PL240667B1 - Peptyd, będący fragmentem płytkopochodnego czynnika wzrostu do zastosowania jako środek leczniczy do podania na skórę w zaburzeniach naskórka do stymulacji odbudowy naskórka - Google Patents

Description

PL 240 667 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest nowy związek (oznaczony jako PDGF2) będący pochodną płytkopochodnego czynnika wzrostu (PDGF) o właściwościach stymulujących epitelizację (odbudowę naskórka) w procesie gojenia ran. Wynalazek dotyczy zatem nowego związku do zastosowania jako środek leczniczy do podania na skórę w zaburzeniach naskórka do stymulacji odbudowy naskórka, zwłaszcza jako środek stosowany w gojeniu ran.

Aktualnie istnieje duża potrzeba opracowania nowych sposobów leczenia obrażeń wymagających interwencji chirurgicznej, jak np. oparzenia termiczne, chemiczne czy radiacyjne o dużej powierzchni, ran przewlekłych wywołanych chorobami cywilizacyjnymi jak cukrzyca czy wywołane niedokrwieniem. Takim sposobem może być stymulacja regeneracji i bezbliznowego gojenia ran.

Gojenie ran to dynamiczny proces złożony z kilku nachodzących na siebie etapów, wśród których wyróżnia się trzy główne fazy: zapalną, proliferacyjną i przebudowy. W jego kontroli uczestniczy wiele czynników, a ważną funkcję pełnią czynniki wzrostu, regulujące proliferację i różnicowanie komórek. Szczególną rolę odgrywa tu wytwarzany przed trombocyty płytkopochodny czynnik wzrostu (PDGF). Został on odkryty w latach 70-tych i uczestniczy w prawie wszystkich etapach gojenia. Rodzina czynników PDGF obejmuje pięć homodimerycznych i heterodimerycznych białek: PDGF-AB, PDGF-AA, PDGFBB, PDGF-CC i PDGF-DD, których działanie polega na bezpośrednim wiązaniu do transmembranowych receptorów o aktywności kinazy tyrozynowej (receptory PDGF-α i PDGF-β) i ich aktywacji. Po zranieniu, PDGF jest uwalniany w dużych ilościach przez degranulujące płytki krwi i jest obecny w wysięku z rany, szczególnie wcześnie po zranieniu. Jego źródłem mogą być również keratynocyty, fibroblasty, komórki śródbłonka oraz makrofagi.

PDGF działa jako mitogen dla różnych typów komórek, takich jak fibroblasty, keratynocyty, czy komórki śródbłonka. Powoduje chemotaksję neutrofili, makrofagów, fibroblastów oraz komórek mięśni gładkich do miejsca rany, co pomaga w rozpoczęciu fazy zapalnej gojenia. Ponadto działa chemotaktycznie na mezenchymalne komórki macierzyste szpiku, które gromadzą się w ranie i mogą różnicować się w kierunku fibroblastów. W fazie epitelializacji stymuluje wydzielanie insulinopodobnego czynnika wzrostu (IGF), zwiększającego mobilność keratynocytów i trombospondyny 1. PDGF zwiększa również proliferację fibroblastów, a w konsekwencji produkcję macierzy zewnątrzkomórkowej oraz indukuje zmianę fenotypu fibroblastów w miofibroblasty, co umożliwia obkurczanie rany.

Co więcej PDGF stymuluje produkcję składników macierzy, takich jak fibronektyna, kolagen, proteoglikan i kwas hialuronowy. Dodatkowo zwiększa produkcję i wydzielanie kolagenazy przez fibroblasty, co sugeruje jego rolę w fazie przebudowy. Obniżone stężenie PDGF, ze względu na jego wrażliwość na proteolityczne środowisko typowe dla ran przewlekłych ranach obserwuje się u pacjentów ze „stopą cukrzycową”.

Rekombinowany ludzki PDGF-BB w postaci hydrożelu (Bakaplermin, Regranex, Johnson&Johnson) jest jedynym komercyjnie dostępnym czynnikiem wzrostu zatwierdzonym przez FDA w 1997 roku do stosowania miejscowego w leczeniu owrzodzeń kończyn dolnych w ranach cukrzycowych. Produkt ten nie jest jednak szeroko używany ze względu na wysokie koszty uzyskania oraz ograniczoną skuteczność. Co więcej zaobserwowano, że użycie trzech lub więcej opakowań żelu Regranex, wiąże się z kilkukrotnie podwyższonym ryzykiem powstawania różnego typu nowotworów. Doprowadziło to do ogłoszenia przez FDA ostrzeżenia informującego o zwiększonym ryzyku powstania nowotworu w związku ze stosowaniem bekaplerminu.

Peptydy są od wielu lat stosowane w procesie gojenia się ran. Ze względu na mechanizm ich działania i ich pochodzenie można wyróżnić kilka klas: (i) peptydy o działaniu przeciwbakteryjnym/regeneracyjnym; (ii) związki oparte o sekwencję kolagenu i elastyny; (iii) pochodne czynników/hormonów wzrostu oraz białek i peptydów biorących udział w procesach układu odpornościowego i krwiotwórczego; (iv) związki pochodzenia zwierzęcego. Poniżej przedstawione są przykładowe peptydy z każdej klasy:

PL 240 667 BI

Przykłady peptydów o działaniu przeciwbakteryjnym i regeneracyjnym:

AG30 (MLSLIFLHRLKSMRKRLDRKLRLWHRKNYP), AH90 (ATAWDFGPHGLLPIRP1RIRPLCG); CW49 (APFRMGICTIN); Cys-KR12 (KRIVKR1KKWLR); Esculentin-la(l-21) (G1FSKLAGKKIKNLLISGLKG); Histatin- (RKFHEKHHSHREFPFYGDYGSNYLYDN); IDR-1018 (VRLIVAVRIWRR);

SHAP1 (APKAMKLLKKLLKLQKKGI), Temporin A (FLPLIGRYLSGIL), Temporin

B (LLPIYGNLLKSLL)

Związki oparte o sekwencję kolagenu i elastyny:

GHK, BioGHK (Biotyna-GHK); kolagen; chitozyna; Ac-PGP (A-acetylo-PGP); Combi (DINECEIGAPAGEETEVTVEGLEPG); El (GFTGPAGPAGPIGPVGARGPAGPQGPRGDKGETGEQ);

Związki pochodzenia zwierzęcego:

Tigerl7 (c[WCKPKPKPRCH-NH₂]); Tylotoin (KCVRQNNKRVCK);

Pochodne czynników/hormonów wzrostu oraz białek i peptydów biorących udział w procesach układu odpornościowego i krwiotwórczego:

TP-508 (AGYKPDEGKRGDACEGDSGGPFV); TSN1 (NFQGVQNRFVFGTP),

TNS2 (MENAELDVP1QSVFTR); UN2 (TATSEYQTFFNPR); WKYMVm (WKYMV-O-M); pochodna angiopoetyny-l(QHREDGS); Pep2-YAC (YAC) (pochodna EGF); RGD; różne pochodne czynników wzrostu

Trwałość preparatu farmaceutycznego jest zdefiniowana, jako okres od momentu jego wyprodukowania, aż do momentu, gdy nie odpowiada on wymaganiom Farmakopei, normy lub gdy stężenie substancji czynnej zmniejszy się więcej niż o 10%. Ponadto, preparat ten musi charakteryzować się brakiem zmian w wyglądzie, smaku, dostępności biologicznej, czy toksyczności. Badania stabilności preparatu farmaceutycznego/produktu leczniczego są przeprowadzane w określonych punktach czasowych i warunkach (temperatura, wilgotność, pH itp.), tak by udowodnić, że pozostaje on skuteczny i bezpieczny dla pacjentów. Uzyskane wyniki stanowią podstawę do określenia trwałości produktu i jego daty ważności.

Badania stabilności substancji aktywnej (API) wykonuje się w formie: stałej np. wraz z substancjami wypełniającymi (tabletki), emulsjach (kremy), czy rozpuszczonej tj. w wodzie czy układach buforujących. Niezwykle cennych informacji na temat stabilności API dostarczają jej badania w osoczu i/lub pełnej krwi. Badania te pozwalają na ocenę podatności związku na proteolizę enzymatyczną i dobranie odpowiedniej dawki; leku, tak by uzyskać pożądany efekt farmakologiczny. Związki, które charakteryzują się krótkim czasem połowicznego zaniku, z reguły wymagają dalszych modyfikacji strukturalnych (nie dotyczy pro-leków), tak by polepszyć parametry połowicznego zaniku. Czasami, związki charakteryzują się krótkim okresem półtrwania w osoczu z uwagi na fakt ich wiązania przez białka z osocza krwi, czyli albuminy. Albuminy należą do grupy rozpuszczalnych białek o m.cz. 66-69 kDa. W osoczu stanowią około 55-65% wszystkich białek. Ich podstawową funkcją fizjologiczną jest wiązanie wody, dzięki czemu utrzymuje się odpowiednie ciśnienie koloidoosmotyczne (onkotyczne) osocza i jego prawidłową objętość. Białka te są również głównymi transporterami wolnych kwasów tłuszczowych, hormonów, witamin, metali ciężkich i niektórych leków (np. kwasu acetylosalicylowego). Większość leków wiąże się z białkiem odwracalnie przy udziale wiązań wodorowych, oddziaływań hydrofobowych lub sił van der Waalsa, tworząc tzw. depot (magazyn), z którego stopniowo uwalniają się cząsteczki leku, zastępując te, które uległy już eliminacji. Obecnie coraz częściej zwraca się uwagę na albuminy, jako egzogenne nośniki leku ze względu na to, że nie są one toksyczne czy immunogenne, a dodatkowo poprawiają

PL 240 667 BI profil farmakokinetyczny (ti/2 albuminy wynosi około 15-29 dni) i stabilność leków szybko degradowanych w osoczu. Dodatkowo, białka te są stabilne w zakresie pH 4-9, mogą być ogrzewane do temperatury 60°C przez około 10 godzin i są odporne na denaturację pod działaniem większości odczynników denaturujących, co może być przydatne ze względów technologicznych przy wytwarzania leków.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest zastosowanie medyczne sekwencji aminokwasowej peptydu syntetycznego (PDGF2), którego sekwencja stanowi fragment czynnika wzrostu (PDGF), który oddziałuje z odpowiednim receptorem i wpływ na przyspieszenie odbudowy naskórka w procesie gojenia ran u ssaków.

Syntetyczna, peptydowa pochodna białka PDGF została zaprojektowana na podstawie struktury przestrzennej białka PDGF (w kompleksie PDGF-BB). Pochodna ta jest dobrym kandydatem na związek aktywny, stymulujący odbudowę naskórka podczas gojenia ran. Może on być poddany modyfikacjom chemicznym w celu zwiększania aktywności oraz zmniejszenia efektów ubocznych jego stosowania.

W badaniach wykorzystano zarówno model komórkowy in vitro, jak również model zwierzęcy. W modelu komórkowym zastosowano głównie ludzkie keratynocyty oraz fibroblasty - komórki kluczowe dla procesów gojenia rany i regeneracji skóry. Obecność tych komórek a szczególnie ich proliferacja (podziały) jest niezbędna dla prawidłowego procesu gojenia rany. W modelu zwierzęcym posłużono się analizą gojenia rany tworzonej na grzbiecie myszy. Model ten jest powszechnie aprobowany w badaniach nowych związków - potencjalnych leków stymulujących gojenie ran u ludzi. Z uwagi na zbliżoną fizjologię i biochemię gojenia rany u myszy i ludzi, model zwierzęcy może stanowić podstawę do oceny efektywności działania nowych związków. Ponadto modele zwierzęce dają dużo większą powtarzalność wyników, kontrolę warunków oraz standaryzację doświadczeń w porównaniu do badań z udziałem ludzi.

Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie związku aktywnego w procesie regeneracji rany skóry. Nieoczekiwanie, nowy peptyd w znaczny sposób przyspiesza proliferację komórek skóry (szczególnie keratynocytów), znacznie przyspiesza tworzenie naskórka w ranie oraz znacznie zwiększa grubość utworzonego naskórka w czasie gojenia, w ranie skóry.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest zastosowanie medyczne związku określanego jako PDGF2 o sekwencji aminokwasowej:

H-R¹L²I³D⁴R⁵T⁶N⁷A⁸N⁹F^WL¹ ^NHz

Pobudzenie gojenia ran następuje poprzez zwiększoną proliferację keratynocytów a tym samym przyspieszone naskórkowanie rany.

Gojenie ran obejmuje rany skóry, naskórka, mieszków włosowych, włosów, gruczołów potowych.

Określenia stosowane w niniejszym opisie i zastrzeżeniach patentowych, mają następujące znaczenie:

Określenie “rana” obejmuje każdy rodzaj uszkodzenia żywej tkanki wywołany przez uderzenie lub ucisk i inne czynniki mechaniczne, oparzenie, odmrożenie, promieniowanie, czynniki chemiczne, niedokrwienie i inne czynniki biologiczne. W szczególności termin “rana” obejmuje uszkodzenia skóry, ale też innych tkanek i organów.

Określenie “gojenie ran” odnosi się do pouszkodzeniowego procesu naprawczego, który obejmuje oczyszczenie obszaru rany z ciał obcych i martwych tkanek i proliferację komórek prowadzącą do odtworzenia ciągłości tkanki bądź to z wytworzeniem blizny lub bez.

Określenie “regeneracja” oznacza proces odtworzenia utraconych tkanek, struktur i przydatków zachodzące spontanicznie lub pod działaniem stymulacji farmakologicznej.

Określenie “rana przewlekła” lub “rana niegojąca się” odnosi się do ran, które nie wykazują wyraźnego gojenia w czasie przekraczającym normalne gojenie; typowo rany, które nie goją się w ciągu 3 miesięcy są określane jako przewlekłe. Rany przewlekłe lub rany niegojące się są często związane z niedokrwieniem lub owrzodzeniem u pacjentów cukrzycowych, ale nie są ograniczone do tej grupy.

W przypadku, gdy związek jest podawany we wczesnej fazie gojenia ran, należy rozumieć, że określenie “faza wczesna” obejmuje odpowiedź immunologiczną bezpośrednio po zranieniu.

PDGF - Platelet-derived Growth Factor, płytkopochodny czynnik wzrostu

Peptydomimetyk - oznacza związek o strukturze naśladującym peptyd zawierający aminokwasy niebiałkowe.

DMF - dimetyloformamid

MeOH - metanol

DIPEA - A/,A/-diizopropyloetyloamina

PL 240 667 B1

Fmoc - grupa 9-fluorenylometoksykarbonylowa

Boc - grupa tert-butyloksykarbonylowa

DIC - W,W-Diizopropylokarbodiimid

Et2O - eter dietylowy

Pbf - ugrupowanie 2,2,4,6,7-pentametylodihydrobenzofurano-5-sulfonylowe

O t Bu - ester tert-butylowy

ACN - acetonitryl

TIPSI - triizopropylosilan

TFA - kwas trifluooroctowy

Rt - czas retencji (ang. Retention time)

Ac - grupa acetylowa

Ac2O - bezwodnik kwasu octowego t-Bu - grupa tert-butylowa

KI - jodek potasu

HATU - heksafluorofosforan 2-(1H-7-azabenzotriazol-1-ilo)-1,1,3,3 tetrametyluroniowy

HOAt - 1-hydroksy-7-azabenzotriazol

Oxyma pure - (hydroksyimino)cyjanooctan etylu

DCM - dichlorometan

Mtt - grupa 4-metylotritylowa

MS - spektrometria mas

LDH - Dehydrogenaza mleczanowa (Lactate dehydrogenase)

XTT - sól sodowa 2,3,-bis(2metoksy-4-nitro-5-sulfofenyl)-5-[(fenyloamino)karbonyl]-2H-tetrazolu

API - aktywne substancje farmaceutyczne

HaCaT - unieśmiertelniona linia ludzkich keratynocytów

FBS - płodowa surowica bydlęca (ang. Fetal Bovine Serum)

PBS - buforowana fosforanem sól fizjologiczna (ang. Phospahte-Buffered Saline)

PBMC - jednojądrzaste komórki krwi obwodowej fMLP - N-formyl-metionyl-leucylo fenyloalanina

P/S - penicylina/streptomycyna

ASA - kwas acetylosalicylowy

LPS - lipopolisacharyd

PHA - fitohemaglutynina

BAT - test aktywacji bazofili (ang. Basophil Activation Test)

ASC - komórki macierzyste tkanki tłuszczowej ASCs (ang. Adipose Derived Stem Cells)

P407 - polaoxamer-407 (Poli(glikol polietylenowy)-block-poli(glikoli propylenowy)-block-poli(glikol polietylenowy))

Opis figur:

Fig. 1 - przedstawia schemat syntezy związku PDGF2

Fig. 2 - przedstawia wykresy pokazujące wpływ PDGF2 na proliferację (test XTT)fibroblastów 46BR.1N, keratynocytów HaCaT i fibroblastów pierwotnych oraz jego cytotoksyczność wobec tych komórek (test LDH). Wykresy przedstawiają zestawienie wyników z 4 cykli doświadczeń (w każdym 4 powtórzenia, n=16). * - różnice istotne statystycznie względem kontroli (komórki hodowane w medium bez surowicy), test U-Manna Whitneya (p<0,05, n=16); FBS - kontrola pozytywna w teście XTT (komórki hodowane w medium z 10% surowicy), TRITON X - kontrola pozytywna w teście LDH (komórki inkubowane w medium z dodatkiem 1% triton X, maksymalna cytotoksyczność).

Fig. 3 - przedstawia wykres chemotaksji keratynocytów HaCaT (góra). Są to dane z 4 cykli doświadczeń (n=16). *różnice istotne statystycznie względem kontroli, test U-Manna Whitneya, p<0,05.Wykres przedstawia wpływ PDGF2 (dół) \ w stężeniu 1 μg/ml na chemotaksję ludzkich skórnych fibroblastów pierwotnych. Są to dane z 6 cykli doświadczeń dla PDGF2. * różnice istotne statystycznie, test U Manna Whitneya, p<0,05.

Fig. 4 - przedstawia badania stabilności związku PDGF2 w osoczu ludzkim. Stabilność była badana w czasie 24 godzin. Obecność związku PDGF2 była monitorowana za pomocą techniki HPLC z detektorem PDA. Oznaczenia:

PL 240 667 B1

Datal: PDGF2 0,1 mg/ml w wodzie; Data2: tylko osocze po 24 godzinach; Data3: PDGF2 w osoczu po 1 godzinie; Data4: PDGF2 w osoczu po 2 godzinach; Data5: PDGF2 w osoczu po 3 godzinach; Dataó: PDGF2 w osoczu po 6 godzinach; Data7: PDGF2 w osoczu po 24 godzinach

Fig. 5 - przedstawia widma masowe zarejestrowane dla ostatniego mililitra buforu (po lewej) i frakcji eluat (po prawej) dla peptydu PDGF2. Widmo frakcji ostatniego mililitra buforu dla peptydu PDGF2 wskazuje, że kolumna z osadzoną albuminą została poprawnie odmyta z nadmiaru naniesionego peptydu na co wskazuje brak masy PDGF2. Na widmie frakcji eluatu widoczny jest pik m/z 1331,746 który jest zgodny z masą peptydu PDGF2.

Fig. 6 - przedstawia wykresy pokazujące wpływ pochodnych PDGF na ekspresję genów pluripotencji i regulacji cyklu komórkowego (CDKN1A, MYC, KIT, POU5F1, TGFB3, TP53) w komórkach ludzkich pierwotnych keratynocytów izolowanych od pięciu różnych pacjentów. Genami referencyjnymi są AKTB i TBP. Pacjenci reagują na związki w sposób indywidualny. Brak jest obserwowalnych korelacji oraz trendów w zmianach ekspresji pod wpływem badanych związków.

Fig. 7 - przedstawia badania immunogenności dla związku PDGF2. Na wykresie uwidoczniono procentowe wyniki analiz cytometrycznych pokazuje poziom aktywacji wybranych subpopulacji komórek immunologicznych w obecności badanego związku. Pokazano odsetek limfocytów T (cytotoksycznych - CTL i pomocniczych - Th) oraz komórek NK w następujących warunkach: kontrola - komórki bez stymulacji, tylko w medium hodowlanych; LPS/PHA - kontrola dodatnia, komórki stymulowane lipopolisacharydem i fitohemaglutyniną, PDGF2 - komórki stymulowane badanym związkiem. Wyniki przedstawiono jako medianę (min-max).

Fig. 8 - przedstawia badania immunogenności dla związku PDGF2. Na wykresie pokazano poziomy ekspresji powierzchniowych markerów aktywacji (CD25, CD69, CD71, HLA-DR) w poszczególnych subpopulacjach komórkowych (CTL, Th, NK). Zastosowano następujące kondycje: kontrola - komórki bez stymulacji, tylko w medium hodowlanych; LPS/PHA - kontrola dodatnia, komórki stymulowane lipopolisacharydem i fitohemaglutyniną, PDGF2 - komórki stymulowane badanym związkiem. Wyniki przedstawiono jako medianę (min-max).

Fig. 9 - przedstawia badania immunogenności dla związku PDGF2. Na wykresach zaprezentowano poziomy aktywacji komórek dendrytycznych w następujących kondycjach: kontrola - komórki bez stymulacji, tylko w medium hodowlanych; LPS/PHA - kontrola dodatnia, komórki stymulowane lipopolisacharydem i fitohemaglutyniną, PDGF2 - komórki stymulowane badanym związkiem. Aktywację komórek dendrytycznych oceniano na podstawie ekspresji markerów aktywacyjnych CD80 i CD83. Fenotypy komórek zaktywowanych to: CD11c+ CD80+; CD11c+ CD83+; CD80+CD83+. Wyniki przedstawiono jako medianę (min-max).

Fig. 10 - przedstawia badanie immunogenności dla związku PDGF2 - test aktywacji bazofili (BAT). Na wykresie zaprezentowano aktywację bazofili w obecności kontroli negatywnej, kontroli pozytywnej związku aktywującego bazofile: fMLP; komórki w obecności peptydu PDGF2. Wyniki analiz cytometrycznych przedstawiono jako medianę (min-max).

Fig. 11 - przedstawia sieć regulatorową o najwyższym współczynniku zgodności (ang. consistency score) (6,414) dla komórek ASCs pozyskanych z trzech pacjentów (RNA po spulowaniu) stymulowanych peptydem PDGF2 (1 μg/ml). Wartości liczbowe poniżej poszczególnych cząsteczek oznaczają odpowiednio wartość log2 zmiany ekspresji oraz wartość p (prawdopodobieństwo testowe, ang. p-value). Wartość dodatnia i ujemna oznacza odpowiednio wzrost lub spadek ekspresji. W panelu dolnym strzałka skierowana w górę wskazuje na aktywację zjawiska.

Fig. 12 - przedstawia reprezentatywne fotografie dokumentujące przebieg gojenia ran grzbietowych w grupie otrzymującej hydrożel P407 z peptydem PDGF2 oraz w grupie kontrolnej z samym hydrożelem P407. W dniu 11 widoczna jest poprawa gojenia w grupie otrzymującej peptyd PDGF2 w stosunku do kontroli. Preparaty były podawane w dniu zranienia oraz w dniach 1-4 po zranieniu, raz dziennie po 25 μl na każdą ranę.

Fig. 13 - przedstawia wykres kinetyki gojenia ran skóry grzbietowej. Pionowe, przerywane linie oznaczają dni, w których podawano hydrożel P407 lub hydrożel P407 z peptydem PDGF2 (P407+PDGF2). Wykresy przedstawiają średnie oraz odchylenia standardowe średniej.

Fig. 14 - przedstawia zdjęcia preparatów histologicznych. Po lewej preparaty barwione hematoksyliną i eozyną, po prawej barwienie Massona. U góry preparaty z grup kontrolnych, w środku i na dole preparaty z grup otrzymujących PDGF2. Żółtymi strzałkami oznaczono mieszki włosowe i ich zalążki, czerwonymi gruczoły. Czarna strzałka wskazuje obszar komórek o różniących się od otaczających fibroblastów.

PL 240 667 B1

Fig. 15 - przedstawia reprezentatywne zdjęcia błonek formujących się we wczesnych dniach po zranieniu. W grupach otrzymujących hydrożel P407 z peptydem PDGF2 błonki szybciej pokrywają światło rany a także są grubsze i wytrzymalsze mechanicznie. W grupach tych dochodzi do przyspieszonego tworzenia naskórka pod wpływem peptydu PDGF2 (widoczna cienka błona wybarwiona następnie histochemicznie na Fig. 26).

Fig. 16 - przedstawia zdjęcia preparatów histologicznych naskórka, powstałego w pierwszych czterech dniach gojenia się rany na grzbiecie myszy. Po lewej stronie preparaty kontrolne po hydrożelu P407. Po prawej stronie preparaty z grup myszy otrzymujących hydrożel P407 z peptydem PDGF2. Preparaty u góry barwione hematoksyliną i eozyną, na dole trójkolorowym barwieniem Massona.

Wynalazek ilustrują następujące przykłady wykonania, nie stanowiące jego ograniczenia

P r z y k ł a d 1:

Opis procedury syntezy peptydu o sekwencji H-R¹L²I³D⁴R⁵T⁶N⁷A⁸N9F¹⁰L¹¹-NH2 (opisywany dalej jako PDGF2)

Synteza:

Synteza peptydu o sekwencji H-R¹L²I³D⁴R⁵T⁶N⁷A⁸N9F¹⁰L¹¹-NH² została wykonana na nośniku stałym w automatycznym syntezatorze mikrofalowym Liberty Blue™ (CEM Corporation), zgodnie z metodologią chemii Fmoc. W syntezie wykorzystano żywicę TentaGel R RAM o stopniu osadzenia równym 0,18 mmol/g.

Odczynniki wykorzystane do syntezy:

• DMF suszony nad sitami molekularnymi A3 oraz A4 • 0,2 M roztwory N^a - Fmoc-pochodnych aminokwasów w DMF:

o Fmoc-Ala-OH, o Fmoc-Arg(Pbf)-OH, o Fmoc-Asn(Trt)-OH, o Fmoc-Asp(OtBu)-OH, o Fmoc-Ile-OH, o Fmoc-Leu-OH, o Fmoc-Phe-OH, o Fmoc-Thr(tBu)-OH, • 20% roztwór piperydyny w DMF, • 1 M Oxyma pure w DMF, • 0,5 M DIC w DMF.

W pierwszym etapie syntezy odblokowano grupę aminową na stałym nośniku, osłoniętą ugrupowaniem Fmoc (9H-fluoren-9-ylo-metyloksykarbonylowym). Etap ten wykonano traktując żywicę 20% roztworem piperydyny w DMF i naświetlając ją równocześnie promieniowaniem mikrofalowym o mocy 125 W przez 25 sekund (temperatura równa 70°C), następnie mocą równą 30 W w czasie 65 sekund (temperatura w zakresie 89-90°C). Stały nośnik odsączono i przemywano 4-krotnie DMF. Pierwsza reszta N-chronionego aminokwasu (Fmoc-Leu-OH) została przyłączona do nośnika stałego z wykorzystaniem 0,5 M roztworu DIC w DMF jako odczynnika sprzęgającego oraz 1 M roztworu Oxymy pure, jako supresora racemizacji. W reakcji acylowania użyto 4-krotnego nadmiaru aminokwasu w stosunku do osadzenia stałego nośnika. Reakcję sprzęgania prowadzono wykorzystując indukcję mikrofalową o mocy 170 W przez 15 sekund (temperatura równa 75°C), następnie o mocy 30 W przez 110 sekund, utrzymując temperaturę w zakresie 89-90°C. Peptydylożywicę odsączono i dodano roztwór 20% piperydyny w DMF, w celu odblokowania grupy aminowej pierwszego, N-osłoniętego aminokwasu - Leu (chronionej ugrupowaniem Fmoc). Etap deprotekcji prowadzono z wykorzystaniem promieniowania mikrofalowego o mocy 125 W przez 25 sekund (temperatura równa 70°C), następnie mocą równą 30 W w czasie 65 sekund (temperatura w zakresie 89-90°C). Peptydylożywicę odsączono i przemyto 4-krotnie DMF. Przyłączenie kolejnych N-chronionych aminokwasowych reszt oraz deprotekcję ich N-osłoniętych grup funkcyjnych wykonano analogicznie do powyższego opisu, i zgodnie z Fig. 1. Po zakończeniu syntezy peptydylożywicę przemyto 4-krotnie DMF, następnie 3-krotnie MeOH i pozostawiono ją na noc w próżniowym eksykatorze.

PL 240 667 B1

Odszczepienie peptydu od nośnika:

Peptyd odszczepiono od nośnika stałego, wraz z jednoczesnym usunięciem osłon łańcuchów bocznych reszt aminokwasowych, za pomocą mieszaniny: TFA/TIPSI/H2O (92:4:4, v/v/v). Reakcję prowadzono przez dwie godziny, pozostawiając mieszaninę na wytrząsarce laboratoryjnej. Następnie, stały nośnik odsączono na lejku sitowym pod zmniejszonym ciśnieniem, a przesącz zatężono do objętości około 2 ml przy pomocy wyparki próżniowej. Pozostałość zadano eterem dietylowym, który schłodzonym uprzednio do temperatury około 4°C. Otrzymano biały osad, żwirowano w probówce wirówkowej przez 15 minut (4500 g). Supernatant zlano, a osad potraktowano kolejną porcją Et2O. Osad przemyto 3-krotnie, zgodnie z powyższym opisem, następnie wysuszono go w eksykatorze próżniowym. Tak uzyskany surowy produkt został rozpuszczony w wodzie i poddany procesowi jednokrotnej liofilizacji.

Oczyszczanie:

Związek został oczyszczony z wykorzystaniem wysokosprawnej chromatografii cieczowej. Produkt surowy syntezy został rozpuszczony w wodzie i naniesiony na kolumnę semipreparatywną Jupiter® Proteo C12 (Phenomenex) o wymiarach 21,2 mm x 250 mm, 90 A, 4 μm. Rozdział chromatograficzny w liniowym gradiencie 5-100% B w 180 min przeprowadzono z wykorzystaniem eluentów: A = 0,1% TFA w H2O i B = 0,1% TFA, 30% ACN w H2O. Przepływ eluentów wynosił 14 ml/ min, detekcja UV przy λ = 223 nm.

Charakterystyka otrzymanego produktu - HPLC oraz spektrometria masowa:

Uzyskany surowy produkt poddano analizie chromatograficznej z wykorzystaniem wysokosprawnej chromatografii cieczowej na fazach odwróconych (RP-HPLC). Kolumna chromatograficzna: Jupiter 4 μm Proteo 90 A, 250 x 4.6 mm. Układ faz: A = 0,1% TFA w wodzie, B = 0,1% TFA, 80% ACN w wodzie, przepływ 1 ml/min, detekcja UV przy λ = 223 nm, gradient 5% B ^ 100% B w 60 minut, Rt = 19,9 minut. Masę cząsteczkową związku potwierdzono za pomocą spektrometru masowego MALDI-TOF Biflex III MALDI-TOF (Bruker Daltonics). Teoretyczna masa cząsteczkowa związku: 1331,5 Da, otrzymane m/z: 1332,6 ([M+H]+).

Wymiana przeciwjonu trifluorooctowego na jon octanowy:

Wymiana przeciwjonu trifluorooctowego na jon octanowy została wykonana na kolumience Strata X-C 33U Polymeric Strong Cation według procedury:

- przemyto kolumnę metanolem, a następnie 0,1 M roztworem kwasu octowego w wodzie,

- na zrównowagowaną kolumnę naniesiono peptyd rozpuszczony w wodzie,

- postęp wiązania się peptydu ze złożem kolumienki był monitorowany przy pomocy wysokosprawnej chromatografii cieczowej w układzie faz odwróconych,

- po związaniu się peptydu na kolumience, przemyto ją 0,1 M wodnym roztworem kwasu octowego w wodzie

- peptyd wyeluowano za pomocą 1 M wodnego roztworu octanu amonu w 50% MeOH (v/v).

Uzyskany eluat odparowano przy pomocy wyparki próżniowej, a następnie odsublimowano nadmiar octanu amonu na liofilizatorze. W celu usunięcia resztek amonu, liofilizat ponownie rozpuszczono w wodzie i powtórnie zliofilizowano.

P r z y k ł a d 2

Wpływ związku PDGF2 na proliferację (test XTT) i cytotoksyczność (test LDH) komórek skóry

Zbadano wpływ związku PDGF2 na proliferację unieśmiertelnionych, ludzkich komórek linii fibroblastów skórnych 46BR.1N i keratynocytów skórnych HaCaT (dla każdego peptydu 4 cykle doświadczeń) oraz pierwotnych fibroblastów skórnych (dla każdego peptydu komórki izolowane od 4 pacjentów - 4 cykle doświadczeń). Sprawdzono również ich cytotoksyczność wobec tych komórek. Komórki inkubowano z peptydami uprzednio rozpuszczonymi w podwójnie destylowanej, sterylnej wodzie.

Testy proliferacyjne (XTT) wykonano dla stężeń: 0,01; 0,1; 1; 10; 25; 50; 100; 150 pg/ml, a cytotoksyczności (LDH) dla stężeń: 50, 100, 150 μg/ml.

Wpływ związku PDGF2 na proliferację i cytotoksyczność komórek skóry:

PDGF2 stymuluje proliferację fibroblastów 46BR.1N - wzrost proliferacji względem kontroli o 20-90% w stężeniach: 0,01; 0,1; 1; 10; 25; 50 μg/ml po 48 h i 0,1; 1; 10 μg/ml po 72 h inkubacji, keratynocytów HaCaT - wzrost proliferacji względem kontroli o 20-140% w stężeniach: 0,1; 1; 10; 25; 50 μg/ml po 48 h inkubacji i 0,1; 1; 10; 25; 50; 100; 150 μg/ml po 72 h inkubacji oraz fibroblastów pierwotnych- wzrost proliferacji o 10-40% względem kontroli w stężeniach 0,1; 1; 10; 25; 50 po 48 h i 1; 10; 25 po 72 h inkubacji (różnice istotne statystycznie, test U-Manna Whitneya, p<0,05). PDGF2 nie powoduje zahamowania proliferacji badanych komórek i nie jest wobec nich cytotoksyczny (Fig. 2).

PL 240 667 B1

P r z y k ł a d 3:

Wpływ związku PDGF2 na chemotaksję keratynocytów HaCaT na chemotaksję fibroblastów pierwotnych

Zbadano wpływ związku PDGF2 w stężeniu 1 μg/ml na chemotaksję keratynocytów HaCaT oraz wpływ związku PDGF2 w stężeniu 1 μg/ml na chemotaksję fibroblastów pierwotnych. Komórki „głodzono” w pożywce bezsurowiczej 24 godziny przed eksperymentem. Następnie wysiano je w pożywce bezsurowiczej w insertach (Grainer bio one, 8 μm) umieszczonych w 24-dołkowej płytce. W dołku płytki umieszczono pożywkę zawierającą PDGF2. Kontrolami w teście były: medium bezsurowicze oraz pożywka zawierająca 10% FBS. Po 24 godzinach inkubacji komórki wybarwiono kalceiną. Następnie przy pomocy trypsyny odklejono komórki, które przemigrowały przez błonę insertu i wykonano pomiar fluorymetryczny (dł. fali wzbudzenia 485, dl. fali emisji 520 nm).

Zaobserwowano niewielki efekt chemotaktyczny związku PDGF2 wobec badanych komórek (10-30% w porównaniu do kontroli) (Fig. 3). Uzyskane wyniki dla fibroblastów pokazują, że związek PDGF2 w stężeniu 1 μg/ml hamuje chemotaksję ludzkich skórnych fibroblastów pierwotnych (Fig. 3).

P r z y k ł a d 4:

Badanie stabilności związku PDGF2 w ludzkim osoczu

Krew została pobrana od zdrowych dawców i żwirowana na probówkach pokrytych heparyną litową. Jako antykoagulant użyto EDTA. Peptyd PDGF2 został inkubowany w osoczu w temperaturze 37°C (końcowe stężenie peptydu: 144 μΜ), a jego rozkład przeanalizowany w punkach czasowych: 1, 2, 3, 6 i 24 h. Próbki zostały przygotowane w sterylnych warunkach. Po odpowiednim czasie, został dodany 4-krotny nadmiar etanolu, a następnie próbka została przetrzymana na lodzie przez kolejne 15 min. Następnie została zwirowana (32000 ref, 4°C, 20 min) na wirówce. Supernatant został zebrany i odparowany, a pozostałość została rozpuszczona w 100 μL 0,01% roztworu TFA w H2O. Analizy zostały prowadzone za pomocą HPLC, na kolumnie Phenomenex Luna C18(2) (5 μm, 100 A 4.6 x 250 mm) z detektorem PDA. 0,01% roztwór TFA w H2O (A) oraz 0,01% TFA w 80% MeCN w wodzie (B) został użyty jako bufor. Do analizy zastosowano liniowy gradient 5-100% w 60 min z przepływem 1 mL/min. Obliczenia zostały wykonane przy pomocy oprogramowania Shimadzu LCsolution.

Po godzinie inkubacji w 37°C, można zauważyć brak sygnału od peptydu PDGF2 (Fig. 4).

P r z y k ł a d 5:

Badanie powinowactwa związku PDGF2 do albuminy wołowej

Przygotowanie mikrokolumny do chromatografii powinowactwa:

Do przygotowania kolumny i wykonania testów powinowactwa zastosowano następujące bufory: 1. bufor sprzęgający (ang. coupling buffer, CB) - 0,2M NaHCO3 i 0,5M NaCl (pH 8,3),

2. bufor fosforanowy (ang. phosphate buffer saline, PBS) - 5 mM Na2HPO4 i 150 mM NaCl (pH 7,4),

3. bufor blokujący (ang. blocking buffer, BB) - 0,1 M etanoloamina i 0,5 M NaCl (pH 8,3),

4. bufor myjący (ang. washing buffer, WB) - 0,2 M CH3COONa i 0,5 M NaCl (pH 4),

5. bufor amonowy - 50 mM NH4HCO3 (pH 7,4).

W celu wykonania testu powinowactwa związku PDGF2 do albuminy wykorzystano mikrokolumnę Mobicol „F” firmy Abo (#M105035F). 100 μg białka albuminy odważono i rozpuszczono w 100 μl 0,2 mM buforu sprzęgającego. 0.06 g sefarozy (Activated CH-Sepharose 4B, A9019 Sigma-Aldrich) odważono do mikrokolumienki i namoczono w buforze sprzęgającym przez 5 minut celem spęcznienia żywicy. Rozpuszczoną albuminę przeniesiono do mikrokolumienki i inkubowano przez dwie godziny w temperaturze 25°C z zastosowaniem ciągłego wytrząsania. Następnie mikrokolumnę przemyto czterokrotnie buforem blokującym i myjącym. Kolumnę ponownie poddano godzinnej inkubacji z zastosowaniem wytrząsania w temperaturze 25°C w roztworze blokującym. Po zakończeniu inkubacji kolumnę czterokrotnie przemyto naprzemiennie roztworem blokującym i myjącym.

Wykonanie testu powinowactwa:

Kolumnę zrównoważono 20 ml 50 mM buforu amonowego, a następnie dodano 20 μg peptydu rozpuszczonego w 20 μl buforu amonowego i inkubowano w temperaturze 25°C przez 2 godziny z zastosowaniem ciągłego mieszania. Po 2 godzinach kolumienkę przemyto 100 ml buforu amonowego zbierając pierwszy i ostatni mililitr roztworu (frakcja supernatant oraz last wash). Kompleks związany na kolumnie oddysocjowano przy pomocy 15 minutowej inkubacji z 0,1% TFA w wodzie z zastosowaniem ciągłego wytrząsania. Procedurę powtórzono dwukrotnie każdorazowo zbierając frakcje eluat. Kolu

PL 240 667 B1 mienkę przemyto roztworem PBS w celu renaturacji immobilizowanego białka i przechowywano w temperaturze 4°C. Wszystkie frakcje zostały zliofilizowane i poddane analizie z wykorzystaniem spektrometrii mas (ESI-IT-TOF firmy SHIMADZU).

Analiza uzyskanych widm:

Widmo frakcji ostatniego mililitra buforu dla peptydu PDGF2 wskazuje, że kolumna została poprawnie odmyta (Fig. 5 po lewej) z nadmiaru naniesionego peptydu na co wskazuje brak masy PDGF2. Na widmie frakcji eluatu widoczny jest pik m/z 1331,746 (Fig. 5 po prawej), który jest zgodny z masą peptydu PDGF2.

Na podstawie uzyskanych wyników można wnioskować, że badany związek oddziałuje z albuminą wołową, gdyż we frakcji eluat obecny jest sygnał m/z odpowiadający masie związku PDGF2.

P r z y k ł a d 6:

Badanie wpływu związku PDGF2 na ekspresję genów pluripotencji i regulacji cyklu komórkowego keratynocytów

W celu określenia działania peptydu PDGF2 na ekspresję genów pluripotencji i regulacji cyklu komórkowego, wykonano szereg hodowli ludzkich linii komórkowych keratynocytów pobranych od pacjentów. Hodowle stymulowano peptydem PDGF2 w 3 różnych stężeniach (0,1 μg/ml, 1,0 μg/ml i 10 μg/ml) oraz wykonano jedną hodowlę stymulowaną 5% FBS. Jako kontrolę przyjęto hodowlę linii komórkowych keratynocytów bez dodatku FBS (oznaczona jako Kontrola). Zbadano poziomy transkryptów dla panelu genów obejmującego CDKN1A, MYC, KIT, POU5F1, TGFB3, TP53. Izolacja RNA została wykonana przy użyciu zestawu RNeasy (Qiagen). Poziomy wybranych transkryptów wyznaczono przy użyciu metody ilościowego PCR w czasie rzeczywistym przy wykorzystaniu TBP i ACTB jako transkryptów referencyjnych. Wyniki nie wykazują (Fig. 6) znamiennych statystycznie zmian poziomu wybranych transkryptów pod wpływem badanych związków.

Brak aktywacji transkrypcyjnej analizowanych czynników regulatorowych, w tym związanych z onkogenezą MYC i KIT, wskazuje, że testowany peptyd PDGF2 nie zaburza funkcjonowania keratynocytów.

P r z y k ł a d 7:

Badanie właściwości immunogennych związku PDGF2

Materiałem do badań były tzw. kożuszki leukocytarne, z których izolowano jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) wykorzystując wirowanie w gradiencie gęstości (histopaque, Sigma). Po dwukrotnym płukaniu PBMC w PBS, lizie erytrocytów i zliczeniu (licznik komórek Bio-Rad), komórki wysiewano na płytkę 24-dołkową w ilości 1 min komórek/ 1 ml RPMI 1640 (P/S, 10% FBS)/dołek. Następnie komórki adaptowały się do nowych warunków przez 24 godziny (tzw. resting). Po tym czasie dodawano badanego związku - PDGF2 w stężeniu końcowym 1,0 μg/ml i inkubowano w cieplarce przez 48 h. Kontrolę negatywną stanowiły komórki niestymulowane, natomiast pozytywną - komórki stymulowane LPS (1 μg/ml) i PHA (2,5 μg/ml). Komórki zbierano z dołków po zakończeniu inkubacji, płukano w PBS, zliczano i przygotowywano do analizy cytometrycznej: 100 tys. komórek/100 μl wybarwiano przeciwciałami (anty-CD3, CD4, CD8, CD16, CD56, CD25, CD69, CD71, HLA-DR, CD11c, CD80, CD83), a po 30 minutowej inkubacji w temp pokojowej w ciemności analizowano z wykorzystaniem cytometru przepływowego - LSRFortessa, BD.

Immunogenność i bezpieczeństwo immunologiczne dla związku PDGF2:

Badania immunogenności: badania wpływu peptydów na komórki układu immunologicznego wykonano z wykorzystaniem izolowanych jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC). Komórki te były inkubowane z badanym związkiem - PDGF2 (1,0 μg/ml) przez 48 godzin, następnie efekty ich działania analizowano z wykorzystaniem cytometrii przepływowej. Określono stopień pobudzenia limfocytów T (CD3/CD4/CD8) i komórek NK (CD16/CD56) poprzez ocenę ekspresji markerów aktywacji: CD69, CD71, CD25, HLA-DR. Analizowano również odpowiedź komórek dendrytycznych (CDlc, HLADR), które przy aktywacji zwiększają ekspresję CD80, CD83.

Wykonane analizy wykazują brak właściwości immunogennych PDGF2. Poziom wybranych subpopulacji komórek układu immunologicznego (CTL, Th, NK) zachowywał wartości zbliżone dla kontrolnej negatywnej (Fig. 7).

Podobnych obserwacji (Fig. 8) dokonano w obrębie poszczególnych subpopulacji, przy czym porównanie wyników uzyskanych dla komórek kontroli pozytywnej (LPS/PHA) i komórek stymulowanych PDGF2 - widać istotną statystycznie różnicę w aktywacji - jest ona istotnie niższa w przypadku PDGF2 (p <0,05).

PL 240 667 B1

Również komórki dendrytyczne nie aktywowały się w obecności związku PDGF2 (Fig. 9) (DC bez pobudzenia:CD11lc+ CD80-, CD83-, DC aktywowane: CD11+, CD80+, CD83+). Wyniki badań immunologicznych wskazują, iż związek PDGF2 jest bezpieczny pod względem immunologicznym.

P r z y k ł a d 8:

Badania BAT (Basophil Activation test) potencjału alergizującego związku PDGF2

W celu oceny aktywacji granulocytów zastosowano zestaw komercyjny Flow CAST® highsens (Buhlmann Laboratories, Switzerland). Badanie wykonano na próbkach krwi pobranych od zdrowych ochotników i przeprowadzono w ciągu 24 godzin od pobrania, zgodnie z instrukcją producenta. 100 μL krwi pełnej inkubowano z badanym związkiem - PDGF2 w stężeniu końcowym 1,0 μg/ml. Następnie próbki barwiono koktajlem przeciwciał (CD63, CD203c, CCR3) i inkubowano przez 15 min w łaźni wodnej w temp 37°C. Po zakończeniu inkubacji, lizie erytrocytów i płukaniu, próby były analizowane cytometrycznie (BD FACSCanto II). Dla każdej próby przygotowano również kontrole: negatywną i pozytywną (anti-FcεRI mAb i fMLP).

Uzyskane wyniki (Fig. 10) wskazują na brak aktywacji granulocytów w obecności PDGF2 (1,0 μg/ml) - wartości zbliżone do kontroli negatywnej.

P r z y k ł a d 9:

Ocena profilu transkryptomicznego komórek ASCs oraz fibroblastów pod wpływem peptydu PDGF2

Sprawdzono wpływ dodatku peptydu PDGF2 na profil transkryptomiczny pierwotnych linii komórkowych - mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ang. ASCs Adipose Derived Stem Cells) oraz pierwotnych fibroblastów skóry. Podskórną tkankę tłuszczową oraz skórę pozyskano od trzech zdrowych pacjentów Kliniki Chirurgii Plastycznej GUMed (zgoda nr NKBBN/387/2014 Niezależnej Komisji Bioetycznej ds. Badań Naukowych GUMed). Izolację komórek ASCs przeprowadzono wg standardowego protokołu i hodowano w pożywce DMEM low glucose (Dulbecco’s modified Eagle medium) z dodatkiem 10% surowicy bydlęcej (FBS - Fetal Bovine Serum). Izolację fibroblastów przeprowadzono wg protokołu opisanego wcześniej (Kosikowska, Pikuła; 2015) wykorzystującego enzym kolagenazę i hodowano w mediach DMEM (wysokie stężenie glukozy). Wpływ peptydu PDGF2 badano po drugim pasażu, w taki sposób, że po zmianie pożywki komórki były hodowane przez 24 h z dodatkiem 10% FBS, kolejne 24 h z 5% FBS, a następnie przez 48h wyłącznie z dodatkiem peptydu PDGF2 w stężeniu 1 μg/ml. Jako kontroli użyto komórek ASCs, które przez ostatnie 48 h były hodowane bez żadnych czynników stymulujących (kontrola bez dodatku FBS). Po etapie stymulacji komórki obu linii poddano trypsynizacji, płukaniu, a z zamrożonych pelletów komórkowych izolowano RNA do badań transkryptomicznych. RNA z trzech replikatów biologicznych (o wartości współczynnika RIN - RNA Integrity Number powyżej 7) spulowano w równoważnych ilościach, a następnie przeprowadzono wysokoprzepustowe sekwencjonowanie RNA w celu profilowania całego transkryptomu. Otrzymane fragmenty po sekwencjonowaniu zmapowano do genomu referencyjnego człowieka (edycja hg19) z użyciem oprogramowania TopHat. Analizy porównawcze profili transkryptomicznych ASCs traktowanych peptydem PDGF2 przeprowadzono w odniesieniu do kontroli FBS Min (komórki ASCs hodowane bez dodatku czynników stymulujących) z wykorzystaniem pakietu Cufflinks według procedury opisanej przez twórców oprogramowania (workflow for Cufflinks version 2.2.0 and higher - http://cole-trapnell-lab.github.io/cufflinks/manual/). Wyniki badań porównawczych dla spulowanych prób w postaci matryc DGE (ang. Differential Gene Expression) poddawano analizie funkcjonalnej w pakiecie Ingenuity Pathway Analysis (IPA).

IPA pozwala na analizę zmian transkryptów w badanym zestawie danych i powiązanie ich ze zmianami regulatorów „upstream” oraz zjawiskami biologicznymi zachodzącymi w wyniku tych zmian (tzw. „downstream effects”). Współczynnik, który opisuje dopasowanie tych danych to „consistency score”. Sieć regulatorowa o najwyższym consistency score (6,414) dla komórek ASCs wykazała wyraźną aktywację progresji cyklu komórkowego oraz zahamowanie migracji limfocytów T (Fig. 11). Dla fibroblastów algorytm analizy nie wskazał jednoznacznych sieci regulatorowych.

W przypadku komórek ASCs traktowanych peptydem PDGF2 zaobserwowano aktywację zjawisk biologicznych związanych z progresją cyklu komórkowego i żywotnością komórek, przy jednoczesnym zahamowaniu odpowiedzi zapalnej (Tabela 1). Aktywację podobnych zjawisk związanych z migracją komórek (w tym macierzystych) zanotowano w przypadku fibroblastów (Tabela 2).

PL 240 667 Β1

Tabela 1: Lista zjawisk biologicznych zachodzących w komórkach ASCs pochodzących od trzech pacjentów po „spulowaniu” (łączeniu) RNA w wyniku stymulacji peptydem PDGF2 (1 pg/ml). Z-score jest algorytmem w IPA pozwalającym na identyfikację zjawisk i funkcji aktywowanych (z-score > 2) lub hamowanych (z-score < -2) w wyniku zmian ekspresji obserwowanych w badanym zestawie danych.

Zjawisko	p-value	Kierunek zmiany	z-score	Ilość zaangażowanych transkreplów
Inwazja komórek	7,01E-08	aktywacj a	2,520	77
Progresja cyklu komórkowego	l,55E-05	akty wacj a	2,498	62
Proliferacja linii komórkowych nabłonka	l,84E-05	aktywacj a	2,336	30
Wiązanie komórek fagocytujących	8,97E-07	hamowanie	-2,001	22
Wyciek kationów	E19E-06	hamowanie	-2,037	26
Żywotność limfocytów	l,61E-04	hamowanie	-2,051	10
Ruchy komórkowe limfocytów	5,72E-07	hamowanie	-2,103	30
Ruchy komórkowe fagocytów	1,51E-04	hamowanie	-2,104	31
Wiązanie komórek krwi	2,60E-12	hamowanie	-2,107	49
Migracja leukocytów jednojądrzastych	7,85E-09	hamowanie	-2,118	35
Śmierć komórkowa komórek nowotworowych	l,13E-04	hamowanie	-2,128	26
Migracja limfocytów	l,38E-07	hamowanie	-2,141	29
Limfopocza	l,08E-05	hamowanie	-2,151	22
Wyciek jonów	2J7E-07	hamowanie	-2,164	28
Homeostaza komórkowa	E51E-05	hamowanie	-2,214	82
Wyciek jonów Ca2+	E25E-05	hamowanie	-2,342	23
Ncoplazja limfohcmatopoetyczna	1,49E-14	hamowanie	-2,345	319
Naoplazja hematologiczna	3,76E-14	hamowanie	-2,345	319
Ruchy komórkowe leukocytów jednojądrzastych	7,26E-07	hamowanie	-2,485	38
Ruchy komórkowe limfocytów T	4,67E-05	hamowanie	-2,486	18
Migracja limfocytów T	6,95E-05	hamowanie	-2,522	19
Wiązanie leukocytów jednojądrzastych	L08E-07	hamowanie	-2,563	25
Mobilizacja jonów Ca2+	l,96E-06	hamowanie	-2,944	30

Tabela 2: Lista zjawisk biologicznych zachodzących w komórkach fibroblastów pochodzących od trzech pacjentów po spulowaniu RNA w wyniku stymulacji peptydem PDGF2 (1 pg/ml). Z-score jest algorytmem w IPA pozwalającym na identyfikację zjawisk i funkcji aktywowanych (z-score > 2) lub hamowanych (z-score < -2) w wyniku zmian ekspresji obserwowanych w badanym zestawie danych.

Zjawisko	p-value	Kierunek zmiany	z-score	Ilość zaangażowanych transkryptóyy
Ruchy· komórkowe	2,83E-03	aktywacja	3,742	76
Migracja komórek	l,53E-03	aktywacja	3,445	70
Fosforylacja L-tyrozyny	3,11E-02	aktywacja	2,449	8
Migracja komórek macierzystych	4,20E-04	aktywacja	2,176	5
Inwazja komórek	l,36E-02	aktyyyacja	2,073	40
Apoptoza	l,57E-03	hamowanie	-2,016	88

PL 240 667 B1

P r z y k ł a d 10:

Wpływ miejscowego podania związku PDGF2 na gojenie ran skóry

Wpływ miejscowego podania związku PDGF2 na gojenie ran skóry u myszy określono przy użyciu modelu uszkodzenia skóry grzbietowej. Do eksperymentów wykorzystano 8-tygodniowe samice szczepu Balb/C. Przed wykonaniem uszkodzenia, myszy poddano znieczuleniu ogólnemu, skórę grzbietu ogolono i zdezynfekowano. Dwa symetryczne otwory wykonano w skórze grzbietu przy użyciu sztancy biopsyjnej o średnicy φ 6 mm. Natychmiast po zranieniu związek PDFG2 w hydrożelu (P407) (25 μg/ml) nakładano w postaci jednej kropli 25 μl bezpośrednio na ranę, a następnie raz dziennie przez 4 kolejne dni. Po każdym podaniu PDGF2, po zestaleniu się hydrożelu rany zaopatrywano przezroczystym opatrunkiem Tegaderm, który dodatkowo mocowano za pomocą plastra samoprzylepnego owiniętego wokół tułowia myszy. Eksperyment przeprowadzono dla 6 myszy, a analogiczną procedurę wykonano dla grupy kontrolnej, którym podano tylko hydrożel P407 także złożonej z 6 myszy. W pierwszym tygodniu eksperymentu hydrożel P407 lub hydrożel P407 z peptydem PDGF2 podawano raz dziennie przez 5 dni łącznie z dniem wykonania zranienia. W drugim tygodniu opatrunek zmieniano co drugi dzień. Opatrunek zdjęto na początku trzeciego tygodnia. W dniu zmiany opatrunku wykonywano zdjęcia dokumentujące przebieg gojenia rany. Po upływie trzeciego tygodnia zwierzęta poddano eutanazji. Skórę grzbietową pobrano, rozpięto na korku i umieszczono w formalinie. Rany fotografowano w dniu wykonania uszkodzenia (d0) oraz 2, 4, 7, 11, 14, i 18 dni po zranieniu. Postęp gojenia mierzono przez wyznaczenie powierzchni rany przy użyciu komputerowej analizy obrazu. Protokół eksperymentów na zwierzętach został zatwierdzony przez Lokalną Komisję Etyczną ds. Doświadczeń na Zwierzętach przy Uniwersytecie Technologiczno-Przyrodniczym w Bydgoszczy (nr zgody 49/2016).

Gojenie ran skórnych:

W pierwszym tygodniu gojenia nie obserwujemy drastycznego zmniejszenia powierzchni rany (Fig. 12 i Fig. 13). Pod koniec pierwszego tygodnia obserwujemy nieznaczne zmniejszenie powierzchni rany oraz początki naskórkowania. Wprawdzie u myszy traktowanych hydrożelem z peptydem PDGF2 średnia powierzchnia rany zmienia się podobnie, jak u myszy kontrolnych z samym hydrożelem P407, jednak w tkankach poddanych działaniu peptydu PDGF2 proces ten jest nieznacznie intensywniejszy. W dniu 11. Od podania związku PDGF2 obserwuje się przyspieszenie tworzenie naskórka w porównaniu do kontroli. W tkankach kontrolnych w tym samym czasie obserwujemy wytworzenie naskórka, jednak nie następuje wypełnienie rany tkanką. Do dnia 14 w obu grupach następuje całkowite zamknięcie rany i wytworzenie niewielkiej blizny. W trzecim tygodniu blizna ulega nieznacznemu zmniejszeniu w obu grupach, jednak w grupach otrzymujących peptyd PDGF2 blizny te bardzo szybko bledną i są mniej widoczne (Fig. 12).

Preparaty histologiczne:

Skórę utrwalano w formalinie przez tydzień po czym zatopiono w parafinie i pocięto na 5 μm sekcje. Preparaty wybarwiono hematoksyliną i eozyną lub trójkolorowym barwieniem Massona. Preparaty analizowano pod mikroskopem świetlnym.

Na preparatach z grup kontrolnych widać rozległą tkankę bliznowatą z silnie zaznaczonym kolagenem (Fig. 13). Wewnątrz blizny można zauważyć sporadyczne formowanie się mieszków włosowych jednak nie zaobserwowano tworzenia się gruczołów. Na obrzeżach blizny można zauważyć ujścia mieszków włosowych. W preparatach z grup otrzymujących PDGF2 również można zauważyć tkankę bliznowatą, jednakże jest ona mniej rozległa w porównaniu do kontroli. Struktura kolagenu jest luźniejsza i mniej regularna, zwłaszcza w głębszych rejonach blizny. Obserwujemy też dużo częstsze występowanie zalążków mieszków włosowych i gruczołów. Można też zaobserwować obszary komórek różniące się morfologią od otaczających fibroblastów.

Wnioski:

PDGF2 w hodowli in vitro stymuluje proliferację ludzkich keratynocytów. PDGF2 stosowany na rany powoduje niewielkie przyspieszenie procesu gojenia, jednak należy pamiętać, że skóra myszy jest tkanką gojącą się bardzo szybko zatem dużo bardziej istotna w tym modelu jest jakość odtworzonej tkanki. W tkankach stymulowanych peptydem PDGF2 proces wypełniania rany tkanką rozpoczyna się wcześniej w porównaniu z kontrolną. Zastosowanie peptydu PDGF2 znacząco wpływa na jakość odtworzonej tkanki. Powstała tkanka nie wykazuje klasycznej morfologii blizny (Fig. 14). Kolagen jest ułożony w mniej uporządkowany sposób co jest charakterystyczne dla normalnej skóry. Jest to o tyle istotne, że ściśle upakowane równoległe włókna kolagenowe są dużo mniej odporne na naprężenia mechaniczne. Częstsze występowanie przydawek skóry w rejonie odtworzonym również wskazuje na

Claims (2)

1. PL 240 667 B1 zwiększoną efektywność gojenia. Warto też zwrócić uwagę, że nowa tkanka po zakończeniu procesu gojenia podlega transformacjom i dojrzewaniu trwającemu od tygodnia do kilku miesięcy. Podczas tego procesu w tkance zachodzą zmiany mające na celu zwiększenie wytrzymałości i redukcję nadmiaru kolagenu powstałego podczas gojenia. Obserwowane obszary o zmienionej morfologii sugerują zachodzenie procesów różnicowania, które mogą doprowadzić do powstania elementów obecnych w normalnej skórze takich jak mieszki włosowe, gruczoły, tkanka tłuszczowa czy mięśniówka. Pozwala to przypuszczać, że PDGF2 pozytywnie wpływa na dojrzewanie tkanki powstałej w procesie gojenia.

   W pierwszym tygodniu po zranieniu obserwujemy powstawanie błonek w świetle rany. Zauważono, że „błonki” te (częściowo zróżnicowany naskórek) w grupie otrzymującej PDGF2 pojawiają się szybciej, są grubsze i wytrzymalsze mechanicznie (Fig. 15). Analiza preparatów histologicznych wykazuje znaczące różnice w grubości powstałej tkanki. Błonki z grupy badanej wykazują też większe zagęszczenie komórek w porównaniu do kontroli (Fig. 16).

   Zastrzeżenia patentowe

   1. Pochodna białka PDGF o sekwencji:

   H-R¹L²I³D⁴R⁵T⁶N⁷A⁸N⁹F¹⁰L¹¹-NH2 do zastosowania jako środek leczniczy do podania na skórę w zaburzeniach naskórka do stymulacji odbudowy naskórka.
2. 2. Pochodna do zastosowania według zastrz. 1, jako środek stosowany w gojeniu ran.