CN1167465C - 一种融合防龋dna疫苗及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种融合防龋DNA疫苗及制备方法，大肠杆菌(Esherichiacoli)CCTCC NO：M201042。采用PCR方法，从携带有变形链球菌GS-5株葡糖基转移酶GTF-I的基因gtfB的质粒pYNB13中扩增出编码葡聚糖结合区的序列GLU，并克隆到真核载体pCI中，构建出真核表达质粒pGLU。经DNA序列测定，证实其插入序列的正确性。再将pCIA-P质粒中的变形链球菌表面蛋白PAc的A区和P区的A-P片段序列与pGLU质粒连接，构建出GTF-PAc融合防龋DNA疫苗pGLUA-P。本发明方法简单，生产成本低廉，免疫应答持久，有效防龋。
Description
技术领域
本发明属于口腔预防医学技术领域，尤其是涉及一种PAc和GTFs融合防龋DNA疫苗的制备方法。
背景技术
龋病是一种细菌感染性疾病，许多学者已证明变形链球菌属(MutansStreptococci)与龋病有高度相关性，其中Streptococcus mutans和Streptococcussobribus是引起人类龋病最主要的致病菌。葡糖基转移酶(glucosyltransferaesGTFs)和表面蛋白(surface protein antigen PAc)(又称为抗原B、I/II、IF、P1)是变形链球菌的重要致龋毒力因子。GTFs合成葡聚糖并介导变形链球菌在牙面的葡聚糖依赖性粘附，PAc参与介导了细菌与牙面获得性膜的非葡聚糖依赖性粘附。PAc蛋白中富含丙氨酸的A区和富含脯氨酸的P区为主要的粘附功能区和免疫活性区；GTFs包含有两个免疫活性区和功能区：催化功能区(catalyticregion CAT)和葡聚糖结合区(glucan binding region GLU)。变形链球菌主要合成三种GTFs：GTF-I、GTF-SI、GTF-S，其中GTF-I主要合成以α-1，3糖苷键为主的水不溶性葡聚糖，其编码基因为gtfB。
Taubman等人将根据Streptococcus downei的GTF-I催化功能区的448-457氨基酸序列合成的短肽CAT和葡聚糖结合功能区的1303-1324氨基酸序列合成的短肽GLU与完全弗氏佐剂混合后免疫SD大鼠能够引起明显的血清和唾液抗Streptococcus sobrinus葡糖基转移酶抗体(Taubman，M.A.，D.J.Smith，C.J.Holmberg，and J.W.Eastcott.2000.Coimmunization with complementaryglucosyltransferase peptides results in enhanced immunogenicity and protectionagainst dental caries.Infect Immun 68：2698-703.)。Jespersgaard等人将CAT和GLU多肽免疫兔获得特异性抗体能够明显抑制变形链球菌的GTF合成葡聚糖。将CAT和GLU多肽以鼻内滴注免疫小鼠诱导了明显的粘膜IgA免疫反应(Jespersgaard，C.，G.Hajishengallis，T.E.Greenway，D.J.Smith，M.W.Russell，andS.M.Michalek.1999.Functional and immunogenic characterization of two clonedregions of Streptococcus mutans glucosyltransferase I.Infect Immun 67：810-6.)。Saito等学者采用变形链球菌表面蛋白抗原(PAc)和粘膜佐剂霍乱毒素A亚单位突变体(mCT E112K)共同经鼻粘膜免疫小鼠，结果在唾液和鼻腔分泌物中检测到明显的特异的分泌型抗PAc抗体，同时在颌下腺和鼻腔中检测到大量分泌特异分泌型抗PAc抗体的形成细胞，体外再刺激后发现颈淋巴结CD4(+)细胞明显增殖。而且免疫小鼠后，可以显著降低口腔变链菌的聚集。说明PAc和mCT E112K复合体有望成为有效的粘膜防龋疫苗(Saito，M.，S.Otake，et al.(2001).″Protective Immunity to Streptococcus mutans Induced by Nasal Vaccinationwith Surface Protein Antigen and Mutant Cholera Toxin Adjuvant.″J InfectDis 183(5)：823-826.)。Oishi等认为单独用一种源于PAc蛋白A区的13肽免疫动物几乎不能产生抗体，但是在二聚肽间加入氨基酸残基，尤其是赖氨酸片段，可以明显增强PAc蛋白A区的13肽的抗原性(Oishi，Y.，A.Onozuka，etal.(2001).″The effect of amino acid spacers on the antigenicity ofdimeric peptide-inducing cross-reacting antibodies to a cell surfaceprotein antigen of Streptococcus mutans.″Oral Microbiol Immunol 16(1)：40-44.)。Oho等人构建了包含变形链球菌表面蛋白抗原(PAc)和葡糖基转移酶(GTF)的GLU区的融合蛋白疫苗，并免疫奶牛，获得了含有抗PAc和GTF的特异性抗体，可以抑制Streptococcus mutans与唾液包被的羟基磷灰石珠的粘附。(Oho，T.，Y.Shimazaki，M.Mitoma，M.Yoshimura，Y.Yamashita，K.Okano，Y.Nakano，H.Kawagoe，M.Fukuyama，N.Fujihara，and T.Koga.1999.Bovine milkantibodies against cell surface protein antigen PAc-glucosyltransferase fusion proteinsuppress cell adhesion and alter glucan synthesis of Streptococcus mutans.J Nutr129：1836-41.)
然而以上的各种防龋多肽疫苗存在许多不足之处，首先是这些多肽制备纯化困难，一般需耗时数周且费用昂贵，保存需要特殊条件；其次，多肽防龋疫苗刺激机体产生有效的免疫反应的能力较差，常需添加各种对人体有害的免疫佐剂；多肽防龋疫苗与其它多肽疫苗一样，诱导特异性免疫反应的持续时间一般较短，需反复多次接种才能达到较满意的结果；另外多肽疫苗一般不能诱导婴幼儿产生免疫反应。(Kowalczyk DW，Ertl HCJ.1999.Immune responses to DNA vaccines.CMLS，Cell.Mol.Life Sci.，55：751-770)。
发明内容
本发明的目的是提供一种融合防龋DNA疫苗，将扩增出的编码变形链球菌GS-5株葡糖基转移酶GTF-I的基因gtfB的葡聚糖结合区的序列GLU克隆到真核表达质粒pCIA-P中获得pGLUA-P融合防龋DNA疫苗。
本发明的另一个目的是提供一种制备融合防龋DNA疫苗的制备方法，生产方法简便，成本低廉，纯化简单且产物纯度高。
本发明所提供的大肠杆菌(Escherichia coli)JM109/pGLUA-P，CCTCC NO：M201042。其特征在于运用聚合酶链式反应(PCR)的方法，采用正链引物：5’TCACTCGAGGTACCGGAGAAATGGGCTATCAA3’；负链引物：5’CCCGGGTTAGTCGACAATCCGAACTCGTTC3’，从携带有变形链球菌GS-5株葡糖基转移酶GTF-I的基因gtfB的质粒pYNB13中扩增出编码葡聚糖结合区的序列GLU，并克隆到真核载体pCI中，构建出真核表达质粒pGLU。经DNA序列测定，证实其插入序列的正确性。再将pCIA-P质粒中的变形链球菌表面蛋白PAc的A区和P区的A-P片段序列与pGLU质粒连接，构建出GTF-PAc融合防龋DNA疫苗pGLUA-P。与其它DNA疫苗相比，pGLUA-P具有巨细胞病毒CMV的早期启动子/增强子(CMV IE Pro/En)，该启动子增强表达的能力显著高于其它如劳斯肉瘤病毒启动子LTR、猴病毒40(SV40)等启动子。另外，pGLUA-P的辅助增强表达成分中还含有人β球蛋白基因内含子序列，细胞转染及表达实验表明，该内含子序列可显著增加基因表达，较之仅有CMV启动子而无此内含子的另一个优秀真核表达质粒pcDNA3(Invitrogen公司)，pCI的表达能力要强10到40倍。pGLUA-P质粒中的氨苄青霉素抗性基因(AmpR)内含有两个5’-AACGTT-3’拷贝，该拷贝属于免疫刺激DNA序列(ImmunostimulatoryDNA sequence，ISS)具有诱导机体产生IFN等细胞因子，促进机体对抗原的免疫应答的作用。
与多肽防龋疫苗相比，pGLUA-P DNA防龋疫苗具有以下优点：①pGLUA-P质粒物理化学性质稳定，常温下即可保存，便于运输使用，而多肽疫苗一般需要低温冷藏保存等特殊条件；②pGLUA-P简化了疫苗的生产步骤，仅需完成基因工程的上游部分，省却了下游重组多肽的表达和纯化过程，短时间内可以得到大量的质粒，而且pGLUA-P质粒的纯化方法较为简单且产物纯度很高，而多肽疫苗制备纯化相对困难复杂，一般需耗时数周；③多肽防龋疫苗激发机体产生免疫反应的能力较差，需要添加各种免疫佐剂，但这些佐剂经常引起严重的炎症反应，大大限制了多肽疫苗的应用，而pGLUA-P质粒DNA疫苗本身含有CpG免疫刺激序列可以作为免疫佐剂显著提高机体对pGLUA-P的免疫反应，避免使用各种对人体有害的佐剂；④多肽疫苗一般不能诱导婴幼儿产生免疫反应，但pGLUA-P疫苗可以接种乳鼠诱导特异性抗PAc抗体，该特点十分有利于保护儿童中的龋病易感人群；⑤pGLUA-P如同其他DNA疫苗一样在被以任何途径输入体内后，都可能在被转染的少量细胞中长期表达GLUA-P融合蛋白，不断地刺激机体的免疫系统，诱导长时间的免疫反应。相反多肽疫苗在体内很不稳定易被蛋白酶降解，因而要接种较大量才能引起明显的免疫反应，且要多次接种以维持效果。另外，pGLUA-P能够表达变形链球菌的两种重要毒力因子，细胞和动物实验已证明pGLUA-P能诱导机体产生特异性抗体和抑制龋病的发生和发展，其防龋效果比仅携带A-P片段的DNA疫苗为佳。
附图说明
图1为PAc和GTFs融合防龋DNA疫苗结构示意图
CMV immediate-early enhancer/promoter 巨细胞病毒早期启动子/增强子
Chimeric intron 人β球蛋白基因内含子序列
T7promoter T7噬菌体启动子
GLUA-P fragment GLUA-P重组DNA片段
SV40 late polyA signal SV40病毒晚期加尾信号
Phage f1 region 丝状噬菌体f1复制子
AmpR 氨苄青霉素抗性基因
SalI(1957) 限制性内切酶SalI的酶切位点
XhoI(1964) 限制性内切酶XhoI的酶切位点
KpnI(1075) 限制性内切酶KpnI的酶切位点
HindIII(748) 限制性内切酶HindIII的酶切位点
PAc和GTFs融合防龋DNA疫苗pGLUA-P携带有变形链球菌两个重要毒力因子的免疫活性区和功能区基因序列即：葡糖基转移酶GTF-I中葡聚糖结合区(GLU)序列以及表面蛋白PAc编码A区和P区(A-P)序列，并有能够启动和增强基因在真核细胞中表达的多种控制元件包括：巨细胞病毒早期启动子/增强子、人β球蛋白基因内含子序列、SV40病毒晚期加尾信号。巨细胞病毒CMV的早期启动子/增强子(CMV immediate-early ehancer/promoter)增强表达的能力显著高于其它如劳斯肉瘤病毒启动子LTR、猴病毒40(SV40)等启动子；人β球蛋白基因内含子序列有辅助增强表达作用，氨苄青霉素抗性基因(AmpR)内含有两个5’-AACGTT-3’拷贝，该拷贝属于免疫刺激DNA序列(Immunostimulatory DNAsequence，ISS)，具有诱导机体产生IFN等细胞因子，促进机体对抗原的免疫应答的作用。SV40晚期polyA信号能在RNA多聚酶II的作用下终止转录，并在RNA转录体的3’端加上约200至250个腺嘌呤残基。这种polyA结构能增强RNA的稳定与其后的翻译。f1复制子为丝状噬菌体f1的复制源，便于质粒在大肠杆菌中复制。T7噬菌体启动子为一优良的原核启动子，可以调控A-P片段的表达。
图2 pGLUA-P的酶切鉴定示意图
1 GeneRuler 1Kb DNA Ladder
2 pGLUA-P经MluI酶切
3 pCI经SalI酶切
4 pGLUA-P经SalI和XhoI双酶切
5 pGLUA-P经SalI酶切
6 Lambda DNA/HindIII Marker
图3 GLUA-P片段在大肠杆菌BL-21(DE3)中的表达示意图
1.蛋白质分子量Marker
2.含pGLUA-P的BL-21(IPTG诱导)
3.含pGLUA-P的BL-21(IPTG诱导)
4.含pGLUA-P的BL-21(未作诱导)
5.含pCl的BL-21(IPTG诱导)
6.BL-21(IPTG诱导)
图4重组质粒pGLUA-P转染大鼠原代肌母细胞示意图(SABC法，苏木素衬染，×100)
图5 ELISA检测抗PAc特异性抗体水平结果示意图
sera IgG 血清抗PAc的IgG抗体
sera IgA 血清抗PAc的IgA抗体
saliva IgG 唾液抗PAc的IgG抗体
saliva IgA 唾液抗PAc的IgA抗体
分组说明见附表1
图6龋齿记分分析结果示意图
E为釉质龋，Ds为轻度牙本质龋，Dm为中度牙本质龋附表1定菌鼠的分组和免疫途径
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步详细描述：
根据图1-6可知：运用分子生物学专业软件：DNASIS综合DNA序列分析软件、Gene Construction kit 2.0基因模拟克隆软件、Omiga综合分子生物分析软件、BLAST同源序列分析软件、Oligo引物设计分析软件等软件分析和设计GTF-PAc融合防龋DNA疫苗并模拟克隆全过程。GLU区的引物设计如下：正链引物：5’TCACTCGAGGTACCGGAGAAATGGGCTATCAA3’；负链引物：5’CCCGGGTTAGTCGACAATCCGAACTCGTTC3’在正链和负链引物的5’端分别引入KpnI和SalI限制性酶切位点。运用聚合酶链式反应(PCR)的方法，从携带有变形链球菌GS-5株葡糖基转移酶GTF-I的基因gtfB的质粒pYNB13(纽约州立大学Kuramitsu惠赠)中扩增出编码葡聚糖结合区的序列GLU，并通过KpnI和SalI多克隆位点克隆到真核载体pCI(Promega公司)中，构建出真核表达质粒pGLU。经DNA序列测定，证实了插入序列的正确性。再将携带有变形链球菌表面蛋白PAc的A区和P区的A-P片段序列的pCIA-P质粒以XhoI酶切后将末端以DNA聚合酶Klenow大片段和dNTPs补平，经HindIII酶切后获得了切掉了部分载体序列的线性化pCIA-P质粒；而pGLU经HindIII和SmaI酶切获得了包含部分载体序列和全部GLU序列的粘平末端片段；将两个片段以T4DAN连接酶连接构建出GTF-PAc融合防龋DNA疫苗pGLUA-P(见图1)。酶切分析pGLUA-P：经Mlu I单酶切后呈单一条带，分子量为7.1kb；经Sal I单酶切后呈两条带，分子量分别为4.9kb与2.2kb，经SalI和XhoI双酶切后呈三条带，分子量分别为4.0kb、2.2kb和0.9kb，与预期结果相符，证实重组质粒pGLUA-P携带有GLU和A-P片段(图2)。由于SmaI的5’平端和填平后的XhoI的切端的连接，具有完全正确的阅读框架，保证了A-P片段和GLU片段均可被正确地表达，产生正确的GLUA-P融合蛋白。
将含pGLUA-P的BL-21(DE3)大肠杆菌接种于含Amp的LB培养基，37℃培养过夜。次日将50μl饱和培养物接种于5ml同样的培养基中，37℃培养2小时，加入IPTG(终浓度为1mM)后置37C摇床5小时进行诱导，12000rpm离心1分钟，将沉淀重悬于40μl的2×SDS凝胶加样缓冲液中，100℃加热3分钟，另取只含空白载体pCI经过诱导的BL-21(DE3)、未诱导的BL-21(DE3)/pCIA-P培养物、BL-21(DE3)菌液作为对照。配制15％的分离胶和5％的浓缩胶，依次进行加样，四个样品各加15μl，标准蛋白Marker加20μl。电泳结束后用考马斯亮蓝染液浸泡凝胶染色，甲醇/醋酸溶液脱色，最后作摄影记录。结果显示在Marker的175KDa和83KDa之间出现一条约为115KDa左右的蛋白带，与克隆片段(3129bp，编码含1043个氨基酸的蛋白质)预期表达的蛋白质产物分子量相符，证实了融合蛋白GLUA-P的表达(图3)。
取适量纯化的重组质粒pGLUA-P稀释于200μl无血清的DMEM培养基(以下简称DMEM-SF)中，另取阳离子脂质体DOSPER 12μl稀释于188μlDMEM-SF中，将两者轻轻混合，室温下放置15分钟后逐滴加入细胞培养板中，37℃，5％CO2于细胞培养箱中培养5小时后，重新加入含10％小牛血清的DMEM培养液，37℃培养24-48小时后，细胞进行免疫组织化学染色。转染及免疫组织化学结果显示约10％的细胞胞浆中出现特异性棕色颗粒，证实了GLUA-P融合蛋白可以被在真核细胞中正确表达。(图4)。
将pGLUA-P以股四头肌和颌下腺周围皮下注射接种SD定菌大鼠，并与颌下腺周围皮下注射pCIA-P的免疫效果进行比较，实验分组见附表1。
附表1 定菌鼠的分组和免疫途径
分组 疫苗 接种途径 免疫剂量
A pGLUA-P 颌下腺周围区域皮下注射 100μg/只
B pCIA-P 颌下腺周围区域皮下注射 100μg/只
C pGLUA-P 股四头肌注射 100μg/只
D pCI 股四头肌注射 100μg/只
E 生理盐水 股四头肌注射 100μl/只
70天鼠龄时分别采集唾液、血清和粪便标本，处理后-20°保存待测。将10μg/ml PAc标准冻干品(日本Kyushu大学牙学院Takahiko Oho教授赠)包被96孔酶标板，每孔100μl，4℃过夜洗涤，载体封闭后，将待测血清、唾液、粪便分别按1∶10，1∶5，1∶1的浓度稀释，每孔加样100μl。加入羊抗大鼠IgA、IgG(美国Sigma公司)的浓度为1∶1000和5μg/ml，温育2小时，分别加入1∶5000的碱性磷酸酶标记的兔抗IgG(美国Sigma公司)，温育5小时后显色。酶联检测仪记录波长405nm处的样本OD值。ELISA法检测抗体水平结果：A、B、C组的血清抗PAc的IgG抗体水平明显高于对照组(P＜0.05)，而三组间没有显著差别(P＞0.05)；A、B组的唾液抗PAc的IgA抗体水平明显高于C、D、E组(P＜0.05)，说明pGLUA-P能够刺激机体产生特异性的体液和粘膜免疫反应(图5)。
大白鼠处死后、断颅，然后将其头颅置于高压蒸汽锅中，10Ib/in2处理5分钟，去除软组织，分离上下颌骨，清洗干净，室温干燥。将干燥的颌骨置于0.4％紫脲酸铵染液中浸泡12h，取出后冲洗干净，用厚0.1mm、直径25mm的金钢砂片沿上下颌磨牙牙合面近远中向矢状半切，清洗干燥后，在体视显微镜下根据Keyes经典评估龋齿的方法观察、评估鼠磨牙患龋情况。Keyes龋齿记分结果显示A组的釉质龋和牙本质浅龋记分最低(P＜0.05)，说明颌下腺周围皮下注射接种pGLUA-P的防龋效果最好(图6)。
序列表
pGLUA-P融合防龋DNA疫苗的基因序列如下：
TCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATATTGGCTATTGGCCATT
GCATACGTTGTATCTATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAATATGACCGCCATGTTG
GCATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGA
GTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGAC
GTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTA
TTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGT
CAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCA
GTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGG
ATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCA
CCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCG
TGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCACTAGAAGCTTTATTGC
GGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGCTTCTGACACAACAGTCTCGAACTTAAGCTG
CAGAAGTTGGTCGTGAGGCACTGGGCAGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATA
GAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACAT
CCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGTTCAATTACAGCTCTTAAGGCTAGAGTACTTA
ATACGACTCACTATAGGCTAGCCTCGAGAATTCACGCGTGGTACCGGAGAAATGGGCTATCAAGCCAAA
GGAAAATTTGTAACAACTGCCGATGGTAAAATAAGATATTTTGATAAGCAATCTGGGAACATGTACCG
TAATCGTTTTATTGAAAACGAAGAAGGTAAATGGCTGTATCTCGGTGAAGATGGTGCAGCAGTGACAG
GATCTCAAACCATTAACGGTCAACACCTGTACTTTAGAGCAAACGGTGTTCAGGTCAAGGGTGAATTT
GTCACTGACCACCACGGCCGTATCAGCTATTACGACGGCAATTCAGGGGATCAAATCCGCAACCGCTT
TGTCCGCAATGCTCAGGGTCAATGGTTCTACTTTGATAACAATGGCTATGCCGTAACCGGTGCCAGAA
CCATTAACGGTCAACTCCTATACTTTAGAGCAAACGGTGTTCAGGTCAAGGGTGAATTTGTCACTGAC
CGCTACGGCCGTATCAGCTATTACGACGGCAATTCAGGGGATCAAATCCGCAACCGCTTTGTCCGCAA
TGCTCAGGGTCAATGGTTCTACTTTGATAACAATGGCTATGCCGTAACCGGTGCCAGAACCATTAACG
GTCAACACCTATACTTTAGAGCAAACGGTGTTCAGGTCAAGGGTGAATTTGTCACTGACCGCCACGGC
CGTATCAGCTATTACGACGGCAATTCAGGGGATCAAATCCGCAACCGCTTTGTCCGCAATGCTCAGGG
TCAATGGTTCTACTTTGATAACAATGGCTATGCCGTAACCGGTGCCAGAACCATTAACGGTCAACACC
TATACTTTAGAGCAAACGGTGTTCAGGTCAAGGGTGAATTTGTCACTGACCGCTACGGCCGTATCAGT
TATTACGATGCTAACTCTGGAGAACGAGTTCGGATTGTCGACCCTCGAGAAATGGCTGCCAATCAAGC
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ATGCCGCAAACGAAGCAGACTATCAAGCTAAATTGACCGCCTATCAAACAGAGCTCGCTCGCGTTCAA
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GCAAAATATGACCAAAAAATTCTTCAATTAGATGATCTAGATATCACTAACTTAGAACAATCTAATGA
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TAAGTCCAAGTTTCAAGGTCAAAAGGTTTGGTTAGGTATTTTTACCGATCCAACTTTAGGTGTTTTTG
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TAATGCCAGTTTCTGACATGCCTGTTGTTCCTGGTAAGGACAATACTGATGGCAAAAAACCAAATATT
TGGTATTCTTTAAATGGTAAAATCCGTGCGGTTAATGTTCCTAAAGTTACTAAGGAAAAACCCACACC
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AAACAGAAAAGCCGTTGGAGCCAGCACCTGTTGAGCCAAGCTATGAAGCAGAGCCAACGCCACCGACA
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AGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGATGTGGGAGGTTTTTTAAAG
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CACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTA
AGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCT
TTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTC
CCTTTAGGGTTCCGATTTAGAGCTTTACGGCACCTCGACCGCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCA
CGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGT
GGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATT
TTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAATATTTAACGCGAATTTTAACAAA
ATATTAACGTTTACAATTTCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCG
CATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAAC
ACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTC
CGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGAT
ACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGG
AAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACA
ATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGC
CCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAA
AGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCT
TGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGT
ATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGT
TGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGC
CATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAAC
CGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGC
CATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAAC
TGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGG
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GTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGAC
GGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCA
TTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAA
AAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCA
CTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTG
CTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCT
TTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTT
AGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGC
TGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCA
GCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAG
ATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGT
AAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAG
TCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCT
ATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGGC
TCGACAGATCT
黑体部分为GLUA-P片段。
Claims (2)
1、一种融合防龋DNA疫苗，其特征在于大肠杆菌Esherichia coli，CCTCCNO：M201042携带质粒pGLUA-P，DNA序列为：
TCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATATTGGCTATT
GGCCATTGCATACGTTGTATCTATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAATA
TGACCGCCATGTTGGCATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCAT
TAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTG
GCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTA
ACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCA
CTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACG
GTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGG
CAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACC
AATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACG
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GTTGGTCGTGAGGCACTGGGCAGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAG
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TATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGTTCAA
TTACAGCTCTTAAGGCTAGAGTACTTAATACGACTCACTATAGGCTAGCCTCGAGAATT
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TGACAGGATCTCAAACCATTAACGGTCAACACCTGTACTTTAGAGCAAACGGTGT
TCAGGTCAAGGGTGAATTTGTCACTGACCACCACGGCCGTATCAGCTATTACGAC
GGCAATTCAGGGGATCAAATCCGCAACCGCTTTGTCCGCAATGCTCAGGGTCAAT
GGTTCTACTTTGATAACAATGGCTATGCCGTAACCGGTGCCAGAACCATTAACGG
TCAACTCCTATACTTTAGAGCAAACGGTGTTCAGGTCAAGGGTGAATTTGTCACT
GACCGCTACGGCCGTATCAGCTATTACGACGGCAATTCAGGGGATCAAATCCGCA
ACCGCTTTGTCCGCAATGCTCAGGGTCAATGGTTCTACTTTGATAACAATGGCTAT
GCCGTAACCGGTGCCAGAACCATTAACGGTCAACACCTATACTTTAGAGCAAACG
GTGTTCAGGTCAAGGGTGAATTTGTCACTGACCGCCACGGCCGTATCAGCTATTA
CGACGGCAATTCAGGGGATCAAATCCGCAACCGCTTTGTCCGCAATGCTCAGGG
TCAATGGTTCTACTTTGATAACAATGGCTATGCCGTAACCGGTGCCAGAACCATTA
ACGGTCAACACCTATACTTTAGAGCAAACGGTGTTCAGGTCAAGGGTGAATTTGT
CACTGACCGCTACGGCCGTATCAGTTATTACGATGCTAACTCTGGAGAACGAGTT
CGGATTGTCGACCCTCGAGAAATGGCTGCCAATCAAGCAGCCTATCAAAAAGCCC
TTGCTGCTTATCAGGCTGAACTGAAACGTGTTCAGGAAGCTAATGCAGCCGCCAA
AGCCGCTTATGATACTGCTGTAGCAGCAAATAATGCCAAAAATACAGAAATTGCC
GCTGCCAATGAAGAAATTAGAAAACGCAATGCAACGGCCAAAGCTGAATATGAGA
CTAAGTTAGCTCAATATCAAGCTGAACTAAAGCGTGTTCAGGAAGCTAATGCCGC
AAACGAAGCAGACTATCAAGCTAAATTGACCGCCTATCAAACAGAGCTTGCTCGT
GTTCAAAAAGCCAATGCGGATGCTAAAGCGACCTATGAAGCAGCTGTAGCAGCA
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ATGAGAATGCTAAGGCGACTTATGAAGCTGCACTCAAGCAATATGAGGCCGATTT
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GACCGCCTATCAAACAGAGCTCGCTCGCGTTCAAAAAGCCAATGCGGATGCTAAA
GCGGCCTATGAAGCAGCTGTAGCAGCAAATAATGCCGCAAATGCAGCGCTCACA
GCTGAAAATACTGCAATTAAGAAGCGCAATGCGGATGCTAAAGCTGATTACGAAG
CAAAACTTGCTAAGTATCAAGCAGATCTTGCCAAATATCAAAAAGATTTAGCAGAC
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GGCAGAACTTGAAAAACATAAAAATGAAGACGGAAACTTAACAGAACCATCTGCT
CAAAATTTGGTCTATGATCTTGAGCCAAATGCGAACTTATCTTTGACAACAGATGG
GAAGTTCCTTAAGGCTTCTGCTGTGGATGATGCTTTTAGCAAAAGCACTTCAAAA
GCAAAATATGACCAAAAAATTCTTCAATTAGATGATCTAGATATCACTAACTTAGA
ACAATCTAATGATGTTGCTTCTTCTATGGAGCTTTATGGGAATTTTGGTGATAAAG
CTGGCTGGTCAACGACAGTAAGCAATAACTCACAGGTTAAATGGGGATCGGTACT
TTTAGAGCGCGGTCAAAGCGCAACAGCTACATACACTAACCTGCAGAATTCTTAT
TACAATGGTAAAAAGATTTCTAAAATTGTCTACAAGTATACAGTGGACCCTAAGTC
CAAGTTTCAAGGTCAAAAGGTTTGGTTAGGTATTTTTACCGATCCAACTTTAGGT
GTTTTTGCTTCTGCTTATACAGGTCAAGTTGAAAAAAACACTTCTATTTTTATTAA
AAATGAATTCACTTTCTATCACGAAGATGAAAAACCAATTAATTTTGATAATGCCC
TTCTCTCAGTGACTTCTCTTAACCGTGAACATAACTCTATTGAGATGGCTAAAGAT
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ACTATGTATAAAAATAGTCAAGCTGGTTCAGGATGGGATAGTTCAGATGCGCCGA
ATTCTTGGTATGGAGCAGGGGCTATTAAAATGTCTGGTCCGAATAACCATGTTACT
GTAGGAGCAACTTCTGCAACAAATGTAATGCCAGTTTCTGACATGCCTGTTGTTC
CTGGTAAGGACAATACTGATGGCAAAAAACCAAATATTTGGTATTCTTTAAATGGT
AAAATCCGTGCGGTTAATGTTCCTAAAGTTACTAAGGAAAAACCCACACCTCCGG
TTAAACCAACAGCTCCAACTAAACCAACTTATGAAACAGAAAAGCCATTAAAACC
GGCACCAGTAGCTCCAAATTATGAAAAGGAGCCAACACCGCCGACAAGGACACC
GGATCAAGCAGAGCCAAACAAACCCACACCGCCGACCTATGAAACAGAAAAGCC
GTTGGAGCCAGCACCTGTTGAGCCAAGCTATGAAGCAGAGCCAACACCGCCGAC
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AGAAAAGCCGTTGGAGCCAGCACCTGTTGAGCCAAGCTATGAAGCAGAGCCAAC
GCCACCGACACCAACACCAGATCAACCAGAACCAAACAAACCTGTTGAGCCAAC
TTATGAGTAAGTCGACCCCGGGCGGCCGCTTCGAGCAGACATGATAAGATACATTGAT
GAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTT
GTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACA
ATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGATGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAG
TAAAACCTCTACAAATGTGGTAAAATCGATAAGGATCCGGGCTGGCGTAATAGCGAAG
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CCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTA
CACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACG
TTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAG
AGCTTTACGGCACCTCGACCGCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGG
CCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGT
GGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTA
TAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAATATTT
AACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCT
TACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGA
TGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGG
GCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCA
TGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGAT
ACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCAC
TTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATAT
GTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGA
GTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCC
TGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGT
GCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTC
GCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTA
TTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAA
TGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTA
AGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCT
GACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCAT
GTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGC
GTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGA
ACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTG
CAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGA
GCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCT
CCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAG
ACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTT
ACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAA
GATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGC
GTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAA
TCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCA
AGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAAT
ACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCC
TACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGT
GTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTG
AACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAG
ATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGA
CAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGG
GGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTC
GATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGC
CTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGGCTCGACAGATCT
2、一种实现权利要求1所述的一种融合防龋DNA疫苗的制备方法，其特征在于采用正链引物5’TCACTCGAGGTACCGGAGAAATGGGCTATCAA3’、负链引物5’CCCGGGTTAGTCGACAATCCGAACTCGTTC3’；从携带有变形链球菌GS-5株葡糖基转移酶GTF-I的基因gtfB质粒pYNB13中扩增出编码葡聚糖结合区的序列GLU，并克隆到真核载体pCI中，构建出真核表达质粒pGLU，再将pCIA-P质粒中的变形链球菌表面蛋白PAc的A区和P区的A-P片段序列与pGLU质粒连接，构建出GTF-PAc融合防龋DNA疫苗pGLUA-P。
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