CN1668746A - 具有数目减少的vntr重复单位的muc－1抗原 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及新的核酸构建体，所述构建体在核酸疫苗方案中用于治疗和预防表达MUC－1的肿瘤。具体地讲，所述核酸是DNA，所述DNA构建体包含一个具有少于10个完全重复单位的编码MUC－1衍生物的基因。本发明还提供包含所述构建体的药用组合物、特别是适于颗粒介导传递的药用组合物、制备它们的方法以及它们在药物中的用途。也提供由所述核酸编码的新的蛋白和含有它们的药用组合物。
Description
本发明涉及新的核酸构建体，所述构建体在核酸疫苗方案中用于治疗和预防表达MUC-1的肿瘤。具体地讲，所述核酸是DNA，所述DNA构建体包含一个具有少于10个完全重复单位的编码MUC-1衍生物的基因。本发明还提供包含所述构建体的药用组合物、尤其是适于颗粒介导传递的药用组合物、制备它们的方法以及它们在药物中的用途。也提供由所述核酸编码的新的蛋白和含有它们的药用组合物。
发明背景
上皮细胞粘蛋白MUC-1(也称为上皮唾蛋白(episialin)或多形性上皮粘蛋白，PEM)是在许多上皮细胞上表达的大分子量糖蛋白。所述蛋白由一个胞质尾、一个跨膜结构域和一个20个氨基酸基序的变数串联重复(在本文称为VNTR单体，也可称为VNTR表位或VNTR重复)组成，所述VNTR重复含有高比例的脯氨酸残基、丝氨酸残基和苏氨酸残基。因为MUC-1基因座上的遗传多态性，重复数目是可变的，最通常在30-100个范围内(Swallow等，1987，Nature 328：82-84)。在正常的导管上皮中，MUC-1蛋白仅存在于细胞顶面，向管腔暴露(Graham等，1996，Cancer Immunol Immunother 42：71-80；Barratt-Boyes等，1996，Cancer Immunol Immunother 43：142-151)。MUC-1分子的最显著特征之一是其广泛存在的O联糖基化。每个MUC-1 VNTR单体中有5个推定的O联糖基化位点。按照以下编号系统，它们是Thr-4、Ser-10、Thr-11、Ser-19和Thr-20。
VNTR可以表征为具有如下所示的序列的典型或完全重复序列、或包含与所述20个氨基酸相比有2-3个差异的完全重复序列的小变异：
下面是所述完全重复的序列。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
A P D T R P A P G S T A P P A H G V T S
E S T
A
Q
有下划线的氨基酸可以被所示氨基酸残基取代。
不完全重复序列对所述共有序列具有不同的氨基酸取代，在氨基酸水平上约有55-90％同一性。4个不完全重复序列如下所示，下划线是取代：
APDTRPAPGSTAPPAHGVTS-完全重复
AP
AT
EPA
SGS
AA
TWGQDVTS-不完全重复1
VP
VTRPA
LGST
TPPAH
DVTS-不完全重复2
APD
NKPAPGSTAPPAHGVTS-不完全重复3
APD
NRPA
LGSTAPP
VH
NVTS-不完全重复4
野生型MUC-1中的不完全重复邻接完全重复区。在这些上皮细胞瘤性转化引起的恶性肿瘤中，一些改变影响了MUC-1的表达。所述蛋白的极化表达丧失，发现它遍布于转化细胞整个表面。MUC-1的总量也增加了，一般为10倍或10倍以上(Strous & Dekker，1992，CritRev Biochem Mol Biol 27：57-92)。最值得注意的是，其O联糖链的数量和质量发生了明显变化。较少丝氨酸残基和苏氨酸残基被糖基化。发现这些糖链异常缩短，产生肿瘤相关糖抗原STn(Lloyd等，1996，JBiol Chem，271：33325-33334)。这些糖基化变化的结果是：MUC-1肽链上先前被所述糖链遮盖的各种表位变得可及。通过每20个氨基酸VNTR完全单体上存在的序列APDTR(图2中的Ala8-Arg12)，形成一个以这种方式变得可及的表位(Burchell等，1989，Iht J Cancer44：691-696)。
显然，在MUC-1中的这些变化，意味着能激活针对肿瘤上表达MUC-1形式的免疫系统的疫苗，对上皮细胞肿瘤是有效的，并且甚至对发现MUC-1的其它细胞类型例如T淋巴细胞等也是有效的。免疫系统用来杀伤表达异常蛋白的细胞的重要的效应器机制之一是细胞毒性T淋巴细胞免疫应答(CTL′s)，而这样的应答正是治疗肿瘤的疫苗以及抗体应答所需要的。一个好的疫苗将激活所有武装的免疫应答。然而，目前的糖疫苗和肽疫苗例如癌疫苗(Theratope)或BLP25(Biomira Inc，Edmonton，Canada)优先激活一个武装的免疫应答—分别是体液应答和细胞应答，而较好的疫苗设计最好是产生更平衡的应答。
与常规蛋白疫苗相比，核酸疫苗提供许多优势，因为它们容易大量制备。据报道，它们甚至是在小剂量下也能诱导强烈的免疫应答，并能诱导细胞毒性T淋巴细胞免疫应答以及抗体应答。
然而，全长MUC-1因其高度重复序列而很难操作，因为它非常容易重组，这样的重组事件给生物制药开发带来很大困难。而且，VNTR区富含GC的特性使测序困难。此外，因为法规的原因—必需充分表征所述DNA构建体。对这样的高频重复结构进行分子测序是非常困难的。如果未能准确了解野生型MUC-1中有多少重复单位，则无法准确表征全长MUC-1，这对获得管理部门的批准来说是不可接受的。
认为MUC-1 VNTR区含有优势免疫表位。令人惊奇地的是，本发明人发现了能够减少VNTR的数目，从而制备出免疫原性构建体，所述构建体具有与野生型全长MUC-1等同的抗肿瘤活性。本发明的构建体是稳定的。具体地讲，在作为大肠杆菌(E.coli)培养物生长了9代、每代持续10-14小时的过程中，所述构建体在生长特征、质粒保留和质粒质量方面是稳定的。
发明概述
本发明提供一种编码MUC-1抗原的核酸序列，所述序列能在体内提高免疫应答，并且是稳定的，与全长MUC-1相比降低了重组易发性。稳定性是对以限定形式存在的质粒量的度量。在大规模生长后，用琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶进行测定时，用内眼目测，最好是小于2.0％的重组体污染。通常，大规模是指生长规模大于一升。另有一个对稳定性的独立度量，即质粒拷贝在传代期间保持稳定。质粒拷贝数最好随传代数而增加，尤其是自1-9代开始。优选质粒拷贝数增加约10％、20％、30％、35％、40％，最优选在9代中增加约50％。在具体的实施方案中，本发明提供具有1-15个、优选1-10个完全VNTR重复单位的构建体。优选少于8个完全重复。优选的实施方案提供分别带有一个、两个、三个、四个、五个、六个和七个重复的DNA构建体。在本发明的某些实施方案中，保留了所述不完全重复区。优选含有一个或七个完全重复的构建体。由所述构建体编码的蛋白是新的，构成本发明的一个方面。
在本发明的另一方面，所述核酸序列是呈质粒形式的DNA序列。优选所述质粒是超螺旋的。
在本发明的另一方面，提供一种包含本文所述核酸序列和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体的药用组合物。
所述载体最好是金珠，而所述药用组合物最好能通过颗粒介导递药而传递。
在又一个实施方案中，本发明提供用于药物的药用组合物和核酸构建体。具体地讲，提供本发明的核酸构建体，以制备用于治疗或预防表达MUC-1的肿瘤的药物。
本发明还通过给予安全有效量的本文所述组合物或核酸，提供一种治疗患有或易患表达MUC-1的肿瘤的患者的方法，所述表达MUC-1的肿瘤尤其是乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌(尤其是非小细胞肺癌)、胃癌和其它GI(胃肠)癌。
在又一个实施方案中，本发明提供一种制备本文所述药用组合物的方法，所述方法通过将本发明的核酸构建体或蛋白与药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体混合。
发明详述
如本文所述，本发明的核酸构建体一般具有少于15个完全重复、更典型少于10个完全重复。野生型MUC-1(参见图1)分子含有一个信号序列、一个前导序列、不完全或非典型VNTR、完全VNTR区、一个额外的非典型VNTR、一个非VNTR胞外结构域、一个跨膜结构域和一个胞质结构域。
本发明优选的实施方案具有少于14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个重复。特别优选的构建体具有1个、2个或7个完全重复。
非VNTR胞外结构域是VNTR 5′的约80个氨基酸和VNTR 3′的190-200个氨基酸。本发明的所有构建体都包含至少一个来自该区的表位。通常由至少7个氨基酸序列形成一个表位。因此，本发明的构建体包括至少一个来自非VNTR胞外结构域的表位。优选包括几乎所有的非VNTR结构域，或更优选包括所有的非VNTR结构域。特别优选的构建体含有至少一个表位，所述表位包含在序列FLSFHISNL、NSSLEDPSTDYYQELQRDISE或NLTISDVSV中。更优选在所述构建体中包含两个、优选三个表位序列。
在一个优选的实施方案中，所述构建体包含一个N端前导序列。所述信号序列、跨膜结构域和胞质结构域各自独立地任选存在于所述构建体中。全都可以存在，或者可以缺失一个或多个。
本发明优选的构建体是：
1)7 VNTR MUC-1(即只带有7个完全重复的全Muc-1)
2)7 VNTR MUC-1 Δss(同1，但也不含信号序列)
3)7 VNTR MUC-1 ΔTM ΔCYT(同1，但不含跨膜结构域和胞质结构域)
4)7 VNTR MUC-1 Δss ΔTM ΔCYT(同3，但也不含信号序列)。
也优选与以上1-4等同、但仅含有2个VNTR或1个VNTR的构建体。在所述构建体中的VNTR具有上文描述的完全重复序列。在一个实施方案中，通过改变糖基化位点，使一个或多个VNTR单位突变，从而降低糖基化潜力。所述突变最好是取代，但也可以是插入或缺失。通常至少一个苏氨酸或丝氨酸被缬氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、苯丙氨酸或色氨酸取代。在野生型VNTR单体中，每个MUC-1 VNTR单体内有5个推定的O联糖基化位点。它们是(参见以上编号)Thr-4、Ser-10、Thr-11、Ser-19和Thr-20。因此，优选至少1个、优选2个或3个或更多个、优选至少4个残基被上述氨基酸取代。
优选的取代包括：
Thr 4→ Val
Ser 10→Ala
Thr 11→ILe或Val
Ser 19→Val
Thr 20→Ala
在另一个实施方案中，提供带有编码异源T细胞表位的核酸序列的MUC-1构建体。所述表位包括来源于细菌蛋白和毒素(例如破伤风毒素和白喉毒素)的T细胞表位。例如，来源于破伤风毒素的P2表位和P30表位。所述表位可以是较长序列的一部分。所述表位可以掺入到所述核酸分子中或掺入到本发明序列的3′端或5′端。
其它融合配偶体也可以考虑，例如来源于乙型肝炎核心抗原或结核的融合配偶体。在一个实施方案中，融合配偶体来源于结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)RA12即MTB32A的一个亚序列(氨基酸192-323)(Skeiky等，Infection and Immunity(1999)67：3998-4007)。
其它免疫融合配偶体包括例如来源于乙型流感嗜血菌(Haemophilus influenza B)的D蛋白(WO 91/18926)或来源于肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的LYTA的一部分(通常是C端部分)(Biotechnology 10：795-798，1992)。
根据本发明的另一方面，提供一种表达载体，所述载体包含本发明的多核苷酸序列并能指导所述多核苷酸序列的表达。所述载体可适于在细菌细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞、尤其是人类细胞中驱动异源DNA表达。
根据本发明的另一方面，提供一种宿主细胞，所述细胞包含本发明的多核苷酸序列或本发明的表达载体。所述宿主细胞可以是细菌例如大肠杆菌细胞、哺乳动物细胞例如人类细胞，或者可以是昆虫细胞。包含本发明载体的哺乳动物细胞可以是经体外转染的培养细胞，或者可以是通过将所述载体给予哺乳动物而体内转染的细胞。
本发明还提供一种药用组合物，所述组合物包含本发明的多核苷酸。优选所述组合物包含DNA载体。在优选的实施方案中，所述组合物包含许多颗粒、优选金颗粒，所述颗粒被包含编码本发明多核苷酸序列的载体的DNA包埋，所述序列如上所述编码MUC-1氨基酸序列。在替代实施方案中，所述组合物包含药学上可接受的赋形剂和本发明的DNA载体。
所述组合物也可包括佐剂，或与佐剂或免疫刺激剂一起给药或序贯给药。
因此，在本发明的一个实施方案中，本发明的载体与免疫刺激剂一起使用。优选所述免疫刺激剂与本发明的核酸载体同时给药，在一个优选的实施方案中，将它们两者配制在一起。所述免疫刺激剂包括以下药物(但该表并非是详尽的，也不排除其它制剂)：合成的咪唑并喹啉类例如咪喹莫特[S-26308，R-837]，(Harrison等，′Reductionof recurrent HSV disease using imiquimod alone or combined with aglycoprotein vaccine(单独使用咪喹莫特或与糖蛋白疫苗联用以降低复发性HSV疾病)′，Vaccine 19：1820-1826，(2001))和瑞喹莫德[S-28463，R-848](Vasilakos等，′Adjuvant activites of immune response modifierR-848：Comparison with CpG ODN(免疫应答调节剂R-848的佐剂活性：与CpG ODN的比较)′，Cellular immunology 204：64-74(2000).)、在抗原呈递细胞和T细胞表面组成型表达的羰基和氨基的席夫碱，例如妥卡雷琐(Rhodes，J.等，′Therapeutic potentiation of immune systemby costimulatory Schiff-base-forming drugs(共同刺激的形成席夫碱的药物的免疫系统治疗增强作用′，Nature 377：71-75(1995))、细胞因子、趋化因子和共同刺激分子(可以是蛋白或肽)，所述分子包括促炎细胞因子例如干扰素，尤其是干扰素和GM-CSF、IL-1α、IL-1β、TGF-α和TGF-β，Th1诱导物，例如干扰素γ、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和IL-21，Th2诱导物例如IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13和其它趋化因子和共同刺激基因，例如MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、TCA-3、CD80、CD86和CD40L，其它免疫刺激靶向配体例如CTLA-4和L-选择蛋白、细胞凋亡刺激蛋白和肽，例如Fas、(49)、合成脂基佐剂，例如vaxfectin(Reyes等，′Vaxfectin enhances antigen specificantibody titres and maintains Th1 type immune responses to plasmid DNAimmunization(vaxfectin增强抗原特异性抗体效价并维持对质粒DNA免疫的Th1型免疫应答)′，Vaccine 19：3778-3786)、角鲨烯、α-生育酚、吐温80、DOPC和胆固醇、内毒素、[LPS](Beutler，B，.′Endotoxin，Toll-like receptor 4，and the afferent limb of innate immunity(内毒素，Toll样受体4和先天免疫的传入分支)′，Current Opinion in Microbioloty3：23-30(2000)；CpG寡核苷酸和CpG二核苷酸(Sato，Y.等，′Immunostimulatory DNA sequences necessary for effective intradermalgene immunization(对有效皮内基因免疫必要的免疫刺激性DNA序列)′，Science 273(5273)：352-354(1996).Hemmi，H.等，′A Toll-likereceptor recognizes bacterial DNA(Toll样受体识别细菌DNA)′，Nature408：740-745，(2000))和其它能触发Toll受体产生诱导Th1的细胞因子的配体，所述诱导Th1的细胞因子例如合成分枝杆菌脂蛋白、分枝杆菌蛋白p19、肽聚糖、磷壁酸和脂质A。其它来源于细菌的免疫刺激蛋白包括霍乱毒素、大肠杆菌毒素以及它们的突变类毒素。
某些引发优势Th1-型应答的优选佐剂包括例如脂质A衍生物例如单磷酰脂质A，或优选3-脱-O-酰化单磷酰脂质A。MPL佐剂可得自Corixa Corporation(Seattle，WA；参见例如美国专利第4,436,727、4,877,611、4,866,034和4,912,094号)。含有CpG的寡核苷酸(其中CpG二核苷酸是未甲基化的)也诱导优势Th1应答。所述寡核苷酸是众所周知的，描述于例如WO 96/02555、WO 99/33488和美国专利第6,008,200和5,856,462号中。免疫刺激性DNA序列也有描述，例如Sato等，Science 273：352，1996。另一种优选的佐剂包含皂苷，例如QuilA或其衍生物，包括QS21和QS7(Aquila Biopharmaceuticals Inc.，Framingham，MA)；七叶皂苷；毛地黄皂苷；或丝石竹属(Gypsophila)或白藜(Chenopodium quinoa)皂苷。
也提供了本发明的多核苷酸或蛋白、或本发明的载体在治疗或预防表达MUC-1的肿瘤或转移瘤中的用途。
本发明也提供治疗或预防表达MUC-1的肿瘤、任何症状或相关疾病(包括转移瘤)的方法，所述方法包括给予有效量的本发明的多核苷酸、载体或药用组合物。药用组合物的给予可采用一个剂量或多个单独剂量的形式，例如以“初次-加强”的治疗性接种方案。在某些情况下，所述“初次”接种可以通过颗粒介导DNA给予本发明的多核苷酸，优选将其掺入到来源于质粒的载体中，而所述“加强”接种通过给予包含相同多核苷酸序列的重组病毒载体，或用在佐剂中的所述蛋白来加强。反过来说，所述初次接种可用病毒载体或用蛋白制剂(一般是配制在佐剂中的蛋白)，而所述加强接种可以用本发明的DNA疫苗。
如上所讨论的，本发明包括包含本发明核苷酸序列的表达载体。所述表达载体可用分子生物学技术常规构建，并可例如包括使用质粒DNA和合适的起始密码子、启动子、增强子和其它元件，例如必要的和位于正确方向的聚腺苷酸化信号等，以便允许蛋白表达。其它合适的载体对本领域技术人员来说是显而易见的。在这一方面为了进一步举例说明，我们参考了Sambrook等，Molecular Cloning：aLaboratory Manual.第2版，CSH Laboratory Press.(1989)。
本发明的多核苷酸、或者用于本发明的载体中，最好有效连接控制序列，所述控制序列能够让宿主细胞表达编码序列，也就是说，所述载体是表达载体。术语“有效连接”是指并列关系，其中所述组件间的关系能让它们以既定方式起作用。以这样的方式“有效连接”编码序列的调节序列例如启动子，使得在与所述调节序列相容的条件下所述编码序列能够表达。
所述载体可以是例如带有复制起点、任选带有所述多核苷酸表达启动子和任选所述启动子的调节子的质粒、人工染色体(例如BAC、PAC、YAC)、病毒载体或噬菌体载体。所述载体可含有一个或多个选择标记基因，例如在细菌质粒的情况下是氨苄西林或卡那霉素抗性基因，或者是用于真菌载体的抗性基因。载体可以用于体外，例如用于DNA或RNA的制备，或用于转染或转化宿主细胞(例如哺乳动物宿主细胞)，例如用于所述载体编码的蛋白的制备。所述载体也可适用于体内，例如用于DNA接种方法或基因治疗方法。
可以选择与设计用于表达的宿主细胞相容的启动子和其它表达调节信号。例如，哺乳动物启动子包括金属硫蛋白启动子和β-肌动蛋白启动子，所述金属硫蛋白启动子能诱导对重金属(例如镉)的应答。也可以使用病毒启动子，例如SV40大T抗原启动子、人巨细胞病毒(CMV)立即早期(IE)启动子、劳斯肉瘤病毒LTR启动子、腺病毒启动子或HPV启动子、尤其是HPV上游调节区(URR)。所有这些启动子在本领域中都已充分描述并容易使用。
一个优选的启动子元件是缺乏内含子A、但包含外显子1的CMV立即早期启动子。因此，提供一种包含处于HCMV IE早期启动子的控制之下的本发明多核苷酸的载体。
合适的病毒载体实例包括单纯疱疹病毒载体、痘苗病毒载体或甲病毒载体和逆转录病毒，包括慢病毒、腺病毒和腺伴随病毒。使用这些病毒的基因转移技术对本领域技术人员来讲是已知的。例如逆转录病毒载体可用于将本发明的多核苷酸稳定地整合到宿主基因组中，尽管这样的重组并不是最好的。相比之下，复制缺陷型腺病毒载体却保留了附加体，因而允许瞬时表达。可以使用能驱动在昆虫细胞(例如杆状病毒载体)、人类细胞或细菌中表达的载体，以便制备大量的由本发明多核苷酸编码的HIV蛋白，例如用作亚单位疫苗或用于免疫测定。在病毒疫苗中，当如前所述产生全长痘苗构建体的努力不成功时，本发明的多核苷酸尤其有用。
本发明的多核苷酸用于所述编码蛋白表达的制备中，所述表达可在体外、体内或离体发生。因此，所述核苷酸可参与重组蛋白合成，例如以便提高产量，或者甚至可在DNA疫苗技术中找到它们作为治疗剂的自身特有的正当用途。当本发明的多核苷酸用于在体外或离体制备所述编码蛋白时，可以修饰细胞(例如在细胞培养中)，使之包含待表达的多核苷酸。所述细胞包括瞬时哺乳动物细胞系、或优选稳定的哺乳动物细胞系。可通过插入编码本发明多肽的载体而修饰的细胞的具体实例包括哺乳动物HEK293T、CHO、HeLa、293和COS细胞。所选用的细胞系最好是不仅稳定而且还允许多肽的成熟糖基化和细胞表面表达。在转化的卵母细胞中可以进行表达。在转基因非人类动物细胞中、优选在小鼠细胞中，本发明的多核苷酸可表达为多肽。从本发明的多核苷酸表达多肽的转基因非人类动物包括在本发明的范围内。
本发明还提供给哺乳动物受试者接种的方法，所述方法包括给予受试者有效量的所述疫苗或疫苗组合物。最优选用于DNA疫苗、疫苗组合物和免疫治疗剂的表达载体是质粒载体。
DNA疫苗可以以“裸DNA”形式给予，例如以液体制剂形式用注射器或高压喷射法给予，或者将DNA与脂质体或刺激性转染增强剂一起配制，或者通过颗粒介导DNA传递(PMDD)。所有这些传递系统都是本领域众所周知的。所述载体可导入哺乳动物体内，例如通过病毒载体传递系统的方式。
本发明的组合物可以通过各种途径给予，例如肌内、皮下、腹膜内或静脉内给予。
在一个优选的实施方案中，所述组合物经皮内给予。具体地讲，所述组合物以基因枪(尤其是颗粒轰击)给药技术的方式传递，所述给药技术包括将所述载体包埋在微珠(例如金珠)上，然后用高压给予皮内，例如Haynes等，J Biotechnology 44：37-42(1996)所述。
在一个说明性实施例中，可以使用例如PowderjectPharmaceuticals PLC(Oxford，UK)和Powderject Vaccines Inc.(Madison，WI)生产的装置，达到气体驱动颗粒加速，其中某些实例描述于美国专利第5,846,796、6,010,478、5,865,796、5,584,807号和欧洲专利第0500 799号。该方法提供无针递送方法，其中用手持式装置产生的氦气射流将微细颗粒的干粉制剂(例如多核苷酸)加速到高速，将所述颗粒推进到目标靶组织，通常是皮肤。所述颗粒是优选直径为0.4-4.0μm、更优选为0.6-2.0μm的金珠，而所述DNA缀合物包埋在其上，然后装入药筒或药盒中，置入“基因枪”中。
在一个相关实施方案中，可用于本发明组合物的气驱式无针注射的其它装置和方法包括由Bioject，Inc.(Portland，OR)提供的装置和方法，其中某些实例描述于美国专利第4,790,824、5,064,413、5,312,335、5,383,851、5,399,163、5,520,639和5,993,412号。
将包含编码抗原肽的核苷酸序列的载体以预防或治疗有效量给予。通常给药量是每剂中核苷酸的范围为：对于颗粒介导传递是1皮克至1毫克、优选1皮克至1微克，而对于其它途径是10微克至10毫克。准确剂量可根据待免疫的患者体重和给药途径而变化。
可以将包含编码所述抗原肽的核苷酸序列的免疫原组分一次性给予，或者按约1天和约18个月的间隔重复给予例如1-7次，优选1-4次。然而，将再次根据患者体型、待治疗/预防疾病、给予的核苷酸序列量、给药途径和对熟练医师来说是显而易见的其它因素，而显著改变该治疗方案。所述患者可接受作为他们的总体治疗方案组成部分的一种或多种其它抗癌药物。
将所述裸多核苷酸或载体导入患者体内的合适的技术也包括与合适溶媒一起用于局部应用。所述核酸可局部给予皮肤或粘膜表面，例如通过鼻内、口服、阴道内或直肠内给药。所述裸多核苷酸或载体可与药学上可接受的赋形剂(例如磷酸缓冲盐溶液(PBS))一起给予。通过使用促进剂例如bupivacaine，或者单独或包括在DNA制剂中，可进一步促进DNA摄入。直接将所述核酸给予受体的其它方法包括超声、电刺激、电穿孔和微量接种(microseeding)，所述方法描述于US-5,697,901中。
可以通过几种已知转染技术提高核酸构建体的摄入，所述技术例如包括使用转染剂的技术。这些转染剂的实例包括阳离子试剂(例如磷酸钙)和DEAE-葡聚糖和脂转染试剂(例如lipofectam和transfectam)。待给予核酸的剂量可以改变。
本发明的核酸序列也可通过转化细胞的方式给予。所述细胞包括从受试者收获的细胞。可将本发明的裸多核苷酸或载体体外导入所述细胞中，然后将所述转化细胞回输给所述受试者。本发明的多核苷酸可通过异源重组事件整合到细胞中已经存在的核酸中。如果需要，转化细胞可在体外生长，一种或多种所得细胞可以用于本发明。通过已知外科或显微外科技术(例如移植、显微注射等)，可以为患者提供合适部位的细胞。
实施例：
1.1构建体的产生
下面详述的所有构建体之间的关系示意图示于图1。
1.2全长MUC-1表达盒的构建
MUC-1表达盒的构建从质粒pcDNA3-FL-MUC-1(ICRF，London)开始。该质粒具有pcDNA3主链(Invitrogen)，所述主链含有在BamHI位点上克隆的全长MUC-1(FL-MUC1)cDNA盒。以在ICRF上进行的限制酶切作图为基础，MUC-1基因具有约32个VNTR单位(变数串联重复)。通过荧光测序、使用引物2004MUC1-2014MUC1(附录A)证实了MUC-1的存在。MUC-1序列示于图2，所述序列是FL-MUC1序列的基础。在所述克隆步骤的第一步，一个含有全长MUC-1 cDNA序列的BamHI片段被分离出来并克隆到表达载体pcDNA3.1(+)/潮霉素(Invitrogen)的BamHI位点，产生质粒JNW278。通过PCR和荧光测序，证实所述片段相对于CMV启动子的正确定向。
克隆的下一个步骤包括3′非翻译区(UTR)的去除和用改进的限制酶位点的取代，以便于后面的克隆步骤。用引物2062MUC1和2063MUC1(附录A)、用JNW278作为模板并用BstXI和XhoI进行限制酶切，将MUC-1的一个片段进行PCR扩增。在平行实验中，用BstXI和XhoI对质粒JNW278进行限制酶切。将纯化载体主链与PCR片段连接，产生质粒JNW314。限制酶切分析和荧光测序证实存在正确片段。
在平行实验中，5′UTR被除去，并用最佳Kozak序列和改进的限制酶位点取代。用NheI-XhoI对JNW278进行限制酶切，去除整个MUC-1 cDNA序列。用PCR引物2060MUC1和2061MUC1(附录A)，对一个MUC-1片段进行PCR扩增，用NheI和XhoI限制酶切，并连接到载体主链中，产生质粒JNW294。
在克隆的下一步，用BsaMI对JNW294进行限制酶切，产生两个片段(约为2.3kbp和3.2kbp)。分离并纯化这两个片段中的较大片段(片段A)。在平行实验中，JNW314用BsaMI进行限制酶切，分离并纯化这两个片段中的较大片段(片段B，大小约为7kbp)。将片段A和片段B连接在一起，产生质粒JNW340。通过限制酶切作图、使用Nhe-XhoI和单独使用XbaI，证实了正确定向。
在克隆的最后一个步骤中，通过用NheI和XhoI限制酶切消化，从JNW340中分离出一个表达盒，释放出一个约4kbp的片段。表达质粒pVAC1(Thomsen Immunology 95：51OP106，1998)用NheI-XhoI进行限制酶切，并连接MUC-1盒，产生全长MUC-1表达质粒JNW358。MUC-1序列相对于CMV启动子的正确定向用限制酶切消化和荧光测序证实。MUC-1表达盒的序列示于图3。
1.3含有一个VNTR单位的MUC-1载体的构建
含有一个VNTR单位的MUC-1表达盒的构建从JNW278开始。高度重复VNTR DNA序列的一个独特特征是在其每个重复单位中存在一个FseI限制位点。JNW278用FseI进行彻底的限制酶切消化，分离出载体主链并重新连接，产生质粒JNW283。单一VNTR单位的存在用限制酶切分析、PCR和荧光测序证实。JNW283的MUC-1序列示于图2。
1.4含有一个VNTR单位的MUC-1表达载体的构建
为了从JNW283将含有一个VNTR单位的MUC-1盒转移到表达质粒pVAC中，进行以下克隆步骤。克隆的第一步包括5′和3′非翻译区(UTR)的去除和用改进的限制酶位点取代，以便于后面的克隆步骤。一个MUC-1片段用引物2060MUC1和2062MUC1、用JNW283作为模板并用NheI和XhoI进行限制酶切，进行PCR扩增。在平行实验中，质粒pVAC用NheI和XhoI进行限制酶切。将纯化的载体主链连接所述PCR片段，产生质粒JNW322。限制酶切分析和荧光测序证实存在正确片段。
1.5含有少量VNTR单位的MUC-1盒的构建
含有少量VNTR单位的MUC-1表达盒的构建从JNW283开始，JNW283用FseI线性化。用FseI部分消化质粒JNW278，产生VNTR单位，释放序列梯短片段，片段大小从60bp(相当于一个VNTR单位)至约420bp(相当于7个VNTR单位)。JNW278部分消化产生的VNTR片段序列梯示于图7。所述60-500bp片段用凝胶提取纯化，然后与FseI线性化的JNW283连接。通过PCR、用分别位于MUC-1的VNTR区5′和3′的引物2005MUC1和2013MUC1，初步筛选克隆。所述PCR以以下方式进行：使得含有多个VNTR单位的克隆产生的一个PCR片段大于对应于JNW283的一个VNTR单位的PCR片段。将PCR阳性克隆用限制酶切消化和荧光测序进行进一步分析，证实存在的VNTR单位数目。采用该方案，获得许多不同的质粒，包括一共拥有7个VNTR单位的JNW319和拥有两个VNTR单位的JNW321。JNW319和JNW321的序列示于图4和图5。JNW319的VNTR单位显示出存在于更多群体中的多态性(用星号表示)。
1.6含有7个VNTR单位的MUC-1表达载体的构建
为了将含有7个VNTR单位的MUC-1盒转移到表达质粒pVAC中，进行了以下克隆步骤。克隆的第一步包括3′非翻译区(UTR)的去除和用改进的限制酶位点取代，以便于后面的克隆步骤。一个MUC-1片段用引物2062MUC1和2063MUC1、用JNW278作为模板并用BstXI和XhoI进行限制酶切，进行PCR扩增。在平行实验中，质粒JNW319用BstXI和XhoI进行限制酶切。所述纯化的载体主链连接所述PCR片段，产生质粒JNW622。限制酶切分析和荧光测序证实存在正确片段。
在克隆的下一步，用BsaMI对JNW294进行限制酶切，产生两个片段(约为2.3kbp和3.2kbp)。分离并纯化这两个片段中的较大片段(片段A)。在平行实验中，JNW622用BsaMI进行限制酶切，分离并纯化这两个片段中的较大片段(片段C，大小约为4kbp)。将片段A和片段C连接在一起，产生质粒JNW640。通过采用XbaI限制酶切作图和荧光测序，证实了正确定向。在克隆的最后一个步骤，用NheI和XhoI限制酶切消化后，从JNW640中分离出MUC-1盒，与pVAC(也用NheI和XhoI线性化)连接，产生质粒JNW656。通过荧光测序证实MUC-1表达盒的序列，该序列示于图6。
1.7.VNTR单位的纯化
用FseI消化JNW278(FL-MUC1)后，释放出序列梯VNTR，范围为60bp(相当于一个VNTR单位)至420bp(相当于7个VNTR单位)。电泳后，从琼脂糖凝胶中分离出所述片段并进行纯化。图8显示两个序列梯的VNTR单位。DNA标记示于泳道A和D。泳道B显示代表范围在60-240bp的VNTR单位的序列梯。泳道C显示出代表范围在180-420bp的VNTR单位的序列梯。这些片段随后连接到经FseI线性化的JNW283上，构建含有2个和7个VNTR单位的MUC-1基因。含有3个、4个、5个或6个VNTR单位的其它构建体可以类似方式进行构建(参见图7)。
2：用于皮肤基因枪免疫的构建体的制备
用氯化钙和亚精胺将质粒DNA沉淀在直径2μm的金珠上。载药珠包埋在Tefzel管上，如文献(Eisenbraum等，1993；Pertmer等，1996)所述。用Accell基因传递系统(PCT WO 95/19799)进行颗粒轰击。对于每种质粒，在第0天、第21天和第42天，3次给予质粒来免疫雌性C56BL/6小鼠。每次给药都由DNA/金的两次轰击组成，提供总剂量为约4-5μg质粒。
2.1肌内(i.m.)DNA免疫
在第0天、第21天和第42天，对雌性C57B1/6小鼠进行免疫，给小鼠后腿肌内给予溶于PBS的50μgDNA。
2.2肿瘤细胞注射
进行了两组肿瘤消退实验，其中在第一组实验中，在最后一次免疫后2周，将0.5×106肿瘤细胞皮下注射到麻醉小鼠的右胁。在第二组实验中，采用更多侵袭性模型，其中所述动物接受1.0×106肿瘤细胞。每周两次用游标卡尺测定肿瘤的两维尺寸，来监测肿瘤生长。根据(a×b2)/2，计算肿瘤体积，其中a表示最大直径，b表示最小直径。实验终点(死亡)定义为肿瘤直径达到15mm的时间点。
3：构建体的测试
3.1.1材料与方法
B16F0和B16F0-MUC1肿瘤细胞
用人cDNA MUC-1表达载体转染的B16F0(鼠转移性黑素瘤)得自GlaxoWellcome U.S。细胞在补充了10％热灭活胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和1mg/ml新霉素抗生素(G148)的DMEM中培养成贴壁单层。为了用于酶联免疫斑点(ELISPOT)试验，用依地酸和辐射(16,000拉德)，从培养瓶中取出细胞。
3.1.2表达MUC-1的EL4肿瘤细胞的构建
EIA细胞在补充了10％FCS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、2mM L-谷氨酰胺、50μM 2-巯基乙醇的RPMI完全培养基中进行培养。JNW278(全长MUC-1)用FspI线性化，用苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提，然后用乙醇沉淀而纯化。在0.4mm BIORAD杯中，将在0.5ml RPMI完全培养基中的2×107细胞与20μg线性化DNA混合。以320V、960μF通过电穿孔转染所述细胞。电穿孔后，将所述细胞悬液转移到30ml预热RPMI完全培养基中，孵育24小时以便恢复。所述细胞在含有500μg/ml潮霉素的RPMI完全培养基中孵育7-10天进行选择。存活细胞在200μl含有500μg/ml潮霉素的RPMI完全培养基中以0.5细胞/孔的浓度稀释到U形底的96孔板中。8-10天后，将克隆转移到24孔板中。在此期间，MUC-1表达分布型用流式细胞仪评价，维持阳性的相同克隆，用于进一步分析。
3.2.T细胞对MUC-1基因产物应答的EliSPOT试验
3.2.1脾细胞的制备
在加强免疫后7天(或者在第28天或者在第49天)，获取免疫动物的脾脏。将脾脏在载玻片间研磨处理，得到细胞悬液。用氯化铵处理溶解红细胞，除去碎片，得到优质的脾细胞悬液。细胞以8×106/ml的浓度重悬于RPMI完全培养基中，以备用于ELISPOT试验。
3.3肽文库的筛选
包括完整MUC-1序列的肽文库购自Mimotopes。所述文库含有116个15mer肽，所述肽包括完整MUC-1序列(包括1个拷贝的串联重复区)在内的11个氨基酸肽重叠。肽用184-299的数字表示。为了筛选所述肽文库，用下述方案，在IFNγ和IL-2的ELISPOT中，使用肽的终浓度为10μM。对于IFNγ的ELISPOT，IL-2以10ng/ml加入到所述试验中。在第49天，从用FL MUC1在第0天、第21天和第42天免疫的C57BL/6小鼠或CBA小鼠中，采集用于筛选的脾细胞。
3.4表位作图
在C57BL/6小鼠中，选出两个显示出良好反应性的MUC-1区，以供进一步研究。这些区域被肽222-225和238-239覆盖。通过流式细胞仪(方案如下)，显示出响应这些肽而产生IFNγ的细胞是CD8细胞。为了对表位作图，从Mimotopes再次定购分别被7个或8个氨基酸重叠的8mer肽和9mer肽。使用来自经如上详述免疫动物的脾细胞，在IFNγ的ELISPOT中，对这些肽进行测定。鉴定出两个优势免疫肽，即SAPDNRPAL和PTTLASHS。
3.5ELISPOT试验
培养板用15μg/ml(在PBS中)大鼠抗小鼠IFNγ或大鼠抗小鼠IL-2(Pharmingen)包被。培养板在+4℃包被过夜。使用前，所述板用PBS洗涤三次。将脾细胞以4×105细胞/孔加入到所述板中。肽SAPDNRPAL以10nM的终浓度用于试验。肽PAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGV(25mer肽)以终浓度为25μM来使用。这些肽得自Genemed Synthesis。从文库筛选和表位作图研究中鉴定的如下肽也用于ELISPOT试验：10μM的203(DVTLAPATEPATEPA)、10μM的299(LSYTNPAVAATSANL)、1μM的PTTLASHS(Mimotopes)。以肿瘤细胞：效应物的比例为1∶4，使用经辐射的肿瘤细胞B16、B16-MUC1和EL4、EL4-278。在IL-2(10ng/ml)、IL-7(10ng/ml)存在下、或者在没有细胞因子情况下，进行ELISPOT试验。每孔总体积为200μl。含有肽刺激细胞的板在37℃湿润培养箱中孵育16小时，而含有肿瘤细胞作为刺激物的板孵育40小时。
3.5.1.ELISPOT试验板的开发
经过用水洗涤一次(1分钟浸泡以确保细胞溶解)以及用PBS洗涤三次，从所述板上洗下细胞。以1μg/ml(溶于PBS)加入生物素缀合的大鼠抗小鼠IFNγ或IL-2(Phamingen)。将培养板在室温下震荡培养2小时。然后将培养板用PBS洗涤三次，然后以1/1000的稀释度加入链霉抗生物素碱性磷酸酶(Caltag)。用PBS洗涤三次后，通过与BCICP底物(Biorad)孵育15-45分钟，显示斑点。底物用水洗去，让板干燥。用Brian Hayes(Asthma Cell Biology unit，GSK)设计的图像分析系统对斑点进行计数。
3.6检测T细胞响应肽刺激而产生IFNγ的流式细胞仪分析
脾细胞以4×106/ml重新悬浮。加入终浓度为10μM的肽和终浓度为10ng/ml的IL-2。细胞在37℃孵育3小时，以10μg/ml的浓度加入布雷菲德菌素A，然后继续孵育过夜。
细胞用FACS缓冲液(PBS+2.5％FCS+0.1％叠氮化物)洗涤，然后用抗CD4 Cychrome和抗CD8 FITC(Pharmingen)染色。细胞经洗涤后，用Caltag Fix和Perm试剂盒的介质A固定15分钟，然后洗涤并加入用Fix和Perm试剂盒的介质B稀释的抗IFNγPE(Pharmingen)。孵育30分钟后，将细胞洗涤，然后用FACSCAN分析。每份样品收集总量为500,000的细胞，然后收集CD4和CD8细胞，以测定响应每种肽而分泌IFNγ的细胞群体。
3.7抗MUC-1基因产物抗体的ELISA测定
在第-1天、第21天、第49天和第56天，通过静脉穿刺，从所述动物中得到血清样品，然后分析存在的抗MUC-1抗体。用3μg/ml野生型MUC-01肽序列(40-mer，相当于2个串联重复序列即PAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAP)在4℃下包被过夜的Nunc Maxisorp板，进行ELISA。用TBS-吐温(Tris-缓冲盐溶液，pH7.4，含有0.05％吐温20)洗涤后，所述板在室温下用溶于TBS-吐温缓冲液的3％BSA封闭2小时。所有血清在TBS-吐温缓冲液中以1∶100的稀释度在室温下孵育1小时。用HRP缀合的兔抗小鼠免疫球蛋白(#P0260，Dako)以1∶2000的稀释度(溶于TBS-吐温缓冲液)，检测抗体结合。再次洗涤各板，用快速OPD显色试剂(Sigma，UK)检测结合的缀合物。通过加入3M硫酸终止反应，然后OPD产物通过测定490nm的吸光度进行定量。
3.8免疫小鼠血清的流式细胞仪分析
为了证明这些疫苗诱发的抗体能识别肿瘤细胞，来自PMID免疫小鼠的抗血清样品用于标记各种肿瘤细胞系，并且所述标记被流式细胞仪显现。细胞(T47-D、MCF-7、EL4、EL4-278、B16F0和B16F0MUC1；1×106)在补充了5％FCS的PBS缓冲液中洗涤，然后与小鼠血清以1∶100稀释度在4℃孵育15分钟。洗涤后，细胞与第二抗体(绵羊抗小鼠IgG，Dako，Denmark，以1∶50稀释度)在相同条件下孵育。在用第二步试剂染色之前，对照细胞与FACS缓冲液孵育，而不是与第一步抗体孵育。用FACScan(Becton Dickinson)进行FACS分析。每份样品1000-10000细胞同时测定FSC(前向角光散射)和SSC((集束光散射)以及绿色(FL1)荧光(表示为总荧光的对数)。记录不包括聚集体，所述聚集体的FCS在范围之外。对于结合到肿瘤细胞表面的不同类型的小鼠血清，数据表示为柱状图，以细胞数(Y轴)对荧光强度(X轴)作图。
3.9瞬时转染试验
通过将所述质粒瞬时转染到CHO(中国仓鼠卵巢)细胞中，然后或者通过对总细胞蛋白的蛋白质印迹、或者通过对表达MUC-1的细胞膜的流式细胞仪分析，来分析不同DNA构建体的MUC-1表达。按照生产商的说明，用Transfecsam试剂(Ptomega)进行瞬时转染。简而言之，在24孔组织培养板中每孔接种1ml含5×104 CHO细胞的DMEM完全培养基(DMEM，10％FCS、2mM L-谷氨酰胺、青霉素100IU/ml、链霉素100μg/ml)，然后在37℃孵育16小时。将0.5μgDNA加入到25μl的0.3M NaCl(对一孔来说是足够的)中，然后将2μl的Transfectam加入到25μl的Milli-Q中。所述DNA和Transfectam溶液轻柔混合，然后在室温下孵育15分钟。在该孵育步骤中，所述细胞在PBS中洗涤一次，然后用150μl无血清培养基(DMEM，2mM L-谷氨酰胺)覆盖。将所述DNA-Transfectam溶液滴加到所述细胞中，所述板轻柔摇晃，然后在37℃孵育4-6小时。加入500μl的DMEM完全培养基，将所述细胞在37℃下继续孵育48-72小时。
3.10用MUC-1质粒瞬时转染的CHO细胞的流式细胞仪分析
瞬时转染后，所述CHO细胞用PBS洗涤一次，然后用依地酸(1∶5000)/0.025％胰蛋白酶溶液处理，将所述细胞转变为悬液。胰蛋白酶消化后，所述CHO细胞沉淀，然后重悬于FACS缓冲液(PBS，4％FCS，0.01％叠氮化钠)中。加入第一抗体即ATR1，使之终浓度为15μg/ml，然后将所述样品在冰上保温15分钟。对照细胞与FACS缓冲液在没有ATR1的条件下孵育。所述细胞在FACS缓冲液中洗涤三次，重悬于含有10μg/ml第二抗体即山羊抗小鼠免疫球蛋白FITC缀合的F(ab′)2(Dako，F0479)的100μl FACS缓冲液中，然后在冰上保温15分钟。第二抗体染色后，所述细胞在FACS缓冲液中洗涤三次。用FACScan(Becton Dickinson)进行FACS分析。每样品1000-10000细胞同时测定FSC(前向角光散射)和SSC(集束光散射)以及绿色(FL1)荧光(表示为总荧光的对数)。记录不包括聚集体，所述聚集体的FCS在范围之外。数据表示为柱状图，以细胞数(Y轴)对荧光强度(X轴)作图。
3.11用MUC-1质粒瞬时转染的CHO细胞的蛋白质印迹分析
瞬时转染的CHO细胞用PBS洗涤，然后用依地酸(1∶5000)/0.025％胰蛋白酶溶液处理，以将所述细胞转变为悬液。胰蛋白酶消化后，所述CHO细胞沉淀，然后重悬于50μl的PBS中。加入含有50mM DTT的等体积的2x TRIS-甘氨酸SDS样品缓冲液(Invitrogen)，将所述溶液加热到95℃达5分钟。将1-20μl样品加样到4-20％TRIS-甘氨酸凝胶1.5mm(Invitrogen)上，在稳压(125V)下、在1x TRIS-甘氨酸缓冲液(Invitrogen)中电泳90分钟。使用预染色的宽范围标记(New England Biolabs，#P7708S)，以估计样品大小。电泳后，使用XcellIII Blot Module(Invitrogen)、用含有20％甲醇的1x转移缓冲液(Invitrogen)、在25V的稳压下将所述样品转移到预先用甲醇润湿的Immobilon-P PVDF膜(Millipore)上达90分钟。所述膜在4℃下在含有3％脱脂奶末(Marvel)的TBS-吐温(Tris缓冲盐溶液，pH7.4，含有0.05％吐温20)中封闭过夜。第一抗体(ATR1)以1∶100稀释，然后与所述膜在室温下保温1小时。用TBS-吐温充分洗涤后，第二抗体以1∶2000用含有3％脱脂奶末(Marvel)的TBS-吐温稀释，然后与所述膜在室温下保温1小时。充分洗涤后，所述膜与SupersignalWest Pico化学发光底物(Pierce)保温5分钟。除去多余液体，所述膜密封在两层保鲜膜中，对Hyperfilm ECL胶片曝光(AmershamPharmacia Biotech)1-30分钟。
4.结果
4.1基因枪和肌内注射的比较
质粒pcDNA3-FL-MUC1中的FL-MUC1表达盒通过PMID和肌内注射给予小鼠。
4.2抗体应答的比较
经肌内注射(小鼠A-C)和经PMID(小鼠D-F)免疫后，抗MUC-1抗体应答示于图9。结果表明，经PMID给予诱导较强抗体应答，具有较快的动力学，其中3只小鼠中有3只都在第41天应答。相比之下，经肌内途径免疫，仅有1只小鼠在第41天显示出良好的抗体应答。甚至在第42天再一次加强免疫后，3只小鼠中仅有2只显示出与经PMID免疫小鼠相当的MUC-1抗体水平。
4.3细胞应答的比较
经PMID或肌内(IM)用pcDNA3(空载体)或pcDNA3-FL-MUC1免疫后，在第0天初次免疫后和在第21天和第42天两次加强免疫后，用ELISPOT评价细胞应答。在第二次加强免疫后13天进行测定。脾细胞用肽SAPDTRPAP(9.1)刺激，所述肽先前已在文献中作为良好H-2Kb表位而描述过。对于IFNγ应答，图10显示，100％经PMID免疫小鼠对所述肽具有可检测的应答，而在经肌内免疫小鼠中没有检测到应答。
4.4 MUC-1构建体的体外表达-蛋白质印迹
图11显示，在各种MUC-1构建体瞬时转染到CHO细胞中后，总细胞蛋白对于MUC-1的蛋白质印迹结果。数据表明，FL-MUC1构建体(JNW358)在83-175kDa产生不清晰的成片条带，与预测分子量108kDa以及VNTR结构的不均一而广泛的糖基化一致。7x VNTRMUC-1构建体(JNW656)产生更集中的不清晰的成片条带，中心约为65kDa，与预测分子量(61kDa)和VNTR结构的不均一糖基化一致。1x VNTR MUC-1构建体(JNW332)产生模糊的单一条带，约为40kDa，与仅存在一个VNTR单位一致。
4.5 MUC-1构建体的体外表达-流式细胞仪分析
所述MUC-1构建体瞬时转染到CHO细胞中后，MUC-1在所述细胞表面的表达通过流式细胞仪、用MUC-1 VNTR特异性抗体ATR1进行评价。MUC-1阳性细胞百分率，对于用FL-MUC1(JNW358)转染的样品来说为9.6％，对于用7x VNTR MUC-1转染的样品来说为8.8％，而对于用1x VNTR MUC-1(JNW332)转染的样品来说为9.8％。该数据表明，VNTR的数目并不影响MUC-1转运到所述细胞表面并被抗体ATR1检测到的能力。
4.6经PMID免疫后，针对FL-MUC1、7x VNTR MUC-1和1x VNTRMUC-1的抗体应答
用pVAC(空载体)、JNW358(FL-MUC1)、JNW656(7x VNTRMUC-1)和JNW332(1x VNTR MUC-1)免疫后，在第0天经PMID初次免疫后以及第21天和第42天两次加强免疫后，用ELISA评价抗体应答。图12显示在第56天采集的血清中的抗体应答。对于所述空载体，没有MUC1特异性应答，而FL-MUC1构建体和7x VNTR-MUC-1构建体产生强的和大致相等的MUC1特异性抗体效价。相比之下，1x VNTR MUC-1构建体诱导较低效价的抗体应答。图12b显示，对FL-MUC1和7x VNTR MUC-1的抗体应答动力学也非常类似，而对1x VNTR MUC-1的应答进行得较慢，需要在第42天第2次加强才达到平台。该数据证实，VNTR单位的大量缺失对诱导强烈的MUC-1特异性抗体应答来说是没有害处的。然而，按其强度和发生的动力学来说，对1x VNTR MUC-1的抗体应答不是最佳的。
4.7来自MUC-1免疫小鼠的血清对表达MUC-1的肿瘤细胞的识别
为了证实用FL-MUC1、7x VNTR MUC-1和1x VNTR MUC-1诱导的抗体能识别在肿瘤细胞上表达的人MUC-1形式，来自免疫小鼠的血清用流式细胞仪进行检验。所述靶细胞是B16F0MUC1，即一种经工程改造以表达人MUC-1的肿瘤细胞系。示于图13的结果证实，来自FL-MUC1免疫小鼠(JNW358)、7x VNTR MUC-1免疫小鼠(JNW656)和1x VNTR MUC-1免疫小鼠(JNW332)的血清，在识别B16F0MUC1上表达的MUC-1的能力上是等同的，这表明大量VNTR单位的去除对诱导生理上相关的抗体应答来说是没有害处的。
4.8通过MUC-1肽文库筛选，对C57BL/6小鼠的MUC-1中新的T细胞表位的鉴定
第0天用JNW358(FL-MUC1)经PMID免疫以及在第21天和42天两次加强免疫后，在第49天进行ELISPOT试验。以10μM的终浓度测定来自FL-MUC1文库的肽。从这次初筛中，发现几组15mer肽能刺激IFNγ或IL-2的分泌。目标区标示在图20上。通过胞内细胞因子染色和流式细胞仪，进一步研究肽刺激的IFNγ分泌，确定所述区是否含有CD4或CD8表位。发现肽223、224、225、238和239诱导CD8细胞良好分泌IFNγ。为了进一步对CD8表位作图，得到或者有7个氨基酸、或者有8个氨基酸重叠的8mer肽和9mer肽。这些肽在IFNγ的ELISPOT试验中进行检测，随后对几个显示出反应性的肽用流式细胞仪进行检测。区223-225含有CD8表位簇。通过滴定，所述优势肽显示为SAPDNRPAL，即一种已经被他人用于测定MUC-1特异性应答的肽。然而，鉴定出该区中一些新的肽，所述肽以10μg和更低浓度诱导CD8细胞分泌IFNγ。我们已经表明，其中之一，即TSAPDNRPA能在体外诱导细胞毒性T细胞(数据未显示)。显示区238-239含有一个强CD8表位和几个较弱CD8表位，所述强CD8表位即PTTLASHS，我们已将所述强CD8表位用于后续MUC-1分析中。
4.9PMID免疫后，针对FL-MUC1、7x VNTR MUC-1和1VNTRMUC-1的细胞应答
用pVAC(空载体)、JNW358(FL-MUC1)、JNW656(7x VNTRMUC-1)和JNW332(1x VNTR MUC-1)免疫后，在第0天经PMID初次免疫以及在第21天和第42天两次加强免疫后，用ELISPOT评价细胞应答。在加强后7天进行评价。采用如下三个不同的测定条件：1)表达MUC-1的肿瘤细胞B16-MUC1和EL4-MUC1，用于证明广泛的抗肿瘤细胞应答，2)SAPDNRPAL肽，即一种在MUC-1的VNTR区外的高亲和性肽(在所有使用的构建体中出现一次)，3)25mer肽，所述肽编码包括VNTR区的完整重复和来自邻近重复序列的额外5个氨基酸的序列。该肽主要诱导免疫脾细胞产生IL-2。FL-MUC1构建体即7x VNTR-MUC1和1x VNTR-MUC1构建体对所有用来测试的刺激物产生强的和大致相等的MUC-1特异性细胞应答(图14)。在SAPDNRPAL肽的情况下，我们已经表明，IFNγ由CD8细胞产生，由CD4细胞或者CD8细胞为应答肿瘤细胞而产生IFNγ并且为应答25mer肽而产生IL-2。该数据证实，大量VNTR单位的缺失对诱导针对VNTR区内外的表位的强MUC-1特异性细胞应答来说是没有害处的。
4.10肿瘤攻击后保护作用的比较(PMID与I.M)
经PMID或肌内注射3次给予MUC-1表达质粒pcDNA3-FL-MUC-1或空载体pcDNA3.1后，小鼠用表达MUC-1的肿瘤细胞(B16F0MUC1)攻击。无瘤小鼠百分率示于图15，清楚地证明了在随后的肿瘤攻击中，与用相同质粒经肌内注射相比，PMID诱导较多小鼠的保护作用。该数据结合以上详述的抗体应答和细胞应答来看，表明PMID与肌内递送相比诱导更强的细胞应答和抗体应答，相应地改进了肿瘤保护分布型。
4.11 MUC-1 cDNA构建体(F/L MUC-1和7 VNTR)在肿瘤保护中的功效
如材料与方法中所述，小鼠用空载体(pVAC空)或编码全长MUC-1的载体(JNW358)免疫3次。最后一次加强后2周，用B16FOMUC1细胞对它们进行肿瘤攻击，然后监测肿瘤生长。在空载体接种组中，在肿瘤攻击后约10-15天出现肿瘤时，而在FL-MUC1接种组中，在约22天才出现肿瘤。图16a比较了用空载体或编码全长MUC-1的载体免疫的两组小鼠存活率。与用所述空载体免疫的小鼠(20％无肿瘤)相比，在用FL-MUC1免疫的小鼠(60％无肿瘤)中存活率明显更高。图16b显示，用上述实验的2倍数量的肿瘤细胞(1.0×106)，FL-MUC1和7x VNTR以及对照组的肿瘤保护作用的比较。两种MUC-1构建体产生显著的和大致相等的肿瘤生长延迟，与对照免疫组相比延迟约25天。该效应随后下降，可能是因为对肿瘤抗原免疫应答的耗尽所致。
总之，7VNTR xMUC-1构建体与FL-MUC-1一样，都产生相同的保护性抗肿瘤应答，甚至在高严格条件下也是如此。
4.12在重组痘苗病毒系统中，FL MUC-1与7VNTR MUC-1的稳定性
全长人MUC-1作为BamHI片段插入到载体pSC接头中。通过所述载体与痘苗病毒基因组的TK(胸苷激酶)基因的同源重组，将该构建体用于产生重组痘苗病毒。
将所述重组病毒接种到HTK-细胞的细胞层上，然后通过卤代吲哚基-β-D-半乳糖苷试验，测定所述噬斑的β-半乳糖苷酶活性。所述载体携带β-gal基因，因而蓝色噬斑是重组病毒。选择大量蓝色噬斑并克隆，直到进行卤代吲哚基-β-D-半乳糖苷试验时，100％噬斑都产生蓝色染色。
这些克隆中的6个用于感染HTK-细胞，感染复数为10，感染后6小时、24小时和32小时收获细胞。将所述细胞重悬于200μl培养基中，取出40μl并与SDS-PAGE加样缓冲液混合。
这些细胞提取液在SDS PAGE凝胶上进行电泳，然后通过蛋白质印迹、用单克隆抗体ATR1和HMFG1进行试验，这两种单克隆抗体都能识别MUC-1的VNTR区内的表位。感染重组病毒的样品都没有被这些抗体染色。用pVAC-7VNTRMUC 1感染的细胞的对照细胞提取液染成明亮条带，表明存在TR表位。用抗β-半乳糖苷酶抗体染色表明，所有用所述重组病毒感染的样品都表达β-gal，但是在wt病毒或细胞对照中不表达。
通过PCR对收获的感染细胞进行分子分析。选择能指示在所述重组病毒基因组中存在pSC11接头-FLMUC1构建体不同部分的引物对。选择以下引物对：
FMC 101+2014MUC1 -载体和MUC-1 5′端之间的接头
2008MUC1+FMC102 -载体和MUC-1 3′端之间的接头
2004MUC1+2014MUC1 -VNTR区的MUC-1 5′部分
2007MUC1+2009MUC1 -VNTR区的MUC-1 3′部分
FMC101和FMC102是所述载体序列中分别位于接头序列5′和3′的引物。
FMC101：-CATAAATAATAAATACAATAATTAATTTCTCG
FMC102：-GCCTCCTTAAAGCATTTCATACACACAGC
用1μl收获的感染重组病毒的细胞(感染后32小时)，在加热到80℃达10分钟后，进行以上显示的4个PRC反应。也在wt病毒感染细胞的样品以及非感染细胞样品上进行反应。也包括1ng的pSC接头-FLMUC1质粒DNA的阳性对照。
所述阳性对照在琼脂糖凝胶电泳中产生正确大小的扩增片段。其它样品都不产生特异性产物，表明所述构建体在所述病毒基因组中不再是完整的。
随后，以同样的方式，产生含有人MUC-1的7VNTR区的重组病毒，在得到克隆群体后，所述病毒用于感染HTK-细胞，所述细胞如前所述进行收获。感染后2天通过对感染细胞用ATR1的蛋白质印迹以及通过FACS分析，这些感染细胞的细胞提取物清楚地证明了MUC-1的表达。在ELISPOT试验中，用7VNTR重组病毒感染的小鼠MC57细胞用于刺激来自MUC-1免疫小鼠的脾细胞。孵育过夜后，所述脾细胞在应答7VNTR痘苗感染细胞时显示出分泌IL-2，但是wt痘苗感染的细胞不分泌。
这些结果表明，使用带有7个串联重复的MUC-1构建体提高了所述构建体的稳定性。全长MUC-1重组痘苗病毒在感染细胞中不能诱导MUC-1的表达，这一事实强有力地表明了所述构建体在高度重组条件下是不稳定的。6个病毒克隆都不表达MUC-1，似乎它们也不含有MUC-1基因，但是它们全都表达β-半乳糖苷酶，所述酶基因在同一载体上携带。然而，携带少数重复序列的7VNTR区清楚地证明，在3个不同试验中的表达表现出较高稳定性，而对抗体或抗原特异性T细胞的识别也没有降低。
5.FL MUC、7 VNTR和1 VNTR在大肠杆菌DH1中生长时的稳定性
相关载体用于转化大肠杆菌DH1。所述空载体也用于转化，作为对照。
为了确定VNTR区中重复数目是否影响稳定性，用FL-MUC1、7xVNTR MUC1和1xVNTR MUC1质粒进行了摇瓶稳定性试验。
稳定性研究对每种构建体进行了9代、每代持续10-14小时的摇瓶培养，在所述培养中观察了每种构建体的生长、质粒产量和质粒保留。使用稳定性研究，以确定所述细胞在摇瓶中反复传代是否导致质粒产量和质量发生变化。因为在摇瓶中条件是不受控制的(例如pH、通气)，在本项研究中质粒质量和产量的维持是这些特征保持稳定的良好指标。
5.结果
5.2.1.培养物生长
尽管每次传代时细胞的最终OD600nm会由于接种量的轻微变化而有一些变化，但是总的来说，无论是在试验中还是在不同的MUC-1构建体之间在生长速率方面都没有显著性差异。
5.2.2.质粒产量
获得第1代、第5代和第9代(最后一代)的质粒拷贝数值。对于全长构建体，PCN在此期间下降54％，而对于其它3种构建体却上升～40％。对于7VNTR，在整个研究中容积得率(mg质粒/L培养物)保持稳定，而在全长构建体中下降64％。在所述空载体(21％)和单一VNTR构建体(24％)中，观察到容积得率略有下降，尽管这并不如在全长构建体中观察到的那么明显。
5.2.3.质粒保留
用影印培养试验测定质粒保留，对于所有构建体来说在整个稳定性研究中保持在80％和100％之间。此外，所述构建体之间没有显著性差异。
5.2.4.质粒稳定性
为了研究在该研究期间的质粒稳定性，借助Qiagen Mini-prep.质粒提取离心柱，制备在开始(第0天收获)和终点(第5天收获)的质粒提取物。然后在Sybr-Gold染色之前，通过琼脂糖凝胶电泳分离分析这些提取物。所述基于Sybr-Gold的染色方法被认为是特别适于分析质粒稳定性的，因为先前的工作已证明它能够在1000ng样品中检测出1ng“穗(spike)”重组体。研究结果显示如下(参见图6)，根据这些结果，可以得出如下3个结论：
1.7xVNTR和1xVNTR构建体含有预期数目的VNTR重复，整个实验中的任何时间点都没有证据显示在质粒主链或在VNTR重复结构的不稳定。
2.用于稳定性试验的p7313空载体没有预期的分布图，且与标准p7313质粒不同。
3.从最终时间点(第5天，第9代)采集的全长Muc1样品含有未知来源的痕量质粒。
为了p7313分布图的差异以及FL-Muc1构建体在第5天的痕量质粒种类的鉴定，已进行了进一步研究工作。
为了研究用于稳定性研究的p7313空载体与标准质粒之间所观察到的差异，进行了限制酶切分析。该分析的结果揭示，含有BamHI(1926bp)和SapI(2422bp)限制位点的p7313构建体的一段～800bp区缺失。然后，设计邻接该区的引物，然后对所述质粒进行测序。得到的序列数据证明，在1866和2589间的区域缺失。所述质粒的该区域含有Cer序列。因为这个Cer序列用于帮助多联体的解离，它的缺失可解释在稳定性研究中观察到的多条带p7313质粒。
进一步的研究工作：FL MUC1样品中痕量质粒的分析
进一步分析了在终点的FL-Muc1样品中观察到的痕量的质粒。该分析揭示出这些痕量质粒在第4天前是检测不到的。发现该现象的同时，这些痕量质粒也进行了凝胶纯化、再次转化、再次纯化和测序。通过这些分析，这些质粒后来被鉴定为污染物，而不是重组体；也就是说，这些质粒是用于稳定性试验的7xVNTR(p7656)、在Cer区(如上概述)缺失的p7313和该p7313 Cer缺失的假定多联体。
根据这些结果，得出的结论是：FL-MUC1样品被p7313空载体和7xVNTR(p7656)构建体污染，在FL-MUC1的终点样品中不存在重组体。这些污染物被认为是在所述质粒转化开始时进入到FL-Muc1原种大肠杆菌DH1中。因为所述痕量质粒在第4天前在琼脂糖凝胶上并未出现，一个可能是因为它们比FL-Muc1质粒小，所以在研究过程中被选择出来。
3.结论
稳定性研究数据表明，质粒即7xVNTR MUC1在生长特性、质粒保留和质粒质量上是稳定的。就生长特性、质粒保留和质粒质量而论，1xVNTR、7xVNTR和FL-MUC1载体之间没有可辨别的差异。然而，拷贝数的数据却突出了这些构建体之间有显著性差异。在稳定性研究过程中，对于全长构建体来说，质粒拷贝数和容积得率与7xVNTR相比都有显著下降。尽管观察到全长构建体在整个实验期间的质粒保留仍然是100％，但这只表明在群体中的所有细胞仍然含有足够的质粒，使它们具有卡那霉素抗性。如果实验再进行下去的话，拷贝数可能会下降到对卡那霉素的抗性不足以让它们在选择平板上能够生长的水平，导致观察到的质粒保留会下降。这些数据表明，7xVNTR构建体因其有利的生长分布型，可具有显著优势。质粒含量可以影响细胞沉淀的纯化。因为7VNTR和FL-MUC1构建体之间的差异，可能7VNTR较容易纯化，并能以较高收率获得。
Claims (16)
1.一种编码MUC-1抗原的核酸分子，所述分子能提高体内免疫应答，并且具有比全长MUC-1降低的重组易发性。
2.一种编码MUC-1抗原的核酸分子，所述分子包含1-15个VNTR完全重复单位。
3.权利要求2的核酸分子，所述分子包含少于8个完全VNTR重复单位。
4.前述权利要求中任一项的核酸分子，其中使至少一个VNTR发生突变，以降低糖基化潜力。
5.权利要求1-4中任一项的核酸分子，所述分子掺入一个编码选自以下表位的序列：FLSFHISNL、NSSLEDPSTDYYQELQRDISE和NLTISDVSV。
6.权利要求1-5中任一项的核酸分子，其中所述分子是DNA分子。
7.一种包含权利要求6的DNA分子的质粒。
8.一种由权利要求1-6中任一项的核酸编码的蛋白。
9.一种药用组合物，所述组合物包含权利要求1-6中任一项的核酸或权利要求7的质粒或权利要求8的蛋白以及药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
10.权利要求9的药用组合物，其中所述载体是微颗粒。
11.权利要求10的药用组合物，其中所述微颗粒是金颗粒。
12.权利要求9-11中任一项的药用组合物，所述组合物包含佐剂。
13.权利要求1-6中任一项的核酸、权利要求7的质粒、权利要求8的蛋白或权利要求9-12中任一项的药用组合物，它们在药物中的用途。
14.权利要求1-6中任一项的核酸在制备用于治疗或预防表达MUC-1的肿瘤的药物中的用途。
15.权利要求8的蛋白在制备用于治疗或预防表达MUC-1的肿瘤的药物中的用途。
16.一种治疗或预防肿瘤或转移瘤的方法，所述方法包括给予安全有效量的权利要求1-6中任一项的核酸、权利要求7的质粒或权利要求8的蛋白。
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