ES2865485T3

ES2865485T3 - Nueva vacuna de conjugado meningocócico semisintético

Info

Publication number: ES2865485T3
Application number: ES15745570T
Authority: ES
Inventors: Akshay Goel; Santosh Renukuntla; Eswara Kowlakuntla; Mahima Datla; Narender Dev Mantena
Original assignee: Biological E Ltd
Current assignee: Biological E Ltd
Priority date: 2014-05-24
Filing date: 2015-05-22
Publication date: 2021-10-15
Anticipated expiration: 2035-05-22
Also published as: US11420993B2; EP3148577B1; EP3148577A2; SA516380338B1; WO2015181834A3; US20190389894A1; US20170198004A1; WO2015181834A4; WO2015181834A2

Abstract

Vacuna de conjugado meningocócico C semisintético de fórmula (II) **(Ver fórmula)** en la que m y n son números enteros que oscilan desde 1 hasta 10; R1 y R2 son iguales o diferentes y representan independientemente H, alquilo C1-6, acetilo; R4 representa H o alquilo C1-6; R5 representa H, alquilo C1-6, arilo; CP representa una proteína portadora, que se selecciona preferiblemente de toxoide tetánico (TT), toxoide diftérico (DT) o resto de reacción cruzada 197 (CRM197); L1 es un enlace, -O-, -S-, -NR8-, -C(=O)-, -NR8C(=O)-, -NR8C(=O)O-, -C(=O)NR8-, -OC(=O)NR8-, -SC(=O)-, -C(=O)S- , -OC(=O)-, -C(=O)O-, -NR8C(=S)-, -C(=S)NR8-, trans-CR9=CR9, cis-CR9=CR9, -C=C-, -OC(R9)2-, -C(R9)2O-, -NR8C(R9)2-, -C(R9)2NR8-, -SC(R9)2-, -C(R9)2S-, -S(=O)2O-, -OS( =O)2-, -S(=O)2NR8-, -NR8S(=O)2- o una cadena de hidrocarburo C1-20 opcionalmente sustituido, opcionalmente en la que una o más unidades de carbono de la cadena de hidrocarburo está reemplazada por -O-, -S-, -NR8-, -C(=O)-, NR8C(=O)-, -NR8C(=O)O-, -C(=O)NR8-, -OC(=O)NR8-, -SC(=O)-, -C(=O)S--OC(=O)-, -C(=O)O-, -NR8C(=S)-, -C(=S)NR8-, trans-CR9=CR9-, cis-CR9=CR9-, -C=C-, -S(=O)2O-, -OS(=O)2-, -S(=O)2NR8- o -NR8S(=O)2, en los que R8 es hidrógeno, alquilo C1-6 opcionalmente sustituido o un grupo protector de nitrógeno, o R8 está unido con el átomo de carbono adyacente para formar un anillo heterocíclico opcionalmente sustituido, y en los que cada aparición de R9 se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, alquilo C1-10 opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, carbociclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido y heteroarilo opcionalmente sustituido, o R9 está unido con el átomo de carbono o de nitrógeno o de oxígeno adyacente para formar un anillo carbocíclico o heterocíclico opcionalmente sustituido, o dos grupos R9 están unidos para formar un anillo carbocíclico opcionalmente sustituido o heterocíclico opcionalmente sustituido; L2 es un resto derivado de un reactivo de reticulación capaz de reticular el portador y L1, en la que L2 se selecciona de **(Ver fórmula)** o ; y R7 es independientemente hidrógeno, alquilo C1-6 opcionalmente sustituido, acilo opcionalmente sustituido o un grupo protector de nitrógeno, con la condición de que cuando m es de 1 a 2, entonces n no es de 1 a 5.

Description

DESCRIPCIÓN

Nueva vacuna de conjugado meningocócico semisintético

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una vacuna de conjugado meningocócico semisintético que comprende oligosacárido sintético conjugado con una proteína portadora. La presente divulgación también se refiere a un nuevo oligosacárido meningocócico sintético y a un procedimiento para su preparación.

Antecedentes de la invención

Neisseria meningitidis es la principal causa de meningitis bacteriana y septicemia en todo el mundo. Las bacterias meningocócicas incorporan polisacáridos en su estructura de superficie. Por tanto, la gran mayoría de bacterias están cubiertas con polisacárido de glicocáliz o cápsula que induce una respuesta inmunitaria en humanos. La membrana exterior de la bacteria Neisseria meningitidis (NM) Gram negativa consiste, entre otros, en lipopolisacárido (LPS). Tales polisacáridos (PS) se forman basándose en unidades de repetición en las que los constituyentes y los enlaces están definidos y que son cada uno característicos de los serogrupos de NM. Así, estas unidades de repetición contienen los epítopos o las estructuras determinantes de antigenicidad.

Una composición inmunogénica conjugada está compuesta por un componente de antígeno diana (polisacárido) conjugado químicamente con una proteína portadora. Estas vacunas se conocen por ser altamente inmunogénicas en todos los grupos de edad, incluyendo los lactantes. Un conjugado que comprende un oligosacárido unido covalentemente a una proteína portadora también se denomina glicoconjugado.

La inmunogenicidad de los polisacáridos capsulares puede mejorarse acoplándolos covalentemente a una proteína portadora. Cuando están unidos covalentemente a una proteína portadora, el componente de PS resultante en una vacuna de conjugado se convierte en un antígeno dependiente de células T (TD), que induce inmunidad a largo plazo con memoria inmunitaria incluso en lactantes y niños pequeños.

El documento WO 2010/111703 comenta donantes de fosfato de sialilo alfa-selectivos para la preparación de sialósidos y matrices de sialósido para la detección del virus de la gripe.

Guo, Zhongwu; Liao, Guochao y Zhou, Zhifang (Chem. Commun. (2015), 51, 9647-9650) mencionan la síntesis y el estudio inmunológico de conjugados del ácido a-2,9-oligosiálico como vacunas contra la meningitis del grupo C. El documento WO 02/058737 divulgó composiciones inmunológicas para el tratamiento de conjugados de polisacárido-proteína meningocócicos provocados por el patógeno Neisseria meningitidis, que comprenden dos o más conjugados de proteína-polisacárido, en las que cada uno de los conjugados comprende un polisacárido capsular de N. meningitidis conjugado con una proteína portadora.

El documento WO 03/007985 divulgó un procedimiento para purificar un polisacárido capsular bacteriano, que comprende las etapas de (a) precipitar el polisacárido, seguido por (b) solubilizar el polisacárido precipitado usando un alcohol.

Lin, Chang-Ching; et al. (Tetrahedron (2009), 65(24), 4714-4725) divulgaron la síntesis de ácido a -(2^9 ) tetrasiálico usando donante de fosfito y sialilaciones iterativas para alargar la cadena de azúcar desde el extremo no reductor al extremo reductor.

Chang-Ching Lin, et al. (J. Org. Chem., 2010, 75 (15), 4921-4928) divulgaron un método a-selectivo eficiente para la síntesis de ácido a -(2^9 ) tetrasiálico usando donantes de sialilo de tioglucósido protegido con 5-N,4-0-carbonilo.

Chu, Kuo-Ching; et al. (Angewandte Chemie, International Edition (2011), 50(40), 9391-9395) divulgaron la síntesis de ácidos a -(2^9 ) oligosiálicos: de monómeros a dodecámeros, que se consideran como las vacunas actuales contra enfermedades meningocócicas C. Puede usarse la ruta sintética de tetrasialósido y hexasialósido para sintetizar el pentámero de Men C propuesto usando donantes de sialilo de fosfato de glicosilo protegido con 5-N,4-0-carbonilo.

En el mercado hay disponibles varias vacunas de conjugado meningocócico C como productos monovalentes (por ejemplo, Neisvac-C®, Menjugate®) así como multivalentes (por ejemplo, Menactra®, Mencevax, Nimenrix, Menveo®). El componente de polisacárido en todas estas vacunas se deriva de la fermentación y purificación de las bacterias patógenas reales. El resto de sacárido en vacunas de glicoconjugado es habitualmente un polisacárido capsular (CPS) bacteriano funcionalizado. En tales procedimientos, los diversos desafíos a los que debe hacerse frente incluyen la necesidad de fermentación usando el huésped patógeno, control riguroso de aditivos y parámetros fisiológicos; etapas de purificación complicadas para retirar impurezas tales como proteína, endotoxinas, ácidos nucleicos, la necesidad de reducción del tamaño del oligosacárido purificado, la necesidad de unión de un grupo de unión al oligosacárido purificado y bajos rendimientos de conjugación. Así, la principal desventaja de estos procedimientos biológicos convencionales es la necesidad de purificaciones repetidas, lo que da como resultado bajos rendimientos.

El documento WO 2014/097099 A2 comentó que, antes de la etapa de activación, puede ajustar el tamaño del polisacárido de la invención para lograr un peso molecular apropiado. Esto se realiza o bien de manera mecánica o bien mediante hidrolización sencilla.

Con el fin de superar las desventajas asociadas con la preparación de oligosacáridos meningocócicos convencionales, los inventores de la presente invención han descubierto que la conjugación de una proteína portadora con un oligosacárido inmunogénico elaborado de manera sintética dará como resultado el desarrollo de una vacuna meningocócica rentable con una inmunogenicidad no inferior en comparación con las vacunas existentes.

Los polisacáridos sintéticos tienen varias ventajas potenciales con respecto a los polisacáridos nativos. Existe una facilidad de producción de estos polisacáridos sin la necesidad de fermentación. Los hidratos de carbono de origen natural son mezclas heterogéneas y pueden incluir pequeñas cantidades de contaminantes e impurezas naturales. En cambio, los hidratos de carbono sintéticos pueden producirse como compuestos individuales homogéneos de manera controlada, con poca o ninguna variabilidad entre lotes. Otra ventaja es que pueden elaborarse para incluir grupos funcionales para la derivatización o modificación del resto de hidrato de carbono que son difíciles o imposibles de realizar con un polisacárido nativo.

Objetivo de la invención

El principal objetivo de la presente invención es proporcionar una vacuna de conjugado de Men C semisintético, con una inmunogenicidad no inferior.

Aún otro objetivo es proporcionar una vacuna de conjugado de Men C semisintético sin usar el complicado procedimiento de fermentación y, por tanto, repetidas purificaciones en múltiples etapas.

Aún otro objetivo de la presente invención es proporcionar una producción de vacuna de conjugado de Men C libre de impurezas y económicamente viable.

Sumario de la invención

Por consiguiente, la presente divulgación proporciona un nuevo oligosacárido meningocócico C sintético de fórmula (I)

en la que m y n son números enteros que oscilan desde 1 hasta 10;

R1 y R2 son iguales o diferentes y representan independientemente H, alquilo C1-6, acetilo;

R3 representa azida, NR5R6, en el que R5 y R6 son iguales o diferentes y representan independientemente H, alquilo C1-6, arilo;

R4 representa H, alquilo C1-6, catión de metal alcalino seleccionado de Li, Na, K y Cs;

con la condición de que cuando m = de 1 a 2, entonces n no es de 1 a 5.

La presente invención proporciona una nueva vacuna de conjugado meningocócico C semisintético de fórmula (II)

en la que m y n son números enteros que oscilan desde 1 hasta 10;

R4 representa H o alquilo C1-6;

R5 representa H, alquilo C1-6, arilo;

CP representa una proteína portadora, que se selecciona preferiblemente de toxoide tetánico (TT), toxoide diftérico (DT) o resto de reacción cruzada 197 (CRM197);

L1 es un enlace, -O-, -S-, -NR8-, -C(=O)-, -NR8C(=O)-, -NR8C(=O)O-, -C(=O)NR8-, -OC(=O)NR8-, -SC(=O)-, -C(=O)S-, -OC(=O )-, -C(=O)O-, -NR8C(=S)-, -C(=S)NR8-, frans-CR9=CRg, C/S-CRg=CRg, -C=C-, -OC(R9)2-, -C(R9)2O-, -NR8C(R9)2-, -C(R9)2NR8-, -SC(R9)2-, -C(R9)2S-, -S(=O)2O-, -OS(=O)2-, -S (=O)2NR8-, -NR8S(=O)2- o una cadena de hidrocarburo C1.20 opcionalmente sustituido, opcionalmente en la que una o más unidades de carbono de la cadena de hidrocarburo está reemplazada por -O-, -S-, -NR8-, -C(=O)-, NR8C(=O)-, -NR8C(=O)O-, -C(=O)NR8-, -OC(=O)NR8--SC(=O)-, -C(=O)S--OC(=O)-, -C(=O)O-, -NR8C(=S)-, -C(=S)N R8-, trans-CR9=CR9-, Cs-CR9=c R9-, -C=C-, -S(=O)2O-, -OS(=O)2-, -S(=O)2NR8- o -NR8S(=O)2, en los que R8 es hidrógeno, alquilo C1.6 opcionalmente sustituido o un grupo protector de nitrógeno, o R8 está unido con el átomo de carbono adyacente para formar un anillo heterocíclico opcionalmente sustituido, y en los que cada aparición de R9 se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, alquilo C1-10 opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, carbociclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido y heteroarilo opcionalmente sustituido, o R9 está unido con el átomo de carbono o de nitrógeno o de oxígeno adyacente para formar un anillo carbocíclico o heterocíclico opcionalmente sustituido, o dos Rg grupos están unidos para formar un anillo carbocíclico opcionalmente sustituido o heterocíclico opcionalmente sustituido;

L2 es un resto derivado de un reactivo de reticulación capaz de reticular el portador y L1, en la que L2 se selecciona de

R7 es independientemente hidrógeno, alquilo C1-6 opcionalmente sustituido, acilo opcionalmente sustituido o un grupo protector de nitrógeno,

con la condición de que cuando m es de 1 a 2, entonces n no es de 1 a 5.

Breve descripción de los dibujos:

Figura 1: 1H-RMN del nuevo oligosacárido sintético.

Figura 2: Peso molecular del oligosacárido sintético (EMAR).

Figura 3: Confirmación analítica (TOCSY) del oligosacárido en conjugado semisintético a granel.

Figura 4: Cuantificación de ácido siálico en el conjugado meningocócico C semisintético usando ácido siálico como patrón de referencia mediante el método de HPAEC-PAD.

Figura 5: Niveles de anticuerpo anti-IgG de polisacárido meningocócico individuales medidos mediante ELISA específico de serotipo.

Figura 6: Media geométrica de las concentraciones de anticuerpo anti-IgG de MenC para el grupo de ratones tras la inmunización con formulaciones de vacuna de prueba y de referencia.

Figura 7: Título de rSBA relativo para sueros obtenidos tras la inmunización con sMenC, en el que la media geométrica se presenta como una barra.

Descripción detallada de la invención

El polisacárido capsular del serogrupo C de Neisseria meningitidis es un homopolímero de ácido N-acetil-neuramínico unido a -2^-9,^9)-D-NeupNAc(7/8OAc)-a-(2^, con grupo O-acetilo en la posición C7 y C8 en un porcentaje variable. La presente divulgación proporciona un nuevo oligosacárido meningocócico C sintético de fórmula (I)

en la que m y n son números enteros que oscilan desde 1 hasta 10;

R4 representa H, alquilo Ci-6,catión de metal alcalino seleccionado de Li, Na, K y Cs;

con la condición de que cuando m = de 1 a 2, entonces n no es de 1 a 5.

La presente invención proporciona una vacuna de conjugado meningocócico C semisintético de fórmula (II)

en la que m y n son números enteros que oscilan desde 1 hasta 10;

R4 representa H o alquilo C1-6;

R5 representa H, alquilo C1-6, arilo;

L1 es un enlace, -O-, -S-, -NR8-, -C(=O)-, -NR8C(=O)-, -NR8C(=O)O-, -C(=O)NR8-, -OC(=O)NR8-, -SC(=O)-, -C(=O)S-, -OC(=O )-, -C(=O)O-, -NR8C(=S)-, -C(=S)NR8-, frans-CR9=CRg, C/S-CRg=CRg, -C=C-, -OC(R9)2-, -C(R9)2O-, -NR8C(R9)2-, -C(R9)2NR8-, -SC(R9)2-, -C(R9)2S-, -S(=O)2O-, -OS(=O)2-, -S (=O)2NR8-, -NR8S(=O)2- o una cadena de hidrocarburo C1.20 opcionalmente sustituido, opcionalmente en la que una o más unidades de carbono de la cadena de hidrocarburo está reemplazada por -O-, -S-, -NR8-, -C(=O)-, NR8C(=O)-, -NR8C(=O)O-, -C(=O)NR8-, -OC(=O)NR8--SC(=O)-, -C(=O)S--OC(=O)-, -C(=O)O-, -NR8C(=S)-, -C(=S)N R8-, trans-CR9=CR9-, cis-CR⁹=cR ⁹-, -C=C-, -S(=O)2O-, -OS(=O)2-, -S(=O)2NR8- o -NR8S(=O)2, en los que R8 es hidrógeno, alquilo C1-6 opcionalmente sustituido o un grupo protector de nitrógeno, o R8 está unido con el átomo de carbono adyacente para formar un anillo heterocíclico opcionalmente sustituido, y en los que cada aparición de R9 se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, alquilo C1-10 opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, carbociclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido y heteroarilo opcionalmente sustituido, o R9 está unido con el átomo de carbono o de nitrógeno o de oxígeno adyacente para formar un anillo carbocíclico o heterocíclico opcionalmente sustituido, o dos R9 grupos están unidos para formar un anillo carbocíclico opcionalmente sustituido o heterocíclico opcionalmente sustituido;

con la condición de que cuando m es de 1 a 2, entonces n no es de 1 a 5.

En una realización preferida, L1 es de fórmula

En un aspecto preferido, la presente divulgación se refiere a un oligosacárido meningocócico C sintético de fórmula (IA)

en la que m y n son números enteros que oscilan desde 1 hasta 10;

con la condición de que cuando m es de 1 a 2, n no es de 1 a 5.

En una realización, la presente invención también proporciona un procedimiento para la preparación de una vacuna de conjugado meningocócico semisintético, que comprende las etapas de:

a) sintetizar el oligosacárido meningocócico de fórmula (I):

en la que m y n son números enteros que oscilan desde 1 hasta 10;

en la que R1, R2 y R4 tienen el mismo significado que se definió anteriormente para la fórmula (II);

R3 representa NR5R6, en el que R5 y R6 son iguales o diferentes y representan independientemente H, alquilo C1-6, arilo;

con la condición de que cuando m = de 1 a 2, entonces n no es de 1 a 5,

b) activar el oligosacárido,

c) derivatizar la proteína portadora,

d) conjugar el oligosacárido meningocócico obtenido en la etapa (b) con la proteína portadora derivatizada obtenida en la etapa (c), y

e) purificar la vacuna de conjugado obtenida en la etapa (d).

En una realización preferida, el oligómero sintético (sMenC) se activa usando éster de N-hidroxisuccinimida del ácido 6-maleimidohexanoico. La proteína portadora se derivatiza usando éster de N-hidroxisuccinimida del ácido 3-(acetiltio)propiónico.

Los reactivos de reticulación adecuados para la invención se conocen ampliamente en la técnica (véase, por ejemplo, 1994 Pierce Technical Handbook: reticulación disponible en http://www.piercenet.com/resources/browse.cfm?fldID=184).

En una realización preferida, el reactivo de reticulación usado para derivatizar la proteína portadora es

En determinadas realizaciones, la invención proporciona un método de preparación de una vacuna de conjugado de fórmula (II) descrita en el presente documento, que comprende acoplar un compuesto de fórmula

en la que L2 es un reactivo de reticulación capaz de reticular un grupo amino y -SH.

En otra realización, la vacuna de conjugado semisintético preferida es de fórmula que se proporciona a continuación:

En otra realización, el portador es un proteína, un lípido, una proteína lipolizada, un virus, un péptido que comprende un epítopo de células T o un dendrímero de glicopéptidos. En determinadas realizaciones, el portador es una proteína de toxina seleccionada del grupo que consiste en toxina diftérica-material de reacción cruzada 197 (DT-CRM197), toxoide diftérico (DT), toxoide tetánico (TT) y proteína de la membrana exterior (OMP). Preferiblemente, la proteína portadora es toxoide tetánico, toxoide diftérico o CRM197.

La activación del oligosacárido se lleva a cabo usando éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) del ácido bromoacético, éster de NHS del ácido 6-maleimidohexanoico, éster de NHS del ácido 6-(yodoacetamido)caproico, éster de NHS del ácido maleimidopropiónico, éster de NHS del ácido maleimidoacético, éster de NHS del ácido maleimidobenzoico y similares.

La derivatización de la proteína portadora se lleva a cabo usando éster de N-hidroxisuccinimida del ácido 3-(acetiltio)propiónico, éster de NHS del ácido acetiltio-hexadecanoico y similares.

El componente de polisacárido fabricado usando un procedimiento químico se denomina oligosacárido u oligómero sintético. El constructo de conjugado usando el oligosacárido sintético y una proteína portadora se denomina conjugado semisintético.

Tal como se usa en el presente documento, el término “Men C” se refiere al componente de serogrupo C de Neisseria meningitidis de la vacuna. El componente de polisacárido capsular Men C fabricado usando un procedimiento químico se denomina, por tanto, oligómero sMenC (o sMenC). El sMenC se conjuga adicionalmente con una proteína portadora para proporcionar una composición inmunogénica semisintética.

Tal como se usa en el presente documento, el término “oligómero” o “sacárido capsular” se refiere a oligosacáridos. Los términos pueden usarse de manera intercambiable.

Los ejemplos de grupos protectores y detalles de su utilización están disponibles en, por ejemplo, Greene, T. W. y Wuts, R G. M., Protective Groups in Organic Synthesis, 2a ed. (1991).

Los siguientes compuestos son los nuevos oligómeros meningocócicos sintéticos preferidos de la presente divulgación:

A continuación se proporcionan las vacunas de conjugado meningocócico C semisintético preferidas de la presente invención:

En aún otro aspecto, la presente divulgación proporciona un procedimiento para la preparación de oligómero sMenC de fórmula (I) tal como se muestra en el esquema I que se proporciona a continuación:

en el que A representa un grupo saliente, tal como halógeno (tal como F, Cl, Br o I (yodo)), alcoxicarboniloxilo, ariloxicarboniloxilo, alcanosulfoniloxilo, arenosulfoniloxilo, alquil-carboniloxilo (por ejemplo, acetoxilo), arilcarboniloxilo, ariloxilo, metoxilo, W,0-dimetilhidroxilamino, pixilo y haloformiatos. En algunos casos, el grupo saliente es un éster de ácido sulfónico, tal como toluenosulfonato (tosilato, -OTs), metanosulfonato (mesilato, -OMs), p-bromobencenosulfoniloxilo (brosilato, -OBs) o trifluorometanosulfonato (triflato, -OTf);

Ri es cloroacetato, dicloroacetato, tricloroacetato, trifluoroacetato.

Etapa (i): acoplamiento de compuesto (1) y (2), seguido por acetilación para producir el compuesto de fórmula (3). El acoplamiento se lleva a cabo en presencia de disolventes tales como diclorometano, acetonitrilo, propionitrilo, éter, acetona, cloroacetonitrilo, N,N-dimetilformamida, tetrahidrofurano, dimetilsulfóxido y similares, o una mezcla de los mismos, usando N-yodosuccinimida (NIS), N-bromosuccinimida (NBS) y similares. La reacción puede llevarse a cabo en presencia de catalizadores tales como TMSOTf, TESOTf, TfOH, Tf2O, AgOTf, BF3.Et2O, triflatos de lantánido y similares, a una temperatura en el intervalo de -78°C a 25°C durante un periodo en el intervalo de 1-12 horas.

La acetilación de los grupos hidroxilo del producto acoplado se lleva a cabo usando anhídrido acético, cloruro de acetilo en presencia de una base tal como DIPEA, TEA, imidazol, lutidina, piridina y similares, así como TfOH, TMSOTf, BF3.Et2O, triflatos de lantánido y similares.

Etapa (ii): la descloroacetilación se lleva a cabo en presencia de disolventes tales como metanol, etanol, isopropanol, acetona, acetonitrilo y similares usando bases tales como DIPEA, TEA, imidazol, piridina y similares.

Etapa (iii): repetición de las reacciones de sialilación, acetilación y descloroacetilación para producir sialósidos de orden alto. Esta secuencia de tres etapas proporciona los ácidos trisiálico y tetrasiálico.

Etapa (iv): desprotección y desesterificación. La reacción se lleva a cabo usando disolventes tales como etanol, metanol, propanol, /-propanol, agua y similares; y bases tales como hidróxido de litio, hidróxido de sodio, hidróxido de potasio y similares. La reacción se lleva a cabo a una temperatura en el intervalo de 25°C a 80°C. Las aminas resultantes se acetilaron en N usando agentes de acetilación tales como anhídrido acético, cloruro de acetilo y similares en presencia de bases tales como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, NaHCO3, DIPEA, TEA, imidazol, piridina y similares.

En aún otro aspecto, el compuesto de fórmula (I), en la que R3 representa azida, se convierte en amino. La reacción se lleva a cabo usando agentes reductores tales como Pd/C, Pt/C, LiAlH4, borohidruro de sodio y similares en un método convencional.

En una realización, la presente invención también proporciona un procedimiento para la preparación de una vacuna de conjugado semisintético de fórmula (II), que comprende las etapas de:

Etapa 1: derivatización de la proteína portadora.

A la proteína portadora se le añade éster N-succinimidílico del ácido 3-(acetiltio)propiónico y se incuba. Se desala la mezcla y se intercambia el tampón con solución salina tamponada con fosfato (Pb S). Además, se trata la disolución con clorhidrato de hidroxilamina y se incuba. Se desala y concentra esta mezcla.

Etapa 2: activación del oligosacárido.

Se activa el oligosacárido con grupo de unión con éster de N-hidroxisuccinimida del ácido 6-maleimidohexanoico y luego se incuba para que se produzca la reacción. Se desala y concentra adicionalmente esta mezcla.

Etapa 3: conjugación.

Se mezclan la proteína portadora derivatizada y el oligosacárido sintético activado y se incuba para formar la vacuna de conjugado. Se purifica el conjugado usando diafiltración para generar un conjugado a granel.

Los aspectos fisicoquímicos, así como la respuesta inmunitaria del constructo semisintético, se caracterizan mediante métodos analíticos.

La vacuna de conjugado semisintético de la presente invención se caracteriza física y químicamente para confirmar y cuantificar la presencia de oligosacárido sintético. El constructo también se caracteriza usando espectroscopía de correlación total (TOCSY) bidimensional para confirmar la presencia de siálico ácido en el conjugado meningocócico C semisintético a granel.

Los aspectos fisicoquímicos de la vacuna de conjugado semisintético se miden mediante las siguientes técnicas: a. Espectros de RMN del oligosacárido sintético (figura 1);

b. Espectroscopía de masas de alta resolución (EMAR) del oligosacárido meningocócico C sintético. La EMAR confirma el peso molecular del constructo de glicano (figura 2);

c. TOCSY (120 ms) del conjugado meningocócico C semisintético a granel. (figura 3);

d. Cuantificación de ácido siálico en el conjugado meningocócico C semisintético usando ácido siálico como patrón de referencia mediante el método de HPAEC-PAD (figura 4).

La actividad inmunogénica de los oligosacáridos descritos en el presente documento se potencia a menudo mediante conjugación con una proteína. Por tanto, la invención incluye la conjugación del oligosacárido con una proteína a través de un resto grupo de unión, que puede ser L1 y L2 en la fórmula (II).

Se midió la respuesta inmunitaria en ratones después de cada dosis en una pauta de 3 dosis de conjugado meningocócico C semisintético, en comparación con referencias tales como Quadri Meningo no conjugado y Menectra® conjugado.

También se determinó la inmunogenicidad de ratón mediante ELISA. Se midió la respuesta de anticuerpos mediante ELISA indirecto usando antígeno de recubrimiento de polisacárido comercial en placas NUNC covalink. Se midieron las lecturas usando un lector de placas de 96 pocillos.

También se realizó la identificación de la antigenicidad mediante ensayo de inmunodifusión. Se evaluó la antigenicidad del conjugado usando antisuero meningocócico del grupo C mediante inmunodifusión en comparación con polisacárido purificado negativo de N. meningitidis C, que sirvió como referencia positiva. Se observó una región clara de precipitado de anticuerpo frente a antígeno.

Las composiciones inmunogénicas de la invención son adecuadas para su uso en humanos adultos así como en niños. Opcionalmente, una composición de este tipo puede administrarse en combinación con otras sustancias farmacéuticamente activas y, con frecuencia, se administrará en combinación con otras vacunas como parte de un programa de vacunación infantil. Las composiciones para administración pueden incluir de manera beneficiosa otros tipos de compuestos inmunogénicos, tales como glicoconjugados, que provocan una respuesta inmunitaria contra otros patógenos de meningitis.

En aún otra realización, la presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden la vacuna de conjugado meningocócico C semisintético de la invención junto con al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Se demuestra que el conjugado semisintético de la presente invención es inmunogénico en un modelo animal establecido (ratones). Se demuestra que los sueros aislado después de la vacunación primaria contienen anticuerpos específicos para el polisacárido meningocócico C (ELISA). Además, los ensayos de inmunodifusión muestran una clara banda de precipitación correspondiente a anticuerpos neutralizantes contra el polisacárido meningocócico C. Las ventajas de la vacuna de conjugado meningocócico semisintético de la presente invención incluyen:

1. El componente de polisacárido se fabrica de manera sintética en lugar de derivarse de un procedimiento biológico. El grupo de unión con múltiples carbonos en el constructo de oligosacárido sintético se une al oligómero sin la participación de una etapa de procedimiento independiente;

2. El procedimiento de conjugación usando la química del tiol con el constructo de oligosacárido sintético da como resultado altos rendimientos.

3. La construcción de un antígeno independiente de células T (oligómero o glicano) que se transforma en un antígeno dependiente de células T tras la conjugación;

4. Los oligosacáridos son pequeños y tienen la posibilidad de conjugarse con diferentes proteínas portadoras.

La invención también proporciona vacunas y composiciones inmunogénicas que comprenden sacárido capsular sintético del serogrupo C de N. meningitidis y sacáridos capsulares de al menos dos de los serogrupos A, W135 e Y de N. meningitidis, en las que dichos sacáridos capsulares se conjugan con proteína(s) portadora(s), cuyos métodos se conocen en la técnica. Por ejemplo, la siguiente bibliografía proporciona la conjugación de polisacáridos con una proteína portadora.

1. Joanna Kubler-Kielb y Vince Pozsgay, National Institute of Child Health and Human Development, National Institutes of Health, 31 Center Dr. MSC 2423 Bethesda, MD;

2. Joanna Kubler-Kielb et al., Oligosaccharide conjugates of Bordetella pertussis and bronchiseptica induce bactericidal antibodies, an addition to pertussis vaccine, PNAS 2011, 108:4087-92;

3. Joanna Kubler-Kielb y Vince Pozsgay, A New Method for Conjugation of Carbohydrates to Proteins Using an Aminooxy-Thiol Heterobifunctional Linker, J. Org. Chem. 2005, 70, 6987-6990;

4. J. Kubler-Kielb, E. Vinogradov, G. Ben-Menachem, V. Pozsgay, J. B. Robbins, R. Schneerson, Saccharide/protein conjugate vaccines for Bordetella species: preparation of saccharide, development of new conjugation procedures, and physico-chemical and immunological characterization of the conjugates. Vaccine 2008, 26: 3587-93.

La presente invención proporciona un kit que comprende: (a) sacárido capsular sintético del serogrupo C de N. meningitidis, conjugado con una proteína portadora (b) sacáridos capsulares de los serogrupos A, W135 e Y de N. meningitidis, conjugados con una proteína portadora.

En aún otra realización, el sacárido capsular sintético conjugado del serogrupo C de N. meningitidis tiene una razón de sacárido:proteína (p/p) de entre 0,1:1 y 2:1.

En aún otra realización, la presente invención proporciona una composición inmunogénica que comprende una vacuna de conjugado semisintético que contiene de 1 |ig a 10 |ig de oligosacárido Men C sintético conjugado con de 5 a 20 |ig de proteína portadora. La presente invención comprende además de 1 |ig a 10 |ig de cada polisacárido seleccionado de los serogrupos meningocócicos A, Y y W-135, cada uno conjugado individualmente a de 5 a 20 |ig de proteína portadora.

Las vacunas y composiciones farmacéuticas de la invención están destinadas para administración parenteral, tópica, oral o local. Preferiblemente, se administran por vía parenteral, por ejemplo, por vía intravenosa, subcutánea, intradérmica o intramuscular. Por tanto, la invención proporciona composiciones para administración parenteral que comprenden una disolución del resto inmunogénico disuelto o suspendido en un excipiente aceptable, preferiblemente un portador principalmente acuoso. Puede usarse una variedad de portadores acuosos, por ejemplo, agua, agua tamponada, solución salina al 0,8%, glicina al 0,3%, ácido hialurónico y similares. Estas composiciones pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales o pueden esterilizarse por filtración. Las disoluciones acuosas resultantes pueden envasarse para su uso como tal o liofilizarse, combinándose la preparación liofilizada con una disolución estéril antes de la administración.

La invención proporciona una composición inmunogénica que comprende un conjugado de oligosacárido meningocócico C semisintético, y que comprende además (i) un adyuvante de fosfato de aluminio o de hidróxido de aluminio (ii) un tampón, preferiblemente un tampón fosfato, y opcionalmente uno o más excipientes seleccionados de sacarosa, polisorbato y trometamol, y similares.

La invención también proporciona el uso de un sacárido capsular sintético del serogrupo C de N. meningitidis, o de un conjugado del mismo, en la fabricación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de una enfermedad provocada por bacterias encapsuladas. Las enfermedades provocadas por Neisseria incluyen meningitis, septicemia y gonorrea. Las enfermedades provocadas por H. influenzae incluyen otitis media, bronquitis, neumonía, celulitis, pericarditis y meningitis. Las enfermedades provocadas por Pneumococcus incluyen meningitis, septicemia y neumonía.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar la invención, y simplemente son a modo de ilustración y no debe interpretarse como que limitan el alcance de la invención.

Ejemplo 1

Preparación del compuesto 2

A una disolución con agitación de 6-bromo-1-hexanol (25 g, 0,138 mol) en DMF, se le añadió azida de sodio (18 g, 0,277 mol) a 0°C y se agitó a T.A. durante 24 h. Se extinguió la mezcla de reacción con agua helada y se extrajo con dietil éter. Se lavó la fase orgánica con salmuera, se separó, se secó sobre Na2SO4 y se concentró. Se obtuvo 6-azido-1-hexanol como un líquido incoloro (17 g, 75%).

A una disolución con agitación del compuesto 1 (40 g, 62,30 mmol) y 6-azido-1-hexanol (10,6 g) en DCM (265 ml) y acetonitrilo (135 ml) se le añadió MS 4A° (40 g), se enfrió hasta -78°C. A esta mezcla se le añadieron NIS (20,04 g, 89,09 mmol), TfOH (2,65 ml, 18,6 mmol). Se elevó la temperatura de reacción hasta -50°C y se agitó durante 30 min. Se extinguió la mezcla de reacción con disolución hipotónica saturada (150 ml), se filtró a través de Celite, se separó la fase orgánica, se lavó con agua, se secó sobre Na2SO4 y se concentró. Se purificó el compuesto en bruto mediante CCP eluyendo con el 10-20% de acetato de etilo y hexanos, se obtuvo el compuesto la como un sólido pegajoso blanquecino (28 g, 65%).

A una disolución con agitación del compuesto la (34 g, 51,5 mmol) en metanol (1,3 l), se le añadió trietilamina (7,1 ml,51,5 mmol) a la mezcla de reacción a 0°C y se agitó durante 30 minutos a T.A. Una vez completada, se neutralizó la mezcla de reacción (pH 7) con disolución de HCl al 10% y se concentró la mezcla de reacción a presión reducida. Se purificó el compuesto en bruto mediante CCP eluyendo con acetato de etilo, hexanos y metanol (1:1:0,1). Se obtuvo el compuesto 2 como un sólido pegajoso (14 g, 60%).

Preparación del compuesto 3

(i) A una mezcla con agitación del compuesto 1 (40 g, 62,30 mmol, preparado tal como se describe en J. Org. Chem., 2010, 75, 4921-4928) y el compuesto 2 (10,65 g) en DCM (140 ml) y acetonitrilo (70 ml), se le añadió MS 3A° (20 g), se enfrió hasta -78°C. A esta mezcla se le añadieron NIS (6,937 g, 44,102 mmol), ácido tríflico (1,28 ml, 14,494 mmol). Se elevó la temperatura de reacción hasta -50°C y se agitó durante 30 min. Se extinguió la mezcla de reacción con disolución saturada de Na2S2O3 (150 ml), se filtró a través de Celite, se separó la fase orgánica, se lavó con agua, se secó sobre Na2SO4 y se concentró. Se colocó el compuesto en bruto (31 g) en la siguiente etapa.

(ii) A la disolución del material en bruto en CH2Cl2 (400 ml), se enfrió hasta 0°C, se le añadieron Ac2O (11,65 ml, 123,364 mmol) y TfOH (0,272 ml, 3,084 mmol). Se agitó la reacción a 0°C durante 15 min y luego se extinguió con disolución saturada de NaHCO3. Se separó la fase orgánica, se lavó con disolución de salmuera, se secó sobre Na2SO4 y se concentró. Se aisló el dímero 3 (17 g, 50% para 2 etapas) mediante CCP eluyendo con el 50-60% de acetato de etilo; hexanos como un sólido blanquecino.

Preparación del compuesto 4

A una disolución con agitación del dímero 3 (16 g, 15,46 mmol) en MeOH (600 ml) y EtOAc (100 ml), se le añadió Et3N (2,15 ml, 15,46 mmol) a la mezcla de reacción a 0°C y se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Luego se neutralizó la mezcla de reacción hasta pH 7 con disolución de HCl al 10% y se concentró. Se aisló el producto 4 mediante CCP eluyendo con acetato de etilo, hexanos y metanol (1:1:0,1) como un sólido blanco (6 g, 50%).

Preparación del compuesto 5

Se acoplaron el compuesto 1 (5 g, 7,453 mmol) y el compuesto 4 (5 g, 6,211 mmol) usando un método similar al descrito para la etapa i del dímero 3 (40 ml de DCm , 20 ml de CH3CN, 3,1 g de MS 3a °, 2,5 g de NIS, 0,275 ml de TfOH).Se colocó el compuesto en bruto (10 g) en la siguiente etapa sin purificación.

Se trató el producto en bruto en un método similar al descrito para la etapa ii del dímero 3 (100 ml de DCM, 2,95 ml de Ac2O, 0,137 ml de TfOH). Se aisló el trímero 5 (4,3 g, 40% para 2 etapas) mediante CCP eluyendo con el 50-60% de acetato de etilo; hexanos como un sólido blanquecino.

Preparación del compuesto 6

Se trató el trímero 5 (4,8 g, 3,409 mmol) en un método similar al descrito para el compuesto 4 (190 ml de MeOH, 37 ml de EtOAc, 0,473 ml de Et3N, 3,409 mmol). Se aisló el producto 6 (2 g, 45%) mediante CCP eluyendo con acetato de etilo, hexanos y metanol (1:1:0,2) como un sólido blanco.

Preparación del compuesto 7

(i) Se acoplaron el compuesto 1 (1,308 g, 2,307 mmol) y el compuesto 6 (2 g, 1,697 mmol) usando un método similar al descrito para la etapa i del dímero 3 (16 ml de Dc M, 8 ml de CH3CN, 0,85 g de MS 3A°, 0,687 g de NIS, 0,072 ml de TfOH). Se colocó el compuesto en bruto (3 g) en la siguiente etapa sin purificación.

(ii) Se trató el compuesto en bruto en un método similar al descrito para el compuesto 4 (100 ml de MeOH, 15 ml de EtOAc, 0,25 ml de Et3N). Se colocó el compuesto en bruto (3 g) en la siguiente etapa sin purificación.

(iii) A una disolución con agitación del producto en bruto anterior en piridina (4 ml), se le añadió anhídrido acético (2 ml) y se agitó a T.A. durante 24 h. Se aisló el tetrasialósido 7 (1 g, 35%) mediante CCP eluyendo con acetato de etilo, hexanos y metanol (1:1:0,2) como un sólido blanco.

Preparación del compuesto 8

(i) A una disolución con agitación de tetrasialósido 7 (1 g, 0,5963 mmol) en etanol (60 ml) y agua (60 ml), se le añadió hidróxido de litio monohidratado (0,75 g, 17,889 mmol) y se mantuvo la reacción a 80°C durante 24 h. Se neutralizó la mezcla de reacción con disolución de HCl al 10% y luego se concentró.

(ii) Se disolvió el residuo (1,8 g) en agua (20 ml) y luego se le añadió NaHCO3 (1 g, 11,926 mmol) seguido por anhídrido acético (0,608 g, 5,963 mmol) a T.A. Después de agitarse durante 16 h adicionales, se evaporó el disolvente a presión reducida y se colocó el producto en bruto en la siguiente etapa.

(iii) Se disolvió el residuo en metanol (20 ml) y luego se le añadió NaOMe (0,65 g, 11,926 mmol) a T.A. Después de agitarse durante 16 h, se neutralizó la mezcla de reacción con resina Dowex WxB 50*8 y se filtró y concentró la disolución neutralizada. Se purificó el residuo mediante Biogel P2 eluyendo con agua. Se liofilizó el producto obtenido para proporcionar ácido tetrasiálico 8 como un sólido blanco (0,5 g, 60% para 3 etapas).

Preparación de tetrámero del compuesto 9

A una disolución con agitación de ácido tetrasiálico 8 (0,5 g, 0,3825 mmol) en etanol (20 ml) y agua (10 ml), se le añadieron ácido acético (10 ml) y Pd al 10%/C (0,2 g). Después de purgar con N2, se filtró la mezcla de reacción a través de Celite y se concentró a presión reducida a T.A. Se purificó el producto mediante Sephadex-G-10 eluyendo con agua. Se liofilizó el producto 9 obtenido para conseguir el producto requerido como un sólido blanco (0,3 g, 60%). Ejemplo 2

Derivatización de la proteína portadora para la conjugación

Se concentró el toxoide tetánico y se intercambió el tampón con PBS 10 mM hasta de 5 a 20 mg/ml. A esto se le añadió un equivalente 25 molar de éster N-hidroxisuccinimidílico del ácido 3-(acetilotio)propiónico frente a la concentración molar de amina. Después de eso, se incubó finalmente a temperatura ambiente durante 2 horas. Después del periodo de incubación, se desaló la mezcla de reacción y se intercambió el tampón con PBS 10 mM usando un filtro de membrana con valor de corte de 10 kD. Se desacetiló usando clorhidrato de hidroxilamina y luego se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas. Finalmente, se desaló y concentró con PBS 10 mM.

Ejemplo 3

Activación del oligosacárido

En primer lugar, se estimó la concentración de amina del oligómero mediante el ensayo de TNBS. Luego se añadió un equivalente 1,5 molar de éster de N-hidroxisuccinimida del ácido 6-maleimidohexanoico con respecto a la concentración molar de amina del oligómero. Se incubó esta mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 5 horas. Después de eso, se secó el oligómero derivatizado usando vacío durante una hora. Luego se desaló y se intercambió el tampón con PBS 10 mM usando cromatografía y se concentró hasta de aproximadamente 5 a 10 mg/ml. Ejemplo 4

Conjugación del oligosacárido sintético con la proteína portadora

Se conjugó el oligómero preparado de manera sintética con la proteína portadora (TT) usando la química del tiol, en la que se mezclaron tanto el oligómero activado como el TT derivatizado preparados anteriormente y se incubó a de 2 a 8°C durante 96 horas.

Después de formarse el conjugado, se purificó y se siguió por intercambio del tampón con 1X PBS para lo cual se usó un filtro de membrana con un valor de corte de 10 kD. Finalmente, se filtró a través de un filtro de 0,2 |i.

Ejemplo 5

Prueba para determinar la inmunogenicidad de la vacuna de oligosacárido semisintético

Se realizó un estudio de inmunogenicidad en ratón de la formulación de conjugado meningocócico del serogrupo C semisintético. Se administró por vía subcutánea. Se inmunizó un grupo de 10 ratones con 3 dosis de vacuna y cada vez se tomó el sangrado terminal después de 7 días. El grupo de control que recibía Menactra recibió 2 dosis. Después de eso, se midieron los niveles de anticuerpo anti-IgG de polisacárido meningocócico C (Men-c) mediante ELISA específico de serotipo. De manera similar, se agruparon y usaron los sueros de los sangrados terminales de 10 ratones inmunizados con Menactra. Se asignó la concentración de anticuerpos para el patrón con un valor arbitrario de 100 unidades/ml. Se calculó la concentración de anticuerpos para la formulación de vacuna de prueba en relación con el patrón.

Se descubrió que la media geométrica de la concentración de anticuerpos tras la primera dosis de Men C semisintético era de 1,4, se observó un aumento significativo tras la segunda dosis que proporcionó una concentración media de anticuerpos de 176,23 unidades/ml. Esto fue análogo con una respuesta de memoria y todos los ratones mostraron un contenido aumentado de anticuerpos. La concentración media de anticuerpos aumentó tras la tercera dosis hasta 412,5 unidades/ml. (figura 5 y figura 6). Esto indica que la formulación semisintética provocó una respuesta de anticuerpos con un perfil similar a la vacuna de conjugado clásica.

Para determinar los anticuerpos funcionales en respuesta a la vacunación, se realizó el ensayo bactericida del suero (SBA). Se adquirieron los sueros tras la inmunización con composición de conjugado Men C semisintético, se obtuvieron sueros de control a partir de ratones inmunizados con Quadri Meningo y Menactra®. El análisis de la varianza entre todos los grupos mostró una diferencia significativa (p=0,00). La consulta de la diferencia entre los grupos, realizada usando la prueba de Dunnett con múltiples comparaciones, demostró títulos significativamente mayores para los grupos de CONTROL, es decir, sueros de la vacuna Quadri Meningo (p-0,00) y sueros de la vacuna Menactra® (p=0,003) (figura 7).

Por tanto, se encontró una alta concentración de anticuerpos anti-IgG funcionales capaces de destruir Neisseria meningitidis en el SBA para una preparación de sMen-C administrada a una dosificación de inmunización de 2,5 |ig.

Claims

REIVINDICACIONES

Vacuna de conjugado meningocócico C semisintético de fórmula (II)

en la que m y n son números enteros que oscilan desde 1 hasta 10;

R1 y R2 son iguales o diferentes y representan independientemente H, alquilo C1-6, acetilo;

R4 representa H o alquilo C1-6;

R5 representa H, alquilo C1-6, arilo;

CP representa una proteína portadora, que se selecciona preferiblemente de toxoide tetánico (TT), toxoide diftérico (DT) o resto de reacción cruzada 197 (CRM197);

L1 es un enlace, -O-, -S-, -NR8-, -C(=O)-, -NR8C(=O)-, -NR8C(=O)O-, -C(=O)NR8-, -OC(=O)NR8-, -SC(=O)-, -C(=O)S-, -OC(=O)-, -C(=O)O-, -NR8C(=S)-, -C(=S)NR8-, trans-CRg=CRg, cis-CRg=CRg, -C=C-, -OC(Rg)2-, -C(Rg)2O-, -NR8C(Rg)2-, -C(Rg)2NR8-, -SC(Rg)2-, -C(Rg)2S-, -S(=O)2O-, -OS( =O)2-, -S(=O)2NR8-, -NR8S(=O)2- o una cadena de hidrocarburo C1-20 opcionalmente sustituido, opcionalmente en la que una o más unidades de carbono de la cadena de hidrocarburo está reemplazada por -O-, -S-, -NR8-, -C(=O)-, NR8C(=O)-, -NR8C(=O)O-, -C(=O)NR8-, -OC(=O)NR8-, -SC(=O)-, -C(=O)S--OC(=O)-, -C(=O)O-, -NR8C(=S)-, -C(=S)NR8-, trans-CRg=CRg-, cis-CRg=CRg-, -C=C-, -S(=O)2O-, -OS(=O)2-, -S(=O)2NR8- o -NR8S(=O)2, en los que R8 es hidrógeno, alquilo C1-6 opcionalmente sustituido o un grupo protector de nitrógeno, o R8 está unido con el átomo de carbono adyacente para formar un anillo heterocíclico opcionalmente sustituido, y en los que cada aparición de Rg se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, alquilo C1-10 opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, carbociclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido y heteroarilo opcionalmente sustituido, o Rg está unido con el átomo de carbono o de nitrógeno o de oxígeno adyacente para formar un anillo carbocíclico o heterocíclico opcionalmente sustituido, o dos grupos Rg están unidos para formar un anillo carbocíclico opcionalmente sustituido o heterocíclico opcionalmente sustituido;

L2 es un resto derivado de un reactivo de reticulación capaz de reticular el portador y L1, en la que L2 se selecciona de

R7 es independientemente hidrógeno, alquilo C1-6 opcionalmente sustituido, acilo opcionalmente sustituido o un grupo protector de nitrógeno,

con la condición de que cuando m es de 1 a 2, entonces n no es de 1 a 5.

Procedimiento para la preparación de vacuna de conjugado meningocócico semisintético según la reivindicación 1, que comprende las etapas de:

a) sintetizar el oligosacárido meningocócico de fórmula (I):

en la que Ri, R2 y R4 tienen el mismo significado que en la reivindicación 1;

R3 representa NR5R6, en el que R5 y R6 son iguales o diferentes y representan independientemente H, alquilo C1-6, arilo;

con la condición de que cuando m = de 1 a 2, entonces n no es de 1 a 5,

b) activar el oligosacárido,

c) derivatizar la proteína portadora,

d) conjugar el oligosacárido meningocócico obtenido en la etapa (b) con la proteína portadora derivatizada obtenida en la etapa (c), y

e) purificar la vacuna de conjugado obtenida en la etapa (d).

Procedimiento según la reivindicación 2, en el que la activación del oligosacárido se lleva a cabo usando éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) del ácido bromoacético, éster de NHS del ácido 6-maleimidohexanoico, éster de NHS del ácido 6-(yodoacetamido)caproico, éster de NHS del ácido maleimidopropiónico, éster de NHS del ácido maleimidoacético, éster de NHS del ácido maleimidobenzoico.

Procedimiento según la reivindicación 2, en el que la derivatización de la proteína portadora se lleva a cabo usando éster de N-hidroxisuccinimida del ácido 3-(acetiltio)propiónico o éster de NHS del ácido acetiltio-hexadecanoico.

Composición inmunogénica, que comprende el conjugado meningocócico C semisintético según la reivindicación 1 seleccionado de:

6. Composición farmacéutica que comprende (a) una vacuna de conjugado meningocócico C semisintético según la reivindicación 1 y (b) un excipiente farmacéuticamente aceptable.

7. Composición según la reivindicación 6, que comprende además un antígeno sacarídico de uno o más de los serogrupos A, W135 e Y de N. meningitidis, siendo el sacárido un oligosacárido y estando conjugado con una proteína portadora.

8. Composición según la reivindicación 6 ó 7, que comprende además un adyuvante de vacuna.

9. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, que es una vacuna contra una enfermedad provocada por Neisseria meningitidis.

10. Vacuna de conjugado meningocócico C semisintético de fórmula (II) según la reivindicación 1, para su uso en la prevención o el tratamiento de una enfermedad provocada por unas o más bacterias encapsuladas.

11. Composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, para su uso en la prevención o el tratamiento de una enfermedad provocada por unas o más bacterias encapsuladas.

12. Composición inmunogénica según la reivindicación 5, que comprende además de 1 |ig a 10 |ig de cada polisacárido seleccionado de los serogrupos meningocócicos A, Y y W-135, conjugados individualmente con de 5 a 20 |ig de proteína portadora.