CN1379682A - 与rsv的致免疫肽结合的肠杆菌外膜蛋白a在制备经鼻内给药的疫苗中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及与由呼吸道合胞病毒(RSV)衍生的致免疫肽有关的肠杆菌的外膜蛋白A(OmpA)、特别是肺炎克雷白杆菌的蛋白P40在制备鼻内给药的药物组合物中的用途,设计该组合物可以诱导保护上呼吸道和下呼吸道(肺)对抗RSV感染的免疫反应。本发明还涉及所述化合物在制备预防和治疗RSV感染的疫苗中的用途。

Description

与RSV的致免疫肽结合的肠杆菌外膜蛋白A 在制备经鼻内给药的疫苗中的用途
本发明涉及与呼吸道合胞病毒(RSV)衍生致免疫肽结合的肠杆菌OmpA膜蛋白、特别是肺炎克雷白杆菌P40蛋白在制备药物组合物中的用途，所述的药物组合物可以经鼻给药并且能够诱导保护个体的上呼吸道和下呼吸道(肺部)对抗RSV的感染的免疫反应。本发明包括这些化合物在制备用于预防和治疗RSV感染的疫苗中的用途。
RSV是1岁内婴儿急性呼吸感染住院的最常见原因。患有喉-气管-支气管炎、毛细支气管炎和肺炎的儿童需要住院护理，并且在患有先天性心脏病的婴儿中，死亡率高于37％。其他疾病如支气管肺发育异常、肾病和免疫缺损同样是导致高死亡率的因素。RSV感染也可以是成年个体死亡的原因。
在温带国家中，RSV流行性表现为在十一月至四月的冬季中，在2至6个月的婴儿中出现严重疾病的发生率最高。利用RSV G糖蛋白的抗原变异可以区分出两种类型的RSV：RSV-A和RSV-B：亚型A和亚型B，它们并行散播。自1982-1990年间，法国的最新研究显示，在5年内一种亚型变化为另一种亚型。A菌株经常引起比B菌株更加严重的感染。
人RSV属于肺病毒属，其是副粘病毒科家族的一员。该病毒的基因组由具有负极性的非区段RNA链组成，编码10个不同的蛋白：NS1、NS2、N、P、M、SH(或IA)、G、F、M2(或22K)和L(Murphy等，VirusRes.32：13-36，1994)。
许多公开了的实验业已证实，参与保护作用的主要蛋白是：F、G和N。作为前体F0合成的F融合糖蛋白分裂为两个亚单位F1(48kDa)和F2(20kDa)，它们通过二硫键连接。F蛋白在RSV-A和RSV-B之间是保守的(91％同源性)。相反地，附着糖蛋白G在亚型之间却区别很大。只有13个氨基酸的区(aa614-aa176)是高度保守的，并且特别是在四个半胱氨酸残基的位置(173、176、182和186)上在所有人和牛RSV中保持不变。业已在动物模型上证实，两种糖蛋白F和G在抵抗RSV的保护作用中发挥着重要的作用。抗G和F的单克隆抗体能够在体外中和病毒，而且当被动给药时，它们保护棉鼠(cotton rat)免受RSV感染。在二十世纪六十年代，人们试图开发出常规疫苗，即甲醛灭活RSV，其与麻疹疫苗类似，但没有成功。这种疫苗的作用加强天然病毒性疾病，而不是给予接种的儿童保护作用。
对抗婴儿中由RSV所致疾病的恶化的现行疗法是通过吸出粘液来清除呼吸道的充血并且通过换气进行辅助呼吸。抗病毒剂利巴韦林似乎在严重感染的情况中有效。然而，其在儿科疗法中的用途仍然很难确定。利用抗RSV免疫球蛋白被动免疫是另一种治疗严重RSV感染的方法：业已观察到没有不良的副作用。然而，此类治疗非常昂贵且难以推测可以用于大规模治疗。
人们业已尝试了多种接种疫苗抵抗人RSV的方法：要么是疫苗虽然可以保护动物(大鼠、灵长类)免受RSV感染但会引起肺部病症，要么就是疫苗的致免疫性不足，并且无法起保护作用(ConNors等，Vaccine 10：475-484，1992)。根据现状来看，通过注射给药的亚单位疫苗可以产生有效的保护作用，但仅仅限于肺内，而不是在ORL范围内。特别可以提及公开号为WO 96/14415的PCT国际申请，其描述了一种皮下给药的RSV疫苗，其中含有与肺炎克雷白杆菌外膜蛋白P40偶联的RSV G蛋白片段；以及公开号为WO 96/14416的PCT国际专利申请，其描述了可以经腹膜内给药的RSV疫苗，其中含有与链球菌G蛋白的BB蛋白偶联的RSV G蛋白片段。
只有含减毒RSV的活疫苗经鼻给药才可以产生对ORL范围的保护作用。然而，这种方式有害，因为存在减毒株逆转的可能危险。
所以，目前对可以经鼻给药并且能够在肺和ORL范围内诱导抗人RSV的保护性反应的疫苗存在着巨大需要。
这恰恰是本发明的主题。
因此，本发明涉及与呼吸道合胞病毒(RSV)衍生致免疫肽结合的肠杆菌OmpA蛋白或其片段在制备药物组合物中的用途，所述的药物组合物可以经鼻给药并用来诱导保护个体的上呼吸道和/或下呼吸道(肺)对抗RSV感染的免疫反应。
优选地，按照本发明，所述诱导的免疫反应可以保护个体上呼吸道和下呼吸道(肺)对抗RSV感染。
在本发明中，术语“蛋白”表示肽或多肽，并且术语“OmpA”(“外膜蛋白”)是指外膜的A型蛋白。
术语表达“OmpA蛋白的片段”特别是指包含在OmpA蛋白的氨基酸序列中的任何氨基酸序列的片段，当RSV的致免疫肽结合时，任选地在免疫性的佐剂存在下，所述的OmpA蛋白能够产生或提高对抗所述致免疫肽的抗体型的免疫反应，所述的OmpA蛋白的片段含有所述OmpA蛋白的氨基酸序列中的至少10个连续氨基酸、优选至少15个连续氨基酸、或更优选至少20个连续氨基酸。
术语表达“呼吸道合胞病毒衍生致免疫肽”特别是指任何肽，其氨基酸序列包含由RSV表达的蛋白序列的至少5个连续氨基酸、优选至少10或15个连续氨基酸，所述的肽在其序列内含有抗原决定簇或表位，它们能够在预先用所述致免疫肽免疫的生物体中诱导对抗所述“B”表位的抗体型(B淋巴细胞依赖的)免疫反应。
本发明优选包含本发明的用途，其特征在于所述的肠杆菌为肺炎克雷白杆菌。
本发明的一个主题还在于本发明的用途，其特征在于所述的OmpA蛋白的氨基酸序列或其片段含有：a)序列SEQ ID No.2的氨基酸序列；b)在最适排列之后，具有与序列SEQ ID No.2至少80％、优选90％、95％或97％的百分同一性序列的氨基酸序列；或c)序列SEQ ID No.2的至少10个连续氨基酸的片段的氨基酸序列。
鉴于本发明的目的，术语两个核酸或氨基酸序列之间的“百分同一性”是指在最佳排列之后，被比较的两个序列之间相同的核苷酸或氨基酸残基的百分比；该百分比纯粹是统计学的，这两个序列之间的差异随机分布并且在其整个长度内。一般在其最佳排列之后通过比较这些序列可以完成两个核酸或氨基酸序列之间的序列比较，所述比较是通过区段或通过“比较窗”来实现的，目的是鉴定和比较序列局部区域的相似性。除了手动以外，利用Smith和Waterman的局部同源性算法(1981)[Ad.App.Math.2：482]、利用Neddleman和Wunsch的局部同源性算法(1970)[J.Mol.Biol.48：443]、利用Pearson和Lipman的相似性寻找方法(1988)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444]、利用使用这些算法的计算机程序(Wisconsin genetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Coumputer Group，575Scinece Dr.，Madison，WI)可以产生用于比较的序列的最佳排列。
通过比较上述两个序列可以测定两个核酸或氨基酸序列之间的百分同一性，这两个序列通过“比较窗”最佳化排列；其中核酸或氨基酸序列的被比较区域与用于该两个序列之间最佳化排列的参比序列相比可以含有附加或缺失。百分同一性可以通过测定相同位置的数目来计算，在这些相同位置上两个序列具有相同的核苷酸或氨基酸残基，将这个相同位置的数目除以比较窗中的位置总数并将所得结果乘以100，由此得到这两个序列之间的百分同一性。
在一个具体实施方案中，本发明包括本发明的肠杆菌OmpA蛋白或其片段的用途，其特征在于所述肠杆菌OmpA蛋白或其片段是利用提取的方法从所述肠杆菌的细胞获得的。
提取细菌膜蛋白的方法是该技术领域普通技术人员公知的，并且在本说明书中没有加以发展。可以提及但不限于例如J.H Haeuw等(Eur.J.Biochem.255，446-454，1998)所述的提取方法。
在另一优选实施方式中，本发明还包括本发明的肠杆菌OmpA蛋白或其片段的用途，其特征在于该肠杆菌OmpA蛋白或其片段或所述的致免疫肽是通过重组途径获得的。
现今制备重组蛋白的方法是该技术领域技术人员公知的并且在本说明书中没有加以发展，然而，可以参考实施例中所述的方法。在可以用来制备这些重组蛋白的细胞中，当然应该提及细菌细胞(Olins P.O.和Lee S.C.，1993，在大肠杆菌中异种基因表达的新进展(Recentadvances in heterologous gene expression in E.Coli.)Curr.OpBiotechNology，4：520-525)，还有酵母细胞(Buckholz R.G.，1993，用于异种基因产品表达的酵母系统(Yeast Systems for theExpression of Heterologous Gene Products.)Curr.Op.BiotechNology 4：538-542)，以及动物细胞，特别是哺乳动物细胞的培养物(Edwards C.P.和Aruffo A.，1993，基于瞬时表达系统的COS细胞的现行用途(Current applications of COS cell basedtransient expression systems.)Curr.Op.BiotechNology 4：558-563)，以及昆虫细胞，其中可以采用例如使用了杆状病毒的方法(Luckow V.A.，1993，Baculovirus systems for the expression ofhuman gene produscts.Curr.Op.BiotechNology 4：564-572)。
特别是，本发明涉及本发明的用途，其特征在于所述致免疫肽选自由RSV的G、F、M2或N蛋白衍生的肽，优选由G蛋白衍生的肽。
在本发明的一个优选实施方式中，所述致免疫肽是G蛋白的片段，含有B型表位。
包含在RSV G蛋白的片段内的术语“B型表位”特别是指G蛋白的片段的至少5、10或15个连续氨基酸的氨基酸序列，其能够诱导对抗所述氨基酸序列的抗体型(B-淋巴细胞-依赖的)免疫反应，特别是在序列SEQ ID No.1的P40 OmpA蛋白的存在下。
在本发明的一个特别优选的实施方式中，所述致免疫肽选自SEQID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9或SEQ ID No.11的肽，或在最适排列后具有与序列SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ IDNo.7、SEQ ID No.9或SEQ ID No.11至少80％、优选90％、95％或97％的百分同一性的氨基酸序列的肽。
本发明的一个主题还在于本发明的用途，其特征在于所述的致免疫肽与所述的肠杆菌OmpA蛋白或其片段偶联或混合。
另一方面，本发明涉及本发明的用途，其特征在于所述的药物组合物含有编码所述肠杆菌OmpA蛋白或其片段的核酸构建物，和/或编码所述致免疫肽的核酸构建物；所述核酸构建物含在表达载体中或者含在能够表达所述肠杆菌OmpA蛋白或其片段和/或所述致免疫肽的转化宿主细胞中。
本发明还涉及本发明的用途，其特征在于所述致免疫肽通过共价附着、特别是化学偶联与所述的OmpA蛋白或其片段偶联，由此形成杂合蛋白。
在一个具体实施方式中，本发明的用途的特征在于，一个或多个附着元件引入到所述OmpA蛋白或其片段和/或所述致免疫肽中，从而有助于化学偶联；优选地，引入的附着元件是氨基酸。
按照本发明，可以引入一个或多个附着元件，特别是氨基酸，目的在于促进OmpA蛋白或其片段与所述的致免疫肽之间的偶联反应。按照本发明，OmpA蛋白或其片段与所述的致免疫肽的共价偶联可以在OmpA蛋白或其片段的N-或C-末端进行。可以进行这种偶联的双官能试剂将作为OmpA蛋白或其片段的末端(其被选择用来进行偶联)的函数以及所述的将要被偶联的致免疫肽的性质的函数被确定。
在另一具体实施方式中，本发明用途的特征在于，通过所述致免疫肽和所述OmpA蛋白或其片段之间的共价偶联形成的杂合蛋白是融合蛋白，其通过用编码所述杂合蛋白的核酸构建物转化的细胞表达。
由所述致免疫肽和所述OmpA蛋白或其片段之间的共价偶联衍生的杂合蛋白可以通过基因重组制备。利用重组DNA技术、通过把编码所述致免疫肽的序列插入或加入到编码所述OmpA蛋白或其片段的DNA序列中，可以制备杂合或嵌合蛋白。
合成杂合分子的方法包括利用基因工程中用于构建编码所需多肽序列的杂交多核苷酸所采用的方法。有利地，可以参考例如D.V.Goeddel所述的获得编码融合蛋白的基因的技术(基因表达技术，酶学中的方法(Gene expression technology，Methods inEnzymology)，185卷，3-187，1990)。
本发明的优选特征在于，用来制备经鼻给药的本发明药物组合物的肠杆菌OmpA蛋白或其片段和所述呼吸道合胞病毒衍生致免疫肽是杂合蛋白形式，它是在序列SEQ ID No.2的肺炎克雷白杆菌p40蛋白，或经最适排列之后具有与序列SEQ ID No.2至少80％、优选90％、95％或97％的百分同一性的氨基酸序列的肺炎克雷白杆菌p40蛋白与SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9或SEQ ID No.11的RSV衍生致免疫肽，或经最适排列后具有与序列SEQ ID No.5、SEQID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9或SEQ ID No.11至少80％、优选90％、95％或97％的百分同一性的氨基酸序列的RSV衍生致免疫肽之间通过共价偶联、通过化学合成或通过基因融合得到的。
另一方面，本发明还涉及本发明的用途，其特征在于含有编码该杂合蛋白的核酸构建物，特别地它们含在表达载体中，或含在能够表达所述杂合蛋白的核酸构建物的转化宿主细胞中。
本发明的作者业已证实，所述的与RSV衍生致免疫肽结合的、特别是通过共价附着结合的OmpA蛋白、尤其是肺炎克雷白杆菌P40具有令人惊奇的增强一些上述致免疫肽的免疫反应的特性，无需一定要求助于加入佐剂。
所以，按照本发明，所述药物组合物在适当处含有免疫性的佐剂。
本发明还包含本发明的用途，其特征在于所述药物组合物以改善其稳定性和/或致免疫的形式被运载，特别是包封在脂质体中。
本发明优选包含本发明的用途，其特征在于所述载体是含有编码所述OmpA蛋白或其片段、所述致免疫肽或所述杂合蛋白的核酸构建物的病毒载体，或含有能够表达所述OmpA蛋白或其片段、所述致免疫肽或所述杂合蛋白的核酸构建物的转化宿主细胞。
更优选地，所述转化宿主细胞是细菌，其对于哺乳动物来说是非致病的，并且其所含有的核酸构建物还含有分泌所需要的元件，或在所述细菌膜、所述OmpA蛋白或其片段、所述致免疫肽或所述杂合蛋白的表面上表达所需要的元件。
最后，本发明涉及本发明在制备用于预防或治疗RSV感染的药物组合物，特别是疫苗组合物中的用途。
下列实施例用于举例说明本发明，但不以任何方式限定其范围。
在这些实施例中，可以参考附图，附图说明如下所述。
附图说明：图1：在序列SEQ ID No.2的重组P40蛋白(rP40)(37kDa)的、递减顺序的分子大小标记M(200、116、97.4、66、45、31和21.5kDa)的和SEQ ID No.4的P40G2Na蛋白(49kDa)的变性条件下的12％SDS PAGE凝胶。图2A至2C：对全身性IgG反应(图2A)和在幼鼠(图2B)或用肺炎克雷白杆菌预敏化小鼠(图2C)中的血清IgG的定型评估，所述预敏化小鼠接受3次40μg融合rP40的SEQ ID No.9的G2Na蛋白的鼻内给药(i.n.)。图3A和3B：经i.n.施用给BALB/c小鼠P40-G5偶联物的免疫原性。给幼鼠施用3次10μg与rP40偶联的G5等效物，每次给药间隔10天(图3A)，或者施用给用肺炎克雷白杆菌预敏化的小鼠(图3B)。末次免疫10天后，将动物穿刺放血，并且通过ELISA滴定抗G5的血清IgG。图4A和4B：BALB/c小鼠用P40G2Na融合蛋白免疫后对上呼吸道(图4A)和下呼吸道(图4B)保护作用的研究。图5A和5B：BALB/c小鼠用P40G5偶联物免疫后对上呼吸道(图5A)和下呼吸道(图5B)保护作用的研究。
实施例1：编码肺炎克雷白杆菌P40 OmpA蛋白的DNA的克隆
通过PCT扩增、利用肺炎克雷白杆菌IP I145的基因组DNA得到编码P40蛋白的DNA(Nguyen等，Gene 210：93-101，1998)。将编码P40的基因片段插入不同表达载体，特别是在Trp操纵子启动子的控制下的载体：pvaLP40(5.7Kbp)。P40蛋白的核苷酸序列和肽序列分别由序列SEQ ID No.1和SEQ ID No.2代表。用pavLP40表达载体(5.7kbp)转化大肠杆菌K12生产菌株。将rP40蛋白制成包含体的形式，其收率可观(＞10％，g的蛋白/g的干生物质)。本实施例仅仅举例说明rP40蛋白的表达，但也可以适合其他菌株和其他表达载体。实施例2：编码P40G2Na蛋白的DNA的克隆
按照Nguyen等(M.Uhlen，E.Hornes&O.Olsvik(编辑)，生物磁分离进展(Advances in biomagnetic separation).EatonPublishing Co.Natick，p.73-78，1994)所述，在固相支持体(Dynal磁珠，Oslo)上通过装配合成的低聚核苷酸可以得到RSV-A G蛋白的编码G2Na片段序列SEQ ID No.9的DNA(对应于RSV-A G蛋白序列的氨基酸序列aa130-aa230)；该低聚核苷酸用通常的大肠杆菌密码子设计并最佳化。将G2Na DNA克隆到实施例1所述的pavLP40中；所得的表达载体称作pavLP40G2Na(6kbp)。分别由序列SEQ ID No.3和SEQ IDNo.4代表P40G2Na的核苷酸序列和肽序列。用这种载体转化的大肠杆菌菌株K12在上述培养条件下产生出包含体形式的P40G2Na蛋白(49kDa)，其产量丰富(＞5％，g的蛋白/g的干生物质)。
利用用于G2Na和P40g2Na的技术可以获得RSV-B G蛋白的编码SEQID No.11的G2Nb片段的DNA克隆(对应于RSV-A G蛋白序列的氨基酸序列aa130-aa230)以及P40G2Nb融合蛋白。实施例3：rp40蛋白和P40G2Na融合蛋白的发酵方法
下列发酵方法的描述可以适用于rP40蛋白和P40G2Na蛋白的表达。通过举例说明给出培养条件并且可以最佳化，以得到更好收率的表达蛋白。
将含有250mlTSB(胰胨豆胨肉汤，Difco)的锥形瓶培养基(培养基中含有氨苄青霉素(100μg/ml，Sigma)和四环素(8μg/ml，Sigma))用上述重组大肠杆菌接种，并且该锥形瓶在37℃下培养过夜。随后将上面得到的200ml培养物接种2L的处于发酵罐(Biolafitte，法国)中的培养基。以相当常规的方式，该培养基可以由化学试剂组成，补充有维生素和/或酵母提取物，已知其能够促进高密度细菌细胞的生长，如Nguyen等(Gene 210：93-101，1998)所述。
在发酵过程中控制的参数如下：pH，搅拌，温度，氧合水平和混合原料(甘油或葡萄糖)的补充。一般地，pH调节为7.0并且温度固定在37℃。通过补充甘油(87％)使其处于恒定重量(12ml/h)来控制生长，从而使溶解的氧张力信号维持在30％。当培养物的浊度(在580nm下测定)达到80的值(培养大约24小时后)时，通过加入吲哚丙烯酸(IAA)使其终浓度为25mg/l来引发蛋白生产。引发大约4小时后，通过离心收获细胞。所得湿生物质的量大约为200g。实施例4：提取和纯化rP40蛋白的方法A)rP40的提取
提取和纯化方法已由Haeuw等人进行了描述(Eur.J.Biochem.255：446-454，1998)。
将培养物肉汤离心(4000rpm，10分钟，4℃)后，将细胞重新悬浮在pH 8.5的25mM Tris-HCl缓冲液中。用溶菌酶处理(0.5g.L，1小时，室温下/轻轻搅拌)后得到不溶性成分或包含体。将通过离心(15分钟，10000g，4℃)得到的包含体丸粒溶于pH 8.5的25mM Tris-HCl缓冲液，该缓冲液含有5mM MgCl2，随后离心(15分钟，10000g)。
37℃下，将包含体在pH 8.5的25mM Tris-HCl缓冲液中增溶2小时，该缓冲液含有7M脲(变性剂)和10mM二硫苏糖醇(二硫键的还原)。离心(15分钟，10000g)可以除去不溶性颗粒。
所得的上清液随后再悬浮在13倍体积的pH 8.5的25mM Tris-HCl中，其中含有NaCl(8.76g/L)和Zwittergent 3-14(0.1％，w/v)。室温和轻轻搅拌下，使该溶液在与空气接触下过夜(通过稀释和二硫键的再氧化促进蛋白的复性)。B)rP40蛋白的纯化-阴离子交换色谱步骤
进一步离心后，4℃下，该溶液相对于pH 8.5的25mM Tris-HCl缓冲液进行透析过夜，缓冲液中含有0.1％Zwittergent 3-14(100倍体积的缓冲液)。
把透析液装载到含有强阴离子交换型(Biorad Macro Prep High Q凝胶)支持体的柱上，所述支持体在上述缓冲液中平衡，线性流速15cm/h。在280nm下检测蛋白。对于在含有0.1％Zwittergent 3-14的pH 8.5的25mM Tris-HCl中的浓度为0.2M的NaCl而言，用60cm/h的线性流速洗脱rp40蛋白。-阳离子交换色谱步骤
混合含有rP40蛋白的级份，并且对于大约100ml的体积，借助于带有搅拌的、与YM10型Diaflo膜(10kDa截留阈值)一起使用的Amicon细胞体系通过超滤浓缩，或者对于较大的体积，借助于与具有10kDa截留阈值的膜平板一起使用的Millipore Minitan切向流动过滤体系浓缩，由此浓缩的级份在4℃下相对于含有0.1％Zwittergent 3-14的pH 3.0的20mM柠檬酸盐缓冲液透析过夜。
把透析液装载到含有强阳离子交换型(Biorad Macro Prep High S凝胶)支持体的柱上，该支持体在含有0.1％Zwittergent 3-14的pH3.0的20mM柠檬酸盐缓冲液中平衡。对于0.7M的NaCl浓度洗脱rp40蛋白(流速为61cm/h)。实施例5：提取和纯化P40G2Na蛋白的方法。A)P40G2Na融合蛋白的提取
将培养物肉汤离心(4000rpm，10分钟，4℃)后，将细菌细胞重新悬浮在pH 8.5的50mM Tris-HCl缓冲液中，该缓冲液含有1mM EDTA、0.2MNaCl和0.05％吐温20。用溶菌酶处理(0.5g/L，1小时，室温下/轻轻搅拌)后得到不溶性成分或包含体。将通过离心(15分钟，10000g，4℃)得到的包含体丸粒溶于pH 8.5的25mM Tris-HCl缓冲液中，该缓冲液含有5mM MgCl2，随后离心(15分钟，10000g)。
37℃下，将包含体在pH 8.5的25mM Tris-HCl缓冲液中增溶2小时，该缓冲液含有7M盐酸胍(变性剂)和10mM二硫苏糖醇(二硫键的还原)。离心(15分钟，10000g)可以除去不溶性颗粒。
随后将上清液再悬浮在13倍体积的pH 8.5的25mM Tris-HCl缓冲液中，其中含有NaCl(8.76g/L)和Zwittergent 3-14(0.1％，w/v)。室温和轻轻搅拌下，使该溶液在与空气接触下过夜。B)P40G2Na融合蛋白的纯化-阴离子交换色谱步骤
进一步离心后，4℃下，使溶液相对于pH 10.5的20mM乙醇胺-HCl缓冲液进行透析过夜，缓冲液中含有0.1％Zwittergent 3-14(100倍体积的缓冲液)。
把透析液装载到含有强阴离子交换型(Amersham PharmaciaBiotech Source Q凝胶)支持体的柱上，该支持体在上述缓冲液中平衡，用在相同缓冲液中的NaCl梯度液洗脱P40G2Na蛋白。在280nm下检测蛋白。-阳离子交换色谱步骤
混合含有P40G2Na蛋白的级份，并且对于大约100ml的体积，借助于带有搅拌的、与YM10型Diaflo膜(10kDa截留阈值)一起使用的Amicon细胞体系通过超滤浓缩；或者对于较大的体积，借助于与具有10kDa截留阈值的膜平板一起使用的Millipore Minitan切向流动过滤体系浓缩，由此浓缩的级份在4℃下相对于含有0.1％Zwittergent3-14的pH 8.0的20mM柠檬酸盐缓冲液透析过夜。
把透析液装载到含有强阳离子交换型(Amersham PharmaciaBiotech Source Q凝胶)支持体的柱上，该支持体在上述缓冲液中平衡。用在相同缓冲液中的NaCl梯度液洗脱P40G2Na蛋白。在通过采用上述系统之一超滤浓缩之前混合感兴趣的级份。实施例6：化学偶联得到P40-G5A)P40-G5Cysa偶联物的合成和表征鉴定-G5aCys和CysG5a肽的合成
由SEQ ID No.5表示的G5a肽是16个氨基酸的肽，其与RSV-A G蛋白的aa144-aa159片段相对应。通过固相化学合成、由C末端侧开始向N末端侧延长得到该肽。分别由SEQ ID No.6和SEQ ID No.7表示的CysG5a和G5aCys肽分别相应于在N-或C-末端侧带有另外的半胱氨酸的肽，其一对一地偶联在载体蛋白上。
利用自动固相肽合成仪，由C末端侧向N末端侧延伸来合成肽(FMOC化学，以0.1的规模，0.25或1.0mmol)。CysG5a肽是用预装在HMP型树脂上的脯氨酸来合成，其可以在裂解后得到C末端侧的游离酸官能团；或用预装在Rink酰胺MBHA型的树脂上的脯氨酸来合成，其可以在裂解后得到位于C末端侧的酰胺官能团。用预装在一种或其它树脂上的半胱氨酸开始G5aCys肽的合成。利用与FMOC化学相容的基团，可以保护所用氨基酸的侧链的反应性官能团[Cys(Trt)；Arg(Pmc)；Asn(Trt)；Gln(Trt)；Lys(Boc)；Ser(tBu)；Thr(tBu)]。偶联循环按照下列方式进行：用哌啶将第一个氨基酸的N末端胺官能团脱保护，用HBTU/HMP将要偶联的第二个氨基酸的酸官能团活化，并且偶联；在合成结束时，从树脂上裂解下肽，并且通过与水/TFA混合物反应使侧链脱保护。用预冷至-40℃的乙醚预沉淀该肽，离心该混合物。丸粒用乙醚洗涤3次，随后在氮气下干燥。使该丸粒溶于含有0.1％TFA的水中。再次离心该混悬液，从丸粒分离出含肽的上清液，其中含有树脂。粗肽经半制备HPLC纯化。利用反相HPLC和毛细管电泳(FZCE)核实纯化的肽的同质性。通过比较由ES-MS型质谱测定的质量与由理论氨基酸序列计算出来的质量的相容性，可以证实其理论构建物·CysG5aNH2肽-合成：在合成结束时理论的肽-树脂重量：                  593mg氮气下干燥后测量的重量：                         619mg肽-树脂裂解和粗肽的分析：                        200mg(1/3的批次)冷冻干燥后裂解的粗肽的质量：                     84mg(75％的肽的净重
                                             量，即97％收率)粗肽的同质性：                                   97％(RP-HPLC；UV
                                             210NM)
                                     97％(FZCE/MicrocoatTM)纯化：冷冻干燥后纯化肽的质量：                 50mg(75％的肽的净重
                                     量，即58％收率)特征：纯化肽的同质性：                         ＞99％(RP-HPLC；UV 210NM)
                                     ＞99％
                                     (FZCE/MicrocoatTM；
                                     UV 200nm)质谱(ES-MS)计算的质量：                             1951.29Da测定的质量：                             1950.80Da±0.31-缩写：AA或aa：氨基酸；Boc：叔丁氧基羰基；BHA：溴代羟基琥珀酰亚胺基酸；CE：毛细管电泳；ES-MS：电子喷射-质谱；FMOC：芴基甲氧基羰基；FZCE：自由区毛细管电泳；HBTU：2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸；HMP：对羟基甲基苯氧基甲基聚苯乙烯；MBHA：甲基二苯甲胺；NMP：N-甲基-2-吡咯烷酮；Pmc：2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基；RP-HPLC：反相高效液体色谱；SPPS：固相肽合成；tBoc：叔丁氧基羰基；tBu：叔丁基；TFA：三氟乙酸；Trt：三苯甲基。
Haeuw等业已描述了偶联的方法(Eur.J.Biochem.255：446-454，1998)。利用含杂原子双官能试剂N-羟基琥珀酰亚胺溴代乙酸盐或HBA通过溴乙酰基化使蛋白的赖氨酸残基活化，并且随后肽经硫羟基偶联，所述的硫羟基携带在引入到肽的C末端位置的半胱氨酸残基上。
简单地说，4℃下，使P40蛋白对含0.1％Zwittergent 3-14的pH7.0的0.1M磷酸钠缓冲液透析过夜。透析的蛋白用HBA试剂活化。其以1.2mg(存在于10μl的二甲基甲酰胺中)/mgP40的量加入，并且随后在室温下把整个混合物在黑暗中放置1小时同时搅拌。利用分子筛色谱在Pharmacia Sephadex G25支持体上使活化的P40脱盐。用含0.1％Zwittergent 3-14的pH 7.0的0.1M磷酸钠缓冲液洗脱蛋白。合并含有活化P40的级份。为了偶联，向1mg的P40(浓度约5mg/ml)中加入0.4mg的肽(在上述缓冲液中，浓度为10mg/ml)。使溶液在氩气流下饱和后，室温下把整个溶液在黑暗中放置2小时同时搅拌。随后，+4℃下，使偶联物对含0.1％Zwittergent 3-14的pH 7.0的0.1M磷酸钠缓冲液pH 7.0透析24小时，之后通过SDS-PAGE和分析表征鉴定。
在酸水解和用PITC衍生化(Waters PicoTag方法)后，通过HPLC分析氨基酸来测定偶联肽的数目。Kolodny和Robey(Anal.Biochem.187：136-149，1990)所述的释放的羧甲基半胱氨酸残基的定量方法可以精确测定出附着在每1摩尔P40蛋白上的G5Cysa肽的摩尔数。这个值通常为5-10 G5Cysa/P40。实施例7：用P40G2Na免疫后的抗体反应
以40μg G2Na当量剂量的P40G2Na(由RSV G蛋白aa130-230衍生的抗原)经鼻内(i.n.)以10天的间隔给BALB/c小鼠施用3次，所述的小鼠可以未经或已经用肺炎克雷白杆菌i.n.给药2次进行预敏化。这种预敏化的目的在于自然地模拟人体状况，因为这种呼吸道病原体是人们常常遇到的，因此，其具有基本抗rP40效价。
令人惊奇地，图2A证实了融合蛋白i.n.给药后出现高的抗G2Na血清IgG效价。在用肺炎克雷白杆菌预敏化的动物中该效价明显增高，并且向融合蛋白中加入CTB(霍乱毒素B亚单位)也可以改善反应的强度及其同质性。血清IgG反应的同种型(图2b和2c)证实了在缺乏CTB下的一个主要的IgG1反应，在用肺炎克雷白杆菌敏化的小鼠中IgG1和IgG2a效价增高(图2C)。一旦将CTB加入融合蛋白，预敏化对同种型的影响就不再明显。应该注意，提取来源的CTB(Sigma，St-Louis，MO，USA)还含有痕量的CTA(痕量毒素亚单位A)，它是负责抗体反应诱导的毒素成分。这组数据证实了当G2Na肽与rP40蛋白融合并经鼻给药后它的免疫原性。实施例8：用P40-G5免疫后的抗体反应
用由RSV G蛋白衍生的纯B表位(称作G5)(Plotnicky-Gilquin等，J.Virol.73：5637，1999)评估抗体反应。
正如所料，G5单独或在CTB存在下均不致免疫。令人惊奇地，G5肽在与rP40蛋白偶联并经i.n.给药时是致免疫的(图3A)。用肺炎克雷白杆菌预敏化的小鼠(图3B)明显改善抗G5血清IgG反应。实施例9：用P40G2Na和RSV刺激免疫后的保护作用
为了就保护作用评估免疫反应的质量，用P40G2Na杂合蛋白来免疫BALB/c小鼠，随后用RSV-A经鼻感染。
图4A显示，在与或不与CTB一起给药下，单独给予rP40载体蛋白不影响小鼠的RSV-A感染。有利地，给未经肺炎克雷白杆菌敏化的小鼠施用P40G2Na融合蛋白可以导致6只小鼠中的5只小鼠中病毒效价降低2个log10。令人惊奇地，肺炎克雷白杆菌对小鼠的敏化作用可以显著改善对肺通道的保护作用。
对于鼻道的保护作用(图4B)，肺炎克雷白杆菌预敏化的贡献在有或无CTB存在下均特别清晰。肺炎克雷白杆菌预敏化的这种重要性可以由IgG反应在预敏化小鼠中的同质性更高来解释，也可以通过这些动物中局部IgA型反应增高来解释(没有给出数据)。
这些试验数据首次证明，由与P40载体蛋白融合的RSV G蛋白衍生的重组亚单位蛋白的粘膜给药可以同时保护动物的肺通道和鼻道。实施例10：用P40-G5和RSV刺激免疫后的保护作用
有利地，图5A显示，偶联rP40的G5肽的经鼻给药使小鼠肺内的抗RSV-A感染的病毒血症明显减轻(p＜0.05)。就上呼吸道的保护作用而言(图5B)，所得的结果显示用P40-G5免疫的动物在用RSV-A感染后病毒血症减轻，这种效果在它们已经用肺炎克雷白杆菌预敏化后特别显著(p＜0.05)。
                                序列表<110>PIERRE FABRE MEDICAMENT<120>与RSV的致免疫肽结合的肠杆菌OMPA膜蛋白用于制备鼻内给药的疫苗的用途<130>D18229<140><141><150>FR 99/11888<151>1999-09-23<160>11<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1032<212>DNA<213>肺炎克雷白杆菌<220><221>CDS<222>(1)..(1032)<220><223>P40<400>1atg aaa gca att ttc gta ctg aat gcg gct ccg aaa gat aac acc tgg    48Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Asn Ala Ala Pro Lys Asp Asn Thr Trp1               5                  10                  15tat gca ggt ggt aaa ctg ggt tgg tcc cag tat cac gac acc ggt ttc    96Tyr Ala Gly Gly Lys Leu Gly Trp Ser Gln Tyr His Asp Thr Gly Phe
         20                  25                  30tac ggt aac ggt ttc cag aac aac aac ggt ccg acc cgt aac gat cag    144Tyr Gly Asn Gly Phe Gln Asn Asn Asn Gly Pro Thr Arg Asn Asp Gln
     35                  40                  45ctt ggt gct ggt gcg ttc ggt ggt tac cag gtt aac ccg tac ctc ggt    192Leu Gly Ala Gly Ala Phe Gly Gly Tyr Gln Val Asn Pro Tyr Leu Gly
 50                  55                  60ttc gaa atg ggt tat gac tgg ctg ggc cgt atg gca tat aaa ggc agc    240Phe Glu Met Gly Tyr Asp Trp Leu Gly Arg Met Ala Tyr Lys Gly Ser65                  70                  75                  80gtt gac aac ggt gct ttc aaa gct cag ggc gtt cag ctg acc gct aaa    288Val Asp Asn Gly Ala Phe Lys Ala Gln Gly Val Gln Leu Thr Ala Lys
             85                  90                  95ctg ggt tac ccg atc act gac gat ctg gac atc tac acc cgt ctg ggc    336Leu Gly Tyr Pro Ile Thr Asp Asp Leu Asp Ile Tyr Thr Arg Leu Gly
        100                 105                 110ggc atg gtt tgg cgc gct gac tcc aaa ggc aac tac gct tct acc ggc    384Gly Met Val Trp Arg Ala Asp Ser Lys Gly Asn Tyr Ala Ser Thr Gly
    115                 120                 125gtt tcc cgt agc gaa cac gac act ggc gtt tcc cca gta ttt gct ggc    432Val Ser Arg Ser Glu His Asp Thr Gly Val Ser Pro Val Phe Ala Gly
130                 135                 140ggc gta gag tgg gct gtt act cgt gac atc gct acc cgt ctg gaa tac    480Gly Val Glu Trp Ala Val Thr Arg Asp Ile Ala Thr Arg Leu Glu Tyr145                 150                 155                 160cag tgg gtt aac aac atc ggc gac gcg ggc act gtg ggt acc cgt cct    528Gln Trp Val Asn Asn Ile Gly Asp Ala Gly Thr Val Gly Thr Arg Pro
            165                 170                 175gat aac ggc atg ctg agc ctg ggc gtt tcc tac cgc ttc ggt cag gaa    576Asp Asn Gly Met Leu Ser Leu Gly Val Ser Tyr Arg Phe Gly Gln Glu
        180                 185                 190gat gct gca ccg gtt gtt gct ccg gct ccg gct ccg gct ccg gaa gtg    624Asp Ala Ala Pro Val Val Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Glu Val
    195                 200                 205gct acc aag cac ttc acc ctg aag tct gac gtt ctg ttc aac ttc aac    672Ala Thr Lys His Phe Thr Leu Lys Ser Asp Val Leu Phe Asn Phe Asn
210                 215                 220aaa gct acc ctg aaa ccg gaa ggt cag cag gct ctg gat cag ctg tac    720Lys Ala Thr Leu Lys Pro Glu Gly Gln Gln Ala Leu Asp Gln Leu Tyr225                 230                 235                 240act cag ctg agc aac atg gat ccg aaa gac ggt tcc gct gtt gtt ctg    768Thr Gln Leu Ser Asn Met Asp Pro Lys Asp Gly Ser Ala Val Val Leu
            245                 250                 255ggc tac acc gac cgc atc ggt tcc gaa gct tac aac cag cag ctg tct    816Gly Tyr Thr Asp Arg Ile Gly Ser Glu Ala Tyr Asn Gln Gln Leu Ser
        260                 265                 270gag aaa cgt gct cag tcc gtt gtt gac tac ctg gtt gct aaa ggc atc    864Glu Lys Arg Ala Gln Ser Val Val Asp Tyr Leu Val Ala Lys Gly Ile
    275                 280                 285ccg gct ggc aaa atc tcc gct cgc ggc atg ggt gaa tcc aac ccg gtt    912Pro Ala Gly Lys Ile Ser Ala Arg Gly Met Gly Glu Ser Asn Pro Val
290                 295                 300act ggc aac acc tgt gac aac gtg aaa gct cgc gct gcc ctg atc gat    960Thr Gly Asn Thr Cys Asp Asn Val Lys Ala Arg Ala Ala Leu Ile Asp305                 310                 315                 320tgc ctg gct ccg gat cgt cgt gta gag atc gaa gtt aaa ggc tac aaa    1008Cys Leu Ala Pro Asp Arg Arg Val Glu Ile Glu Val Lys Gly Tyr Lys
            325                 330                 335gaa gtt gta act cag ccg gcg ggt                                    1032Glu Val Val Thr Gln Pro Ala Gly
        340<210>2<211>344<212>PRT<213>肺炎克雷白杆菌<223>P40<400>2Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Asn Ala Ala Pro Lys Asp Asn Thr Trp1               5                  10                  15Tyr Ala Gly Gly Lys Leu Gly Trp Ser Gln Tyr His Asp Thr Gly Phe
         20                  25                  30Tyr Gly Asn Gly Phe Gln Asn Asn Asn Gly Pro Thr Arg Asn Asp Gln
     35                  40                  45Leu Gly Ala Gly Ala Phe Gly Gly Tyr Gln Val Asn Pro Tyr Leu Gly
 50                  55                  60Phe Glu Met Gly Tyr Asp Trp Leu Gly Arg Met Ala Tyr Lys Gly Ser65                  70                  75                  80Val Asp Asn Gly Ala Phe Lys Ala Gln Gly Val Gln Leu Thr Ala Lys
             85                  90                  95Leu Gly Tyr Pro Ile Thr Asp Asp Leu Asp Ile Tyr Thr Arg Leu Gly
        100                 105                 110Gly Met Val Trp Arg Ala Asp Ser Lys Gly Asn Tyr Ala Ser Thr Gly
    115                 120                 125Val Ser Arg Ser Glu His Asp Thr Gly Val Ser Pro Val Phe Ala Gly
130                 135                 140Gly Val Glu Trp Ala Val Thr Arg Asp Ile Ala Thr Arg Leu Glu Tyr145                 150                 155                 160Gln Trp Val Asn Asn Ile Gly Asp Ala Gly Thr Val Gly Thr Arg Pro
            165                 170                 175Asp Asn Gly Met Leu Ser Leu Gly Val Ser Tyr Arg Phe Gly Gln Glu
        180                 185                 190Asp Ala Ala Pro Val Val Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Glu Val
    195                 200                 205Ala Thr Lys His Phe Thr Leu Lys Ser Asp Val Leu Phe Asn Phe Asn
210                 215                 220Lys Ala Thr Leu Lys Pro Glu Gly Gln Gln Ala Leu Asp Gln Leu Tyr225                 230                 235                 240Thr Gln Leu Ser Asn Met Asp Pro Lys Asp Gly Ser Ala Val Val Leu
            245                 250                 255Gly Tyr Thr Asp Arg Ile Gly Ser Glu Ala Tyr Asn Gln Gln Leu Ser
        260                 265                 270Glu Lys Arg Ala Gln Ser Val Val Asp Tyr Leu Val Ala Lys Gly Ile
    275                 280                 285Pro Ala Gly Lys Ile Ser Ala Arg Gly Met Gly Glu Ser Asn Pro Val
290                 295                300Thr Gly Asn Thr Cys Asp Asn Val Lys Ala Arg Ala Ala Leu Ile Asp305                 310                 315                 320Cys Leu Ala Pro Asp Arg Arg Val Glu Ile Glu Val Lys Gly Tyr Lys
            325                 330                 335Glu Val Val Thr Gln Pro Ala Gly
        340<210>3<211>1356<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：由肺炎克雷白杆菌DNA(SEQ ID No.1)和呼吸道合胞病毒
 DNA(SEQ ID No.8)融合导致的核酸序列<220><221>CDS<222>(1)..(1356)<220><223>P40G2Na<400>3atg aaa gca att ttc gta ctg aat gcg gct ccg aaa gat aac acc tgg    48Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Asn Ala Ala Pro Lys Asp Asn Thr Trp1               5                  10                  15tat gca ggt ggt aaa ctg ggt tgg tcc cag tat cac gac acc ggt ttc    96Tyr Ala Gly Gly Lys Leu Gly Trp Ser Gln Tyr His Asp Thr Gly Phe
         20                  25                  30tac ggt aac ggt ttc cag aac aac aac ggt ccg acc cgt aac gat cag    144Tyr Gly Asn Gly Phe Gln Asn Asn Asn Gly Pro Thr Arg Asn Asp Gln
     35                  40                  45ctt ggt gct ggt gcg ttc ggt ggt tac cag gtt aac ccg tac ctc ggt    192Leu Gly Ala Gly Ala Phe Gly Gly Tyr Gln Val Asn Pro Tyr Leu Gly
 50                  55                  60ttc gaa atg ggt tat gac tgg ctg ggc cgt atg gca tat aaa ggc agc    240Phe Glu Met Gly Tyr Asp Trp Leu Gly Arg Met Ala Tyr Lys Gly Ser65                  70                  75                  80gtt gac aac ggt gct ttc aaa gct cag ggc gtt cag ctg acc gct aaa    288Val Asp Asn Gly Ala Phe Lys Ala Gln Gly Val Gln Leu Thr Ala Lys
             85                  90                  95ctg ggt tac ccg atc act gac gat ctg gac atc tac acc cgt ctg ggc    336Leu Gly Tyr Pro Ile Thr Asp Asp Leu Asp Ile Tyr Thr Arg Leu Gly
        100                 105                 110ggc atg gtt tgg cgc gct gac tcc aaa ggc aac tac gct tct acc ggc    384Gly Met Val Trp Arg Ala Asp Ser Lys Gly Asn Tyr Ala Ser Thr Gly
    115                 120                 125gtt tcc cgt agc gaa cac gac act ggc gtt tcc cca gta ttt gct ggc    432Val Ser Arg Ser Glu His Asp Thr Gly Val Ser Pro Val Phe Ala Gly
130                 135                 140ggc gta gag tgg gct gtt act cgt gac atc gct acc cgt ctg gaa tac    480Gly Val Glu Trp Ala Val Thr Arg Asp Ile Ala Thr Arg Leu Glu Tyr145                 150                 155                 160cag tgg gtt aac aac atc ggc gac gcg ggc act gtg ggt acc cgt cct    528Gln Trp Val Asn Asn Ile Gly Asp Ala Gly Thr Val Gly Thr Arg Pro
            165                 170                 175gat aac ggc atg ctg agc ctg ggc gtt tcc tac cgc ttc ggt cag gaa    576Asp Asn Gly Met Leu Ser Leu Gly Val Ser Tyr Arg Phe Gly Gln Glu
        180                 185                 190gat gct gca ccg gtt gtt gct ccg gct ccg gct ccg gct ccg gaa gtg    624Asp Ala Ala Pro Val Val Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Glu Val
    195                 200                 205gct acc aag cac ttc acc ctg aag tct gac gtt ctg ttc aac ttc aac    672Ala Thr Lys His Phe Thr Leu Lys Ser Asp Val Leu Phe Asn Phe Asn
210                 215                 220aaa gct acc ctg aaa ccg gaa ggt cag cag gct ctg gat cag ctg tac    720Lys Ala Thr Leu Lys Pro Glu Gly Gln Gln Ala Leu Asp Gln Leu Tyr225                 230                 235                 240act cag ctg agc aac atg gat ccg aaa gac ggt tcc gct gtt gtt ctg    768Thr Gln Leu Ser Asn Met Asp Pro Lys Asp Gly Ser Ala Val Val Leu
            245                 250                 255ggc tac acc gac cgc atc ggt tcc gaa gct tac aac cag cag ctg tct    816Gly Tyr Thr Asp Arg Ile Gly Ser Glu Ala Tyr Asn Gln Gln Leu Ser
        260                 265                 270gag aaa cgt gct cag tcc gtc gtt gac tac ctg gtt gct aaa ggc atc    864Glu Lys Arg Ala Gln Ser Val Val Asp Tyr Leu Val Ala Lys Gly Ile
    275                 280                 285ccg gct ggc aaa atc tcc gct cgc ggc atg ggt gaa tcc aac ccg gtt    912Pro Ala Gly Lys Ile Ser Ala Arg Gly Met Gly Glu Ser Asn Pro Val
290                 295                 300act ggc aac acc tgt gac aac gtg aaa gct cgc gct gcc ctg atc gat    960Thr Gly Asn Thr Cys Asp Asn Val Lys Ala Arg Ala Ala Leu Ile Asp305                 310                 315                 320tgc ctg gct ccg gat cgt cgt gta gag atc gaa gtt aaa ggc tac aaa    1008Cys Leu Ala Pro Asp Arg Arg Val Glu Ile Glu Val Lys Gly Tyr Lys
            325                 330                 335gaa gtt gta act cag ccg cag ggc ccc ggg gat cct atg acc gtg aaa    1056Glu Val Val Thr Gln Pro Gln Gly Pro Gly Asp Pro Met Thr Val Lys
        340                 345                 350acc aaa aac acc acg acc acc cag acc cag ccg agc aaa ccg acc acc    1104Thr Lys Asn Thr Thr Thr Thr Gln Thr Gln Pro Ser Lys Pro Thr Thr
    355                 360                 365aaa cag cgt cag aac aaa ccg ccg aac aaa ccg aac aac gat ttc cat    1152Lys Gln Arg Gln Asn Lys Pro Pro Asn Lys Pro Asn Asn Asp Phe His
370                 375                 380ttc gaa gtg ttc aac ttc gtg ccg tgc agc atc tgc agc aac aac ccg    1200Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys Ser Asn Asn Pro385                 390                 395                 400acc tgc tgg gcg atc tgc aaa cgt atc ccg aac aaa aaa ccg ggc aaa    1248Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys Arg Ile Pro Asn Lys Lys Pro Gly Lys
            405                 410                 415aaa acc acg acc aaa ccg acc aaa aaa ccg acc ttc aaa acc acc aaa    1296Lys Thr Thr Thr Lys Pro Thr Lys Lys Pro Thr Phe Lys Thr Thr Lys
        420                 425                 430aaa gat cat aaa ccg cag acc acc aaa ccg aaa gaa gtg ccg acc acc    1344Lys Asp His Lys Pro Gln Thr Thr Lys Pro Lys Glu Val Pro Thr Thr
    435                 440                 445aaa ccg gtc gac                                                    1356Lys Pro Val Asp
450<210>4<211>452<212>PRT<213>人工序列<223>P40G2Na<400>4Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Asn Ala Ala Pro Lys Asp Asn Thr Trp1               5                  10                  15Tyr Ala Gly Gly Lys Leu Gly Trp Ser Gln Tyr His Asp Thr Gly Phe
         20                  25                  30Tyr Gly Asn Gly Phe Gln Asn Asn Asn Gly Pro Thr Arg Asn Asp Gln
     35                  40                  45Leu Gly Ala Gly Ala Phe Gly Gly Tyr Gln Val Asn Pro Tyr Leu Gly
 50                  55                  60Phe Glu Met Gly Tyr Asp Trp Leu Gly Arg Met Ala Tyr Lys Gly Ser65                  70                  75                  80Val Asp Asn Gly Ala Phe Lys Ala Gln Gly Val Gln Leu Thr Ala Lys
             85                 90                   95Leu Gly Tyr Pro Ile Thr Asp Asp Leu Asp Ile Tyr Thr Arg Leu Gly
        100                 105                 110Gly Met Val Trp Arg Ala Asp Ser Lys Gly Asn Tyr Ala Ser Thr Gly
    115                 120                 125Val Ser Arg Ser Glu His Asp Thr Gly Val Ser Pro Val Phe Ala Gly
130                 135                 140Gly Val Glu Trp Ala Val Thr Arg Asp Ile Ala Thr Arg Leu Glu Tyr145                 150                 155                 160Gln Trp Val Asn Asn Ile Gly Asp Ala Gly Thr Val Gly Thr Arg Pro
            165                 170                 175Asp Asn Gly Met Leu Ser Leu Gly Val Ser Tyr Arg Phe Gly Gln Glu
        180                 185                 190Asp Ala Ala Pro Val Val Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Glu Val
    195                 200                 205Ala Thr Lys His Phe Thr Leu Lys Ser Asp Val Leu Phe Asn Phe Asn
210                 215                 220Lys Ala Thr Leu Lys Pro Glu Gly Gln Gln Ala Leu Asp Gln Leu Tyr225                 230                 235                 240Thr Gln Leu Ser Asn Met Asp Pro Lys Asp Gly Ser Ala Val Val Leu
            245                 250                 255Gly Tyr Thr Asp Arg Ile Gly Ser Glu Ala Tyr Asn Gln Gln Leu Ser
        260                 265                 270Glu Lys Arg Ala Gln Ser Val Val Asp Tyr Leu Val Ala Lys Gly Ile
    275                 280                 285Pro Ala Gly Lys Ile Ser Ala Arg Gly Met Gly Glu Ser Asn Pro Val
290                 295                 300Thr Gly Asn Thr Cys Asp Asn Val Lys Ala Arg Ala Ala Leu Ile Asp305                 310                 315                 320Cys Leu Ala Pro Asp Arg Arg Val Glu Ile Glu Val Lys Gly Tyr Lys
            325                 330                 335Glu Val Val Thr Gln Pro Gln Gly Pro Gly Asp Pro Met Thr Val Lys
        340                 345                 350Thr Lys Asn Thr Thr Thr Thr Gln Thr Gln Pro Ser Lys Pro Thr Thr
    355                 360                 365Lys Gln Arg Gln Asn Lys Pro Pro Asn Lys Pro Asn Asn Asp Phe His
370                 375                 380Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys Ser Asn Asn Pro385                 390                 395                 400Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys Arg Ile Pro Asn Lys Lys Pro Gly Lys
            405                 410                 415Lys Thr Thr Thr Lys Pro Thr Lys Lys Pro Thr Phe Lys Thr Thr Lys
        420                 425                 430Lys Asp His Lys Pro Gln Thr Thr Lys Pro Lys Glu Val Pro Thr Thr
    435                 440                 445Lys Pro Val Asp
450<210>5<211>16<212>PRT<213>呼吸道合胞病毒(RSV)<220><223>G5<400>5Ser Lys Pro Thr Thr Lys Gln Arg Gln Asn Lys Pro Pro Asn Lys Pro1               5                  10                  15<210>6<211>17<212>PRT<213>呼吸道合胞病毒(RSV)<220><223>CysG5<400>6Cys Ser Lys Pro Thr Thr Lys Gln Arg Gln Asn Lys Pro Pro Asn Lys1               5                  10                  15Pro<210>7<211>17<212>PRT<213>呼吸道合胞病毒(RSV)<220><223>G5Cys<400>7Ser Lys Pro Thr Thr Lys Gln Arg Gln Asn Lys Pro Pro Asn Lys Pro1               5                  10                  15Cys<210>8<211>303<212>DNA<213>呼吸道合胞病毒(RSV)<220><221>CDS<222>(1)..(303)<220><223>G2Na<400>8acc gtg aaa acc aaa aac acc acg acc acc cag acc cag ccg agc aaa    48Thr Val Lys Thr Lys Asn Thr Thr Thr Thr Gln Thr Gln Pro Ser Lys1               5                  10                  15ccg acc acc aaa cag cgt cag aac aaa ccg ccg aac aaa ccg aac aac    96Pro Thr Thr Lys Gln Arg Gln Asn Lys Pro Pro Asn Lys Pro Asn Asn
         20                  25                  30gat ttc cat ttc gaa gtg ttc aac ttc gtg ccg tgc agc atc tgc agc    144Asp Phe His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys Ser
     35                  40                  45aac aac ccg acc tgc tgg gcg atc tgc aaa cgt atc ccg aac aaa aaa    192Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys Arg Ile Pro Asn Lys Lys
 50                  55                  60ccg ggc aaa aaa acc acg acc aaa ccg acc aaa aaa ccg acc ttc aaa    240Pro Gly Lys Lys Thr Thr Thr Lys Pro Thr Lys Lys Pro Thr Phe Lys65                  70                  75                  80acc acc aaa aaa gat cat aaa ccg cag acc acc aaa ccg aaa gaa gtg    288Thr Thr Lys Lys Asp His Lys Pro Gln Thr Thr Lys Pro Lys Glu Val
             85                  90                  95ccg acc acc aaa ccg                                                303Pro Thr Thr Lys Pro
        100<210>9<211>101<212>PRT<213>呼吸道合胞病毒(RSV)<223>G2Na<400>9Thr Val Lys Thr Lys Asn Thr Thr Thr Thr Gln Thr Gln Pro Ser Lys1               5                  10                  15Pro Thr Thr Lys Gln Arg Gln Asn Lys Pro Pro Asn Lys Pro Asn Asn
         20                  25                  30Asp Phe His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys Ser
     35                  40                  45Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys Arg Ile Pro Asn Lys Lys
 50                  55                  60Pro Gly Lys Lys Thr Thr Thr Lys Pro Thr Lys Lys Pro Thr Phe Lys65                  70                  75                  80Thr Thr Lys Lys Asp His Lys Pro Gln Thr Thr Lys Pro Lys Glu Val
             85                  90                  95Pro Thr Thr Lys Pro
        100<210>10<211>303<212>DNA<213>呼吸道合胞病毒(RSV)<220><221>CDS<222>(1)..(303)<220><223>G2Nb<400>10acc gcg cag acc aaa ggc cgt atc acc acc agc acc cag acc aac aaa    48Thr Ala Gln Thr Lys Gly Arg Ile Thr Thr Ser Thr Gln Thr Asn Lys1               5                  10                  15ccg agc acc aaa agc cgt agc aaa aac ccg ccg aaa aaa ccg aaa gat    96Pro Ser Thr Lys Ser Arg Ser Lys Asn Pro Pro Lys Lys Pro Lys Asp
         20                  25                  30gat tac cac ttc gaa gtg ttc aac ttc gtg ccc tgc agc atc tgc ggc    144Asp Tyr His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys Gly
     35                  40                  45aac aac cag ctg tgc aaa agc atc tgc aaa acc atc ccg agc aac aaa    192Asn Asn Gln Leu Cys Lys Ser Ile Cys Lys Thr Ile Pro Ser Asn Lys
 50                  55                  60ccg aaa aag aaa ccg acc atc aaa ccg acc aac aaa ccg acc acc aaa    240Pro Lys Lys Lys Pro Thr Ile Lys Pro Thr Asn Lys Pro Thr Thr Lys65                  70                  75                  80acc acc aac aaa cgt gat ccg aaa acc ccg gcg aaa atg ccg aag aag    288Thr Thr Asn Lys Arg Asp Pro Lys Thr Pro Ala Lys Met Pro Lys Lys
             85                  90                  95gaa atc atc acc aac                                                303Glu Ile Ile Thr Asn
        100<210>11<211>101<212>PRT<213>呼吸道合胞病毒(RSV)<223>G2Nb<400>11Thr Ala Gln Thr Lys Gly Arg Ile Thr Thr Ser Thr Gln Thr Asn Lys1               5                  10                  15Pro Ser Thr Lys Ser Arg Ser Lys Asn Pro Pro Lys Lys Pro Lys Asp
         20                  25                  30Asp Tyr His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys Gly
     35                  40                  45Asn Asn Gln Leu Cys Lys Ser Ile Cys Lys Thr Ile Pro Ser Asn Lys
 50                  55                  60Pro Lys Lys Lys Pro Thr Ile Lys Pro Thr Asn Lys Pro Thr Thr Lys65                  70                  75                  80Thr Thr Asn Lys Arg Asp Pro Lys Thr Pro Ala Lys Met Pro Lys Lys
             85                  90                  95Glu Ile Ile Thr Asn100

Claims (19)

1.与呼吸道合胞病毒(RSV)衍生的致免疫肽结合的肠杆菌OmpA蛋白或其片段用于制备药物组合物的用途，该药物组合物可以经鼻给药，并且可以诱导保护个体的上呼吸道和/或下呼吸道(肺)对抗RSV感染的免疫反应。
2.权利要求1所述的用途，其特征在于所述的肠杆菌是肺炎克雷白杆菌。
3.权利要求2所述的用途，其特征在于所述OmpA蛋白或其片段的氨基序列含有：
a)序列SEQ ID No.2的氨基酸序列；
b)在最适排列之后，具有与序列SEQ ID No.2至少80％的百分同一性序列的氨基酸序列；或
c)序列SEQ ID No.2的至少10个连续氨基酸的片段的氨基酸序列。
4.权利要求1-3任一项所述的用途，其特征在于所述OmpA蛋白或其片段是利用提取的方法由所述肠杆菌的细胞中获得的。
5.权利要求1-3任一项所述的用途，其特征在于所述肠杆菌OmpA蛋白或其片段，或所述致免疫肽是经重组途径获得的。
6.权利要求1-5任一项所述的用途，其特征在于所述致免疫肽选自由RSV的G、F、M2或N蛋白衍生的肽。
7.权利要求6所述的用途，其特征在于所述致免疫肽是衍生自G蛋白的肽。
8.权利要求7所述的用途，其特征在于所述致免疫肽是含有B型表位的G蛋白的片段。
9.权利要求7所述的用途，其特征在于所述致免疫肽选自序列SEQID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9或SEQ ID No.11的肽，或在最适排列后具有与序列SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ IDNo.7、SEQ ID No.9或SEQ ID No.11至少80％的百分同一性序列的肽。
10.权利要求1-9任一项所述的用途，其特征在于所述药物组合物含有编码所述肠杆菌OmpA蛋白或其片段或所述致免疫肽的核酸构建物，所述核酸构建物含在表达载体中，或者含在能够表达所述肠杆菌OmpA蛋白和/或所述致免疫肽的转移宿主细胞中。
11.权利要求1-10任一项所述的用途，其特征在于所述致免疫肽通过共价附着与所述OmpA蛋白或其片段偶联，从而形成杂合蛋白。
12.权利要求11所述的用途，其特征在于通过共价附着的偶联是由化学合成产生的偶联。
13.权利要求12所述的用途，其特征在于一个或多个附着元件被引入到所述OmpA蛋白或其片段中，和/或引入到所述致免疫肽中，从而促进化学偶联。
14.权利要求13所述的用途，其特征在于所述的被引入的附着元件是氨基酸。
15.权利要求11所述的用途，其特征在于所述杂合蛋白是融合蛋白，其由用编码该杂合蛋白的核酸构建物转化的细胞表达。
16.权利要求15所述的用途，其特征在于所述的药物组合物含有编码所述杂合蛋白的核酸构建物，特别是含在表达载体中，或者含在能够表达所述杂合蛋白的转化宿主细胞中。
17.权利要求1-16任一项所述的用途，其特征在于所述药物组合物是以可改善其稳定性和/或其免疫原性的形式运载的。
18.权利要求17所述的用途，其特征在于该载体是脂质体、含有编码所述OmpA蛋白或其片段、所述致免疫肽或所述杂合蛋白的核酸构建物的病毒载体，或能够表达所述OmpA蛋白或其片段、所述致免疫肽或所述杂合蛋白的转化宿主细胞。
19.权利要求1-18任一项所述的用于制备预防或治疗RSV感染的药物组合物、特别是疫苗组合物用途。
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