MX2012010609A - Vacunas adyuvadas para meningococos serogrupo b. - Google Patents

Abstract

Una composición inmunogénica que comprende (i) un oligonucleótido inmunoestimulante y un polímero policatiónico, en donde el oligonucleótido y el polímero idealmente se asocia con otro para formar un complejo, y (ii) una antígeno de meningococo serogrupo B. En la mayoría de las modalidades, la composición no incluye una sal de aluminio y no incluye una emulsión aceite en agua.

Description

VACUNAS ADYUVADAS PARA MENINGOCOCOS SEROGRUPO B Descripción de la Invención Esta invención se relaciona con el campo de las vacunas contra meningococos .

Actualmente están siendo investigadas diferentes vacunas contra Neisseria meningitidis serogrupo B ("MenB"). Algunas vacunas se basan en vesículas con membrana externa (OMVs, por sus siglas en inglés) , tal como el producto de las Vacunas de Novartis MENZB™, el producto del Instituto Finlay VA-MENGOC-BC™, y el producto del Instituto de Salud Pública MENBVAC™ . Otros se basan en las proteínas recombinantes , tales como la "vacuna universal para el miningococcus serogrupo B" reportado por Novartis Vaccines en la ref . 1.

Es un objetivo de la invención el proveer vacunas modificadas y mejoradas contra MenB y, en particular, vacunas adyuvadas .

La invención proporciona una composición inmunogénica que comprende (i) un antígeno de meningococo del serogrupo B y (ii) un adyuvante que comprende un oligonucleótido inmunoestimulante y un polímero policatiónico, en donde (i) la composición inmunogénica no incluye una sal de aluminio; (ii) la composición inmunogénica no incluye una emulsión, aceite en agua; (iii) el antígeno de meningococo del serogrupo B no incluye un polipéptido que comprende una Ref.:233067 secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEC ID Nos: 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ó 22; y (iv) la composición inmunogénica no incluye un antígeno fHBP.

El oligonucleótido inmunoestimulante y el polímero policatiónico se asocia preferentemente uno con el otro. Estos pueden formar un complejo oligonucleótido/polímero.

La invención también proporciona una composición inmunogénica que comprende (i) un antígeno de meningococo del serogrupo B; (ii) un adyuvante que comprende un oligonucleótido inmunoestimulante y un polímero policatiónico y; (iii) uno o más de otros antígenos seleccionados de un antígeno de neumococo, el toxoide de la difteria, toxoide del tétanos, un antígeno de pertussis, HBsAg, un antígeno HAV, un antígeno Hib, y/o IPV. La composición inmunogénica también puede comprender una sal de aluminio y/o una emulsión aceite en agua .

La invención también proporciona una composición inmunogénica que comprende (i) un lipooligosacárido de meningococo purificado, y (ii) un adyuvante que comprende un oligonucleótido inmunoestimulante y un polímero policatiónico. La composición inmunogénica también puede incluir una sal de aluminio y/o una emulsión aceite en agua.

La invención también proporciona una composición inmunogénica que comprende (i) un componente del antígeno 5-valente que consiste de un antígeno MenB, un sacárido capsular conjugado del serogrupo A de N. meningitidis, un sacárido capsular conjugado de N. meningitidis del serogrupo C, un sacárido capsular conjugado de N. meningitidis del serogrupo 135, un sacárido capsular conjugado de N. meningitidis del serogrupo Y; y (ii) un adyuvante que comprende un oligonucleótido inmunoestimulante y un polímero catiónico, siempre que la composición inmunogénica no incluya una sal de aluminio y no incluya una emulsión aceite en agua.

En una modalidad de la invención, el antígeno MenB puede adsorberse por un complejo formado por el oligonucleótido y el polímero en el adyuvante. Alternativamente, el antígeno MenB no se adsorbe al complejo oligonucleótido/polímero en el adyuvante .

La invención también proporciona un proceso para preparar una composición inmunogénica de la invención, que comprende un paso de mezclar (i) un adyuvante que comprende un complejo de un oligonucleótido inmunoestimulante y un polímero policatiónico y (ii) un antígeno de meningococo del serogrupo B ("MenB"), siempre que el antígeno MenB no incluya un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionadas de la SEC ID Nos: 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ó 22; y no incluye un antígeno fHBP . En métodos alternos, el antígeno MenB y el adyuvante comprenden un oligonucleótido inmunoestimulante y polímero policatiónico se mezclan antes que se haya formado el complejo. Por ejemplo, el antígeno MenB puede mezclarse con el oligonucleótido, y después se agrega el polímero; o el antígeno MenB puede mezclarse con · el polímero, y después se agrega el oligonucleótido. El complejo se forma después que se junta el oligonucleótido y el polímero.

El antígeno MenB, el oligonucleótido y el polímero pueden mezclarse en cualquier orden.

La invención también proporciona un kit que comprende: (i) un primer recipiente que contiene un oligonucleótido inmunoestimulante y un polímero policatiónico y (ii) un segundo recipiente que contiene un antígeno MenB siempre que el antígeno MenB no incluya un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionados de la SEC ID Nos: 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ó 22 y no incluya un antígeno fHBP. Ni el primer recipiente ni el segundo recipiente en el kit incluye una sal de aluminio o una emulsión aceite en agua .

La invención también proporciona un kit que comprende (i) un primer recipiente que contiene un oligonucleótido inmunoestimulante y un polímero policatiónico y (ii) un segundo recipiente que contiene un lipooligosacárido de meningococo purificado.

La invención también proporciona un kit que comprende (i) un primer recipiente que contiene un oligonucleótido inmunoestimulante y un polímero policatiónico y (ii) un segundo recipiente que contiene un antígeno de meningococo del serogrupo B y (iii) un recipiente que contiene uno o más de otros antígenos seleccionados de antígeno de neumococo, el toxoide de la difteria, toxoide del tétanos, un antígeno de pertussis, HBsAg, un antígeno HAV, un antígeno Hib, y/o IPV. El recipiente en la parte (iii) puede ser el primer recipiente, el segundo recipiente o un tercer recipiente.

El contenido de los recipientes en estos kits pueden combinarse (p.ej., en el punto de uso) para formar una composición inmunogénica de la invención. Estos kits pueden incluir otro recipiente que contenga un inmunizador y/u otro adyuvante .

En algunas modalidades, el único adyuvante en una composición o kit es el adyuvante que comprende un oligonucleótido inmunoestimulante y un polímero policatiónico .

Iiununizadores de Meningococo del Serogrupo B Las composiciones inmunogénicas se utilizan para elucidar una respuesta inmune contra el meningococo del serogrupo B ("MenB") . Los inmunizadores para elucidar las respuestas anti-MenB incluyen antígenos de polipéptidos , lipopolisacárido y/o vesículas con membrana. Otros detalles de los antígenos del serogrupo B se proporcionan enseguida.

Antígenos de polipéptidos de meningococo Una composición inmunogénica de la invención puede incluir uno o más antígeno(s) de polipéptido meningococo. Por ejemplo, una composición puede incluir un antígeno de polipéptido seleccionada del grupo que consiste de: 287, NadA, NspA, HmbR, NhhA, App y/o Omp85. Estos antígenos útiles se presentarán como polipéptidos purificados p . ej . , polipéptidos recombinantes . El antígeno preferentemente elucidará anticuerpos antimeningococo bactericida después de la administración a un sujeto.

Una composición inmunogénica de la invención puede incluir un antígeno 287. El antígeno 287 se incluyó en la secuencia genómica publicada para el meningococo serogrupo B de la cepa MC58 [2] como gen NMB2132 (GenBank número de acceso GI:7227388; SEC ID NO: 3 en la presente). Las secuencias del antígeno 287 de muchas cepas se han publicado después de esto, por ejemplo, las formas alélicas de 287 pueden verse en las Figuras 5 y 15 de la referencia 3, y en ejemplo 13 y la figura 21 de la referencia 4 (SEC ID NO: 3179 a 3184 en la presente) . También se han reportado diferentes fragmentos inmunizadores del antígeno 287. Los antígenos 287 preferidos que se usan con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que .tienen 50% o más de la identidad (p.ej., 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% o más) con la SEC ID NO: 3; y/o (b) que comprende un fragmento al menos de "n" aminoácidos consecutivos de la SEC ID NO: 3, en donde "n" es 7 o más (p.ej., 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 150, 200, 250 o más) . Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epitopo de la SEC ID NO: 3. Los antígenos 287 más útiles de la invención pueden elucidar anticuerpos que, después de la administración a un sujeto, pueden unirse a un polipéptido de meningococo que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 3. Los antígenos 287 ventajosos que se usan con la invención pueden elucidar anticuerpos antimeningococo bactericidas después de la administración a un sujeto.

Una composición inmunogénica de la composición de la invención de la presente invención incluye un antígeno NadA. El antígeno NadA se incluye en la secuencia del genoma publicado para el meningococo serogrupo B cepa MC58 [2] como el gen NMB1994 (GenBank número de acceso GI: 7227256; SEC ID NO: 4 en la presente) . Las secuencias del antígeno NadA de muchas cepas se han publicado desde entonces, y la actividad de la proteína como una adhesina Neisseria se ha documentado bien. Se han reportado diferentes fragmentos de NadA. Los antígenos NadA preferidos que se usan con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tienen 50% o más de la identidad (p.ej., 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% o más) con la SEC ID NO: 4; y/o (b) que comprende un fragmento al menos de "n" aminoácidos consecutivos de la SEC ID NO: 4, en donde "n" es 7 o más (p.ej., 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 150, 200, 250 o más) . Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epitopo de la SEC ID NO: 4. La SEC ID NO: 6 es uno de estos fragmentos. Los antígenos NadA más útiles de la invención pueden elucidar anticuerpos que, después de la administración a un sujeto, pueden unirse a un polipéptido de meningococo que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 4. Los antígenos NadA ventajosos que se usan con la invención pueden elucidar anticuerpos antimeningococo bactericidas después de la administración a un sujeto.

Una composición inmunogénica de la composición de la invención de la presente invención incluye un antígeno NspA. El antígeno NspA se incluyó en la secuencia del genoma publicado para el meningococo serogrupo B cepa MC58 [2] como el gen NMB0663 (GenBank número de acceso GI: 7225888; SEC ID NO: 5 en la presente) . El antígeno se conoció previamente de las referencias 5 y 6. Las secuencias del antígeno NspA de muchas cepas se han publicado desde entonces. Se han reportado diferentes fragmentos inmunizadores de NspA. Los antígenos NspA preferidos que se usan con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tienen 50% o más de la identidad (p.ej., 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% o más) con la SEC ID NO: 5; y/o (b) que comprende un fragmento al menos de "n" aminoácidos consecutivos de la SEC ID NO: 5, en donde "n" es 7 o más (p.ej., 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 150, 200, 250 o más) . Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epitopo de la SEC ID NO: 5. Los antígenos NadA más útiles de la invención pueden elucidar anticuerpos que, después de la administración a un sujeto, pueden unirse a un polipéptido de meningococo que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 5. Los antígenos NspA ventajosos que se usan con la invención pueden elucidar anticuerpos antimeningococo bactericidas después de la administración a un sujeto.

Una composición inmunogénica de la invención puede incluir un antígeno HmbR de meningococo. La secuencia del HmbR de longitud completa se incluyó en la secuencia del genoma publicado para el meningococo serogrupo B cepa MC58 [2] como el gen NMB1668 (SEC ID NO: 12 en la presente) . La invención puede usar un polipéptido que comprende la secuencia de HmbR de longitud completa, pero frecuentemente usará un polipéptido que comprende una secuencia parcial de HmbR. De esta forma en algunas modalidades una secuencia de HmbR se utiliza de acuerdo con la invención puede comprender una secuencia de aminoácidos que tienen al menos i% de la identidad de la secuencia con la SEC ID NO: 12, donde el valor de i es de 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 o más. En otras modalidades una secuencia HmbR utilizada acuerdo con la invención puede comprender un fragmento de una secuencia de al menos j aminoácidos consecutivos con la SEC ID NO: 12, donde el valor de j es 7, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 150, 200, 250 o más. En otras modalidades una secuencia de HmbR de acuerdo con la invención puede comprender una secuencia de aminoácidos (i) que tienen al menos i% de la identidad con la secuencia con la SEC ID NO: 12 y/o (ii) que comprende un fragmento al menos de j aminoácidos consecutivos de la SEC ID NO: 12. Preferentemente los fragmentos de j aminoácidos comprende un epitopo de la SEC ID NO: 12. Estos epitopos generalmente comprenden aminoácidos que se localizan sobre la superficie del HmbR. Los epitopos útiles incluyen aquellos con aminoácidos involucrados en la unión de HmbR con la hemoglobina, al igual que los anticuerpos que se unen con estos epitopos pueden bloquear la capacidad de una bacteria a unirse con la hemoglobina huésped. La topología del HmbR, y sus residuos funcionales críticos, se investigaron en la referencia 7. La mayoría de los antígenos de HmbR más útiles de la invención pueden elucidar anticuerpos que, después de la administración a un sujeto, pueden unirse a un polipéptido de meningococo que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 12. Los antígenos de HmbR ventajosos que se usan con la invención pueden elucidar anticuerpos antimeningococo bactericidas después de la administración a un sujeto.

Una composición inmunogénica de la invención puede incluir un antígeno de NhhA. El antígeno NhhA se incluyó en la secuencia del genoma publicado para el meningococo serogrupo B cepa MC58 [2] como el gen NMB0992 (GenBank número de acceso GI:7226232; SEC ID NO: 6 en la presente). Las secuencias del antígeno NhhA de muchas cepas se han publicado desde entonces p.ej., refs. 3 y 8, y se han reportado diferentes fragmentos inmunizadores de NhhA. También se conoce como Hsf . Los antígenos NhhA preferidos que se usan con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tienen 50% o más de la identidad (p.ej., 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% o más) con la SEC ID NO: 6; y/o (b) que comprende un fragmento al menos de "n" aminoácidos consecutivos de la SEC ID NO: 6, en donde "n" es 7 o más (p.ej., 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 150, 200, 250 o más). Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epitopo de la SEC ID NO: 6. Los antígenos NhhA más útiles de la invención pueden elucidar anticuerpos que, después de la administración a un sujeto, pueden unirse a un polipéptido de meningococo que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 6. Los antígenos NhhA ventajosos que se usan con la invención pueden elucidar anticuerpos antimeningococo bactericidas después de la administración a un sujeto.

Una composición inmunogénica de la invención puede incluir un antígeno de App. El antígeno App se incluyó en la secuencia del genoma publicado para el meningococo serogrupo B cepa MC58 [2] como el gen NMB1985 (GenBank número de acceso GI:7227246; SEC ID NO: 7 en la presente). Las secuencias del antígeno App de muchas cepas se han publicado desde entonces. También se han reportado diferentes fragmentos inmunizadores de App. Los antígenos App preferidos que se usan con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tienen 50% o más de la identidad (p.ej., 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% o más) con la SEC ID NO: 7; y/o (b) que comprende un fragmento al menos de "n" aminoácidos consecutivos de la SEC ID NO: 7, en donde "n" es 7 o más (p.ej., 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 150, 200, 250 o más) . Los fragmentos preferidos de (b) comprenden ún epitopo de la SEC ID NO: 7. Los antígenos App más útiles de la invención pueden elucidar anticuerpos que, después de la administración a un sujeto, pueden unirse a un polipéptido de meningococo que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 7. Los antígenos App ventajosos que se usan con la invención pueden elucidar anticuerpos antimeningococo bactericidas después de la administración a un sujeto.

Una composición inmunogénica de la invención puede incluir un antígeno de Omp85. El antígeno Omp85 se incluyó en la secuencia del genoma publicado para el meningococo serogrupo B cepa C58 [2] como el gen N B0182 (GenBank número de acceso GI:7225401; SEC ID NO: 8 en la presente). Las secuencias del antígeno Omp85 de muchas cepas se han publicado desde entonces. También se ha reportado otra información de Omp85. Los antígenos Omp85 preferidos que se usan con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tienen 50% o más de la identidad (p.ej., 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% o más) con la SEC ID NO: 8; y/o (b) que comprende un fragmento al menos de "n" aminoácidos consecutivos de la SEC ID NO: 8, en donde "n" es 7 o más (p.ej., 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 150, 200, 250 o más) . Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epitopo de la SEC ID NO: 8. Los antígenos Omp85 más útiles de la invención pueden elucidar anticuerpos que, después de la administración a un sujeto, pueden unirse a un polipéptido de meningococo que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 8. Los antígenos Omp85 ventajosos que se usan con la invención pueden elucidar anticuerpos antimeningococo bactericidas después de la administración a un sujeto.

Composiciones de la invención no incluye el factor H de meningococo que enlaza el antígeno de la proteína (fHBP, por sus siglas en inglés) . Un antígeno del fHBP es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos, (i) que tiene al menos 80% de la identidad de la secuencia con cualquiera de las SEC ID Nos: 9, 10 u 11 y/o (ii) que consiste de un fragmento al menos de 7 aminoácidos contiguos de las SEC ID Nos: 9, 10 u 11. En algunas modalidades las composiciones no incluyen una proteína que pueda unirse con el factor H (p.ej., factor H humano) en una prueba como se describe en las referencias 11 y 12.

Los fragmentos comprenden preferentemente un epitopo de la respectiva SEC ID NO: secuencia. Otros fragmentos carecen de uno o más aminoácidos (p.ej., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del C-terminal y/o uno o más aminoácidos (p.ej., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del N-terminal de la respectiva SEC ID NO: aunque retiene al menos un epitopo de esta.

En algunas modalidades los polipéptido (s) se forman con lípidos, p.ej., en una cisteína N-terminal. Para polipéptido (s) formado'(s) con lípidos, los lípidos unidos con las cisteínas generalmente incluyen residuos de palmitoilo, p.ej., como tripalmitoil -S-gliceril -cisteina (Pam3Cys) , dipalmitoil-S-gliceril cisteína (Pam2Cys) , N-acetil (dipalmitoil-S-gliceril cisteina), etc.

Lipooligosacárido de meningococo Una composición inmunogénica puede incluir uno o más antígeno(s) de lipooligosacárido (LOS, por sus siglas en inglés) de meningococo. El LOS de meningococo es un fosfolípido a base de glucosamina que se encuentra en la monocapa exterior de la membrana externa de la bacteria. Esta incluye una parte A lipídica y una región de oligosacárido del núcleo, con la parte A lipídica que actúa como un ancla hidrofóbica en la membrana. La heterogeneidad dentro del núcleo del oligosacárido genera diversidad estructural y antígena entre las diferentes cepas de los meningococos , lo cual se ha utilizado para subdividir las cepas en 12 inmunotipos (Ll a L12) . La invención puede utilizar el LOS de cualquier tipo, p.ej., de Ll, L2 , L3 , L4 , L5 , L6, L7 , y/o L8.

Los L2 y L3 con cadenas a incluyen de forma natural lacto-N-neotetraosa (LNnT) . Donde la invención utiliza el LOS de un inmunotipo L2 o L3 esta LNnT puede estar ausente. Esta ausencia puede lograrse convenientemente al usar cepas mutantes que se diseñan para interrumpir su capacidad para sintetizar el tetrasacárido LNnT dentro de la cadena-a. Se sabe que para lograr este objetivo por eliminación de las enzimas que son responsables de las adiciones biosintéticas relevantes [13,43]. Por ejemplo, la eliminación de la enzima LgtB previene la adición de la galactosa terminal de LNnT, así como también previene la adición en dirección 3' del ácido siálico terminal de la cadena- . La eliminación de la enzima LgtA previene la adición déla N-acetil-glucosamina de LNnT, y también las adiciones en dirección 3'. La eliminación de LgtA puede estar acompañada por la eliminación de LgtC. De forma similar, la eliminación de la enzima LgtF y/o GalE previene la adición interna de galactosa, y la eliminación de la LgtF previene la adición de glucosa con el residuo Hep1. Cualquiera de estas eliminaciones pueden utilizarse, solas o en combinación, para interrumpir el tetrasacárido LNnT en una cepa del inmunotipo L2 , L3 , L4 L7 o L9. Se prefiere la eliminación al menos de LgtB, ya que esto proporciona un LOS que retiene la inmunización útil mientras se remueve el epitopo LNnT.

Además, o en lugar de mutaciones para interrumpir el epitopo LNnT, una eliminación del gen galE también proporciona un LOS modificado útil, y un gen de transferasa del lípido A graso puede similarmente interrumpirse [14] . Puede eliminarse al menos un ácido graso unido con O primario del LOS [15] . También puede utilizarse LOS tiene un número reducido de cadenas de acilo secundarias por molécula de LOS [16] . El LOS típicamente incluye al menos la estructura del GlcNAc-Hep22fosfoetanolamina-KD02-Lípido A [17] . El LOS puede incluir un trisacárido de GlcNAcpi-3Ga^l-4Glc mientras la ausencia mientras está ausente el tetrasacárido LNnT.

El LOS puede estar incluido en diferentes formas. Puede usarse en forma purificada por si sola. Puede estar conjugado con una proteína portadora. Cuando el LOS está conjugado, la conjugación puede ser por medio de una porción del lipido A en el LOS o por cualquier otro radical adecuado, p.ej., sus residuos KDO . Si está ausente el radical del lipido A del LOS entonces se requiere este enlace alterno. Las técnicas de conjugación del LOS se conocen de p.ej., las referencias 15, 17, 18, 19, etc. Las proteínas portadoras útiles para estos conjugados incluyen p.ej., toxinas bacterianas, tal como de la difteria o toxinas del tétanos, o toxoides o mutantes de estos .

El LOS puede ser de una cepa (p.ej., cepa de meningococo genéticamente modificada) que tiene un inmunotipo del LOS fijo (es decir, sin fase variable) como se describe en la referencia 20. Por ejemplo, los inmunotipos del LOS L2 y L3 pueden ser fijos. Estas cepas pueden tener una relación de cambio entre los inmunotipos que se reduce por más del doble (aun > 50 veces) con relación a la cepa tipo silvestre original. La referencia 20 revela cómo puede lograrse este resultado por la modificación de los productos del gen IgtA y/o IgtG. Él LOS puede estar O-acetilado en un residuo GlcNac unido a su residuo de Heptosa II p.ej., para L3 [21] .

Una composición inmunogénica de la invención puede incluir más de un tipo de LOS p.ej., LOS de los inmunotipos de meningococo L2 y L3. Por ejemplo, pueden usarse las combinaciones del LOS revelada en la referencia 22.

Un antígeno del LOS preferentemente puede elucidar anticuerpos antimeningococo bactericida después de la administración a un sujeto.

Vesículas con membrana Una composición inmunogénica de la invención puede incluir vesículas con membrana externa de meningococo. Esta incluye cualquier vesícula proteoliposómica obtenida por interrupción o formación de ampolla de la membrana externa de meningococo para formar vesículas con esta que incluye los componentes de la proteína de la membrana externa. De esta forma el término incluye OMVs (algunas veces referido como "ampollas"), microvesículas (MVs [23]) y "OMVs nativas" ( "NOMVs" [24] ) .

Las MVs y NOMVs son vesículas con membrana que se presentan naturalmente que se forman espontáneamente durante el crecimiento bacteriano y se liberan en el medio de cultivo. Las MVs pueden obtenerse al cultivar Neisseria en el medio del caldo de cultivo, separando todas las células de las MVs más pequeñas en el medio del caldo de cultivo (p.ej., por filtración o por centrifugación de baja velocidad para granular solo las células y no las vesículas más pequeñas) , y después recolectar las MVs del medio agotado en células (p.ej., por filtración, por precipitación o agregación diferencial de las MVs, por centrifugación de alta velocidad o granulación de las MVs) . Las cepas que se usan en la producción de las MVs generalmente se seleccionan en base a la cantidad de las MVs producidas en el cultivo p.ej., refs. 25 y 26 describen Neisseria con alta producción de MV.

Las OMV se preparan artificialmente de las bacterias, y pueden prepararse utilizando tratamiento con detergente (p.ej., con desoxicolato) , o por medios sin detergente (p.ej., véase la referencia 27) . Las técnicas para formar las OMVs incluyen tratamiento bacteriano con un detergente con sal de ácido biliar (p.ej., sales de ácido litocólico, ácido quenodesoxicólico, ácido ursodesoxicólico, ácido desoxicólico, ácido cólico, ácido ursocólico, etc., con desoxicolato de sodio [28 y 29] que se prefiere para el tratamiento de Neisseria) a un pH suficientemente alto para no precipitar el detergente [30] . Otras técnicas pueden desarrollarse sustancialmente en ausencia del detergente [27] utilizando técnicas como la sonicación, homogeneización, microfluidificación, cavitación, choque osmótico, molienda, prensa francesa, mezclado, etc. Los métodos que no utilizan o que utilizan poco detergente pueden retener antígenos útiles tal como NspA [27] . De esta forma un método puede utilizar un amortiguador de extracción de OMV con aproximadamente 0.5% de desoxicolato o menor p.ej., alrededor del 0.2%, aproximadamente 0.1%, <0.05% a cero.

Un proceso útil para la preparación de OMV se describe en la referencia 31 e involucra la ultrafiltración en las OMVs crudas, en lugar de la centrifugación de alta velocidad. El proceso puede involucrar un paso de ultracentrifugación después de que se realiza la ultrafiltración .

Vesículas que se utilizan con la invención pueden prepararse con cualquier cepa de meningococo. Las vesículas generalmente formarán un cepa del serogrupo B, pero es posible prepararlas con serogrupos diferentes al B (p.ej., la referencia 30 revela un proceso para el serogrupo A) , tal como A, C, 135 o Y. La cepa puede ser de cualquier serotipo (p.ej., 1, 2a, 2b, 4, 14, 15, 16, etc.), cualquier serosubtipo, y cualquier inmunotipo (p.ej., Ll; L2 ; L3 ; L3 , 3, 7; LIO; etc.) . Los meningococos pueden ser de cualquier línea adecuada, incluyendo las líneas híper- invasiva e híper-virulenta, p.ej., cualquiera de las siguientes siete líneas híper-virulentas : subgrupo I; subgrupo III; subgrupo IV- 1; complejo ET-5; complejo ET-37; racimo A4 ; línea 3. Estas líneas se han identificado por electroforesis enzimática de sitios múltiples (MLEE, por sus siglas en inglés) , pero también se ha utilizado la escritura de la secuencia en sitios múltiples (MLST) para clasificar los meningococos [ref. 32] p.ej., el complejo ET-37 es el complejo ST-11 por MLST, el complejo ET-5 es ST-32 (ET-5), línea 3 es ST-41/44, etc. Las vesículas pueden prepararse con cepas que tienen uno de los siguientes subtipos: Pl .2 ; Pl.2,5 Pl .4 ; Pl .5 ; Pl .5 , 2 ; P1.5,C,10; Pl.7,16; P1.7,16b; P1.7h,4; Pl .9 ; Pl .15 ; Pl.9,15; Pl.12,13; P1.13; Pl .14 ; Pl.21,16; Pl.22,14.

Las vesículas usadas con la invención pueden prepararse con las cepas de meningococo del tipo silvestre o de las cepas de meningococo mutante . Por ejemplo, la referencia 33 revela las preparaciones de vesículas obtenidas de N. meningitidis con un gen fur. La referencia 41 enseña que la expresión nspA debería estar regulada con porA concomitante y eliminación de cps. Otras eliminaciones de mutantes de N. meningitidis para la producción de OMV se revelan en las referencias 41 a 43. La referencia 34 revela vesículas en donde el fHBP se regula. La referencia 35 revela la construcción de vesículas de cepas modificadas para expresar seis diferentes subtipos PorA. También puede utilizarse la Neisseria mutante con bajos niveles de endotoxina, logrados por la eliminación de enzimas involucra la biosíntesis LPS [36,37] . Estos y otros mutantes todos pueden utilizarse con la invención.

De esta forma una cepa utilizada con la invención puede en algunas modalidades expresar más de un subtipo PorA. Las cepas PorA 6-valente y 9-valente se han construido previamente. La cepa puede expresar 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 Ó 9 de los subtipos PorA: Pl.7,16; Pl.5-1,2-2; Pl.19, 15-1; P1.5- 2,10; Pl.12-1, 13; Pl.7-2.4; Pl.22,14; Pl .7-1,1 y/o P1.18-1,3,6. En otras modalidades una cepa puede haberse regulado por disminución por la expresión de PorA p . ej . , en donde la cantidad de PorA se ha reducido por al menos 20% (p.ej., =30%, >40%, >50%, >60%, >70%, >80%, >90%, >95%, etc.), o aun eliminados, con relación a los niveles del tipo silvestre (p.ej., con relación a la cepa H44/76, como se revela en la referencia 44) .

En algunas modalidades una cepa puede híper-expresar (con relación a la correspondiente cepa tipo silvestre) ciertas proteínas. Por ejemplo, las . cepas puede híper-expresar NsA, proteína 287 [38] , fHBP [34] , TbpA y/o TbpB [39], superóxido de Cu,Zn dismutasa [39], HmbR, etc.

En algunas modalidades una cepa puede incluir uno o más de las mutaciones de eliminación y/o híper-expresión reveladas en las referencias 40 a 43. Los genes preferidos para la regulación por disminución y/o eliminación incluye: (a) Cps, CtrA, CtrB, CtrC, CtrD, FrpB, GalE, HtrB/MsbB, LbpA, LbpB, LpxK, Opa, Opc, PilC, PorB, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA, y/o TbpB [40] ; (b) CtrA, CtrB, CtrC, CtrD, FrpB, GalE, HtrB/MsbB, LbpA, LbpB, LpxK, Opa, Opc, PhoP, PilC, PmrE, PmrF, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA, y/o TbpB [41] ; (c) ExbB, ExbD, rmpM, CtrA, CtrB, CtrD, GalE, LbpA, LbpB, Opa, Opc, PilC, PorB, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA, y/o TbpB [42] ; y (d) CtrA, CtrB, CtrD, FrpB, Opa, OpC, PilC, PorB, SiaD, SynA, SynB y/o SynC [43] .

Donde se utiliza una cepa mutante, en alguna modalidad puede tener una o más, o todas de las siguientes características: (i) LgtB y/o GalE regulada por disminución o eliminada para truncar el LOS del meningococo; (ii) TbpA regulado por incremento; (iii) NhhA regulado por incremento; (iv) Omp85 regulado por incremento; (v) LbpA regulado por incremento; (vi) NspA regulado por incremento; (vi i) PorA eliminado; (viii) FrpB regulado por disminución; (ix) Opa regulado por disminución o eliminado; (x) Opc regulado por disminución o eliminado; (xi) complejo del gen cps suprimido. Un LOS trunco puede ser uno que no incluye un epitopo de sialil-lacto-N-neotetraosa p.ej., podría ser un LOS deficiente en galactosa. Él LOS puede no presentar una cadena OÍ .

Sí LOS está presente en una vesícula es posible tratar la vesícula a fin de que se una su LOS y los componentes de la proteína (conjugación "intra-ampolla" [43] ) .

La invención puede utilizarse con mezclas de vesículas de diferentes cepas. Por ejemplo, la referencia 44 revela la vacuna que comprende composiciones de vesícula de meningococo multivalente , que comprende una primera vesícula derivada de una cepa de meningococo con un serosubtipo prevalente en una región de uso, y una segunda vesícula derivada de una cepa que necesita no tener un serosubtipo presente en una región de uso. La referencia 45 también revela combinaciones útiles de diferentes vesículas. Una combinación de vesículas para cepas en cada uno de los inmunotipos L2 y L3 pueden utilizarse en algunas modalidades.

En algunas modalidades, la composición inmunogénica no contiene MenB OMV.

Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden administrarse a animales para inducir una respuesta inmune. La invención puede usarse para el tratamiento o protección contra una amplia variedad de enfermedades.

El oligonucleótido inmunoestimulante y el polímero policatiónico La invención utiliza un oligonucleótido inmunoestilmulante y un polímero policatiónico. Estos se asocian idealmente uno con el otro para formar un complejo de partículas, el cual es benéficamente un agonista TLR9.

Los oligonucleótidos inmunoestimulantes se sabe que son adyuvantes útiles. Frecuentemente contienen un motivo CpG (una secuencia binucleótida que contiene una citosina no metilada unida a una guanosina) y se discute su efecto adyuvante en las refs. 46-51. Los oligonucleótidos que contienen motivos TpG, secuencias palindrómicas , múltiples nucleótidos de timidina consecutivos (p.ej., TTTT) , múltiples nucleótidos de citosina consecutivos (p.ej., CCCC) o secuencias poli(dG) son también inmunoestimulantes conocidos, que son ARN bicatenario. Aunque cualquiera de estos oligonucleótidos inmunoestimulantes puede usarse con la invención, se prefiere usar un oligodesoxinucleótido que contiene desoxiinosina y desoxicitosina . Los oligonucleótidos que contienen inosina pueden incluir un motivo Cpl (una secuencia binucleótida que contiene una citosina unida a una inosina) . El oligodesoxinucleótido puede incluir más de un (p.ej., 2, 3, 4, 5, 6 o más) motivo Cpl, y estos pueden repetirse directamente (p.ej., que comprende la secuencia (CI)X, donde x es 2, 3, 4, 5, 6 ó más) o separados uno del otro (p.ej., que comprende la secuencia (CIN)X, donde x es 2, 3, 4, 5, 6 ó más, y donde cada N representa independientemente uno o más nucleótidos) . Los residuos de citosina idealmente no están metilados.

Los oligonucleótidos típicamente tendrán entre 10 y 100 nucleótidos p.ej., 15-50 nucleótidos, 20-30 nucleótidos, o 25-28 nucleótidos. Típicamente serán catenarios .

Los oligonucleótidos pueden incluir exclusivamente nucleótidos naturales, exclusivamente nucleótidos no naturales, o una mezcla de ambos. Por ejemplo, puede incluir uno o más enlace (s) de fosfotioato, y/o uno o más nucleótidos pueden tener una modificación de 2'-0-metilo.

Un oligonucleótido preferido que se usa con la invención es un desoxinucleótido catenario que comprende 26-mer de la secuencia 5' - (IC) 13-3 ' (SEC ID NO: 1) . Este oligodesoxinucleótido forma complejos estables con polímeros policatiónicos para proporcionar un buen adyuvante.

El polímero policatiónico idealmente un péptido policatiónico, tal como un péptido antimicrobiano catiónico. El polímero puede incluir uno o más residuo (s) de aminoácido de leucina y/o uno o más residuo (s) de aminoácido de lisina. El polímero puede incluir uno o más residuo (s) de aminoácido (s) de arginina. Puede incluir al menos una repetición directa de uno de estos aminoácidos p.ej., una o más de las secuencia (s) del dipéptido Leu-Leu, una o más de las secuencia (s) del dipéptido Lys-Lys, o una o más de las secuencia (s) del dipéptido Arg-Arg. Puede incluir al menos una de las secuencia (s) del dipéptido Lys-Leu (y preferentemente múltiple p.ej., 2 ó 3) y/o al menos una de las secuencia (s) del tripéptido Lys-Leu-Lys (y preferentemente múltiple p.ej., 2 ó 3) .

El péptido puede comprender una secuencia Ri-XZXZxXZX-R2, en donde: x 3, 4, 5, 6 ó 7; cada X es independientemente un residuo de aminoácido natural y/o no natural positivamente cargado; cada Z es independientemente un residuo de aminoácido L, V, I, F ó W; y Rx y R2 se selecciona independientemente del grupo que consiste de -H, -NH2, -COCH3, o -COK. En algunas modalidades X-R2 puede ser una amida, éster o tioéster del residuo de aminoácido C-terminal del péptido. También véase la referencia 53.

Un péptido de policatiónico típicamente tiene entre 5 y 50 aminoácidos p.ej., 6-20 aminoácidos, 7-15 aminoácidos, o 9-12 aminoácidos.

Un péptido puede incluir exclusivamente aminoácidos naturales, exclusivamente aminoácidos no naturales, o una mezcla de ambos. Puede incluir L-aminoácidos y/o D-aminoácidos. Son típicamente L-aminoácidos.

Un péptido puede tener un N-terminal natural (NH2-) o un N-terminal modificado p.ej., un hidroxilo, acetilo, etc. Un péptido puede tener un C-terminal natural (-C00H) o un C-terminal modificado p.ej., un hidroxilo, un acetilo, etc. Estas modificaciones puede 'mejorar la estabilidad del péptido.

Un péptido preferido que se usa con la invención es el 11-mer KLKLLLLLKLK (SEC ID NO: 2; ref . 54), con todos los L-aminoácidos. El N-terminal puede ser des-aminado y el C-terminal puede estar hidroxilado. Un péptido preferido es H-KLKL5 LK-OH, con todos los L-aminoácidos. Este oligopéptido es un antimicrobiano [55] , activador neutrófilo [56] y adyuvante [57] y forma complejos adecuados con oligonucleótidos inmunoestimulador para dar un adyuvante bueno .

La mezcla más preferida del oligonucleótido inmunoestimulante y polímero policatiónico es el agonista TLR9 conocido como IC31™ [58-60] , la cual es un complejo que se puede adsorber de oligodesoxinucleótido SEC ID NO: 1 y el oligopéptido policatiónico SEC ID NO: 2.

El oligonucleótido y oligopéptido puede mezclarse junto con varias relaciones, pero generalmente se mezclará con el péptido con un exceso molar. El exceso molar puede ser al menos 5:1 p.ej., 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1 etc. Una relación molar de aproximadamente 25:1 es ideal [61,62] . Mezclar con esta relación de exceso puede resultar la formación de complejos de partículas insolubles entre oligonucleótido y oligopéptido. Donde el antígeno MenB es 'LOS purificado, los complejos pueden combinarse con una sal de aluminio como se describe en la presente.

El oligonucleótido y oligopéptido típicamente se mezclan bajo condiciones acuosas p.ej., una solución del oligonucleótido puede mezclarse con una solución de oligonucleótido con una relación deseada. Las dos soluciones pueden prepararse al disolver materiales secos (p.ej., liofilizada) en agua o amortiguador para formar soluciones de abastecimiento que después pueden mezclarse.

Los complejos pueden analizarse utilizando los métodos revelados en la referencia 63. Los complejos con un diámetro promedio están en el intervalo 1 µ?? - 20 ym.

La poli -arginina y CpG oligodesoxinucleótidos similarmente forman complejos [64] .

Los complejos pueden mantenerse en suspensión acuosa p.ej., en agua o en amortiguador. .Los típicos amortiguadores que se usan con los complejos son amortiguadores de fosfato (p.ej., salina amortiguada con fosfato), amortiguadores Tris, amortiguadores Tris/sorbitol , amortiguadores de borato, amortiguadores de succinato, amortiguadores de citrato, amortiguadores de histidina, etc. Como una alternativa, los complejos algunas veces están liofilizados .

Complejos en la suspensión acuosa puede centrifugarse para separarlos del medio en masa (p.ej., por aspiración, decantación, etc.). Estos complejos después pueden volver a suspenderse en un medio alterno si se desea.

Sales de aluminio La mayoría de las modalidades de la invención no incluyen una sal de aluminio. Algunas modalidades permiten el uso de las sales de aluminio, sin embargo, por ejemplo, donde la composición inmunogénica comprende un LOS MenB purificado o donde la composición incluye uno o más de otros antígenos seleccionado del antígeno del sacárido de neumococo, toxoide de la difteria, toxoide del tétanos, antígeno pertussis, HBsAg, antígeno HAV, antígeno Hib e IPV. Las sales de aluminio incluyen los adyuvantes conocidos individualmente como hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio. Estos nombres son convencionales, pero se usan solo para conveniencia, ya que ninguno es una descripción precisa del compuesto químico actual que está presente [p.ej., véase el capítulo 9 de la referencia 65] . El término "sal de aluminio" también se refiere a cualquiera de los adyuvantes "hidróxido" o "fosfato" que son en general el uso como adyuvantes. En algunas modalidades, que permiten las sales de aluminio, se prefiere el uso del adyuvante de hidróxido de aluminio.

Los adyuvantes conocidos como "hidróxido de aluminio" típicamente son sales de oxihidroxido de aluminio, que generalmente son al menos parcialmente cristalinos. El oxihidroxido de aluminio, que puede representarse por la fórmula AlO(OH), puede distinguirse de otros compuestos de aluminio, tal como hidróxido de aluminio Al(OH)2, por espectroscopia por infrarrojos (IR) , en particular por la presencia de una banda de adsorción a 1070 cnf1 y un desnivel a 3090-3100 cm"1 [capítulo 9 o ref . 65]. Los grados de la cristalinidad de un adyuvante de hidróxido de aluminio se reflejan por el ancho de la banda de difracción a media altura (WHH) , con partículas con pobre cristalinidad que muestra mayor ampliación de la línea debido a la disminución del tamaño cristalino. El área superficial se incrementa mientras se incrementa la WHH, los adyuvantes con mayores WHH se han visto que tienen mayor capacidad de la adsorción del antígeno. Una morfología fibrosa (p.ej., como se ve en las micrográficas de transmisión de electrones) es típica para los adyuvantes de hidróxido de aluminio. Los diámetros de partícula promedio en el intervalo de 1-10 pm se reportan en la referencia 66..La pl de los adyuvantes de hidróxido de aluminio está típicamente alrededor de 11, es decir, el adyuvante por sí mismo tiene una carga superficial positiva a pH fisiológico. Las capacidades de adsorción de entre 1.8-2.6 mg de proteína por mg Al+++ a pH 7.4 se han reportado para los adyuvantes de hidróxido de aluminio.

Los adyuvantes conocidos como "fosfato de aluminio" son típicamente hidroxifosfatos de aluminio, frecuentemente también contienen una pequeña cantidad de sulfato (es decir, sulfato hidroxifosfato de aluminio) . Pueden obtenerse por precipitación, y las condiciones de reacción y concentraciones durante la precipitación influencia el grado de sustitución del fosfato para hidroxilo en la sal. Los hidroxifosfatos generalmente tienen una relación molar P04/Al entre 0.3 y 1.2. Los hidroxifosfatos pueden distinguirse del AlP04 estricto por la presencia de grupos hidroxilo. Por ejemplo, una banda del espectro de IR en 3164 cm"1 (p.ej., cuando se calienta a 200°C) indica la presencia de hidroxilos estructurales [capítulo 9 de ref . 65] . La relación molar de P04/A13+ de un fosfato de aluminio adyuvante generalmente estará entre 0.3 y 1.2, preferentemente entre 0.8 y 1.2, y más preferentemente 0.95 ± 0.1. El fosfato de aluminio generalmente será amorfo, particularmente por sales de hidroxifosfato . Un adyuvante típico es hidroxifosfato de aluminio amorfo con relación P04/Al entre 0.84 y 0.92, se incluye a 0.6 mg Al3+/ml . El fosfato de aluminio generalmente serán partículas (p.ej., morfología similar a platos como se ve en las micrográficas de transmisión de electrones) . Los típicos diámetros de las partículas están en el intervalo de 0.5-20 pm (p.ej., alrededor de 5-10 pm) después de cualquier adsorción de antígenos. Se han reportado las capacidades de adsorción entre 0.7-1.5 mg de proteína por mg Al+++ a pH 7.4 para los adyuvantes de fosfato de aluminio. El punto de carga cero (PZC, por sus siglas en inglés) del fosfato de aluminio está inversamente relacionado con el grado de sustitución de fosfato para hidroxilo, y este grado de sustitución puede variar dependiendo de las condiciones de reacción y concentraciones de los reactivos utilizados para preparar la sal por precipitación. El PZC también se altera por el cambio de la concentración de iones de fosfato libres en la solución (más fosfato = más PZC ácido) o al agregar un amortiguador tal como un amortiguador de histidina (hace al PZC más básico) . Los fosfatos de aluminio usado de acuerdo con la invención generalmente tendrán una PZC entre 4.0 y 7.0, más preferentemente entre 5.0 y 6.5 p.ej., 5.7.

También puede utilizarse una mezcla de ambos un hidróxido de aluminio y un fosfato de aluminio. En esta situación existe más fosfato de aluminio que de hidróxido, p.ej., una relación en peso al menos de 2:1 p.ej., = 5:1, = 6:1, = 7:1, > 8:1, > 9:1, etc.

En algunas modalidades de la invención (p.ej., donde la composición inmunogénica comprende un LOS MenB purificado) la composición puede comprender: (i) un hidróxido de aluminio, un oligonucleótido inmunoestimulante y un polímero policatiónico; (ii) un fosfato de aluminio, un oligonucleótido inmunoestimulante y un polímero policatiónico; o (iii) un hidróxido de aluminio, un fosfato de aluminio, un oligonucleótido inmunoestimulante y un polímero policatiónico.

La concentración de Al+++ en una composición farmacéutica de la invención generalmente es <10 mg/ml, p.ej., = 5 mg/ml, 4 mg/ml, < 3 mg/ml, < 2 mg/ml, = 1 mg/ml, etc. Un intervalo preferido está entre 0.3 y 1 mg/ml.

Adsorción Los complejos preferidos de oligonucleótido inmunoestimulante y polímero policatiónico son adsorbentes es decir, los inmunógenos pueden ser adsorbidos por los complejos, por medio de una variedad de mecanismos. En algunas circunstancias, sin embargo, los inmunógenos y complejos ambos pueden estar presentes en una composición sin la adsorción, ya sea a través de una propiedad intrínseca del inmunógeno o debido a los pasos realizados durante la formulación (p.ej., el uso de un pH apropiado durante la formulación para prevenir que se presente la adsorción) .

Los adyuvantes de sal de aluminio también pueden ser adsorbentes. En las modalidades donde un complejo y una sal de aluminio ambos están presentes, por lo tanto, existen múltiples oportunidades de adsorción para un inmunógeno: un inmunógeno puede adsorberse por la sal de aluminio, o por un complejo de oligonucleótido/polímero, ambos (en diferentes proporciones), o ninguno. La invención cubre todos los arreglos. Por ejemplo, en una modalidad un inmunógeno puede adsorberse por una sal de aluminio, y el inmunógeno adsorbido/sal después pueden mezclarse con un complejo de oligonucleótido/polímero. En otra modalidad un inmunógeno puede adsorberse por un complejo de oligonucleótido/polímero, y el inmunógeno adsorbido /complejo después puede mezclarse con una sal de aluminio. En otra modalidad dos inmunógenos (el mismo o diferente) pueden adsorberse por separado con un complejo de oligonucleótido/polímero y una sal de aluminio, y los dos compuestos adsorbidos después pueden mezclarse.

En algunas situaciones, un inmunógeno puede cambiar su estado de absorción, p.ej., por un cambio en el pH o temperatura, o después de mezclar los compuestos. Se conoce la desorción de los antígenos de las sales de aluminio in vitro [67] in vivo [68] . Se puede presentar la desorción de una partícula que se puede adsorber seguida por la resorción de una partícula adsorbente diferente, por medio de esto origina p.ej., la transferencia de un inmunógeno de un adyuvante de sal de aluminio a un complejo o viceversa. En algunas modalidades, una sola molécula de antígeno o complejo puede adsorber ambos una sal de aluminio y un complejo, después de formar un puente entre las dos partículas adsorbentes .

Si un inmunógeno se adsorbe por el compuesto adsorbente, no es necesaria la adsorción de todo el inmunógeno.. Esta situación puede presentarse debido a un equilibrio intrínseco del inmunógeno entre la fase adsorbida y la soluble, o porque las superficies adsorbentes están saturadas. De esta forma el inmunógeno en la composición puede adsorberse total o parcialmente, y la fracción adsorbida puede estar en uno o más de los diferentes componentes adsorbentes (p.ej. en la sal de aluminio y/o sobre un complejo de oligonucleótido/polímero) . En esta situación, la fracción adsorbida puede ser al menos del 10% (en peso) de la cantidad total del inmunógeno en la composición p.ej., >20%, >30%, >40%, >50%, >60%, >70%, >80%, >90%, >95%, >98% o más. En algunas modalidades un inmunógeno se adsorbe totalmente, es decir, se puede detectar en el sobrenadante después de la centrifugación para separar los complejos del medio líquido en masa. En otras modalidades, sin embargo, ningún inmunógeno en particular puede adsorberse.

En algunas circunstancias es posible que el oligonucleótido inmunoestimulante y/o polímero policatiónico componente de un complejo pudieran adsorberse por una sal de aluminio. También para evitar la adsorción de los complejos por una sal de aluminio (y viceversa) es útil que la sal de aluminio y los complejos tengan puntos similares de carga cero (puntos isoeléctricos) p.ej., dentro de 1 unidad de pH uno del otro. De esta forma los complejos útiles tienen un PZC de entre 10 y 12, que es útil para combinar con un adyuvante de hidróxido de aluminio que tiene un PZC de aproximadamente 11.

La emulsión aceite en agua La mayoría de las modalidades no contienen una emulsión "aceite en agua" , aunque algunas modalidades permitieron su presencia p.ej., donde la composición inmunogénica comprende un LOS MenB purificado. Las emulsiones de aceite en agua típicamente incluye al menos un tensioactivo, con aceite (s) y tensioactivo (s) son biodegradable (se puede metabolizar) y es biocompatible .

Las gotas de aceite en la emulsión generalmente son menores de 5 µp? de diámetro, e idealmente tienen un diámetro sub-micrón, con estos pequeños tamaños logrados por un micro-fluidificador para proporcionar emulsiones estables. Se prefieren las gotas con un tamaño menor de 220 nm ya que se sujetan a esterilización por filtración. En algunas * emulsiones útiles al menos 80% (en número) de las gotas de aceite tiene un diámetro menor, de 500 nm.

Las emulsiones pueden incluir aceites como aquellas de una fuente animal (como pescado) o vegetal. Las fuentes de aceites vegetales incluyen, nueces, semillas y granos. Pueden utilizarse el aceite de cacahuate, aceite de semilla de soja, aceite de coco, y aceite de oliva, la mayoría comúnmente disponibles, ejemplificando el aceite de nuez. Puede usarse el aceite de jojoba p.ej., obtenido de la semilla de jojoba. Los aceites de semillas incluyen aceite de cártamo, aceite de semilla de algodón, aceite de semilla de girasol, aceite de ajonjolí, etc. En el grupo principal, el aceite de maíz es el más disponible, pero también puede utilizarse el aceite de otros granos de cereales como el trigo, avena, centeno, arroz, cereal teff, tritical, etc. Los ésteres de ácido graso de 6-10 carbonos de glicerol y 1 , 2 -propanodiol , aunque no se presentan de forma natural en aceite de semillas, pueden prepararse por hidrólisis, separación y esterificación de los materiales apropiados iniciando con aceite de nueces y semillas. Las grasas y aceites de la leche de mamíferos se pueden metabolizar y por lo tanto se usan en la práctica de esta invención. Los procedimientos para la separación, purificación, saponificación y otros medio necesarios para obtener aceites puros de fuentes animales se conocen bien en la técnica. La mayoría de los pescados contienen aceites que se pueden metabolizar los cuales se pueden recuperar fácilmente. Por ejemplo, aceite de hígado de bacalao, aceites de hígado de tiburón, y aceite de ballena como esperma de ballena ejemplificando varios de los aceites de pescado que se pueden usar en la presente. Diferentes aceites de cadena ramificada se sintetizan biológicamente en unidades de isopreno de 5 carbonos y generalmente se refieren como terpenoides . El aceite de hígado de tiburón contiene un terpenoide insaturado, ramificado conocido como escualeno, 2 , 6 , 10 , 15 , 19, 23-hexametil-2 , 6 , 10, 14 , 18, 22 -tetracosahexaeno . También puede utilizarse escualano, el análogo saturado del escualeno. Los aceites de pescado, que incluyen escualeno y escualano, fácilmente disponibles de fuentes comerciales o pueden obtenerse por medio de métodos conocidos en la técnica. Se prefiere el escualeno.

Otros aceites útiles son los tocoferóles, que ventajosamente que se incluyen en las vacunas que se usan en sujetos de edad avanzada (p.ej., edades de 60 o mayores) porque la vitamina E ha sido reportada que presenta un efecto positivo en la respuesta inmune en este grupo. También tienen propiedades antioxidantes que pueden ayudar a estabilizar emulsiones. Existen diferentes tocoferoles ( , ß, ?, d, e, ?) pero se utiliza generalmente c¡ . Una -tocoferol preferida es el DL-OÍ- tocoferol . El succinato de a-tocoferol se sabe que es compatible con las vacunas de la influenza y es un preservador útil como un compuesto alterno al mercúrico.

Pueden usarse mezclas de aceites p.ej., escualeno y a-tocoferol .

Es típico un contenido de aceite en el intervalo de 2-20% (en volumen) .

Los tensioactivos pueden clasificarse por su "HLB" (de sus siglas en inglés de balance hidrófilo/lipófilo) . Algunos tensioactivos útiles con la invención tienen un HLB al menos de 10 p.ej., al menos de 15 o al menos 16. La invención puede usarse con tensioactivos incluyendo, pero no limitándose a: tensioactivos de ésteres de polioxietilen sorbitán (comúnmente conocido como los Tweens) , especialmente el polisorbato 20 y polisorbato 80; copolímeros del óxido de etileno (EO) , óxido de propileno (PO) , y/u óxido de butileno (BO) , vendido bajo la marca registrada DOWFAX™, tal como los copolímeros en bloque EP/PO; octoxinoles, que pueden variar en el número repeticiones de grupos etoxi (oxi-1,2-etanodiilo) , con octoxinol-9 (Tritón X-100, o t-octilfenoxipolietoxietanol ) que es de particular interés; (octilfenoxi) polietoxietanol ( IGEPAL CA-630/NP-40) ) ; fosfolípido tal como fosfatidilcolina (lecitina) ; etoxilatos de nonilfenol, tal como Tergitol™ serie NP; los éteres grasos de polioxietileno derivados de alcoholes de laurilo, cetilo, estearilo y oleilo (conocido como tensioactivos Brij ) , como el éter de monolauril trietilenglicol (Brij 30) ; y ésteres de sorbitán (comúnmente conocidos como los SPANs) , como el trioleato de sorbitán (Span 85) y monolaurato de sorbitán. Se prefieren los tensioactivos no iónicos. El tensioactivo más preferido para incluir en la emulsión es polisorbato 80 (monooleato de polioxietilen sorbitán; Tween 80) .

Mezclas de tensioactivos pueden utilizarse, p.ej., mezclas de Tween 80/Span 85. También es adecuada una combinación de un éster de polioxietilen sorbitán y un octoxinol. Otra combinación útil comprende laureth más un éster de polioxietilen sorbitán y/o octoxinol.

Las cantidades útiles de tensioactivos (% en peso) son: éster de polioxietilen sorbitán (como Tween 80) 0.01 a 1%, en particular alrededor de 0.1% de octil- o nonil-fenoxi polioxietanoles (tal como Tritón X-100, u otros detergentes en la serie Tritón) 0.001 a 0.1%, en particular 0.005 a 0.02%; ésteres de polioxietileno (tal como lauret 9) 0.1 a 20%, p.ej., 0.1 a 10% y en particular 0.1 a 1% 1 alrededor de 0.5%.

Se prefieren emulsiones que contienen escualeno, particularmente aquellas que contienen polisorbato 80.

Los adyuvantes específicos de emulsión aceite en agua útiles con la invención incluyen, pero no se limitan a: • Una emulsión submicrón de escualeno, polisorbato 80, y trioleato de sorbitán. La composición de la emulsión en volumen puede ser aproximadamente 5% de escualeno, alrededor de 0.5% de polisorbato 80 y aproximadamente 0.5% de Span 85. En términos de peso, estas relaciones se vuelven 4.3% de escualeno, 0.5% de polisorbato 80 y 0.48% de Span 85. Este adyuvante se conoce como " F59" [69-71] , como se describe con mayor detalle en el capítulo 10 de la ref . 65 y capítulo 12 de la ref . 72. La emulsión MF59 incluye ventajosamente iones de citrato p.ej., amortiguador de citrato de sodio 10 mM.

Una emulsión submicrón de escualeno, un tocoferol y polisorbato 80. Las emulsiones puede tener de 2 a 10% de escualeno, de 0.3 a 3% de polisorbato 80, y la relación en peso de escualeno : tocoferol es preferentemente = 1 (p.ej., 0.90) ya que esta puede proporcionar una emulsión estable. El escualeno y el polisorbato 80 pueden estar presentes con una relación en volumen de aproximadamente 5:2 o con una relación en peso de aproximadamente 11:5. Una emulsión puede hacerse al disolver Tween 80 en PBS para dar una solución al 2%, después mezclar 90 mi de esta solución con una mezcla de (5 g de DL-o¡-tocoferol y 5 mi de escualeno) , después se microfluidifica la mezcla. La emulsión resultante tiene gotas oleosas submicrón p.ej., con un diámetro promedio entre 100 y 250 nm, preferentemente alrededor de 180 nm. La emulsión también puede incluir un monofosforilo 3-des-O-acilado de lípido A (3d-MPL) . Otra emulsión útil de este tipo puede comprender, para la dosis en humanos, 05-10 mg de escualeno, 0.5-11 mg de tocoferol, y 0.1-4 mg de polisorbato 80 [73] .

Una emulsión de escualeno, un tocoferol y un detergente Tritón (p.ej., Tritón X-100) . La emulsión también puede incluir 3d-MPL (véase enseguida) . La emulsión contiene un amortiguador de fosfato.

Una emulsión que comprende un polisorbato . (p.ej., polisorbato 80), un detergente (p.ej., Tritón X-100) y un tocoferol (p.ej., un succinato de a-tocoferol) . La emulsión puede incluir estos tres componentes con una relación en masa de aproximadamente 75:11:10 (p.ej., 750 µg/ml de polisorbato 80, 110 pg/ml Tritón X-100 y 100 µg/ml de succinato de a-tocoferol) , y estas concentraciones deben incluir cualquier contribución de estos componentes de los antígenos. La emulsión también puede incluir escualeno. La emulsión también puede incluir un 3d-MPL. La fase acuosa puede contener un amortiguador de fosfato.

Una emulsión de escualeno, polisorbato 80, y poloxámero 401 ( "Pluoronic™ L121"). La emulsión puede formularse en solución salina amortiguada con fosfato, pH 7.4. Esta emulsión es un vehículo para el suministro útil para los dipéptidos de muramilo, y se ha utilizado con treonilo-MDP en el adyuvante "SAF-1" [74] (0.05-1% Thr-MDP, 5% de escualeno, 2.5% de Pluronic L121 y 0.2% de polisorbato 80) . También puede utilizarse sin el Thr-MDP, como en el adyuvante "AF" [75] (5% de escualeno, 1.25% Pluronic L121 y 0.2% polisorbato 80). Se prefiere la microfluidificaeion .

Una emulsión que comprende escualeno, un solvente acuoso, un tensioactivo no iónico hidrofílico del alquiléter de polioxietileno (p.ej., polioxietileno (12) éter de cetoestearilo) y un tensioactivo no iónico hidrofóbico (p.ej., un éster de sorbitán o éster de manida, tal como monooleato de sorbitán o "Span 80") . La emulsión es preferentemente es termoreversible y/o tiene al menos 90% de gotas oleosas (en volumen) con un tamaño menor de 200 nm [76] . La emulsión también puede incluir uno o más de: alditol; un agente crioprotector (p.ej., azúcar, tal como dodecilmaltosida y/o sacarosa) ; y/o alquilpoliglicósido . La emulsión puede incluir un agonista TL 4 [77] . Estas emulsiones pueden estar liofilizadas .

Una emulsión de escualeno, poloxámero 105 y Abil-Care [78] . La concentración final (peso) de estos componente en las vacunas adyuvadas son 5% de escualeno, 4% de poloxámero 105 de (poliol plurónico) y 2% de Abil-Care 85 (Bis-PEG/PPG-16/16 PEG/PPG-16/16 dimeticona; triglicérido caprílico/cáprico) .

Una emulsión que tiene de 0.5-50% de un aceite, 0.1-10% de un fosfolípido, y 0.05-5% de un tensioactivo no iónico. Como se describe en la referencia 79, los componentes de fosfolípido preferidos son fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina , fosfatidilinositol , fosfatidilglicerol , ácido fosfatídico, esfingomielina y cardiolipina . Son ventajosos los tamaños de gotas submicrón .

Una emulsión aceite en agua submicrón de un aceite no metabolizable (como aceite mineral ligero) y al menos un tensioactivo (como lecitina, Tween 80 y Span 80) . Pueden incluirse aditivos como saponina QuilA, colesterol, un conjugado de saponina- lipófilo (como el GPI-0100, descrito en la referencia 80, producido por la adición de la amina alifática a la desacilsaponina por medio del grupo carboxi del ácido glucurónico) , bromuro de dimetilidioctadecilamoniq y/o N, -dioctadecil-N, N-bis- (2-hidroxietil) propandiamina .

Una emulsión en donde una saponina (p.ej., QuilA o QS21) y un esterol (p.ej., colesterol) se asocian como micelas helicoidales [81] .

Una emulsión que comprende un aceite mineral, un alcohol graso etoxilado no iónico lipofílico, y un tensioactivo hidrofílico no iónico (p.ej., un alcohol graso etoxilado y/o copolímero en bloques de polioxietileno- polioxipropileno) [82] .

• Una emulsión que comprende un aceite mineral, un alcohol graso etoxilado hidrofílico y un tensioactivo lipofílico no iónico (p.ej., un alcohol graso etoxilado y/o copolímero en bloques polioxietileno-polioxipropileno) [82] .

Como se mencionó anteriormente, emulsiones aceite en agua que comprende escualeno se prefiere particularmente. En algunas modalidades, la concentración de escualeno en una dosis de vacuna puede estar en el intervalo de 5-15 mg (es decir, una concentración de 10-30 mg/ml, asumiendo un volumen de dosis 0.5 mi) . Es posible, sin embargo, para reducir la concentración de escualeno [83,84] p.ej., para incluir < 5 mg por dosis, o aun < 1.1 mg por dosis. Por ejemplo, una dosis humana puede incluir 9.75 mg de escualeno por dosis (como en el producto FLUAD™ : 9.75 mg de escualeno, 1.175 mg de polisorbato 80, 1.175 mg de trioleato de sorbitán, en un volumen de dosis de 0.5 mi), o puede incluir una cantidad fraccional de esta p.ej., 3/4, 2/3, 1/2, 2/5, 1/3, 1/4, 1/5, 1/6, 1/7, 1/8, 1/9, 1/10. Por ejemplo, una composición puede incluir 4.875 de escualeno por dosis (y de esta forma 0.588 mg de cada uno de polisorbato 80 y trioleato de sorbitan), 3.25 mg de escualeno/dosis, 2.438 mg/dosis, 1.95 mg/dosis, 0.975 rag/dosis, etc. Cualquiera de estas diluciones fracciónales del FLUAD™-concentración MF59 puede utilizarse con la invención, mientras mantiene una relación de escualeno ¡polisorbitan-80 : sorbitán-trioleato de 8.3:1:1 (en masa).

Otros antígenos que se usan con la invención Composiciones y kits de la invención también pueden comprender uno o más de ' otros antígenos de otros patógenos, particularmente de bacterias y/o virus. Uno o más de los otros antígenos preferidos se seleccionan de: • Un antígeno de neumococo • Un toxoide de la difteria ("D") • Un toxoide del tétanos ("T") • Un antígeno de pertussi ("P"), que típicamente es acelular ("aP") • Un antígeno superficial del virus de hepatitis B (HBV) ( "HBsAg" ) • Un antígeno del virus de hepatitis A (HAV) • Un sacárido capsular conjugado de Haemophilus influenzae tipo b ("Hib") • Vacuna de poliovirus inactiva (IPV) • Un sacárido capsular conjugado de N.meningitidis serogrupo A ( "MenA" ) • Un sacárido capsular conjugado de N. meningitidis serogrupo W135 ("MenW135") • Un sacárido capsular conjugado de N.meningitidis serogrupo Y ( "MenY" ) Pueden utilizarse uno o más de los otros antígenos. Las siguientes combinaciones se prefieren particularmente en las composiciones y kits de la invención: • Men-C-PnC • D-T-Pa-MenC • D-T-Pa-Hib- enC; D-T-Pa-IPV-MenC; D-T-Pa-HBsAg-MenC; D- D-T-Pa-MenC- nC .

· D-T-Pa-HBsAg-IPV-MenC; D-T-Pa-HBsAg-MenC-PnC .

• D-T-Pa-HBsAg- IPV-Hib-MenC ; D-T-Pa-HBsAg-Hib-MenC-MenA.

• D-T-Pa-HBsAg- IPV-Hib-MenC-MenA; D-T-Pa-HBsAg-IPV-Hib- MenC-PnC .

Estas composiciones pueden consistir de los antígenos listados, o además pueden incluir antígenos de patógenos adicionales. De esta forma pueden utilizarse de forma individual, o como componentes de otras vacunas.

Sacáridos de N.meningitidis conjugados Otros antígenos pueden incluir antígenos de meningococo conjugados. Los antígenos de meningococo conjugados comprenden antígenos de sacáridos capsulares de Neisseria meningitidis conjugado por proteínas portadoras. Las vacunas monovalentes conjugadas contra el serogrupo C se han probado para el uso humano, e incluyen MENJUGATE™ [85] , ENJUGATE™ y NEISVAC-C™. Las mezclas de conjugados de los serogrupos A+C se conocen [86,87] y mezclas de los conjugados de los serogrupos A+C+ 135+Y se ha reportado [88-91] y se probaron en 2005 como el producto MENACTRA™ .

La invención puede incluir sacáridos de uno o más de los serogrupos A, C, 135 y/o Y p.ej., A, C, W135, Y, A+C, C+W135, C+Y, A+C-W135, A+C+W135, A+C+Y, C+W135+Y, A+C+W135+Y.

El sacárido capsular de meningococo serogrupo A es un homopolímero de N-acetil-D-manosamina-l-fosfato (al?6) -unido, con O-acetilación parcial en la posición C3 y C4. La acetilación en la posición C-3 puede ser del 70-95%. Las condiciones usadas para purificar el sacárido pueden originar la des-O-acetilación (p.ej., bajo condiciones básicas), pero se prefiere retener el OAc en esta posición C-3. De esta forma, preferentemente al menos 50% (p.ej., al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más) délos residuos de manosamina están O-acetilados en la posición C-3.

El sacárido capsular de meningococo serogrupo C es un homopolímero o¡l?9-unido de ácido siálico (ácido N-acetilneuramínico) , típicamente con los grupos 0-acetilo (OAc) en los residuos C7 y C8. El compuesto está representado como: ?9) -Neu p NAc 7/8 OAc- (o¡2? . Algunas cepas MenC (-12% de los aislados invasivos) producen un polisacárido que carece de este grupo OAc. La presencia o ausencia de los grupos OAc generan epitopos únicos, y la especificidad del enlace del anticuerpo con el sacárido puede afectar su actividad bacteriana contra las cepas O-acetiladas (OAc-) y des-O-acetiladas [92-94] . Las vacunas conjugadas MenC con licencia incluyen tanto sacáridos OAc- (NEISVAC-C™1) y OAc+ (MENJUGATE™ & MENINGITEC™) . Los sacáridos de serogrupo C utilizados con la invención pueden prepararse ya sea con cepas OAc+ u OAc- . Las cepas preferidas para la producción de los conjugados de serogrupo C con cepas OAc+, preferentemente del serotipo 16, preferentemente del serosubtipo P1.7a,l. De esta forma se prefieren las cepas C:16:P1.7a,l 0AC+ . También son útiles las cepas OAc+ en serosubtipo Pl.l, tal como la cepa Cll.

El . sacárido del serogrupo W135 es un polímero de unidades de disacárido de ácido siálico-galactosa . Igual que el sacárido de serogrupo C, tiene O-acetilación variable, pero en las posiciones 7 y 9 del ácido siálico [95] . La estructura se escriben como: ?4) -D-Neup5Ac (7/90Ac) -a- (2?6) -D-Gal-a- ( 1? El sacárido del serogrupo Y es similar al sacárido del serogrupo 135, excepto que la unidad de repetición del sacárido incluye glucosa en lugar de galactosa. Al igual que el serogrupo 135, tiene O-acetilación variable en las posiciones 7 y 9 del ácido siálico [95] . La estructura del serogrupo Y se escriben como: -?4) -D-Neup5Ac (7/90Ac) -a- (2?6) -D-Glu-a- ( 1? Los productos MENJUGATE™ Y MENINGITEC™ usan una proteína portadora, y este portador también puede utilizarse de conformidad con la invención. El producto NEISVAC-C™ utiliza una proteína portadora de toxoide del tétanos, y este portador también puede utilizarse de conformidad con la invención, que puede ser el toxoide de la difteria. Otra proteína portadora útil para los conjugados de meningococo es la proteína D de Haemophilus influenzae, que no está presente en ninguna de las vacunas conjugadas aprobadas existentes.

El sacárido de otros antígenos puede comprender sacáridos de toda la longitud que se preparan con meningococo, y/o puede comprender fragmentos del sacárido completo. Los sacáridos de otros antígenos son preferentemente más cortos que los sacáridos capsulares vistos en las bacterias. De esta forma los sacáridos de otros antígenos son preferentemente despolimerizados , con la despolimerización que se presenta después de la purificación del sacárido pero antes de la conjugación. La despolimerización reduce la longitud de la cadena de los sacáridos. Un método de despolimerización involucra el uso de peróxido de hidrógeno [88] . El peróxido de hidrógeno se agrega a un sacárido (p.ej., para dar una concentración final de H202 del 1%), y la mezcla después se incuba (p.ej., alrededor de 55 °C) hasta que se ha logrado una reducción deseada de la longitud de cadena. Otro método de despolimerización involucra la hidrólisis del ácido [89] .

Otros métodos de despolimerización se conocen en la técnica. Los sacáridos utilizados para preparar conjugados que se usan de conformidad con la invención pueden obtenerse por cualquier método de despolimerización. La despolimerización puede usarse a fin de proporcionar una longitud óptima para la inmunogenización y/o para reducir la longitud de cadena para el manejo físico de los sacáridos. Los sacáridos preferidos tienen el siguiente intervalo de grados promedio de polimerización (Dp) : A = 10-20; C = 12-22; W135 = 15-25; Y = 15-25. En términos del peso molecular, a diferencia de Dp, los intervalos preferidos son, para todos los serogrupos : <100kDa; 5kDa-75kDa; 7kDa-50kDa; 8kDa-35kDa; 12kDa-25kDa; 15kDa-22kDa.

Los conjugados de meningococo con una relación de sacárido : proteína (p/p) de entre 1:10 (es decir, proteína en exceso) y 10:1 (es decir, sacárido en exceso) pueden usarse en los otros antígenos p.ej., relaciones entre 1:5 y 5:1, entre 1:2.5 y 2.5:1, o entre 1:1.25 y 1.25:1. Puede usarse una relación de 1:1.

Típicamente, una composición incluirá entre 1 µg y 20 pg (medida como sacárido) por dosis del otro antígeno serogrupo que esté presente .

Los conjugados de meningococo pueden o no adsorberse por un adyuvante de sale de aluminio.

Los conjugados de meningococo pueden estar liofilizados previo a su uso de acuerdo con la invención. Si están liofilizados , la composición puede incluir un estabilizador como manitol. También puede incluir cloruro de sodio.

Sacáridos de neumococo conjugados Otros antígenos pueden incluir antígenos de neumococo conjugados. Los antígenos de neumococo conjugados comprenden antígenos de sacáridos capsulares de Streptococcus pneumoniae conjugados con las proteínas portadoras [p.ej., ref. 96 a 98] . Se prefiere incluir sacáridos de más de un serotipo de mezclas de S .pneumoniae: se utilizan ampliamente mezclas de polisacáridos de 23 diferentes serotipos, que son vacunas conjugadas con polisacáridos de 5 a 11 diferentes serotipos [99] . Por ejemplo, PREV AR™ [100] contiene antígenos de siete serotipos (4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, y 23F) con cada uno de los sacáridos individualmente conjugados con CRM197 por aminación reductora, con 2 yg de sacárido por 0.5 mi de dosis (4 pg del serotipo 6B) .

Otros antígenos preferentemente incluyen antígenos de sacárido al menos para los serotipos 6B, 14, 19F y 23F. Otros serotipos se seleccionan preferentemente de 1, 3, 4, 5, 7F, 9V y 18C. 7-valente (como en PREVNAR™), 9-valente (p.ej., los 7 serotipos de PREVNAR, más 1 & 5), 10-valente (p.ej., los 7 serotipos de PREVNAR, más 1, 5 & 7F) y 11-valente (p.ej., los 7 serotipos de PREVNAR, más 1, 3, 5 & 7F) es particularmente útil el abarcar los serotipos de neumococo.

La porción del sacárido del conjugado puede comprender toda la longitud del sacárido que se prepara a partir de neumococo, y/o puede comprender fragmentos de los sacáridos de longitud completa. Los sacáridos usados de acuerdo con la invención son preferentemente más cortos que los sacáridos capsulares nativos vistos en las bacterias, como se describen anteriormente para los conjugados de meningococo.

Los conjugados de neumococo con una relación de sacárido : proteína (p/p) entre 1:10 (es decir, proteína en exceso) y 10:1 (es decir, sacárido en exceso) puede usarse p.ej., relaciones entre 1:5 y 5:1, entre 1:2.5 y 2.5:1, o entre 1:1.25 y 1.25:1.

El producto PREV AR™ utiliza una proteína portadora CRM197, y este portador también puede usarse de acuerdo con la invención. Los portadores alternativos que se usan con los sacáridos de neumococo incluyen, pero no se limitan a, un portador del toxoide de tétanos, un portador del toxoide de difteria y/o un portador de la proteína D de H.influenzae. El uso de múltiples portadores que se mezclan con los serotipos de neumococo puede ser ventajoso [101] p.ej., para incluir ambos un portador de la proteína D de H.influenzae y p.ej., un portador del toxoide de tétanos y/o un portador del toxoide de difteria. Por ejemplo, uno o más (preferentemente todos) los serotipos 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14 y 23F pueden estar conjugados con un portador de la proteína D de H. influenzae, serotipo 18C puede estar conjugado con un toxoide de tétanos, y el serotipo 19F puede estar conjugado con un portador del toxoide de difteria.

Típicamente, una composición incluirá entre 1 pg y 20 yg (medido como sacárido) por dosis de cada serotipo que esté presente .

Antígeno Pertussis Otros antígenos pueden incluir antígenos pertussis. El Bordetella pertussis origina tosferina. Los antígenos de pertussis en las vacunas son tanto celulares (célula completa, en forma de células de B .pertussis no activas) o no celulares. La preparación de los antígenos de pertussis celulares está bien documentada [p.ej., véase el capítulo 21 de la ref . 102] p.ej., puede obtenerse por desactivación térmica del cultivo fase I de B .pertussis . Preferentemente, sin embargo, la invención utiliza antígenos no celulares.

Donde se utilizan los antígenos no celulares, se prefiere utilizar uno, dos o (preferentemente) tres de los siguientes antígenos: (1) toxoide de pertussis destoxificado (toxoide de pertussis, o "PT"); (2) hemaglutinina filamentosa ( "FHA" ) (3) pertactina (también conocida como la proteína de membrana externa de 69 KiloDaltones) . Estos tres antígenos se preparan preferentemente por aislamiento del crecimiento del cultivo de B .pertussis en medio líquido Stainer-Scholte modificado. El PT y FHA pueden aislarse del cultivo de fermentación (p.ej., por adsorción en el gel de hidroxiapatita) , mientras la pertactina pueda extraerse de las células por tratamiento térmico y floculación (p.ej., utilizando cloruro de bario) . Los antígenos pueden purificarse en cromatografía sucesiva y pasos de precipitación. Los PT y FHA pueden purificarse por ejemplo, por cromatografía hidrofóbica, cromatografía por afinidad y cromatografía por exclusión de tamaño. La pertactina puede purificarse por ejemplo, por cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrofóbica y cromatografía de exclusión de tamaño. La FHA y al pertactina pueden tratarse con formaldehído previo a su uso de acuerdo con la invención. El PT está preferentemente destoxificado por tratamiento con formaldehído y/o glutaraldehído . Como una alternativa para este procedimiento de destoxificación química el PT puede ser un PT mutante en donde la actividad enzimática se ha reducido por mutagénesis [103] , pero se prefiere la destoxificación por tratamiento químico.

Los antígenos de pertussis acelulares se adsorben preferentemente sobre uno o más adyuvantes de sal de aluminio. Como una alternativa, pueden agregarse en un estado no adsorbido. Donde se agrega la pertactina entonces preferentemente se adsorbe preferentemente sobre un adyuvante de hidróxido de aluminio. El PT y FHA puede adsorberse sobre un adyuvante de hidróxido de aluminio o un fosfato de aluminio. Se prefiere más que todos el PT, FHA y la pertactina con hidróxido de aluminio.

Las composiciones típicamente incluirán: 1-50 pg/dosis de PT; 1-50 pg/dosis de FHA; y 1-50 pg/dosis de pectina. Las cantidades preferidas son de aproximadamente 25 pg/dosis de PT, 25 g/dosis de FHA; y 8 pg/dosis de pectina.

Así como también, el PT, la FHA, y la pertactina, es posible incluir fimbriae (p.ej., aglutinógenos 2 y 3) en una vacuna de pertussis no celular.

Vacuna de poliovirus inactivo Otros antígenos pueden incluir antígenos de poliovirus inactivo Los poliovirus originan poliomielitis. En lugar de usar vacunas orales de poliovirus, se utilizan otros antígenos de IPV, que se revelan con mayor detalle en el capítulo 24 de referencia 102.

Los poliovirus pueden crecer en cultivo celular, y un cultivo celular preferido utiliza una línea celular Vero, derivada de riñon de primate. Las células Vero pueden convenientemente cultivarse sobre microportadores . Después del crecimiento, los viriones pueden purificarse utilizando técnicas como ultrafiltración, diafiltración, y cromatografía. Previo a la administración a los pacientes, los poliovirus deben estar inactivos, y esto puede lograrse por tratamiento con formaldehído .

La poliomielitis puede originarse por uno de los tres tipos de polivirus. Los tres tipos son similares y originan síntomas idénticos, pero antigénicamente son muy diferentes y la infección por un tipo no protege contra la infección de los otros. Por .lo tanto se prefiere utilizar antígenos de poliovirus en la invención: el poliovirus Tipo 1 (p.ej., cepa ahoney) , poliovirus Tipo 2 (p.ej., cepa MEF-1) , y poliovirus Tipo 3 (p.ej., cepa Saukett) . Los virus preferentemente crecen, se purifican e inactivan individualmente, y después se combinan para dar una mezcla trivalente en volumen para su uso con la invención.

Las cantidades de IPV típicamente se expresan en unidades "DU" (la "unidad D-antígeno" [104] ) . Se prefiere el uso entre 1-100 DU por tipo viral por dosis, p.ej., alrededor de 80 DU del poliovirus Tipo 1, alrededor de 16 DU del poliovirus Tipo 2, y aproximadamente 64 DU del poliovirus Tipo 3.

Los antígenos de poliovirus preferentemente no se adsorben por cualquier sal de aluminio adyuvante antes que se usen para hacer composiciones de la invención, pero pueden comenzar a absorberse sobre el/los adyuvante (s) de aluminio en la composición de vacuna durante el almacenamiento.

Toxoide de la difteria Otros antígenos pueden incluir antígenos de toxoide de difteria. La Corynebacterium diphtheriae origina difteria. La toxina de difteria puede tratarse (p.ej., utilizando formalina o formaldehído) para eliminar la toxicidad mientras retiene la capacidad de inducir anticuerpos anti-toxina específico después de la inyección. Estos toxoides de difteria se utilizan en las vacunas de la difteria, y se revelan con mayor detalle en el capítulo 13 de la referencia 102. Los toxoides de la difteria son aquellos preparados por tratamiento de formaldehído . El toxoide de la difteria puede obtenerse por crecimiento de C. diphtheriae en el medio de crecimiento (p.ej., medio Fentom o medio Linggoud & Fenton) que puede complementarse con extracto de bovino, seguido por tratamiento de formaldehído, ultrafiltración y precipitación. El material toxoide después puede tratarse por un proceso que comprende una filtración y/o diálisis estéril.

Las cantidades del toxoide de difteria pueden expresarse en unidades internacionales (IU) . Por e emplo, la NIBSC suministra el "Tercer Estándar Internacional del Toxoide de la Difteria 1999" [105,106], que contiene 160 IU por ampolleta. Como una alternativa al sistema IU, la "unidad Lf" ("unidades de floculación" o la "dosis de floculación con cales") se define como la cantidad de toxoide que, cuando se mezcla con una Unidad Internacional de antitoxina, produce una mezcla de floculación óptima [107] . Por ejemplo, la NIBSC provee el "Toxoide de Difteria, sencillo" [108] , que contiene 300 LF por ampolleta, y también suministra "El 1er Reactivo de Referencia Internacional para el Toxoide de la Difteria para la Prueba de Floculación" [109] que contiene 900 LF por ampolleta .

Las composiciones típicamente incluyen entre 20 y 80 Lf del toxoide de la difteria, típicamente alrededor de 50 Lf.

Por mediciones de IU, las composiciones típicamente incluirán al menos 30 IU/dosis.

El toxoide de la difteria preferentemente se adsorbe sobre un adyuvante de hidróxido de aluminio.

Toxoide del tétanos Otros antígenos puede incluir antígenos del toxoide del tétanos. El Clostridium tetani origina el tétanos. La toxina del tétanos puede tratarse para proporcionar un toxoide protector. Los toxoides se usan en las vacunas del tétanos, y se describen con mayor detalle en el capítulo 27 de referencia 102. Los toxoides de los tétanos preferidos son aquellos preparados por el tratamiento con formaldehído . El toxoide del tétanos puede obtenerse por crecimiento C. tetani en el medio de crecimiento (p.ej., un medio Latham derivados de caseína de bovino) , seguido por tratamiento con formaldehído, ultrafiltración y precipitación. El material después puede tratarse por medio de un proceso que comprende filtración y/o diálisis estéril.

Las cantidades del toxoide del tétanos puede expresarse en unidades internacionales (IU) . Por ejemplo, la NIBSC provee el "Tercer Estándar Internacional del Toxoide de la Difteria 2000" [110,111], que contiene 469 IU por ampolleta.

Como una alternativa al sistema IU, la "unidad Lf" ("unidades de floculación" o la "dosis de floculación limes") se define como la cantidad de toxoide que, cuando se mezcla con una Unidad Internacional de antitoxina, produce una mezcla de floculación óptima [107] . Por ejemplo, la NIBSC provee "El 1er Reactivo de Referencia Internacional para el Toxoide de la Difteria para la Prueba de Floculación" [112] que contiene 1000 LF por ampolleta.

Las composiciones típicamente incluyen entre 5 y 50 Lf del toxoide de la difteria, típicamente alrededor de 20 Lf .

Por mediciones de IU, las composiciones típicamente incluirán al menos 40 IU/dosis.

El toxoide del tétanos pueden adsorberse sobre un adyuvante de hidróxido de aluminio, pero no necesariamente (p.ej., puede utilizarse para la adsorción de entre 0-10% del toxoide del tétanos total) .

Antígenos del virus de Hepatitis A Otros antígenos pueden incluir antígeno del virus de hepatitis A. El virus de hepatitis A (HAV, por sus siglas en inglés) es uno de los agentes conocidos que originan hepatitis viral. Las vacunas del HAV se revelan en el capítulo 15 de la referencia 102. Un componente del HAV preferido se basa en el virus inactivo, y desactivación puede lograrse por tratamiento con formalina. El virus puede crecer en los fibroblastos del diploide pulmonar embriónico de humano, tal como las células MRC-5. Una cepa HAV preferida es HM175, aunque también puede usarse CR326F. Las células pueden crecer bajo condiciones que permiten el crecimiento viral. Se produjo lisis en las células, y la suspensión resultante puede purificarse por ultrafiltración y cromatografía de permeación en gel.

La cantidad del antígeno del HAV, medido en EU (Unidades Elisa), es típicamente al menos aproximadamente 500 EU/ml.

Antígenos del virus de Hepatitis B Otros antígenos pueden incluir antígeno del virus de hepatitis B. El virus de hepatitis B (HBV, por sus siglas en inglés) es uno de los agentes conocidos que originan hepatitis viral. El virión del HBV consiste de un núcleo interno rodeado por un recubrimiento o cápside de proteína y el núcleo viral contiene el genoma da ADN viral. El componente principal del cápside es una proteína conocida como antígeno superficial del HBV o comúnmente, "HBsAg" , que es típicamente un polipéptido de 226 aminoácidos con un peso molecular de ~24kDa. Todas las vacunas de hepatitis B existentes contiene HBsAg, y cuando este antígeno se administra a una persona vacunada normal este estimula la producción de los anticuerpos anti-HBsAg que protegen contra la infección del HBV.

Para la producción de la vacuna, el HBsAg se ha hecho de dos formas. El primer método involucra purificar el antígeno en una forma particular a partir del plasma de los portadores de hepatitis B crónicos, como grandes cantidades de HBsAg que se sintetizan en el hígado y se liberan en el torrente sanguíneo durante la infección de HBV. El segundo método involucra expresar la proteína por el método de ADN recombinante . El HBsAg que se usa con el método de la invención se expresa de forma preferida recombinante en las células de levadura. Las levaduras adecuadas incluyen, por ejemplo, huéspedes de Saccharomyces (tal como S . cerevisiae) o Hanensula (tal como H.polymorpha) .

El HBsAg está preferentemente no glicolisado. A diferencia del HBsAg nativo (es decir, como en el producto purificado del plasma) , el HBsAg expresado en levadura generalmente no está glicolisado, y esta es la forma más preferida del HBsAg que se utiliza en la invención, porque es altamente inmunizador y puede prepararse sin el riesgo de contaminación con el producto sanguíneo.

La HBsAg generalmente estará en forma de partículas sustancialmente esféricas (diámetro promedio de aproximadamente 20 nm) , incluyendo una matriz lipídica que comprende fosfolípidos . Las partículas del HBsAg expresadas en almidón pueden incluir fosfatidilinositol , que no se encuentra en los viriones del HBV naturales. Las partículas también pueden incluir una cantidad no tóxica de LPS a fin de estimular el sistema inmune [113] . El HBsAg preferido está en forma de partículas que incluyen una matriz lipídica que comprende fosfolípidos , fosfatidilinositol y polisorbato 20.

Todos los HBV subtipos conocidos contienen el determinante "a" común. Se combina con otros determinantes y sub-determinantes , se han identificado nueve subtipos: aywl, ayw2 , ayw3 , ayw4 , ayr, adw2 , ad , adrq- y adrq+ . No obstante estos subtipos, han surgido otros subtipos, tal como los mutantes HBV que se han detectado en individuos 'inmunizados ("mutantes de escape") . El subtipo del HBV más preferido que se utiliza en la invención es el subtipo adw2.

Además de la secuencia "S" , un antígeno superficial puede incluir todo o parte de la secuencia pre-S, tal como todo o parte de una secuencia pre-Sl y/o pre-S2.

Un método preferido para la purificación HBsAg involucra, después de la interrupción celular: la ultrafiltración; cromatografía de exclusión del tamaño; cromatografía de intercambio iónico, ultracentrifugación; desalinización, y filtración estéril. Los lisatos pueden precipitarse después de la interrupción celular (p.ej., utilizando un polietilenglicol ) , dejando el HBsAg en solución, fácil para la ultraf iltración .

Después de la HBsAg puede sujetarse a diálisis (p.ej., con cisteína) , que puede utilizarse para remover cualquier conservador mercúrico como trimerosal que puede haberse usado durante la preparación de HbsAg [114] .

Cantidades del ABsAg se expresan típicamente en microorganismos, y una cantidad típica del ABsAg por dosis de vacuna está entre 5 y 5 ig p.ej., 10 pg/dosis.

Aunque el HBsAg puede adsorberse por un adyuvante de hidróxido de aluminio en la vacuna final (como en el producto bien conocido ENGERIX-B™) o puede permanecer sin adsorberse, generalmente se adsorberá por un adyuvante de fosfato de aluminio [115] .

Antígenos conjugados de Haemophilus influenzae tipo b Otros antígenos pueden incluir antígenos de Haemophilus influenzae tipo b conjugados ( "Hib" ) . Los Hib provocan meningitis bacteriana. Las vacunas del Hib se basan típicamente en el antígeno sacárido capsular [capítulo 14 de la ref. 102], la preparación de estas está bien documentada [p.ej., referencias 116 a 125] .

El sacárido Hib puede estar conjugado con una proteína portadora a fin de mejorar la inmunogenicidad, especialmente en niños. Las típicas proteínas portadoras son el toxoide del tétanos, toxoide de la difteria, el CRM197 derivado del toxoide de la difteria, la proteína D de H. influenzae, y un complejo de proteína con membrana externa del meningococo serogrupo B. La proteína portadora en el conjugado Hib es preferentemente diferente de la(s) proteína (s) del portador en el/los conjugado (s) de meningococo, pero el mismo portador puede usarse en algunas modalidades.

El toxoide tetánico es el portador preferido, como se usa en el producto comúnmente referido como "PRP-T" . El PRP-T puede hacerse al activar un polisacárido capsular Hib utilizando bromuro de cianógeno, acoplando el sacárido activado con una molécula de enlace de ácido adípico ( como ( 1 -etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida) , típicamente la sal de clorhidrato) , y después se hace reaccionar todo la molécula de enlace-sacárido con una proteína portadora del toxoide de tétanos .

El radical de sacárido del conjugado puede comprender toda la longitud del fosfato de poliribosilribitol (PRP) que se prepara con la bacteria Hib, y/o fragmentos de toda la longitud del PRP.

El Hib se conjuga con una relación de sacárido : proteína (p/p) entre 1:5 (es decir, proteína en exceso) y 5:1 (es decir, sacárido en exceso) puede utilizarse p.ej., con relaciones entre 1:2 y 5:1 y relaciones entre 1:1.25 y 1:2.5. En vacunas preferidas, sin embargo, la relación en peso del sacárido a la proteína portadora está entre 1:2 y 1:4, preferentemente entre 1:2.5 y 1:3.5. Las vacunas donde está presente el toxoide del tétanos tanto como un antígeno y como una proteína portadora entonces la relación en peso del sacárido a la proteína portadora en el conjugado puede estar entre 1:0.3 y 1:2 [126] .

Las cantidades de los conjugados de Hib generalmente se dan en términos de la masa del sacárido (es decir, la dosis del conjugado (portador + sacárido) como un conjunto es mayor que la dosis declarada) a fin de evitar variaciones debido a la elección del portador. Una típica cantidad del sacárido Hib por dosis está entre 1-30 µg, preferentemente alrededor de 10 g.

La administración del conjugado de Hib preferentemente origina una concentración del anticuerpo anti-PRP de = 0.15 yg/ml, y más preferentemente = 1 µg/ml, y estos son umbrales de la respuesta estándar.

Los conjugados Hib pueden estar liofilizados previo a su uso de acuerdo con la invención. Otros componentes también pueden agregarse previo al secado por congelamiento p.ej., como estabilizadores. Los estabilizadores preferidos para la inclusión son lactosa, sacarosa, y manitol, así como también mezclas de estos, p.ej., mezclas de lactosa/sacarosa, mezclas de sacarosa/manitol , etc. La vacuna final de esta forma puede contener lactosa y/o sacarosa. Utilizando una mezcla de sacarosa/manitol pude acelerarse el proceso de secado.

Los conjugados de Hib pueden o no adsorberse con un adyuvante de sal de aluminio. Se prefiere que no se adsorban por un adyuvante de hidróxido de aluminio.

Mezclado del oligonucleótido y el polímero con el antígeno MenB Las composiciones inmunogénicas de la invención convenientemente pueden prepararse al mezclar una suspensión acuosa del complejo de oligonucleótido/polímero con un antígeno. El complejo se mantiene típicamente en forma líquida, por lo tanto proporciona una forma más fácil de realizar la formulación complementaria.

En algunas modalidades una o ambas suspensiones incluyen un inmunógeno a fin de que el mezclado proporcione una composición inmunogénica de la invención.

Donde se mezclan dos líquidos la relación e volumen para el mezclado puede variar (p.ej., entre 20:1 y 1:20, entre 10:1 y 1:10, entre 5:1 y 1:5, entre 2:1 y 1:2, etc.) pero es idealmente aproximadamente 1:1. La concentración de los componentes en las dos suspensiones puede seleccionarse a fin de que se alcance una concentración final deseada después del mezclado p.ej., ambos pueden prepararse con una concentración de 2x tal que el mezclado 1:1 proporcione las concentraciones finales deseadas.

Pueden utilizarse diferentes concentraciones del oligonucleótido y el polímero policatiónico p.ej., cualquiera de las concentraciones utilizadas en las referencias 58, 61, 62 ó 127. Por ejemplo, puede estar presente un oligopéptido policatiónico con 1100 µ?, 1000 µ?, 350 µ?, 220 µ?, 200 µ?, 110 µ?, 100 µ?, 11 µ?, 10 µ , 1 µ?, 500 ??, 50 ??, etc. Un oligonucleótido puede estar presente en 44 nM, 40 nM, 20 nM, 14 nM, 4.4 nM, 4 nM, 2 nM, etc. Es típica una concentración de oligopéptido policatiónico de menos de 2000 nM. Para una SEC ID Nos: 1 & 2, se mezclan con una relación molar de 1:25, las concentraciones en mg/ml en tres modalidades de la invención puede ser de 0.311 & 1.322, o 0.311 o 0.109 & 0.463 o 0.031 y 0.132.

Algunas composiciones inmunogénicas de la invención comprenden una sal de aluminio y un complejo del oligonucleótido inmunoestimulante y el polímero policatiónico. En estas composiciones, una sal de aluminio y un complejo del oligonucleótido inmunoestimulante y el polímero policatiónico son típicamente ambas partículas. El diámetro de partícula promedio de los adyuvantes de la sal de aluminio está típicamente en el orden de 1-20 µt? [66,128] . También es el intervalo del tamaño para los complejos vistos en IC31™. Cuando estas partículas se combinan, el diámetro promedio de las partículas de sal puede sustancialmente ser las mismas que el diámetro promedio de los complejos. En otras modalidades, sin embargo, el diámetro promedio de las partículas de sal puede ser menor que el tamaño promedio de los complejos. En otras modalidades, el diámetro promedio de las partículas de sal puede ser mayor que el tamaño promedio de los complejos. Donde los diámetros promedio difieren, el diámetro mayor puede ser más grande por un factor al menos de 1.05x p.ej., l.lx, 1.2x, 1.3x, 1.4x, 1.5x, 2x, 2.5x, 3x o más. Si cualquiera la sal o el complejo tiene partículas con un intervalo de diámetros, pero los diámetros promedio difieren, los intervalos pueden o no traslaparse. De esta forma la partícula de sal más grande puede ser menor que las partículas del complejo más pequeño o las partículas del complejo más grande puede ser más pequeña que las partículas de sal más pequeñas .

Debido a que las partículas son generalmente muy grandes para filtrarse de forma esterilizada, la esterilidad de una composición inmunogénica de la invención típicamente se logrará al preparar el complejo, y donde es apropiado, la sal de aluminio, bajo condiciones estériles, y después mezclarlos bajo condiciones estériles. Por ejemplo, los componentes del complejo podrían filtrarse de forma esterilizada. En algunas modalidades, estos complejos estériles podrían mezclarse con un adyuvante de sal de aluminio (estéril) en autoclave para proporcionar una composición adyuvante estéril. El adyuvante estéril después puede mezclarse con un inmunógeno estéril para dar una composición inmunogénica adecuada para la administración al paciente.

La densidad de las partículas de la sal de aluminio es típicamente diferente de la densidad de un complejo de oligonucleótido inmunoestimulante y el polímero policatiónico, lo que significa que las dos partículas pueden separarse con base en la densidad p.ej., por un gradiente de sacarosa.

Composición farmacéutica Las composiciones inmunogénicas de la invención generalmente incluyen compuestos además del antígeno MenB y el oligonucleótido y polímero p.ej., típicamente incluyen uno o más componentes farmacéuticamente aceptables. Estos componentes también pueden estar presentes en composiciones inmunogénicas de la invención, originando ya sea la composición adyuvante u otra composición. Una discusión de estos componentes está disponible en la referencia 129.

Una composición puede incluir un conservador tal como tiomersal o 2 -fenoxietanol . Se prefiere que la vacuna deba estar sustancialmente libre de (p.ej., <10 g/ml) material mercúrico p.ej., libre de tiomersal. Las vacunas que no contienen mercurio se prefieren más. Las vacunas libres de conservadores son particularmente preferidas. Puede estar incluido el succinato de -tocoferol como una alternativa para los compuestos de mercurio en las vacunas de la influenza .

Para controlar la tonicidad, una composición puede incluir una sal fisiológica, como una sal de sodio. Se prefiere el cloruro de sodio (NaCl) , que puede estar presente entre 1 y 20 mg/ml. Otras sales que pueden estar presentes incluyen el cloruro de potasio, fosfato dihidrógeno de potasio, fosfato disódico, y/o cloruro de magnesio, etc.

Las composiciones pueden tener una osmolaridad entre 200 mOsm/kg y 400 mOsm/kg, p . ej . , entre 240-360 mOsm/kg, puede estar dentro del intervalo de 280-330 mOsm/mg o 290-310 mOsm/kg .

El pH de una composición generalmente estará entre 5.0 y 8.1 y más típicamente entre 6.0 y 8.0 p.ej., 6.5 y 7.5 o entre 7.0 y 7.8.

Una composición A es preferentemente estéril. Una composición es preferentemente no pirogénico p.ej., que contiene <1 EU (unidad de endotoxina, una medida estándar) por dosis, y preferentemente <0.1 EU por dosis. Una composición es preferentemente libre de gluten.

Una composición inmunogénica puede incluir material para una simple inmunización, o puede incluir material para las inmunizaciones múltiples (es decir, un kit de "dosis múltiples") . La inclusión de un conservador es útil en disposiciones de dosis múltiples. Como una alternativa (o en adición) para incluir un conservador en composiciones de dosis múltiples, las composiciones pueden contenerse en un recipiente que tiene un adaptador aséptico para la eliminación de material.

Las composiciones generalmente estarán en forma acuosa en el punto de administración. Las vacunas se administran típicamente en un volumen de dosis de aproximadamente 0.5 mi, aunque la mitad de la dosis (es decir, alrededor de 0.25 mi) algunas veces puede administrarse p.ej., a niños. En algunas modalidades de la invención una composición puede administrarse con una dosis mayor p.ej., aproximadamente 1 mi p.ej., después de mezclar dos volúmenes de 0.5 mi.

Empaque de las composiciones o componentes del kit Los recipientes adecuados para las composiciones inmunogénicas y componentes del kit de la invención incluyen frascos, jeringas (p.ej., jeringas desechables) , etc. Los recipientes pueden empacarse juntos para formar un kit p.ej., en la misma caja.

Donde se localiza un componente en un frasco, el frasco puede hacerse de un material de vidrio o plástico. El frasco se esteriliza preferentemente antes que la composición se agregue a este. Para evitar problemas con los sujetos sensibles al látex, los frascos se- sellan preferentemente con una tapa libre de látex, y se prefiere la ausencia de látex en todo el material de empaque. El frasco puede incluir una sola dosis de la vacuna o puede incluir más de una dosis (un frasco de "dosis múltiples") p.ej., 10 dosis. Los frascos útiles se hacen de vidrio incoloro. Se prefieren el vidrio de borosilicato a los vidrios de sosa-cal. Los frascos pueden tener tapas hechas de caucho de butilo.

Un frasco puede tener una tapa (p.ej., un cerradura Luer) adaptado tal que una jeringa puede insertarse dentro de la tapa. Una tapa del frasco puede localizarse dentro de un sello o cubierta, tal que el sello o cubierta tiene que quitarse antes de acceder a la tapa. Un frasco puede tener una tapa que permite la eliminación aséptica de su contenido, particularmente para frascos de dosis múltiples.

Donde se empaca un componente en una jeringa, la jeringa puede tener una aguja fija a esta. Si no está fija una aguja, puede proporcionarse una aguja por separado con la jeringa para su ensamble y uso. Esta ajuga puede estar protegida. El embolo en una jeringa puede tener un tapón para prevenir que el émbolo se salga accidentalmente durante la aspiración. La jeringa puede tener una tapa de caucho de látex y/o émbolo. Las jeringas desechables contienen una sola dosis de vacuna. La jeringa generalmente tendrá una tapa en la punta para sellar la punta previa a la unión de una aguja, y la tapa de la punta puede hacerse de un caucho de butilo. Si se empaca por separado la jeringa y la aguja entonces la aguja se fija preferentemente con una protección de caucho de butilo. Las jeringas útiles son aquellas vendidas bajo la marca registrada "Tip-Lok"™.

Los recipientes pueden marcarse para que muestren un volumen de la mitad de la dosis p.ej., para facilitar el suministro a los niños. Por ejemplo, una jeringa que contiene 0.5 mi de dosis puede tener una marca que muestre un volumen de 0.25 mi.

Es usual en productos de componentes múltiples incluir más material que el necesario la administración del sujeto, de esta forma se obtiene un volumen de dosis final a pesar de cualquier ineficiencia en la transferencia de material. Así un recipiente individual puede incluir el sobrellenado p.ej., 5-20% en volumen.

Métodos de tratamiento y administración de composiciones inmunogénicas Las composiciones de la invención son adecuadas para la administración a los sujetos humanos y la invención proporciona un método para incrementar la respuesta inmune en un sujeto, que comprende el paso de administrar una composición inmunogénica de la invención al sujeto.

La invención también proporciona un método para incrementar la respuesta en un sujeto, que comprende el paso de mezclado del contenido de los recipientes de un kit de la invención y administrar el contenido de mezcla al sujeto.

La invención también proporciona la composición o kit de la invención que se usa como un medicamento p.ej., que se utiliza para incrementar una respuesta inmune en un sujeto.

La invención también proporciona el uso de un antígeno MenB (como se define, anteriormente), un oligonucleótido inmunoestimulante y un polímero policatiónico, en la producción de un medicamento para incrementar una respuesta inmune en un suj eto .

Estos métodos y usos generalmente se utilizarán para generar una respuesta del anticuerpo, preferentemente una respuesta del anticuerpo protector.

Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden administrarse de diferentes formas. La ruta de inmunización usual es por medio de inyección intramuscular (p.ej., en el brazo o pierna) , pero otras rutas disponibles incluyen la inyección subcutánea, intranasal, oral, bucal, sublingual, intradérmica, transcutánea, transdérmica, etc.

Las composiciones inmunogénicas preparadas de acuerdo con la invención pueden usarse como vacunas para el tratamiento tanto de niños como adultos. Un sujeto puede ser menor de 1 año de edad, 1-5 años, 5-15 años, 15-55 años, o al menos de 55 años. Los sujetos que reciben las vacunas pueden ser adultos mayores (p.ej., = 50 años, = 60 años y preferentemente = 65 años), niños (= 5 años,), sujetos hospitalizados, trabajadores de la salud, servicio armado y personal militar, mujeres embarazadas, los sujetos con inmunodeficiencia, con enfermedad crónica, población que viaja al extranjero, etc. Los adyuvantes de sal de aluminio se utilizan rutinariamente en poblaciones infantiles, y el IC31™ también ha sido efectivo en este grupo de edades [127, 130] . Las vacunas no son únicamente para estos grupos, sin embargo, pueden utilizarse por lo general en una población.

El tratamiento puede ser un simple esquema de dosificación o un esquema de dosis múltiple. Las dosis múltiples pueden utilizarse en un esquema de inmunización primario y/o un esquema de inmunización por potenciación. En un esquema de dosis múltiples las diferentes dosis pueden proporcionarse por la misma o diferentes rutas p.ej., un inmunización inicial vía parenteral y potenciación de la vacuna por vía mucosa, una inmunización inicial vía mucosa y potenciación de la vacuna por vía parenteral, etc. La administración de más de una dosis (típicamente dos dosis) es particularmente útil en sujetos inmunológicamente nativos. Las dosis múltiples típicamente se administrarán al menos con 1 semana de separación (p.ej., alrededor de 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, alrededor de 4 semanas, cerca de 6 semanas, alrededor de 8 semanas, aproximadamente 12 semanas, cerca de 16 semanas, etc.).

General El término "que comprende" abarca "que incluye" así como también "que consiste" p.ej., una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente de X o puede incluir algo adicional p.ej., X + Y.

La redacción "sustancialmente" no excluye "completamente" p.ej., una composición que está "sustancialmente libre" de Y puede estar completamente libre de Y. Donde es necesario, la palabra "sustancialmente" puede omitirse de la definición de la invención.

El término "aproximadamente" con relación al valor numérico x es óptimo y medio, por ejemplo, x ± 10%.

A menos de que se declare específicamente, un proceso que comprende un paso de mezclar dos o más componentes o requieren algún orden específico de mezclado. De esta forma los componentes pueden mezclarse en cualquier orden. Donde existan tres componentes entonces dos de los componentes pueden combinarse uno con el otro, y después la combinación puede combinarse con el tercer componente, etc.

Donde se utiliza materiales animales (y particularmente bovino) se usa en el cultivo celular, deben obtenerse a partir de fuentes que son libres de encefalopatías espongiformes transmisibles (TSEs, por sus siglas en inglés) , y en particular libre de encefalopatías espongiformes de bovino (BSE, por sus siglas en inglés) . En general, se prefiere el cultivo de las células en ausencia total de los materiales derivados de animales .

Donde un compuesto se administra al cuerpo como parte de una composición entonces el compuesto puede alternativamente reemplazarse por un profármaco adecuado.

Donde se utiliza un sustrato celular para los procedimientos genéticos inversos o de reevaluaciones, o para el crecimiento viral, es preferentemente uno que se ha aprobado para el uso en la producción de la vacuna de humano, p.ej., como en Ph Eur capítulo general 5.2.3.

Modalidades para la realización de la invención Adyuvantes Se prepararon los complejos IC31 como se revela en la referencia 62. Se prepara una suspensión del adyuvante de hidróxido de aluminio por medio de métodos estándar. Donde las composiciones comprenden un adyuvante de hidróxido de aluminio e IC31, las combinaciones adyuvantes se hicieron al mezclar el adyuvante de hidróxido de aluminio con los complejos IC31.

Para el meningococo (iii) y (iv) siguiente, se preparó IC31 en concentraciones alta y baja (10 veces de diferencia) que se revela en la referencia 62 y una emulsión escualeno en agua. Para el Meningococo (iv) , MF59, se preparó como se revela en el Capítulo 10 de la referencia 65. Las combinaciones de adyuvantes se hicieron al mezclar MF59 con IC31alto o IC31bajo con cualquier relación en volumen 1:1 o una relación en volumen 5:1.

Meningococo (i) Los tres polipéptidos que hacen la vacuna "5CVMB" se revelan en la referencia 1 adyuvaron con hidróxido de aluminio y/o IC31. Los polipéptidos tienen secuencias de aminoácidos SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14 y SEC ID NO: 15 (véase la ref. 1 y 131).

En un primer conjunto de experimentos, nueve grupos de ratones recibieron 10 \ig de los antígenos, 3 mg/ml de hidróxido de aluminio y variando la dosis del IC31. Los grupos recibieron las siguientes nueve composiciones, con los grupos 7-9 que recibieron los mismos antígenos que 1-6 pero formulados de forma diferente: Se utilizó una suspensión IC31 estándar, 100 µ? de esta suspensión dio concentración completa. Menores volúmenes dieron menores concentraciones. Para conservar el volumen para las composiciones con menor concentración, se agregó amortiguador hasta 100 µ?.

** Modalidades de la invención.

Sueros de los ratones se probaron contra un panel de cepas de meningococo para la actividad bacteriana. Los títulos bacterianos del experimento MP03 fueron como sigue contra seis cepas diferentes, A a F: De esta forma los títulos obtenidos con Al-H como el único adyuvante (grupo 5) generalmente mejoraron a través del panel por la adición de IC31 con varias relaciones (grupos 1 a 4) . El mismo efecto se ve con la diferente formulación de antígeno (comparación de los grupos 7 y 8) .

Sin embargo, cuando se utilizó IC31 como el único adyuvante, (grupos 6 y 9) , los títulos bacterianos se encontraron que son altos, o mayores que con Al-H e IC31-Allí, en todas las seis cepas.

Se probaron las nueve composiciones en su pH y osmolaridad. Para las composiciones 1-5, 7 y 8 el pH estuvo en el intervalo de 6.2 a 6.6; las composiciones 6 y 9 tienen un pH ligeramente mayor, en el intervalo de 6.9 a 7.3. La osmolaridad de todas las composiciones estuvo en el intervalo de 280-330 mOsm/kg.

Meningococos (??) Un péptido de triple fusión que contiene tres variaciones de fHBP, en el orden de II-III-I (como se revela en la referencia 60; SEC ID NO: 17 en la presente), fue adyuvante con hidróxido de aluminio y/o IC31.

En un primer conjunto de experimentos, seis grupos de ratones recibieron 20 g de antígeno (con o sin una marca de purificación) , 3 mg/ml de hidróxido de aluminio y 100 µ? de IC31. Los grupos recibieron lo siguiente: ** Modalidades de la invención Se probaron los sueros de los ratones contra un panel de cepas de meningococo para la actividad bacteriana.

Se probaron los sueros del experimento MP05 de nuevo contra un panel de cepas (25 en total) . 56% de las cepas en el grupo 1 (IC31, sin marca) y el grupo 3 (IC31+A1-H, sin marca) tuvo un título = 1:1024, aunque solo 36% de las cepas en el grupo 5 (Al-OH, sin marca) tuvo un título = 1:1024. Similarmente , 76% de las cepas en los grupos 1 y 3 tuvo un título = 1:128 aunque este título solo se observó en 64% de las cepas en el grupo 5. De esta forma, en ausencia de una marca de purificación, los títulos bacterianos más altos se lograron utilizando IC31.

Las comparaciones del título bacteriano de antígenos marcados con purificación revelaron que el 84% de las cepas en el grupo 2 (IC31, marca) tuvieron un título de = 1:128. En contraste, 80% de las cepas en el grupo 4 (IC31+A1-H) y solo 76% de las cepas en el grupo 6 (Al-OH) tuvieron un título de = 1:128. De esta forma, en presencia de una marca de purificación, se lograron los títulos bacterianos más altos solo con IC31.

Las composiciones libres de marca (1, 3 y 5) se probaron en el pH y osmolaridad. El pH estuvo en el intervalo de 6.87 a 7.00. La osmolaridad estuvo en el intervalo de 302-308 mOsm/kg .

Otros experimentos de inmunogenicidad usaron el antígeno fHBPn-m-! en combinación con la NadA y los antígenos 287-953 (SEC ID Nos: 13 y 15) en el experimento MP04 , con la misma agrupación y el panel de .cepas . Los grupos 1 y 3 tuvieron un título bacteriano de = 1:128 en 100% de las cepas probadas, comparadas solo con 84% en el grupo 5. Con un umbral más astringente de = 1:1024, los sueros de los grupos 1 y 3 fueron bacterianos contra 88% de las cepas, comparadas solo con el 56% en el grupo 5.

Los resultados similares se observaron con antígenos marcados-purificación, donde 88% de los grupos 2 y 4 tuvieron un título bacteriano de = 1:128 comparado solo con 80% del grupo 6.

De esta forma, se obtuvieron las respuestas inmunes antimeningococo más altas solo con el IC31, que fue al menos tan bueno como IC31+A1-H y mejor que el Al-H solo.

Meningococos (iii) Los tres polipéptidos que formulan la vacuna "5CVMB" revelada en la referencia 1 se combinaron con una mezcla tetravalente del conjugado de meningococo contra los serogrupos A, C, W135 y Y. Las mezclas se unieron con un adyuvante de Al-H y/o IC31 (una concentración alta y baja) . Los títulos bacterianos fueron como sigue contra un panel con una cepa de cada uno de los serogrupos A, C, W135 y Y: ** Modalidades de la invención De esta forma los mejores títulos contra el serogrupo A se vieron cuando se usó el IC31 solo, y los títulos contra los serogrupos C, 135 y Y fueron mayores que cuando se utiliza Al-H solo.

Meningococos (iv) Los antígenos de la vacuna de meningococos del serogrupo B de referencia 1 se mezclaron con los adyuvantes con MF59, IC31al a, lC31bajo o combinaciones de estas. Se probó su actividad bacteriana de los sueros de los ratones inmunizados contra varias cepas de meningococos. Los resultados incluyen: ** Modalidades de la invención El uso del IC31 solo elucida los títulos bacterianos más altos en las cepas B, D, E y F, y los segundos títulos más altos en cepas A, C y G.

Estos antígenos de proteína de meningococos B también se combinaron con los antígenos de sacárido conjugado de los antígenos serogrupos A, C, 135 y Y, y se probaron con las mismas mezclas adyuvantes. Los títulos bacterianos contra üna cepa de prueba para cada serogrupo fueron como sigue: ** Modalidades de la invención Por lo tanto, los títulos bacterianos más altos se vieron cuando se utilizó IC31 para el serogrupo A, C y W135.

Meningococos (v) Una composición que contiene las tres variantes fHBP, en el orden de II-III-I, + 961 + 287-953 (denota rMenBl) se mezcló con el adyuvante Al-H, IC31 o IC31-A1-H. Estas composiciones se compararon con una composición que comprende 936-741 + 961 + 287-953 + OMV, que se mezcló con el adyuvante Al-H (rMenB2) .

Los sueros de los ratones inmunizados se probaron para su actividad bacteriana contra 12 cepas meningococos . El rMenBl se mezcló con el adyuvante IC31 solo se encontró que elucidan un mayor % de cobertura a través de 12 cepas probadas que cualquier otra composición (p.ej., con >90 % de cobertura, comparado con el >50 % de cobertura para rMenB2) .

Se entenderá que la invención se ha revelado como medio solo de ej emplif icación y las modificaciones pueden hacerse mientras permanecen dentro del alcance y la perspectiva de la invención.

REFERENCIAS [I] Giuliani et al. (2006) Proc Nati Acad Sci USA 103 (29) : 10834-9. [2] Tettelin et al. (2000) Science 287:1809-1815. [3] OOO/66741. [41 099/57280 [5] Martin et al. (1997) J Exp Med 185 (7) : 1173-83. [6] 096/29412. [7] Perkins-Balding et al. (200-3) Microbiology 149:3423-35. [8] O01/55182. [9] O01/38350. [10] WO00/23595.

[II] Madico et al. (2006) J ImmunoL 177:501-10. [12] Schneider et al. (2006) J. ImmunoL 176:7566-75. [13] Ram et al. (2003) J Biol Chem 278:50853-62. [14] W098/53851 [15] US-6531131 [16] WOOO/26384. [17] US-6645503 [18] WO03/070282. [19] O94/08021 [20] WO2004/015099. [21] WO2007/144316. [22] 02007/144317. [23] W002/09643. [24] Katial et al. (2002) Infect . Iraraun. 70:702-707. [25] US 6, 180, 111. [26] WO01/34642. [27] WO2004/019977. [28] EP-0011243. [29] Fredriksen et al, (1991) NIPH Ann. 14(2) :67-80. [30] O01/91788. [31] WO2005/004908. [32] Maiden et al. (1998) PNAS USA 95:3140-3145. [33] W098/56901. [34] W02006/081259. [35] Claassen et al. (1996) 14 (10) : 1001-8. [36] W099/10497. [37] Steeghs et al. (2001) The EMBO Journal 20:6937-6945 [40] WO01/09350. [41] WO02/09746. [42] O02/062378. [43] WO2004/014417. [44] O03/105890. [45] O2006/024946 [46] Krieg (2003) Nature Medicine 9:831-835. [47] McCluskie et al . (2002) FEMS Immunology and Médical Microbiology 32:179-185. [48] O98/40100. [49] US 6,207,646. [50] US 6, 239, 116. [51] US 6,429, 199. [52] O01/93905. [53] WO02/32451. [54] Aichinger et al. (2008) Cell Biology International 32 : 1449-58. [55] Alvarez-Bravo et al. (1994) Biochem J 302:535-8. [56] Nakajima et al. (1997) FÉBS Letts 415:64-66. [57] Fritz et al. (2004) Vaccine 22:3274-84. [58] Schellack et al. (2006) Vaccine 24:5461-72. [59] Lingnau ét al, (2007) Expert Rev Vaccines 6:741-6. [60] 02004/084938. [61] Kamath et al. (2008) Eur J Imraunol 3 8:1247-56. [62] Riedl et al . (2008) Vaccine 26:3461-8. [63] Kritsch et al . (2005) J Chromatography B 822:263-70. [64] Lingnau et al . (2003) Vaccine 20:3498-508. [65] Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (Powell & Newman) 1995 (ISBN 0-306-44867-X) . [66] Clausi et al . (2008) J Pharm Sci DOI 10.1002/jps .21390 [67] WO2009/081172. [68] Seeber et al . (1991) J Parenteral Sci Technol 45:156-9 [69] WO90/14837. [70] Podda & Del Giudice (2003) Expert Rev Vaccines 2:197- 203. [71] Podda (2001) Vaccine 19: 2673-2680. [72] Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols (Volumen 42 de Methods in Molecular Medicine series) . ISBN: 1-59259-083-7. Ed. O'Hagan. [73] WO2008/043774 , [74] Allison & Byars (1992) Res Immunol 143:519-25. [75] Hariharan et al. (1995) Cáncer Res 55:3486-9. [76] US-2007/0014805. [77] US-2007/0191314. [78] Suli et al. (2004) Vaccine 22 (25-26) : 3464-9. [79] WO95/11700. [80] US patent 6,080,725. [81] WO2005/097181. [84] WO2008/128939. [85] Jones (2001) Curr Opin Investig Drugs 2:47-49. [86] Costantino et al. (1992) Vaccine 10:691-8. [87] Lieberman et al. (1996) JAAM 275:1499-503. [88] WO02/058737. [89] WO03/007985, [90] Rennels et al. (2002) Pediatr Infect Dis J 21:978-979. [91] Campbell et al. (2002) J Infect Dis 186:1848-1851. [92] Arakere & Frasch (1991) Infect. Immun. 59:4349-4356. [93] Michon et al. (2000) Dev. Biol . 103:151-160. [94] Rubinstein & Stein (1998) J. Immunol . 141:4357-4362. [95] WO2005/033148. [96] Watson (2000) Pediatr Infect Dis J 19:331-332. [97] Rubín (2000) Pediatr Clin North Am 47:269-285, v. [98] Jedrzejas (2001) Microbiol Mol Biol Rev 65:187-207. [99] Zielen et al. (2000) Infect. Immun. 68:1435-1440. [100] Darkes & Plosker (2002) Paediatr Drugs 4:609-630. [101] W098/51339. [102] Vaccines. (Eds. Plotkin & Orenstein) . 4a edición, 2004, ISBN: 0-7216-9688-0. [103] Rappuoli et al. (1991) TIBTECH 9:232-238. [104] Módulo 6 of MMO 1 s The immunological basis for immunization series (Robertson) [105] Sesardic et al. (2001) Biologicals 29:107-22. [106] NIBSC code: 98/560. [107] Module 1 of WHO ' s The immunological basis for immunization series (Galazka) . [108] NIBSC code: 69/017. [109] NIBSC code: DIFT. [110] Sesardic et al . (2002) Biologicals 30:49-68. [111] NIBSC COde: 98/552. [112] NIBSC code: TEFT. [113] Vanlandschoot et al . (2005) J Gen Virol 86:323-3 1. [114] O03/066094. [115] W093/24148. [116] Ramsay et al . (2001) Lancet 357 (9251) : 195-196. [117] Lindberg (1999) Vaccine 17 Suppl 2:S28-36. [118] Buttery & Moxon (2000) J R Coll Physicians Lond 34:163- 68. [119] Ahmad & Chapnick (1999) Infect Dis Clin North Am 3:113-133, vii. [120] Goldblatt (1998) J. ed. Microbiol . 7 : 563-567. [121] Patente Europea 0477508. [122] Patente Estadounidense 5,306,492. [123] W098/42721. [124] Conjúgate Vaccines (eds. Cruse et al.) ISBN 3805549326, particularmente vol . 10:48-114. [125] Hermanson (1996) Bioconjugate Techniques ISBN: 0123423368 or 012342335X. [126] WO96/40242. [127] Olafsdottir et al . (2009) Scand J Immunol 69:194-202. [128] Hem & HogenEsch (2007) Expert Rev Vaccines 6:685-98. [129] Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20th edition, ISBN: 0683306472. [130] Kamath et ai (2008) PLoS ONE 3(ll):e3683. [131] W02004/032958.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (18)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Composición inmunogénica que comprende (i) un antígeno de meningococo serogrupo B y (ii) un adyuvante que comprende un oligonucleótido inmunoestimulante y un polímero policatiónico, caracterizada porque (i) la composición inmunogénica no incluye una sal de aluminio; (ii) la composición inmunogénica no incluye una emulsión aceite en agua; (iii) el antígeno de meningococo serogrupo B no incluye un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionados de la SEC ID Nos: 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ó 22; y (iv) la composición inmunogénica no incluye un antígeno fHBP.

2. Composición inmunogénica, caracterizada porque comprende (i) un antígeno serogrupo B de meningococo; (ii) un adyuvante que comprende un oligonucleótido inmunoestimulante y un polímero policatiónico y; (iii) uno o más de otros antígenos seleccionados del antígeno de neumococo, el toxoide de la difteria, toxoide del tétanos, un antígeno de pertussis, HBsAg, un antígeno HAV, un antígeno Hib, y/o IPV.

3. Composición inmunogénica, caracterizada porque comprende (i) un polioligosacárido de meningococo purificado; y (ii) un adyuvante que comprende un oligonucleótido inmunoestimulante y un polímero policatiónico .

. Composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 2 o la reivindicación 3, caracterizada porque la composición inmunogénica comprende uno o más de (i) una sal de aluminio; y (ii) una emulsión aceite en agua.

5. Composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el oligonucleótido y el polímero se asocian uno con el otro para formar un complejo.

6. Composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el oligonucleótido inmunoestimulante es mono-catenario y tiene entre 10 y 100 nucleótidos.

7. Composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el oligonucleótido es 5' - (IC) i3-3' .

8. Composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el polímero policatiónico es un péptido.

9. Composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque el péptido incluye una o más de la(s) secuencia (s) dipéptidos Leu-Leu, una o más de la(s) secuencia (s) dipéptidos Arg-Arg.

10. Composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 8 o reivindicación 9, caracterizada porque el péptido incluye una o más de la(s) secuencia (s) de dipéptidos Lys-Leu, y/o una o más de la(s) secuencia (s) de tripéptidos Lys-Leu-Lys.

11. Composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8-10, caracterizada porque el péptido tiene entre 5 y 50 aminoácidos.

12. Composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque el péptido tiene la secuencia de aminoácidos KLKLLLLLKLK.

13. Composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el oligonucleótido y el polímero está presente con una relación molar de 1:25.

14. Proceso para preparar la composición inmunogénica de conformidad con cualquiera reivindicación precedente, caracterizado porque comprende un paso de mezclado (i) un oligonucleótido inmunoestimulante y un polímero policatiónico y (ii) un antígeno de meningococo serogrupo B.

15. Kit que comprende: (i) un primer recipiente que contiene un oligonucleótido inmunoestimulante y un polímero policatiónico y (ii) un segundo recipiente que contiene un antígeno de meningococo serogrupo B; caracterizado porque la composición inmunogénica no incluye una sal de aluminio; (ii) la composición inmunogénica no incluye una emulsión aceite en agua; (iii) el antígeno de meningococo serogrupo B no incluye el péptido con la SEC ID Nos: 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ó 22; y (iv) la composición inmunogénica no incluye un antígeno fHBP .

16. Kit que comprende (i) un primer recipiente que contiene un oligonucleótido inmunoestimulante y un polímero policatiónico y (ii) un segundo recipiente que contiene un antígeno de meningococo serogrupo B; caracterizado porque el antígeno de meningococo serogrupo B es un lipooligosacárido de meningococo purificado.

17. Kit, caracterizado porque comprende (i) un recipiente que contiene un oligonucleótido inmunoestimulante y un polímero policatiónico y (ii) un recipiente que contiene un antígeno de meningococo serogrupo B y (iii) un recipiente que contiene uno o más de otros antígenos seleccionados del antígeno sacárido de neumococo, toxoide de la difteria, toxoide del tétanos, antígeno de pertussis , HBsAg, antígeno HAV, antígeno Hib, y/o IPV.

18. Composición inmunogénica, caracterizada porque comprende (i) un componente del antígeno 5-valente que consiste de un antígeno MenB, un sacárido capsular conjugado de N. meningitidis del serogrupo A, un sacárido capsular conjugado de N. meningitidis del serogrupo C, un sacárido capsular conjugado de N. meningitidis del serogrupo W135, un sacárido capsular conjugado de N. meningitidis del serogrupo Y; y (ii) un adyuvante que comprende un oligonucleótido inmunoestimulante y un polímero catiónico, siempre que la composición inmunogénica no incluya una sal de aluminio y no incluya una emulsión aceite en agua.