PL194800B1 - Polinukleotydy kodujące białko LbpB Neisseria meningitidis, jego fragment lub białko o określonej identyczności z białkiem LbpB Neisseria meningitidis, komórka gospodarza zawierająca taki polinukleotyd i sposób jej wytwarzania, sposoby wytwarzania rekombinowanego polipeptydu LbpB i pęcherzyka zewnątrzbłonowego zawierającego zrekombinowny LbpB, nielipidowany polipeptyd LbpB z Neisseria meningitidis, rekombinowny polipeptyd oraz polipeptyd LbpB z Neisseria meningitidis, jego fragment oraz swoiste immunologiczne przeciwciało wobec polipeptydu LbpB z Neiss - Google Patents

Polinukleotydy kodujące białko LbpB Neisseria meningitidis, jego fragment lub białko o określonej identyczności z białkiem LbpB Neisseria meningitidis, komórka gospodarza zawierająca taki polinukleotyd i sposób jej wytwarzania, sposoby wytwarzania rekombinowanego polipeptydu LbpB i pęcherzyka zewnątrzbłonowego zawierającego zrekombinowny LbpB, nielipidowany polipeptyd LbpB z Neisseria meningitidis, rekombinowny polipeptyd oraz polipeptyd LbpB z Neisseria meningitidis, jego fragment oraz swoiste immunologiczne przeciwciało wobec polipeptydu LbpB z Neiss

Info

Publication number
PL194800B1
PL194800B1 PL338649A PL33864998A PL194800B1 PL 194800 B1 PL194800 B1 PL 194800B1 PL 338649 A PL338649 A PL 338649A PL 33864998 A PL33864998 A PL 33864998A PL 194800 B1 PL194800 B1 PL 194800B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
seq
lbpb
polypeptide
sequence
amino acid
Prior art date
Application number
PL338649A
Other languages
English (en)
Other versions
PL338649A1 (en
Inventor
Annika Margareta Pettersson-Fernholm
Johannes Petrus Maria Tommassen
Original Assignee
Stw Technology Foundation
Univ Utrecht
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB9717423.9A external-priority patent/GB9717423D0/en
Priority claimed from GBGB9802544.8A external-priority patent/GB9802544D0/en
Application filed by Stw Technology Foundation, Univ Utrecht filed Critical Stw Technology Foundation
Publication of PL338649A1 publication Critical patent/PL338649A1/xx
Publication of PL194800B1 publication Critical patent/PL194800B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/22—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Neisseriaceae (F)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

1. Izolowany polinukleotyd kodujacy bialko LbpB Neisseria meningitidis, który jest polinukleotydem o Id. Sekw. nr. 1 (od nukleotydu 100 do nukleotydu 2274), Id. Sekw. nr 3, Id. Sekw. nr 5, Id. Sekw. nr 7 albo Id. Sekw. nr 9. 2. Izolowany polinukleotyd, obejmujacy sekwencje nukleotydowa, która jest przynajmniej w 65% identyczna z sekwencja o Id. Sekw. nr 1 od nukleotydu 100 do nukleotydu 2274 na calej jej dlugosci lub obejmujacy sekwencje nukleotydowa, która koduje polipeptyd przynajmniej w 65% identyczny z sekwencja o Id. Sekw. nr 2 na calej jej dlugosci. 3. Izolowany polinukleotyd wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze obejmuje sekwencje nukleotydo- wa, która koduje sekwencje aminokwasowa z Id. Sekw. nr 2 od aminokwasu w pozycji 19 do konca C polipeptydu. 4. Izolowany polinukleotyd obejmujacy sekwencje nukleotydowa, która jest przynajmniej w 65% identyczna z sekwencja o Id. Sekw. nr 3 na calej jej dlugosci lub obejmujacy sekwencje nukleotydowa, która koduje polipeptyd przynajmniej w 65% identyczny z sekwencja o Id. Sekw. nr 4 na calej jej dlugosci. PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są polinukleotydy kodujące białko LbpB Neisseria meningitidis, jego fragment lub białko o określonej identyczności z białkiem LbpB Neisseria meningitidis, komórka gospodarza zawierająca taki polinukleotyd i sposób jej wytwarzania, sposoby wytwarzania rekombinowanego polipeptydu LbpB i pęcherzyka zewnątrzbłonowego zawierającego zrekombinowany LbpB, nielipidowany polipeptyd LbpB z Neisseria meningitidis, rekombinowany polipeptyd oraz polipeptyd LbpB z Neisseria meningitidis, jego fragment oraz swoiste immunologiczne przeciwciało wobec polipeptydu LbpB z Neisseria meningitidis, sposób identyfikacji związków hamujących LbpB z Neisseria meningitidis, szczepionki zawierające polipeptydy LbpB z Neisseria meningitidis lub ich fragmenty lub polinukleotydy, oraz zastosowania kompozycji obejmującej nielipidowane białko LbpB z Neisseria meningitidis i kompozycji zawierającej odpowiadający polinukleotyd. W ogólności wynalazek dotyczy nowo zidentyfikowanych polinukleotydów, kodowanych przez nie polipeptydów oraz zastosowania tych polinukleotydów i polipeptydów oraz ich wytwarzania, przy czym wszystkie te rozwiązania są powiązane z rodziną białek błony zewnętrznej Neisseria (OMP), zaś w szczególności białka B wiążącego laktoferrynę (LbpB). Ponadto, wynalazek dotyczy zastosowania terapeutycznego LbpB w szczepieniu przeciwko chorobom wywoływanym przez Neisseria.
Zapalenie opon mózgowych jest pochodzenia bakteryjnego albo wirusowego, przy czym bakteryjne jest znacznie cięższe. Bakteriami odpowiedzialnymi są głównie Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae i Streptococcus pneumoniae. Od wprowadzenia szczepionki przeciwko H. influenzae typu B (HIB) i włączenia jej w rutynowe szczepienia dzieci, N. meningitidis objęła prowadzenie jako wiodąca przyczyna zapalenia opon mózgowych na świecie, zaś jej częstość tylko w Stanach Zjednoczonych ocenia się na 2600 przypadków rocznie.
Gatunek N. meningitidis jest podzielony na 13 grup serologicznych według składu polisacharydów otoczkowych. Oprócz tego, każda z grup serologicznych została dalej podzielona na serotypy, podtypy i immunotypy na podstawie innych składników bakterii. Trzy serogrupy (A, B i C) przyczyniają się do ponad 90% przypadków zapalenia opon mózgowych, zaś w rozwiniętych społeczeństwach uprzemysłowionych, serogrupa B jest odpowiedzialna za 50-80% przypadków.
Istnieją skuteczne szczepionki oparte na polisacharydach otoczkowych, zapobiegające zapaleniu opon mózgowych wywołane przez N. meningitidis serogrupy A i C. Szczepionki polisacharydowe serogrupy C nie wywołują efektu ochronnego u dzieci poniżej 2 roku życia (zakres wieku, w którym istnieje najwyższe ryzyko rozwinięcia zapalenia opon mózgowych), jednakże wadę tę można przezwyciężyć przez koniugację tych polisacharydów z białkiem nośnikowym. Koniugacja ma dodatkowo zaletę wywoływania pamięci immunologicznej przeciwko antygenowi.
W przeciwieństwie, polisacharyd podgrupy B N. meningitidis wykazuje słabą albo żadną immunogenność u ludzi, niezależnie od koniugacji. Stąd, byłoby niezwykle pożądane otrzymanie szczepionki przeciwko chorobom wywoływanym przez N. meningitidis (w szczególności serogrupy B) innej niż szczepionka oparta na polisacharydach.
Obiecującą klasą potencjalnych szczepionek są szczepionki, które mogą dostarczyć antygeny, które są immunogenne i dostępne dla ludzkiej reakcji odpornościowej. OMP odpowiedzialne za wychwyt żelaza do komórki są szczególnie obiecujące.
Żelazo jest niezbędną substancją odżywczą dla większości bakterii. W przedziale zewnątrzkomórkowym ludzkiego organizmu, żelazo jest kompleksowane głównie z transferryną w surowicy i laktoferryną na powierzchniach śluzowych (Finkelstein i in., 1983), z nieznaczną ilością w postaci wolnej. Stąd, skuteczne zdobywanie żelaza jest istotnym czynnikiem zjadliwości dla bakterii patogennych. W odniesieniu szczególnie do N. meningitidis (bezpośredniego patogenu człowieka) zapotrzebowanie na żelazo jest zaspokajane przez zastosowanie receptorów dla ludzkich białek wiążących żelazo, takich jak transferryną i laktoferryną, które umożliwiają komórce wiązanie tych białek, a następnie pobieranie żelaza koniecznego do wzrostu. Synteza tych receptorów białkowych jest indukowana gdy bakterie odczuwają ograniczenie żelaza.
Białka receptorowe związane z wychwytem żelaza z transferryny, TbpA i TbpB (Cornelissen i in., 1992; Legrain i in., 1993; Andersen i in., 1994) oraz białko A wiążące laktoferrynę (LbpA) (Pettersson i in., 1993; 1994b; Biswas i Sparling, 1995) sklonowano i sekwencjonowano. Białka receptora wiążącego transferrynę tworzą kompleks w błonie zewnętrznej. U N. meningitidis zarówno TbpA i TbpB wydają się być konieczne do transportu żelaza (Irwin i in., 1993). TpbA jest białkiem integralnym błony, podczas gdy TbpB jest lipoproteiną zakotwiczoną w błonie tylko domeną lipidową. WspółPL 194 800 B1 czesny model mechanizmu receptora przewiduje, że transferryna wysycona żelazem wiąże się z kompleksem receptora. W tym kompleksie, białko TbpB rozróżnia pomiędzy transferryną z żelazem i apotransferryną. Wiązanie transferryny powoduje zmiany konformacyjne w receptorze, który uwalnia żelazo z transferryny i otwiera bramkowany kanał w TbpA, zaś żelazo może być transportowane przez błonę zewnętrzną (Cornelissen i Sparling, 1994; 1996).
Receptor laktoferryny uważany jest również za istotny czynnik zjadliwości N. meningitidis. Głównym miejscem wniknięcia do organizmu jest nosogardziel, gdzie laktoferryna jest głównym źródłem żelaza. Ponadto, wstępne doniesienia wskazują, że laktoferryna może przekraczać barierę krew-mózg w trakcie ostrego stanu zapalnego (Gschwentner i in., 1997). Możliwe, że laktoferryna jest również istotnym źródłem żelaza dla meningokoków w późniejszych stadiach zapalenia opon mózgowych, gdy bakterie dosięgają opon mózgowych. Przez zastosowanie procedury izolacji przez powinowactwo, zidentyfikowano pojedynczy receptor białkowy laktoferryny (Schryvers i Morris, 1988). Strukturalny gen tego receptora, nazywany LbpA został scharakteryzowany (Pettersson i in.,1993; 1994b; Biswas i Sparling, 1995), jak również zaproponowano jego model topologiczny białka błony zewnętrznej (Pettersson i in., 1994a). Białko wykazuje homologię z TbpA. Oprócz tego, część ewentualnej ramki odczytu zidentyfikowano powyżej genu IbpA, zaś wywnioskowana sekwencja aminokwasowa wykazuje homologię z TbpB (Pettersson i in., 1994a).
TbpB i inne oczyszczone OMP meningokoków są przedmiotem poprzednich zgłoszeń patentowych, w odniesieniu do zastosowania jako szczepionki przeciwko N. meningitidis (np. TbpB, WO 93/07172; białko powierzchniowe 22 kDa, WO 96/29412; receptor hemoglobiny, WO 96/12020; białko poryny, WO 95/03413; białka pilin, WO 94/08013; OMP 64 kDa, EP 474313-B1).
Istnieje potrzeba identyfikacji i charakteryzacji dalszych członków rodziny OMP, którzy odgrywają rolę w zapobieganiu, łagodzeniu albo korygowaniu dysfunkcji albo chorób, w tym, choć nie wyłącznie, chorób wywołanych przez neisseria (np. zapalenie opon mózgowych).
Przeciwciała przeciwko LbpA nie wydają się być zabójcze dla bakterii, stąd ich zastosowanie jako szczepionka może być ograniczone (Pettersson i in., 1993).
Wynalazek identyfikuje i charakteryzuje inne białko wiążące laktoferrynę, białko wiążące laktoferrynę B (LbpB), jego rolę w wykorzystaniu żelaza z laktoferryny i jego zastosowania terapeutyczne.
Istnieje kilka zalet LbpB jako szczepionek nad innymi OMP. Po pierwsze, w etapie krwiopochodnym choroby wywołanej przez meningokoki u człowieka laktoferryna jest niezbędna dla organizmu, ponieważ ma 300-krotnie wyższe powinowactwo do żelaza niż ludzka transferryna, a stąd wykorzystanie laktoferryny jako źródła żelaza jest niezbędne dla organizmu. Po wtóre, laktoferryna wywiera znany efekt przeciwbakteryjny, zaś jej stężenie we krwi rośnie po zakażeniu. Stąd, istotne dla organizmu jest wiązanie ludzkiej laktoferryny dla uzyskania pewnej odporności na ten efekt. Na koniec, ludzka laktoferryna jest głównym źródłem żelaza dla N. meningitidis w miejscu wniknięcia bakterii do organizmu (nosogardziel).
Istotność tych zalet jest taka, że antygeny LbpB powinny być raczej wyrażane na powierzchni większości meningokoków w organizmie, ponieważ domena powierzchniowa LbpB wydaje się być bardzo zakonserwowana z powodu swego działania wiążącego laktoferrynę, oraz, że reakcja odpornościowa skierowana przeciwko antygenowi LbpB może nie tylko zatrzymać zakażenia meningokokowego we krwi, ale również zatrzymać przeniesienie organizmu w nosogardzieli.
Przedmiotem wynalazku jest izolowany polinukleotydy kodujący białko LbpB Neisseria meningitidis, który jest polinukleotydem o Id. Sekw. nr. 1 (od nukleotydu 100 do nukleotydu 2274), Id. Sekw. nr 3, Id. Sekw. nr 5, Id. Sekw. nr 7 albo Id. Sekw. nr 9.
Wynalazkiem jest objęty również izolowany polinukleotyd, obejmujący sekwencję nukleotydową, która jest przynajmniej w 65% identyczna z sekwencją o Id. Sekw. nr 1 (od nukleotydu 100 do nukleotydu 2274), Id. Sekw. nr 3, Id. Sekw. nr 5, Id. Sekw. nr 7, lub Id. Sekw. nr 9 na całej jej długości lub obejmujący sekwencję nukleotydową, która koduje polipeptyd przynajmniej w 65% identyczny odpowiednio z sekwencją o Id. Sekw. nr 2, Id. Sekw. nr 4, Id. Sekw. nr 6, Id. Sekw. nr 8 lub Id. Sekw. nr 10 na całej jej długości, a korzystnie od aminokwasu w pozycji 19 do końca C polipeptydu.
Przedmiotem wynalazku jest również izolowany polinukleotyd obejmujący fragment izolowanego polinukleotydu kodującego białko LbpB Neisseria meningitidis, będącego polinukleotydem o Id. Sekw. nr. 1 (od nukleotydu 100 do nukleotydu 2274), Id. Sekw. nr 3, Id. Sekw. nr 5, Id. Sekw. nr 7 albo Id. Sekw. nr 9, przy czym fragment ten koduje sekwencję aminokwasową o aktywności antygenowej LbpB N. meningitidis. Korzystnie izolowany polinukleotyd według wynalazku obejmuje sekwencję nu4
PL 194 800 B1 kleotydową, która koduje odpowiednio sekwencję aminokwasową z Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 lub 10, od aminokwasu w pozycji 19 do końca C polipeptydu.
Ponadto przedmiotem wynalazku jest polinukleotyd obejmujący sekwencję nukleotydową, która jest przynajmniej w 65% identyczna z sekwencją o Id. Sekw. nr 1,3, 5, 7 lub 9 na całej jej długości lub obejmujący sekwencję nukleotydową, która koduje polipeptyd przynajmniej w 65% identyczny z sekwencją o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 lub 10 na całej jej długości, oraz rekombinacyjny układ ekspresyjny, przy czym polinukleotyd jest zdolny do wytwarzania rekombinowanego polipeptydu LbpB w zgodnej komórce gospodarza. Wynalazkiem objęta jest zatem komórka gospodarza obejmująca polinukleotyd zawierająca taki polinukleotyd.
Wynalazek dostarcza również sposobu wytwarzania rekombinowanego polipeptydu LbpB, obejmującego hodowanie komórki gospodarza według wynalazku w warunkach odpowiednich do wytwarzania polipeptydu i odzyskiwanie polipeptydu z hodowli; oraz sposobu wytwarzania komórki wytwarzającej rekombinowany polipeptyd LbpB, obejmującego transformowanie albo transfekowanie komórki gospodarza rekombinacyjnym układem ekspresyjnym zawierającym polinukleotyd według wynalazku, tak, że komórka gospodarza w odpowiednich warunkach hodowli jest zdolna do wytwarzania rekombinowanego polipeptydu LbpB.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób wytwarzania pęcherzyka zewnątrzbłonowego zawierającego rekombinowany polipeptyd LbpB, który obejmuje transformowanie albo transfekowanie komórki gospodarza rekombinacyjnym układem ekspresyjnym zawierającym polinukleotyd według wynalazku, tak, że komórka gospodarza w odpowiednich warunkach hodowli jest zdolna do wytwarzania rekombinowanego polipeptydu LbpB.
Ponadto wynalazkiem objęty jest nielipidowany polipeptyd LbpB z Neisseria meningitidis obejmujący sekwencję aminokwasową przynajmniej w 65% identyczną z sekwencją o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 lub 10 na całej jej długości; rekombinowany polipeptyd LbpB z Neisseria meningitidis, obejmujący dodatkową sekwencję aminokwasową, która ułatwia oczyszczanie polipeptydu, przy czym polipeptyd obejmuje sekwencję aminokwasową przynajmniej w 65% identyczną z sekwencją aminokwasową o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 lub 10 na całej jej długości; polipeptyd LbpB z Neisseria meningitidis będący polipeptydem z Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 lub 10; polipeptyd LbpB z Neisseria meningitidis obejmujący sekwencję aminokwasową odpowiednio z Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 lub 10 od aminokwasu w pozycji 19 do końca C polipeptydu oraz jego białka fuzyjne; oraz fragment polipeptydu LbpB z N. meningitidis o sekwencji aminokwasowej z Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 lub 10, zachowujący aktywność antygenową polipeptydu, przy założeniu, że fragmenty reprezentowane przez aminokwasy w pozycjach 650-725 z Id. Sekw. nr 2 oraz 559-741 z Id. Sekw. nr 6 nie są uwzględnione, oraz jego białko fuzyjne.
Wynalazek dostarcza również polinukleotydu obejmującego sekwencję nukleotydową kodującą fragment polipeptydu LbpB z N. meningitidis o sekwencji aminokwasowej z Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 lub 10 zachowujący aktywność antygenową polipeptydu, przy założeniu że fragmenty reprezentowane przez aminokwasy w pozycjach 650-725 z Id. Sekw. nr 2 oraz 559-741 z Id. Sekw. nr 6 nie są uwzględnione, lub jego białko fuzyjne. Przedmiotem wynalazku jest również przeciwciało swoiste immunologicznie wobec polipeptydu LbpB z N. meningitidis według wynalazku.
Ponadto przedmiotem wynalazku jest sposób identyfikacji związków, które hamują polipeptyd LbpB z N. meningitidis według wynalazku obejmujący etapy (a) doprowadzenia do kontaktu związku kandydującego z komórkami, które wyrażają polipeptyd LbpB; i (b) obserwowania wiązania, albo zahamowania odpowiedzi funkcjonalnej; albo porównywania pod kątem aktywności wobec polipeptydu LbpB zdolności komórek, które doprowadzono do kontaktu ze związkiem kandydującym z takimi samymi komórkami, które nie były kontaktowane.
Wynalazek dostarcza również szczepionkę zawierającą skuteczną ilość polipeptydu LbpB z N. meningitidis według wynalazku oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Korzystnie szczepionka według wynalazku obejmuje co najmniej jeden antygen N. meningitidis. Inną szczepionką stanowiącą również przedmiot wynalazku jest szczepionka zawierająca skuteczną ilość fragmentu polipeptydu LbpB z N. meningitidis według wynalazku, przy czym fragment zachowuje aktywność antygenową polipeptydu, przy założeniu że fragmenty reprezentowane przez aminokwasy w pozycjach 650-725 z Id. Sekw. nr 2 oraz 559-741 z Id. Sekw. nr 6 nie są uwzględnione, lub jego białko fuzyjne, oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Korzystnie szczepionka ta zawiera co najmniej jeden antygen N. meningitidis. Przedmiotem wynalazku jest też szczepionka obejmująca skuteczną ilość polinukleotydu według wynalazku oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
PL 194 800 B1
Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie kompozycji obejmującej skuteczną ilość nielipidowanego LbpB z Neisseria meningitidis według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia lub hamowania choroby wywoływanej u ludzi przez Neisseria. Korzystnie lek otrzymywany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku jest przeznaczony do podawania doustnie, podskórnie, doodbytniczo, dotchawiczo, domięśniowo albo donosowo.
Wynalazek obejmuje również zastosowanie kompozycji obejmującej skuteczną ilość polinukleotydu według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia lub hamowania choroby wywoływanej u ludzi przez Neisseria. Korzystnie lek ten jest przeznaczony do podawania podskórnie, dotchawiczo, domięśniowo albo donosowo.
Krótki opis rysunków
Figura 1. Analiza met. Western blot białek z całych komórek hodowanych przy ograniczeniu żelaza. Ścieżki 1 i 5, szczep BNCV; ścieżki 2 i 6, mutant IbpA CE1452; ścieżki 3 i 7, mutant IbpB CE1454; ścieżki 4 i 8, mutant IbpAB CE1402. Zastosowano surowice odpornościowe skierowane przeciwko peptydom syntetycznym, opartym na sekwencji LbpB. Ścieżki 1-4, surowica 17-3, przeciwko peptydowi C1; ścieżki 5-8, surowica 19-1 przeciwko peptydowi E1. Położenie wzorców ciężaru cząsteczkowego zaznaczono po prawej stronie w tysiącach. Białko LbpB zaznaczono strzałką po lewej.
Figura 2. Mapa restrykcyjna fragmentów DNA zawierających gen IbpB i IbpA szczepu BNCV. Wstawki w różnych plazmidach rekombinowanych oraz produkt PCR (PCR) pokazano jako ramki. Plazmidy pAM23 i pAM1 zawierają fragmenty locus IbpBA, który scharakteryzowano uprzednio (Pettersson i in., 1993, 1994a). Otwarte ramki odczytu zaznaczono grubymi strzałkami. Sondy zastosowane do badania przesiewowego biblioteki albo do badania met. Southern'a pokazano powyżej otwartych ramek odczytu. Pozycje starterów zastosowanych do amplifikacji PCR pokazano poniżej otwartych ramek odczytu. Miejsce wprowadzenia kasety oporności na kanamycynę w pAM6K pokazano jako nie wypełniony trójkąt. Miejsce kasety oporności na erytromycynę w pAM23E zaznaczono wypełnionym trójkątem.
Figura 3. Przyrównanie białek LbpB szczepu BNCV i TbpB szczepu B16B6. Aminokwasy identyczne zaznaczono pionową kreską. Liczby po prawej oznaczają pozycje aminokwasowe.
Przerwy (-) wprowadzono w celu optymalizacji przyrównania. Peptydy zastosowane do immunizacji myszy zaznaczono powyżej sekwencji LbpB. Podkreślono dwa ciągi bogate w reszty naładowane ujemnie. Domniemane miejsce odcięcia sygnału przez peptydazę II pokazano strzałką powyżej sekwencji.
Figura 4. Sekwencja promotora powyżej IbpB. Miejsce rozpoczęcia translacji (ATG) zaznaczono wytłuszczoną czcionką. Miejsce wiązania rybosomu, oraz domniemane kasety -10 i -35 podkreślono (odpowiednio, cienką i grubą linią). Domniemaną kasetę Fur wzięto w ramkę.
Figura 5. Analiza met. Western blot białek z całych komórek hodowanych w pożywce TSB (ścieżki 1, 3, 5 i 7) albo w TSB z EDDA (ścieżki 2, 4, 6 i 8). Zastosowanymi przeciwciałami były: monoklonalne mn98k1 i mn98k2, skierowane przeciwko LbpA (panel A) albo surowica odpornościowa 17-3 przeciwko peptydowi C1 LbpA (Panel B). Ścieżki 1 i 2, szczep BNCV; ścieżki 3 i 4, mutant IbpA CE1452; ścieżki 5 i 6, mutant IbpB CE1454; ścieżki 7 i 8, mutant IpbAB CE1402.
Figura 6. A. Analiza met. Western blot białek z błon zewnętrznych szczepu BNCV meningokoków, hodowanego w ograniczeniu żelaza. Białka błony zewnętrznej poddano elektroforezie w warunkach nie denaturujących, i wykrywano białko LbpB przy użyciu surowicy skierowanej przeciwko syntetycznemu peptydowi A1. Ścieżki 1 i 2 pokazują próbki inkubowane w, odpowiednio, 0°C i 95°C przed elektroforezą. Pozycje wzorców ciężaru cząsteczkowego zaznaczono po prawej stronie w tysiącach. B. Test wiązania laktoferryny na membranach Western, z białkami z kompleksów błony zewnętrznej szczepu BNCV hodowanego w warunkach ograniczenia żelaza. Białka z kompleksów błony zewnętrznej poddano elektroforezie w warunkach nie denaturujących i inkubowano membranę z laktoferryną ludzką sprzęgniętą z peroksydazą. Ścieżki 1-3 pokazują próbki inkubowane w 0°C, 37°C i 95°C, przed elektroforezą. Pozycje wzorców ciężaru cząsteczkowego zaznaczono po prawej stronie w tysiącach.
Figura 7. Wiązanie laktoferryny z mutantami Ibp w teście ELISA z całymi komórkami. Szczepami, zaznaczonymi po prawej stronie pokryto studzienki. Laktoferrynę dodano w stężeniach 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125 i 0 ng/ml (odpowiednio, ścieżki 1-8). Laktoferrynę związaną z komórkami wykrywano surowicą odpornościową swoistą wobec peroksydazie sprzęgniętej z laktoferryną.
Figura 8. Testy płytkowe szczepów z rekombinowaną ludzką laktoferryną. Pokazano jedynie istotną część płytki. Komórki szczepów zaznaczonych po prawej wysiano na płytkach z ograniczeniem żelaza. Pobudzenie wzrostu wokół kropli laktoferryny w zaznaczonym stężeniu śledzono po całonoc6
PL 194 800 B1 nej hodowli. Strzałki pokazują położenie kropli w panelu B. W doświadczeniu zastosowano laktoferrynę wysyconą w 11% żelazem.
Figura 9. Przyrównanie białek LbpB z pięciu szczepów meningokoków. Przyrównanie przeprowadzono przy użyciu programu CLUSTAL (PC Gene, Intelligenetics) i optymalizowano ręcznie. Liczby po prawej stronie oznaczają pozycję aminokwasową. Odstępy (-) wprowadzono w celu optymalizacji przyrównania. Pozycje wszystkich pięciu sekwencji są identyczne, zaznaczone*.
Figura 10. A. Mapa restrykcyjna istotnych części pJP29 (Bosch i in., 1986), pAM31 i pAM32. Pokazano jedynie wstawki. Wektorem jest pACYC184, pJP29 zawierał gen phoE (jasno szary) za swoim promotorem. Promotor i sekwencje flankujące zaznaczono na biało. Miejsce PstI na granicy sekwencji odpowiadało sekwencji sygnałowej i dojrzałemu białku PhoE. pAM31 zawierał od lewej do prawej: promotor phoE (na biało) i rekombinowany gen kodujący sekwencję sygnałową PhoE (jasno szary) i dojrzałe LbpB (czarny). Fragmenty DNA odpowiadające końcowi N LbpA (ciemno szary), końcowi C PhoE (jasno szary) i sekwencje flankujące (białe) są również obecne. pAM32 skonstruowano z pAM31 przez wprowadzenie łącznika (paskowana ramka), kodującego znacznik His i miejsce cięcia czynnika Xa, w miejsce Pstl pAM31. Patrz Przykład 8 opisujący szczegółowo konstruowanie pAM31 i pAM32. Miejsca restrykcyjne na pAM32 zaznaczono nawiasami, ponieważ zostały zniszczone podczas klonowania.
B. Sekwencje aminokwasowe rekombinowanego konstruktu LbpB (poniżej) w porównaniu z sekwencją LbpB typu dzikiego (powyżej). Pokazano jedynie ostatni i pierwszy aminokwas sekwencji sygnałowej LbpB/PhoE i dojrzałej LbpB. Znacznik His i miejsce cięcia czynnika Xa pokazano w całości. Miejsce peptydazy I i II (odpowiednio, Lpasel i II) oraz miejsce cięcia czynnika Xa pokazano strzałkami.
Figura 11. PAGE oczyszczonego rekombinowanego białka LbpB. Ścieżki 1 i 2 pokazują próbki inkubowane, odpowiednio w 0°C i 100°C przed elektroforezą. Położenie wzorców ciężaru cząsteczkowego zaznaczono po prawej stronie w tysiącach.
Figura 12. Analiza met. Western blot fałdowanych (ścieżki 1, 3, 5, 7 i 9) i denaturowanych (ścieżki 2, 4, 6, 8, i 10) rekombinowanych LbpB pięciu surowic wyzdrowiałych ludzi. Ścieżki 1 i 2, surowica 69; ścieżki 3 i 4, surowica 262439; ścieżki 5 i 6, surowica 262532; ścieżki 7 i 8, surowica 263017; ścieżki 9 i 10, surowica 330. Położenie wzorców ciężaru cząsteczkowego zaznaczono po prawej stronie w tysiącach. Strzałki po lewej pokazują położenie denaturowanego (dLbpB) i fałdowanego (fLbpB).
Figura 13. Wyniki ELISA przeciwko całym komórkom i przeciwko LbpB (Tabela 7), przeprowadzonych jak to opisano w Przykładzie 10. A. Reakcja przeciwko LbpB u myszy immunizowanych LbpB albo całymi komórkami N. meningitidis szczepu BNCV. Immunizacje kontrolne przeprowadzono przy użyciu roztworu PBS. B. Reakcja przeciwko całym komórkom (szczep BNCV hodowany w warunkach niedoboru żelaza) u myszy immunizowanych LbpB albo całymi komórkami N. meningitidis szczepu BNCV. Immunizacje kontrolne przeprowadzono przy użyciu roztworu PBS. C. Reakcja przeciwko całym komórkom (szczep H44/76 hodowany w warunkach niedoboru żelaza) u myszy immunizowanych LbpB albo całymi komórkami N. meningitidis szczepu BNCV. Immunizacje kontrolne przeprowadzono przy użyciu roztworu PBS.
Figura 14. Wyniki aktywności bakteriobójczych (Tabela 8) surowic przeciwko całym komórkom i przeciwko LbpB szczepu BNCV przeprowadzone jak w Przykładzie 10. A. Miano bakteriobójcze przeciwko szczepowi H44/76 N. meningitidis (hodowanego w warunkach bogatych w żelazo). B. Miano bakteriobójcze przeciwko szczepowi H44/76 N. meningitidis (hodowanego w warunkach pozbawionych żelaza).
Definicje
Poniższe definicje dostarczono w celu ułatwienia zrozumienia pewnych często stosowanych tu określeń.
„LbpB zasadniczo odnosi się do polipeptydu, korzystnie lipoproteiny, o sekwencji aminokwasowej podanej jako Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10 albo ich odmian allelicznych.
„Aktywność LbpB albo aktywność polipeptydu LbpB albo „aktywność biologiczna LbpB albo polipeptydu LbpB dotyczy działania metabolicznego albo fizjologicznego LbpB, w tym podobnych aktywności. Konkretnie, aktywność LbpB jest zdolnością do wiązania ludzkiej laktoferryny. Aktywność tą można badać stosując sposób opisany w Przykładzie 6. Włączone do tej definicji są również aktywności antygenowe i immunogenne LbpB. Antygenowość tą można badać stosując metodę badania immunologicznego opisaną w Przykładzie 9, korzystnie stosując surowice poliklonalne przeciwko LbpB szczepu BNCV meningokoków, jak opisano w Przykładzie 10A. Immunogenność można badać przez
PL 194 800 B1 pomiar reakcji przeciwciał (stosując surowice poliklonalne wytworzone przeciwko odmianie) w ELISA z użyciem oczyszczonego LbpB ze szczepu BNCV meningokoków, jak to opisano w Przykładzie 10B.
„Gen IbpB dotyczy polinukleotydu o sekwencji nukleotydowej 100-2271 podanej na Id. Sekw.
nr 1, albo kompletnej sekwencji nukleotydowej podanej jako Id. Sekw. nr 3, 5, 7 albo 9 albo ich odmian allelicznych i/lub sekwencji komplementarnych.
„Przeciwciała w znaczeniu tu zastosowanym obejmują przeciwciała poliklonalne i monoklonalne, chimeryczne, jednołańcuchowe i humanizowane, jak również fragmenty Fab, w tym produkty bibliotek ekspresyjnych Fab i innych immunoglobulin.
„Izolowane oznacza zmieniony „ręką człowieka stan występowania w naturze. Jeżeli „izolowana kompozycja albo substancja występuje w naturze, została zmieniona albo pobrana z otoczenia albo jedno i drugie. Przykładowo, polinukleotyd albo polipeptyd naturalnie występujący w organizmie zwierzęcia nie jest „izolowany, podczas gdy ten sam polinukleotyd albo polipeptyd oddzielony od substancji współistniejących w stanie naturalnym jest „izolowany w znaczeniu tu zastosowanym.
„Polinukleotyd ogólnie oznacza dowolny polirybonukleotyd albo polidezoksyrybonukleotyd, który może być niemodyfikowanym RNA albo DNA albo modyfikowanym RNA albo DNA. „Polinukleotydy obejmują, bez ograniczania, pojedyncze albo dwuniciowe DNA, DNA stanowiące mieszaninę regionów jedno- i dwuniciowych, jedno- albo dwuniciowe RNA, i RNA stanowiące mieszaninę regionów jedno- i dwuniciowych, cząsteczki hybrydowe obejmujące DNA i RNA, które mogą być jednoniciowe albo częściej dwuniciowe, albo mieszaniny regionów jedno- i dwuniciowych. Oprócz tego, „polinukleotyd oznacza regiony trójniciowe obejmujące RNA albo DNA albo RNA i DNA. Określenie „polinukleotyd obejmuje również DNA i RNA zawierające jedną albo wiele zmodyfikowanych zasad oraz DNA i RNA o szkieletach modyfikowanych dla stabilności albo z innych względów. „Modyfikowane zasady oznaczają, przykładowo zasady trytylowane oraz niezwykłe zasady takie jak inozyna. DNA i RNA modyfikowano w różny sposób, stąd określenie „polinukleotyd obejmuje chemicznie, enzymatycznie albo metabolicznie modyfikowane postaci polinukleotydów zwykle spotykanych w naturze, jak również postaci chemiczne DNA i RNA charakterystyczne dla wirusów i komórek. „Polinukleotydy obejmują również względnie krótkie pollnukleotydy, często określane jako oligonukleotydy.
Określenie „polipeptydy dotyczy dowolnego peptydu albo białka obejmującego dwa albo więcej aminokwasów połączonych ze sobą wiązaniami peptydowymi albo modyfikowanymi wiązaniami peptydowymi, tj. izoestrami peptydowymi. „Polipeptyd dotyczy zarówno krótkich łańcuchów, zwykle określanych jako peptydy, oligopeptydy albo oligomery, jak również dłuższych łańcuchów, zasadniczo określanych jako białka. Polipeptydy mogą zawierać aminokwasy inne niż 20 aminokwasów kodowanych przez geny. „Polipeptydy obejmują sekwencje aminokwasowe modyfikowane procesami naturalnymi, takimi jak obróbka potranslacyjna, albo technikami modyfikacji chemicznej, które są dobrze znane w stanie techniki. Takie modyfikacje są dobrze opisane w podręcznikach i szczegółowych monografiach, jak również w literaturze naukowej. Modyfikacje mogą wystąpić w dowolnym miejscu w polipeptydzie, w tym w szkielecie polipeptydowym, łańcuchach bocznych aminokwasów oraz na końcach aminowych albo karboksylowych. Uwzględnia się, że ten sam rodzaj modyfikacji może występować w tym samym albo różnym stopniu w kilku miejscach w danym polipeptydzie. Dany polipeptyd może również zawierać wiele rodzajów modyfikacji. Polipeptydy mogą być rozgałęzione w wyniku ubikwitynacji albo cykliczne z albo bez rozgałęzień. Cykliczne, rozgałęzione i cykliczne rozgałęzione polipeptydy mogą powstać w wyniku naturalnych procesów potranslacyjnych albo mogą być wytworzone metodami syntetycznymi. Modyfikacje obejmują acetylację, acylację, ADP-rybozylację, amidację, kowalencyjne przyłączenie flawiny, kowalencyjne przyłączenie domeny hemowej, kowalencyjne przyłączenie nukleotydu albo pochodnej nukleotydu, kowalencyjne przyłączenie lipidu albo pochodnej lipidu, kowalencyjne przyłączenie fosfatydyloinozytolu, sieciowanie, cyklizację, tworzenie mostków disiarczkowych, demetylację, tworzenie sieciowania kowalencyjnego, tworzenie cystyny, tworzenie proglutaminianu, formylację, gamma-karboksylację, glikozylację, tworzenie zakotwiczenia GPI, hydroksylację, jodynację, metylację, mirystylację, oksydację, obróbkę proteolityczną, fosforylację, prenylację, racemizację, selenylację, sulfatację, dodanie aminokwasów do białka za pośrednictwem RNA, jak arginylacja i ubikwitynacja, patrz, przykładowo, Proteins Structure and Molecular Properties, wyd. 2, Creighton, Freeman and Company, New York, 1993, i Wold, Posttranslational Protein Modyfications: Perspectives and Prospects, str. 1-12, w Posttranslational Covalent Modification of Proteins, Johnson, Wyd. Academic Press, New York, 1983; Seifert i in., Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors, Meth. Enzymol. (1990) 182:626-646 i Rattan i in., Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging, Ann. NY Acad. Sci. (1992) 663:48-62.
PL 194 800 B1 „Odmiana w znaczeniu tu zastosowanym oznacza polinukleotyd albo polipeptyd, który różni się do polinukleotydu albo polipeptydu odniesienia, ale zachowuje zasadnicze właściwości biologiczne. Typowe odmiany polinukleotydu różnią się sekwencją nukleotydową od innego polinukleotydu odniesienia. Zmiany w sekwencji nukleotydowej odmiany mogą, ale nie muszą zmieniać sekwencji aminokwasowej polipeptydu kodowanego przez polinukleotyd odniesienia. Zmiany nukleotydowe mogą spowodować zastąpienia, addycję, delecje aminokwasowe, fuzje i okrawanie polipeptydu kodowanego przez polinukleotyd odniesienia. Typowa odmiana polipeptyd różni się sekwencją aminokwasową od polipeptydu odniesienia. Zasadniczo, różnice są ograniczone w taki sposób, że sekwencja polipeptydu odniesienia i odmiany są ogólnie podobne, zaś w wielu regionach identyczne. Odmiana i polipeptyd odniesienia mogą się różnić w sekwencji aminokwasowej jednym albo wieloma zastąpieniami, addycjami, delecjami w dowolnej kombinacji. Zastąpiona albo wprowadzona reszta aminokwasowa może, ale nie musi być kodowana przez kod genetyczny. Odmiany polinukleotydu albo polipeptydu mogą występować w naturze, jak np. odmiany alleliczne (przykładowo, Id. Sekw. nr 3, 5, 7 albo 9 są odmianami polinukleotydu IbpB o Id. Sekw. nr 1, zaś Id. Sekw. nr 4, 6, 8 albo 10 są odmianami polipeptydu LbpB o Id. Sekw. nr 2) albo może być odmianą nie występującą w naturze. Odmiany polinukleotydów albo polipeptydów nie występujące naturalnie można wytworzyć technikami mutagenezy albo bezpośredniej syntezy. Odmiany powinny zachowywać jedną albo wiele aktywności biologicznych polipeptydu LbpB. Powinny być zdolne do wiązania ludzkiej laktoferryny (korzystnie, jak to opisano w teście aktywności w Przykładzie 6), albo mieć podobne właściwości antygenowe albo immunogenne co LbpB. Antygenowość można najlepiej zbadać stosując badanie immunologiczne opisane w Przykładzie 9, korzystnie stosując surowice poliklonalne przeciwko LbpB szczepu BNCV meningokoków, jak to opisano w Przykładzie 10A. Immunogenność można badać przez pomiar reakcji przeciwciał (stosując surowice poliklonalne wytworzone przeciwko odmianie) w ELISA z użyciem oczyszczonego LbpB ze szczepu BNCV meningokoków, jak to opisano w Przykładzie 10B. Korzystnie, odmiana powinna zachowywać wszystkie powyższe aktywności biologiczne.
„Identyczność jest miarą podobieństwa sekwencji nukleotydowych albo aminokwasowych. Ogólnie, sekwencje przyrównuje się w taki sposób, żeby uzyskać najwyższy stopień dopasowania. „Identyczność per se ma znaczenie zrozumiałe w dziedzinie i można ją obliczyć stosując opublikowane techniki. Patrz, nnp Computational Molecular Biology, Lesk i in., wyd. Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith wyd., Academic Press, New York, 1993; Computer analysis of Sequence Data, cz. I, Griffin i Griffin, wyd. Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heijne, Academic Press, 1987; i Sequence Analysis Primer, Gribskov i Devereux, wyd. Stockton Press, New York, 1991). O ile istnieje wiele sposobów mierzenia identyczności pomiędzy dwiema sekwencjami polinukleotydowymi albo polipeptydowymi, określenie, „identyczność jest dobrze znane specjalistom (Carillo i Lipton, SIAM J. Appl. Math. (1988) 48:1073). Sposoby powszechnie stosowane do określania identyczności albo podobieństwa pomiędzy dwiema sekwencjami obejmują, choć nie są ograniczone do ujawnionych w Guide to Huge Computers, Martin Bishop, wyd. Academic Press, San Diego, 1994 i Carillo i Lipton SIAM J. Appl. Math. (1988) 48:1073. Sposoby określania identyczności i podobieństwa są określone w programach komputerowych. Korzystne programy komputerowe do określania identyczności i podobieństwa pomiędzy dwiema sekwencjami obejmują, choć nie są ograniczone do pakietu programów GCS (Devereux i in., Nucl. Acids. Res. (1984) 12(1):387), BLASTP, BLASTN, FASTA (Altschul i in., J. Molec. Biol. (1990) 215:403).
Jako ilustracja, polinukleotydem o sekwencji nukleotydowej o przynajmniej, przykładowo, 95% „identyczności z sekwencją nukleotydową odniesienia o Id. Sekw. nr 1 jest taki polinukleotyd o sekwencji nukleotydowej identycznej z sekwencją odniesienia z takim wyjątkiem, że sekwencja może zawierać średnio do 5 punktów mutacji na każde 100 nukleotydów sekwencji nukleotydowej odniesienia o Id. Sekw. nr 1. Innymi słowy, w celu otrzymania polinukleotydu o sekwencji nukleotydowej w przynajmniej 95% identycznej z sekwencją nukleotydową odniesienia, do 5% nukleotydów w sekwencji odniesienia może być usuniętych albo zastąpionych innymi nukleotydami, albo do 5% całkowitej liczby nukleotydów w sekwencji odniesienia można wprowadzić do sekwencji odniesienia. Mutacje sekwencji odniesienia mogą wystąpić na końcu 5' albo 3' sekwencji nukleotydowej odniesienia albo gdziekolwiek pomiędzy pozycjami końcowymi, rozproszone pojedynczo wśród nukleotydów sekwencji odniesienia, albo w jednej albo wielu ciągłych grupach w sekwencji odniesienia.
Podobnie, polipeptydem o sekwencji aminokwasowej o przynajmniej, przykładowo 95% „identyczności z sekwencją aminokwasową odniesienia o Id. Sekw. nr 2 jest taki polipeptyd o sekwencji peptydowej identycznej z sekwencją odniesienia z takim wyjątkiem, że sekwencja może zawierać
PL 194 800 B1 średnio do 5 zmian aminokwasowych na każde 100 aminokwasów sekwencji peptydowej odniesienia o Id. Sekw. nr 2. Innymi słowy, w celu otrzymania polipeptydu o sekwencji peptydowej w przynajmniej 95% identycznej z sekwencją peptydową odniesienia, do 5% aminokwasów w sekwencji odniesienia może być usuniętych albo zastąpionych innymi aminokwasami, albo do 5% całkowitej liczby aminokwasów w sekwencji odniesienia można wprowadzić do sekwencji odniesienia. Zastąpienia w sekwencji odniesienia mogą wystąpić na końcu aminowym albo karboksylowym sekwencji peptydowej odniesienia albo gdziekolwiek pomiędzy pozycjami końcowymi, rozproszone pojedynczo wśród aminokwasów sekwencji odniesienia, albo w jednej albo wielu ciągłych grupach w sekwencji odniesienia.
Polipeptydy według wynalazku
W jednym aspekcie, wynalazek dotyczy polipeptydów LbpB (albo białek LbpB). Polipeptydy LbpB obejmują polipeptydy o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10 (reszty 1-18 stanowią naturalną sekwencję sygnałową każdego z białek, zaś reszta Cys19 jest aminokwasem końca N, który jest lipidowany w naturalnym dojrzałym białku); jak również polipeptydy obejmujące sekwencję aminokwasową o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10; i polipeptydy obejmujące sekwencję aminokwasową, która wykazuje przynajmniej 65% identyczności z Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10 na całej długości, jeszcze korzystniej przynajmniej 70%, zaś jeszcze korzystniej przynajmniej 80%, zaś jeszcze korzystniej przynajmniej 90% identyczności z Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10. Ponadto, najkorzystniejsze są takie o przynajmniej 95-99% identyczności. Objęte pojęciem polipeptydów LbpB są również polipeptydy o sekwencji aminokwasowej o przynajmniej 65% identyczności z polipeptydem o sekwencji aminokwasowej o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10 na całej długości, jeszcze korzystniej przynajmniej 70%, zaś jeszcze korzystniej przynajmniej 80%, zaś jeszcze korzystniej przynajmniej 90% identyczności z Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10. Ponadto, najkorzystniejsze są takie o przynajmniej 95-99% identyczności.
Polipeptydy LbpB dostarczone w Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10 są polipeptydami LbpB ze szczepów N. meningitidis, odpowiednio, BNCV, M981, H44/76, M990 i 881607.
Polipeptydy LbpB mogą być w postaci białka dojrzałego albo mogą stanowić część większego białka jak białko fuzyjne. Korzystne może być włączenie dodatkowej sekwencji aminokwasowej, która zawiera sekwencje wydzielnicze albo liderowe (takie jak naturalne sekwencje liderowe LbpB; reszty 1-18 Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10), pro-sekwencje, sekwencje wspomagające oczyszczanie, takie jak wielokrotne reszty histydynowe albo dodatkowe sekwencje dla stabilności podczas wytwarzania rekombinacyjnego.
Fragmenty polipeptydów LbpB są również włączone do wynalazku. Fragment polipeptydu o sekwencji aminokwasowej, która stanowi część, ale nie całość, sekwencji aminokwasowej polipeptydów LbpB. Podobnie jak w przypadku polipeptydów LbpB, fragmenty mogą być „wolne albo włączone do większego polipeptydu, które stanowią część albo region, korzystnie jako pojedyncze ciągły region. Reprezentatywne przykłady fragmentów polipeptydowych według wynalazku obejmują, przykładowo, fragmenty o liczbie aminokwasów około 1-20, 21-40, 41-60, 61-80, 81-100 i 101 od końca polipeptydu LbpB. W tym kontekście „około obejmuje poszczególne wymienione zakresy większe albo mniejsze o kilka, 5, 4, 3, 2 albo 1 aminokwas na jednym końcu albo obu końcach.
Korzystne fragmenty obejmują, przykładowo okrojone polipeptydy o sekwencji aminokwasowej polipeptydów LbpB, z wyjątkiem delecji ciągłego szeregu reszt, które obejmują koniec aminowy albo ciągłego szeregu reszt, które obejmują koniec karboksylowy i/lub region śródbłonowy albo delecję dwóch ciągłych szeregów reszt, które obejmują oba końce, aminowy i karboksylowy. Korzystne są również fragmenty charakteryzujące się cechami strukturalnymi albo funkcjonalnymi takie jak fragmenty obejmujące helisę alfa i regiony tworzące helisę alfa, płachtę beta i regiony tworzące płachtę beta, skręt i regiony tworzące skręt, spiralę i regiony tworzące spiralę, regiony hydrofilowe, regiony hydrofobowe, regiony amfipatyczne alfa, regiony amfipatyczne beta, regiony giętkie, regiony tworzące powierzchnie, regiony wiążące substrat i regiony silnie antygenowe. Innymi korzystnymi fragmentami są fragmenty biologicznie czynne. Fragmentami biologicznie czynnymi są takie, które pośredniczą w aktywności LbpB, w tym fragmenty o podobnej aktywności albo lepszej aktywności, albo o zmniejszonej niepożądanej aktywności. Objęte są również takie fragmenty, które są antygenowe albo immunogenne dla zwierząt, zwłaszcza dla człowieka. Fragmenty powinny zachowywać jedną albo wiele aktywności biologicznych polipeptydu LbpB. Korzystnie, fragmenty polipeptydowe powinny stanowić ciąg (ponad 16 aminokwasów sekwencji aminokwasowej pochodzącej z Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10, o aktywności biologicznej antygenowej albo immunogennej takiej jak polipeptyd LbpB pełnej długości, z którego pochodzą.
PL 194 800 B1
Odmiany o określonej sekwencji i fragmenty również tworzą część wynalazku. Korzystnymi odmianami są takie odmiany, które różnią się od postaci odniesienia konserwatywnymi zastąpieniami aminokwasowymi, tj. takie, że zastąpiono resztę inną o podobnej charakterystyce. Zwykle, zastąpienia dokonuje się pomiędzy Ala, Leu, Val i Ile; Ser i Thr; resztami kwasowymi Asp i Glu; Asn i Gln; oraz Lys i Arg; Phe i Tyr. Szczególnie korzystnymi odmianami są takie, które różnią się od postaci odniesienia zastąpieniami aminokwasowymi, które spotyka się w strukturalnie równoważnych pozycjach (jak pokazano przez przyrównanie homologii) w innych sekwencjach LbpB (Przykładowo, przyrównania homologii 5 sekwencji LbpB na Fig. 9). Szczególnie korzystne odmiany obejmują sekwencję aminokwasową, która wykazuje przynajmniej 65% identyczności z Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10 na całej długości, jeszcze korzystniej przynajmniej 70%, zaś jeszcze korzystniej przynajmniej 80%, zaś jeszcze korzystniej przynajmniej 90% identyczności z Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10. Ponadto, najkorzystniejsze są takie o przynajmniej 95-99% identyczności. Przykładowo, na Figurze 9 jeżeli sekwencją odniesienia jest LbpB z BNCV, odmiana powinna mieć zastąpione reszty 300-308 dowolnymi resztami w równoważnej pozycji sekwencji LbpB szczepu H44/76 (reszty, odpowiednio, 305-313), szczepu M990 (reszty 307-315), szczepu M981 (reszty 302-310) albo szczepu 881607 (reszty 303-311). Sekwencję aminokwasową NPDLAKSHA można zastąpić STDVATNLA [ST (z M981, reszty 302-303), D (z BNCV, reszta 302), V (z 881607, reszta 306), A (z M990, reszta 311), T (z H44/76, reszta 310), NLA (z M990, reszty 313-315)] zaś powstałe białko można zaklasyfikować jako odmianę i polipeptyd według wynalazku.
Takie zastąpienia mogą obejmować delecje, przykładowo reszty 357-366 LbpB szczepu M981 (ponieważ nie ma równoważników pozycji aminokwasowych w LbpB szczepu BNCV - patrz, Fig.9), takie białko może stanowić odmianę i polipeptyd według wynalazku.
Oprócz tego, dobrze wiadomo, że genomy N. meningitidis i innych szczepów neisseria (przykładowo N. gonorrhoeae) są genomowo bardzo homologiczne ze sobą. Genomy N. meningitidis i Moraxella catharralis (dawniej Neisseria catharralis) są również wystarczająco homologiczne aby umożliwić wymianę genu. Białka równoważne LbpB (albo odmiany alleliczne LbpB) szczepów neisseria i Moraxella catharralis również stanowią polipeptydy według wynalazku, ponieważ spełniają opisane wyżej kryteria % identyczności sekwencji. Oprócz tego, taki równoważnik powinien stanowić polipeptyd według wynalazku, jeżeli wykazuje wspólną, przynajmniej 65% podobieństwo sekwencji z jedną z sekwencji odniesienia (Ld. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10) na całej długości, mierzone programem BLAST (Altschul i in., (1997) Nucl. Acids Res. 25:3389-3402; Karlin i Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68; Karlin i Atschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-7), jeszcze korzystniej przynajmniej 70%, zaś jeszcze korzystniej przynajmniej 80%, zaś jeszcze korzystniej przynajmniej 90% identyczności z Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10. Ponadto, najkorzystniejsze są takie o przynajmniej 95-99% identyczności. Białka takie powinny wiązać ludzką laktoferrynę (z definicji) i powinny być zdolne do reakcji krzyżowej z surowicami poliklonalnymi przeciwko LbpB ze szczepów meningokoków. Dokładną sekwencję aminokwasową tych odmian można łatwo określić stosując informację o sekwencjach polinukleotydowych i polipeptydowych o Id. Sekw. nr 1-10.
Polipeptydy LbpB według wynalazku można wytworzyć w dowolny sposób. Polipeptydy takie obejmują izolowane, występujące naturalnie lipopolipeptydy, polipeptydy albo lipopolipeptydy wytworzone rekombinacyjnie, polipeptydy wytworzone syntetycznie albo polipeptydy wytworzone kombinacją tych sposobów. Sposoby wytwarzania takich polipeptydów są dobrze znane w dziedzinie wiedzy.
Polinukleotydy według wynalazku
Inny aspekt wynalazku dotyczy polinukleotydów LbpB. Polinukleotydy LbpB obejmują izolowane polinukleotydy, które kodują polipeptydy i fragmenty LbpB, i blisko z nimi spokrewnione polinukleotydy. Konkretnie, polinukleotyd LbpB według wynalazku obejmuje polinukleotyd obejmujący sekwencję nukleotydową zawartą w Id. Sekw. nr 1, 3, 5, 7 albo 9, kodujących polipeptyd LbpB o, odpowiednio, Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10, i polinukleotydy o konkretnej sekwencji o Id. Sekw. nr 1, 3, 5, 7 albo 9. Polinukleotydy LbpB dalej obejmują polinukleotyd obejmujący sekwencję nukleotydową wykazującą przynajmniej 65% identyczności na całej długości z sekwencją nukleotydową kodującą polipeptyd LbpB o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10 i polinukleotyd obejmujący sekwencję nukleotydową wykazującą przynajmniej 65% identyczności z Id. Sekw. nr 1 od nukleotydu 100 do nukleotydu 2274, i polinukleotyd obejmujący sekwencję nukleotydową, która jest przynajmniej w 65% identyczna z Id. Sekw. Nr 3, 5, 7 albo 9. Pod tym względem, bardziej korzystny jest polinukleotyd wykazujący przynajmniej 70% identyczności, szczególnie korzystne są polinukleotydy wykazujące przynajmniej 80% identyczności, zaś szczególnie korzystne są polinukleotydy wykazujące przynajmniej 90% identyczności. Ponadto,
PL 194 800 B1 polinukleotydy o 95% identyczności są niezwykle korzystne, zaś najkorzystniejsze są polinukleotydy o 98-99% identyczności, przy czym najkorzystniejsze są przynajmniej 99%. Pod pojęciem polinukleotydów LbpB mieszczą się również sekwencje nukleotydowe, które wykazują wystarczającą identyczność z sekwencją nukleotydową zawartą w Id. Sekw. nr 1,3, 5, 7 albo 9, do hybrydyzacji w warunkach umożliwiających amplifikację albo zastosowanie jako sondę albo znacznik. Wynalazek dostarcza również polinukleotydów, które są komplementarne z takimi polinukleotydami LbpB.
Polinukleotydy LbpB dostarczone jako Id. Sekw. nr 1, 3, 5, 7 albo 9 są polinukleotydami LbpB ze szczepów N. meningitidis, odpowiednio, BNCV, M981, H44/76, M990 i 881607.
Sekwencja nukleotydowa kodująca polipeptyd LbpB o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10 może być identyczna z sekwencją kodującą polipeptyd, zawartą w nukleotydach od 100 do 2274 Id. Sekw. nr 1, albo sekwencją kodującą polipeptyd, zawartą w Id. Sekw. nr 3, 5, 7 albo 9, albo może być sekwencją, która w wyniku nadmiarowości (redundancji) kodu genetycznego również koduje polipeptyd o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10.
Jeżeli polinukleotydy według wynalazku stosuje się do rekombinacyjnego wytwarzania polipeptydu LbpB, polinukleotyd może obejmować sekwencję kodującą dojrzały polipeptyd (reszty 19 do końca C Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10) albo jej fragment; Sekwencja kodująca dojrzały polipeptyd albo fragment w ramce odczytu z inną sekwencją kodującą, jak sekwencje kodujące sekwencję liderową albo wydzielniczą, sekwencję pre- albo pro- albo pre-pro-białka, albo inne części białka fuzyjnego (przykładowo reszty 1 do 18 Id. Sekw. nr 2, naturalna sekwencja sygnałowa LbpB). Przykładowo, może kodować sekwencję znacznika ułatwiającego oczyszczanie polipeptydu fuzyjnego. W konkretnych korzystnych wykonaniach tego aspektu wynalazku, sekwencją znacznika jest heksapeptyd histydynowy, jak wprowadzany przez wektor pQE (QIAgen, Inc.) i opisany przez Gentz i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86:821-824, albo jest znacznikiem HA, albo transferazy S glutationowej. Korzystna jest również fuzja LbpB z naturalną sekwencją sygnałową (reszty 1 do 18 Id. Sekw. nr 2). Polinukleotyd może również zawierać nie kodujące sekwencje 5' i 3', takie jak ulegające transkrypcji, nie ulegające translacji, sekwencje sygnały składania transkryptu i poliadenylacji, miejsca włączania rybosomu i sekwencje stabilizujące mRNA.
Dalszymi korzystnymi wykonaniami są polinukleotydy kodujące odmiany polipeptydu LbpB opisane wcześniej. Najkorzystniej, obejmują one sekwencję aminokwasową polipeptydu LbpB o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10, w których kilka, 10-25, 5-10, 1-5, 1-3, 1-2 albo 1 reszta aminokwasowa została zastąpiona, usunięta albo dodana, w dowolnej kombinacji i zachowują one aktywności biologiczne polipeptydu LbpB.
Wynalazek dotyczy dalej polinukleotydów, które hybrydyzują z opisanymi tu sekwencjami. Pod tym względem, wynalazek szczególnie dotyczy polinukleotydów, które hybrydyzują w surowych warunkach z opisanymi wyżej polinukleotydami. W znaczeniu tu zastosowanym, określenie „surowe warunki oznaczają, że hybrydyzacja zajdzie tylko wtedy gdy pomiędzy sekwencjami istnieje przynajmniej 80%, korzystnie przynajmniej 90%, zaś najkorzystniej przynajmniej 95%, jeszcze korzystniej 97-99% identyczność.
Polinukleotydy według wynalazku, które są identyczne albo wystarczająco identyczne z sekwencją nukleotydową zawartą w Id. Sekw. nr 1,3, 5, 7 albo 9 albo ich fragmentach, można zastosować jako sondy hybrydyzacyjne dla cDNA i genomowego DNA, w celu wyizolowania cDNA i klonów genomowych pełnej długości, kodujących polipeptyd LbpB oraz w celu izolowania cDNA i klonów genomowych innych genów (w tym genów kodujących homologi i ortologi gatunków innych niż N. meningitidis), które wykazują wysokie podobieństwo do genu LbpB. Takie techniki hybrydyzacji są znane specjalistom w dziedzinie. Zwykle, te sekwencje nukleotydowe są w 80% identyczne, korzystnie w 90%, jeszcze korzystniej w 95% identyczne z sekwencją odniesienia. Sondy zasadniczo obejmują przynajmniej 15 nukleotydów. Korzystnie, sondy takie powinny mieć przynajmniej 30 nukleotydów i mogą mieć przynajmniej 50 nukleotydów. Szczególnie korzystne są sondy w zakresie od 30 do 50 nukleotydów.
W jednym wykonaniu, w celu otrzymania polinukleotydu kodującego polipeptyd LbpB, w tym homologi i ortologi z gatunków innych niż N. meningitidis, sposób obejmuje etapy testów przesiewowych odpowiedniej biblioteki w surowych warunkach hybrydyzacji ze znakowaną sondą o sekwencji nukleotydowej o Id. Sekw. nr 1, 3, 5, 7 albo 9 albo ich fragmentem; i izolowania klonów cDNA i genomowych pełnej długości zawierających sekwencje polinukleotydowe. Tak wiec w innym aspekcie, polinukleotydy LbpB według wynalazku, dalej obejmują sekwencję nukleotydową obejmującą sekwencję nukleotydową, która hybrydyzuje w surowych warunkach z sekwencją nukleotydową o sekwencji nukleotydowej Id. Sekw. nr 1, 3, 5, 7 albo 9, albo ich fragmentów. Objęte są również polipeptydy LbpB
PL 194 800 B1 obejmujące sekwencje aminokwasowe kodowane przez sekwencje nukleotydowe otrzymane w powyższych surowych warunkach hybrydyzacji. Takie techniki hybrydyzacji są dobrze znane specjalistom. Surowe warunki hybrydyzacji są, jak to podano wyżej, albo alternatywnie warunki inkubacji przez noc w 42°C w roztworze zawierającym: 50% formamid, 5xSSC (150 mM NaCl, 15 mM cytrynian trisodu), 50 mM fosforan sodu (pH 7,6), 5X roztwór Denhardta, 10°% siarczan dekstranu i 20 pg/ml denaturowanego, fragmentowanego DNA spermy łosia, a następnie płukanie w 0,1xSSC w około 65°C.
Polinukleotydy i polipeptydy według wynalazku można zastosować jako odczynniki badawcze do badania leczenia i środków diagnostycznych u zwierząt i ludzi.
Wektory, komórki gospodarza, ekspresja
Wynalazek dotyczy również wektorów, które obejmują polinukleotyd albo polinukleotydy według wynalazku, i komórki gospodarza, które zmieniono genetycznie przy użyciu wektorów według wynalazku oraz wytwarzania polipeptydów według wynalazku technikami rekombinacyjnymi. Bezkomórkowe układy translacji można zastosować w celu wytworzenia takich białek stosując mRNA pochodzące z konstruktów DNA według wynalazku.
Do rekombinacyjnego wytwarzania, komórki gospodarza można zmienić genetycznie w taki sposób, że obejmują one układy ekspresyjne albo ich części dla polinukleotydów według wynalazku. Wprowadzanie polinukleotydów do komórki gospodarza można przeprowadzić sposobami opisanymi w wielu standardowych podręcznikach, takich jak Davies i in., Basic Methods in Molecular Biology (1986) i Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboroatory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, jak transfekcja fosforanem wapnia, transfekcja za pośrednictwem DEAE-dekstranu, transfekcja, mikrowstrzyknięcie, lipofekcja za pośrednictwem lipidu kationowego, elsktroporacja, transdukcja, wprowadzanie balistyczne albo zakażenie.
Reprezentatywne przykłady odpowiednich gospodarzy obejmują komórki bakteryjne, takie jak meningokoki (dwoinki), paciorkowce, E. coli, komórki Streptomyces i Bacillus subtilis; komórki grzybów, takie jak drożdże i Aspergillus, komórki owadów takie jak Drosophila S2 i Spodoptera Sf9, komórki zwierzęce jak CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK 293 i komórki czerniaka Bowesa, oraz komórki roślinne.
Można zastosować szereg układów ekspresyjnych. Układy takie obejmują, między innymi, układy chromosomalne, episomalne i wirusowe, np. wektory pochodzące z plazmidów bakteryjnych, z bakteriofagów, z transpozonów, z episomów drożdży, z elementów insercyjnych, z elementów chromosomów drożdżowych, z wirusów takich jak bakulowirusy, wirusy papova, jak SV40, wirus krowianki, adenowirusy, wirusy ospy drobiu, wirusy pseudowścieklizny i retrowirusy, i wektorów otrzymywanych ich kombinacji, takich jak pochodzące z plazmidu i elementu genetycznego bakteriofaga, jak kosmid i fagemid. Układy ekspresyjne zasadniczo mogą zawierać regiony kontrolne, które regulują jak również zapoczątkowują ekspresję. Zasadniczo, można zastosować dowolny układ albo wektor przydatny do utrzymywania, namnażania albo wyrażania polinukleotydów w celu wytwarzania polipeptydu w komórce gospodarza. Odpowiednie sekwencje nukleotydowe można wprowadzać do układu ekspresyjnego przy użyciu licznych i dobrze znanych technik, jak np. patrz, Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboroatory Manual, (wyżej).
W celu wydzielania białka do światła siateczki śródplazmatycznej, do przestrzeni periplazmatycznej albo do środowiska zewnątrzkomórkowego można włączyć do pożądanego polipeptydu odpowiednie sygnały wydzielnicze. Sygnały te mogą być endogenne dla polipeptydu (reszty 1-18 Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10) albo heterologiczne.
W celu wyrażenia lipidowanego, rekombinowanego LbpB, korzystnie endogenny peptyd sygnałowy kodowany jest przez konstrukt genowy zaś korzystnym układem będzie gospodarz bakteryjny.
Jeżeli polipeptyd LbpB ma być wyrażany do zastosowania w testach przesiewowych, zasadniczo, korzystne jest żeby peptyd był wytwarzany na powierzchni komórki. W tym przypadku, komórki można zebrać przed zastosowaniem ich w teście przesiewowym. Jeżeli polipeptyd LbpB jest wydzielany do pożywki, pożywkę można odzyskiwać w celu odzyskania i oczyszczania polipeptydu; Jeżeli produkowany w komórkach, komórki trzeba najpierw rozłożyć przed odzyskaniem polipeptydu.
Polipeptyd LbpB można odzyskiwać i oczyszczać z hodowli rekombinowanych komórek dobrze znanymi sposobami, w tym przez precypitację siarczanem amonu albo etanolem, ekstrakcję kwaśną, chromatografię jonowymienną anionową albo kationową, chromatografię na fosfocelulozy, chromatografię oddziaływań hydrofobowych, chromatografię powinowactwa, chromatografię na hydroksyapatycie, i chromatografię lektynową. Jeszcze korzystniej, do oczyszczania stosuje się wysokosprawną chromaPL 194 800 B1 tografię ciekłofazową. Dobrze znane techniki ponownego fałdowania białek można zastosować w celu regeneracji aktywnej konformacji, gdy polipeptyd został zdenaturowany podczas izolowania i oczyszczanie.
Testy diagnostyczne
Niniejszy wynalazek dotyczy również zastosowania LpbB, przeciwciał przeciwko LpbB i faga prezentującego przeciwciała przeciwko LpbB do wykorzystania jako reagenty diagnostyczne. Wykrywanie LpbB może dostarczyć narzędzia diagnostycznego, które można między innymi dodać do diagnostyki albo zastosować do postawienia diagnozy rzeżączki.
Materiały do diagnostyki można uzyskać z komórek osobnika, takich jak komórki krwi, komórki uzyskane z moczu, śliny, bioptatów tkankowych.
Tak więc w innym, aspekcie, niniejszy wynalazek dotyczy zestawu diagnostycznego do diagnostyki choroby albo podejrzenia choroby, szczególnie rzeżączki, który obejmuje:
(a) pollnukleotyd LpbB, korzystnie sekwencję nukleotydową o Id. Sekw. nr 1, 3, 5, 7 albo 9, albo jej fragment;
(b) sekwencję nukleotydową komplementarną do (a);
(c) polipeptyd LpbB, korzystnie polipeptyd o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10, albo jego fragment; albo (d) przzciwciało przeciwko pc^llj:^^p3tt^dc^wi LpbB, kotzzstnie przeciwko polippetydowi o I d. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10 (i bardziej korzystnie przeciwko reszcie 19 końca C polipeptydu o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10).
(e) fag prezerTujący przeciwciało pr^^^(^i\^ł^o pollpeptydowi LpbB, korzystne ρι^^^(^ϊ\^Ι^ο pollpeptydowi o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10 (i bardziej korzystnie przeciwko reszcie 19 końca C polipeptydu o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10).
Będzie korzystnie, gdy w każdy z tych zestawów (a), (b), (c), (d) albo (e) będzie mógł zawierać istotny składnik.
Przeciwciała
Polipeptydy według wynalazku albo ich fragmenty, albo ich analogi, albo komórki je wyrażające można również zastosować jako czynnki immunogenne do wytwarzania przeciwciał immunoswoistych wobec polipeptydu LbpB. Termin „immunoswoiste oznacza, że przeciwciała wykazują znacząco większe powinowactwo do polipeptydów według wynalazku, niż ich powinowactwo do innych pokrewnych polipeptydów we wcześniejszym stanie techniki.
Przeciwciała wytworzone przeciwko polipeptydom LbpB można uzyskać przez podawanie według typowych protokołów polipeptydów albo fragmentów niosących epitop, analogów albo komórek zwierzęciu, korzystnie niebędącemu człowiekiem. W celu uzyskania przeciwciał monoklinalnych można stosować każdą technikę do uzyskiwania przeciwciał wytwarzanych przez stałą hodowlę komórkową. Przykłady obejmują technikę hybrydoma (kohler, G. i Milstein, C. Nature (1975) 256:495-497), technikę trioma, technikę hybrydoma ludzkich limfocytów B (Kozbor i in., Immunology Today (1983) 4:72) i technikę hybrydoma EBV (Cole i in., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, str. 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985).
Techniki do wytwarzania przeciwciał pojedynczego łańcucha (patent amerykański nr 4 946 778) można również wykorzystać do wytwarzania przeciwciał pojedynczego łańcucha przeciwko polipeptydom według wynalazku. Do wyrażania przeciwciał humanizowanych można wykorzystać również myszy transgeniczne, albo inne organizmy w tym inne ssaki.
Powyżej opisane przeciwciała można wykorzystać do wyizolowania albo do identyfikacji klonów wyrażających polipeptyd albo do oczyszczania polipeptydów chromatografią powinowactwa.
Przeciwciała przeciwko polipeptydom LpbB można również wykorzystać między innymi do leczenia rzeżączki (np. rzeżączkowego zapalenia opon mózgowych). Można je również wykorzystać do diagnostyki choroby.
Szczepionki
Inny aspekt niniejszego wynalazku dotyczy sposobu wywoływania odpowiedzi odpornościowej u ssaka (korzystnie człowieka) obejmującego zaszczepienie ssaka polipeptydem LbpB, albo fragmentami niosącymi epitop, analogami, cząstkami pozabłonowymi, albo komórkami (atenuowanymi lub innymi) wystarczającej do wytworzenia przeciwciała i/lub odpowiedzi odpornościowej limfocytów T w celu między innymi ochrony danego zwierzęcia przed rzeżączką. Jeszcze inny aspekt niniejszego wynalazku dotyczy sposobu wywoływania odpowiedzi odpornościowej u ssaka (korzystnie człowieka) obejmującego dostarczanie polipeptydu LbpB poprzez wektor kierujący ekspresją polinukleotydu LbpB in vivo w celu wywołania takiej odpowiedzi odpornościowej, która powoduje wytwarzanie przeciwciała chroniącego dane zwierzę przed chorobami.
PL 194 800 B1
Kolejny aspekt niniejszego wynalazku dotyczy kompozycji immunologicznej albo formulacji szczepionki, która po wprowadzeniu do ssaka będącego gospodarzem (korzystnie człowieka) wywołuje odpowiedź odpornościową w tego ssaka wobec polipeptydu LbpB, która to kompozycja obejmuje gen LbpB, albo polipeptyd LbpB, albo fragmenty niosące epitopy, analogi, cząstki zewnątrzbłonowe, albo komórki (atenuowane albo inne). Korzystnie formulacja szczepionki może również zawierać odpowiedni nośnik. Kompozycja szczepionki LbpB jest korzystnie podawana doustnie albo pozajelitowo (w tym zastrzyki podskórne, domięśniowe, dożylne, śródskórne). Formulacje korzystne do podawania pozajelitowego obejmują wodne i niewodne sterylne roztwory do wstrzyknięć, które mogą zawierać przeciwutleniacze, bufory, środki bakteriostatyczne i substancje rozpuszczalne utrzymujące izotoniczność wobec krwi biorcy, wodne i niewodne sterylne zawiesiny, które mogą zawierać czynniki zawieszające albo czynniki zagęszczające. Formulacje mogą występować w pojemnikach zawierających pojedynczą dawkę, albo wiele dawek, na przykład zatopione ampułki i probówki i mogą być przechowywane w jako liofilizaty wymagające jedynie dodania sterylnego płynnego nośnika bezpośrednio przed użyciem. Formulacje szczepionki mogą również zawierać układ adjuwanta nasilający immunogenność formulacji, taki jak układ olej w wodzie i inne układu znane w stanie techniki. Dawkowanie będzie zależeć od swoistej aktywności szczepionki i może zostać łatwo określone przez standardowe doświadczenia.
Jeszcze inny aspekt dotyczy formulacji odpornościowo/szczepionkowej, która obejmuje polinukleotyd według wynalazku, takie techniki są znane w stanie techniki, patrz na przykład Wolff i in., Science, (1990) 247:1465-8.
Testy przesiewowe
Polipeptyd LbpB według niniejszego wynalazku można wykorzystać do procesu przesiewania związków, które antagonizują (antagoniści, albo inaczej inhibitory) polipeptydu LbpB według niniejszego wynalazku. Tak więc, polipeptydy według wynalazku można również wykorzystać do identyfikacji antagonistów w, na przykład komórkach, preparatach bezkomórkowych, bibliotekach chemicznych i naturalnie wytworzonych mieszaninach. Antagoniści ci mogą być naturalnymi, albo zmodyfikowanymi substratami, ligandami, receptorami, enzymami itp., jako przykład może być polipeptyd według niniejszego wynalazku; albo mogą nimi być strukturalne albo czynnościowe mimetyki polipeptydu według niniejszego wynalazku. Patrz Coligan i in., Current Protocols in Immunology 1(2): Rozdział 5 (1991).
Polipeptydy LbpBsa odpowiedzialne za wiele funkcji biologicznych, w tym wiele patologicznych. Zgodnie z tym, pożądane jest znalezienie związków i leków mogących hamować czynności polipeptydu LbpB. Ogólnie, antagoniści mogą być wykorzystani w różnorodnych leczniczych i terapeutycznych celach w takich stanach jak rzeżączka.
Ogólnie, takie procedury przesiewowe mogą obejmować zastosowanie odpowiednich komórek, które wyrażają polipeptyd LbpB albo odpowiadają polipeptydowi LbpB według wynalazku. Takie komórki obejmują komórki ssaka, drożdży, Drosophila albo E. coli. Komórki, które wyrażają polipeptyd LbpB są następnie kontaktowane ze związkiem testowym w celu obserwacji wiązania, albo zahamowania odpowiedzi czynnościowej. Zdolność komórek, które są kontaktowane z ewentualnymi związkami jest porównywana z takimi samymi komórkami, które nie zostały skontakowane z LbpB.
Testy mogą być po prostu testami wiązania ewentualnych związków, w których przyleganie do komórek niosących polipeptyd LbpB jest wykrywane przez znakowanie pośrednie albo bezpośrednie związane z ewentualnym związkiem albo w teście obejmującym współzawodnictwo ze znakowaną substancją współzawodniczącą.
Następnie, testy mogą po prostu obejmować etapy mieszania ewentualnego związku z roztworem zawierającym polipeptyd LbpB w celu stworzenia mieszaniny, pomiaru aktywności LbpB w mieszaninie i porównania aktywności LbpB w mieszaninie w porównaniu ze standardem.
cDNA LbpB, białko i przeciwciała przeciwko białku również można zastosować do zbudowania testów do wykrywania efektu dodawania związków na wytwarzanie mRNA LbpB i białka w komórkach. Na przykład, ELISA wykorzystujące przeciwciała monoklonalne i poliklonalne można zaprojektować do mierzenia wydzielanych albo związanych z komórką poziomów białka LbpB standardowymi sposobami znanymi w stanie techniki, i można to wykorzystać do wykrycia czynników, które mogą hamować wytwarzanie LbpB (zwanego również antogonistą) w odpowiednio przetworzonych komórkach albo tkankach.
Przykłady potencjalnych antagonistów polipeptydu LbpB obejmują przeciwciała, albo w niektórych przypadkach, oligonukleotydy albo białka, które są blisko związane z ligandami, albo substratami polipeptydu LbpB, tj. fragment ligandów albo substratów; albo małe cząstki, które wiążą się z polipepPL 194 800 B1 tydem według niniejszego wynalazku, lecz nie wywołują odpowiedzi, tak wiec aktywność polipeptydu jest zahamowana.
Tak więc w innym aspekcie niniejszy wynalazek dotyczy zestawu do przesiewania do identyfikacji antagonistów, ligandów, albo substratów dla LbpB, które obejmują:
(a) polipeptyd LbpB, korzystnie polipeptyd o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10;
(b) rekombinowaną komórkę wyrażającą polipeptyd LbpB, korzystnie polipeptyd o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10;
(c) błonę komórkową wyrażającą pollpeptyd LbpB, korzystnie pollpeptyd o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 albo 10;
(d) przeciwciało przeciwko LbpB, przeciwko pollpeptydowi o Id. Sekw.
nr 2, 4, 6, 8 albo 10.
Będzie korzystnie, gdy w każdy z tych zestawów (a), (b), (c), albo (d) będzie mógł zawierać istotny składnik.
Formulacja i podawanie
Peptydy, takie jak rozpuszczalna postać polipeptydów LbpB i peptydy antagoniści albo małe cząstki można formułować w połączeniu z odpowiednim nośnikiem farmaceutycznym. Takie formulacje obejmują terapeutycznie skuteczną ilość polipeptydu albo związku, i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik albo zaróbkę. Nośniki takie obejmują, lecz nie są ograniczone do soli fizjologicznej, buforowanej soli fizjologicznej, dekstrosy, wody, glicerolu, etanolu i ich kombinacii. Formulacja powinna odpowidać sposobowi podawania i być dobrze znana w stanie techniki. Wynalazek dotyczy następnie opakowań i zestawów farmaceutycznych obejmujących jeden lub więcej pojemników napełnionych jednym albo więcej składnikami wcześniejszych kompozycji według wynalazku.
Polipeptydy i inne związki według niniejszego wynalazku mogą wykorzystywać jedynie jeden związek albo być w połączeniu z innymi związkami, takimi jak związki terapeutyczne.
Korzystne postaci do podawania układowego kompozycji farmaceutycznych obejmują wstrzyknięcia, typowo wstrzyknięcia dożylne. Mogą być stosowanie inne drogi wstrzykiwania takie jak podskórna, domięśniowa albo dootrzewnowa. Alternatywne sposoby podawania układowego obejmują podawanie przez błony śluzowe i podawanie przezskórnie wykorzystujące środki penetrujące takie jak sole żółciowe albo kwasy fusydowe albo inne detergenty. Dodatkowo, jeśli są poddane prawidłowej formulacji w postaci do podawania dojelitowego albo w postaci kapsułek możliwe jest podawanie doustne. Związki te można podawać domiejscowo, albo lokalnie w postaci maści, past, żeli i podobnych.
Zakres wymaganego dawkowania zależy od wybranego peptydu, drogi podawania, rodzaju formulacji, stanu osobnika i osądu lekarza prowadzącego. Jednakże, odpowiednie dawkowanie waha się w granicach 0,1-100 pg/kg. Jednakże, oczekuje się dużej zmienności potrzebnego dawkowania ze względu na różnorodność dostępnych związków i różniące się skutecznością drogi podawania. Na przykład, podawanie doustne będzie wymagało wyższych dawek, niż podawanie przez wstrzyknięcia dożylne. Zmienności w poziomach dawkowania można dopasować wykorzystując standardowe, empiryczne sposoby optymalizacji, dobrze znane w stanie techniki.
Przykłady
Poniższe przykłady przeprowadzono stosując techniki standardowe, które są rutynowe i znane specjalistom, o ile nie zaznaczono inaczej. Przykłady ilustrują wynalazek nie ograniczając go.
P r z y k ł a d 1: Szczepy bakteryjne i warunki wzrostu
Szczepy bakteryjne wymieniono w Tabeli 1. Meningokoki hodowano przez noc na płytkach z agarem GC (Difco), z dodatkiem Vitox (Oxoid) w nawilżanej atmosferze 5% CO2 w 37°C. Optymalną ekspresję białek regulujących żelazo osiąga się przez dodanie 5 pg/ml chelatora żelaza, kwasu etylenodiamino di-o-hydroksyfenylooctowego (EDDA, Sigma). W celu preparowania próbek do SDS-PAGE, badania immunologicznego i izolowania chromosomalnego DNA, komórki hodowano w opisany wcześniej sposób (Pettersson i in., 1993).
Szczep Y1090 E. coli (Young i Davies, 1983) który zastosowano do namnożenia faga Xgt11, hodowano na podłożu Luria-Bertoldi (LB) z dodatkiem ampicyliny (100 pg/ml), 0,2% maltozy i 10 mM MgCl2. Szczep DH5a, zastosowany do klonowania, hodowano w pożywce LB z dodatkiem 100 pl/ml ampicyliny, 25 pg/ml kanamycyny albo 100 pg/ml erytromycyny, kiedy konieczna była selekcja rekombinantów. Po transformacji pochodnymi pEMBL19, komórki wysiano na płytki LB z dodatkiem odpowiedniego antybiotyku i 5-bromo-4-chloro-3-indolo-b-D-galktozydu (40 (pg/ml) i 0,5 mM izopropylo-b-D-tiogalaktopiranozydu w celu poszukiwania plazmidu ze wstawką. Szczep PC2494, zastosowany do
PL 194 800 B1 wytworzenia jednoniciowego DNA trzymano na płytkach z minimalną pożywką, z dodatkiem 5 pg/ml tiaminy i 0,2% glukozy.
P rz y k ła d 2A: Wytwarzanie mysiej surowicy odpornościowej przeciwko peptydom
Peptydy (Fig. 2) syntetyzowano stosując automatyczny syntezator peptydów i sprzęgano z anatoksyną tężcową, jak opisano (van der Ley i in., 1991). Myszy Balb/c immunizowano 50 pg peptydu
20 pg Quil A jako adiuwant. Podawano dwie dawki przypominające. Surowicę zbierano 54 dni po pierwszym wstrzyknięciu.
2B: Identyfikacja produktu genu IbpB
W celu badania czy domniemany gen IbpB koduje białko, wywołano surowice odpornościowe przeciwko syntetycznym peptydom (oznaczone A1-E1 na Fig. 3), które oparte były na wywnioskowanej sekwencji aminokwasowej częściowej ramki odczytu. Surowice badano met. Western blot, wobec całych komórek szczepu BNCV hodowanych w warunkach ograniczonej dostępności żelaza. Surowice przeciwko peptydowi B1 nie wykazywały żadnej reakcji (dane nie pokazane). Surowice przeciwko innym peptydom reagowały z prążkiem wielkości około 95 kDa (Fig. 1). Ponieważ ten prążek nie występował u mutanta IbpB (skonstruowanego, jak to opisano niżej) (Fig. 1, ścieżki 3 i 7), wywnioskowano, że gen IbpB ulega ekspresji w szczepie typu dzikiego, oraz, że koduje białko o ciężarze cząsteczkowym (Mr) 95000. Niektóre z surowic przeciwko peptydom D1 i E1 wykazywały dodatkowo reakcję z prążkiem o Mr 60000 (Fig. 1). Oba te peptydy zawierały sekwencję VVFGAK, która również występowała w TbpB (Fig. 3). Stąd, prążek 68 kDa mógł być TbpB. W celu zbadania tej możliwości, badano met. Western blot mutanta TbpB, N91, oraz szczep rodzicielski B16B6. Surowica 19-1 (przeciwko E1) reagowała z dwoma prążkami 95 kDa i 68 kDa w szczepie B16B6, ale tylko z prążkiem 95 kDa w szczepie N91. Wynik ten wskazuje, że prążek 68 kDa jest rzeczywiście TbpB (dane nie pokazane).
P rz y k ła d 3: SDS-PAGE i badanie immunologiczne
SDS-PAGE białek całych komórek przeprowadzono jak to opisano uprzednio (Pettersson i in., 1990, 1993). W doświadczeniach, w których chciano zapobiec denaturacji LbpB wprowadzono następującą modyfikację. Bufor do próbek nie zawierał b-merkaptoetanolu. Kompleksy błony zewnętrznej nie podgrzewano w 95°C w buforze do próbek przed elektroforezą, ale inkubowano na lodzie albo w 37°C przez 10 minut. W doświadczeniu nad wiązaniem laktoferryny, żel poliakryloamidowy zawierał 5% (wag./obj.) żelu zwykłego i 8% (wag./obj.) żelu zawierającego 0,05% SDS. Bufor elektrod zawierał tylko 0,05% zamiast 0,1% SDS. Elektroforezę przeprowadzono przy stałym napięciu 100 V przez godziny w 4°C. Zastosowano standardowy bufor do próbek z 2% SDS.
Elektoroforezę białek błony zewnętrznej w celu wykrywania pofałdowanych postaci LbpB przeprowadzono na układzie PhastSystem (Pharmacia) według instrukcji producenta, stosując 7,5% (wag./obj.) homogennych żelów poliakryloamidowych z paskami bufora SDS.
Badanie immunologiczne przeprowadzono jak to opisano uprzednio (Pattersson i in., 1990, 1993). W przypadku żelów PhastSystem, bufor zawierał 0,05% SDS), zaś aktywność peroksydazy wykrywano przy użyciu układu ECL według instrukcji producenta (Amersham). Mysie surowice odpornościowe zastosowano w rozcieńczeniu 1:500. Przeciwciała monoklonalne przeciwko LbpA, mn98K1 i mn98K2 (Pattersson i in., 1993) zastosowano jako mieszaninę w rozcieńczeniu 1:2000 każdego.
P rz y k ła d 4:
4A: Strategie klonowania i sekwencjonowania
Biblioteka genowa Xgt11 ze szczepu BNCV została udostępniona przez E.C. Gotschlicht (The Rockefeller University, New York, USA). Bibliotekę namnożono w szczepie Y1090 E. coli i badano przesiewowo sondami DNA BE1 i AP6 (Fig. 2). BE1 wytworzono przez wyizolowanie fragmentu BitEII-EcoRI wielkości 355 bp z plazmidu pAM1 (Pettersson i in., 1993). AP6 była fragmentem EcoRIEcoRV wielkości 417 bp wyizolowanym z plazmidu pAM6. Znakowanie sondy, badanie łysinek i wykrywanie przeprowadzono, jak to opisano (Pettersson i in., 1993), stosując zestaw DIG DNA Labelling and Detection kit (Boehringer Mannheim). λ DNA wyizolowano (Sambrook i in., 1989), po czym wstawkę klonowano do fagemidu pEMBL19. Plazmidowy DNA wyizolowano na minikolumnach Jetstar (Genomed) według instrukcji producenta. Jednołańcuchowy DNA namnożono stosując faga pomocniczego VCSM13 (Stratagene).
Chromosomalny DNA izolowano jak to opisano (ausubel i in., 1989). DNA trawiono AccI i Dral i rozdzielono na 1% żelu agarozowym. Badanie metodą Southern'a przeprowadzono, jak opisano wcześniej (Pettersson i in., 1993). Sondę ES1 (Fig. 2) wytworzono przez wyizolowanie z pAM13 fragmentu EcoRI-Sall wielkości 320 bp i znakowano jak wyżej. Sondę poddano reakcji z fragmentem chromosomalnego DNA trawionego AccI/Dral, wielkości 1,5 kb w badaniu met. Southern'a. Fragmenty
PL 194 800 B1
1,5 kb wy izolowano z żelu i poddano ligacji w pEMBL19. Mieszaninę ligacyjną amplifikowano przez
PCR z uniwersalnym, starterem M13 (Pharmacia) i starterem LB11 (Tabela 2). Polimerazę Goldstar, pochodną polimerazy Taq (Eurogentec) zastosowano do amplifikacji PCR, według instrukcji producenta. Produkt PCR wielkości 1,3 kb oczyszczono z żelu agarozowego.
Sekwencjonowanie DNA przeprowadzono ręcznie stosując mieszaninę sekwencjonującą deaza-G/A T7 (Pharmacia) albo automatycznie stosując ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Perkin Elmer). Do automatycznego sekwencjonowania, znakowanie przeprowadzono stosując zestaw Dye Terminator Cycle Seguencing kit (Perkin Elmer). Startery wewnętrzne (syntetyzowane przez Pharmacia albo Gibco-BRL) oraz startery uniwersalne M13 i startery wsteczne (Pharmacia) zastosowano do sekwencjonowania jednoniciowych DNA, dwuniciowych plazmidowych DNA albo produktu PCR.
Podobne strategie zastosowano do sekwencjonowania genu IbpB ze szczepów H44/76 i M981 N. meningitidis.
4B: Klonowanie i sekwencjonowanie genu IbpB
W celu klonowania brakującej części geny IbpB, bibliotekę genową Xgt11 szczepu BNCV przeszukiwano sondami DNA. Stwierdzono obecność dwóch różnych klonów lambda. Wstawki klonowano do pEMBL19, otrzymując plazmidy pAM6 i pAM13 (Fig. 2) i sekwencjonowano. W ten sposób nie stwierdzono promotora i początku genu IbpB. Kilka innych prób klonowania końca 5' genu zawiodło, co wskazuje, że ekspresja jest toksyczna dla E. coli. W celu uzyskania reszty sekwencji, wytworzony wzbogacony bank chromosomalnego DNA trawionego AccI i Dral. Fragmenty chromosomalnego DNA wielkości około 1,5 kb poddano ligacji z pEMBL19 i przeprowadzono amplifikację PCR bezpośrednio na mieszaninie ligacyjnej, stosując starter (LB11, Fig. 2) oparty na znanej części sekwencji IbpB i starter M13. Powstały produkt PCR (Fig. 2) zastosowano bezpośrednio do sekwencjonowania. Strategia ta pozwalała uniknąć klonowania prawdopodobnie toksycznego dla E. coli genu.
Sekwencjonowanie różnych fragmentów IbpB ujawniło otwartą ramkę odczytu długości 2175 bp. Kodowała ona białko długości 725 aminokwasów (Fig. 3) o ciężarze cząsteczkowym około 79,4 kDa. Analiza sekwencji końca N wykazała charakterystykę sekwencji sygnałowej rozpoznawanej przez peptydazę sygnałową II (von Heijne, 1989). Takie sekwencje sygnałowe występują u prekursorów lipoprotein, które są acylowane na reszcie cysteinowej końca N dojrzałego białka. Podobną sekwencję sygnałową stwierdzono w białku TbpB, które w rzeczywistości było modyfikowane lipidem (Anderson i in., 1994). Dojrzałe białko LbpB ma określony ciężar cząsteczkowy 77,5 kDa, który jest istotnie niższy niż obserwowany w SDS-PAGE ciężar cząsteczkowy 95 kDa, obserwowany podczas elektroforezy na żelu poliakryloamidowym z SDS (SDS-PAGE) (Fig. 1). Badanie przesiewowe bazy danej SwissProt w kierunku podobnych wykazało homologię z TbpB Neisseriae i Actinobacillus pleuropneumoniae. Najwyższą homologię, 33% identyczności (przy użyciu programu PALIGN), stwierdzono dla TbpB N. meningitidis szczepu B16B6 (Legrain i in., 1993) (Fig. 3). W białku TbpB, stwierdzono nieco powtórzeń wewnętrznych i zaproponowano, że cząsteczka ma strukturę dwu-płatową, która wyewoluowała po wewnętrznym podwojeniu (Fuller i in., 1996; Renaud-Mongenie i in., 1996). Gdy 354 aminokwasy końca N dojrzałego LbpB przyrównano z 353 aminokwasami końca C, stwierdzono 30% identyczność i 10% podobieństwo (dane nie pokazane). Wynik ten wskazuje, że LbpB może występować w strukturze dwu-płatowej. Punkt izoelektryczny białka wynosił 4,5. W sekwencji można wyróżnić dwa długie ciągi, bogate w reszty kwasowe (Fig. 3). Ponieważ ciągów tych nie ma w TbpB, mogą być one istotne do wiązania laktoferryny, która, w przeciwieństwie do transferryny jest cząsteczką naładowaną dodatnio.
W obszarze promotora, można wyróżnić typową sekwencję Shine-Delgarno. Oprócz tego, znaleziono dwie domniemane kasety -10 i -35 (Fig. 4). Sekwencja przypominająca miejsce wiązania Fur nakłada się na kasetę -10. Fur działa, w połączeniu z Fe2+, jako represor genów regulowanych żelazem, przez wiązanie z sekwencją 19 bp w regionie promotora (Bagg i Neilands, 1987). Sekwencja zgodności tej kasety Fur na postać:
GATAATGATAATCATTATC, zaś 16 z 19 bp tej sekwencji jest zakonserwowane w tym elemencie w promotorze IbpB. Dalej powyżej promotora, stwierdzono bezpośrednie powtórzenie 131 bp (dane nie pokazane. Sekwencja ta występuje przynajmniej dwukrotnie w tym położeniu, to samo powtórzenie stwierdzono poniżej genu IbpA (Prinz i in., obserwacja niepublikowana). Badanie homologii FASTA wykazało homologie tego powtórzenia z wieloma sekwencjami neisseria, w większości flankującymi ramki odczytu (dane nie pokazane).
Homologia sekwencji pomiędzy białkami LbpB szczepów BNCV i M981 N. meningitidis oraz pomiędzy białkami LbpB szczepów BNCV i H44/76 N. meningitidis wynosiła, odpowiednio, 72,7% i 78,5%.
PL 194 800 B1
P r z y k ł a d 5:
5A: Konstruowanie mutantów izogenicznych
Plazmidy pAM23 i pAM6 zastosowano do insercyjnej aktywacji, odpowiednio, IbpA i IbpB. Kasetę oporności na erytromycynę (Erm') z pER2 (Jennings i in., 1993) wycięto CIaI i HindlII. Fragment traktowano polimerazą DNA T4 i poddano ligacji z pAM23 trawionym EcoRV, otrzymując plazmid pAM23E. Kasetę oporności na kanamycynę (Km') z pUC4K (Pharmacia) wycięto HincII. Plazmid pAM6 linearyzowano BglII i traktowano polimerazą DNA T4. Kasetę Km' poddano ligacji w to miejsce, otrzymując plazmid pAM6K. Łącznik, zbudowany z oligonukleotydów nus1 i nus2 (Tabela 2), który zawierał sekwencję wychwytującą z neisseria (GCCGTCTGAA) i jednoniciowe ciągi zgodne z Kpnl, klonowano w miejsce KpnI pAM6K, otrzymując plazmid pAM6K-nus. Geny oporności na antybiotyki znajdowały się w tym samym kierunku co geny IbpA i IbpB w plazmidach, odpowiednio, pAM23E i pAM6K (-nus). Plazmid pAM23E, linearyzowany KpnI zastosowano do transformacji szczepu H44/76, jak to opisano wcześniej (van der Ley i Poolman, 1992). Transformanty selekcjonowano na płytkach GC zawierających 5 pg erytromycyny na ml. Prawidłowe zastąpienie genu w jednym z transformantów, oznaczonym CE1449, potwierdzono przez PCR stosując startery FW5 i DYAS2 (Tabela 2) oraz analizą metodą Southern'a stosując sondę AP23 (Fig. 2; izolowany jako fragment SspI-Hindlll 148 bp z pAM23). Do badania Southern'a, chromosomalny DNA trawiono ClaI i SalI. Izogeniczne mutanty w szczepie BNCV wytworzono przez elektroporację (Genco i in., 1991) ponieważ ten szczep okazał się nie ulegać transformacji. Chromosomalny DNA z mutanta CE1449 IbpA zastosowano do wytworzenia mutanta IbpA. Transformanty selekcjonowano na płytkach GC z erytromycyną i potwierdzano, jak wspomniano wyżej. Plazmid pAM6K-nus zastosowano do wytworzenia mutanta IbpB. Transformanty selekcjonowano na płytkach GC zawierających 100 pg/ml kanamycyny. Prawidłowe zastąpienie genu potwierdzono przez PCR, stosując startery SDA1 i PR1 (Tabela 2), oraz badaniem Southern^ stosując sondę AP23.
5B: Konstruowanie mutantów izogenicznych
W celu potwierdzenia identyczności białka 94 kDa oraz zbadania roli poszczególnych białek wiążących laktoferrynę w wiązaniu i utylizacji laktoferryny, skonstruowano zestaw izogenicznych pochodnych BNCV pozbawionych LbpA albo LbpB, jak to opisano w Przykładzie 5A. Prawidłowe zastąpienie genu potwierdzono przez PCR i badanie Southern'a (dane nie pokazane). Ekspresję LbpA i LbpB w tych mutantach sprawdzono met. Western blot (Fig. 5). Mutant IbpA CE1452, nie wyrażał LbpA (Fig. 5A, ścieżka 4), zaś mutant IbpB CE1454 nie wyrażał białka 94 kDa (Fig. 5B, ścieżka 6). Te wyniki potwierdzają, że gen IbpB jest rzeczywiście wyrażany przez szczepy typu dzikiego, oraz że koduje on białko o Mr 94000, co wynosi znacznie więcej niż obliczony ciężar cząsteczkowy 77,5 kDa. Ponadto, wyniki z Fig. 4 pokazują, że inaktywacji IbpB nie wywiera efektu polaryzującego na ekspresję LbpA (Fig. 5A, ścieżka 6). Oczekiwano tego, ponieważ kaseta oporności na kanamycynę, którą wprowadzono do IbpB nie zawierała terminatora transkrypcji. Uprzednio opisany spontaniczny mutant IbpA CE 1402 (Pattersson i in., 1994b) pozbawiony był również ekspresji LbpB (Fig. 5B, ścieżka 8). Ponieważ zarówno mutant, jak i BNCV są pochodnymi szczepu M986, jego genetyczne podłoże jest takie same jak innych mutantów. Ekspresja LbpA i LbpB wydaje się być regulowana żelazem (Fig. 5). Słaba ekspresja LbpA obserwowana była w szczepie CE1454, nawet, gdy komórki hodowano bez chelatora żelaza (Fig. 5A, ścieżka 5). Ekspresja ta spowodowana jest prawdopodobnie transkrypcją z promotora genu oporności na kanamycynę w IbpB. Jednakże, również w tym przypadku ekspresja LbpA wzrosła kilkakrotnie, gdy szczep hodowano w obecności chelatora żelaza (Fig 5A, ścieżka 6).
P r z y k ł a d 6:
6A: Test wiązania laktoferryny
Wiązanie laktoferryny z całą komórką badano w teście typu ELISA. Rekombinowana ludzka laktoferryna, wytworzona w Aspergillus avamori została udostępniona przez Agennix Inc., Houston, Texas, USA. Laktoferrynę nasycono żelazem, jak to opisano (van Berkel i in., 1995) z następującymi modyfikacjami. Zamiast Fe(NO3)3 zastosowano FeCh, zaś dializę przeprowadzono wobec 5 mM bufora Na2HPO4/NaH2PO4 pH 7,7, przez 4 godziny. Kolonie z płytki zawieszono w roztworze soli buforowanym Tris, pH 7,5 (TBS) i zabito przez podgrzanie przez 30 minut w 56°C. Próbki (100 pl) o gęstości optycznej przy 620 nm, wynoszące 0,05 rozdzielono do studzienek płytki do mikromiareczkowania. Próbki pozostawiono do wyschnięcia przez noc w 37°C. Test przeprowadzono w 37°C. Wiązanie nieswoiste zablokowano 100 pl roztworu blokującego, zawierającego 0,5% Protifar (Nutricia) i 0,1% Tween 20 w TBS przez godzinę. Po zablokowaniu, studzienki wypełniono różnymi stężeniami laktoferryny w roztworze blokującym. Stężenie laktoferryny w studzienkach wahało się od 3,125 do 200 ng. Po
PL 194 800 B1 inkubacji przez godzinę w trzech płukaniach pod wodą bieżącą, dodano do studzienek kompleks peroksydazy sprzęgniętej z króliczą surowicą odpornościową przeciwko ludzkiej laktoferrynie (ICN Biochemicals). Przeciwciało zastosowano w rozcieńczeniu 1:5000 w buforze blokującym. Po inkubacji przez godzinę i trzech płukaniach pod wodą bieżącą, dodano peroksydazę (Abdillahi i Poolman, 1987).
Wiązanie laktoferryny z membraną przeprowadzono w następujący sposób. Nieswoiste wiązanie zablokowano przez inkubowanie membrany w 0,2 M buforze Na2HPO4ZNaH2PO4 pH 5,7, zawierającym 0,1% Tweed 20 i 0,5% Protifar (Nutricia) przez 2 godziny. Membranę inkubowano z 1,2 pgZml laktoferryny ludzkiej sprzęgniętej z peroksydazą (Pettersson i in., 1993) w buforze blokującym przez godzinę i płukano trzykrotnie buforem blokującym. Aktywność peroksydazy wykrywano w układzie ECL według instrukcji producenta (Amersham).
6B: Test żywienia na płytkach
Meningokoki hodowano przez noc w TSB z dodatkiem Vitox, jak to opisano w Przykładzie 1. Po całonocnej hodowli, 300 pl zawieszono w 3 ml górnego agaru (1% agar GC z 20 pg EDDA na ml, schłodzone do 42°C) i natychmiast wylano na płytki agarowe z dodatkiem Vitox i 20 pg ml EDDA. Krople (10 pl) rekombinowanej ludzkiej laktoferryny (11 % nasycenia żelazem, albo nasyconej jak opisano wyżej) nakroplono na płytkę. Stężenie laktoferryny w kroplach wynosiło, odpowiednio, 10 i 20 mgZml. Płytki hodowano przez noc.
6C: Wiązanie laktoferryny z fałdowanym LbpB na membranie
W celu zbadania, czy laktoferryna może wiązać LbpB poszukiwano warunków w których LbpB nie uległaby denaturacji (patrz, Przykład 6A). Gdy próbki podgrzano w buforze do próbek przed elektroforezą, można było zaobserwować szybsze poruszanie się postaci LbpB białka, prawdopodobnie stanowiącego natywne, pofałdowane białka (Fig. 6A). Postać ta ma ciężar cząsteczkowy około 80 kDa. Po podgrzaniu przez 10 minut w 95°C białko LbpB jest całkowicie denaturowane i migruje jako 94 kDa (Fig. 6A, ścieżka 2). Co ciekawe, jedynie surowica przeciwko peptydowi A1 (Fig. 2) reagowała z szybciej migrującą postacią białka. Peptyd ten zawierał jeden z dwóch ciągów, bogatych w ujemnie naładowane aminokwasy i prawdopodobnie związany jest z wiązaniem laktoferryny. Wiązanie przeciwciał i z pofałdowanym białkiem sugeruje, że ta część białka jest eksponowana, podczas gdy wszystkie inne epitopy peptydu są schowane w pofałdowanej strukturze LbpB.
Następnie oceniano wiązanie laktoferryny z pofałdowanym białkiem LbpB. Białka błony zewnętrznej szczepy BNCV naniesiono na membranę nitrocelulozową i inkubowano z ludzką laktoferryną sprzęgniętą z peroksydazą. Swoistość wiązania laktoferryny okazała się niezwykle wrażliwa na warunki inkubacji, z czego najistotniejsze było pH. W optymalnych warunkach laktoferryna wiązała się swoiście z prążkiem białka o Mr 80 kDa (Fig. 6B, ścieżki 1 i 2). Nie obserwowano wiązania kiedy próbki podgrzano do 95°C przez 10 minut przed SDS-PAGE (Fig. 6B, ścieżka 3). Prążek nie był wykrywany w próbkach mutanta IbpB CE1454 (dane nie pokazane). Stąd, wywnioskowano, że szybsza migracja postaci białka LbpB, prawdopodobnie stanowi pofałdowaną postać białka, jest zdolna do wiązania laktoferryny.
6D: Wiązanie i utylizacja laktoferryny w całych komórkach
Wiązanie laktoferryny z całymi komórkami badano testem typu ELISA. Płytki ELISA pokryto całymi komórkami szczepu BNCV mutantów izogenicznych, i dodano do studzienek laktoferrynę w różnych stężeniach. Wiązanie laktoferryny z komórkami sondowano przeciwciałem przeciwko ludzkiej laktoferrynie sprzęgniętej z peroksydazą (Fig. 7). Mutant IbpB miał nieco zmniejszoną zdolność wiązania laktoferryny. Mutant IbpA wiązał laktoferrynę jeszcze słabiej, podczas gdy podwójny mutant praktycznie nie wiązał laktoferryny (Fig. 7).
Zdolność do zastosowania laktoferryny jako jedynego źródła żelaza badano w teście płytkowym. Meningokoki hodowano w warunkach ograniczenia żelaza na płytkach, krople rekombinowanej ludzkiej laktoferryny nakraplano na płytki i śledzono pobudzenie wzrostu. Mutant IbpB był zdolny do wzrostu na laktoferrynie, podczas gdy mutant IbpA nie był zdolny (Fig. 8).
Laktoferryna była nasycona żelazem w 11%. Ten sam eksperyment przeprowadzono z laktoferryną nasyconą żelazem zasadniczo z tym samym wynikiem, (dane nie pokazane). Dane te wskazują, że białko LbpB jest konieczne dla wychwytu żelaza przez laktoferrynę podczas gdy samo LbpB nie wydaje się być niezbędne.
P r z y k ł a d 7:
Badanie zmienności białka LbpB meningokoków, sekwencjonowanie genów IbpB od dalszych czterech szczepów: H44Z76, M990, M981,881607 (patrz, Tabela 1).
7A: Sekwencjonowanie IbpB z czterech szczepów meningokoków - Metody
PL 194 800 B1
Bakterie hodowano w sposób opisany w Przykładzie 1. Chromosomalny DNA wyizolowano z bakterii rosnących na płytce. Po całonocnej hodowli, bakterie zdrapano z płytek i zawieszono w 1,5 ml bufora 10 mM Tris HCl, 10 mM EDTA, pH 8 i 10 μΙ lizozymu (10 mg/ml). Zawiesinę inkubowano przez. 15 minut w temperaturze pokojowej, po czym dodano 1,5 ml 2% Triton X-100, 50 mM Tris HCl, 10 mM EDTA, pH 8. Po 15 minutach inkubacji, dodano 10 μl proteinazy K (10 mg/ml). Probówki inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Mieszaninę ekstrahowano mieszaniną fenolu, chloroformu i alkoholu izoamylowego (w stosunku 24:24:1), a następnie chloroformem nasyconym wodą. Chromosomalny DNA precypitowano etanolem.
Chromosomalny DNA zastosowano do amplifikacji genu IbpB przez PCR. Startery LB20 i REV2 (Tabela 3) zastosowano wobec szczepów H44/76, M990 i 881607. Startery LB20 i LB23 zastosowano wobec szczepu M981. Startery oparte były na sekwencji IbpB ze szczepu BNCV. LB20 wiązał się powyżej genu IbpB, zaś LD23 i Rev2 na początku genu IbpA. LB23 miał dodatkowe miejsce BamHI na końcu 5'. Do amplifikacji PCR zastosowano polimerazę Goldstar, pochodną polimerazy Taq (Eurogentec) według instrukcji producenta. Temperatura przyłączania we wszystkich przypadkach wynosiła 50°C i przeprowadzano po 30 cykli. Produkty PCR oczyszczano z żelu agarozowego stosując b-agarazę (New England Biolabs) według instrukcji producenta.
Sekwencjonowanie DNA przeprowadzono metodą „gene walking stosując startery zaprojektowane dla genów IbpB. Startery syntetyzowano w Gibco BRL. Sekwencjonowanie przeprowadzono automatycznie na urządzeniu ABI Prism 310 Genetic Analyser (Perkin Elmer). Znakowanie przeprowadzono stosując zestaw Dye Terminator Cycle Sequencing kit (Perkin Elmer).
Do translacji sekwencji nukleotydowej na sekwencję aminokwasową zastosowano programy TRANSL, PALIGN i CLUSTAL z pakietu oprogramowania PC Gene 6.70.
7B: Sekwencjonowanie IbpB z dalszych szczepów meningokoków - Wyniki
Sekwencje nukleotydowe genów IbpB czterech szczepów pokazano jako Id. Sekw. nr 3, 5, 7 i 9. Sekwencje nukleotydowe poddano translacji na sekwencję aminokwasową, zaś przyrównanie pięciu znanych sekwencji białek LbpB przedstawiono na Fig. 9. Na poziomie aminokwasowym, identyczność pomiędzy białkami LbpB różnych szczepów wynosiła 70-80%. Porównanie parami przedstawiono w Tabeli 4.
P r z y k ł a d 8:
Poziom ekspresji LbpB w N. meningitidis jest bardo niski; białka nie można wykryć podczas analizy białek błony zewnętrznej metodą SDS-PAGE. Do badań immunologicznych i strukturalnofunkcjonalnych białka LbpB wytworzono konstrukt do ekspresji białka w E. coli. W celu ułatwienia oczyszczania rekombinowanego białka, białko zawierało znacznik His, zaś modyfikacji lipidem końca N zapobiegnięto przez zastąpienie natywnej sekwencji sygnałowej i pierwszych reszt aminokwasowych domeny dojrzałej.
8A: Ekspresja rekombinowanego LbpB - Szczepy bakteryjne i warunki wzrostu
Szczep meningokoków BNCV (-:2a:P.2) hodowano przez noc na płytkach z agarem GC (Difco) z dodatkiem Vitox (Oxoid) w nawilżanej atmosferze 5% CO2 w 37°C. Konstrukt kodujący rekombinowane białko LbpB wyrażono w szczepie E. coli CE1448 (udostępnionym przez C. Jansen), który jest pochodną htrA ompT szczepu CE1224 (Tommassen i in., 1983). Szczep hodowano w 37°C w syntetycznej pożywce buforowanej HEPES (Tomamassen i Lugtenberg, 1980) z dodatkiem substancji odżywczych koniecznych z powodu mutacji auksotroficznej i 1,32 mM K2HPO4 (warunki z fosforanami). Po całonocnej hodowli, hodowle rozcieńczono 1:13,5 w tej samej pożywce, ale bez K2HPO4 (warunek bez fosforanów) i hodowano przez 6 godzin w 37°C.
8B: Ekspresja rekombinowanego LbpB - klonowanie w E. coli
Chromosomalny DNA wyizolowano z komórek meningokoków hodowanych przez noc na płytkach. Bakterie zdrapano z płytek i zawieszono w 1,5 ml bufora 10 mM Tris HCl, 10 mM EDTA, pH 8 i 10 μl lizozymu (10 mg/ml). Zawiesinę inkubowano przez 15 minut w temperaturze pokojowej, po czym dodano 1,5 ml 2% Triton X-100, 50 mM Tris HCl, 10 mM EDTA, pH 8. Po 15 minutach inkubacji, dodano 10 μl proteinazy K (10 mg/ml). Probówki inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Mieszaninę ekstrahowano mieszaniną fenolu, chloroformu i alkoholu izoamylowego (w stosunku 24:24:1), a następnie chloroformem nasyconym wodą. Chromosomalny DNA precypitowano etanolem.
Chromosomalny DNA zastosowano jako matrycę do amplifikacji części genu IbpB, odpowiadającej dojrzałemu LbpB przez PCR stosując startery LB22 i LB23 (Tabela 5). Starter LB22 rozpoczynał reakcję w miejscu odpowiadającym części końca N LbpB i wprowadzał miejsce Pstl do produktu PCR. LB23 rozpoczynał reakcję tuż poniżej IbpB na początku genu IbpA i wprowadzał miejsce BamHI. PoPL 194 800 B1 limerazę Pwo (Boehringer Mannheim), enzym nie mylący się, zastosowano do reakcji PCRwip. Temperatura przyłączania wynosiła 60°C i przeprowadzano 30 cykli. Produkt PCR izolowano z żelu stosując β-agarazę (NEB) według instrukcji producenta. Produkt PCR trawiono Pstl i BamHI, po czym poddano ligacji do pJP29 (Fig. 10A), który również trawiono Pstl i BglII. W powstałym konstrukcie, pAM31, znikły miejsca BamHI i Bglll. Białko LbpB ulegało ekspresji w tym konstrukcie pod kontrolą promotora phoE i zawierało sekwencję sygnałową PhoE zamiast autentycznej sekwencji. Ponadto, pierwsze dwie reszty końca N zmieniono z, odpowiednio, Cys i Ile na Ala i Val. W celu ułatwienia oczyszczania białka pomiędzy sekwencję sygnałową i dojrzałą część LbpB wprowadzono znacznik His. pAM31 trawiono Pstl i poddano ligacji z łącznikiem obejmującym oligonukleotydy VGO12a i VGO13a (Tabela 5), otrzymując plazmid pAM32 (Fig. 10A). Miejsce Pstl stracono po pierwszej ligacji. Łącznik kodował sześć reszt His i miejsce cięcia czynnika Xa (Fig. 10B).
8C: Oczyszczanie rekombinowanego LbpB
Rekombinowane LbpB wytwarzanie w szczepie CE1448 zawierającym pAM32. Komórki ograniczane co do fosforanów z 5-litrowej hadowli płukano 500 ml soli fizjologicznej i zawieszono w 150 ml 10 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, pH 8,0. Zawiesinę zamrożono w -20°C na noc. Komórki odmrożono i dodano trzy tabletki mieszaniny inhibitorów proteaz (Complete™, Boehringer Mannheim). Komórki przepuszczono dwukrotnie przez prasę French'a pod ciśnieniem 8000 psi. Nie zniszczone komórki usunięto przez wirowanie na rotorze Sorvall GSA przy prędkości 5000 rpm przez 20 minut. Nadsącz odwirowano na rotorze Beckman T160 przy prędkości 40000 rpm przez 90 minut. Otoczki komórkowe rozpuszczono w 5 mM buforze Na2HPO4-NaH2PO4, pH 7,6.
Otoczki komórkowe ekstrachowano dwukrotnie 2% n-oktylooligo-oksyetylenem (Oktylo-POE) w 37°C. Pierwszą ekstrakcję prowadzono przez godzinę, zaś drugą przez 3 godziny, po czym nierozpuszczalne białka zwirowano na rotorze Beckman TLA100.2 przy prędkości 100000 rpm przez godzinę. Nadsącze zawierające białko LbpB połączono i dodano agarozę Ni-NTA. Oczyszczanie białek przeprowadzono partiami w natywnych warunkach, według instrukcji producenta (Qiagen). Stężenie imidazolu i NaCl wynosiło, odpowiednio, 20 mM i 300 mM, podczas wiązania i płukania. W sumie zastosowano 2 ml agarozy Ni-NTA, podzielone na 10 probówek. Elucję przeprowadzono etapowo przy użyciu 3 ml 100 mM, 200 mM i 250 mM imidazolu. Po elucji, białko dializowano dwukrotnie w woreczkach Spectra/Por 2 (Spectrum) wobec 2,5 l roztworu soli buforowanego fosforanem. Białko zatężono w urządzeniu Fugisept Maxi Centrifugal Concentrator (Intersept) o ciężarze odcięcia 10 kDa. Wirowanie przeprowadzono na rotorze Sorvall GSA przy prędkości 5000 rpm do objętości 1-1,5 ml.
Elektroforezę na żelu poliakryloamidowym (PAGE) przeprowadzono w sposób opisany przez Lugtenberg i in., (1975) z niewielkimi modyfikacjami. Żel poliakryloamidowy został skomponowany z 5% żelu stałego i 11% żelu rozpuszczalnego, nie zawierającego SDS. W celu zapobieżenia denaturacji LbpB próbka buforu nie zawierała b-merkaptoetanolu (Lugtenberg i in., 1975), i próbki trzymano w 0°C przed rozpoczęciem elektroforezy. W celu denaturacji LbpB bufor uzupełniono b-merkaptoetanolem, i próbki gotowano przez 5 min. Elektorforezę przeprowadzono w przy prądzie stałym 20 mAmp w temp. 4°C. Żel barwiono błękitem brylantowym Coomassie.
8D: Ekspresja i oczyszczanie rekombinowanego LbpB - Wyniki
Rekombinowaną postać LbpB N. meningitidis szczepu BNCV wyrażano w E. coli szczepu CE1448. Wytworzono konstrukt, pAM32, kodujący rekombinowane białko obejmujące sekwencję sygnałową PhoE, znacznik His i dojrzałe białko LbpB (Fig. 10A). Białko wyrażano pod kontrolą promotora phoE w warunkach ograniczenia fosforanów. Autentyczną sekwencję sygnałową typu II LbpB zastąpiono sekwencją sygnałową typu I, zaś znacznik His poprzedzał miejsce cięcia czynnika Xa, wprowadzonego pomiędzy sekwencję sygnałową i dojrzałą LbpB. Ponadto, dwa pierwsze aminokwasy dojrzałej LbpB Cys i Ile, zastąpiono, odpowiednio, Ala i Val (Fig. 10B). W konsekwencji, rekombinowane białko nie mogło być modyfikowane lipidem na N-końcowej Cys. Rekombinowane białko LbpB frakcjonowało z błonami komórkowymi, a nie z białkami rozpuszczalnymi (dane nie pokazane). Stąd, ekstrachowano je z błon przy użyciu detergentów. Zastosowano Oktylo-POE, ponieważ rozpuszczał około 50% całkowitej ilości rekombinowanego LbpB z błon. Ponadto, gdy ekstrachowane białko nie jest denaturowane przez gotowanie w buforze do próbek, migruje ono szybciej w PAGE, niż białko denaturowane (dane nie pokazane), co wskazuje, że białko jest prawidłowo fałdowane. Po ekstrakcji, białko znakowane His oczyszczano przez chromatografię powinowactwa z Ni. Większość białka eluowała we frakcji 100 mM i 200 mM imidazolu. Jednakże, wszystkie frakcje połączono przed dializą. Białko było czyste, co sprawdzono przez barwienie żelu błękitem Coomassie (Fig. 11), zaś jego większość występowała w postaci pofałdowanej, która migrowała szybciej podczas PAGE, niż postać de22
PL 194 800 B1 naturowana. Fałdowaną postać LbpB, ale nie postać denaturowaną wiązała laktoferrynę na błonie co wykazano w przykładzie 6.
P r z y k ł a d 9:
W celu zbadania immunogenności białka LbpB u ludzi, badano obecność przeciwciał rozpoznających białko LbpB szczepu BNCV w surowicach ozdrowieńców przy użyciu testu immunologicznego.
9A: Immunogenność LbpB u człowieka - Metody
Dziesięć surowic od ozdrowieńców uzyskano od SmithKline Beecham Biologicals SA, Belgia i siedem od the National Institute of Public Health and the Environment, Holandia (Tabela 6). Osobnicy byli zakażeni szczepami o różnych serotypach i podtypach.
Rekombinowny LbpB wyizolowano stosując procedurę opisaną w Przykładzie 8. Elektroforezę na żelu poliakrylamidowym (PAGE) przeprowadzono w sposób opisany przez Lugtenberga i in., (1975) w kilkoma modyfikacjami. Żel poliakrylamidowy został skomponowany z 5% żelu stałego i 11% żelu rozpuszczalnego, nie zawierającego SDS. W celu zapobieżenia denaturacji LbpB próbka buforu nie zawierała b-merkaptoetanolu (Lugtenberg i in., 1975), i próbki trzymano w 0°C przed rozpoczęciem elektroforezy. W celu denaturacji LbpB bufor uzupełniono b-merkaptoetanolem, i próbki gotowano przez 5 min. Elektorforezę przeprowadzono w przy prądzie stałym 20 mA w temp. 4°C.
Znakowanie immunologiczne przeprowadzono w sposób opisany przez Petterssona i in., (1993). Ludzką surowicę rozcieńczono 1:500. Jako drugie przeciwciało zastosowano skoniugowane z peroksydazą królicze przeciwciało przeciwko ludzkiemu Igg (Dako A/S) w rozcieńczeniu roboczym 1:5000. Aktywność peroksydazy badano stosując system ECL zgodnie z instrukcją dostarczoną przez producenta (Amersham).
9B: Immunogenność LbpB u człowieka - Wyniki
Obecność przeciwciał swoistych wobec LbpB w ludzkiej surowicy badano wobec oczyszczonego, rekombinowanego białka LbpB szczepu BNCV (-:2a:P1.2) w prążkach testu immunologicznego. Reaktywność badano zarówno wobec pofałdowanego LbpB i wobec zdenaturowanego białka (patrz na przykład Fig.12). Wyniki przedstawiono sumarycznie w Tabeli 6. Cztery surowice silnie reagowały zarówno ze zdenaturowaną, jak i pofałdowaną postacią LbpB. Pięć surowic reagowało słabo z obiema postaciami, dwie surowice słabo jedynie z postacią pofałdowaną, dwie surowice słabo z jedynie postacią zdenaturowaną, cztery surowice nie reagowały wogóle z LbpB. Wyniki te wskazują na to, że LbpB meningokokowego zapalenia opon mózgowych wywołuje odpowiedź odpornościową u ludzi i sugerują znaczący stopeń wywoływania krzyżowej reaktywności pomiędzy białkiem LbpB pochodzącym z różnych szczepów.
P r z y k ł a d 10: ELISA & Testy baketriobójcze wykorzystujące surowicę uzyskaną od myszy immunizowanych komórkami meningokokowymi albo LbpB
10A: Protokół immunizacji
Immunizacja szczepem BNCV N. meningitidis: Grupy 10 myszy (6-cio tygodniowe Balb/C) immunizowano (100 pi dootrzewnowo albo 100 pi podskórnie) trzykrotnie 5 x 108 CFU inaktywowanymi gorącem całymi komórkami BNCV w adiuwancie SBAS2.
Immunizację przeprowadzono w odstępach 21 dniowych, i krew upuszczono 56 dnia przez nakłucie worka osierdziowego. Surowicę zbierano i dzielono na grupy.
Immunizacja LbpB pochodzącym ze szczepu BNCV N. meningitidis: Przeprowadzono takim samym sposobem jak opisany powyżej za wyjątkem tego, że dwie pierwsze immunizacje przeprowadzono 10 pg nieoczyszczonego LbpB (otoczki komórek E. coli zawierające rekombinowane LbpB) i trzecią immunizacje przeprowadzono 2,5 pg czystego LbpB (przygotowanego w sposób opisany w Przykładzie 8).
10B: Pomiary odpowiedzi w teście ELISA z całymi komórkami (WCE) i w teście ELISA z oczyszczonym LbpB
Zastosowano płaskodenne 96-studzienkowe płytki immunologiczne Nunc. 100 pl inaktywowanych ciepłem Neisseria meningitidis szczepu B [hodowano w warunkach niedoboru żelaza (fe-) z zastosowaniem EDDA jak opisano w Przykładzie 1] (20 pg/ml całkowitego białka) zawieszone w PBS dadawano do poszczególnych studzienek i pozwolono na odparowanie w temp. 37°C przez noc.
Pokryte płytki przemywano czterokrotnie 0,9% NaCl, 0,05% Tween i nasycano 0,3% PBS Casein (Merck) przez 30 min. w temperaturze pokojowej, mieszając i przemywając w tym samym czasie. 100 pl uzyskanej surowicy było 100-krotnie przemyte w 0,05% PBS Tween 20, 0,1% kazeinie dodano do pierwszej studzienki, następnie dwukrotne rozcieńczenie aż do rozcieńczeń 12 krotnych, i płytki inkubowano przez 30 min w temp. 37°C mieszając. Po przemyciu, dodano 100 pl 2000-krotnego rozcieńczenia biotyny przeciwko mysim immunoglobulinom (Dakopatts E0413) w 0,05% PBS Tween 20,
PL 194 800 B1
0,3% kazeina i płytki inkubowano tek samo jak poprzednio. Płytki następnie przemywano i dodano 100 μΙ 4000-krotnego rozcieńczenia kompleksu streptawidyna biotynylowana peroksydaza chrzanowa w 0,05% PBSPBS Tween 0,05% i płytki inkubowano w ten sam sposób. Po przemyciu, dodano 100 μl świeżo przygotowanego roztworu 4 mg barwnika O-fenylodiaminy (OPDA) (sigma P8787) w 0,1 M buforze cytrynowym o pH 4,0 i płytki inkubowano przez 15 min w temperaturze pokojowej w ciemnym pomieszczeniu. Reakcję zatrzymano przez dodanie 50 μl 1 N HCl. Absorbancję mierzono przy 490 nm.
Anty-LbpB ELISA pracowało w ten sam sposób jak WCE za wyjątkiem tego, że pokrycie płytek było inne. Płytki pokryto 100 μl roztworu 0,5 μg/ml czystego LbpB w 0,05 M buforze węglan/biwęglan o pH 9, 6 i inkubowano przez noc w temp. 37°C (nie odparowywano).
10C: Test Bakteryjny
Hodowlę meningokoków grupy B (szczep H44/76) [również hodowany w warunkach niedoboru żelaza (fe-) tak jak to opisano w Przykładzie 1, albo w warunkach bogatych w żelazo (fe+) uzyskanych przez brak dodatku EDTA) w logarytmicznej fazie wzrostu (OD-0,3) zawieszano w sterylnym roztworze Hanksa z 0,3% BSA w celu uzyskania zawiesiny czynnych komórek dopasowanej do 20000 CFU/ml.
Mieszaninę do pierwszej reakcji (75 μ) przygotowano tak, że zawierała 50 μl/studzienkę dwukrotnie rozcieńczone próbki badanej surowicy (przykład 10A) (inaktywowanej ciepłem w 56°C przez 30 min) i 25 μl/studzienkę 20000 CFU/ml fazy logarytmicznej meningokoków grupy B. Probówki reakcyjne przechowywano w 37°C przez 15 min i wstrząsano przy 210 rpm.
Końcowa mieszanina reakcyjna (100 μ) dodatkowo zawierająca 25% wcześniej zbadanej surowicy osesków króliczych jako źródło dodatkowe inkubowano w tych samych warunkach przez 60 min. Sterylne polistyrenowe u-denne 96-studzienkowe płytki do mikromiareczkowania zastosowano w tym teście.
μl próbki pobrano z każdej studzienki stosując wielokanałową pipetę i nakraplano na płytki agarowe Mueller-Hinton zawierające 1% Izovitaleksu i 1% inaktywowanej ciepłem surowicy końskiej i inkubowano przez 18 godz. w temp. 37°C, w 5% CO2. Poszczególne kolonie mogły być liczone do 80 CFU na próbkę.
Następujące trzy próbki badane wykorzystane jako kontrole: bufor+bakteria+dopełniacz; bufor+bakteria+inaktywowany dopełniacz; surowica+bakteria+inaktywowany dopełniacz.
Miana kalkulowano stosując procedurę programu Excel (Mikrosoft). Procedura ta dała możliwość precyzyjnych pomiarów rozcieńczeń odpowiadających 50% zabitych komórek przez wyliczenia regresyjne.
P rzykła d 10: Wyniki
Tabela 7 i Figura 13 pokazują, że immunizacja LbpB wywołuje dobrą odpowiedź przeciwko LbpB (Fig 13A), jak rónież przeciwko próbkom całych komórek ze szczepu BNCV (źródło rekombinowanego LbpB) i szczepu H44/76 (LbpB wykazujący jedynie 78,5% identyczności sekwencji z BNCV) (Figura 13B i C). Uzyskana surowica z wykorzystaniem schematu immunizacji obejmuje jedynie rekombinowane LbpB dające podobne rezultaty (dane nie pokazane). Przejrzysta immunizacja przeciwko całym komórkom szczepem BNCV prowadzi do wyższych poziomów w teście ELISA pełnokomórkowym zarówno dla komórek BNCV, jak i H44/76 (odpowiednio Fig. 13B i C).
Dodatkowo, immunizacja rekombinowanym LbpB ze szczepu N. meningitidis BNCV wywołuje przeciwciała, które wiążą białko o podobnym ciężarze cząsteczkowym w próbkach pełnokomórkowych z Moraxella catarrhalis przepuszczonych na żeli elektroforetycznych co przeprowadzono jak opisano w Przykładzie 9 (dane nie pokazane).
Tabela 8 i Fig. 14 pokazują, że przeciwciała wytwarzane w surowicy po immunizacji rekombinowanym LbpB (ze szczepu BNCV) są bakteriobójcze wobec heterologicznego szczepu (H44/76), którego LbpB wykazuje jedynie 78,5% identyczności sekwencji z BNCV. Istnieje również przykład wykorzystujący surowicę uzyskaną po schemacie immunizacji obejmującym jedynie rekombinowany LbpB (dane nie pokazane). Jest to prawdziwe, gdy H44/76 hodowany jest w otoczeniu zawierającym żelazo (Fig. 14A) i pozbawionym żelaza (Fig. 14B). Wydaje się, jak należało tego oczekiwać, że jest to większy efekt w otoczeniu pozbawionym żelaza, LbpB jest wyrażane w większej ilości, gdy bakterie są w tych warunkach.
Tak więc LbpB jest antygenem immunoochronnym i następnie, pokazano dowody dostarczające krzyżową ochronę immunologiczną przeciwko heterologicznym szczepom N. meningitidis.
PL 194 800 B1
T a b e l a 1. Zastosowane szczepy bakteryjne i plazmidy
Szczep a Opis Odnośnik/Źródło
N. meningitidis
H44/76 B:15:P1.7,16 E. Holten
CE1449 H44/76 /óp4::Ermr Niniejsze zgłoszenie
BNCV -;2a:P1.2 Nonencapsułated derivative of M986 E.C. Gotschiich
CE1452 BNCV /M4::Erm Niniejsze- zgłoszenie
CE1452 BNCV IbpB. :Kmr Niniejsze zgłoszenie
CE1402 M986 IbpA, IbpB Pettersson et al. 1994a
M990 B:6:P1.6
881607 B:nt:P1.12
B16B6 B:2a:P1.2 A. Schryvers
N91 B16B6 /óp£ A. Schryvers
M98! B:4:nt
£ coli
DH5a Laboratory stock
Y1090 Ampr Young and Davis, 1983
PC2494 hsdR derivative of JM 101 Phabagen Collection
Plazmidy
pEMBL19 Ampr Laboratory stock
pUC4K Kmr-box, Ampr Pharmacia Biotech
pER2 Ermr-box in pBiuescript, Ampr jennings et al., 1993
pAM6 pEMBL19 carrymg par^t.s' of IbpA and IbpB Niniejsze zgłoszenie
pAMÓK pAM6 with a ΚπΕ-Εοχ from pUC4K inserted in the Bg/1l site of IbpB Niniejsze zgłoszenie
pAM6K-nus pAM6K with a neisserial uptake seguence inserted in the Ap/rZsite of the multiple cloning site of the vector Niniejsze zgłoszenie
pAMB pEMBL19 carrying parts of IbpA and IbpB Niniejsze zgłoszenie
pAMl pUC 19 carrying parts of IbpA and IbpB Pettersson et al. 1993
ΡΑΜ23 pLC19 carrying IbpA and part of IbpB Pettersson et al. 1994b
pAM23E pAM23 with an Erm^- box inserted in the £coRV-site of IbpA Niniejsze zgłoszenie
Wspomniane są: grupa serologiczna, serotyp albo podtyp ; nt: niemożliwe do typowania
PL 194 800 B1
T a b e l a 2. Startery zastosowane do klonowania przez PCR albo łączniki
Nazwa
Sekwencja
Uwagi
DVAS2 AGACCGACCCrTCGACGACTTCGG
FW5 C^AA^C^/^G?^?^(j(^(^>TT(^GT(^(^(jG
SDA1 CCTCrTTAGTATCTTTCTTCGCAC
LB11 ctt^tttcatcttttccc
PR1 CA\T^^^TA^CTKG^TTG.Tr'AGTK^^^^3· Wiąże się a kasetą Km'
nusl TTCAGACGGCTGTAC Sekwencja wychwytu Neissena komplementarna a nusl
nus2 AGCCGTCTGAAGTAC
Tabela 3. Startery zastosowane do amplifikacji czterech dalszych genów IbpB
Nazwa
Sekwencja
LB20
LB23 CGGGATCCAGCC/ATGGCAGTCAGGGTAAGC
REV2 GCACGGACGGTTTCCTCTTTCAG<
T a b e l a 4. Identyczność oceniana parami sekwencji LbpB, w %
H44/76 M990 M981 881607
BNCV 78.5 73.8 72.7 71.4
H44/76 72.5 74.1 78.5
M990 70.5 71.3
M981 80.6
T a b e l a 5. Startery zastosowane do wyrażania rekombinowanego LbpB
Sekwencja Nazwa
LB22 AACTTCTCTrCCTKTCTTATrrcGGTTTGCA
LB23 TGCGATCCACCTTTCGCAGTCAGGGTt^GC
VCO 12a TACC ATT ACCACC ACC ACGTGATCGAGGGGCGTGC A
VCO13a TCTTTTTTCATTATGTGGTGGTGGTGGTGCTGTGCA
PL 194 800 Β1
Tabela 6. Wyniki badania immunologicznego ludzkich surowic przeciwko oczyszczonemu LbpB
Surowica Charakterystyka Natywne Denaturowane Źródło
262439 B:NT:P1.4 + + SKB
262532 B:15:P1.7,16 + + SKB
262658 B:NT:P1.15 - - SKB
262716 B:15:P1.7,16 - + SKB
262892 B:2b:P1.10 ++ ++ SKB
262917 B:4:NT ++ ++ SKB
262941 B:1:P1.15 + + SKB
262987 B:2a:P1.15 + + SKB
263017 B:4:NT - - SKB
263021 B:4:P1.4 - - SKB
69 B:15:P1.16 + - RIVM
322 B:15:P1.5 + - RIVM
329 B:1:P1.4 - - RIVM
330 B:1:P1.4 ++ ++ RIVM
187 - - + RIVM
195 - ++ ++ RIVM
118 - + + RIVM
aZaznaczono sero- i podtypy szczepu, którym zakażony byt pacjent, jeżeli wiadomy. NT: niemożliwy do typowania. b++ wskazuje na silną reakcję, + słaba reakcja i - brak reakcji z natywną albo denaturowaną postacią białka CSKB: SmithKline Beecham Biologicals, RIVM: Natioonal Institute of Public Health and the Environment
Tabela 7. Wyniki ELISA z całymi komórkami i anty-LbpB przeprowadzone jak to opisano w Przykładzie 10.
reakcja anty-LbpB
100' 200 400 800 1600 3200 6400 12800 25600 51200 102400 204800
BNCV 0.341b 0.196 0.107 0.063 0.033 0.018 0.014 0.011 0.013 0.012 0.009 0.012
LbpB 2.772 2.918 2.794 2.867 2.687 2.487 2.046 1.504 1.043 0.668 0.405 0.202
PBS OJ 4 0.079 0.044 0.028 0.016 0.018 0.012 0.01 0 01 0.008 0.012 0.01
reakcja anty-BNCV(Fe-)’
100 200 400 800 1600 3200 6400 12800 25600 51200 102400 204800
BNCV 2.476 3.09 3.04 3.154 3.034 3J12 3.111 2.905 2.745 2.436 1.659 1.056
LbpB 1.783 1.856 1.292 0.914 0.622 0.385 0.257 0.185 0.122 0.106 0.096 0.089
PBS 0.687 0.55 0.358 0.243 0.154 0J23 0.099 0.088 0.083 0.081 0.031 0.081
reakcja anty-H44/76(Fe-)
100 200 400 800 1600 3200 6400 12800 25600 51200 102400 204800
BNCV 2.814 3.003 2.966 2.976 2.873 2.66 2.371 1.862 1.312 0.873 0.591 0.452
LbpB 2.653 2.287 1.683 1.123 0.748 0.536 0.409 0.35 0.309 0.298 0.289 0.295
PBS 1.646 1.049 0.695 0.47 0.338 0.271 0.238 0.226 0.226 0.251 0.284 0.285
Rozcieńczenie surowicy; bgęstość optyczna przy 490 nm
PL 194 800 B1
T a b e l a 8. Wyniki aktywności bakteriobójczej surowic przeciwko całym komórkom i przeciwko LbpB przeprowadzone jak opisano w Przykładzie 10
Miano bakteriobójcze przeciwko H44/76(Fe-)
200.0 a 400.0 800.0 1600.0 3200.0 6400.0 12800.0 25600.0
H44/76 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 97.2
BNCV 100.0 94.4 93.0 83.2 81.8 63.7 48.3 34.4
LbpB 10.6 -0.5 -0.5 -0.5 -0.5 -0.5 -0.5 -0.5
PBS -0.5 -0.5 -0.5 -0.5 -0.5 -0.5 -0.5 -0.5
Miano bakteriobójcze przeciwko H44/76(Fe-)
200.0 400.0 800.0 1600.0 3200.0 6400.0 12800.0 25600.0
H44/76 100 98 100 100 100 100 100 98
BNCV 100 98 96 85 83 70 64 32
LbpB 34 25 0 0 0 0 0 0
PBS 0 0 0 0 0 0 0 0
arozcieńczenie surowicy
Wszystkie Publikacje, w tym, choć nie wyłącznie patenty i zgłoszenia patentowe, cytowane w niniejszym opisie są włączone jako odnośniki.
PL 194 800 Β1
Odnośniki
Abdillahi, H., and Poolman, J. Τ. (19S7) Whole-cell ELISA for typing of Neisseria meningitidis with monoclonal antibodies. FEMS Microbiol. Lett 48: 367-371.
Anderson. J. E., Sparling, P. F., and Comelissen, C. N. (1994) Gonococcal transferrinbinding protein 2 facilitates but is not essential for transferrin utilization. J Bacteriol
176: 3162-3170.
Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore. D. M., Seidman, J. G., Smith. J. A., and Struhl, K. (1989) Current protocols in molecular biology. Brooklyn, NY: Greene Publishing Associates.
Bagg. A., and Neilands, J. B. (1987) Ferric uptake regulation protein acts as a repressor, employing iron (II) as a cofactor to bind the operator of an iron transport operon in Escherichia coli. Biochemistry 26: 5471-5477.
Biswas, G. D„ and Sparling, P. F. (1995) Characterisation of IbpA, the structura! gene for a lactofemn receptor in Neisseria gonorrhoeae. Infect Immun 63: 2958-2967.
Bosch. D.. Leunissen, J., Yerbakel. J., de Jong, M., van Erp, H., and Tommassen, J.
(1986) Periplasmic accumulation of truncated forms of outer membranę PhoE protein of Escherichia coli K-12. J. Mol. Biol. 189:449-455.
Comelissen, C. N., Biswas, G. D.. Tsai. J.. Paruchuri, D. K., Thompson, S. A., and
Sparling. P. F. (1992) Gonnococcal transferrin-binding protein 1 is required for transfemn utilization and is homologous to TonB-dependent outer membranę receptors. JBacteriol 174: 5788-5797.
Finkelstein. R. A., Sciortino, C. V., and Mclntosh. M. A. (1983) Role of iron in microbehost interactions. Rev Infect Dis 5: S759-S777.
Fuller, C. A., Retzer, M. D., Jacobs, E., and Schryvers, A. B. (1996) Evidence for a bi-lobed structure for meningococcal transferrin binding protein B. In Pathogenic Neisseria. Zollinger, W. D., Frasch, C. E., and Deal, C. D. (eds). Abstract book from the lOth Pathogenic Neisseria Conference. pp 572-573.
Genco, C, A., Chen, C. Y., Arko, R. J., Kapczynski, D. R., and Morse, S. A. (1991)
Isolation and characterization of a mutant of Neisseria gonorrhoeae that is defective
PL 194 800 Β1 in the uptake of iron from transferrin and hemoglobin and is avirulent in mouse subcutaneous chambers. J Gen Microbiol 137: 1313-1321.
Gschwentner, C„ Lassman, H„ and Huettinger, M. (1997) Lactoferrin and its receptor(s): modulators of inflammation? Abstracts of Third Internationa! Conference on Lactoferrin. p.68.
Irwin. S. W., Averil, N. A.. Cheng, C. Y., and Schrvvers, A. B. (1993) Preparation and analysis of isogenic mutants in the transferrin receptor protein genes, tbpA and tbpB. from Neisseria meningilidis. Mol Microbiol 8: 1125-1133.
Jennings, Μ. P., van der Ley, P., Wilks, Κ. E., Maskell, D. J., Poolman, J. T., and Μοχοη,
E. R. (1993) Cloning and molecular analysis of the galE gene of Neisseria meningitidis and its role in lipopolysaccharide biosynthesis. Mol Microbiol 10; 361369.
Legrain. M.. Marazin, V., Irwin. S. W., Bouchon. B., Quentin-Millet, M.-J., Jacobs, E.. and Schryvers, A. B. (1993) Cloning and characterisation of Neisseria meningitidis genes encoding the transferrin-binding proteins Tbpl and Tbp2. Gene 130: 73-80.
Lugtenberg. B., Meyers. J., Peters. R... van der Hoek, P.. and van Alphen. L. (1975)
Electrophoretic resolution of the major outer membranę protein of Escherichia coli K-12 into four bands. FEBS Lett. 58:254-258.
Pettersson, A., Kuipers. B., Pelzer, M., Verhagen, E., Tiesjema, R. H„ Tommassen, J., and Poolman. J. T. (1990) Monoclonal antibodies against the 70-kiłodalton ironregulated protein of Neisseria meningitidis are bactericidal and strain specific. Infect Immun 58. 3036-3041.
Pettersson, A., van der Ley, P„ Poolman, J. T., and Tommassen, J., (1993) Molecular characterization of the 98-kilodalton iron-regulated outer membranę protein of Neisseria meningitidis. Infect Immun 61: 4724-4733.
Pettersson, A., Klarenbeek, V.. van Deurzen, J., Poolman, J. T., and Tommassen, J., (1994a) Molecular characterization of the structural gene for the lactorferrin receptor of the meningococcal strain H44/76. Microbial Pathogen 17: 395-408.
Pettersson, A., Maas, A., and Tommassen, J., (1994b) Identification ofthe iroA gene product of Neisseria meningitidis as a lactoferrin receptor. J Bacteriol 176: 17641766.
PL 194 800 Β1
Renauld-Mongenie, G., Poncet. D.. and Quentin-Millet, M. J. (1996) Study of human transferrin binding sites within the transferrin binding protein Tbp2 from N.
meningitidis M982 using the pMAL expression system. In Pathogenic Neisseria.
Zollinger, W. D., Frasch, C. E., and Deal. C. D. (eds). Abstract book from the lOth
Pathogenic Neisseria Conference. pp 585-586.
Sambrook, J„ Fritsch, E. F„ and Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd edn. Cold Spnng Harbor, NY: Cold Spnng Harbor Laboratory Press.
Schryvers, A. B., and Morris, L. J. (1988) Identification and characterization of the human lactofemn-binding protein from Neisseria meningitidis. Infect Immun 56: 11441149.
Tommascn, J., and Lugtenberg, B. (1980) Outer membranę protein e of Escherichia coli K-12 is co-regulated with alkaline phosphatase. J. Bacteriol 143:151-157.
Tommassen. J., van Tol, H.. and Lugtenberg, B. (1983) The ultimate localization of an outer membranę protein of Escherichia coli K-12 is not determined by the signal sequence. EMBO J. 2:1275-1279.
van Berkel, Ρ. H. C.. Geerts. Μ, E. J„ van Veen, H. A., Kooiman, Ρ. M., Pieper, F. R., de Boer, H. A., and Nuijens. J. H. (3995) Glycosylated and unglycosylated human lactoferrins both bind iron and show identical affinities towards human lysozyme and bacterial polysaccharide. but differ in their susceptibilities towards tryptic proteolysis. Biochem 7312: 107-114.
van der Ley, P., Heckels, J. E„ Virji, M„ Hoogerhout, P., and Poolman, J. T. (1991)
Topoiogy of outer membranę porins in pathogenic Neisseria spp. Infect Immun 59: 2963-2971.
van der Ley, P., and Poolman, J. T. (1992) Construction of a multivalent meningococcal strain based on the cłass 1 outer membranę protein. Infect Immun 60: 3156-3161.
von Heijne, G. (1989) The structure of signal peptides from bacterial lipoproteins. Prot Eng 2: 533-534.
Young, R. A., and Davis, R. W. (1983) Yeast RNA polymerase II genes: isolation and antibody probes. Science 222: 778-782.
PL 194 800 B1
LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE:
(i) ZGŁASZAJĄCY: University of Utrecht, Technology Foundation (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Białko Neisseria wiążące laktoferrynę (iii) LICZBA SEKWENCJI: 10 (iv) ADRES DO KORESPONDENCJI:
(A) ADRESAT: SmithKline Beecham, Corporate IP Department (B) ULICA: Two, New Horizons Court (C) MIASTO: Brentford (D) STAN: Middlesex (E) KRAJ: Zjednoczone Królestwo (F) KOD: TW8 9EP (v) POSTAĆ MOŻLIWA DO ODCZYTANIA PRZEZ KOMPUTER:
(A) RODZAJ NOŚNIKA: dyskietka (B) KOMPUTER: kompatybilny z IBM (C) SYSTEM OPERACYJNY: DOS (D) OPROGRAMOWANIE: FastSeq for Windows ver. 2.0 (vi) DANE DOTYCZĄCE OBECNEGO ZGŁOSZENIA:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA:
(B) DATA ZGŁOSZENIA:
(vii) DANE DOTYCZĄCE POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA:
(B) DATA ZGŁOSZENIA:
(xii) INFORMACJA O RZECZNIKU:
(A) NAZWA: DALTON, Marcus, Jonathan William (B) NUMER REJESTRACYJNY: XXXXXX (C) NUMER SPRAWY: B45106 (xiii) INFORMACJA TELEKOMUNIKACYJNA:
(A) TELEFONE: (0181) 975 6348 (B) TELEFAX: (0181) 975 6177 (2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR:1:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 2277 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:
(B) SZCZEP: Neisseria meningitidis szczep BNCV (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: sekwencja kodująca (B) LOKALIZACJA: 100...2274 (C) INNE INFORMACJE:
(xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR:1:
PL 194 800 B1
TCCTGATTTT TGTTAATTCA CTATAAAAAC GGGTTGATAT TATCTGTACA TATTAATATA 60 ATGATAATTA TTATTAATCA AATAGGAGGA AAAGTAGGG ATG TGT AAA CCG AAT 114
Met Cys Lys Pro Asn 1 5
T2 ' T , , V- Gly rr r- Gly ATT Ile GTC Va1 10 TTC Leu TTG Leu GGG Pro TTA Leu CTT Leu 15 TTG Leu GCA Ala r r^T Ser TGT Cys ATC Ile 20 GGC Gly 162
AAT TT - GGC GTG rrr GGT GTT GTC GAA TCA ACG CCG ACC GCG TAC 210
Gly Asn Phe Gly Val Gln Pro Val Val Glu Ser Thr Pro Thr Ala Tyr
25 30 35
CCC GTC ACT TTC AAG TCC ΑΑα GAC GTT CCC ACT CCG CCC CCT GCC AAA 258
Pro Val Thr Phe Lys Ser Lys Asp Val Pro Thr Pro Pro Pro Ala Lys
40 45 50
W--.- 1 TGT ATA GAA ATC ACG CCG GTC AAC CGG CCC GCC GTC GGT GCG GCA 306
Pro Ser Ile Glu Ile Thr Pro Val Asn Arg Pro Ala Val Gly Ala Ala
55 60 65
PL 194 800 B1
ATG CGG CTG CCA AGG CGG AAT AuV GCT ψΠ”Ρ CAT CGT GAA GAT GGC ACG 354
Mer Arg Leu Pro Arg Arg Asn Thr Ala Phe His Arg Glu Asp Gly Thr
70 75 80 85
GAA ATT CCA AAT AGC AAA CAA GCA GAA GAA AAG CTG TCG ttt CAA GAA 402
Glu 11.e Pro Asn Ser Lys Gin Ala Glu Glu Lys Leu Ser Phe Gin Glu
90 95 100
GGT GAT GTT CTG TTT TTA TAC GGT TCA AAA GGA AAT AAA CTT CAA CAA 450
Gly Asp Val Leu Phe Leu Tyr Gly Ser Lys Gly Asn Lys Leu Gin Gin
105 110 115
CG? AAA AGC GAA ATT CAT AAA CGT GAT TCC GAT GTA GAA ATT AGG AGA 4 98
Leu Lys Ser Glu I his Lys Arg Asp Ser Asp Val Glu Ile Arg Thr
120 125 130
TCA GAA. AAG GAA AAT AAA AAA VA V GAT TAT AAA TTT GTA GAT GCA GGT 54 6
Ser Giu Lys Glu Asn Lys Lys Tyr Asp Tyr Lys Phe Val Asp Ala ul y
135 140 145
TLT GTA TAT GTA AAG GGA AAA U,·-. 1 GAA. ATT AAG TGG ACT TCA GAT TAC 594
Tvr Val Tyr Val Lys Gly Lys Asp Glu Ile Lys Trp Thr Ser Asp Tyr
150 155 160 165
AAG CAG TT v TCT AAC CGG TTA GGT TAT GAC GGT TTT GTA TAT TAT TCr 64 2
Lys Gin Phe Ser Asn Arg Leu Gly Tyr Asp Gly Phe Val Tyr Tyr Ser
170 175 180
GG« GAA CGT GGV TGG CAA Τ p VTA. CCG AGT GCG GGA ACG GTG GAA TAT €90
Gly Glu Arg Pro Ser Gin Ser Lsu Pro Ser Ala Gly Thr Val Glu Tyr
185 190 195
TCT GGT AAC TGG CAA TAT ATG ACC GAT GCC AAA CGT CAT CGA GCA GGT 738
Ser Gly Asn Trp Gin Tyr Met Thr Asp Ala Lys Arg His Arg Ala Gly
200 205 210
AAG asG GTT GGC ATT GAC AAT TTG GGT TAT TAC ACA TTT TAT GGT AAC 786
Lys Ala Val Gly Ile Asp Asn Leu Gly Tyr Tyr Thr Phe Tyr Gly Asn
215 220 225
GAG GTT GGT GCA ACT TCT TAT GCG GCT AAG GAT GTC GAC GAA AGG GAA 834
Asp Val Gly Ala Vhr Ser Tyr Ala Ala Lys Asp Val Asp Glu Arg Glu
230 235 240 245
PL 194 800 B1
AAA CAT CCT GCT AAA TAT ACG GTA GAT TTC GGT AAC AAA ACC CTG ACG 882
Lys His Pro Ala Lys Tyr Thr Val Asp Phe Gly Asn Lys Thr Leu Thr
250 255 26C
GGC GAG CTG ATT AAA AAC CAA TAT GTC AAA CCC AGT GAG AAG CAA AAA 930
Gly Glu Leu Ile Lys Asn Gln Tyr Val Lys Pro Ser Glu Lys Gir. Lys
265 270 275
CCG GTC- ACC ATT TAC AAC ATC ACT GCC GA? TTA AAC GGC AAC CGC TTT 978
Prc Leu Thr 11·- Tyr Asn Ile Thr Ala Asp Leu Asn Gly Asn Arg Phe
280 235 290
ACC GGu AGT GCC AAG GTC AAT CCT GAT TTA GCG AAA AGC CAT GCC AAT 1026
Thr Gly Ser Ala Lys Val Asn Pro Asp Leu Ala Lys Ser His Ala Asn
295 300 305
GAG CAT TTG TTT TTC CAT ucC □Mi CC~ GAT CAG CGG CTT GAG GGC 1074
Lys Glu His Leu Phe Phe His Ala Asp Ala Asp Gln Arg Leu Glu Gly
310 315 320 325
• 1 ttj TTC Gkji GAT AAG GGu GAA GAu GTT GCC GGA CGG TTT ATC AGC 1122
Gly P n o Phe Gly Asp Lys Gly Glu Glu Leu Ala Gly Arg Phe Ile Ser
330 335 340
AAC GAu AAC AGc GTA 7ΤΡ GGT GtA TTC GCA GGC AAA CAA AAT AGC CCC 1170
As n Asp Asn Ser Val Phe Gly Val Phe Ala Gly Lys Gln Asn Ser Pro
345 350 355
.-TG CGG TCT GgA AAA CAC ACC T * Tl γλγ. ATC TTG GAT rp V- CTG AAA ATT TCC 1218
Val Pro Ser Gly Lys His Thr Lys He Leu Asp Ser Leu Lys Ile Ser
360 365 370
GTT GAT GAG GCA AGT GGT GAA AAT CCC CGA CCG TTT GCC ATT TCT CCT 1266
Val Asp Glu Ala Ser Gly Glu Asn Pro Arg Pro Phe Ala Ile Ser Pro
375 380 385
ATG CCC GAT TTT GGT CAT CCC GAC AAA CTT CTT GTC GAA GGG CAT GAA 1314
Met Pro Asp Phe Gly His Pro Asp Lys Leu Leu Val Glu Gly His Glu
390 395 400 405
PL 194 800 Β1
ATT CCT TTG GTT AGC CAA GAG AAA ACC ATC GAG CTT GCC GAC GGC AGG 1362
Ile Pro Leu Val Ser Gin Glu Lys Thr Ile Glu Leu Ala Asp Gly Arg
410 415 420
AAA ATG ACC GTC AGT GCT TGT TGC GAC TTT TTG ACC TAT GTG AAA CTC 1410
Lys Met Thr Val Ser Ala Cvs Cys Asp Phe Leu Thr Tyr Vsl Lys Leu
425 430 435
CGG ATA AAA ACC GAA CGC CCC GCC GCC AAA CCG AAG GCG CAG GAC 1458
G.y Arg Ile Lys Thr Glu Arg Pro A.I a A.I a Lys Pro Lys Ala Gin Asp
440 445 450
GAA GAG GAT TCG GAC ATT GAT AAT GGC GAA* GAA AGC GAA GAC GAA ATC 1506
Glu Glu Asp Ser Asp Ile Asp Asn Gly Glu Glu Ser Glu Asp Giu I le
4 55 4 60 465
GGC GAT C-AA GAA GAA GGC ACC C-AA GAT GCA GCC GeA GGA GAT GAA GGC 1554
Gly Asp Glu Glu Glu Gly Thr Glu Asp A.I a Ala Ala Gly Asp Glu C-ly
470 475 480 485
AGC GAA GAA GAC GAA CCC ACA G.AA AAC GAA GAC GGC GAA G.AA GAC GAA 1602
Ser Glu Glu Asp Glu Ala Thr Glu Asn Glu Asp Gly Glu Glu Asp Glu
490 495 500
GCT GAA GAA CCT GAA GAA GhA T CG TCG GCA GAA kjuC AAC GGC AGT TCA 1650
Ala Glu Giu Pro Glu Glu Glu Ser Ser Ala Glu Gly Asn Gly Ser Ser
505 510 515
AAC GCC ATC /-•Τ' I*' U i 'J CCT GTC CCG GAA. GCC TCT AAA UuC AGu GAT ATC GAC 1693
As r. A.I a Ile Leu Pro Vai Pro Glu Ala Ser Lys Gly Arg Asp Ile Asp
520 525 530
CTT TTC < χ G AAA GGT ATC CGC ACG GCA GAA ACG AAT ATT CCG C.AA ACT 1746
Leu Phe Leu Lys Gly Ile Arg Thr A.I a Glu Thr Asn Ile Pro Gin Thr
535 54 0 545
GGA GAA GCA CGC TAT ACC GGC ACT TGG GAA GCG CGT ATC GGC AAA CCC 1794
Gly Glu Ala Arg Tyr Thr Gly Thr Trp Glu Ala Arg Ile Gly Lys Pro
550 555 560 565
ATT CAA TGG GAC AAT CAT GCu GAT AAA GAA GCG GCA AAA GCA GTA TTT 1842
Ile Gin Trp Asp Asn His Ala Asp Lys Glu Ala Ala Lys Ala Val Phe
570 575 580
PL 194 800 Β1
ACC GTT GAT TTC Phe 585 GGC AAG AAA TCG ATT Ile 590 TCC GGA ACG CTG ACG GAG AAA 1890
Thr Val Asp Gly Lys Lys Ser Ser Gly Thr Leu Thr 595 Glu Lys
AAC GGT GTA GAA CCT GCT TTC CGT ATT GAA AAC GGC GTG ATT GAG GGC 1938
Asn Gly Val Glu Pro Ala Phe Arg Ile Glu Asn Gly Val Ile Glu Gly
600 605 610
AAC GGT TTC CAT GCG ACA GCG CGC ACT CGG GAT GAC GGC ATC GAC CTT 1986
Asn Gly Phe His Ala Thr Ala Arg Thr Arg Asp Asp Gly Ile Asp Leu
615 620 625
TCC GGG CAG GGT TCG ACC AAA CCG CAG ATC TTC AAA GCT AAT GAT CTT 2034
Ser Gly Gln Gly Ser Thr Lys Pro Gln Ile Phe Lys Ala Asn Asp Leu
630 635 640 645
CGT GTA GAA GGA GGA TTT TAC GGC CCG AAG GCG GAG GAA TTG GGC GGT 2082
Arg Val Glu Gly Gly Phe Tyr Gly Pro Lys Ala Glu Glu Leu Gly Gly
650 655 660
ATT ATT TTC AAT AAT GAT GGG AAA TCT CTT GGT ATA ACT GAA GGT ACT 2130
Ile Ile Phe Asn Asn Asp Gly Lys Ser Leu Gly Ile Thr Glu Gly Thr
665 670 675
GAA AAT AAA GTT GAA GCT GAT GTT GAT GTT GAT GTT GAT GTT GAT GTT 2178
Glu Asn Lys Val Glu Ala Asp Val Asp Val Asp Val Asp Val Asp Val
680 685 690
GAT GCT GAT GCT GAT GTT GAA CAG TTA AAA CCT GAA GTT AAA CCC CAA 2226
Asp Ala Asp Ala Asp Val Glu Gln Leu Lys Pro Glu Val Lys Pro Gln
695 700 705
TTC GGC GTG GTA TTC GGT GCG AAG AAA GAT AAT AAA GAG GTG GAA AAA T 2275
Phe Gly Val Val Phe Gly Ala Lys Lys Asp Asn Lys GlU Val Glu Lys
710 715 720 725
GA
2277
PL 194 800 B1 (2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR:2:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 725 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (iii) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:
(A) ORGANIZM: Neisseria meningitidis szczep BNCV (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR:2:
Met Ί Cys Lys Pro Asn 5 Tvr Gly Gly Ile Val 10 Leu Leu Pro Leu Leu 15 Leu
τ, ί _ Cl Ser Cys Ile Gly Gly Asn Phe Gly Val Gin Pro Val Val Glu Ser
20 25 30
Thr Pro Thr Ala Tyr Pro Val Thr Phe Lys Ser Lys Asp Val Pro Thr
35 40 45
Pro Pro Pro Ala Lys Pro S°r Ile Glu Ile Thr Pro Val Asn Arg Pro
50 c c U -ś 60
Ala Val Gly Ala Ala Met Arg Leu Pro Arg Arg Asn Thr Ala Phe His
C 0 70 75 80
n m ' ± U Asp Gly Thr Glu -le Pro Asn Ser Lys Gin Ala Glu Glu Lys
85 90 95
Leu Ser Phe Gin Glu Gly Asp Val Leu Phe Leu Tyr Gly Ser Lys Gly
100 105 110
Asn Lys Leu Gin Gin Leu Lys Ser Glu Ile His Lys Arg Asp Ser Asp
115 120 125
Val Glu Ile Arg Thr Ser Glu Lys Glu Asn Lys Lys Tyr Asp Tyr Lys
130 135 140
Phe Val Asp Ala Gly Tyr Val Tyr Val Lys Gly Lys Asp Glu Ile Lys
145 150 155 160
Trp Thr Ser Asp Tyr Lys Gin Phe Ser Asn Arg Leu Gly Tyr Asp Gly
165 170 175
PL 194 800 Β1
Phe Val Tyr Tyr 180 Ser Gly Glu Arg Pro 185 Ser Gin Ser Leu Pro 190 Ser Ala
Gly Thr Val Glu Tyr Ser Gly Asn Trp Gin Tyr Met Thr Asp Ala Lys
195 200 205
Arg His Arg Ala Gly Lys Ala Val Gly Ile Asp Asn Leu Gly Tyr Tyr
210 215 220
Thr Phe Tyr Gly Asn Asp Val Gly Ala Thr Ser Tyr Ala Ala Lys Asp
22 5 230 235 240
Vai Asp Glu Arg Glu Lys His Pro Ala Lys Tyr Thr Val Asp Phe Gly
245 250 255
Asn Lys Thr Leu Thr Gly Glu Leu Ile Lys Asn Gin Tyr Val Lys Pro
260 2 65 270
Ser Glu Lys Gir. Lys Pro Leu Thr Ile Tyr Asn Ile Thr Ala Asp Leu
275 290 285
Asn Gly Asn Arg Phe Thr Gly Ser Al a Lys Val Asn Pro Asp Leu Ala
2 90 295 300
Lys Ser His Ala ASh Lys Glu His Leu Phe Phe His Ala Asp Ala Asp
305 310 315 320
G 1 n Arg Leu Glu Gly Gly Pne Phe Gly Asp Lys Gly Glu Glu Leu Ala
325 330 335
G1 y Arg Phe i 1 θ Ser Asn Asp Asn Ser Val Phe Gly Val Phe Ala Gly
340 345 350
Lys Gin A.sn Ser Pro Val Pro Ser ul y Lys His Thr Lys Ile Leu Asp
- = c 360 365
S £27 Leu Lys Ile Ser y a 1 Asp Giu Ala Ser Gly Giu Asn Pro Arg Pro
330 37 5 380
A.1 a Ile Ser Pro Met Pro Asp Phe Gly His Pro Asp Lys Leu Leu
365 390 395 400
Val Glu j-y His Glu Ile Pro Leu Val Ser Gin Glu Lys Thr Ile Glu
405 410 415
Leu Ala Asp Gly Arg Lys Met Thr Val Ser Ala Cys Cys Asp Phe Leu
4 20 425 430
Thr Tyr Val Lys Leu Gly Arg Ile Lys Thr Glu Arg Pro Ala Ala Lys
435 440 445
Pro Lys Ala Gir. Asp Glu Gru Asp Ser Asp Ile Asp Asn Gly Glu Glu
450 455 460
PL 194 800 B1
Ser Glu Asp Glu Ile Gly A.sp Glu Glu Glu Gly Thr Glu Asp Ala Ala
465 470 475 480
Al a Gly Asp Glu Gly Ser Glu Glu Asp Glu Ala Thr Glu Asn Glu Asp
485 490 495
Gly Glu Glu Asp Glu Ala Glu Glu Pro Glu Glu Glu Ser Ser Ala Glu
500 505 510
Gly Asn Gly Ser Ser Asn Ala Ile Leu Pro Val Pro Glu Ala Ser Lys
515 52C 525
Gly Arg Asp Ile Asp Leu Phe Leu Lys Gly Ile Arg Thr Ala Glu Thr
530 535 540
Asn Ile Pro Gln Thr Gly Giu Ala Arg Tyr Thr Gly Thr Trp Glu Ala
545 550 555 560
Arg Ile Gly Lys Pro Ile Gln Trp Asp Asn His Ala Asp Lys Glu Ala
565 570 575
Ala Lys Ala Val Phe Thr Val Asp Phe Gly Lys Lys Ser Ile Ser Gly
580 585 590
Thr Leu Thr 01 u Lys Asn Gly Val Glu Pro Ala Phe Arg Ile Glu Asn
595 600 605
Gly Val Ile Glu Gly Asn Gly Phe His Ala Thr Ala Arg Thr Arg Asp
610 615 620
Asp Gly Ile Asp Leu Ser Gly Gin Gly Ser Thr Lys Pro Gin Ile Phe
62 5 630 635 640
Lys Ala Asn Asp Leu Arg Val Glu Gly Gly Phe Tvr Gly Pro Lys Ala
645 650 655
Glu Glu Leu Gly Gly T s Ile Pne Asn Asn Asp Gly Lys Ser Leu Gly
660 665 670
Ile Thr Glu Gly Thr Glu Asn Lys Val Glu Ala Asp Val Asp Val Asp
675 680 685
Val Asp Val Asp Val A.sp Ala Asp Ala Asp Val Glu Gin Leu Lys Pro
690 695 700
Glu Val Lys Pro Gin Phe Gly Val Val Phe Gly Ala Lys Lys Asp Asn
705 710 715 720
Lys Glu Val Glu Lys
725
PL 194 800 B1 (2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR:3:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 2169 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (c) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:
(B) SZCZEP: Neisseria meningitidis szczep M981 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: sekwencja kodująca (B) LOKALIZACJA: 1... 2166 (C) INNE INFORMACJE:
(xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR:3:
ATG Met 1 TGT Cys AAA Lys CCG Pro AAT Asn 5 TAT Tyr GGC Gly GGC Gly ATT Ile GTC Val 10 TTG Leu TTG Leu CCC Pro TTA Leu CTT Leu 15 TTG Leu 48
GCA TCT TGC ATC GGC GGC AAT TTC GGC GTG CAG CCT GTT GTC GAA TCA 96
Ala Ser Cys Ile Gly Gly Asn Phe Gly Val Gin Pro Val Val Glu Ser
20 25 30
ACG CCG ACC GCG TAC CCC GTC ACT TTC AAG TCT AAG GAC GTT CCC ACT 144
Thr Pro Thr Ala Tyr Pro Val Thr Phe Lys Ser Lys Asp Val Pro Thr
35 40 45
TCG CCC CCT GCC GGG •pęn· TCG GTA GAA ACC ACG CCG GTC AAC CAG CCC 192
Ser Pro Pro Ala Gly Ser Ser Val Glu Thr Thr Pro Val Asn Gin Pro
50 55 60
GCC GTC GGT GCG GCA ATG CGG CTG TTG AGA CGG AAT ACT GCT TTT CAT 240
Ala Val Gly Ala Ala Met Arg Leu Leu Arg Arg Asn Thr Ala Phe His
65 70 75 80
CGT GAA GAT GGC ACG GCA ATT CCC GAT AGC AAA CAA GCA GAA GAA AAG 288
Arg Glu Asp Gly Thr Ala Ile Pro Asp Ser Lys Gin Ala Glu Glu Lys
PL 194 800 B1
CTG Leu TCG Ser TTT Phe AAA Lys 100 GAA GGT GAT GTT CTG Leu 105 TTT Phe TTA Leu TAC GGT TCA Ser 110 AAA Lys GAA du 336
du dy Asp Val Tyr dy
AAT AAA CTT CAA CAA CTT AAA AGC GAA ATT CAT AAA CGT AAT CCT GAG 384
Asn Lys Leu. dn dn Leu Lys Ser Glu Ile His Lys Arg Asn Pro du
115 120 125
GCA AGC ATT ACC ACA TCG GAA AAT GAA AAT AAA AAA TAT AAT TAT CGG 432
Ala Ser Ile Thr Thr Ser du Asn du Asn Lys Lys Tyr Asn Tyr Arg
130 135 140
TTT GTG AGT GCC GGT TAT GTG TTT ACT AAA AAC GGA AAA GAT GAA ATT 480
Phe Va 1 Ser Ala dy Tyr Val Phe Thr Lys Asn dy Lys Asp du Ile
145 150 155 160
GAG AAA ACA TCG GAT GAA AAG CAG TTT TCT AAT CGT TTA GGC TAT GAC 528
Glu Lys Thr Ser Asp Glu Lys dn Phe Ser Asn Arg Leu dy Tyr Asp
165 170 175
GGT TTT GTA TAT TAT CTC GGA GAA CAT CCT TCC CAA TCT TTA CCG AGC 576
Glv Phe Val Tyr Tyr Leu dy du His Pro Ser dn Ser Leu Pro Ser
180 185 190
GCG ACG ulu AAA TAT TCC GGG AAC TGG CAA TAT ATG ACC GAT GCC 624
Ala Gly Thr val Lys Tyr Ser dy Asn Trp dn Tyr Met Thr Asp Ala
195 200 205
ATA CGT CAT CGG AGA n /-mpr u c 1 AAG GGG GTT TCC AGT GTG GAT TTG GGT TAT 672
He Arg His Arg Arg Gly Lys dy Val Ser Ser Val Asp Leu dy Tyr
210 215 220
ACC ACA TAT TAT GGT AAT GAA ATT GGG GCA GCT TGT TAT GAG GCT AGG 72 0
Thr Thr yr Tyr dy Asn du He dy Ala Ala Ser Tyr du Ala Arg
225 230 235 240
GAT GCG GAT GGC CGG GAA AAA CAT CCT GCC GAA TAT ACG GTT AAT TTC 768
Asp Ala Asp dy Arg Glu Lys His Pro Ala du Tyr Thr Val Asn Phe
245 250 255
GAC AAA AAA AAC CTG GAA GGT AAG TTG ATT AAA AAT CAG TAT GTG CAA 816
Asp Lys Lys Asn Leu du dy Lys Leu Ile Lys Asn Gin Tyr Val dn
260 265 270
PL 194 800 B1
AAG Lys AGA GAT GAT ASp CCT Pro AAA Lys AAT Asn CCA CTG ACC Thr ATT He TAC Tyr AAC Asn 265 ATT ACC GCA B64
Arg ASp 275 Pro 280 Leu Ile Thr Ala
ACA TTG GAC GGC AAC CGC TTT ACC GGC AGT GCC AAA GTT AGC ACC GAG 912
Thr Leu Asp Gly Asn Arg Phe Thr Gly Ser Ala Lys Val Ser Thr Glu
290 295 300
GTG AAG ACG CAA CAC GCT GAT AAA GAA TAT TTG TTT TTC CAT ACC GAT 960
Val Lys Thr Gin His Ala Asp Lys Glu Tyr Leu Phe Phe His Thr Asp
305 310 315 320
GCC GAT CAG CGG CTT GAG GGC GGT TTT TTC GGC GAT AAC GGA GAA GAG 100Θ
Ala Asp Gin Arg Leu Glu Gly Gly Phe Phe Gly Asp Asn Gly Glu Glu
325 330 335
CTT GCC GGG CGG TTT ATC AGT AAC GAC AAC AGC GTA TTC GGC GTG TTC 1056
Leu Ala Gly Arg Phe Ile Ser Asn Asp Asn Ser Val Phe Gly Val Phe
340 345 350
GCA GGC AAA CAA AAA ACA GAG ACA GCA AAC GCA TCA GAT ACA AAT CCT 1104
Ala Gly Lys Gin Lys Thr Glu Thr Ala Asn Ala Ser Asp Thr Asn Pro
355 360 365
GCC CTG CCG TCT GGA AAA CAC ACC AAA ATC TTG GAT TCT CTA AAA ATT 1152
Ala Leu Pro Ser Gly Lys His Thr Lys Ile Leu ^p Ser Leu Lys Ile
370 375 380
TCC GTT GAC GAG GCG ACT GAT GAC CAT GCC CGT AAG TTT GCC ATT TCC 1200
Ser Val Asp Glu Ala Thr Asp Asp His Ala Arg Lys Phe Ala Ile Ser
3S5 390 395 400
ACT ATG CCC GAT TTT GGT CAT CCC GAC AAA CTT CTT GTC GAA GGG CGT 1248
Thr Met Pro Asp Phe Gly His Pro ^p Lys Leu Leu Val Glu Gly Arg
405 410 415
GAA ATT CCT TTG GTT AGC CAA GAG AAA ACC ATC GAG CTT GCC GAC GGC 1296
Glu Ile Pro Leu Val Ser Gin Glu Lys Thr Ile Glu Leu Ala Asp Gly
420 42S 430
PL 194 800 B1
PL 194 800 Β1
TAT Tyr GCG AAT CAA GCG Gln Ala GCA Ala AAA Lys 615 GCA Ala GAA Glu TTT Phe GAC Asp GTT Val 620 GAT Asp TTT Phe GGT Gly GCG Ala 1872
Ala 610 Asn
AAG TCG CTT TCA GGT AAG TTG ACA GAA AAA AAT GAT ACA CAC CCC GCT 1320
Lys Ser Leu Ser Gly Lys Leu Thr Glu Lys Asn Asp Thr His Pro Ala
625 630 635 640
TTT TAT ATT GAA AAA GGT GTG ATT GAT GGC AAC GGT TTC CAC GCT TTG 1968
Phe Tyr Ile Glu Lys Gly Val Ile Asp Gly Asn Gly Phe His Ala Leu
645 650 655
GCG CGT ACT CGT GAA AAT GGT GTT GAT TTG TCT GGG CAA GGT TCG ACT 2016
Ala Arg Thr Arg Glu Asn Gly Val Asp Leu Ser Gly Gln Gly Ser Thr
660 665 670
AAT CGC CAA AGT TTT AAA GCC AGT AAT CTT CTC GTA GAA GGA GGA TTT 2064
Asn Pro Gln Ser Phe Lys Ala Ser Asn Leu Leu Val Glu Gly Gly Phe
675 680 685
TAT GGT CCG CAG GCG GCA GAG TTG GGT GGT AAT ATT ATC GAC AGT GAC 2112
Tyr Gly Pro Gln Ala Ala Glu Leu Gly Gly Asn Ile Ile Asp Ser Asp
690 695 700
CGG AAA ATC GGC GTG GTA i GCG AAG AAA GAT ATG CAG GAG GTG 2160
Arg Lys Ile Gly Val Val Phe Gly Ala Lys Lys Asp Met Gln Glu Val
705 710 715 720
GAA AAA TGA Glu Lys
2169
PL 194 800 Β1 (2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR:4:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 722 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (iii) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:
(A) ORGANIZM: Neisseria meningitidis szczep M981 (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR:4:
Met Cys 1
Ala Ser
Thr Pro
Ser Pro
A.1 a Val 55
Arg Glu
Leu Ser
Asn Lys
Ala Ser
130 Phe Val 145
Glu Lys
Gly Phe
Ala Gly
Ile Arg
210
Lys Pro
Cys Ile 20
Thr Ala 35
Pro Ala
Gly Ala
Asp Gly
Phe Lys 100
Leu Gln 115
Ile Thr
Ser Ala
Thr Ser
Val Tyr 180
Thr Val 195
His Arg
Asn 5 Tyr
Gly Gly
Tyr Pro
Gly Ser
Ala Met 70
Thr 85 Ala
Glu Gly
Gln Leu
Thr Ser
Gly Tyr 150
Asp 165 Glu
Tyr Leu
Lys Tyr
Arg Gly
Gly Gly
Asn Phe
Val Thr 40
Ser Val 55
Arg Leu
Ile Pro
Asp Val
Lys Ser 120
Glu Asn
135
Val Phe
Lys Gln
Gly Glu
Ser Gly 200
Lys Gly 215
Ile Val 10
Gly Val 25
Phe Lys
Glu Thr
Leu Arg
Asp Ser 90
Leu Phe 105
Glu Ile
Glu Asn
Thr Lys
Phe Ser
170
His Pro
185
Asn Trp
Val Ser
Leu Leu
Gln Pro
Ser Lys
Thr Pro 60
Arg Asn 75
Lys Gln
Leu Tyr
His Lys
Lys Lys 140
Asn Gly 155
Asn Arg
Ser Gln
Gln Tyr
Ser Val
Pro Leu
Val Val
Asp Val 45
Val Asn
Thr Ala
Ala Glu
Gly Ser
110 Arg Asn 125
Tyr Asn
Lys Asp
Leu Gly
Ser Leu
190 Met Thr 205
Asp Leu
Leu Leu
Glu Ser
Pro Thr Gln Pro
Phe His 80
Glu 95 Lys
Lys Glu
Pro Glu
Tyr Arg
Glu Ile 160
Tyr 175 Asp
Pro Ser
Asp Ala
Gly Tyr
220
PL 194 800 B1
Thr Thr Tyr Tyr Gly Asn Glu Ile Gly Ala Ala Ser Tyr Glu ALa Arg
225 230 235 240
Asp Ala Asp Gly Arg Glu Lys His Pro Ala Glu Tyr Thr Val Asn Phe
245 250 255
Asp Lvs Lys Asn Leu Glu Gly Lys Leu Ile Lys Asn Gin Tyr Val Gin
260 265 270
Lys Arg Asp Asp Pro Lys Asn Pro Leu Thr Ile Tyr Asn He Thr Ala
275 280 285
Thr Leu Asp Gly Asn Arg Phe Thr Gly Ser Ala Lys Val Ser Thr GLu
290 295 300
Val Lys Thr Gin His Ala Asp Lys Glu Tyr Leu Phe Phe His Thr Asp
305 310 315 320
Ala Asp Gin Arg Leu Glu Gly Gly Phe Phe Gly Asp Asn Gly GLu Glu
325 330 335
Leu Al a Gly Arg Phe Ile Ser Asn Asp Asn Ser Val Phe Gly Val Phe
340 345 350
Ala Gly Lys Gin Lys Thr Glu Thr Ala Asn Ala Ser Asp Thr Asn Pro
355 360 365
Ala Leu Pro Ser Gly Lys His Thr Lys He Leu Asp Ser Leu Lys Ile
370 375 380
Ser Val Asp Glu Ala Thr Asp Asp His Ala Arg Lys Phe Ala Ile Ser
385 390 395 400
Thr Met Pro Asp Phe Gly His Pro Asp Lys Leu Leu Val Glu Gly Arg
405 410 415
Glu He Pro Leu Val Ser Gin GLu Lys Thr Ile Glu Leu Ala Asp Gly
420 425 430
Arg Lvs Met Thr He Arg Ala Cys Cys Asp Phe Leu Thr Tyr Val Lys
435 440 445
Leu Gly Arg Ile Lys Thr Asp Arg Pro Ala Val Lys Pro Lys Ala Gin
450 455 460
Asp Glu Glu Asp Ser Asp He Asp Asn Gly Glu Glu Ser Glu Asp Glu
465 470 475 480
Ile Ser Glu Asp Asp Asn Gly Glu Asp Glu Val Thr Glu GLu Glu Glu
485 490 495
Ala Glu Glu Thr Glu Glu Glu Thr ASp Glu Asp Glu Glu Glu Glu Pro
500 505 510
Glu Glu Thr Glu Glu Thr Glu Glu Thr Glu Glu Thr Glu GLu Thr Glu
515 520 525
Glu Thr Glu Glu Lys Ser Pro Thr Glu Glu Gly Asn Gly Gly Ser Gly
530 535 540
Ser Ile Leu Pro Thr Pro Glu Ala Ser Lys Gly Arg Asp Ile Asp Leu
545 550 555 560
PL 194 800 B1
Phe Leu Lys Gly Ile 565 Arg Thr Ala Glu Ala Asp 570 Ile Pro Gin Ile 575 Gly
Lys Ala Arg Tyr Thr Gly Thr Trp Glu Ala Arg Ile Gly Val Pro Asp
580 585 590
Lys Lys Gly Glu Gin Leu Asp Gly Thr Thr Ser Ile Gin Lys Asp Ser
595 600 605
Tyr Ala Asn Gin Ala Ala Lys Ala Glu Phe Asp Val Asp Phe Gly Ala
610 615 620
Lys Ser Leu Ser Gly Lys Leu Thr Glu Lys Asn Asp Thr His Pro AL a
625 630 635 640
Phe Tyr Ile Glu Lys Gly Val Ile Asp Gly Asn Gly Phe His Ala Leu
645 650 655
Ala Arg Thr Arg Glu Asn Gly Val Asp Leu Ser Gly Gin Gly Ser Thr
660 665 670
Asn Pro Gin Ser Phe Lys Ala Ser Asn Leu Leu Val Glu Gly Gly Phe
675 680 685
Tyr Gly Pro Gin Ala Ala Glu Leu Gly Gly Asn Ile Ile Asp Ser Asp
690 695 700
Arg Lys Ile Gly Val Val Phe Gly Ala Lys Lys Asp Met Gin Glu Val
705 710 715 720
Glu Lys
PL 194 800 B1 (2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR:5:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 2226 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:
(B) SZCZEP: Neisseria meningitidis szczep H44/76 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: sekwencja kodująca (B) LOKALIZACJA: 1...2223 (C) INNE INFORMACJE:
(xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR:5:
ATG Met 1 TGT Cvs AAA Lys CCG Pro AAT Asn 5 TAT Tvr GGC Gly GGC Gly ATT Ile GTC Val 10 TTG Leu TTG Leu CCC Pro TTA Leu CTT Leu 15 TTG Leu 48
GCA TGT TGT ATT GGC GGC AAT TTC GGC GTG CAG CCT GTT GTC GAA TCA 96
Ala Ser Cys Ile Gly Gly Asn Phe Gly Val Gin Pro Val Val Glu Ser
20 25 30
ACG CCG ACC GCG TAC CCC GTC ACT TTC AAG TCT AAG GAC GTT CCC ACT 144
Thr Pro Thr Ala Tyr Pro Val Thr Phe Lys Ser Lys Asp Val Pro Thr
35 40 45
CCG CCC CCT GCC AAA CCT TCT ATA GAA ACC ACG CCG GTG CCG TCA ACC 192
Pro Pro Pro Ala Lys Pro Ser Ile Glu Thr Thr Pro Val Pro Ser Thr
50 55 60
GGG CCT GCC GTC GGT GCG GCA ATG CGG CTG TTG AGG CGG ATT TTC GCA 240
Gly Pro Ala Val Gly Ala Ala Met Arg Leu Leu Arg Arg Ile Phe Ala
65 70 75 80
ACT TCT GAT AAG GTT GGC AAT GAT TTT CCA AAT AGC AAA CAA GCA GAA 288
Thr Ser Asp Lys Val Gly Asn Asp Phe Pro Asn Ser Lys Gin ALa Glu
PL 194 800 B1
GAA du AAG Lys CTG Leu TCG Ser 100 TTT Phe AAA Lys GAA GGT GAT Asp 105 GTT CTG TTT TTA TAC GGT dy TCA Ser 336
Glu dy Val Leu Phe Leu Tyr 110
AAA AAA GAT AAA CTT CAG TGG CTT AAG GAT AAA ATT CAT CAA CGC AAT 394
Lys Lys Asp Lys Leu Gin Trp Leu Lys Asp Lys Ile His dn Arg Asn
115 120 125
CCT AAT GTA GAA ATT AGG ACA TCA GAA AAT GAA AAT AAA AAA TAT GGT 432
Pro Asn Val Glu Ile Arg Thr Ser GLu Asn du Asn Lys Lys Tyr dy
130 135 140
TAT GAA TTT GTG GAT GCC GGT TAT GTA TAT ACT AAA AAC GGA AGA GAT 480
Tyr Glu Phe Val Asp Ala Gly Tyr Val Tyr Thr Lys Asn dy Thr Asp
145 150 155 160
GAA ATT GAG TGG ACT TCA AAT CCC AAG CAG TTT TCT AAT CGT TTT GGC 528
Glu ile Glu Trp Thr Ser Asn Arg Lys Gin Phe Ser Asn Arg Phe dy
165 170 175
TAC GAC GGT TTT GTA TAT TAT TCC GGA GAA CAT CCT TCC CAA TCT TTA 576
Tyr Asp Gly Phe Val Tyr Tyr Ser dy du His Pro Ser dn Ser Leu
1B0 IBS 190
CCG AGC GCG GGA ACG GTG CAA TAT TCC GGT AAC TGG CAA TAT ATG ACC 624
Pro Ser Ala dy Thr val Gin Tvr Ser Gly Asn Trp dn Tyr Mer Thr
195 200 205
GAT GCC ATA CGT CAT CGA ACA GGA AAA GCA GGA GAT CCT AGC GAA GAT 672
ASp Ala Ile Arg His Arg Thr GLy Lys Ala dy Asp Pro Ser Glu Asp
210 215 220
TTG GGT TAT CTG GTT TAT TAC GGT CAA AAT GTC GGA GCA ACT TCT TAT 720
Leu Gly Tyr Leu Val Tyr Tyr Gly dn Asn Val dy ALa Thr Ser Tyr
225 230 235 240
GCT GCG ACT GCC GAC GAC CGG GAG GGA AAA CAT CCT GCC GAA TAT ACG 768
Ala Ala Thr Ala Asp Asp Arg Glu dy Lys His Pro ALa du Tyr Thr
245 250 255
GTT GAT TTC GAT AAG AAA ACT TTG ACG GGT CAA TTA ATT AAA AAT CAG 816
Val Asp Phe Asp Lys Lys Thr Leu Thr dy dn Leu Ile Lys Asn dn
260 265 270
PL 194 800 B1
ΤΑΤ Tyr GTG Val CAA AAG AAA Lys ACC Thr GAT Asp GAA Glu 280 AAG Lys AAA Lys CCA Pro CTG Leu ACC Thr 285 ATT Ile TAC Tyr GAC Asp 864
Gln 275 Lys
ATT ACC GCA ACA TTG GAC GGC AAC CGC TTT ACC GGC AGT GCC AAA GTT 912
Ile Thr ALa Thr Leu Asp Gly Asn Arg Phe Thr Gly Ser Ala Lys Val
290 295 300
AAC ACC GAG TTG AAG ACG AGC CAC GCT GAT AAA GAG CAT TTG TTT TTC 950
Asn Thr Glu Leu Lys Thr Ser His Ala Asp Lys Glu His Leu Phe Phe
305 310 315 320
CAT ACC GAT GCC GAT CAG CGG CTT GAG GGC GGT TTT TTC GGC GAT AAG 1008
His Thr Asp Ala Asp Gln Arg Leu Glu Gly Gly Phe Phe Gly Asp Lys
325 330 335
GGG GAA GAG CTT GCC GGA CGG TTT ATC AGC AAC GAC AAC AGC GTA TTC 1055
Gly Glu Glu Leu Ala Gly Arg Phe He Ser Asn. Asp Asn Ser Val Phe
340 345 350
GGC GTA TTC GCA GGC AAA AAA ACA AAC GCA TCA AAC GCA GCA GAT ACA 1104
Gly Val Phe Ala Gly Lys Lys Thr Asn Ala Ser Asr. Ala Ala Asp Thr
355 350 355
AAT CCT GCT ATG CCG TCT GAA AAA CAC ACC AAA ATC TTG GAT TCT CTG 1152
Asn Pro Ala Met Pro Ser Glu Lys His Thr Lys Ile Leu Asp Ser Leu
370 375 380
AAA ATT TCC GTT GAC GAG GCG ACG GAT AAA AAT GCC CGC CCG TTT GCC 1200
Lys Ile Ser Val Asp Glu Ala Thr Asp Lys Asn Ala Arg Pro Phe ALa
385 3 90 395 400
ATT TCZC CCT CTG CCC GAT TTT GGC CAT CCC GAC AAA CTC CTT GTC GAA 1248
Ile Ser Pro Leu Pro Asp Phe Gly His Pro Asp Lys Leu Leu Val Glu
405 410 415
GGG CGT GAA ATT CCT TTG GTT AGC CAA. GAG AAA ACC ATC GAG CTT GCC 1296
Gly Arg Glu Ile Pro Leu Val Ser Gln Glu Lys Thr Ile Glu Leu Ala
420
425
430
PL 194 800 Β1
GAC GGC AGG AAA Asp Gly Arg Lys ATG Met ACC Thr GTC CGT GCT TGT Cys TGC Cys GAT TTT CTG ACC TAT 1344
Val Arg 440 Ala Asp Phe 445 Leu Thr Tyr
435
GTG AAA CTC GGA CGG ATA AAA ACT GAC CGC CCA GCA AGT AAA CCA AAG 1392
Val Lys Leu Gly Arg Ile Lys Thr Asp Arg Pro Ala Ser Lys Pro Lys
450 455 460
GCG GAA GAT AAA GGG AAG GAT GAA GAG GAT ACA GGC GTT GGT AAC GAC 1440
Ala Glu Asp Lys Gly Lys Asp Glu Glu Asp Thr Gly Val Gly Asn Asp
465 470 475 480
GAA GAA GGC ACG GAA GAT GAA GCC GCA GAA GGC AGC GAA GGA GGC GAA 1488
Glu Glu Gly Thr Glu Asp Glu Ala Ala Glu Gly Ser Glu Gly Gly Glu
485 490 495
GAC GAA ATC GGC GAT GAA GGA GGA GGT GCG GAA GAC GAA GCC GCA GAA 1536
Asp Glu Ile Gly Asp Glu Gly Gly Gly Ala Glu Asp Glu Ala Ala Glu
500 505 510
AAC GAA GGC GGC GAA GAA GAC GAA GCT GAA GAA CCT GAA GAA CCC GAA 1584
Asn Glu Gly Gly Glu Glu Asp Glu Ala Glu Glu Pro Glu Glu Pro Glu
515 520 525
GAA GAA TCG CCG GCA GAA GGC GGC GGT GGT GGT TCA GAC GGC ATC CTG 1632
Glu Glu Ser Pro Ala Glu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Asp Gly Ile Leu
530 535 540
CCC GCT CCG GAA GCT CCT AAA GGC AGG GAT ATC GAC CTT TTC CTG AAA 1680
Pro Ala Pro Glu Ala Pro Lys Gly Arg Asp Ile Asp Leu Phe Leu Lys
545 550 555 560
GGT ATC CGC ACG GCG GAA GCC GAC ATT CCG CAA ACT GGA AAA GCA CGC 1728
Gly Ile Arg Thr Ala Glu Ala Asp Ile Pro Gin Thr Gly Lys Ala Arg
565 570 575
TAT ACC GGC ACT TGG GAA GCG CGT ATC AGC AAA CCC ATT CAA TGG GAC 1776
Tyr Thr Gly Thr Trp Glu Ala Arg Ile Ser Lys Pro Ile Gin Trp Asp
580 585 590
AAT CAT GCG GAT AAA AAA GCG GCA AAA GCA GAA TTT GAC GTT GAT TTC 1824
Asn His Ala Asp Lys Lys Ala Ala Lys Ala Glu Phe Asp Val Asp Phe
595 600 605
PL 194 800 B1
GGC Gly GAG Glu 610 AAA Lys TCG Ser ATT He TCC Ser GGA Gly 615 ACG Thr CTG Leu ACG Thr GAG Glu AAA Lys 620 AAC Asn GGT Gly GTA Val CAA Gln 1872
CCT GCT ttc CAT ATT GAA AAC GGC GTG ATT GAG GGC AAT GGT TTC CAC 1920
Pro Ala Phe His Ile Glu Asn Gly Val Ile Glu Gly Asn Gly Phe His
625 630 635 640
GCG ACA GCG CGC ACT CGG GAT AAC GGC ATC AAT CTT TCG GGA AAT GAT 1968
A-i a Thr Ala Arg Thr Arg Asp Asn Gly Ile Asn Leu Ser Gly Asn Asp
645 650 655
TCG ACT AAT CCT CCA AGT TTC AAA GCC AAT AAT CTT CTT GTA ACA GGC 2016
Ser Thr Asn Pro Pro Ser Phe Lys Ala Asn Asn Leu Leu Val Thr Gly
660 665 670
GGC TTT TAC GGC CCG CAG GCG GAG GAA TTG GGC GGT ACT ATT TTC AAT 2064
Gly Phe Tyr Gly Pro Gln Ala Glu Glu Leu Gly Gly Thr Ile Phe Asn
675 680 6B5
AAT GAT GGG AAA TCT CTT GGT ATA ACT GAA GAT ACT GAA AAT GAA GCT 2112
Asn Asp Gly Lys Ser Leu Gly Ile Thr Glu Asp Thr Glu Asn Glu Ala
690 695 700
GAA GCT GAA GTT GAA AAT GAA GCT GGT GTT GGC GAA CAG TTA AAA CCT 2160
Glu Ala Glu Val Glu Asn Glu Ala Gly Val Gly Glu Gln Leu Lys Pro
705 710 715 720
GAA GCT AAA CCC CAA TTC GGC GTG GTA TTC GGT GCG AAG AAA GAT AAT 2208
Glu Ala Lys Pro Gln Phe Gly Val Val Phe Gly Ala Lys Lys Asp Asn
725 730 735
AAA GAG GTG GAA AAA TGA 2226
Lys Glu Val Glu Lys
740
PL 194 800 Β1 (2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR:6:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 741 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (iii) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:
(A) ORGANIZM: Neisseria meningitidis szczep H44/76 (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR:6:
Met Cys Lys Pro Asn Tyr Gly Gly Ile Val Leu Leu Pro Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ala Ser Cys Ile Gly Gly Asn Phe Gly Val Gln Pro Val Val Glu Ser
20 25 30
Thr Pro Thr Ala Tyr Pro Val Thr Phe Lys Ser Lys Asp Val Pro Thr
35 40 45
Pro Pro Pro Ala Lys Pro Ser Ile Glu Thr Thr Pro Val Pro Ser Thr
50 55 60
Gly Pro Ala Val Gly Ala Ala Met Arg Leu Leu Arg Arg Ile Phe Ala
55 70 75 80
Thr Ser Asp Lys Val Gly Asn Asp Phe Pro Asn Ser Lys Gln Ala Glu
85 90 95
Glu Lys Leu Ser Phe Lys Glu Gly Asp Val Leu Phe Leu Tyr Gly Ser
100 105 110
Lys Lys Asp Lys Leu Gln Trp Leu Lys Asp Lys Ile His Gln Arg Asn
115 120 125
Pro Asn Val Glu Ile Arg Thr Ser Glu Asn Glu Asn Lys Lys Tyr Gly
130 135 140
Tyr Glu Phe Val Asp Ala Gly Tyr Val Tyr Thr Lys Asn Gly Thr Asp
145 150 155 160
Glu Ile Glu Trp Thr Ser Asn Arg Lys Gln Phe Ser Asn Arg Phe Gly
165 170 175
Tyr Asp Gly Phe Val Tyr Tyr Ser Gly Glu His Pro Ser Gln Ser Leu
180 185 190
Pro Ser Ala Gly Thr Val Gln Tyr Ser Gly Asn Trp Gln Tyr Met Thr
195 200 205
Asp Ala Ile Arg His Arg Thr Gly Lys Ala Gly Asp Pro Ser Glu Asp
210 215 220
PL 194 800 B1
Leu Gly Tyr Leu Val Tyr Tyr Gly Gln Asn Val GLy AL a Thr Ser Tyr
225 230 235 240
Ala Ala Thr Ala ASp Asp Arg Glu GLy Lys His Pro Ala Glu Tyr Thr
245 250 255
Val Asp Phe Asp Lys Lys Thr Leu Thr Gly Gln Leu Ile Lys Asn Gln
260 265 270
Tyr Val GLn Lys Lys Thr Asp Glu Lys Lys Pro Leu Thr Ile Tyr Asp
275 280 235
Ile Thr Ala Thr Leu Asp Gly Asn Arg Phe Thr Gly Ser Ala Lys Val
290 295 300
Asn Thr Glu Leu Lys Thr Ser His Ala Asp Lys Glu His Leu Phe Phe
305 310 315 320
His Thr Asp Ala Asp Gin Arg Leu Glu Gly Gly Phe Phe Gly Asp Lys
325 330 335
Gly Glu Glu Leu Ala GLy Arg Phe Ile Ser Asn Asp Asn Ser Val Phe
340 345 350
Gly Val Phe Ala Gly Lys Lys Thr Asn Ala Ser Asn Ala Ala Asp Thr
355 360 365
Asn Pro Ala Met Pro Ser Glu Lys His Thr Lys Ile Leu Asp Ser Leu
370 375 380
Lys Ile Ser Val Asp Glu Ala Thr Asp Lvs Asn Ala Arg Pro Phe Ala
305 390 395 400
Ile Ser Pro Leu Pro Asp Phe GLy His Pro Asp Lys Leu Leu Val Glu
405 410 415
Gly Arg Glu He Pro Leu Val Ser Gln Glu Lys Thr Ile Glu Leu Ala
420 425 430
Asp Gly Arg Lys Met Thr Val Arg Ala Cys Cys Asp Phe Leu Thr Tyr
435 44 0 445
Val Lys Leu Gly Arg Ile Lys Thr Asp Arg Pro Ala Ser Lys Pro Lys
450 455 460
Ala Glu Asp Lys Gly Lys Asp Glu GLu Asp Thr Gly Val Gly Asn Asp
465 470 475 480
Glu Glu Gly Thr Glu Asp GLu Ala Ala Glu Gly Ser Glu Gly Gly Glu
405 490 495
Asp Glu Ile Gly Asp Glu GLy GLy Gly Ala Glu Asp Glu Ala Ala Glu
500 505 510
Asn Glu Gly Gly GLu Glu Asp Glu Ala Glu Glu Pro Glu Glu Pro Glu
515 520 525
Glu Glu Ser Pro Ala Glu Gly Gly GLy Gly Gly Ser Asp Gly Ile Leu
530 535 540
Pro Ala Pro Glu Ala Pro Lys GLy Arg Asp Ile Asp Leu Phe Leu Lys
545 550 555 560
PL 194 800 B1
Gly Ile Arg Thr Ala 565 Glu Ala Asp Ile Pro Gin Thr Gly Lys Ala Arg
570 575
Tyr Thr Gly Thr Trp Glu Ala Arg Ile Ser Lys Pro Ile Gin Trp Asp
580 585 590
Asn His Ala Asp Lys Lys Ala Ala Lys Ala Glu Phe Asp Val Asp Phe
595 600 605
Gly Glu Lys Ser Ile Ser Gly Thr Leu Thr Glu Lys Asn Gly Val Gin
610 615 620
Pro Ala Phe His Ile Glu Asn Gly Val Ile Glu Gly Asn Gly Phe His
625 630 635 640
Ala Thr Ala Arg Thr Arg Asp Asn Gly Ile Asn Leu Ser Gly Asn Asp
645 650 655
Ser Thr Asn Pro Pro Ser Phe Lys Ala Asn Asn Leu Leu Val Thr Gly
660 665 670
Gly Phe Tyr Gly Pro Gin Ala GLu Glu Leu Gly Gly Thr Ile Phe Asn
675 680 685
Asn Asp Gly Lys Ser Leu Gly Ile Thr Glu Asp Thr Glu Asn Glu Ala
690 695 700
Glu Ala Glu Val Glu Asn Glu Ala Gly Val Gly Glu Gin Leu Lys Pro
705 710 715 720
Glu Ala Lys Pro Gin Phe Gly Val Val Phe Gly Ala Lys Lys Asp Asn
725 730 735
Lys Glu Val Glu Lys
740
(2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR:7:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 2262 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:
(B) SZCZEP: Neisseria meningitidis szczep M990 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: sekwencja kodująca (B) LOKALIZACJA: 1...2259 (C) INNE INFORMACJE:
(xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR:7:
PL 194 800 B1
ATG TGT AAA CCG AAT TAT GGC GGC ATT
Met 1 Cys Lys Pro Asn 5 Tyr Gly Gly Ile
GCA TCT TGT ATC GGC GGC AAT TTC GGC
Ala Ser Cys Ile 20 Gly Gly Asn Phe Gly 25
ACG CCG ACC GCG CCA ACT CTG TCA GAT
Thr Pro Thr 35 Ala Pro Thr Leu Ser 40 Asp
GAT AAG CCT GCT CCA GCT CCT GCC GAG
Asp Lys 5C Pro Ala Pro Ala Pro 55 Ala Glu
GTC AAG CGG CCC GCC GTC GGT GCG GCA
Val 6 5 Lys Arg Pro Ala Val 70 Gly Ala Ala
ATC GCA ACT TTT GAT AAA AAT GGT AAT
Ile Ala Thr Phe Asp 85 Lys Asn Gly Asn
gca GAG GAG TAT CTG CCG CTC AAA GAG
Ala Glu Glu Tyr 100 Leu Pro Leu Lys Glu 105
GGT ACG CCG AAA GAA CAG GCT GAC AAA
G-y Thr Pro 115 Lys Glu Gin Ala Asp 120 Lys
CGG CAT CCT AAT GCA CCA ATC TAC ACG
Arg His 130 Pro Asn Ala Pro Ile 135 Tyr Thr
TAT CAA TAT AAA TAT GTC CGG GCC GGA
Tyr 145 Gin Tyr Lys Tyr Val 150 Arg Ala Gly
GTC TTG TTG CCC TTA CTT TTA 48
Val Leu Leu Pro Leu Leu Leu
10 15
GTA Val CAG Gin CCT Pro GTT Val GTC Val 30 GAA Glu TCA Ser 96
TCC AAA TCT TCC AAT CCT GCG 144
Ser Lys Ser Ser 45 Asn Pro Ala
CCT TCG GTA GAA ATC ACG CCG 192
Pro Ser Val 60 Glu Ile Thr Pro
ATG CGG CTG CCA AGG CGG AAT 240
Met Arg 75 Leu Pro Arg Arg Asn 80
GAA ATT CCC AAT AGT AAG CAG 288
Glu 90 Ile Pro Asn Ser Lys 95 Gin
AAG GAT ATC CTG TTT TTA GAC 336
Lys Asp Ile Leu Phe 110 Leu Asp
CTT AAA AAG GAA ATC AAC GGA 384
Leu Lys Lys Glu 125 Ile Asn Gly
TCC GAT TTA AAA GAT GAT GCG 432
Ser Asp Leu 140 Lys Asp Asp Ala
TAT GTT TAT ACT AGA TAT GGA 480
Tyr Val 155 Tyr Thr Arg Tyr Gly 160
PL 194 800 Β1
ACA Thr GAT Asp GAA ATC GAA Glu 165 CAG Gin AAC Asn TCA Ser GGC Gly GGT Gly 170 AAG Lys CGG Arg GTT Val ACC Thr CAC His 175 CGC Arg 528
Glu Ile
TTA GGT TAT GAC GGT TTT GTA TAT TAT TCC GGA GAA CGT CCT TCC CAA 576
Leu Gly Tyr Asp Gly Phe Val Tyr Tyr Ser Gly Glu Arg Pro Ser Gin
180 185 190
TCT TTA CCG AGT GCG GGA ACG GTG GAA TAT TCT GGT AAC TGG CAA TAT 624
Ser Leu Pro Ser Ala Gly Thr Val Glu Tyr Ser Gly Asn Trp Gin Tyr
195 200 205
ATG ACC GAT GCC AAA CGT CAT CGA GCA GGT CAG GCG GTT GGC ATT GAC 672
Met. Thr Asp Ala Lys Aro His Arg Ala Gly Gin Ala Val Gly Ile Asp
210 215 220
AAT TTG GGT TAT ATC ACA TTT TAT GGT AAC GAT GTT GGT GCA ACT TCT 720
Asn Leu Gly Tyr Ile Thr Phe Tyr Gly Asn Asp Vai Gly Ala Thr Ser
225 230 235 240
TAT GCG GCT AAG GAT GTC GAC GAA AGG GAA AAG CAT CCT GCC AAA TAT 768
Tyr Ala Ala Lys Asp Val Asp Glu Arg Glu Lys His Pro Ala Lys Tyr
245 250 255
ACG GTT GAT TTT GAT AAC AAA ACC ATG AAT GGC AAG CTG ATT AAA AAT 816
Thr Val Asp Phe Asp Asn Lys Thr Met Asn Gly Lys Leu ile Lys Asn
260 265 270
CAG TAT GTG CGA AAT AAA AAA GAT GAA CCC AAA AAA CCG CTG ACC ATT 864
Gin Tyr Val Arg Asn Lys Lys Asp Glu Pro Lys Lys Pro Leu Thr Ile
275 280 285
TAC GAC ATT ACT GCA AAA TTG GAC GGC AAC CGC TTT ACC GGC AGT GCC 912
Tyr Asp Ile Thr Ala Lys Leu Asp Gly Asn Arg Phe Thr Gly Ser Ala
290 295 300
AAG GTC AAT CCT GAT TTA GCG AAA AAC CTT GCC GGT AAT GAG CGT TTG 960
Lys Val Asn Pro Asp Leu Ala Lys Asn Leu Ala Gly Asn Glu Arg Leu
305 310 315 320
TTT TTC CAT GCC GAT GCC GAT CAG CGG CTT GAG GGC GGT TTT TTC GGC 1008
Phe Phe His Ala Asp Ala Asp Gin Arg Leu Glu Gly Gly Phe Phe Gly
325 330 335
PL 194 800 B1
GAT AAC Asp Asn GGA GAA GAG Glu CTT Leu GCC Ala GGA CGG TTT Phe ATC Ile AGC AAC GAC AAC AGC 1056
Gly Glu 340 Gly Arg 345 Ser Asn Asp 350 Asn Ser
GTA TTC GGC GTA TTC GCA GGC AAA AAA ACA GAG ACA GCA AAC GCA GCA 1104
Val Phe Gly Val Phe Ala Gly Lys Lys Thr Glu Thr Ala Asn Ala Ala
355 360 365
GAT ACA AAA CCT GCC CTG CCG TCT GGA AAA CAC ACC AAA ATC TTG GAT 1152
Asp Thr Lys Pro Ala Leu Pro Ser Gly Lys His Thr Lys Ile Leu Asp
370 375 380
TCT CTA AAA ATT TCC GTT GAC GAG GCG ACT GAT GGC CAT GCC CGT AAG 1200
Ser Leu Lys Ile Ser Val Asp GLu Ala Thr Asp GLy His Ala Arg Lys
385 390 395 400
TTT GCC ATT TCC TCT ATG CCC GAT TTT GGT CAT CCC GAC AAA CTT CTT 1248
Phe Ala Ile Ser Ser Met Pro Asp Phe Gly Kis Pro Asp Lys Leu Leu
405 410 415
GTC GAA GGG CGT GAA ATT CCT TTG GTA AAC GAA GAA CAA ATC ATC AAG 1296
Val Glu GLy Arg GLu Ile Pro Leu Val Asn Glu Glu Gin Ile Ile Lys
420 425 430
CTT GCC GAC GGC AGG AAA ATG ACC GTC CGT GCT TGT TGC GAC TTT TTG 1344
Leu Ala Asp Gly Arg Lys Met Thr Val Arg Ala Cys Cys Asp Phe Leu
435 440 445
ACC TAT GTG AAA CTC GGA CGG ATA AAA ACC GAT CGC CCG GCA AGT AAA 1392
Thr Tyr Val Lys Leu GLy Arg Ile Lys Thr Asp Arg Pro Ala Ser Lys
450 455 450
CCA AAG GCG GAA GAT AAA GGG GAG GAT GAA GAG GGT GCA GGC GTT GAT 1440
Pro Lys Ala Glu Asp Lys Gly GLu Asp Glu Glu GLy Ala Gly Val Asp
465 470 475 480
AAC GAC GAA GAA AGC GAA GAC GAA GCC GTA GAA GAC GAA GGC GGC GAA 1488
Asn Asp Glu GLu Ser Glu Asp Glu Ala Val Glu Asp Glu GLy Gly Glu
485 490 495
PL 194 800 B1
GAA Glu GAC GAA ACT Thr 500 TCC GAA GAG GAT AAT GGC GAA GAC GAA GAA GCA Glu Glu ALa 510 ACC Thr 1536
Asp Glu Ser Glu Glu Asp Asn 505 Gly Glu Asp
GCC GAA GAA GAA ACC GAA GAA GTT GAT GAA GCC GAA GAG GAG GAA GTT 1584
Ala Glu Glu Glu Thr Glu Glu Val Asp Glu Ala Glu Glu Glu Glu Val
515 520 525
GAA GAA CCC GAA GAA AAA TCG CCG GCA GAA GGC AAC GGC GGT TCA GGC 1632
Glu Glu Pro Glu Glu Lys Ser Pro Ala Glu Gly Asn Gly Gly Ser Gly
530 535 540
AGG ATC CTG CCT GCC CTA GAA GCC TCT AAA GGC AGG GAC ATC GAC CTT 1680
Ser Ile Leu Pro Ala Leu Glu Ala Ser Lys Gly Arg Asp Ile Asp Leu
545 550 555 560
TTC CTG AAA GGT ATC CGC ACG GCA GAA ACG GAT ATT CCG CAA AGC GGA 1728
Phe Leu Lys Gly Ile Arg Thr Ala Glu Thr Asp Ile Pro Gln Ser Gly
565 570 575
ACG GCG CAT TAT AGC GGC ACT TGG GAA GCG CGT ATC GGC AAA CCC ATT 1776
Thr Ala His Tyr Thr Gly Thr Trp Glu Ala Arg Ile Gly Lys Pro Ile
580 5B5 590
CAA TGG GAC AAT CAG GCG GAT GAA AAA GCG GCA AAA GCA GAA TTT ACC 1824
Gln Trp Asp Asn Gln Ala Asp Glu Lys Ala Ala Lys Ala Glu Phe Thr
595 600 605
GTT GAT TTC GAC AAG AAA TCG ATT TCC GGA AAG CTG ACG GAG CAA AAC 1872
Val Asp Phe Asp Lys Lys Ser Ile Ser Gly Lys Leu Thr Glu Gln Asn
610 615 620
GGG GTA GAA CCT GCT TTC CAT ATT GAA GAC GGC AAG ATT GAT GGC AAC 1920
Gly Val Glu Pro Ai a Phe His Ile Glu Asp Gly Lys Ile Asp Gly Asn
625 630 635 640
GGT TTC CAC GCG ACA GCG CGC ACT CGG GAG AGC GGC ATC AAT CTT TCG 1968
Gly Phe His Ala Thr Ala Arg Thr Arg Glu Ser Gly Ile Asn Leu Ser
645 650 655
GGA AAT GGT TCG ACC GAC CCC AAA ACA TTC CAA GCT AGT AAT CTT CGT 2016
Gly Asn Gly Ser Thr Asp Pro Lys Thr Phe Gln ALa Ser Asn Leu Arg
660
5
670
PL 194 800 B1
GTA Val GAA Glu GGA Gly 675 GGA TTT TAC Tyr GGC Gly CCG Pro 680 CAG Gin GCG Ala GCG Ala GAA GLu TTG Leu 685 GGC Gly GGT Gly ACT Thr 2064
Gly Phe
ATT TTC AAT AAT GAT GGG AAA TCT CTT AGT ATA ACT GAA AAT ATT GAA 2112
Ile Phe Asn Asn Asp Gly Lys Ser Leu Ser Ile Thr Glu Asn Ile GLu
690 695 700
AAT GAA GCT GAA GCT GAA GTT GAA GTT GAA GCT GAA GCT GAA GTT GAA 2160
Asn Glu Ala GLu Ala GLu Val Glu Val Glu Ala Glu Ala Glu Val Glu
705 710 715 720
GTT GAA GCT GAT GTT GGC AAA CAG TTA GAA CCT GAT GAA GTT AAA CAC 2208
Val Glu Ala Asp Val Gly Lys Gin Leu GLu Pro Asp Glu Val Lys His
725 730 735
AAA TTC GGC GTG GTA TTC GGT GCG AAG AAA GAT ATG CAG GAG GTG GAA 2256
Lys Phe GLy Val Val Phe Gly Ala Lys Lys Asp Met Gin Glu Val Glu
740 745 750
AAA TGA 2262
Lys (2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR:8:
(i) CCAAAAKEEYSSYKK SSEK^EECJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 753 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (c) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RADDZJ CCĄSSECCZI: b iałao (iii) RRODZA FRAAGMENE: wewnętrzny (vi) ŹRÓDŁO OYSGINALNE:
(A) ORGANIZM: Neisseria meningitidis szczep M990 (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR:8:
Met Cys Lys Pro Asn Tyr Gly Gly Ile Val Leu Leu Pro Leu. Leu Leu 15
PL 194 800 B1
Ala Ser Cys Ile 20 Gly Gly Asn Phe Gly Val 25 Gln Pro Val Val 30 Glu
Thr Pro Thr Ala Pro Thr Leu Ser Asp Ser Lys Ser Ser Asn Pro
35 40 45
Asp Lys Pro Ala Pro Ala Pro Ala Glu Pro Ser Val Glu Ile Thr
50 55 60
Val Lys Arg Pro Ala Val GLy Ala Ala Met Arg Leu Pro Arg Arg
65 70 75
He Ala Thr Phe Asp Lys Asn Gly Asn Glu Ile Pro Asn Ser Lys
85 90 95
Ala Glu Glu Tyr Leu Pro Leu Lys Glu Lys Asp Ile Leu Phe Leu
100 105 110
Gly Thr Pro Lys Glu Gln Ala Asp Lys Leu Lys Lys Glu Ile Asn
115 120 125
Arg His Pro Asn Ala Pro Ile Tyr Thr Ser Asp Leu Lys Asp Asp
130 135 140
Tyr Gln Tyr Lys Tyr Val Arg Ala Gly Tyr Val Tyr Thr Arg Tyr
145 150 155
Thr Asp Glu Ile GLu Gln Asn Ser Glv GLy Lys Arg Val Thr His
185 170 175
Leu Gly Tyr ASp Gly Phe Val Tyr Tyr Ser Gly Glu Arg Pro Ser
ieo 185 190
Ssr Leu Pro Ser Ala Gly Thr Val Glu Tyr Ser Gly Asn Trp Gln
195 200 205
Mec Thr Asp Ala Lys Arg His Arg Ala Gly Gln Ala Val Gly Ile
210 215 220
Asn Leu Gly Tyr Ile Thr Phe Tyr Gly Asn Asp Val Gly Ala Thr
225 230 235
Tyr Ala Ala Lys Asp Val Asp GLu Arg Glu Lys His Pro Ala Lys
245 250 255
Thr Val Asp Phe Asp Asn Lys Thr Met Asn Gly Lys Leu Ile Lys
260 285 270
Gln Tyr Val Arg Asn Lys Lys Asp Glu Pro Lys Lys Pro Leu Thr
275 280 285
Tyr Asp Ile Thr Ala Lys Leu Asp Gly Asn Arg Phe Thr Gly Ser
290 295 300
Lys Val Asn Pro Asp Leu Ala Lys Asn Leu Ala Gly Asn Glu Arg
305 310 315
Phe Phe His Ala Asp Ala Asp Gln Arg Leu Glu Gly Gly Phe Phe
325 330 335
Asp Asn Gly Glu GLu Leu Ala Gly Arg Phe Ile Ser Asn Asp Asn
340 345 350
Ser
Ala
Pro
Asn
Gln
Asp
Gly
Ala
Gly
160
Arg
Gln
Tyr
Asp
Ser
240
Tyr
Asn
Ile
Ala
Leu
320
Gly
Ser
PL 194 800 B1
Val Phe Gly 355 Val Phe Ala Gly Lys 360 Lys Thr Glu Thr Ala Asn Ala Ala 365
Asp Thr Lys Pro Ala Leu Pro Ser Gly Lys His Thr Lys Ile Leu Asp
370 375 380
Ser Leu Lys Ile Ser Val Asp Glu Ala Thr Asp Gly His Ala Arg Lys
385 390 395 400
Phe Ala Ile Ser Ser Met Pro Asp Phe Gly His Pro Asp Lys Leu Leu
405 410 415
Val Glu Gly Arg Glu Ile Pro Leu Val· Asn Glu Glu Gln Ue Ue Lys
420 425 430
Leu Ala Asp Gly Arg Lys Met Thr vaL Arg ALa Cys Cys Asp Phe Leu
435 440 445
Thr Tyr Val Lys Leu Gly Arg Ile Lys Thr Asp Arg Pro Ala Ser Lys
450 455 460
Pro Lys Ala Glu Asp Lys Gly Glu Asp Glu Glu Gly ALa Gly Val Asp
465 470 475 480
Asn Asp Glu Glu Ser Glu Asp Glu Ala VaL Glu Asp Glu Gly Gly Glu
465 490 495
Glu Asp Glu Thr Ser Glu Glu Asp Asn Gly Glu Asp Glu Glu Ala Thr
500 505 510
Ala Glu Glu Glu Thr Glu Glu Val Asp Glu Ala Glu Glu Glu Glu Val
515 520 525
Glu Glu Pro Glu Glu Lys Ser Pro Al a Glu Gly Asn Gly Gly Ser Gly
530 535 540
Ser Ile Leu Pro Ala Leu Glu Ala Ser Lys Gly Arg Asp Ile Asp Leu
545 550 555 560
Phe Leu Lys Gly Ile Arg Thr Ala Glu Thr Asp Ile Pro Gln Ser Gly
565 570 575
Thr Ala His Tyr Thr Gly Thr Trp Glu Ala Arg Ile Gly Lys Pro Ile
580 5B5 590
Gln Trp Asp Asn Gln Ala Asp Glu Lys Ala Ala Lys Ala Glu Phe Thr
595 600 605
Val Asp Phe Asp Lys Lys Ser Ile Ser Gly Lys Leu Thr Glu Gln Asn
610 615 620
Gly Val Glu Pro Ala Phe His Ile Glu Asp Gly Lys Ile ASp Gly Asn
625 630 635 640
Gly Phe His Ala Thr Ala Arg Thr Arg Glu Ser Gly Ile Asn Leu Ser
645 650 655
Gly Asn Gly Ser Thr Asp Pro Lys Thr Phe Gln Ala Ser Asn Leu Arg
660 665 670
Val Glu Gly Gly Phe Tyr Gly Pro Gln ALa ALa Glu Leu Gly Gly Thr
675 680 685
PL 194 800 Β1
Ile Phe 690 Asn Asn Asp Gly Lys 695 Ser Leu Ser Ile Thr 700 Glu Asn Ile Glu
Asn Glu Ala Glu Ala Glu Val Glu Val Glu Ala Glu Ala Glu Val Glu
705 710 715 720
Val Glu Ala Asp val Gly Lys Gin Leu Glu Pro Asp Glu Val Lys His
725 730 735
Lys Phe Gly Val Val Phe Gly Ala Lys Lys Asp Met Gin Glu Val Glu
740 745 750
Lys (2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR:9:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 2124 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:
(B) SZCZEP: Neisseria meningitidis szczep 881607 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: sekwencja kodująca (B) LOKALIZACJA: 1...2121 (C) INNE INFORMACJE:
(xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR:9:
ATG Met 1 TGT Cys AAA Lys CCG Pro AAT Asn 5 TAT Tyr GGC Gly GGC Gly ATT Ile GTC Val 10 TTG Leu TTG Leu CCC Pro TTA CTT TTG Leu 48
Leu Leu 15
GCA TCT TGC ATC GGC GGC AAT TTC GGC GTG CAG CCT GTT GTC GAA TCA 96
Ala Ser Cys Ile Gly Gly Asn Phe Gly Val Gin Pro Val Val Glu Ser
20 25 30
ACG CCG ACC GCG TAC CCC GTC ACT TTC AAG TCT AAG GAC GTT CCC ACT 144
Thr Pro Thr Ala Tyr Pro Val Thr Phe Lys Ser Lys Asp Val Pro Thr
35 40 45
PL 194 800 Β1
TCG Ser CCT Pro 50 CCT Pro GCC Ala GGG Gly TCT Ser TCG Ser 55 GTA GAA ACC Thr ACG Thr CCG Pro 60 GTC val AAC Asn CGA Arg CCC Pro 192
val Glu
GCC GTT GGT GCG GCA ATG CGG CTG TTG AGA CGG AAT ATT GCA ACT TCT 240
Ala Val Gly Ala Ala Met Arg Leu Leu Arg Arg Asn Ile Ala Thr Ser
65 70 75 80
GAT AAG GAT GGC AAT GAT TTT CCA AAT AGC AAA CAA GCA GAA GAA AAG 288
Asp Lys Asp Gly Asn Asp Phe Pro Asn Ser Lys Gin Ala Glu Glu Lys
85 90 95
CTG TCG TTT AAA GAG GAA GAT ATC CTG TTT TTA TAC GGT TCC AAA AAA 336
Leu Ser Phe Lys Glu Glu Asp Ile Leu Phe Leu Tyr Gly Ser Lys Lys
100 105 110
GAT CAA CGT CAG CAG CTT AAA GAT AAA ATT CGT CAA CCA AAT CCT ACG 384
Asp Gin Arg Gin Gin Leu Lys Asp Lys Ile Arg Gin Pro Asn Pro Thr
115 120 125
GCA AGC ATT ACC ACA TCG GAA AAG AAA AAT AAA AAA TAT GAT TAT AAA 432
Ala Ser Ile Thr Thr Ser Glu Lys· Lys Asn Lys Lys Tyr Asp Tyr Lys
130 135 140
rprpiFyi GTA GAT GCA GGT TAT GTA TAT ACT AAA GAC GGA AAA GAT GAA ATT 480
Phe Val ASp Ala Gly Tyr Val Tyr Thr Lvs Asp Gly Lys Asp Glu Ile
145 150 155 160
GAG TGG ACT TCA AAT TAC AAG CAG TCT ACC AAC CGG TTT GGT TAT GAC 528
Glu Trp Thr Ser Asn Tyr Lys Gin Ser Thr Asn Arg Phe Gly Tyr Asp
165 170 175
GGT TTT GTA TAT TAT TCC Gja GAA CAT CCT TCG CAA TCT TTA CCG AGC 576
Gly Phe Val Tyr Tyr Ser Gly Glu His Pro Ser Gin Ser Leu Pro Ser
180 185 190
GCG GGA ACG GTG AAA TAT TCC GGC AAC TGG CAA TAT ATG ACC GAT GCC 624
Ala Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Asn Trp Gin Tyr Met Thr Asp Ala
195 200 205
PL 194 800 Β1
TCT Ser 545 AAA GGC AGG Arg GAC ATC GAC Asp CTT Leu TTC Phe CTG AAA GGT ATC Ile CGC Arg ACG Thr GCG Ala 560 1680
Lys Gly Asp Ile 550 Leu Lys 555 Gly
GAA GCC GAC ATT CCA AAA AAC GGA ACG GCG CAT TAT ACC GGC ACT TGG 1728
Glu Ala Asp Ile Pro 565 Lys Asn Gly Thr Ala 570 His Tyr Thr Gly Thr 575 Trp
GAA GCG CGT ATC GGC GTA TCG GAT AGT GGT ACG TCC ATT CAA AAG GAT 1776
Glu Ala Arg Ile 5B0 Gly Val Ser Asp Ser 585 Gly Thr Ser Ile Gin 590 Lys Asp
AGC TAT GCG AAT CAA GGG GCA AAA GCA GAA TTT ACC GTT GAT TTC GAA 1824
Ser Tyr Ala 595 Asn Gin Gly Ala Lys 600 Ala Glu Phe Thr val 605 Asp Phe Glu
GCG AAG ACG GTG TCC GGA ATG CTG ACA GAA AAA AAT GAT ACA ACC CCC 1872
Ala Lys 610 Thr Val Ser Gly Met 615 Leu Thr Glu Lys Asn 620 Asp Thr Thr Pro
GCT TTT TAT ATT GAA AAA GGT GTG ATT GAC GGT AAC GGT TTC CAC GCT 1920
Ala 625 Phe Tyr Ile Glu Lys 630 Gly Val Ile Asp Gly 635 Asn Gly Phe His Ala 640
TTG GCG CAT ACT CGG GAG AAC GGT ATT GAC CTT TCT GGG CAG GGT TCG 1968
Leu Ala His Thr Arg 645 Glu Asn Gly Ile Asp 650 Leu Ser Gly Gin Gly 655 Ser
ACT AAC CCG AAG AAC TTC AAA GCC GAC AAT CTT CTT GTA ACA GGC GGC 2016
Thr Asn Pro Lys 660 Asn Phe Lys Ala Asp 665 Asn Leu Leu Val Thr 670 Gly Gly
TTT TAT GGC CCG CAG GCG GCA GAA TTG GGC GGT AAT ATT ATC GAC AGC 2064
Phe Tyr Gly 675 Pro Gin Ala Ala Glu 680 Leu Gly Gly Asn Ile 685 Ile Asp Ser
GAC CGG AAA TTC GGT GCG GTA TTT GGG GCG AAA AAA GAT GAC AAG GAG 2112
Asp Arg 690 Lys Phe Gly Ala Val 695 Phe Gly Ala Lys Lys 700 Asp Asp Lys Glu
GCA ACA CGA TGA 2124
Ala Thr Arg
705
PL 194 800 B1
ATT Ile 385 TCC Ser GTT Val GAC Asp GAG Glu GCA AGT GGT GAA AAT Asn CCC Pro 395 CGA Arg CCG Pro TTT Phe GAG Glu GTT Val 400 1200
Ala 390 Ser Gly Glu
TCC ACT ATG CCC GAT TTT GGT CAT CCC GAC AAA CTT CTT GTC GAA GGG 1248
Ser Thr Met Pro Asp 405 Phe Gly His Pro Asp 410 Lys Leu Leu Val Glu 415 Gly
CGT GAA ATT CCT TTG GTA AAC AAA GAA CAA ACC ATC GAT CTT GCC GAC 1296
Arg Glu Ile Pro 420 Leu Val Asn Lys Glu 425 Gin Thr Ile Asp Leu 430 Ala Asp
GGC AGG AAA ATG ACC GTC CGT GCT TGT TGC GAC TTT TTG ACC TAT GTG 1344
Gly Arg Lys 435 Met Thr Val Arg Ala 440 Cys Cys Asp Phe Leu 445 Thr Tyr Val
AAA CTC GGA CGG ATA AAA ACC GAA CGC CCC GCC GTC CAA CCG AAG GCG 1392
Lys Leu 450 Gly Arg Ile Lys Thr 455 Glu Arg Pro Ala Val 460 Gin Pro Lys Ala
CAG GAT GAA GAG GGG GAC GAA GAG GGT GTA GGC GTT GAT AAC GGT AAA 1440
Gin 455 Asp Glu Glu Gly Asp 470 Glu Glu Gly Val Gly 475 Val Asp Asn Gly Lys 4B0
GAA AGC GAA GAC GAA ATC GGC GAT GAA GAA AGC ACC GGA GAC GAA GTC 1488
Glu Ser Glu Asp Glu 485 Ile Gly Asp Glu Glu 490 Ser Thr Gly Asp Glu 495 Val
GTA GAA GAT GAA GAC GAA GAT GAA GAC GAA GAA GAA ATC GAA GAA GAA 1536
Val Glu Asp Glu 500 Asp Glu ASp Glu Asp 505 Glu Glu Glu Ile Glu 510 Glu Glu
CCT GAA GAA GAA GCT GAA GAG GAA GAA CCC GAA GAA GAA TTG CCG GCA 1584
Pro Glu Glu 515 Glu Ala Glu Glu Glu 520 Glu Pro Glu Glu Glu 525 Leu Pro Ala
GAA GAA GGC AAC GGC GGT TCA GGC AGC ATC CTG CCC ACT CCG GAA GCC 1632
Glu Glu Gly Asn Gly Gly Ser Gly Ser Ile Leu Pro Thr Pro Glu Ala
530 535
540
PL 194 800 B1
ΑΤΑ Ile CGT Arg 210 CAT His CGA ACA GGA Gly AAA GCA Lys Ala 215 GGA GAT Gly Asp CCT Pro AGC GAA GAT TTG GGT 672
Arg Thr Ser 220 Glu Asp Leu Gly
ΤΑΤ ATC GTT TAT TAC GGT CAA AAT GTC GGA GCA ACT TCT TAT GCT GCG 720
Tyr Ile Val Tyr Tyr Gly Gin Asn Val Gly Ala Thr Ser Tyr Ala Ala
225 230 235 240
ACT GCC GAC GAC CGG GAG GGA AAA CAT CCT GCC GAA TAT ACG GTT AAT 768
Thr Ala Asp Asp Arg Glu Gly Lys His Pro Ala Glu Tyr Thr Val Asn
245 250 255
.TC GAC CAA AAA ACT CTG AAT GGC AAG CTG ATT AAA AAT CAG TAT GTG 816
Phe Asp Gin Lys Thr Lau Asn Gly Lys Leu Ile Lys Asn Gin Tyr Val
260 265 270
CAA AAG AGA GAT GAT CCT AAA AAA CCA CTG ACC ATT TAC GAC ATT ACT r 864
Gin Lys Arg Asp Asp Pro Lys Lys Pro Leu Thr Ile Tyr Asp Ile Thr
275 280 285
GCA AAA TTG GAC GGC AAC CGC TTT ACC GGC AGT GCC AAA GTT AAC ACA 912
Ala Lys Leu Asp Gly Asn Arg Phe Thr Gly Ser Ala Lys val Asn Thr
290 295 300
GAG GTG AAG ACG AAT CAC GCT GAT AAA GAA TAT TTG TTT TTC CAT ACC 960
Glu Val Lys Thr Asn His Ala Asp Lys Glu Tyr Leu Phe Phe His Thr
305 310 315 320
GAT GCC GAT CAG CGG CTT GmG GGC GGT TTT ΓΤ~ GGC GAT AAG GGG GAA 100B
Aso Ala ASp Gin Arg Leu Glu Gly Gly Phe Phe Gly Asp Lys Gly Glu
325 330 335
GAG CTT GCC GGA CGG TTT ATC AGC AAC GAC AAC AGC GTA TTC GGC GTG 1056
Glu Leu Ala Gly Arg Phe Ile Ser Asn Asp Asn Ser Val Phe Gly Val
340 345 350
TTC GCA GGC AAA CAA AAA ACA GAG ACA GCA AAC GCA TCA GAT ACA AAT 1104
Phe Ala Gly Lys Gin Lys Thr Glu Thr Ala Asn Ala Ser Asp Thr Asn
355 360 365
CCT GCC CTG CCG TCT GGA AAA CAC ACC AAA ATC TTG GAT TCT CTA AAA 1152
Pro Ala Leu Pro Ser Gly Lys His Thr Lys Ile Leu Asp Ser Leu Lys
370 375 380
PL 194 800 B1 (2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR:10:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 707 aminokwasów (b) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko l (iii) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:
(A) ORGANIZM: Neisseria meningitidis szczep 881607 (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR:10:
Mer 1 Cys Lys Prc Asn 5 Tyr Gly Gly Ile Val 10 Leu Leu Pro Leu Leu 15 Leu
Ala Ser Cys Ile Gly Gly Asn Phe Gly Val Gln Pro Val Val Glu Ser
20 25 30
Thr Pro Thr Ala Tyr Pro Val Thr Phe Lys Ser Lys Asp Val Pro Thr
35 40 45
Ser Pro Pro Ala Gly Ser Ser Val Glu Thr Thr Pro Val Asn Arg Pro
50 55 60
Ala Val Gly Ala Ala Met Arg Leu Leu Arg Arg Asn Ile Ala Thr Ser
6 5 70 75 80
Asp Lys Asp Gly Asn Asp Phe Pro Asn Ser Lys Gln Al a Glu Glu Lys
85 90 95
Leu Ser Phe Lys Glu Glu Asp Ile Leu Phe Leu Tyr Gly Ser Lys Lys
100 105 110
Asp Gln Arg Gln Gln Leu Lys Asp Lys Ile Arg Gln Pro Asn Pro Thr
115 120 125
Ala Ser He Thr Thr Ser Glu Lys Lys Asn Lys Lys Tyr Asp Tyr Lys
130 135 140
Phe Val Asp Ala Gly Tyr Val Tyr Thr Lys Asp Gly Lys Asp Glu Ile
145 150 155 160
Glu Trp Thr Ser Asn Tyr Lys Gln Ser Thr Asn Arg Phe Gly Tyr Asp
165 170 175
Gly Phe Val Tyr Tyr Ser Gly Glu His Pro Ser Gln Ser Leu Pro Ser
180 185 190
Ala Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Asn Trp Gln Tyr Met Thr Asp Ala
195 200
205
PL 194 800 Β1
Ile Arg 210 His Arg Thr Gly Lys Ala 215 Gly Asp Pro Ser 220 Glu Asp Leu Gly
Tyr Ile Val Tyr Tyr Gly Gin Asn Vai Gly Ala Thr Ser Tyr Ala Ala
225 230 235 240
Thr Ala Asp Asp Arg Glu Gly Lys His Pro Ala Glu Tyr Thr Val Asn
245 250 255
Phe Asp Gin Lys Thr Leu Asn Gly Lys Leu Ile Lys Asn Gin Tyr Val
250 265 270
Gin Lys Arg Asp Asp Pro Lys Lys Pro Leu Thr Ile Tyr Asp Ile Thr
275 2B0 285
Ala Lys Leu Asp Gly Asn Arg Phe Thr Gly Ser Ala Lys Val Asn Thr
290 295 300
Glu Val Lys Thr Asn His Ala Asp Lys Glu Tyr Leu Phe Phe His Thr
305 310 315 320
Asp Ala Asp Gin Arg Leu Glu Gly Gly Phe Phe Gly Asp Lys Gly Glu
325 330 335
Glu Leu Ala Gly Arg Phe Ile Ser Asn Asp Asn Ser Val Phe Gly Val
340 345 350
Pha Ala Gly Lys Gin Lys Thr Glu Thr Ala Asn Ala Ser Asp Thr Asn
355 360 365
Pro Ala Leu Pro Ser Gly Lys His Thr Lys Ile Leu Asp Ser Leu Lys
370 375 380
Ile Ser Val Asp Glu Ala Ser Gly Glu Asn Pro Arg Pro Phe Glu Val
385 390 395 400
Ser Thr Met Pro Asp Phe Gly His Pro Asp Lys Leu Leu Val Glu Gly
405 410 415
Arg Glu Ile Pro Leu Val Asn Lys Glu Gin Thr Ile Asp Leu Ala Asp
420 425 430
Gly Arg Lys Met Thr Val Arg Ala Cys Cys Asp Phe Leu Thr Tyr Val
435 440 445
Lys Leu Gly Arg Ile Lys Thr Glu Arg Pro Ala Val Gin Pro Lys Ala
450 455 460
Gin Asp Glu Glu Gly Asp Glu Glu Gly val Gly Val Asp Asn Gly Lys
465 470 475 480
Glu Ser Glu ASp Glu Ile Gly Asp Glu Glu Ser Thr Gly Asp Glu Val
495 490 495
Vai Glu Asp Glu Asp Glu Asp Glu Asp Glu Glu Glu Ile Glu Glu Glu
500 505 510
Pro Glu Glu Glu Ala Glu Glu Glu Glu Pro Glu Glu Glu Leu Pro Ala
515 520 525
Glu Glu Gly Asn Gly Gly Ser Gly Ser Ile Leu Pro Thr Pro Glu Ala
530 535 540
PL 194 800 B1
Ser Lys Gly Arg Asp Ile Asp Leu Phe Leu Lys Gly Ile Arg Thr Ala
54S 550 555 560
Glu Ala Asp Ile Pro Lys Asn Gly Thr Ala His Tyr Thr Gly Thr Trp
565 570 575
Glu Ala Arg Ile Gly Val Ser Asp Ser Gly Thr Ser Ile Gin Lys Asp
580 565 590
Ser Tyr Ala Asn Gin Gly Ala Lys Ala Glu Phe Thr Val Asp phe Glu
595 600 605
Ala Lys Thr Val Ser Gly Met Leu Thr Glu Lys Asn Asp Thr Thr Pro
610 615 620
Ala Phe Tyr Ile Glu Lys Gly Val Ile Asp Gly Asn Gly Phe His Ala
625 630 635 640
Leu Ala His Thr Arg Glu Asn Gly Ile Asp Leu Ser Gly Gin Gly Ser
645 650 655
Thr Asn Pro Lys Asn Phe Lys Ala Asp Asn Leu Leu Val Thr Gly Gly
660 665 670
Phe Tyr Gly Pro Gin Ala Ala Glu Leu Gly Gly Asn Ile Ile Asp Ser
675 660 685
Asp Arg Lys Phe Gly Ala Val Phe Gly Ala Lys Lys Asp Asp Lys Glu
690 695 700

Claims (34)

1. Izolowany polinukleotyd kodujący białko LbpB Neisseria meningitidis, który jest polinukleotydem o Id. Sekw. yr. 1 (od yukieotydu 100 do yukieotydu 2274), Id. Sekw. yr 3, Id. Sekw. yr 5, Id. Sekw. yr 7 aibo Id. Sekw. yr 9.
2. IzolowałypolinuUleetyy, obermującyseeweegjęnuUleetyyową, która j eet przynajmnise w 65% ideytyczya z sekweycją o Id. Sekw. yr 1 od yukieotydu 100 do yukieotydu 2274 ya całej jej długości iub obejmujący sekweycję yukieotydową, która koduje ooiioeotyd orzyyajmyiej w 55% ideytyczyy z sekweycją o Id. Sekw. yr 2 ya całej jej długości.
3. Izolowang polinukleetyy weeług zast^. 2, znamienny tym, że obermuje kekwaegje nukleotydową, która koduje sekweycję amiyokwasową z Id. Sekw. yr 2 od amiyokwasu w oozycji 19 do końca C ooiioeotydu.
4. Izolowasg polinukleotyy obbrmujący kekweegje nukleetyyową, ΚΙογζ j jes p^ynajm^^ w 65% ideytyczya z sekweycją o Id. Sekw. yr 3 ya całej jej długości iub obejmujący sekweycję yukieotydową, która koduje ooiioeotyd orzyyajmyiej w 55% ideytyczyy z sekweycją o Id. Sekw. yr 4 ya całej jej długości.
5. Izolowasg polinuUleotyy zaste. 4, znamienny tym, że obermuje sekwangje nuklidtyldwą, która koduje sekweycję amiyokwasową z Id. Sekw. yr 4 od amiyokwasu w oozycji 19 do końca C ooiioeotydu.
5. Izotówasg poiinukleetyy obermującc kekwencjj nukleotydową, która j ees p^ynajm^^ w 65% ideytyczya z sekweycją o Id. Sekw. yr 5 ya całej jej długości iub obejmujący sekweycję yukieotydową, która koduje ooiioeotyd orzyyajmyiej w 55% ideytyczyy z sekweycją o Id. Sekw. yr 5 ya całej jej długości.
7. Izolowang polinukleetyy weełuuj z^^st^. 6, znamienny tym, że obermuje kekwenccj nukleotydową, która koduje sekweycję amiyokwasową z Id. Sekw. yr 5 od amiyokwasu w oozycji 19 do końca C ooiioeotydu.
PL 194 800 B1
8. Izolowany polinukleotyd obejmujący sekwencję nukleotydową, która jest przynajmniej w 65% identyczna z sekwencją o Id. Sekw. nr 7 na całej jej długości lub obejmujący sekwencję nukleotydową, która koduje polipeptyd przynajmniej w 65% identyczny z sekwencją o Id. Sekw. nr 8 na całej jej długości.
9. Izolowany pollnukleotyd według zastrz. 8, znamienny tym, że obejmuje sekwencję nukleotydową, która koduje sekwencję aminokwasową z Id. Sekw. nr 8 od aminokwasu w pozycji 19 do końca C polipeptydu.
10. Izolowany poiinukleotyd obejmujący sekwencję nukleotydową. która jest przynajmniej w 65% identyczna z sekwencją o Id. Sekw. nr 9 na całej jej długości lub obejmujący sekwencję nukleotydową, która koduje polipeptyd przynajmniej w 65% identyczny z sekwencją o Id. Sekw. nr 10 na całej jej długości.
11. Izolowa ny ροΗηυΜοο1:γό według zastrz. 10, znamienny tym, że obejmie sekwenecę nukleotydową, która koduje sekwencję aminokwasową z Id. Sekw. nr 10 od aminokwasu w pozycji 19 do końca C polipeptydu.
12. Izolowany pollnukkeotyd obejmujący fragment izdowanego pollnukleotydu k^du^^^c^^ białko LbpB Neisseria meningitidis, będącego polinukleotydem o Id. Sekw. nr. 1 (od nukleotydu 100 do nukleotydu 2274), Id. Sekw. nr 3, Id. Sekw. nr 5, Id. Sekw. nr 7 albo Id. Sekw. nr 9, przy czym fragment ten koduje sekwencję aminokwasową o aktywności antygenowej LbpB N. meningitidis.
13. Izolowany ρ^Ν(^ι^Ι^Ι^(^^;^(1 według zastrz. 12, znamienny tym, że obejmie sekwenecę nukleotydową, która koduje odpowiednio sekwencję aminokwasową z Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 lub 10, od aminokwasu w pozycji 19 do końca C polipeptydu.
14. Polinukleotyd obejmujący sekwencję nukleotydową, która jest przynajmniej w 65% identyczna z sekwencją o Id. Sekw. nr 1, 3, 5, 7 lub 9 na całej jej długości lub obejmujący sekwencję nukleotydową, która koduje polipeptyd przynajmniej w 65% identyczny z sekwencją o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 lub 10 na całej jej długości, oraz rekombinacyjny układ ekspresyjny, przy czym polinukleotyd jest zdolny do wytwarzania rekombinowanego polipeptydu LbpB w zgodnej komórce gospodarza.
15. Komórka gospodarza obejmuiąca ρ<^ΙΙι^ι^Ι^Ι^<^0|^<^ sekwencjęnukleotydową, która jest przynajmniej w 65% identyczna z sekwencją o Id. Sekw. nr 1,3, 5, 7 lub 9 na całej jej długości lub zawierający sekwencję nukleotydową, która koduje polipeptyd przynajmniej w 65% identyczny z sekwencją o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 lub 10 na całej jej długości, oraz rekombinacyjny układ ekspresyjny, przy czym polinukleotyd jest zdolny do wytwarzania rekombinowanego polipeptydu LbpB.
16. Sposób wytwarzania rekombinowanego polipeptydu LbpB, znamienny tym, że obejmuje hodowane komórki gospodarza obejmującej polinukleotyd zawierający sekwencję nukleotydową, która jest przynajmniej w 65% identyczna z sekwencją o Id. Sekw. nr 1,3, 5, 7 lub 9 na całej jej długości lub zawierający sekwencję nukleotydową, która koduje polipeptyd przynajmniej w 65% identyczny z sekwencją o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 lub 10 na całej jej długości, oraz rekombinacyjny układ ekspresyjny, przy czym polinukleotyd jest zdolny do wytwarzania rekombinowanego polipeptydu LbpB w warunkach odpowiednich do wytwarzania polipeptydu i odzyskiwanie polipeptydu z hodowli.
17. Sposób wytwarzania komórki wytwarzającej rekombinowany polipeptyd LbpB, znamienny tym, że obejmuje transformowanie albo transfekowanie komórki gospodarza rekombinacyjnym układem ekspresyjnym zawierającym polinukleotyd obejmujący sekwencję nukleotydową, która jest przynajmniej w 65% identyczna z sekwencją o Id. Sekw. nr 1,3, 5, 7 lub 9 na całej jej długości lub obejmujący sekwencję nukleotydową, która koduje polipeptyd przynajmniej w 65% identyczny z sekwencją o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 lub 10 na całej jej długości, tak, że komórka gospodarza w odpowiednich warunkach hodowli jest zdolna do wytwarzania rekombinowanego polipeptydu LbpB.
18. Sposób wytwarzania pęcherzyka zewnątrzbłonowego zawierającego rekombinowany polipeptyd LbpB, znamienny tym, że obejmuje transformowanie albo transfekowanie komórki gospodarza rekombinacyjnym układem ekspresyjnym zawierającym polinukleotyd obejmujący sekwencję nukleotydową, która jest przynajmniej w 65% identyczna z sekwencją o Id. Sekw. nr 1, 3, 5, 7 lub 9 na całej jej długości lub obejmujący sekwencję nukleotydową, która koduje polipeptyd przynajmniej w 65% identyczny z sekwencją o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 lub 10 na całej jej długości, tak, że komórka gospodarza w odpowiednich warunkach hodowli jest zdolna do wytwarzania rekombinowanego polipeptydu LbpB.
19. Niellpidowany polipeptyd LbpB z Neisseria meninghtdis obejmujący sekwencćę aminokwasową przynajmniej w 65% identyczną z sekwencją o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 lub 10 na całej jej długości.
20. Rekombinowany polipeptyd LbpB z Neisseria ΓΌθηίηςίίίόίε. dodatkową sekwencję aminokwasową, która ułatwia oczyszczanie polipeptydu, przy czym polipeptyd obejmuje sekwencję
PL 194 800 B1 aminokwasową przynajmniej w 65% identyczną z sekwencją aminokwasową o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 lub 10 na całej jej długości.
21. Polipeptyd LbpB z Neisseria meningitidis będący polipeptydem z Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 lub 10.
22. Pollpeptyd LbpB z Neisseria meningitidis obejmujący sekwencję aminokwasową odpowiednio z Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 lub 10 od aminokwasu w pozycji 19 do końca C polipeptydu oraz jego białka fuzyjne.
23. Fragmeni pollpeppydu LbpB z N. meningitidis o sekwencji aminokwasowej z Id. Sekw. nr 2,
4, 6, 8 lub 10 zachowujący aktywność antygenową polipeptydu, przy założeniu, że fragmenty reprezentowane przez aminokwasy w pozycjach 650-725 z Id. Sekw. nr 2 oraz 559-741 z Id. Sekw. nr 6 nie są uwzględnione, oraz jego białko fuzyjne.
24. Izo Iowa ny pollnukleotyd sekwoi^ę nukleotydową kodLuącą ffagment pollpeptydu LbpB z N. meningitidis o sekwencji aminokwasowej z Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 lub 10 zachowujący aktywność antygenową polipeptydu, przy założeniu że fragmenty reprezentowane przez aminokwasy w pozycjach 650-725 z Id. Sekw. nr 2 oraz 559-741 z Id. Sekw. nr 6 nie są uwzględnione, lub jego białko fuzyjne.
25. Przeciwciatoswoiste Immunologiczniewobec pollpeptydu LbpB z N. meningitfdis o sekwencji aminokwasowej przynajmniej w 65% identycznej z sekwencją aminokwasową o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 lub 10 na całej jej długości.
26. Sposób Iden-yfikacji związków, które hamiuą pollpeptyd LbpB z Ν. πί^ΓΉΓΚ^ίίίόί;; o sekwen^j aminokwasowej przynajmniej w 65% identycznej z sekwencją aminokwasową o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 lub 10 na całej jej długości, znamienny tym, że obejmuje:
(a) doprowadzenie do kontaktu związku kandydującego z komórkami, które wyrażają polipeptyd LbpB; i (b) obserwowanie wiązania, albo zahamowania odpowiedzi funkcjonalnej; albo porównywanie pod kątem aktywności wobec polipeptydu LbpB zdolności komórek, które doprowadzono do kontaktu ze związkiem kandydującym z takimi samymi komórkami, które nie były kontaktowane.
27. Szczepionka, znamiennatym, że ohoen^e skuuecznąliośćpoHpeptyduLbpB z N. meningitidis o sekwencji aminokwasowej przynajmniej w 65% identycznej z sekwencją aminokwasową o Id. Sekw. nr 2, 4r 6, 8 lub 10 na całej jej długości oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
28. Szczepionka według 27, znamienna tym, że kompozycCa obejmuje co najmniej jeden antygen N. meningitidis.
29. Szczepionka, znamienna tym, że obejmuje skuteczną ilość fragmentu pohpeptydu LbpB z N. meningitidis o sekwencji aminokwasowej o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 lub 10, przy czym fragment zachowuje aktywność antygenową polipeptydu, przy założeniu że fragmenty reprezentowane przez aminokwasy w pozycjach 650-725 z Id. Sekw. nr 2 oraz 559-741 z Id. Sekw. nr 6 nie są uwzględnione, lub jego białko fuzyjne, oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
30. Szczepionka według zas^z. 29, znamienna tym, że kompozycCa obejmuje co najmniej jeden antygen N. meningitidis.
31. Szczepionka, znamienna tym, że obejmie skuueczną iiość pollnukleotydu zawierającego sekwencję nukleotydową, która jest przynajmniej w 65% identyczna z sekwencją o Id. Sekw. nr 1, 3,
5, 7 lub 9 na całej jej długości lub zawierającego sekwencję nukleotydową, która koduje polipeptyd przynajmniej w 65% identyczny z sekwencją o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 lub 10 na całej jej długości oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
32. Zastosowanie kompozygi obejmującej skuteczną ilość niellpidowanego LbpB z Neisseria meningitidis o sekwencji aminokwasowej przynajmniej w 65% identycznej z sekwencją aminokwasową o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 lub 10 na całej jej długości do wytwarzania leku do leczenia lub hamowania choroby wywoływanej u ludzi przez Neisseria.
33. Zastosowanie według zas^z. 32, tym, że lek jess przeznaczony do podawania doustnie, podskórnie, doodbytniczo, dotchawiczo, domięśniowo albo donosowo.
34. Zastosowanie kompozycji obejmującej skuteczną ilość polinukleotydu obejmującego sekwencję nukleotydową, która jest przynajmniej w 65% identyczna z sekwencją o Id. Sekw. nr 1,3, 5, 7 lub 9 na całej jej długości lub obejmującego sekwencję nukleotydową, która koduje polipeptyd przynajmniej w 65% identyczny z sekwencją o Id. Sekw. nr 2, 4, 6, 8 lub 10 na całej jej długości do wytwarzania leku do leczenia lub hamowania choroby wywoływanej u ludzi przez Neisseria.
35. Zastosowanie według zas^z. 34, tym, że lek jess przeznaczony do podawania podskórnie, dotchawiczo, domięśniowo albo donosowo.
PL338649A 1997-08-15 1998-08-10 Polinukleotydy kodujące białko LbpB Neisseria meningitidis, jego fragment lub białko o określonej identyczności z białkiem LbpB Neisseria meningitidis, komórka gospodarza zawierająca taki polinukleotyd i sposób jej wytwarzania, sposoby wytwarzania rekombinowanego polipeptydu LbpB i pęcherzyka zewnątrzbłonowego zawierającego zrekombinowny LbpB, nielipidowany polipeptyd LbpB z Neisseria meningitidis, rekombinowny polipeptyd oraz polipeptyd LbpB z Neisseria meningitidis, jego fragment oraz swoiste immunologiczne przeciwciało wobec polipeptydu LbpB z Neiss PL194800B1 (pl)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9717423.9A GB9717423D0 (en) 1997-08-15 1997-08-15 Vaccine
GBGB9802544.8A GB9802544D0 (en) 1998-02-05 1998-02-05 Vaccine
PCT/EP1998/005117 WO1999009176A1 (en) 1997-08-15 1998-08-10 Neisseria lactoferrin binding protein

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL338649A1 PL338649A1 (en) 2000-11-06
PL194800B1 true PL194800B1 (pl) 2007-07-31

Family

ID=26312080

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL338649A PL194800B1 (pl) 1997-08-15 1998-08-10 Polinukleotydy kodujące białko LbpB Neisseria meningitidis, jego fragment lub białko o określonej identyczności z białkiem LbpB Neisseria meningitidis, komórka gospodarza zawierająca taki polinukleotyd i sposób jej wytwarzania, sposoby wytwarzania rekombinowanego polipeptydu LbpB i pęcherzyka zewnątrzbłonowego zawierającego zrekombinowny LbpB, nielipidowany polipeptyd LbpB z Neisseria meningitidis, rekombinowny polipeptyd oraz polipeptyd LbpB z Neisseria meningitidis, jego fragment oraz swoiste immunologiczne przeciwciało wobec polipeptydu LbpB z Neiss

Country Status (18)

Country Link
US (1) US7105316B2 (pl)
EP (1) EP1003874B1 (pl)
JP (1) JP2001514894A (pl)
KR (1) KR100509712B1 (pl)
CN (1) CN1204253C (pl)
AT (1) ATE344325T1 (pl)
AU (1) AU744733B2 (pl)
BR (1) BR9811907A (pl)
CA (1) CA2301332A1 (pl)
CO (1) CO4810233A1 (pl)
DE (1) DE69836333T2 (pl)
ES (1) ES2275314T3 (pl)
IL (1) IL134436A0 (pl)
NO (1) NO20000731L (pl)
NZ (1) NZ502750A (pl)
PL (1) PL194800B1 (pl)
TR (1) TR200000416T2 (pl)
WO (1) WO1999009176A1 (pl)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK2270173T3 (en) * 1999-05-19 2016-03-07 Glaxosmithkline Biolog Sa Neisserial combination compositions
GB0007433D0 (en) * 2000-03-27 2000-05-17 Microbiological Res Authority Recombinant transferrin binding proteins
GB0011108D0 (en) * 2000-05-08 2000-06-28 Microscience Ltd Virulence gene and protein and their use
GB0107219D0 (en) * 2001-03-22 2001-05-16 Microbiological Res Authority Immunogenic commensal neisseria sequences
WO2004015099A2 (en) 2002-08-02 2004-02-19 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccine composition comprising lipooligosaccharide with reduced phase variability
WO2005032584A2 (en) 2003-10-02 2005-04-14 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Pertussis antigens and use thereof in vaccination
GB0409748D0 (en) * 2004-04-30 2004-06-09 Chiron Srl Lactoferrin cleavage
JP5275983B2 (ja) 2006-06-12 2013-08-28 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム ワクチン
JP2013521770A (ja) 2010-03-10 2013-06-13 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム ワクチン組成物

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2692592B1 (fr) * 1992-06-19 1995-03-31 Pasteur Merieux Serums Vacc Fragments d'ADN codant pour les sous-unités du récepteur de la transferrine de Neisseria meningitidis et procédés les exprimant.
FR2720408B1 (fr) * 1994-05-31 1996-08-14 Pasteur Merieux Serums Vacc Fragments Tbp2 de Neisseria meningitidis.
US6048539A (en) * 1995-11-02 2000-04-11 Connaught Laboratories Limited Lactoferrin receptor protein

Also Published As

Publication number Publication date
NO20000731D0 (no) 2000-02-14
CN1275164A (zh) 2000-11-29
JP2001514894A (ja) 2001-09-18
US7105316B2 (en) 2006-09-12
TR200000416T2 (tr) 2000-07-21
DE69836333T2 (de) 2007-04-19
BR9811907A (pt) 2000-08-15
ATE344325T1 (de) 2006-11-15
EP1003874B1 (en) 2006-11-02
AU9261398A (en) 1999-03-08
ES2275314T3 (es) 2007-06-01
WO1999009176A1 (en) 1999-02-25
CN1204253C (zh) 2005-06-01
CA2301332A1 (en) 1999-02-25
CO4810233A1 (es) 1999-06-30
DE69836333D1 (de) 2006-12-14
KR20010022952A (ko) 2001-03-26
NO20000731L (no) 2000-03-31
IL134436A0 (en) 2001-04-30
PL338649A1 (en) 2000-11-06
AU744733B2 (en) 2002-02-28
NZ502750A (en) 2002-03-01
US20040131634A1 (en) 2004-07-08
KR100509712B1 (ko) 2005-08-24
EP1003874A1 (en) 2000-05-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU747742B2 (en) Novel surface protein of Neisseria meningitidis
KR100698561B1 (ko) Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ Ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ 표면 항원ΝｈｈΑ의 보존 부위를 포함하는 단백질
CA2347849C (en) Omp85 proteins of neisseria gonorrhoeae and neisseria meningitidis, compositions containing same and methods of use thereof
PL197449B1 (pl) Wyizolowane polipeptydy, immunogenne fragmenty tych polipeptydów, wyizolowane polinukleotydy, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza zawierająca taki wektor, sposób wytwarzania polipeptydu, sposób ekspresji polinukleotydu, kompozycja szczepionki, przeciwciało immunospecyficzne w stosunku do polipeptydu lub jego immunogennego fragmentu, sposób diagnozowania zakażenia Neisseria meningitidis, zastosowania kompozycji zawierającej polipeptyd lub jego immunogenny fragment, lub polinukleotyd i kompozycja terapeutyczna do leczenia choroby wywołanej przez Neisseria meningitidis
PL194800B1 (pl) Polinukleotydy kodujące białko LbpB Neisseria meningitidis, jego fragment lub białko o określonej identyczności z białkiem LbpB Neisseria meningitidis, komórka gospodarza zawierająca taki polinukleotyd i sposób jej wytwarzania, sposoby wytwarzania rekombinowanego polipeptydu LbpB i pęcherzyka zewnątrzbłonowego zawierającego zrekombinowny LbpB, nielipidowany polipeptyd LbpB z Neisseria meningitidis, rekombinowny polipeptyd oraz polipeptyd LbpB z Neisseria meningitidis, jego fragment oraz swoiste immunologiczne przeciwciało wobec polipeptydu LbpB z Neiss
US20140286977A1 (en) Protein F - A Novel Haemophilus Influenzae Adhesin with Laminin and Vitronectin binding Properties
AU775996B2 (en) Cloning and expression of Haemophilus Somnus transferrin-binding proteins
CZ2000530A3 (cs) Protein Neisserie vázající laktoferin
JP2003506044A (ja) モラクセラ・カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）由来のＢＡＳＢ１１８ポリペプチドおよびポリヌクレオチド
MXPA00001591A (en) Neisseria lactoferrin binding protein
WO2000061165A1 (en) Conserved adhesin motif and methods of use thereof
JP2003506045A (ja) モラクセラ・カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）由来のＢＡＳＢ１１９ポリペプチドおよびポリヌクレオチド
JP2003511013A (ja) モラクセラ・カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）由来のＢＡＳＢ１３２ポリペプチドおよびポリヌクレオチド