ヒト回復期（conv
alescent) 血清における株BNCVのLbpBタンパク質を認識する抗体の存在を、イム
ノブロットにおいて試験した。９Ａ：ヒトにおけるLbpBの免疫原生−方法１０種のヒト回復期血清を、SmithKline Beecham Biologicals SA, Belgium
から得、そして７種の血清を、National Institute of Public Health and the
Environment, The Netherlandsから得た（表６）。個人は、種々の血清型及びサ
ブタイプの株により感染されている。

【０１５３】組換えLbpBを例８に記載される方法を用いて単離した。ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（PAGE）を、少々の変更を伴って、Lugtenbergなど, (1975)により記
載のようにして行った。ポリアクリルアミドゲルは、５％の積層ゲル、及びSDS
を含まない１１％の分解ゲルから構成された。LbpBの変性が妨げられるべきであ
る場合、サンプル緩衝液（Lugtenbergなど, 1975）はβ−メルカプトエタノール
を含まず、そしてサンプルを、電気泳動の前、０℃で維持した。LbpBを変性する
ために、サンプル緩衝液にβ−メルカプトエタノールを補充し、そしてサンプル
を５分間煮沸した。電気泳動を、４℃で２０ｍＡの一定の電流で行った。

【０１５４】イムノブロットを、Petterssonなど, (1993)により記載のようにして行った。
ヒト血清を1:500 に希釈した。ペルオキシダーゼ−接合されたウサギ抗−ヒトIg
G （Dako A/S）を、1:500 の使用希釈度で、２次抗体として使用した。ペルオキ
シダーゼの活性を、製造業者（Amersham）により提供される説明書に従って、EC
L システムにより検出した。

【０１５５】９Ｂ：ヒトLbpBの免疫原性−結果ヒト血清LbpB特異的抗体の存在を、イムノブロットにおいて、株BNCV（-2:2a:
P1.2）の精製された組換えLbpBタンパク質に対して試験した。反応性を、LbpB及
び変性されたタンパク質の両者に対して試験した（例については、図１２を参照
のこと）。結果は表６に要約される。４種類の血清が変性された及び折りたたま
れた形のLbpBと強く反応した。５種類の血清が両方の形と弱く反応し、２種類の
血清は折りたたまれた形のみと弱く反応し、２種類の血清は変性された形のみと
弱く反応し、そして４種類の血清はLbpBとまったく反応しなかった。それらの結
果は、髄膜炎菌LbpBがヒトにおいて免疫原性であることを示し、そして種々の株
からのLbpBタンパク質間の相当な程度の免疫学的交差反応を示す。

【０１５６】例１０：髄膜炎菌細胞又はLbpBにより免疫化されたマウスから得られた血清を用いてのELISA & 細菌試験１０Ａ：免疫化プロトコールＮ．メニンギチジス株BNCVによる免疫化：１０匹のマウス（生後６週のBalb/C
）のグループを、SBAS２アジュバント中、５×10⁸CFUの熱不活性化されたBNCV完
全細胞により３回、免疫化した（100 μｌの腹腔内又は100 μｌの皮下）。３回
の免疫化を２１日間隔で行い、そして血清を心臓内穿刺により５６日目に抜き取
った。血清をグループごとにプールした。

【０１５７】ナイセリア・メニンギチジス株BNCVからのLbpBによる免疫化：これは、上記と
同じ方法により行われたが、但し、２回の最初の免疫化は10μg の粗LbpB（組換
えLbpBを含むＥ．コリ細胞エンベロープ）により行われ、そして第３の免疫化は
2.5 μg の純粋LbpB( 例８に記載されるのと同じ手段により調製された) により
行われた。

【０１５８】１０Ｂ：完全細胞ELISA (WCE) 及びLbpB ELISAにおける応答の測定平底の９６−ウェルNunc Immuno プレートを用いた。PBS 中、熱不活性化され
たナイセリア・メニンギチジスＢ株[ 例１に記載のようにしてEDDAを用いて、鉄
消耗条件（fe- ）下で増殖されている](20μg/mlの合計タンパック質) の懸濁液
100 μｌを、プレートの個々のウェル中にアリコートし、そして３７℃で一晩、
蒸発せしめた。

【０１５９】被覆されたプレートを、0.9%のNaCl, 0.05% のTween 20により４回洗浄し、そ
して撹拌しながら室温で３０分間、0.3%のPBS 中、0.3%のカゼイン（Merck ）に
より飽和し、そして同じ手段で洗浄した。100 μｌのプールされた血清を、PBS
中、0.05％のTween 20及び0.1%のカゼインにより100 倍に希釈し、最初のウェル
に添加し、次に、２倍〜１２倍に希釈し、そしてプレートを撹拌しながら、３７
℃で３０分間、インキュベートした。

【０１６０】洗浄の後PBS 中、ウサギ抗−マウス免疫グロブリンビオチン（Dakopatts Eo41
3 ）、0.05% のTween 20及び0.3%のカゼインの2000倍希釈溶液100 μl を添加し
、そしてプレートを、前記と同じ手段によりインキュベートした。プレートを洗
浄し、そして次に、PBS 中、0.05% のTween 20、及びストレプタビジン−ビオチ
ニル化されたホースラディシュペルオキシダーゼの4000倍希釈溶液100 μｌを添
加し、そしてプレートを同じ手段でインキュベートした。

【０１６１】洗浄後、０．１Ｍのクエン酸緩衝液（pH4.5)中、4mg のＯ−フェニルジアミン
(OPDA) 株（Sigma P8787 ）の新しく調製された溶液100 μｌを添加し、そして
プレートを暗室において、室温で１５分間インキュベートした。反応を、ＩＮの
HCl 50μl の添加により停止した。吸光度を490nm で読み取った。抗−LbpB ELISAは、WCE と同じ手段で作動し、但し被覆が異なる。ウェルを、
0.05M の炭酸塩／炭酸水素塩緩衝液（pH9.6)中、0.5 μg/mlの純粋LbpBの溶液10
0 μｌにより被覆し、そして３７℃で一晩インキュベートした（蒸発されなかっ
た）。

【０１６２】１０Ｃ：殺細菌アッセイ対数増殖期（OD=0.3）におけるグループＢ髄膜炎菌 [例１に記載のような鉄消
耗（fe- ）の条件下で、EDDAの添加を除外することによっての鉄富化（fe+ ）条
件下で増殖されている] の培養物を、20000CFU/ml に調製された使用細胞懸濁液
を得るために、0.3%のBSA を含む無菌ハンクス培地に懸濁した。

【０１６３】試験血清（例１０Ａ）サンプル（５６℃で３０分間、熱不活性化されている）
の２倍希釈溶液50μl/ウェル、及び20000CFU/ml の対数期のグループＢ髄膜炎菌
25μl/ウェルを含む一次反応混合物（75μｌ）を調製した。反応バイアルを３７
℃で１５分間インキュベートし、そして210rpmで振盪した。最終反応混合物（10
0 μｌ）はさらに、補体源として、２５％の予備試験された子供ウサギ血清を含
み、そして同じ条件下で６０分間インキュベートした。無菌ポリスチレンＵ−底
９６−ウェルマイクロタイタープレートを、このアッセイのために使用した。

【０１６４】 10μl のアリコートを、マルチチャネルピペットを用いて、個々のウェルから
取り、そして１％のIsovitalex及び１％の熱不活性化された馬血清を含むMuelle
r-Hinton寒天プレート上に滴下し、そして５％CO₂において３７℃で１８時間イ
ンキュベートした。個々のコロニーを、アリコート当たり80CFU まで計数した。次の３種の試験カンプルを対照として使用した：緩衝液＋細菌＋補体；緩衝液
＋細菌＋不活性化された補体；血清＋細菌＋不活性化された補体力価を、プログ
ラムExcel (Microsoft )による方法を用いて計算した。この方法は、回帰計算に
よる細胞殺害の５０％に対応する希釈度の正確な測定値を付与する。

【０１６５】例１０Ｄ：結果表７及び図Ｂは、lbpBによる免疫化がLbpBに対する（図１３Ａ）、及び株BNCV
（組変えLbpBの源）及び株H44/76（BNCVのものとわずか７８．５％の配列同一性
を有するLbpB）に対する（図13B 及びC)良好な応答を誘発することを示す。組換
えLbpBのみを包含する免疫化スケジュールを用いて得られた血清は、類似する結
果を与えた（データは示されていない）。明白には、株BNCVによる抗−完全細胞
免疫化は、BNCV細胞およびH44/76細胞の両者に関して、高い抗−ELISA を導く（
それぞれ、図13B 及びＣ）。

【０１６６】さらに、Ｎ．メニンギチジスBNCV からの組換えLbpBによる免疫化は、例９に
記載のようにして実質的に行われたイムノブロット上で試験された、マラキセラ
・カタルトリス（Moraxella catarrhalis ）からの完全細胞における類似する分
子量のタンパク質に結合する抗体を誘発する（データは示されていない）。

【０１６７】表８及び図１４は、組換えLbpB (株BNCVからの) による免疫化の後、血清にお
いて生成された抗体が異種株（H44/76）に対して殺細菌性があることを示し。こ
こで、LbpBはBNCVの配列とわずか７８．５％の配列同一性を有する。これはまた
、組換えLbpBのみを包含する免疫化スケジュールの後に得られる血清を用いての
事例である（データは示されていない）。これは、H44/76が鉄を含む条件下で増
殖され（図１４Ａ）、そして鉄の存在下で消化される（図１４Ｂ）場合、真実で
ある。細菌がそれらの鉄消耗条件下にある場合、LbpBが多量に発現されることが
予測されるように、鉄消耗の条件下でより効果的であると思われる。従って、LbpBは免疫保護抗原であり、そしてさらに、それは、ナイセリア・メ
ニンギチジスの異種株に対して交差−免疫保護性を提供する証拠を示す。

【０１６８】

【表１】

【０１６９】

【表２】

【０１７０】

【表３】

【０１７１】

【表４】

【０１７２】

【表５】

【０１７３】

【表６】

【０１７４】

【表７】

【０１７５】

【表８】本出願に引用されるすべての出版物、たとえば特許及び特許出願（但し、それ
らだけには限定されない）は、引用により本明細書に組み込まれる。

【０１７６】参考文献： Abdillahi, H., and Poolman, J. T. (1987) Whole-cell ELISA for typin
g of Neisseria meningitidis with mnoclonal antibodies. FENS Microbiol. L
ett 48: 367-371. Andersonn, J. E., Sparling, P. F., and Cornelissen, C.N.(1994) Gono
coccal transferrin-binding protein 2 fecilitates but is not essential fo
r trannsferrin utilization. J Bacteriol 176: 3162-3170. Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D. M., Seidman, J
. G., Smith, J. A., and Struhl, K. (1989) Current protocols in molecular
biology. Brooklyn, NY: Greene publishing associates.

【０１７７】 Bagg, A., and Neilands, J, B, (1987) Ferric uptake regulation prote
in acts as a repressor, employing iron(II)as a cofactor to bind the oper
ator of an iron transport operon in Escherichia coli. Biochemistry 26: 5
471-5477. Biswas, G. D., and Sparling, P. F. (1995) Characterisation of IbpA,
the structural gene for a lactoferrin receptor in Neisserria gonorrhoea
e. Infect Immun 63: 2958-2967. Bosch, D., Leunissen, J., Verbakel, J., de Jong, M., ban Erp, H., a
nd Tommassen, J. (1986) Periplasmic accumulation of truncated forms of o
uter membrane PhoE protein of Escherichia coli K-12. J. Mol. Biol. 189:
449-455.

【０１７８】 Cornelissen, C. N., Biswas, G. D., Tsai, J., Paruchuri, D. K., Thom
pson, S. A., and Sparling, P. F. (1992) Gonnococcal transferrin-binding
protein i is required for transferrin utilization and is homologous to T
onB-dependent outer membrane recptors. J Bacteriol 174:5788-5797. Finkelstein, R. A., Sciortino, C. V., and Mclntosh, M. A. (1983) Ro
le of iron in microbe-host interactions. Rev Infect Dis 5: S759-S777. Fuller, C. A., Retzer, M. D., Jacobs, E., and Schryvers, A. B. (199
6) Evidence for a bi-lobed structure for meningococcal transferrin bindi
ng protein B. In PathogenicNeisseria. Zollinger, W. D., Frasch, C. E., a
nd Deal, C. D.,(eds).Abstract Book from the 10th pathogenic Neisseria Co
nference. pp 572-573.

【０１７９】 Genco, C. A., Chen, C. Y., Arko, R. J., Kapcznski, D. R., and Morse
, S. A. (1991) Isolation and charecterization of a mutant of Neisseria g
onorrhoeae that is defective in the uptake of iron from trnsferrinand he
moglobin and is avirulent in mouse subcutaneous chambers. J Gen Microbio
l 137: 1313-1321. Gsschwentner, C., Lassman, H., and Huettinger, M. (1997) Lactoferri
n and its receptor (s): modulatora of inflammation? Abstracts of Third I
nternational Conference on Lactoferrin. P. 68.

【０１８０】 Irwin, S. W., Averil, N. A., Cheng, C. Y., and Schryvers, A. B. (19
93) Preparation and analysis of isogenic mutants in the trnasferrin rece
ptor protein genes, tbpA and tbpB, from Meisseria meningitidis. Mol Micr
obiol 8: 1125-1133. Jennings, M. P., van der Ley, P., Wilks , K. W., Maskell, C. J., Po
olman, J. T., and Moxon, E. R. (1993) Cloning and molecular analysis of
the galE Gene of Neisseria Meningitidis and its role in lipopolysacchari
de biosyntheses. Mol Microbiol 10:361-369. Legain, M., Marazin, V., Irwin, S. W., Bouchon, B., Quentin-Millet,
M. -J., Jacobs, E., and Schryvers, A.B. (1993) Cloning and charecterisa
tion of Neisseria meningitidis genes encoding the transferrin-binding pr
oteins Tbp1 and Tbp2. Gene 130:73-80.

【０１８１】 Lugtenberg, B., Meyers, J., Peters, R., van Alphen, L. (1975) Elect
rophoretic resolution of the "major outer membrane protein" of Escherich
ia coli K-12 into four bands. FEBSL Lett. 58: 254-258. Pettersson, A., Kuipers, B., Pelzer M., Verhagen, E., Tiesjema.R. H
., Tommassen, J., and poolman, J. T. (1990) Monoclonal antibodies agains
t the 70-kilodalton iron-regulated protein of Neisseria meningitidis are
bactericidal and strain specific. Infect Immun 58: 3036-3041. Pettersson, A., van der Ley, P., Poolman, J. T., and Tommassen, J.,
(1993) Molecular characterization of the 98-kilodalton iron-regulated o
uter membrane protein of Neisseria menigitidis. Infect Immun 61: 4724-47
33.

【０１８２】 Pettersson, A., Klarenbeek, V., van Deurzen, J., Poolman, h. T., an
d Tommassen, J., (1994a) Molecular characterization of the structural ge
ne for the lactorferrin receptor of the meningococcal strain H44/76. Mic
robial Pathogen 17: 395-408. Pettersson,l A., Maas, A., and Tommassen, J., (1994b) identiticatio
n of the iroA gene product of Neisseria meningitidis as a Lacroferrin re
ceptor. J Bacteriol 176: 1764-1766. Renauld-Mongenie. G., Poncer, D., and Quentin-Millet, M. J. (1996)
Study fo human trnsferrin binding sites wittin the transferrin binding p
rotein Tbp2 from N. Meningitidis M982 Using the pMAL expression system.
In Pathogenic Neisseria. Zollinger, W.D., Frasch, C. E., and Deal, C.D.
(eds). Abstract book from the 10th pathogenic Neisseria Conference.pp 58
5-586.

【０１８３】 Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989) Molecular clo
ning: a laboratory manual. 2nd edn. Cold Spring Harbor, NY; Cold Sprin H
arbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Schryvers, A. B., and Mo
rris, L. J. (1988) Identification and characterization of the human lact
oferrin-binding protein from Neisseria meningitidis. Infect Immun 56: 11
44-1149. Tommasen, J., and Lugtenberg, B. (1980) Outer membrane protein e of
Escherichia coli K-12 is co-regulated with alkaline phosphatase. J. Bac
teriol. 143: 151-157. Tommassen, J., ban Tol, H., and Lugtenberg, B. (1983) The ultimate
localization of an outer membrane protein of Escherichia coli K-12 is no
t determined by the signal sequence. ENBO J. 2: 1275-1279.

【０１８４】 Van Berkel. P. H. C., Geerts, M. E. j., van Veen, H. A., Kooiman, P
. M., Pieper. F.R., de boer, H. A., and Nuijens, j. H. 1995) Glycosylate
d human lactoferrins both bind iron and show identical affinities toward
s human lysozyme and bacterial polysaccharide. But deffer in their susce
ptibilities towards tryptic proteolysis. Biochem J312: 107-114. Van der Ley, P., Heckels, J. E., Virji, M., Hoogerhout, P., and poo
lman, J. T. (1991) Topology of outer membrane porins in pathogenis Neiss
eria spp. Infect Immun 59: 2963-2971.

【０１８５】 Van der Ley, P., and Poolman, J. T. (1992) Construction of a multiv
alent meningococcal strain based on the class 1 outer membrane protein.
Infect Immun 60: 3156-3161. Van Heijne, G. (1989) The structure of signal peptides from bacteia
l lipoproteins. Prot Eng2: 531-534. Young, R. A., and Davis, R. W. (1983) Yeast RNA polymerase II genes
: isolation and antibody probes. Science 222: 778-782.

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】鉄制限下で増殖された完全な細胞からのタンパク質のウェスターンブロット分
析。レーン１及び５、株BNCV；レーン２及び６、lbpA変異体CE1452；レーン３お
よび７、lbpB変異体CE1454；レーン４及び８、lbpAB 変異体CE1402。使用される
抗血清は、lbpB配列に基づいて、合成ペプチドに対して向けられた。レーン１〜
４、ペプチドＣ１に対する血清17-3。レーン５〜８、ペプチドＥ１に対する血清
１９−１。分子サイズ標準の位置は、右側に示される（×1000）。LbpBタンパク
質は、左側で矢印により示される。

【図２】 BNCVのlbpB及びlbpAを含むDNA フラグメントの制限地図。異なった組換えプラ
スミド及びPCR 生成物（PCR)における挿入体が空白のボックスとして示される。
プラスミドpAM23 及びpAM1は、これまでに特徴づけられているlbpBA 遺伝子座の
フラグメント（Petterssonなど, 1994a ）を含む。オープンリーディングフレー
ムは濃い矢印により示される。ライブラリーをスクリーニングし、又はサガンブ
ロットを行うために使用されるプローブが、読み取り枠の上部に示される。PCR
増幅のために使用されるプライマーの位置は、読み取り枠の下部に示される。pA
N6K におけるカナマイシン耐性ボックスの挿入部位が空白の三角により示される
。pAM23Eにおけるエリトロマイシン耐性ボックスは黒く塗られた三角により示さ
れる。

【図３】下部BNCVのタンパク質LbpB及び下部B16B6 のTbpBの整列。同一のアミノ酸が点
線により示される。右側の数字は、アミノ酸の位置を示す。ギャップ（−）が最
適な整列を達成するために導入された。マウスを免疫化するために使用されるペ
プチドが、LbpBの配列の上部に示される。負に荷電された残基に富んでいる２本
線が下線として引かれている。推定上のシグナルペプチドII分解部位が、配列の
上部に矢印により示される。

【図４】 LbpBの上流のプロモーター領域の配列。翻訳開始部位（ATG)が太字で示される
。リボソーム結合部位、及び推定上の−１０及び−３５ボックスは下線が引かれ
ている（それぞれ、濃い線及び薄い線）。推定上のFur ボックスは、ボックスで
囲まれている。

【図５】 TSB 培地（レーン１，３，５及び７）又はEDDAを含むTSB 培地（レーン２，４
，６及び８）において増殖された完全な細胞からのタンパク質のウェスターンブ
ロット分析、使用される抗体は、LbpAに対して向けられたモノクローナルmn98k1
及びmn98k1及びmn98k2（パネルＡ）、及びLbpBペプチドに対して向けられた抗血
清17-3（パネルＢ）であった。レーン１及び２、株BNCV ;レーン３及び４、lbpA
変異体CE1452；レーン５及び６、lbpB変異体CE1454；レーン７及び８、lbpA変異
体CE1402。

【図６】Ａ：鉄限定下で増殖された髄膜炎菌株BNCVの外層膜からのタンパク質のウェス
ターンブロット分析。外層膜タンパク質が、非変性条件下で電気泳動され、そし
てlbpBタンパク質が合成ペプチドＡ１に対して向けられた血清により検出された
。レーン１及び２は、電気泳動の前、それぞれ０℃及び９５℃でインキュベート
されたサンプルを示す。分子サイズ標準の位置が左側に示される（×1000）。Ｂ
：鉄限定下で増殖された髄膜炎菌株BNCVの外層膜複合体からのタンパク質のウェ
スターンブロット上でのラクトフェリン結合アッセイ。外層膜複合体からのタン
パク質が非変性条件下で電気泳動され、そしてブロットがペルオキシダーゼ−結
合されたヒトラクトフェリンと共にインキュベートされた。レーン１〜３は、電
気泳動の前、それぞれ０℃、３７℃及び９５℃でインキュベートされたサンプル
を示す。分子サイズ標準の位置は右側に示される（×1000）。

【図７】完全な細胞ELISA −型アッセイにおけるlbp 変異体へのラクトフェリンが２０
０，１００，５０，２５，１２．５，６．２５，３. １２５及び０ng/ mlの濃度
で添加された（それぞれ横列１〜８）。細胞に結合されるラクトフェリンが、ペ
ルオキシダーゼ−接合されたラクトフェリン−特異的抗血清により検出された。

【図８】組換えヒトラクトフェリンによる株のプレート供給アッセイ。プレートの相当
する部分のみが示されている。右側に示される株の細胞は、鉄−制限されたプレ
ート上にプレートされた。示される濃度でのラクトフェリンの低下による増殖刺
激が、一晩の増殖の後にモニターされた。矢印は、パネルＢにおける低下の位置
を示す。この実験においては、１１％の鉄−飽和されたラクトフェリンが使用さ
れた。

【図９】５種の髄膜炎菌株からのLbpB株の一列配列。この一列配列はCLUSTAL (PC Gene
, IntelliGenetics ) により実施され、そして手動的に最適化された。右側の数
字はアミノ酸の位置を示す。ギャップ（−）は、最適な一列配列を達成するため
に導入された。すべての５種の配列が同一である位置が、★により示されている
。

【図１０】Ａ：pJP29 （Bosch など., 1986 ）、pAM31 及びpAM32 の相当する部分の制限
地図。挿入体のみが示される。ベクターはpACYC 184 である。pJP29 はそれ自体
のプロモーターの後ろにphoE遺伝子（薄い灰色）を含むプロモーター及びフラン
キング配列は、白色で示される。PstI−部位は、PhoEタンパク質のシグナル配列
及び成熟部分に対応する配列の境界で存在する。pAM31 は左から右のほうに次の
成分を含む：phoEプロモーター（白色）、及びPhoEのシグナル配列（薄い灰色）
及び成熟LbpB（黒色）をコードする組換え遺伝子。LbpAのＮ末端（濃い灰色）、
PhoEのＣ末端（薄い灰色）及びフランキング配列（白色）に対応するDNA フラグ
メントがまた存在する。pAM32 は、His −標識及び第Ｘａ因子切断部位をコード
するリンカー（ストライプのあるボックス）を、pAM31 のPstI−部位中に挿入す
ることによって、pAM31 及びpAM32 の構成については例８を参照のこと。pAM32
上の制限部位は、それらがクローニング工程の間に失われるので、括弧で示され
る。Ｂ：野生型LbpB配列（上部）と比較しての組換えLbpB構造体（下部）のアミノ
酸配列。それぞれ、LbpB/ PhoEシグナル配列及び成熟LbpBの最後及び最初のアミ
ノ酸のみが示される。リーダーペプチダーゼＩ及びII（それぞれLpaseI及びII）
及び第Ｘａ因子分解部位が矢印により示される。

【図１１】精製された組換えLbpBタンパク質のPAGE。レーン１及び２は、電気泳動の前、
それぞれ０℃及び100 ℃でインキュベートされたサンプルを示す。分子量標準の
位置は、kDa で右に示される。

【図１２】折りたたまれた（レーン１，３，５，７及び９）及び変性された（レーン２，
４，６，８及び１０）組換えLbpB 及び５種のヒト回復期血清によるウェスター
ンブロット：レーン１及び２、血清６９；レーン３及び４、血清262439；レーン
５及び６、血清262532; レーン７及び８、血清263017；レーン９及び１０、血清
330 。分子サイズ標準の位置は、キロドルトンで右に示される。左側の矢印は、
変性された（dLbpB ）及び折りたたまれたLbpB (fLbpB)の位置を示す。

【図１３】例１０に記載のようにして行われた抗―完全細胞および抗―LbpB ELISA（表７
）の結果。Ａ：LbpB又はナイセリア・メニンギチジス株BNCV完全細胞により免疫
化されたマウスにおける抗−LbpB応答。対照免疫化は、ＰＢＳ溶液により行われ
た。Ｂ：LbpB又はナイセリア・メニンギチジス株BNCV完全細胞により免疫化され
たマウスにおける抗―完全細胞（鉄欠乏条件下で増殖されたBNCV）応答。対照免
疫化は、PBS 溶液により行われた。Ｃ：LbpB又はナイセリア・メニンギチジス株
BNCV完全細胞により免疫化されたマウスにおける抗―完全細胞（鉄欠乏条件下で
増殖された株H44/76）応答。対照免疫化はPBS 溶液により行われた。

【図１４】例１０に記載のようにして行われた、抗−完全細胞及び抗−株BNCV LbpB 血清
の殺菌活性の結果（表８）。Ａ：ナイセリア・メニンギチジス株H44/76（鉄に富
んでいる条件下で増殖された）に対する殺菌力価。Ｂ：ナイセリア・メニンギチ
ジス株H44/76（鉄消耗された条件下で増殖された）に対する殺菌力価。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年２月１５日（２０００．２．１５）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

【請求項３４】請求項３〜７のいずれか１項記載のポリヌクレオチドまた
は請求工１４〜２１のいずれか１項記載のポリペプチド、フラグメント又はタン
パク質、又は請求項２２記載の抗体を含んで成る、ヒトにおけるナイセリア細菌
による感染を診察するためのキット。

【手続補正書】

【提出日】平成１２年１２月１３日（２０００．１２．１３）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項８

【補正方法】変更

【補正内容】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 14/22 Ｃ０７Ｋ 16/12 16/12 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 21/08 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/15 ＺＧ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 33/68 33/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ペテルソン−フェルンホルム，アニカマルガレータオランダ国，エヌエル−3584 セーハーユトレヒト，パデュアラーン８，ユニバーシティオブユトレヒト (72)発明者トマセン，ヨハネスペトルスマリアオランダ国，エヌエル−3584 セーハーユトレヒト，パデュアラーン８，ユニバーシティオブユトレヒト

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ナイセリア・メニンギチジス（Neisseria meningitidis）Lb
pB （ラクトフェリン−結合プロテインB ）をコードする単離されたポリヌクレ
オチド。
【請求項２】配列番号１（ヌクレオチド100 〜ヌクレオチド2274）、配列
番号３、配列番号５、配列番号７又は配列番号９のポリヌクレオチドである請求
項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】配列番号１のヌクレオチド100 〜ヌクレオチド2274の配列に
対して少なくとも６５％同一であるヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポ
リヌクレオチド。
【請求項４】配列番号３の配列に対して少なくとも６５％同一であるヌク
レオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】配列番号５の配列に対して少なくとも６５％同一であるヌク
レオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】配列番号７の配列に対して少なくとも６５％同一であるヌク
レオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７】配列番号９の配列に対して少なくとも６５％同一であるヌク
レオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８】適合性の宿主細胞においてLbp ポリヌクレオチドを生成する
ことができる組換え発現系を構成する請求項３〜７のいづれか１項記載のポリヌ
クレオチド。
【請求項９】請求項８記載の発現系を含んで成る宿主細胞。
【請求項１０】 LbpBポリペプチドの生成のために十分な条件下で請求項９
記載の宿主を培養し、そして前記培養物から前記ポリペプチドを回収することを
含んで成るLbpBポリペプチドの製造方法。
【請求項１１】請求項８記載の発現系により宿主細胞を形質転換し又はト
ランスフェクトすることにより、該宿主細胞が、適切な培養条件で、LbpBポリペ
プチドを生成するようにすることを含んで成る、LbpBポリペプチドを生成する細
胞の製造方法。
【請求項１２】ナイセリア・メニンギチジスからのLbpBポリペプチド。
【請求項１３】配列番号２，４，６，８又は１０のポリペプチドである請
求項１２記載のポリペプチド。
【請求項１４】その全体の長さにわたって配列番号２のアミノ酸配列に対
して少なくとも６５％同一であるアミノ酸配列を含んで成る単離されたLbpBポリ
ペプチド。
【請求項１５】その全体の長さにわたって配列番号４のアミノ酸配列に対
して少なくとも６５％同一であるアミノ酸配列を含んで成る単離されたLbpBポリ
ペプチド。
【請求項１６】その全体の長さにわたって配列番号６のアミノ酸配列に対
して少なくとも６５％同一であるアミノ酸配列を含んで成る単離されたLbpBポリ
ペプチド。
【請求項１７】その全体の長さにわたって配列番号８のアミノ酸配列に対
して少なくとも６５％同一であるアミノ酸配列を含んで成る単離されたLbpBポリ
ペプチド。
【請求項１８】その全体の長さにわたって配列番号１０のアミノ酸配列に
対して少なくとも６５％同一であるアミノ酸配列を含んで成る単離されたLbpBポ
リペプチド。
【請求項１９】配列番号２，４，６，８又は１０のアミノ酸位置１９〜C
−端末のアミノ酸配列を含んで成るそれぞれ請求項１４，１５，１６，１７又は
１８項記載のポリペプチド。
【請求項２０】請求項１４〜１９のいずれか１項記載のLbpBポリペプチド
に対して免疫特異的な抗体。
【請求項２１】請求項１４〜１９のいずれか１項記載のLbpBポリペプチド
を阻害する化合物を同定するための方法であって：（ａ）前記LbpBポリペプチドを発現する細胞と候補体化合物とを接触せしめ；そして（ｂ）機能的応答の阻害又は結合を観察し；あるいは前記候補体化合物と接触
された細胞の能力と、接触されていない同じ細胞の能力とを、LbpBポリペプチド
活性について比較する；ことを含んで成る方法。
【請求項２２】請求項１４〜１９いずれか１項記載のポリペプチドの有効
量及び医薬的に許容できるキャリヤーを含んで成るワクチン。
【請求項２３】前記組成物が少なくとも１つの他のナイセリア・メニンギ
ジス抗原を含んで成る請求項２２記載のワクチン。
【請求項２４】ナイセリア疾病に対してヒトに予防接種するための方法で
あって、請求項１４〜１９のいずれか１項記載のポリペプチドの有効量を含んで
成る組成物を前記ヒトに投与することを含んで成る方法。
【請求項２５】ナイセリア疾病に対してヒトに予防接種するための方法で
あって、請求項３〜７のいずれか１項記載のポリペプチドの有効量を含んで成る
組成物を前記ヒトに投与することを含んで成る方法。
【請求項２６】前記ポリペプチドが、経口、皮下、直腸、気管内、筋肉内
又は鼻腔内投与される請求項２４記載の方法。
【請求項２７】前記ポリペプチドが、皮下、気管内、筋肉内又は鼻腔内投
与される請求項２５記載の方法。
【請求項２８】ヒトにおけるナイセリア疾病を診断するための方法であっ
て、請求項１４〜１９のいずれか１項記載のポリペプチドを適切なヒト又は動物
に投与することによって生成される抗体と、診断されるべきヒトからの生物学的
サンプルとをインキュベートし、ここでナイセリア疾病の存在下で、抗原―抗体
複合体が形成され；そして続いて、前記複合体の存在について前記流体サンプル
を分析する段階を含んで成る方法。
【請求項２９】請求項１４〜１９のいずれか１項記載のポリペプチドに対
して向けられた少なくとも１つの抗体及び適切な医薬キャリヤーを含んで成る、
ナイセリア疾病を有するヒトの治療において有用な医薬組成物。
【請求項３０】請求項３〜７のいずれか１項記載のポリヌクレオチドまた
は請求項１４〜１９のいずれか１項記載のポリペプチド、または請求項２０記載
の抗体を含んで成る、人におけるナイセリア細菌による感染を診察するためのキ
ット。