CN1221348A

CN1221348A - 免疫原性复合物,其用途和制备方法以及包含它的疫苗

Info

Publication number: CN1221348A
Application number: CN97195397A
Authority: CN
Inventors: H·宾兹; J－F·哈尤; S·斯文森
Original assignee: Pierre Fabre Medicament SA
Current assignee: Pierre Fabre Medicament SA
Priority date: 1996-05-07
Filing date: 1997-05-06
Publication date: 1999-06-30
Also published as: WO1997041888A1; CA2254084A1; AU733845B2; EP0914152A1; JP2000509707A; FR2748476B1; AU2901997A; NZ332809A; BR9708979A; FR2748476A1

Abstract

本发明涉及一种免疫原性复合物,其特征在于它包含至少一种天然存在于细菌中并与选自链球菌的人血清白蛋白结合蛋白、革兰氏阴性细菌的外膜蛋白或其片段的载体蛋白偶联的寡糖或多糖表位。本发明还涉及包含该免疫原性复合物的疫苗以及制备该复合物的方法。

Description

免疫原性复合物，其用途和制备方法以及包含它的疫苗

本发明涉及包含糖类衍生物的新的免疫原性复合物，它可用作药物，尤其可用作疫苗。

蛋白质和多糖是在细菌和真菌中遇到的两类主要表面抗原，并且根据它们的抗原特性，是用于设计疫苗的极好的工具。然而，无副作用的特定疫苗的开发需要使用主要为肽或寡糖的低分子量的接种抗原。这些抗原以及高分子量的其它物质，如多糖本身不能诱导高且长效的免疫应答。

细菌多糖在制备疫苗中的潜力出现于二十世纪初。这些化合物的确在一些革兰化阳性和阴性细菌的结构以及致病性中起主要的作用。两类细菌多糖是作为疫苗剂的极好的候选物。它们是来自细菌荚膜的多糖，和来自革兰氏阴性细菌外膜脂多糖(LPS)的多糖。

它们是本质上由糖类部分组成的聚合物，并且其中该分子的一部分暴露于细胞表面。它由给定细菌种类的特征性重复单元的直链构成，且其中重复单元数目可从一变化至几百，从而解释了它们有时有非常高的分子量。各重复单元本身由一些通过糖苷键相互连接的单糖组成，通常为1-7个单糖残基。后者可或大或小程度上被无机基团，如磷酸盐或被有机基团，如酸，胺，醇，脂肪酸或氨基酸取代。

无论它们是从细菌荚膜分离的多糖或是革兰氏阴性细菌外膜的脂多糖，细菌多糖表位(少量不同的表位)的重复特征的确使它们成为了T-依赖性免疫原。在幼儿，这导致不存在对这些抗原的免疫应答，在成人不存在免疫记忆(无细胞类型的免疫应答，很少或没有回忆效果，对IgM类型的有限的抗体应答)。

包含多糖提取物的疫苗已证实在成人中25-50μg的低剂量相对有效。目前基于细菌多糖的疫苗包括抗下面感染的疫苗：——脑膜炎奈瑟氏球菌感染：抗A,C,W135和Y组菌株的四价疫苗，——肺炎链球菌感染：混合23种荚膜多糖血清型的多价肺炎疫苗，——伤寒沙门氏菌感染：由伤寒沙门氏菌荚膜多糖构成的疫苗。然而，这些疫苗尤其在幼儿中无效。

在抗伤寒沙门氏菌的疫苗策略中已试验了其它方法。的确，沙门氏菌属的细菌为具有消化趋性的毒性肠细菌，其为人和许多脊椎动物的病原体。沙门氏菌属一般由多于2000个不同的血清型构成。由这些细菌诱导的主要疾病为(对于综述参见：Le Minor,L,1987，医学细菌学中的沙门氏菌，L.Le Minor和M.Veron编，药物科学Flammarion Paris,p.411-427,Pegues,D.A.和Miller,S.I.1994，包括伤寒的沙门氏菌病，Curr.Opin.Infect Dis.7,616-623)：——在动物，毒感染：·对一些种类具有特异性，绵羊中的绵羊流产沙门氏菌，家禽中的鸡沙门氏菌·非特异性，由所谓“遍在性”血清型(鼠伤寒沙门氏菌，肠炎沙门氏菌等)引起，——在人类：·伤寒(伤寒沙门氏菌)和副伤寒(甲型、乙型和丁型副伤寒沙门氏菌)，·食物毒素感染，对于它们最常归罪的血清型是鼠伤寒沙门氏菌，肠炎沙门氏菌和巴拿马沙门氏菌。

目前，可从市场上购得三种类型的抗伤寒疫苗(对于综述参见：Levine,M.M.,Hone,D.M.,Stocker,B.A.D.和Cadoz,M.,1990，在新一代疫苗中的抗伤寒的新的及改进疫苗，G.C.Woodrow和M.M.Levine编，Marlel Dekker Inc.New York and Basel,p.269-287,Jalla,A.G.S.,Sazawal,S.和Bhan,M.K.,1994，伤寒疫苗进展，Indian J.Pediatr.61 321-329)：--灭活疫苗

可注射形式的“灭活细菌疫苗”类型是最老的疫苗形式。它们为每剂可包含5-10亿细菌的液体形式的疫苗。通过加热和/或用化合物，如丙酮，福尔马林或苯酚处理灭活细菌。取决于它们包含的细菌血清型，具有--抗伤寒疫苗：在此类中存在的是来自美国WYETH-AYERST公司的特殊产品“伤寒疫苗”，或来自英国WELLCOME公司的“伤寒单价”，——抗伤寒/副伤寒疫苗：在此第二类中存在的是来自法国PASTEUR的疫苗“Vac TAB”或来自意大利BIOCINE SCLAVO的“Typhidrall”。

在法国，疫苗TAB(PASTEUR)是混合了伤寒沙门氏菌，甲型和乙型副伤寒沙门氏菌的三价液体灭活的全细菌疫苗。实际上，其相对功效局限于T效价。该疫苗为反应原性：在三分之一的病例中它导致早熟的局部和全身反应。经皮下途径，以2-4周的间隔进行2-3次注射，接着进行加强注射。在法国，目前仍施用于一些专业人员，包括军队和卫生行业的规定实际上不再合理。在军事部门，现使用一种非商业化的单价T疫苗。

由于在注射后可能发生的不希望的效应(相当疼痛和高烧)，一岁以下幼儿的免疫通常是不提倡的。——减毒活疫苗

口服伤寒疫苗Ty21a(“Vivotif”,BERNA)包含缺乏半乳糖-4-差向异构酶的伤寒沙门氏菌的缺陷性活菌株。它以包含冷冻干燥形式的1-8×10⁹活细菌的胃耐性胶囊的形式被口服。接种方法包括在第1,3和5天时3次连续的剂量和同步剂量的碳酸氢钠以中和胃酸。在埃及和智利地方流行区进行评价，保护值被认为在60和90％之间。不认为具有任何不希望的副作用。最后一次剂量约10天后，接种保护有效。由于保护对于可能从1年变化至7年的期间有效，因此建议到地方流行区旅行的人每年重复接种。

较早的口服剂型仍有供应。它们为其功效仍未清楚确定的灭活疫苗(来自BERNA公司的“Taboral”，意大利的“Enterovaccino”)。——亚单位型疫苗

MERIEUX研究所的疫苗“Typhim Vi”是由从伤寒沙门氏菌纯化的荚膜多糖Vi制备的。它为包含24μg多糖的可注射溶液剂。简单的皮下或肌肉内注射在成人和大于5岁幼儿中提供完全的抗与伤寒沙门氏菌相关的感染危险的保护。该疫苗不提供抗其血清型没有被包括的副伤寒沙门氏菌A和B的保护。在注射后约15天至3周出现免疫性。保护期为至少3年。在高发病地区，观察到的保护水平为约60％。

这些特定产品在治疗和预防伤寒中不是足够地有效。保护期通常是有限的。小孩接种困难且对于喂奶的幼儿的接种是不可能的。灭活疫苗无论如何也不可开给小孩和喂奶的婴儿，后两种疫苗形成不可用于喂奶的婴儿和幼儿。口服疫苗Ty21a的确不在6岁以下儿童中提倡，多糖疫苗“Typhim Vi”不可被注射至18个月以下的幼儿中。

为了避免这些缺点，希望能拥有可在小孩以及喂奶婴儿中提供良好的抗致病菌株的免疫性的免疫原性复合物，它能产生体液和细胞类型的免疫答应，诱导记忆效果以及副作用小。

这些以及后面将出的其它目的可通过免疫原性复合物来实现，其中该免疫原性复合物特征在于它们由至少一种天然存在于病原物如细菌中的、与选自链球菌的人血清白蛋白结合蛋白，革兰氏阴性细菌的外膜蛋白或其片段的载体蛋白偶联的寡糖或多糖表位组成。确实，寡糖或多糖通过共价键的偶联使它们转化成为T-依赖性免疫原。

寡糖或多糖表位可从革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌，尤其是从沙门氏菌属，大肠杆菌属，奈瑟化球菌属，志架氏菌属，嗜血菌属或克雷伯氏菌属的细菌的膜脂多糖或荚膜寡糖而获得。

根据本发明的一个优选方面，病原物可为伤寒沙门氏菌，流感嗜血菌，脑膜炎奈瑟氏球菌或肺炎链球菌。

寡糖或多糖表位也可从真菌，尤其是属于假丝酵母属，隐球菌属或油脂酵母属的真菌而获得。

来自脂多糖的多糖通过从膜中提取LPS并接着通过控制的水解除去脂质A来制备。荚膜多糖更易从细菌悬液中分离：100℃下加热约10分钟(溶解作用)，接着通过离心可从伤寒沙门氏菌中分离荚膜多糖Vi。接着可通过层析和/或膜过滤来纯化两类多糖。

主要由于这些化合物过大，在偶联方法中使用“全”多糖可能导致一些技术问题：形成凝胶，沉淀作用。

为了克服这一问题，可使用各种裂解多糖的方法：用超声断裂，氧化还原解聚，酸或碱介质中控制的水解，酶促水解。

允许释放寡糖的断裂方法应适宜于所研究的多糖。寡糖为可来自多糖并且与起始多糖相比具有减少数目的糖重复单元的化合物。

申请人目前已证实寡糖或多糖通过共价键与如上定义的载体蛋白的偶联使得有可能解决由仅使用多糖衍生物或与其它载体偶联产生的问题。

例如，市场上唯一的偶联疫苗为用于预防人类侵害性b型流感嗜血菌感染(脑膜炎)的疫苗。对于这四种商品化的特殊产品，偶联的接种抗原为从荚膜分离的寡糖或多糖：PRP，磷酸聚核糖基核糖醇。

用于设计这种偶联疫苗的载体蛋白有两种类型：——破伤风类毒素(TT)和白喉类毒素(DT)，——脑膜炎奈瑟氏球菌膜蛋白的提取物，OMPC。

从结构和生物学观点来看(疫苗性质，载体蛋白性质)，破伤风和白喉类毒素是目前表征得最好的载体蛋白，并且由于这些原因被当作参考载体蛋白。

这些蛋白被用于抗破伤风和抗白喉的免疫接种。相应疫苗极为有效(在两种情况下，保护都接近于100％)并且耐受性好。

它们是可从培养物滤液中提取和纯化的细菌外毒素：

破伤风梭菌用于TT而白喉棒杆菌用于DT。TT毒素为150KDa蛋白。DT毒素具有较低的分子量并以535个氨基酸的单链多肽链形式分泌。纯化后，通过加热和福尔马林灭活这些蛋白。它们可相互(DT疫苗)和与许多其它疫苗(百日咳，脊髓灰质炎等)混合。由于具有耐热性，4℃下可将它们保存多年，但不应被冷冻。

然而，太经常使用这些蛋白(抗破伤风和抗白喉接种，偶联疫苗)可与抗半抗原的强免疫应答不相容。如果被免疫个体已经具有高水平的抗它们的抗体，太经常使用它们确实具有导致免疫应答被定向于主要针对这些蛋白的危险。

实际上用于这种相同疫苗中的第二类载体是膜蛋白的提取物：从脑膜炎奈瑟氏球菌分离的OMPC，“外膜蛋白复合物”)。实际上该泡状复合物包含与脂质和脂多糖结合的几种蛋白质。

根据本发明的一个优选方面，载体蛋白包含革兰氏阴性细菌OmpA类型蛋白，尤其是肺炎克雷伯氏菌外膜蛋白的至少一部分。

尤其适宜于实施本发明的蛋白为来自肺炎克雷伯氏菌I-145的主要膜蛋白的蛋白，以下称为p40；它们尤其具有SEQ ID No.2,ID NO.4或ID NO.6之一的序列。来自肺炎克雷伯氏菌外膜蛋白的感兴趣的其它载体蛋白包含-含有位于膜内序列旁侧的第三和第四个膜外环的片段，-含有不可变膜外环和相邻膜内序列的片段。

不可变膜外环被定义为与在不同种的肠细菌之间保守的环序列同源的P40序列。在进化中不保守的膜外环的序列被称为可变环。根据关于大肠杆菌OmpA的VOGEL和JAHNIG模型(1986，分子生物学杂志，190:191-199)进行膜外环的定位。

特别地，将使用SEQ ID No.1的氨基酸127与179之间的片段。

其它适宜的序列分别为SEQ ID No.1的氨基酸108与179之间的序列，SEQ ID NO.1的氨基酸1与179之间的序列，以及与前面序列具有至少90％同源性的序列。

根据本发明另一个有利的方面，载体蛋白包含链球菌G蛋白的人血清白蛋白结合区(下文称BB)的全部或一部分。

该蛋白具有29KDa的分子量，并可在大肠杆菌中表达并以包含体形式产生。

该载体蛋白尤其可具有SEQ ID NO.8的序列，或与所述SEQ ID No.8具有至少80％，优选至少90％相似性的序列。

所有这些载体蛋白可从细菌来源提取或通过重组DNA途径而获得。

根据本发明的免疫原性复合物尤其可由如上定义的载体蛋白与至少一种基本上纯化的且能从伤寒沙门氏菌属细菌的膜脂多糖获得的寡糖之间的偶联物组成；尤其是，沙门氏菌属的细菌将属于带有选自下面组的抗原特异性的血清组：O:1,O:2,O:4,O:6,7,8,O:3和O:9。在一个优选的具体实施方案中，免疫原性复合物包含能从具有O:9抗原特异性的肠炎沙门氏菌的脂多糖获得的寡糖。

实际上，各种沙门氏菌属血清型通过它们的抗原代表式来识别；根据它们的抗原特异性O，它们被分为不同的组。

例如，沙寒伤门氏菌属于具有O:9特异性的D组，对于肠炎沙门氏菌，巴拿马沙门氏菌和都柏林沙门氏菌也是一样。

在其它主要多糖特别产品中，可能提到：——血清组A，具有O:2特异性，其代表为甲型副伤寒沙门氏菌，——血清组B，具有O:4特异性，其代表为乙型副伤寒沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌，——血清组C，具有O:6,7,8特异性，其代表为婴儿沙门氏菌和病牛沙门氏菌。——血清组E，具有O:3特异性，有火鸡沙门氏菌。

属于上面所列的主要抗原特异性的寡糖将尤其适宜用于实施本发明。例如，从由具有O:9抗原特异性的肠炎沙门氏菌的脂多糖分离的寡糖制备疫苗，将使得有可能保护宿主抵抗由伤寒沙门氏菌导致的败血症和抵抗伤寒，但它还可在人类和动物中用于预防由于相同血清组的沙门氏菌导致的毒素感染和动物传染病。

根据本发明一个优选方面的寡糖具有至少一个如下单元：

αD半乳糖p(1-2)-αD甘露糖p(1-4)-αL鼠李糖p(1-3)

α泰威糖p(1-3)

更具体地说，本发明的一个主题是包含至少一种下面结构式的寡糖的免疫原性复合物其中Gal表示半乳糖

Man表示甘露糖

Rha鼠李糖

Tyv表示泰威糖以及n可在1至24之间变化。

优选地，n可在1至5之间变化，且寡糖与具有SEQ ID No.2,ID No.4,ID NO.6或ID NO.8序列之一，或与SEQ ID NO.2,ID NO.4或ID NO.6或ID NO.8序列之一具有至少80％相似性的蛋白质偶联。

本发明的还有一个主题是如上定义的免疫原性复合物在制备疫苗中的用途；根据一个尤其有利的方面，该复合物可用于制备用来保护动物抵抗由属于抗原血清组O:9的沙门氏菌属细菌导致的感染的疫苗。

可使用在上式中n具有不同值的寡糖的混合物。

根据本发明的免疫原性复合物还为包含沙门氏菌荚膜抗原的那些。后者可单独偶联至如上所定义的载体蛋白上，或与包含其它寡糖或多糖表位的复合物结合。

本发明的还有一个主题为包含至少一种如上定义的寡糖和/或抗原复合物的药物组合物。它们还可包含本领域技术人员已知的其它免疫佐剂和其制备所需的药物学可接受的赋形剂，如稀释剂，稳定剂，防腐剂等。

根据一个有利的方面，本发明涉及包含与载体蛋白偶联的膜寡糖，并另外包含另一抗原决定簇的疫苗。尤其是，疫苗包含沙门氏菌荚膜抗原，如荚膜抗原Vi(部分乙酰化的N-乙酰基半乳糖醛酸的均聚物)；这使得有可能增强疫苗的抗具荚膜细菌的功效。

免疫原性复合物的制备方法可包括下列步骤：a)从膜脂多糖中分离沙门氏菌寡糖，b)任选地，纯化寡糖以使寡糖保持相同的分子量，c)将寡糖化学活化，d)将活化的寡糖偶联至载体蛋白上以形成免疫原性复合物。

根据一个优选方面，在步骤d)之前，通过化学方法活化载体蛋白以利于偶联。

用形成包含异硫氰酸苯基胺的衍生物来活化寡糖以及将该衍生物与蛋白偶联的方法可如下所述来进行：-McBroom C.R.等(1972，在“酶学方法”，28B卷，V.Ginsburg编(Academic Press，纽约)，PP.212-219)，或-Svenson S.B.和Lindberg A.A.(1979，免疫学方法25,323-335)。

为了活化寡糖并接着将获得的衍生物与蛋白偶联，可采用其它方法：包括硼氢化钠和氰基硼氢化钠，己二酸二酰肼等方法。

偶联尤其可按照下面方案进行：

可用不同大小的寡糖进行偶联。这些寡糖由酶促裂解所释放(噬菌体的内切鼠李糖酶活性)，因此这优选4的倍数：四糖，八糖，十二糖，十六糖和二十糖等。同样，这些寡糖的混合物(没有预先纯化)的偶联包括在本发明中。

接着可进一步进行另一步骤，即将在步骤d)未获得的复合物与其它沙门氏菌抗原决定簇偶联。

本发明的主题还有包含SEQ ID NO.2、4、6或8序列之一的蛋白在增强寡糖的免疫原性中的用途。

本发明还包括其中至少一个氨基酸被SEQ ID NO.2,4,6或8中的同源氨基酸取代的类似蛋白质的用途。

考虑遗传密码的简并性，这些蛋白尤其被具有SEQ ID NO.1,3,5或7序列之一的DNA序列或其等价序列所编码。

SEQ ID NO.2代表蛋白P40的全部序列。

还可使用称为LP40的重组蛋白(SEQ ID NO.4)，其中该蛋白另外包含包括色氨酸操纵子的前导序列的一部分的9氨基酸肽。

最后，SEQ ID NO.5和6对应于完整的跨膜部分(ΔP40F8)，并缺乏高免疫原性的周质部分(Puohiniemi,R.,Karvonen,M.,Vuopio-Varkila,J.,Muotiala,A.,Helander,I.M.和Sarvas,M.,1990，感染免疫学58,1691-1696)。

SEQ ID NO.8对应于链球菌G蛋白的人血清白蛋白结合区。

下面的实施例意在说明本发明，而不以任何方式限制其范围。

在这些实施例中，将参考下面的附图：

图1：证明P40-二十糖偶联物在小鼠中的免疫原性。

图2：证明P40-二十糖偶联物在兔中的免疫原性。

实施例1：天然P40蛋白的分离和纯化

通过在存在去污剂时，从肺炎克雷伯氏菌生物量中提取，并接着通过阴离子交换层析和随后的阳离子交换层析从由此获得的提取物中纯化来分离肺炎克雷伯氏菌主要外膜蛋白P40蛋白。1.1.材料和方法1.1.1.膜蛋白的提取

用纯乙酸将肺炎克雷伯氏菌(菌株I-145,40-340g干细胞，7-10％干细胞)的pH调至pH2.5。在加入0.5体积的包含6％西曲溴铵(去污剂)，60％乙醇，1.5M CaCl₂(最终浓度为2％西曲溴铵，20％乙醇，0.5M CaCl₂)的溶液后，将pH调至2.5并在室温下将混合物搅拌16小时。1.1.2.澄清步骤

4℃下，以15,000g离心20分钟后，除去沉淀。上清为肺炎克雷伯氏菌膜蛋白的提取物。1.1.3.膜蛋白的沉淀

-20℃下，通过加入3体积95％乙醇(乙醇最终浓度为80％)沉淀上清中的蛋白。迅速搅拌后，在4℃下让混合物静置至少1小时。通过4℃下以10,000g离心10分钟回收沉淀的蛋白质。1.1.4.富含膜蛋白级分(MP级分)的制备

以5ml/g湿沉淀的量将沉淀重新悬浮在1％Zwittergent 3-14溶液中。搅拌1小时(推进式混合器)并借助于ultra-turrax(13,500rpm,30秒)研磨之后，用1N氢氧化钠将pH调至6.5。离心混合物，获得MP级分(去除不溶物)。1.1.5.阴离子交换层析步骤

4℃下，将MP蛋白对含0.1％Zwittergent 3-14的20mM Tris/HCl缓冲液pH8,0透析过夜。将透析液上样在包含强阴离子交换型载体(Biorad Macro Prep High Q凝胶)以15cm/小时线性流速平衡在上述缓冲液中的柱中。280nm处检测蛋白。以60cm/小时的线性流速，用包含0.1％Zwittergent 3-14的20mM Tris/HCl缓冲液pH8.0中0.2M NaCl浓度洗脱蛋白。1.1.6.阳离子交换层析步骤

混合包含P40蛋白的级分并超滤浓缩，对于100ml水平的体积采用YM10型的Diaflo膜(10KDa阈值)和Amicon搅拌室系统；对于更大的体积则采用具有10KDa阈值的膜片和Millipore Minitan切向流过滤系统。4℃下，将由此浓缩的级分对包含0.1％Zwittergent 3-14的20mM柠檬酸缓冲液pH3.0透析过夜。将透析液放上样在平衡在包含0.1％Zwittergent 3-14的20mM柠檬酸缓冲液pH3.0中的包含强阳离子交换型载体(Biorad Macro Prep High S凝胶)的柱中。用0.7M NaCl浓度洗脱P40蛋白(速率为61cm/小时)。混合含P40的级分并如上所述进行浓缩。1.2.结果

用SDS-PAGE分析各次层析步骤后获得的级分以混合包含P40蛋白的那些。

每一步骤后，根据LOWRY方法测定蛋白的量。通过SDS-PAGE，用考马氏兰和硝酸银染色，来估测P40蛋白的纯度和均一性。

在纯化步骤末，浓缩P40以获得5-10mg/ml水平的蛋白浓度。电泳图揭示其纯度大于90％。

免疫印迹后，用在小鼠中获得抗P40单克隆抗体特异性识别该蛋白。

用管式胶凝法或LAL(鲎变形细胞溶解物)试验估测污染脂多糖(内毒素)的存在。在最终溶液中进行的该试验揭示出少于160EU/ml的内毒素水平，从而表明所述溶液满足欧洲规定的标准。实施例2：重组P40蛋白的克隆、表达和纯化2.1.材料和方法2.1.1.肺炎克雷伯氏菌OmpA基因的克隆

从肺炎克雷伯氏菌LD 199的OmpA的公开序列部分(Lawrence J.G.等，1991，普通微生物学杂志137,1911-1921)，不同肠细菌(大肠杆菌，鼠伤寒沙门氏菌，粘质沙雷氏菌，痢疾志贺氏菌，产气肠杆菌)的OmpA序列排列对比产生的共有序列以及根据Edman法进行序列测定而获得的肽序列，从肺炎克雷伯氏菌I-145分离的天然蛋白以及在用溴化氰消化后分离的肽序列来确定核苷酸引物。

根据亚磷酰胺化学方法，借助于Pharmacia Gene Assembler Plus设备合成寡核苷酸。

将肺炎克雷伯氏菌I-145菌落在10μl溶菌缓冲液(25mM TapspH9.3,2mM MgCl₂)中进行溶菌。接着将1μl该溶液用作PCR扩增反应的DNA来源。在100μl具有5pmol各种引物和一酶单位的Taq聚合酶(Perclin Elmer Cetus)的扩增缓冲液中进行扩增。每次循环包括95℃，30秒的变性步骤，接着用DNA与引物杂交以及72℃下延伸1分钟。借助于Perkin Elmer Cetus Gen Amp PCR 9000热循环仪如此进行30次循环。将肺炎克雷伯氏菌OmpA基因克隆至载体pRIT28中(Hultman T.等，1988，核苷核苷酸7,629-638)，该载体拥有氨苄青霉素抗性基因，大肠杆菌和F1噬菌体的复制起点以及大肠杆菌Lac-Z基因(β-半乳糖苷酶)的一部分。

借助于Applied Biosystem自动测序仪373DNA测序仪对由此克隆的片段进行测序。根据供应商的建议，借助于染料终止子试剂盒进行测序反应。2.1.2.包含肺炎克雷伯氏菌OmpA基因的表达载体的构建

接着将P40蛋白的全长基因克隆至可在色氨酸操纵子存在下被诱导的、带有卡那霉素抗性基因和具有两个BsmⅠ和SalⅠ限制性位点的表达载体pTrp中。

为了克隆，通过PCR将BsmⅠ限制性位点在已在下游具有SalⅠ位点的P40基因的上游导入载体pRIT28P40中。接着将具有BsmⅠ/SalⅠ位点的P40基因克隆至载体pTrp中以构建质粒pTrpLP40。2.1.3.LP40蛋白的表达

让融合蛋白LP40在大肠杆菌中表达并以包含体形式产生。它包括全长肺炎克雷伯氏菌OmpA序列，其中应在N-末端水平上加上一个包含在大肠杆菌中表达蛋白所必需的色氨酸操纵子的前导序列一部分的8个氨基酸的肽(肽L)。

在大肠杆菌RRIΔM15中进行LP40蛋白的表达(Ruther,U.,1982,核酸研究10 5765-5772)。37℃下，在存在30μg/ml卡那霉素下在补充有酵母提取物的胰蛋白酶酶解大豆肉汤基本培养基(TSB培养基)中进行预培养过夜。在存在过量色氨酸时(100μg/ml)，载体的操纵子区被封闭。

580nm下读取光密度后，稀释培养物以在前面的培养基(含酵母提取物和卡那霉素的TSB培养基)中获得光密度值1。通过以25μg/ml的最终浓度加入吲哚丙烯酸(色氨酸类似物)来诱导LP40蛋白的合成。37℃下，将培养物搅拌5小时。2.1.4.LP40蛋白的复性和纯化

离心后(4000rpm,10分钟，4℃)，将细胞重新悬浮在25mMTris-HCl缓冲液pH8.5中。超声处理使包含体释放。

将离心(4℃,10,000g,25分钟)获得的包含体的沉淀溶解在含5mM MgCl₂的25mM Tris-HCl缓冲液pH8.5中，并接着离心(10,000g,15分钟)。通过37℃下，将包含体在包含7M盐酸胍或尿素(变性剂)和10mM二硫苏糖醇(二硫桥还原)的25mM Tris-HCl缓冲液pH8.5中保温2小时而获得蛋白的复性。离心(10,000g,15分钟)使去除包含体的不溶性部分。

在用13体积的含NaCl(8.76g/L)和Zwittergent 3-14(0.1％W/V)的25mM Tris-HCl缓冲液pH8.5稀释后，室温下，搅拌并与空气接触下，将混合物放置过夜(通过稀释复性以及二硫桥的重新氧化)。

在再次离心后，4℃下，将样品对含0.1％Zwittergent 3-14的25mM Tris-HCl缓冲液pH8.5(100体积的缓冲液)透析过夜。如上所述，在Biorad Macro Prep High Q载体上进行阴离子交换层析(实施例1)。混合含LP40蛋白的级分，并接着通过超滤将其浓缩，然后在4℃下，对含0.1％Zwittergent 3-14的20mM柠檬酸缓冲液pH3(100体积的缓冲液)透析过夜。如实施例1中所描述，在Biorad Macro Prep High Q载体上进行阳离子交换层析步骤。混合含LP40的级分并随后超滤浓缩。2.2结果

肺炎克雷伯氏菌OmpA基因(P40)包含1008个碱基对(SEQ IDNO.1)，编码335个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO.2)。

LP40基因本身包含1035个碱基对(SEQ ID NO.3)，编码344个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO.4)。至于OmpA基因部分，在编码C末端部分的两个氨基酸的末端水平上观察到一些不同。实际上这些不同仅涉及三个核苷酸。它们是位置1027(P40序列的位置1000处，C代替G)，1028(P40序列的位置1001处，A代替C),1032(P40序列的位置1005处，C代替T)的核苷酸。这些修饰是由于在将OmpA基因克隆至载体pRIT28中时，使用了部分简并的寡核苷酸引物(Kpn14序列)：5′ATAGTCGACAACTTA A(G)G(C)CCTGCGGCTGAG3′。基因序列的这些修饰导致了P40与在大肠杆菌中表达和产生的LP40的肽序列之间的单一差别，它为LP40序列位置343处的氨基酸，其为谷氨酰胺(Gln)残基，而在LP40序列(位置334)中发现为丙氨酸(Ala)残基。

从1升培养物开始，一个变性-复性循环可获得300mg蛋白(用Lowry法估测)。在两次层析步骤后，75mg LP40被纯化。

如上，在纯化后浓缩LP40蛋白以获得5至10mg/ml的最终浓度。电泳图表明95％左右的纯度。免疫印迹后，该蛋白被在小鼠中获得的抗天然P40单克隆抗体特异性地识别。

用SDS-PAGE监测蛋白质的状况。取决于它的形式，即变性的或为天然的，从肺炎克雷伯氏菌膜中提取的P40蛋白具有特征性的电泳(迁移)行为。天然形式(β-折叠片结构)确实具有比在变性剂如尿素或盐酸胍作用下或在存在SDS时在100℃加热的变性形式(α螺旋结构)具有更低的分子量。无泡复性是在不存在或存在0.1％(W/V)Zwittergent 3-14下进行的，在复性后，LP40蛋白均未被适当地复性。另一方面，在对含0.1％(W/V)Zwittergent 3-14的25mM Tris-HCl缓冲液pH8.5透析后获得了完全的复性。然而，应注意到仅当稀释步骤和室温下的处理本身是在存在Zwittergent 3-14下进行的时才获得这种复性(不存在去污剂时为阴性结果)。实施例3：P40蛋白跨膜部分的克隆，表达和纯化

为了克隆对应于缺乏P40蛋白周质部分的全部跨膜部分的基因部分，合成了与编码此基因部分的C-末端部分的末端互补的寡核苷酸，即称为片段F8的P40蛋白的氨基酸1和179之间的序列。

通过PCR，从载体pRIT28P40的小量制备DNA扩增对应于所需片段的基因序列，并纯化及克隆至相同载体中。进行测序以验证扩增中没有突变发生。

接着，如上所述(实施例2)将该基因克隆至载体pTrp中以构建质粒pTrppLΔP40F8。

在用载体pTrppLΔP40F8转染后，在大肠杆菌RRI中表达融合蛋白LΔP40F8。在一个变性/复性循以后，如上所述用阴离子交换层析，接着用阳离子交换层析将其纯化(实施例1)。

蛋白LΔP40F8的基因包含567个碱基对(SEQ ID NO.5)，编码118个氨基酸的蛋白(SEQ ID NO.6)。实施例4：BB蛋白的表达和纯化4.1.材料的方法4.1.1.BB蛋白的表达

将BB蛋白的基因克隆至可由色氨酸操纵子基因的存在而诱导的、带有氨苄青霉素和四环素抗性基因并拥有大肠杆菌中的复制起点的表达载体pva中。在大肠杆菌RV308(菌株ATCC 31608)中表达并以包含体形式产生BB蛋白。

将感受态大肠杆菌RV308菌株用载体pvaBB转化。37℃下，在存在四环素(8μg/ml)和氨苄青霉素(200μg/ml)时，在补充有酵母提取物的胰蛋白酶酶解大豆肉汤基本培养基(TSB培养基)中，进行预培养过夜。在存在过量色氨酸时(100μg/ml)，载体的操纵子区被封闭。

500nm下读取光密度后，稀释培养物以在前述培养基(含酵母提取物和四环素/氨苄青霉素的TSB培养基)中获得光密度值1。通过以最终浓度25μg/ml加入吲哚丙烯酸(色氨酸类似物)来诱导BB蛋白的合成。37℃下，将培养物搅拌5小时。4.1.2.BB蛋白的复性和纯化

将离心(4℃,10,000g,25分钟)获得的包含体沉淀溶解在含5mMMgCl₂的25mM Tris-HCl缓冲液中，并离心(10,000g,15分钟)。通过37℃下将包含体在含7M盐酸胍(变性剂)和10mM二硫苏糖醇(二硫桥的还原)的25mM Tris-HCl缓冲液pH8.5中保温2小时来实现蛋白的变性。离心(10,000g,15分钟)以除去包含体中的不溶性部分。

在用13体积的含NaCl(8.76g/L)和Zwittergent 3-14(0.1％W/V)的25mM Tris-HCl缓冲液pH8.5稀释之后，室温下，搅拌并与空气接触下，将混合物放置过夜(通过稀释复性和二硫桥的重新氧化)。

在再次离心后，通过在HSA-Sepharose载体上的亲和层析纯化BB蛋白(通过人血清白蛋白偶联至“CNBr-活化的Sepharose 4B”Pharmacia凝胶上来制备载体)。注射后(速低流)，用含0.2M NaCl,0.05％Tween 20和1mM EPTA的25mM Tris-HCl缓冲液pH8.5来洗脱未结合的蛋白。保留在载体上的BB蛋白用0.5M乙酸溶液pH2.7洗脱。混合含感兴趣蛋白的级分并接着超滤浓缩。4.2.结果

BB蛋白的基因包含774个碱基对(SEQ ID NO.7)，编码257个氨基酸的蛋白(SEQ ID NO.8)。

从N-末端开始，表达的蛋白包含(见SEQ ID NO.7)。-肽L，氨基酸1-8，-肽E′，氨基酸9-14，-接头肽，氨基酸15-23，-BB蛋白，氨基酸24-257。

产生的蛋白具有约29KDa的分子量(用SDS-PAGE分析)。实施例5：来自脂多糖的肠炎沙门氏菌寡糖的分离和纯化4.1.脂多糖的制备(LPS)

37℃下剧烈搅拌下，将肠炎沙门氏菌SH 1262细菌培养在10升发酵罐中的Ty培养基中，pH=7.0。加入1％甲醛杀死细胞并在4℃下，通过以4000g离心20分钟回收。在PBS中洗涤及如上进行的再次离心后，以20mg(干重)/ml水平的浓度重新悬浮沉淀。用苯酚法(Westphal O.,Lüderitz O.和Bister F.,1952,Z.Naturforsch.7,148-155)提取LPS，回收水相并冷冻干燥。

通过在100℃下在存在0.15M氢氧化钠下处理2小时，在脂质部分(脂质A)的水平上水解磷酸和酯键来制备已是部分无脂质的LPS。离心后，将pH调至3.5，并通过用氯仿连续提取而除去游离脂肪酸。将pH调至7.0，然后将已无脂质的LPS对水进行透析，并最后冷冻干燥。4.2.寡糖的制备

使用与细菌噬菌体P36相关的内切鼠李糖酶活性，从已被制成部分无脂质的LPS中制备寡糖。

将上面获得的LPS加入含P36噬菌体的透析管中，其中透析管已事先以1g LPS/10⁴p.f.u.噬菌率的比例对5mM碳酸铵缓冲液pH7.1进行了透析。37℃下，对600-800mL前述缓冲液进行透析。50小时后，更换透析浴并将透析再重复另外约40小时。接着混合两次对流透析溶液并用旋转蒸发仪浓缩。

用分子筛层析分级分离寡糖。将浓缩的寡糖上样在Biogel P2或P4(Biorad,200-400目)柱(2.5×170cm)中，用水洗脱(流速为8.5ml/小时)。用苯酚(+磺酸)法检测含寡糖的级分。在用薄层层析分析级分后，混合含不同异构体的级分并接着冷冻干燥。用核磁共振和质谱测定获得的寡糖的纯度。实施例6：从肠炎沙门氏菌脂多糖分离的寡糖与P40蛋白的偶联

将寡糖(10-40mg)溶解在0.5mL水中。将该寡糖溶液搅拌下滴加至含20mg氰基硼氢化钠的用水稀释(V/V)的1ml对氨基苯乙胺溶液中。在用1N NaOH将pH调至8.0后，室温下将反应混合物放置24小时。通在Biogel P2柱上凝胶过滤除去过量的试剂。回收含衍生寡糖的级分，借助于旋转蒸发器浓缩至干，并接着将寡糖溶解在3ml 80％乙醇中。

加入200μl稀释在80％乙醇(1V/3V)中的硫光气溶液使得产生异硫氰酸-对氨基苯乙氨基-寡糖衍生物。借助于1M氢氧化钠的80％乙醇溶液维持pH。室温2小时后，反应完成，通过氯仿提取(消除硫光气)从过量试剂中分离衍生的寡糖。将水相浓缩至干并将寡糖溶解在0.5ml包含0.1％Zwittergent 3-14的0.1M碳酸氢钠缓冲液pH8.2中。

将溶解在含0.1％Zwittergent 3-14的0.1M碳酸氢钠缓冲液pH8.2(2.3ml,5mg/ml左右的浓度)中的P40(LP40或ΔP40F8)蛋白连续搅拌下滴加至寡糖中。用1M氢氧化钠将pH调至8.7并在室温下将反应混合物放置48小时。借助于装备有具有30KDa阈值的Diaflo膜的Amicon搅拌室，通过几次稀释和浓缩来去除未偶联的寡糖。将获得的偶联物对含0.1％Zwittergent 3-14的1升PBS缓冲液透析几次。在通过使用苯酚(+磺酸)的分析法测定寡糖的量及用Lowry法测定蛋白量后确定取代的水平，将偶联物贮存于-20℃。

在偶联物P40-二十糖情况下，通过对蛋白质和寡糖的分析测得取代程度为5.3摩尔二十糖/摩尔P40。该值与偶联物的SDS-PAGE之后测定的值一致。实施例7：P40/二十糖偶联物在小鼠中的免疫原性的证明6.1.材料和方法

在第0,14和21天免疫小鼠(NMRI雌性，1S 20g,6只/批)。每只小鼠接受了0.5ml实施例3中制备的偶联物。在存在或不存在完全弗氏佐剂时注射偶联物(10μg)，经腹膜内途径进行注射。在第0和35天用穿刺以集血样。用ELISA法评价收集的各血清中的抗体应答。在BSA-六糖载体上分离血清中的抗二十糖IgG，并借助于用碱性磷酸酶标记的抗小鼠IgG抗血清来进行显示。在405nm处测定光密度。6.2.结果

在存在完全弗氏佐剂时注射时，从第35天(3次免疫)P40/二十糖偶联物能诱导针对寡糖的高应答：抗体效价接近于1/1×10⁵。

如图1所示，当在不存在佐剂进行免疫时维持该效价。实际上抗寡糖抗体效价在1/1×10⁴至1/1×10⁵之间。实施例8：P40/二十糖偶联物在兔中的免疫原性的证明7.1.材料和方法

在第0,14和28时免疫兔子(新西兰白兔，2-3kg)。在存在(V/V)或不存在完全弗氏佐剂时，将P40/寡糖偶联物(10μg)注射至动物的腘淋巴结中。在第0,14,28和56天时，收集血样，用ELISA法评价各血清的抗体应答。将滴定板用2种不同抗原包被：P40蛋白和从中产生与P40偶联的寡糖的LPS。借助于用碱性磷酸酶标记的抗兔IgG偶联物来显示抗体。405nm处测定光密度。7.2.结果

当被P40蛋白呈递时，在存在弗氏佐剂下，二十糖诱导针对其来源脂多糖的高应答：效价大于1/1×10⁶。

在不存在佐剂时，当它被P40呈递时，针对二十糖的应答低于存在佐剂时所获得的，但明显高于注射BSA-二十糖偶联物所诱导的。图2代表针对与P40蛋白偶联的二十糖的来源LPS进行ELISA分析的结果。56天后，抗体效价大于1/10,000。实施例9：被动免疫后小鼠中的攻击实验8.1.材料和方法

给小鼠(NMRI雌性，20g,6只/批)经静脉内途径注射0.2ml在上面实施例5描述的条件下(不存在佐剂时注射，在第56天收集血清)进行一次免疫循环之后在兔中获得的超免疫血清。

在注射超免疫血清2-3小时后，用肠炎沙门氏菌SH2204细菌攻击。经腹膜内途径将细菌注射至动物中。使用三种不同剂量：1.3-13和52倍LD 50(LD50=2.6×10⁵细胞/毫升)。观察小鼠达注射后60天。8.2.结果

用P40-二十糖偶联物免疫后在兔中获得的抗体在静脉内途径注射后能保护小鼠抵抗肠炎沙门氏菌的感染。在通过注射1.3和13倍LD50水平的剂量进行的攻击之后60天，所有小鼠均存活(表1)，而52×LD50的剂量是过量的(动物死亡)表1：在用超免疫血清被动免疫或用P40-二十糖偶联物免疫后在小鼠中的攻击实验。在经腹膜途径注射一定剂量的肠炎沙门氏菌细菌之后60天仍存活的动物百分数测定：

肠炎沙门氏菌的剂量	被动免疫后的攻击	免疫后的攻击
肠炎沙门氏菌的剂量	被动免疫后的攻击	免疫后的攻击	1.3×LD50	100％	100％
13×LD50	100％	100％	1.3×LD50	100％	100％
13×LD50	100％	100％	52×LD50	0	0

实施例10：在用P40/二十糖偶联物免疫后在小鼠中的攻击实验9.1.材料和方法

如实施例4中所描述的，在不存在佐剂时，用P40/二十糖偶联物免疫小鼠(NMRI雌性，20g,6只/批)。

在第42天，如上面实施例6中所描述的，用肠炎沙门氏菌SH 2204细菌进行攻击。9.2结果

用P40-二十糖偶联物接种能直接保护小鼠抵抗肠炎沙门氏菌的攻击。用该偶联物免疫的确使得可能将LD50增加至少10倍(表1)，在这种情况下，LD50可能大于3.4×10⁶/ml。附图说明图1：

图2：

序列表(1)一般信息：(ⅰ)申请人：

(A)名称：PIERRE FABRE MEDICAMENT

(B)街道：45 PLACE ABEL GANCE

(C)城市：BOULOGNE

(E)国家：法国

(F)邮编：92100(ⅲ)序列数目：8(ⅳ)计算机可读形式：

(A)介质类型：软盘

(B)计算机：Apple Macintosh

(C)操作系统：MAC OS Systeme 7(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征：

(A)长度：1008碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：DNA(ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：1..1008 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1:GCT CCG AAA GAT AAC ACC TGG TAT GCA GGT GGT AAA CTG GGT TGG TCC 48Ala Pro Lys Asp Asn Thr Trp Tyr Ala Gly Gly Lys Leu Gly Trp Ser1 5 10 15CAG TAT CAC GAC ACC GGT TTC TAC GGT AAC GGT TTC CAG AAC AAC AAC 96Gln Tyr His Asp Thr Gly Phe Tyr Gly Asn Gly Phe Gln Asn Asn Asn

20 25 30GGT CCG ACC CGT AAC GAT CAG CTT GGT GCT GGT GCG TTC GGT GGT TAC 144Gly Pro Thr Arg Asn Asp Gln Leu Gly Ala Gly Ala Phe Gly Gly Tyr

35 40 45CAG GTT AAC CCG TAC CTC GGT TTC GAA ATG GGT TAT GAC TGG CTG GGC 192Gln Val Asn Pro Tyr Leu Gly Phe Glu Met Gly Tyr Asp Trp Leu Gly

50 55 60CGT ATG GCA TAT AAA GGC AGC GTT GAC AAC GGT GCT TTC AAA GCT CAG 240Arg Met Ala Tyr Lys Gly Ser Val Asp Asn Gly Ala Phe Lys Ala Gln65 70 75 80GGC GTT CAG CTG ACC GCT AAA CTG GGT TAC CCG ATC ACT GAC GAT CTG 288Gly Val Gln Leu Thr Ala Lys Leu Gly Tyr Pro Ile Thr Asp Asp Leu

85 90 95GAC ATC TAC ACC CGT CTG GGC GGC ATG GTT TGG CGC GCT GAC TCC AAA 336Asp Ile Tyr Thr Arg Leu Gly Gly Met Val Trp Arg Ala Asp Ser Lys

100 105 110GGC AAC TAC GCT TCT ACC GGC GTT TCC CGT AGC GAA CAC GAC ACT GGC 384Gly Asn Tyr Ala Ser Thr Gly Val Ser Arg Ser Glu Mis Asp Thr Gly

115 120 125GTT TCC CCA GTA TTT GCT GGC GGC GTA GAG TGG GCT GTT ACT CGT GAC 432Val Ser Pro Val Phe Ala Gly Gly Val Glu Trp Ala Val Thr Arg Asp

130 135 140ATC GCT ACC CGT CTG GAA TAC CAG TGG GTT AAC AAC ATC GGC GAC GCG 480Ile Ala Thr Arg Leu Glu Tyr Gln Trp Val Asn Asn Ile Gly Asp Ala145 150 155 160GGC ACT GTG GGT ACC CGT CCT GAT AAC GGC ATG CTG AGC CTG GGC GTT 528Gly Thr Val Gly Thr Arg Pro Asp Asn Gly Met Leu Ser Leu Gly Val

165 170 175TCC TAC CGC TTC GGT CAG GAA GAT GCT GCA CCG GTT GTT GCT CCG GCT 576Ser Tyr Arg Phe Gly Gln Glu Asp Ala Ala Pro Val Val Ala Pro Ala

180 185 190CCG GCT CCG GCT CCG GAA GTG GCT ACC AAG CAC TTC ACC CTG AAG TCT 624Pro Ala Pro Ala Pro Glu Val Ala Thr Lys His Phe Thr Leu Lys Ser

195 200 205GAC GTT CTG TTC AAC TTC AAC AAA GCT ACC CTG AAA CCG GAA GGT CAG 672Asp Val Leu Phe Asn Phe Asn Lys Ala Thr Leu Lys Pro Glu Gly Gln

210 215 220CAG GCT CTG GAT CAG CTG TAC ACT CAG CTG AGC AAC ATG GAT CCG AAA 720Gln Ala Leu Asp Gln Leu Tyr Thr Gln Leu Ser Asn Met Asp Pro Lys225 230 235 240GAC GGT TCC GCT GTT GTT CTG GGC TAC ACC GAC CGC ATC GGT TCC GAA 768Asp Gly Ser Ala Val Val Leu Gly Tyr Thr Asp Arg Ile Gly Ser Glu

245 250 255GCT TAC AAC CAG CAG CTG TCT GAG AAA CGT GCT CAG TCC GTT GTT GAC 816Ala Tyr Asn Gln Gln Leu Ser Glu Lys Arg Ala Gln Ser Val Val Asp

260 265 270TAC CTG GTT GCT AAA GGC ATC CCG GCT GGC AAA ATC TCC GCT CGC GGC 864Tyr Leu Val Ala Lys Gly Ile Pro Ala Gly Lys Ile Ser Ala Arg Gly

275 280 285ATG GGT GAA TCC AAC CCG GTT ACT GGC AAC ACC TGT GAC AAC GTG AAA 912Met Gly Glu Ser Asn Pro Val Thr Gly Asn Thr Cys Asp Asn Val Lys

290 295 300GCT CGC GCT GCC CTG ATC GAT TGC CTG GCT CCG GAT CGT CGT GTA GAG 960Ala Arg Ala Ala Leu Ile Asp Cys Leu Ala Pro Asp Arg Arg Val Glu305 310 315 320ATC GAA GTT AAA GGC TAC AAA GAA GTT GTA ACT CAG CCG GCG GGT TAA 1008Ile Glu Val Lys Gly Tyr Lys Glu Val Val Thr Gln Pro Ala Gly

325 330 335(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征：

(A)长度：335氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：蛋白质(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2:Ala Pro Lys Asp Asn Thr Trp Tyr Ala Gly Gly Lys Leu Gly Trp Ser GLn Tyr1 5 10 15His Asp Thr Gly Phe Tyr Gly Asn Gly Phe Gln Asn Asn Asn Gly Pro Thr Arg

20 25 30 35Asn Asp Gln Leu Gly Ala Gly Ala Phe Gly Gly Tyr Gln Val Asn Pro Tyr Leu

40 45 50Gly Phe Glu Met Gly Tyr Asp Trp Leu Gly Arg Met Ala Tyr Lys Gly Ser Val55 60 65 70Asp Asn Gly Ala Phe Lys Ala Gln Gly Val Gln Leu Thr Ala Lys Leu Gly Tyr

75 80 85 90Pro Ile Thr Asp Asp Leu Asp Ile Tyr Thr Arg Leu Gly Gly Met Val Trp Arg

95 100 105Ala Asp Ser Lys Gly Asn Tyr Ala Ser Thr Gly Val Ser Arg Ser Glu His Asp

110 115 120 125Thr Gly Val Ser Pro Val Phe Ala Gly Gly Val Glu Trp Ala Val Thr Arg Asp

130 135 140Ile Ala Thr Arg Leu Glu Tyr Gln Trp Val Asn Asn Ile Gly Asp Ala Gly Thr145 150 155 160Val Gly Thr Arg Pro Asp Asn Gly Met Leu Ser Leu Gly Val Ser Tyr Arg Phe

165 170 175 180Gly Gln Glu Asp Ala Ala Pro Val Val Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Glu

185 190 195Val Ala Thr Lys His Phe Thr Leu Lys Ser Asp Val Leu Phe Asn Phe Asn Lys

200 205 210 215Ala Thr Leu Lys Pro Glu Gly Gln Gln Ala Leu Asp Gln Leu Tyr Thr Gln Leu

220 225 230Ser Asn Met Asp Pro Lys Asp Gly Ser Ala Val Val Leu Gly Tyr Thr Asp Arg235 240 245 250Ile Gly Ser Glu Ala Tyr Asn Gln Gln Leu Ser Glu Lys Arg Ala Gln Ser Val

255 260 265 270Val Asp Tyr Leu Val Ala Lys Gly Ile Pro Ala Gly Lys Ile Ser Ala Arg Gly

275 280 285Met Gly Glu Ser Asn Pro Val Thr Gly Asn Thr Cys Asp Asn Val Lys Ala Arg

290 295 300 305Ala Ala Leu Ile Asp Cys Leu Ala Pro Asp Arg Arg Val Glu Ile Glu Val Lys

310 315 320Gly Tyr Lys Glu Val Val Thr Gln Pro Ala Gly325 330 335(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征：

(A)长度：1035碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：DNA(ⅸ)特征

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：1..1035(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:3:ATG AAA GCA ATT TTC GTA CTG AAT GCG GCT CCG AAA GAT AAC ACC TGG 48Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Asn Ala Ala Pro Lys Asp Asn Thr Trp1 5 10 15TAT GCA GGT GGT AAA CTG GGT TGG TCC CAG TAT CAC GAC ACC GGT TTC 96Tyr Ala Gly Gly Lys Leu Gly Trp Ser Gln Tyr His Asp Thr Gly Phe

20 25 30TAC GGT AAC GGT TTC CAG AAC AAC AAC GGT CCG ACC CGT AAC GAT CAG 144Tyr Gly Asn Gly Phe Gln Asn Asn Asn Gly Pro Thr Arg Asn Asp Gln

35 40 45CTT GGT GCT GGT GCG TTC GGT GGT TAC CAG GTT AAC CCG TAC CTC GGT 192Leu Gly Ala Gly Ala Phe Gly Gly Tyr Gln Val Asn Pro Tyr Leu Gly

50 55 60TTC GAA ATG GGT TAT GAC TGG CTG GGC CGT ATG GCA TAT AAA GGC AGC 240Phe Glu Met Gly Tyr Asp Trp Leu Gly Arg Met Ala Tyr Lys Gly Ser65 70 75 80GTT GAC AAC GGT GCT TTC AAA GCT CAG GGC GTT CAG CTG ACC GCT AAA 288Val Asp Asn Gly Ala Phe Lys Ala Gln Gly Val Gln Leu Thr Ala Lys

85 90 95CTG GGT TAC CCG ATC ACT GAC GAT CTG GAC ATC TAC ACC CGT CTG GGC 336Leu Gly Tyr Pro Ile Thr Asp Asp Leu Asp Ile Tyr Thr Arg Leu Gly

100 105 110GGC ATG GTT TGG CGC GCT GAC TCC AAA GGC AAC TAC GCT TCT ACC GGC 384Gly Met Val Trp Arg Ala Asp Ser Lys Gly Asn Tyr Ala Ser Thr Gly

115 120 125GTT TCC CGT AGC GAA CAC GAC ACT GGC GTT TCC CCA GTA TTT GCT GGC 432Val Ser Arg Ser Glu His Asp Thr Gly Val Ser Pro Val Phe Ala Gly

130 135 140GGC GTA GAG TGG GCT GTT ACT CGT GAC ATC GCT ACC CGT CTG GAA TAC 480Gly Val Glu Trp Ala Val Thr Arg Asp Ile Ala Thr Arg Leu Glu Tyr145 150 155 160CAG TGG GTT AAC AAC ATC GGC GAC GCG GGC ACT GTG GGT ACC CGT CCT 528Gln Trp Val Asn Asn Ile Gly Asp Ala Gly Thr Val Gly Thr Arg Pro

165 170 175GAT AAC GGC ATG CTG AGC CTG GGC GTT TCC TAC CGC TTC GGT CAG GAA 576Asp Asn Gly Met Leu Ser Leu Gly Val Ser Tyr Arg Phe Gly Gln Glu

180 185 190GAT GCT GCA CCG GTT GTT GCT CCG GCT CCG GCT CCG GCT CCG GAA GTG 624Asp Ala Ala Pro Vla Vla Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Glu Vla

195 200 205GCT ACC AAG CAC TTC ACC CTG AAG TCT GAC GTT CTG TTC AAC TTC AAC 672Ala Thr Lys His Phe Thr Leu Lys Ser Asp Val Leu Phe Asn Phe Asn

210 215 220AAA GCT ACC CTG AAA CCG GAA GGT CAG CAG GCT CTG GAT CAG CTG TAC 720Lys Ala Thr Leu Lys Pro Glu Gly Gln Gln Ala Leu Asp Gln Leu Tyr225 230 235 240ACT CAG CTG AGC AAC ATG GAT CCG AAA GAC GGT TCC GCT GTT GTT CTG 768Thr Gln Leu Ser Asn Met Asp Pro Lys Asp Gly Ser Ala Val Val Leu

245 250 255GGC TAC ACC GAC CGC ATC GGT TCC GAA GCT TAC AAC CAG CAG CTG TCT 816Gly Tyr Thr Asp Arg Ile Gly Ser Glu Ala Tyr Asn Gln Gln Leu Ser

260 265 270GAG AAA CGT GCT CAG TCC GTT GTT GAC TAC CTG GTT GCT AAA GGC ATC 864Glu Lys Arg Ala Gln Ser Val Val Asp Tyr Leu Val Ala Lys Gly Ile

275 280 285CCG GCT GGC AAA ATC TCC GCT CGC GGC ATG GGT GAA TCC AAC CCG GTT 912Pro Ala Gly Lys Ile Ser Ala Arg Gly Met Gly Glu Ser Asn Pro Val

290 295 300ACT GGC AAC ACC TGT GAC AAC GTG AAA GCT CGC GCT GCC CTG ATC GAT 960Thr Gly Ash Thr Cys Asp Asn Val Lys Ala Arg Ala Ala Leu Ile Asp305 310 315 320TGC CTG GCT CCG GAT CGT CGT GTA GAG ATC GAA GTT AAA GGC TAC AAA 1008Cys Leu Ala Pro Asp Arg Arg Val Glu Ile Glu Val Lys Gly Tyr Lys

325 330 335GAA GTT GTA ACT CAG CCG CAG GGC TAA 1035Glu Val Val Thr Gln Pro Gln Gly

340(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征：

(A)长度：344氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：蛋白质(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:4:Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Asn Ala Ala Pro Lys Asp Asn Thr Trp Tyr Ala1 5 10 15Gly Gly Lys Leu Gly Trp Ser Gln Tyr His Asp Thr Gly Phe Tyr Gly Asn Gly

20 25 30 35Phe Gln Asn Asn Asn Gly Pro Thr Arg Asn Asp Gln Leu Gly Ala Gly Ala Phe

40 45 50Gly Gly Tyr Gln Val Asn Pro Tyr Leu Gly Phe Glu Met Gly Tyr Asp Trp Leu55 60 65 70Gly Arg Met Ala Tyr Lys Gly Ser Val Asp Asn Gly Ala Phe Lys Ala Gln Gly

75 80 85 90Val Gln Leu Thr Ala Lys Leu Gly Tyr Pro Ile Thr Asp Asp Leu Asp Ile Tyr

95 100 105Thr Arg Leu Gly Gly Met Val Trp Arg Ala Asp Ser Lys Gly Asn Tyr Ala Ser

110 115 120 125Thr Gly Val Ser Arg Ser Glu His Asp Thr Gly Val Ser Pro Val Phe Ala Gly

130 135 140Gly Val Glu Trp Ala Val Thr Arg Asp Ile Ala Thr Arg Leu Glu Tyr Gln Trp145 150 155 160Val Asn Asn Ile Gly Asp Ala Gly Thr Val Gly Thr Arg Pro Asp Asn Gly Met

165 170 175 180Leu Ser Leu Gly Val Ser Tyr Arg Phe Gly Gln Glu Asp Ala Ala Pro Val Val

185 190 195Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Glu Val Ala Thr Lys His Phe Thr Leu Lys

200 205 210 215Ser Asp Val Leu Phe Asn Phe Asn Lys Ala Thr Leu Lys Pro Glu Gly Gln Gln

220 225 230Ala Leu Asp Gln Leu Tyr Thr Gln Leu Ser Asn Met Asp Pro Lys Asp Gly Ser235 240 245 250Ala Val Val Leu Gly Tyr Thr Asp Arg Ile Gly Ser Glu Ala Tyr Asn Gln Gln

255 260 265 270Leu Ser Glu Lys Arg Ala Gln Ser Val Val Asp Tyr Leu Val Ala Lys Gly Ile

275 280 285Pro Ala Gly Lys Ile Ser Ala Arg Gly Met Gly Glu Ser Asn Pro Val Thr Gly

290 295 300 305Asn Thr Cys Asp Asn Val Lys Ala Arg Ala Ala Leu Ile Asp Cys Leu Ala Pro

310 315 320Asp Arg Arg Val Glu Ile Glu Val Lys Gly Tyr Lys Glu Val Val Thr Gln Pro325 330 335 340Gln Gly(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征：

(A)长度：567碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：DNA(ⅸ)特征

(A)名称/关键词：CD5

(B)位置：1..567(ⅹi)序列描述：SEQ ID NO:5:ATG AAA GCA ATT TTC GTA CTG AAT GCG GCT CCG AAA GAT AAC ACC TGG 48Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Asn Ala Ala Pro Lys Asp Asn Thr Trp1 5 10 15TAT GCA GGT GGT AAA CTG GGT TGG TCC CAG TAT CAC GAC ACC GGT TTC 96Tyr Ala Gly Gly Lys Leu Gly Trp Ser Gln Tyr His Asp Thr Gly Phe

50 55 60TTC GAA ATG GGT TAT GAC TGG CTG GGC CGT ATG GCA TAT AAA GGC AGC 240Phe Glu Met Gly Tyr Asp Trp Leu Gly Arg Met Ala Tyr Lys Gly Ser65 70 75 80GTr GAC AAC GGT GCT TTC AAA GCT CAG GGC GTT CAG CTG ACC GCT AAA 288Val Asp Asn Gly Ala Phe Lys Aln Gln Gly Val Gln Leu Thr Aln Lys

165 170 175GAT AAC GGC ATG CTG AGC CTG GGC GTT TCC TAC CGC TAA 567Asp Asn Gly Met Leu Ser Leu Gly Val Ser Tyr Arg

180 185(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征：

(A)长度：188氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：蛋白质(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:6:Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Asn Ala Ala Pro Lys Asp Asn Thr Trp Tyr Ala1 5 10 15Gly Gly Lys Leu Gly Trp Ser Gln Tyr His Asp Thr Gly Phe Tyr Gly Asn Gly

165 170 175 180Leu Ser Leu Gly Val Ser Tyr Arg

185(2)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征：

(A)长度：774碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：DNA(ⅸ)特征

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：1..774(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:7:ATG AAA GCA ATT TTC GTA CTG AAT GCG CAA CAC GAT GAA GCC GTA GAC 48Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Asn Ala Gln His Asp Glu Ala Val Asp1 5 10 15GCG AAT TTC GAC CAA TTC AAC AAA TAT GGA GTA AGT GAC TAT TAC AAG 96Ala Asn Phe Asp Gln Phe Asn Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys

20 25 30AAT CTA ATC AAC AAT GCC AAA ACT GTT GAA GGC GTA AAA GAC CTT CAA 144Asn Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Asp Leu Gln

35 40 45GCA CAA GTT GTT GAA TCA GCG AAG AAA GCG CGT ATT TCA GAA GCA ACA 192Ala Gln Val Val Glu Ser Ala Lys Lys Ala Arg Ile Ser Glu Ala Thr

50 55 60GAT GGC TTA TCT GAT TTC TTG AAA TCA CAA ACA CCT GCT GAA GAT ACT 240Asp Gly Leu Ser Asp Phe Leu Lys Ser Gln Thr Pro Ala Glu Asp Thr65 70 75 80GTT AAA TCA ATT GAA TTA GCT GAA GCT AAA GTC TTA GCT AAC AGA GAA 288Val Lys Ser Ile Glu Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu

85 90 95CTT GAC AAA TAT GGA GTA AGT GAC TAT CAC AAG AAC CTA ATC AAC AAT 336Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr His Lys Asn Leu Ile Asn Asn

100 105 110GCC AAA ACT GTT GAA GGT GTA AAA GAC CTT CAA GCA CAA GTT GTT GAA 384Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Asp Leu Gln Ala Gln Val Val Glu

115 120 125TCA GCG AAG AAA GCG CGT ATT TCA GAA GCA ACA GAT GGC TTA TCT GAT 432Ser Ala Lys Lys Ala Arg Ile Ser Glu Ala Thr Asp Gly Leu Ser Asp

130 135 140TTC TTG AAA TCA CAA ACA CCT GCT GAA GAT ACT GTT AAA TCA ATT GAA 480Phe Leu Lys Ser Gln Thr Pro Ala Glu Asp Thr Val Lys Ser Ile Glu145 150 155 160TTA GCT GAA GCT AAA GTC TTA GCT AAC AGA GAA CTT GAC AAA TAT GGA 528Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly

165 170 175GTA AGT GAC TAT TAC AAG AAC CTA ATC AAC AAT GCC AAA ACT GTT GAA 576Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu

180 185 190GGT GTA AAA GCA CTG ATA GAT GAA ATT TTA GCT GCA TTA CCT AAG ACT 624Gly Val Lys Ala Leu Ile Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro Lys Thr

195 200 205GAC ACT TAC AAA TTA ATC CTT AAT GGT AAA ACA TTG AAA GGC GAA ACA 672Asp Thr Tyr Lys Leu Ile Leu Asn GLy Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr

210 215 220ACT ACT GAA GCT GTT GAT GCT GCT ACT GCA AGA TCT TTC AAT TTC CCT 720Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Arg Ser Phe Asn Phe Pro225 230 235 240ATC CTC GAG AAT TCC CGG GGA TCC GTC GAC CTG CAG CCA AGC TTA AGT 768Ile Leu Glu Asn Ser Arg Gly Ser Val Asp Leu Gln Pro Ser Leu Ser

245 250 255AAG TAALys(2)SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)序列特征：

(A)长度：257氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：蛋白质(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:8:Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Asn Ala Gln His Asp Glu Ala Val Asp Ala Asn1 5 10 15Phe Asp Gln Phe Asn Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Asn

20 25 30 35Asn Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Asp Leu Gln Ala Gln Val Val Glu Ser

40 45 50Ala Lys Lys Ala Arg Ile Ser Glu Ala Thr Asp GLy Leu Ser Asp Phe Leu Lys55 60 65 70Ser Gln Thr Pro Ala Glu Asp Thr Val Lys Ser Ile Glu Leu Ala Glu ALa Lys

75 80 85 90Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr His Lys Asn

95 100 105Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Asp Leu Gln Ala Gln Val

110 115 120 125Val Glu Ser Ala Lys Lys Ala Arg Ile Ser Glu Ala Thr Asp Gly Leu Ser Asp

130 135 140Phe Leu Lys Ser Gln Thr Pro Ala Glu Asp Thr Val Lys Ser Ile Glu Leu Ala145 150 155 160Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr

165 170 175 180Tyr Lys Asn Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Ala Leu Ile

185 190 195Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro Lys Thr Asp Thr Tyr Lys Leu Ile Leu Asn

200 205 210 215Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala

220 225 230Arg Ser Phe Asn Phe Pro Ile Leu Glu Asn Ser Arg Gly Ser Val Asp Leu Gln235 240 245 250Pro Ser Leu Ser Lys

255

Claims

1．免疫原性复合物，其特征在于它由至少一种天然存在于细菌中的、与选自链球菌的人血清白蛋白结合蛋白、革兰氏阴性菌的外膜蛋白或其片段的载体蛋白偶联的寡糖或多糖表位组成。

2．根据权利要求1的免疫原性复合物，其特征在于寡糖或多糖表位能从革兰氏阴性或革兰氏阳性菌获得。

3．根据权利要求1或2的免疫原性复合物，其特征在于寡糖或多糖表位选自能从沙门氏菌属、大肠杆菌属、奈瑟氏球菌属、志贺氏菌属、嗜血菌属或克雷伯氏菌属细菌的膜脂多糖和荚膜寡糖获得的寡糖。

4．根据权利要求1-3任一项的免疫原性复合物，其特征在于它包含至少一种能从沙门氏菌属细菌的膜脂多糖获得的基本纯化的寡糖。

5．根据权利要求4的免疫原性复合物，其特征在于寡糖可从属于带有选自下组的抗原特异性的血清组的沙门氏菌属细菌获得：O:1,O:2,O:4,O:6,7,8,O:3和O:9。

6．根据权利要求1-5任一项的免疫原复合物，其特征在于它包含一种能从具有O:9抗原特异性的肠炎沙门氏菌的脂多糖获得的寡糖。

7．根据权利要求1-6任一项的免疫原性复合物，其特征在于它包含至少一个如下单元：

αD半乳糖p(1-2)-αD甘露糖p(1-4)-αL鼠李糖p(1-3)

｜

c泰威糖p(1-3)

8．根据权利要求7的免疫原性复合物，其特征在于它包含至少一种下式的寡糖

其中GaL表示半乳糖

Man表示甘露糖

Rha表示鼠李糖

Tyv表示泰威糖以及n可在1至24之间变化。

9．根据权利要求1-8任一项的免疫原性复合物，其特征在于载体蛋白包含革兰氏阴性细菌OmpA型蛋白的至少一部分。

10．根据权利要求1-9任一项的免疫原性复合物，其特征在于载体蛋白包含肺炎克雷伯氏菌外膜蛋白的至少一部分。

11．根据权利要求1-10任一项的免疫原性复合物，其特征在于载体蛋白具有a)SEQ ID NO.2,ID NO.4或ID NO.6，或b)与a)中所述序列之一具有至少80％同源性的序列。

12．免疫原性复合物，其特征在于它由至少一种下式寡糖组成：其中Gal表示半乳糖

Man表示甘露糖

Rha表示鼠李糖

Tyv表示泰威糖以及n可在1至5之间变化，且该寡糖与具有SEQ ID NO.2,ID NO.4,IDNO.6或ID NO.8序列之一或与SEQ ID NO.2,ID NO.4或ID NO.6或IDNO.8之一具有至少80％相似性的蛋白偶联。

13．根据权利要求1-3任一项的免疫原性复合物，其特征在于它包含至少一种沙门氏菌荚膜抗原。

14．根据权利要求1-13任一项的免疫原性复合物在制备疫苗中的用途。

15．根据权利要求12的复合物在制备用于保护动物抵抗由属于抗原血清组O:9的沙门氏菌属细菌导致的感染的疫苗中的用途。

16．疫苗，其特征在于它包含根据权利要求1-12任一项的免疫原性复合物并且特征在于它还包括沙门氏菌的荚膜抗原。

17．根据权利要求1-12任一项的免疫原性复合物的制备方法，其特征在于a)从膜脂多糖中分离沙门氏菌寡糖，b)任选地，纯化寡糖以使寡糖保持相同的分子量，c)将寡糖化学活化，d)将活化的寡糖与载体蛋白偶联以形成免疫原性复合物。

18．根据权利要求17的方法，其特征在于在步骤d)之前用化学方法活化载体蛋白以利于偶联。

19．根据权利要求17或18的方法，其特征在于接着进行将在步骤d)末获得的复合物与其它沙门氏菌抗原决定簇偶联的另一步骤。

20．具有SEQ ID NO.2,4,6或8序列之一的蛋白质在增强寡糖免疫原性中的用途。