CN1229140C - 一种靶向防龋dna疫苗及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种靶向防龋DNA疫苗及制备方法，大肠杆菌(Esherichiacoli)JM109/pGJGLU CCTCC NO：M202036。设计一对适配子，将靶向融合防龋DNA疫苗pGJA-P用SalI和NotI限制性内切酶进行双酶切，切除A-P片段，在T4连接酶的作用下进行连接反应，构建出编码细胞毒性T淋巴细胞抗原4信号肽、胞外区的序列和Igγ₁铰链区、恒定区融合基因与变形链球菌葡糖基转移酶的GLU区序列的具有靶向功能的防龋DNA疫苗pGJGLU。本发明方法简单，安全性高，生产成本低廉，免疫应答持久，可大幅度提高其免疫效能。

Description

一种靶向防龋DNA疫苗及制备方法

                       技术领域

本发明属于口腔预防医学技术领域，更具体涉及一种编码人细胞毒性T淋巴细胞抗原4信号肽、胞外区的序列和Igγ₁铰链区、恒定区融合基因以及变形链球菌葡糖基转移酶基因的DNA防龋疫苗，本发明还涉及一种所述靶向防龋DNA疫苗的制备方法。

                       背景技术

龋病是一种细菌感染性疾病。许多学者已证明变形链球菌(Streptococcusmutans)是引起人类龋病最主要的致病菌。葡糖基转移酶(glucosyltransferaesGTF_s)是变形链球菌的重要致龋毒力因子。GTF_s合成葡聚糖并介导变形链球菌在牙面的葡聚糖依赖性粘附。GTF_s包含有两个免疫活性区和功能区：催化功能区(catalytic region CAT)和葡聚糖结合区(glucan binding region GLU)。变形链球菌主要合成三种GTF_s：GTF-I、GTF-SI、GTF-S，其中GTF-I主要合成以α-1，3糖苷键为主的水不溶性葡聚糖，其编码基因为gtfB。

Taubman等人将根据Streptococcus downei的GTF-I催化功能区的448-457氨基酸序列合成的短肽CAT和葡聚糖结合功能区的1303-1324氨基酸序列合成的短肽GLU与完全弗氏佐剂混合后免疫SD大鼠能够引起明显的血清和唾液抗Streptococcus sobrinus葡糖基转移酶抗体(Taubman，M.A.，D.J.Smith，C.J.Holmberg，and J.W.Eastcott.2000.Coimmunization with complementaryglucosyltransferase peptides results in enhanced immunogenicity and protectionagainst dental caries.Infect Immun 68：2698-703.)。Jespersgaard等人将CAT和GLU多肽免疫兔获得特异性抗体能够明显抑制变形链球菌的GTF合成葡聚糖。将CAT和GLU多肽以鼻内滴注免疫小鼠诱导了明显的粘膜IgA免疫反应(Jespersgaard，C.，G.Hajishengallis，T.E.Greenway，D.J.Smith，M.W.Russell，andS.M.Michalek.1999.Functional and immunogenic characterization of two clonedregions of streptococcus mutans glucosyltransferase I.Infect Immun 67：810-6.)。

然而以上的各种防龋多肽疫苗存在许多不足之处，首先是这些多肽制备纯化困难，一般需耗时数周且费用昂贵，保存需要特殊条件；其次，多肽防龋疫苗刺激机体产生有效的免疫反应的能力较差，常需添加各种对人体有害的免疫佐剂；多肽防龋疫苗与其它多肽疫苗一样，诱导特异性免疫反应的持续时间一般较短，需反复多次接种才能达到较满意的效果；另外多肽疫苗一般不能诱导婴幼儿产生免疫反应。(Kowalczyk DW，Ertl HCJ.1999.Immune responses to DNA vaccines.Cell.Mol.Life Sci.，55：751-770)。

樊明文等学者将编码变形链球菌表面蛋白PAc的A区和P区基因克隆至真核表达载体pCI中，构建了防龋DNA疫苗pCLA-P，免疫大鼠，可以在血清和唾液中检测到特异性抗体，同时证明能有效防龋(樊明文，边专，彭志翔等。编码PAc结构基因的DNA疫苗免疫动物的实验研究。中华口腔医学杂志，2002；37(1)：)。其后，为了提高DNA疫苗的免疫效能，将扩增出的编码变形链球菌GS-5株葡糖基转移酶GTF-I的基因gtfB的葡聚糖结合区的序列GLU克隆到真核表达质粒pCIA-P中获得pGLUA-P融合防龋DNA疫苗。动物实验证实防龋效果优于pCIA-P(贾荣，樊明文，边专等。GTF-PAc融合防龋DNA疫苗研究(III)pGLUA-P免疫定菌鼠防龋研究。口腔医学纵横杂志2002；18(1)：3)。也有学者构建了以pcDNA3为载体的编码葡糖基转移酶GTF-I的基因gtfB序列防龋DNA疫苗，动物实验可以检测到特异性抗体。(杨锦波，周学东，刘天佳，变形链球菌葡糖基转移酶真核表达质粒PcDNA3-gtfB的构建，华西口腔医学杂志，2001；19(4)：249-252)但是，防龋DNA疫苗和其他DNA疫苗一样依旧面临如何提高免疫效能的问题。

CTLA4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4，CTLA4)，又称CD152，是免疫球蛋白超家族的一员。它主要表达于活化的T细胞表面，亦可表达于CTL细胞，是CD4⁺T细胞免疫应答的重要调节因子，起免疫负调节作用。CTLA4结构基因包括四个外显子，分别编码先导序列、胞外区、跨膜区及胞浆区四个独立的功能区，其胞外区包含一个Ig的V样功能区，侧翼与两个疏水区相接，其中一个可以将CTLA4锚定在细胞膜上。研究表明CTLA4与表达于抗原递呈细胞(APC)表面的CD80和CD86分子有很强的结合能力，是另一配体CD28的10～100倍(Ostrov DA，Shi W，Schwartz JCD，et al.Structure of Murine CTLA-4 andits role in modulating T cell responsiveness.Science，2000，290(27)：816～819)。1998年澳大利亚学者Boyle等研究了结合有CTLA4基因片段的DNA疫苗并免疫小鼠，2周后测得特异性抗体水平比对照组高达10000倍(Boyle JS，Brady JL，LewAM.，Enhanced responses to a DNA vaccine encoding a fusion antigen that is directedto sites of immune induction.Natrue，1998，392(26)：408-411)。最近的研究证明编码小鼠CTLA4靶向融合基因疫苗免疫小鼠后较非靶向疫苗诱导早且强的抗体反应(Lew AM，Brady，Boyle JS.Site-directed immune responses in DNA vaccinesencoding ligand-antigen fusions.Vaccine，2000，18：1681-1685)，其原因可能为CTLA4定向引导抗原与APC表面的B7分子结合，促进了APC摄取抗原，而APC在摄取抗原之后，自身被激活，表达了更多的B7分子，从而使更多的抗原被DC摄取、加工，起到了放大免疫反应的作用。

                       发明内容

本发明的目的是提供了一种靶向防龋DNA疫苗，将编码人CTLA4信号肽、胞外区与人Igγ₁铰链区、恒定区的融合基因的靶向融合防龋DNA疫苗pGJA-P(专利申请号：02139118.1)切下A-P片段，与合适的适配子连接获得靶向防龋DNA疫苗pGJGLU。

本发明的另一个目的是提供一种制备靶向防龋DNA疫苗的方法，安全性高，能表达天然抗原，生产成本低廉，方法简单，纯化简单且产物纯度高。

本发明所提供的靶向防龋DNA疫苗是由大肠杆菌(Escherichia coli)JM109/pGJGLU，CCTCC NO：M202036携带。其步骤如下：

A.首先设计一对适配子：5’TCGACTAAACGCGTGC3’和5’GGCCGCACGCGTTTAG3’。

B.再将靶向融合防龋DNA疫苗pGJA-P用SalI和NotI限制性内切酶进行双酶切，切除A-P片段，在T4连接酶的作用下与适配子连接，构建出具有靶向功能的编码CTLA4信号肽、胞外区的序列和Igγ₁铰链区、恒定区融合基因和变形链球菌葡糖基转移酶GLU片段的序列的重组质粒pGJGLU。

pGJGLU靶向防龋DNA疫苗的基因序列如下：

TCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAA

TATTGGCTATTGGCCATTGCATACGTTGTATCTATATCATAATATGTACATTTAT

ATTGGCTCATGTCCAATATGACCGCCATGTTGGCATTGATTATTGACTAGTTA

TTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCC

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GCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATG

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CGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGA

TTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAA

AATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAA

ATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTA

GTGAACCGTCAGATCACTAGAAGCTTTATTGCGGTAGTTTATCACAGTTAAA

TTGCTAACGCAGTCAGTGCTTCTGACACAACAGTCTCGAACTTAAGCTGCA

GAAGTTGGTCGTGAGGCACTGGGCAGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAG

GTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTT

GCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCT

CCACAGGTGTCCACTCCCAGTTCAATTACAGCTCTTAAGGCTAGAGTACTT

AATACGACTCACTATAGGCTAGCATGGCTTGCCTTGGATTTCAGCGGCAC

AAGGCTCAGCTGAACCTGGCTGCCAGGACCTGGCCCTGCACTCTCCT

GTTTTTTCTTCTCTTCATCCCTGTCTTCTGCAAAGCAATGCACGTGGC

CCAGCCTGCTGTGGTACTGGCCAGCAGCCGAGGCATCGCCAGCTTTG

TGTGTGAGTATGCATCTCCAGGCAAAGCCACTGAGGTCCGGGTGACA

GTGCTTCGGCAGGCTGACAGCCAGGTGACTGAAGTCTGTGCGGCAAC

CTACATGACGGGGAATGAGTTGACCTTCCTAGATGATTCCATCTGCAC

GGGCACCTCCAGTGGAAATCAAGTGAACCTCACTATCCAAGGACTGA

GGGCCATGGACACGGGACTCTACATCTGCAAGGTGGAGCTCATGTAC

CCACCGCCATACTACCTGGGCATAGGCAACGGAACCCAGATTTATGTA

ATTGATCCAGAACCGTGCCCAGATTCTGATCAGGAGCCCAAATCTTCT

GACAAAACTCACACATCCCCACCGTCCCCAGCACCTGAACTCCTGGG

GGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCAT

GATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCC

ACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAG

GTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCAC

GTACCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGA

ATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCC

CCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACC

ACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACC

AGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCG

CCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACC

ACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAG

CTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATG

CTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCC

TCTCCCTGTCTCCGGGTAAAGGTACCGGAGAAATGGGCTATCAAGCCA

AAGGAAAATTTGTAACAACTGCCGATGGTAAAATAAGATATTTTGATAA

GCAATCTGGGAACATGTACCGTAATCGTTTTATTGAAAACGAAGAAGG

TAAATGGCTGTATCTCGGTGAAGATGGTGCAGCAGTGACAGGATCTCA

AACCATTAACGGTCAACACCTGTACTTTAGAGCAAACGGTGTTCAGGT

CAAGGGTGAATTTGTCACTGACCACCACGGCCGTATCAGCTATTACGA

CGGCAATTCAGGGGATCAAATCCGCAACCGCTTTGTCCGCAATGCTCA

GGGTCAATGGTTCTACTTTGATAACAATGGCTATGCCGTAACCGGTGC

CAGAACCATTAACGGTCAACTCCTATACTTTAGAGCAAACGGTGTTCA

GGTCAAGGGTGAATTTGTCACTGACCGCTACGGCCGTATCAGCTATTA

CGACGGCAATTCAGGGGATCAAATCCGCAACCGCTTTGTCCGCAATGC

TCAGGGTCAATGGTTCTACTTTGATAACAATGGCTATGCCGTAACCGG

TGCCAGAACCATTAACGGTCAACACCTATACTTTAGAGCAAACGGTGT

TCAGGTCAAGGGTGAATTTGTCACTGACCGCCACGGCCGTATCAGCTA

TTACGACGGCAATTCAGGGGATCAAATCCGCAACCGCTTTGTCCGCAA

TGCTCAGGGTCAATGGTTCTACTTTGATAACAATGGCTATGCCGTAACC

GGTGCCAGAACCATTAACGGTCAACACCTATACTTTAGAGCAAACGGT

GTTCAGGTCAAGGGTGAATTTGTCACTGACCGCTACGGCCGTATCAGT

TATTACGATGCTAACTCTGGAGAACGAGTTCGGATTGTCGACTAAACGC

GTGCGGCCGCTTCGAGCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAA

ACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGAT

GCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACA

ACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGATGTGGGAGGTTTT

TTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTAAAATCGATAAGGATCCGGG

CTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCG

CAGCCTGAATGGCGAATGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGC

GGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGC

GCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTT

CCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGAGCTT

TACGGCACCTCGACCGCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTG

GGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGT

TCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTC

GGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAA

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TGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGC

TGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAA

GGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTT

CTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTT

GTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCC

TGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATT

TCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCT

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ACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAG

TTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTA

TGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGC

CGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAA

AAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATA

ACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGA

CCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGC

CTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCG

TGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAAC

TGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGA

GGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTG

GTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATT

GCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACG

ACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGAT

AGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATAT

ATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAA

GATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTC

CACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCT

TTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCA

GCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTA

ACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCG

TAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCT

CTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTA

CCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGC

TGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACAC

CGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCG

AAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGG

AGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCC

TGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCA

GGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTT

CCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGGCTCGACAGATCT

黑体部分为插入序列CTLA4-Ig、GLU片段。

与其它DNA疫苗相比，pGJGLU具有巨细胞病毒CMV的早期启动子/增强子(CMV immediate-early ehancer/promoter)，该启动子增强表达的能力显著高于其它如劳斯肉瘤病毒启动子LTR、猴病毒40(SV40)等启动子；pGJGLU的辅助增强表达成分中还含有人β球蛋白基因内含子序列，细胞转染及表达实验表明，该内含子序列可显著增加基因表达，较之仅有CMV启动子而无此内含子的另一个优秀真核表达质粒pcDNA3(Invitrogen公司)，pGJGLU的表达能力要强10到40倍。pGJGLU质粒中的氨苄青霉素抗性基因(AmpR)内含有两个5’-AACGTT-3’拷贝，该拷贝属于免疫刺激DNA序列(Immunostimulatory DNAsequence，ISS)，具有诱导机体产生IFN等细胞因子，促进机体对抗原的免疫应答的作用；pGJGLU携带人CTLA4信号肽、胞外区的序列和Igγ₁铰链区、恒定区融合基因，因此可以利用CTLA4与其配体牢固结合的特性将宿主表达出的抗原蛋白引导至APC表面，大幅度增强DNA疫苗的免疫效能，同时由于Igγ₁部分功能区的存在使使重组蛋白在体内更加稳定，半衰期延长，利于体内应用；pGJGLU表达的重组融合蛋白呈二聚体结构，应该是一个完整的重组蛋白分子含有两个抗原分子，多价抗原应该具有更高的免疫效能。

与多肽防龋疫苗相比，pGJGLU DNA防龋疫苗具有以下优点：①pGJGLU质粒物理化学性质稳定，常温下即可保存，便于运输使用，而多肽疫苗一般需要低温冷藏保存等特殊条件；②pGJGLU简化了疫苗的生产步骤，仅需完成基因工程的上游部分，省却了下游重组多肽的表达和纯化过程，短时间内可以得到大量的质粒，而且pGJGLU质粒的纯化方法较为简单且产物纯度很高，而多肽疫苗制备纯化相对困难复杂，一般需耗时数周；③多肽防龋疫苗激发机体产生免疫反应的能力较差，需要添加各种免疫佐剂，但这些佐剂经常引起严重的炎症反应，大大限制了多肽疫苗的应用，而pGJGLU DNA疫苗本身含有CpG免疫刺激序列可以作为免疫佐剂显著提高机体对pGJGLU的免疫反应，同时携带人CTLA4信号肽、胞外区的序列和Igγ₁铰链区、恒定区融合基因，因此可以利用CTLA4与其配体牢固结合的特性将宿主表达出的抗原蛋白引导至APC表面，大幅度增强DNA疫苗的免疫效能，避免使用各种对人体有害的佐剂；④pGJGLU如同其他DNA疫苗一样在被以任何途径输入体内后，都可能在被转染的少量细胞中长期表达GLU重组蛋白，不断地刺激机体的免疫系统，诱导长时间的免疫反应。相反多肽疫苗在体内很不稳定易被蛋白酶降解，因而要接种较大量才能引起明显的免疫反应，且要多次接种以维持效果。另外比不含CTLA4信号肽、胞外区的序列和Igγ₁铰链区、恒定区融合基因的其他防龋DNA疫苗效果要佳。

                         附图说明

图1pGJGLU防龋DNA疫苗结构示意图

CMV immediate-early enhancer/promoter 巨细胞病毒早期启动子/增强子

Chimeric intron                       人β球蛋白基因内含子序列

T₇ promoter                          T₇噬菌体启动子

CTLA4-Ig GLU fragment                 CTLA4-Ig、GLU片段

SV40 late poly A signal               SV40病毒晚期加尾信号

Phage fl region                       丝状噬菌体fl复制子

NheI(1052)                            限制性内切酶NheI的酶切位点

BclI(1537)                            限制性内切酶BclI的酶切位点

KpnI(2240)                            限制性内切酶KpnI的酶切位点

SalI(3122)                            限制性内切酶SalI的酶切位点

MluI(3131)                            限制性内切酶MluI的酶切位点

NotI(3137)                            限制性内切酶NotI的酶切位点

AmpR                                  氨苄青霉素抗性基因

pGJGLU携带人CTLA4信号肽、胞外区的序列和Igγ₁铰链区、恒定区融合基因，该片段可以直接将抗原蛋白引导于APC表面，并与之结合，含有变形链球菌重要毒力因子之一的葡糖基转移酶GTF-I中葡聚糖结合区(GLU)序列，具有巨细胞病毒CMV的早期启动子/增强子(CMV immediate-earlyehancer/promoter)，该启动子增强表达的能力显著高于其它如劳斯肉瘤病毒启动子LTR、猴病毒40(SV40)等启动子；pGJGLU的辅助增强表达成分中还含有入β球蛋白基因内含子序列，pGJGLU质粒中的氨苄青霉素抗性基因(AmpR)内含有两个5’-AACGTT-3’拷贝，该拷贝属于免疫刺激DNA序列(Immunostimulatory DNA sequence，ISS)，具有诱导机体产生IFN等细胞因子，促进机体对抗原的免疫应答的作用。SV40晚期polyA信号能在RNA多聚酶II的作用下终止转录，并在RNA转录体的3’端加上约200至250个腺嘌呤残基。这种polyA结构能增强RNA的稳定与其后的翻译。fl复制子为丝状噬菌体fl的复制源，便于质粒在大肠杆菌中复制。T₇噬菌体启动子为一优良的原核启动子，可以调控CTLA4-Ig、GLU片段的表达。

图2pGJGLU重组质粒的限制性内切酶酶切分析电泳示意图

           1  DL2000分子量标准

           2  pCI KpnI单酶切

           3  pGJGLU NotI、NheI双酶切

           4  pGJGLU KpnI单酶切

           5  λHind III分子量标准

图3重组质粒pGJGLU在CHO细胞系中的表达示意图

重组质粒pGJGLU转染后的CHO细胞胞浆内特异性表达产物。(cy3-SABC法，×100)

图4重组片段CTLA4-Ig-GLU抗GLU抗体蛋白质免疫印迹结果示意图

           1未经pGJGLU转染细胞培养上清

           2经pGJGLU转染细胞培养上清

           3中分子量标准

           4GTF阳性对照

图5重组片段CTLA4-Ig-GLU的二聚体蛋白质免疫印迹结果示意图

           1重组片段在非还原条件下的二聚体结构

           2重组片段在还原条件下的单聚体结构

           3中分子量标准

                      具体实施方式

下面根据附图对本发明作进一步详细描述：

根据图1可知，运用分子生物学专业软件：DNASIS综合DNA序列分析软件、Gene Construction kit 2.0基因模拟克隆软件、Omiga综合分子生物分析软件、Oligo引物设计分析软件等软件分析和设计靶向防龋DNA疫苗并模拟克隆全过程。

根据图2可知，设计一对适配子，分别为：适配子1：5’TCGACTAAACGCGTGC3’，适配子2：5’GGCCGCACGCGTTTAG3’，分别在5’端和3’设计SalI和NotI位点，中间设计MluI位点，适配子预先退火；将pGJA-P用SalI和NotI进行双酶切，酶切后电泳回收包含部分载体序列和CTLA4、Ig、GLU的目的片段，在T₄连接酶的作用下与适配子进行连接反应，获得靶向防龋DNA疫苗pGJGLU，并转化感受态细胞E.coli JM109，提取纯化pGJGLU，电泳鉴定。pGJGLU经KpnI单酶切得到了6048bp片段，经KpnI和NheI双酶切得到CTLA4-Ig-GLU融合基因2089bp片段和3960bp的片段。电泳结果表明pGJGLU的插入片段大小与预期结果一致(图2)。

根据图3、图4、图5可知，CHO细胞系用无血清专用培养液(Hyclone)37℃、5％CO₂培养。转染时将一定量的质粒pGJGLU和转染剂LipoVec^TM(InvivoGen)混匀，室温孵育30分钟，按一定比例加入细胞培养瓶中，37℃、5％CO₂培养，细胞培养48-72小时后吸取培养上清，分别在还原或非还原条件下用10％聚丙烯酰胺凝胶电泳，设立rGTF重组蛋白作阳性对照。电泳结束后转印至硝酸纤维素膜，3％BSA/TBS封闭液室温摇振1h，然后加入兔抗GLU蛋白抗体溶液(1∶2000)4℃过夜。漂洗后加入HRP标记的羊抗兔抗体，室温下振荡孵育1h。漂洗后加入DAB显色液显色10min。还原条件下，由CHO细胞表达的并分泌出胞的重组蛋白(70kD)可以与特异性抗S.mutans的GLU抗体发生反应，有棕色条带显示。空白对照与阴性对照均无条带出现。而GTF阳性对照在162kD处有条带显示抗体抗原反应。证实pGJGLU可以在真核细胞正确表达，其表达的蛋白具备免疫原性；非还原条件下，表达的重组蛋白呈二聚体(140kD)，还原条件下，表达蛋白为单聚体(70kD)(图4、5)。剩余细胞进行免疫荧光反应。转染细胞镜下呈现荧光，进一步证实了重组融合蛋白可以在真核细胞中正确表达(图3)。

Claims (2)

1、一种靶向防龋DNA疫苗，其特征在于大肠杆菌Escherichia coli，CCTCCNO：M202036携带质粒pGJGLU，DNA序列为：

TCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATAT

TGGCTATTGGCCATTGCATACGTTGTATCTATATCATAATATGTACATTTATATT

GGCTCATGTCCAATATGACCGCCATGTTGGCATTGATTATTGACTAGTTATTA

ATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCG

TTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCC

GCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGAC

TTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCA

GTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACG

GTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCC

TACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGT

TTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTC

CAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATC

AACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAATGG

GCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGA

ACCGTCAGATCACTAGAAGCTTTATTGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGC

TAACGCAGTCAGTGCTTCTGACACAACAGTCTCGAACTTAAGCTGCAGAA

GTTGGTCGTGAGGCACTGGGCAGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTT

AAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGT

TTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCAC

AGGTGTCCACTCCCAGTTCAATTACAGCTCTTAAGGCTAGAGTACTTAATAC

GACTCACTATAGGCTAGCATGGCTTGCCTTGGATTTCAGCGGCACAAGG

CTCAGCTGAACCTGGCTGCCAGGACCTGGCCCTGCACTCTCCTGTTTT

TTCTTCTCTTCATCCCTGTCTTCTGCAAAGCAATGCACGTGGCCCAGC

CTGCTGTGGTACTGGCCAGCAGCCGAGGCATCGCCAGCTTTGTGTGT

GAGTATGCATCTCCAGGCAAAGCCACTGAGGTCCGGGTGACAGTGCT

TCGGCAGGCTGACAGCCAGGTGACTGAAGTCTGTGCGGCAACCTACA

TGACGGGGAATGAGTTGACCTTCCTAGATGATTCCATCTGCACGGGCA

CCTCCAGTGGAAATCAAGTGAACCTCACTATCCAAGGACTGAGGGCCA

TGGACACGGGACTCTACATCTGCAAGGTGGAGCTCATGTACCCACCGC

CATACTACCTGGGCATAGGCAACGGAACCCAGATTTATGTAATTGATCC

AGAACCGTGCCCAGATTCTGATCAGGAGCCCAAATCTTCTGACAAAAC

TCACACATCCCCACCGTCCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGT

CAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCC

GGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGAC

CCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAA

TGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGGG

TGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAG

GAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGA

GAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGT

ACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGC

CTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGA

GTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTC

CCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCG

TGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTG

ATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTG

TCTCCGGGTAAAGGTACCGGAGAAATGGGCTATCAAGCCAAAGGAAA

ATTTGTAACAACTGCCGATGGTAAAATAAGATATTTTGATAAGCAATCT

GGGAACATGTACCGTAATCGTTTTATTGAAAACGAAGAAGGTAAATGG

CTGTATCTCGGTGAAGATGGTGCAGCAGTGACAGGATCTCAAACCATT

AACGGTCAACACCTGTACTTTAGAGCAAACGGTGTTCAGGTCAAGGG

TGAATTTGTCACTGACCACCACGGCCGTATCAGCTATTACGACGGCAA

TTCAGGGGATCAAATCCGCAACCGCTTTGTCCGCAATGCTCAGGGTCA

ATGGTTCTACTTTGATAACAATGGCTATGCCGTAACCGGTGCCAGAAC

CATTAACGGTCAACTCCTATACTTTAGAGCAAACGGTGTTCAGGTCAA

GGGTGAATTTGTCACTGACCGCTACGGCCGTATCAGCTATTACGACGG

CAATTCAGGGGATCAAATCCGCAACCGCTTTGTCCGCAATGCTCAGGG

TCAATGGTTCTACTTTGATAACAATGGCTATGCCGTAACCGGTGCCAG

AACCATTAACGGTCAACACCTATACTTTAGAGCAAACGGTGTTCAGGT

CAAGGGTGAATTTGTCACTGACCGCCACGGCCGTATCAGCTATTACGA

CGGCAATTCAGGGGATCAAATCCGCAACCGCTTTGTCCGCAATGCTCA

GGGTCAATGGTTCTACTTTGATAACAATGGCTATGCCGTAACCGGTGC

CAGAACCATTAACGGTCAACACCTATACTTTAGAGCAAACGGTGTTCA

GGTCAAGGGTGAATTTGTCACTGACCGCTACGGCCGTATCAGTTATTA

CGATGCTAACTCTGGAGAACGAGTTCGGATTGTCGACTAAACGCGTGC

GGCCGCTTCGAGCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCA

CAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTAT

TGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAAT

TGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGATGTGGGAGGTTTTTTAAA

GCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTAAAATCGATAAGGATCCGGGCTGGC

GTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGC

CTGAATGGCGAATGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGT

GTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCC

GCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCC

GTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGAGCTTTACG

GCACCTCGACCGCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCC

ATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTT

AATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTC

TATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAA

TGAGCTGATTTAACAAATATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTA

CAATTTCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACA

CCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGC

CAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCT

GCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCAT

GTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCC

TCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGA

CGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATT

TTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAA

TGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGT

CGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAG

AAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTG

GGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGC

CCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGC

GCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATA

CACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCAT

CTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATG

AGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAA

GGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGA

TCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACA

CCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCG

AACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGG

ATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTA

TTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAG

CACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGG

GGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGT

GCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATAC

TTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATC

CTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACT

GAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTT

TTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGG

TGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTG

GCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTT

AGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCT

AATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGG

GTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAA

CGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAA

CTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGG

GAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAG

CGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTC

GGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGG

GGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCT

GGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGGCTCGACAGATCT

2、一种实现权利要求1所述的一种靶向防龋DNA疫苗的制备方法，其特征在于：

A、设计一对适配子：

5’TCGACTAAACGCGTGC3’；5’GGCCGCACGCGTTTAG3’；

B、将靶向融合防龋DNA疫苗pGJA-P用SalI和NotI限制性内切酶进行双酶切，切除A-P片段，在T4连接酶的作用下与适配子连接，构建出编码细胞毒性T淋巴细胞抗原4信号肽、胞外区的序列和Igγ₁铰链区、恒定区融合基因与变形链球菌葡糖基转移酶的GLU区序列靶向防龋DNA疫苗pGJGLU。

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