NL194865C - Werkwijze voor de bereiding van een niet-giftig hydrolyseproduct van een endotoxine en farmaceutisch preparaat dat een dergelijk hydrolyseproduct bevat. - Google Patents

Description

1 194865

Werkwijze voor de bereiding van een niet-giftig hydrolyseproduct van een endotoxine en farmaceu-* tisch preparaat dat een dergelijk hydrolyseproduct bevat

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het bereiden van een niet-giftig 5 hydrolyseproduct van een endotoxine (ZOE), waarbij belangrijke biologische eigenschappen van het endotoxine behouden zijn gebleven, door uit Gram-negatieve bacteriën gewonnen en gezuiverd endotoxine in waterbevattend milieu met een zuur te hydrolyseren, hierna de waterbevattende fase met hierin opgeloste stoffen te verwijderen, het vaste residu te vriesdrogen, het gevriesdroogde product te extraheren met een oplosmiddel voor het verwijderen van daarin aanwezige vetzuren, en daarna het product aan verdere 10 bewerkingen te onderwerpen om een gezuiverd niet-giftig hydrolyseproduct van endotoxine te verkrijgen.

Een dergelijke werkwijze is bekend uit DE 28 23 750 B2 (G. Ayme). Volgens de werkwijze van DE 28 23 750 wordt een eventueel gezuiverd endotoxine van Bordetella pertussis gedurende 50 tot 150 uur bij een temperatuur tussen 40 en 60°C bij een pH tussen 2 en 4 met trifluorazijnzuur gehydrolyseerd. Het product (product A) van deze hydrolyse wordt van de bovenstaande vloeistof gescheiden, gevriesdroogd en 15 door extractie met een 1:1-mengsel van tolueen en methanol in verdere fracties gescheiden. Uit het extract worden de oplosmiddelen afgedampt en door verdere extractie van het residu wordt een residu met product X1 en een extract met product X2 verkregen. Het residu van de extractie van product A wordt gedurende 15 tot 60 minuten bij 100°C bij, een pH van 1 of lager onderworpen aan een verdere hydrolyse met zoutzuur. Na centrifugeren, wassen en verwijderen van de bovenstaande vloeistof wordt het hydrolyseproduct 20 geëxtraheerd met hexaan, waarbij als residu een product Zz wordt verkregen. Het extract levert na verdamping van de hexaan een product Z,. Het product Z2 wordt eventueel verder gezuiverd door extractie met tolueen/methanol.

De fracties vertonen verschillende biologische activiteiten zoals werkzaamheid als adjuvans, ontstekings-remmende activiteit, anti-tumoractiviteit en een niet-specifieke werking op de immuniteit. Enkele fracties zijn 25 evenals het uitgangsendotoxine toxisch en koortsverwekkend, terwijl andere fracties deze effecten niet hebben. Het product Z2 is niet-pyrogeen en veroorzaakt geen necrose (Shwartzman-negatief), terwijl de werkzaamheid als adjuvans ervan ongeveer gelijk is aan die van het endotoxine. Deze werkwijze wordt door G. Ayme c.s. ook beschreven in Infection and Immunity 27 (1980) 739-745, waarbij iets wordt verteld over de aard van de verschillende fracties.

30 Doel van de uitvinding is te voorzien in een hydrolyseproduct van endotoxine dat een verder verlaagde toxiciteit heeft dan de bekende hydrolyseproducten, maar dat de therapeutische activiteit van het uitgangsendotoxine behouden heeft.

Dit doel wordt volgens de uitvinding bereikt met een werkwijze als in de aanhef omschreven, met het kenmerk, dat men: 35 a) de hydrolyse gedurende 10 tot 60 minuten bij 90 tot 130°C bij een pH van 0 tot 2 uitvoert; b) het hydrolyseproduct van stap a) isoleert, wast en vriesdroogt; c) het ruwe product van stap b) met een eerste oplosmiddel extraheert ter verwijdering van de daarin aanwezige vetzuren, zonder het ZOE op te lossen; d) het residu van stap c) oplost in een tweede oplosmiddel, en 40 e) deze oplossing door een kolom chromatografeert ter verkrijging van een product dat de biologische activiteit van het uitgangsendotoxine behouden heeft, dat per milligram 350 tot 475 nmol fosfor en 1700 tot 2000 nmol vetzuur bevat en waarin geen 2-keto-3-deoxyoctonaat is aan te tonen.

Het volgens de werkwijze van de uitvinding verkregen niet-giftige (ZOE) hydrolyseproduct van een endotoxine is aanzienlijk minder giftig dan de bekende hydrolyse- en andere omzettingsproducten van 45 endotoxine en vertoont samen met celwandskelet (CWS) een goede anti-tumoractiviteit. Volgens de werkwijze van de uitvinding wordt de zure hydrolyse van het endotoxine in één stap uitgevoerd.

De uitvinding heeft verder betrekking op een preparaat dat een volgens de werkwijze van de uitvinding bereid niet-giftig hydrolyseproduct van een endotoxine in combinatie met celwandskelet en een farmaceutisch aanvaardbare drager bevat.

50 Voor de stand der techniek met betrekking tot zure hydrolyse van endotoxine en celwandskelet bevattende preparaten wordt verder verwezen naar de volgende publicaties.

In Cancer Immunology and Immunotherapy 7 (1979) 43-58 beschrijven E. Ribi c.s. de bereiding van een hydrolyseproduct van een endotoxine, aangeduid als lipide A, waarbij een met fenol-waterextractie uit Re-mutant van Salmonella typhimurium G30/C21 verkregen endotoxine met 0,1 N zoutzuur gedurende 55 30 minuten wordt gehydrolyseerd in een afgesloten, in een bad kokend water geplaatst vat, het neerslag door centrifugeren wordt verzameld, met gedestilleerd water wordt gewassen en wordt gevriesdroogd. De giftigheid was door de zure hydrolyse honderdvoudig verminderd, maar het product vertoonde in combinatie 194865 2 met P3 (trehalosedimycolaat) vrijwel geen tumorremmende werking meer.

Het artikel van Ribi c.s. maakt verder melding van de werking van andere hydrolyseproducten van endotoxinen, aangeduid als RESI. RESI is de tractie van lipide A die niet alleen onoplosbaar is in ethyl-acetaat met 0,1% azijnzuur, maar ook onoplosbaar in chloroform. RESI lost wel op in 0,5% triëthylamine.

5 RESI van Serratia marcescens was honderdmaal minder giftig dan het uitgangsendotoxine, maar heeft samen met P3 een zeer sterke werkzaamheid tegen tumoren. RESI van Salmonella typhimurium heeft eveneens samen met P3 een sterke werkzaamheid tegen tumoren, maar de giftigheid ervan werd niet bepaald.

Ribi c.s. beschrijven ook het gebruik van celwandskelet. Een combinatie van celwandskelet afkomstig 10 van Mycobacterium bovis en een endotoxinederivaat B4, endotoxische glycolipiden afkomstig uit Salmonella Re-mutanten, bleek in de vorm van een suspensie in olie voor injectie zeer effectief tegen tumoren bij cavia’s. B4 is echter zeer giftig.

In Immunochemistry 12 (1975) 19-28 beschrijven Ch.M. Chang en A. Nowotny de bereiding van RESI van Serriata marcescens. Het endotoxine werd 30 tot 35 minuten met 1 N zoutzuur in een bad kokend 15 water gehydrolyseerd tot een neerslag werd gevormd. Het product dat hierna verkregen werd (lipide A) werd afgecentrifugeerd en driemaal met water gewassen. Het ruwe lipide A werd eerst geëxtraheerd met ethylacetaat met 0,1% azijnzuur. Het residu van deze extractie werd bij 5°C met chloroform geëxtraheerd. Het niet in chloroform oplosbare product is RESI. Volgens deze publicatie is het RESI van Serriata marcescens zeer giftig en zelfs tweemaal giftiger dan het ruwe lipide A. Uit figuur 4 van deze publicatie blijkt 20 dat de giftigheid van het lipide A daalt naarmate de zure hydrolyse langer duurt. Vermoedelijk leidt dit ook tot geringere giftigheid van het uit dit lipide A verkregen RESI.

De Nederlandse octrooiaanvrage 7808337 beschrijft in vaste vorm gebrachte, celwandskeletbevattende preparaten met werkzaamheid tegen tumoren. Deze preparaten bevatten naast celwandskelet een dragerolie, een suspendeermiddel en een dispergeermiddel. Het preparaat dat na bereiding eventueel kan 25 worden gevriesdroogd, heeft een verbeterde houdbaarheid. Bij toepassing wordt het preparaat voor toediening aan patiënten gesuspendeerd in gedestilleerd water zodat een olie-in-wateremulsie werd gevormd.

Het preparaat "celwandskelet” bestaat in wezen uit bacterie-celwanden waaruit veel van de normaliter aanwezige eiwitten en vetten verwijderd zijn, zie bijvoorbeeld T.J. Meyer c.s. Journal of the National Cancer 30 Institute 52 (1) (1974) 103-111. Celwandskelet C.W.S. is een polymeer, een mycolzuur-arabinogalactan-mucopeptide met restanten trehalose-mycolaat (”P3”) en niet verteerde tuberculose-eiwitten. Dit preparaat kan men verkrijgen uit alle mogelijke mycobacteriën, waaronder Mycobacterium smegmatis, M, phlei, Nocardia rubra, Nocardia asteroldes, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium parvum, Mycobacterium M. kansasii, M. tuberculosis (stammen H 37 RV en Ayoma B) en M. bovis, stam BCG. Bovendien kan 35 celwandskelet uit andere bacteriën zoals E. coli, Brucella abortus en Coxiella burnetii verkregen worden.

Celwandskelet wordt bereidt door eerst een bacterie zoals M. bovis stam BCG (Bacille Calmette-Guerin) te kweken en te oogsten. Het aldus verkregen residu van gehele cellen wordt met een cel-fractionator verwerkt (Ribi Cell Fractionator, Servall, Model RF-1) waarin de cellen opgebroken worden en de buitenste omhullingen oftewel celwanden van het protoplasma gescheiden worden. Deze celwanden ondergaan dan 40 een serie extracties en enzymbehandelingen, (met trypsine en/of chymotrypsine) wat dan gezuiverd celwandskelet geeft.

De endotoxine-extracten van het type dat men als uitgangsstoffen gebruikt voor het bereiden van het niet-giftige hydrolyseproduct van een endotoxine volgens de uitvinding (ZOE) kunnen uit alle Gram-negatieve bacteriën (zowel oorspronkelijke soorten als mutanten) bereid worden. Bijvoorbeeld kan men ze 45 verkrijgen uit soorten van de geslachten Salmonella, Shigella, Escherichia, Brucella, Bordetella, Citrobacter, Pseudomonas, Pasteurella, Neisseria, Proteus, Klebsiella en Serratia.

Representatief daaronder zijn de soorten Salmonella minnesota, Salmonella typhimurium, Bordetella pertussis, Brucella abortus, Salmonella enteritidis, Escherichia coli, Salmonella typhi, Serratia marcescens, Salmonella typhosa en Shigetia flexneri.

50 Het bereiden van de als uitgangsstoffen te gebruiken endotoxine-extracten kan op bekende wijze gebeuren, bijvoorbeeld volgens de methode beschreven door C.H. Chen, A.G. Johnson, N. Kasai, B.A. Key, J. Leving en A. Nowotny in J. Infect. Dis. 128 (1973) (suppl) S 43-S 51, waarbij door extractie met chloroform/methanol 4:1 en vervolgens toevoegen van meer methanol een neerslag wordt verkregen.

Het met methanol/chloroform verkregen neerslag laat men dan met een organisch of anorganisch zuur 55 reageren en wordt dan gevriesdroogd tot een ruw hydrolyseproduct van endotoxine dat vergeleken met de uitgangsstof minder giftig en minder pyrogeen is. Dat product wordt dan met een oplosmiddel behandeld dat specifiek vetzuren en andere verontreinigingen kan oplossen zonder het hydrolyseproduct op te lossen; het 3 194865 bevoorkeurde oplosmiddel hiervoor is aceton. Het tosfaatgehalte van het niet-giftige hydrolyseproduct van een endotoxine1 is ongeveer de helft van dat van het toxische tegendeel, hetgeen suggereert dat het tosfaatgehalte te maken heeft met de giftige werking van de endotoxinen.

De bij voorkeur gebruikte anorganische zuren voor het behandelen van het met methanol en chloroform 5 verkregen neerslag zijn zoutzuur, zwavelzuur en tosforzuur, en de bij voorkeur gebruikte organische zuren zijn tolueensulfonzuur en trichloorazijnzuur. De hydrolyse wordt uitgevoerd bij een pH van 0 tot 2 en bij voorkeur een pH van 1 bij een temperatuur tussen 90 en 130°C, gedurende 10 tot 60 minuten en bij voorkeur gedurende 15 tot 30 minuten.

Het bereiden van het gezuiverde niet giftige hydrolyseproduct van endotoxine kan ook gebeuren door de 10 uitgangsstof in aanwezigheid van een organisch oplosmiddel zoals chloroform, methanol en/of ethanol met een water bevattend zuur te behandelen.

Het aldus verkregen hydrolyseproduct wordt geïsoleerd, gewassen en gevriesdroogd en geëxtraheerd met een eerste oplosmiddel, bijvoorbeeld aceton, ter verwijdering van vetzuren en het residu van deze extractie wordt opgelost in een tweede oplosmiddel en door een geschikte chromatografiekolom geleid, 15 bijvoorbeeld een kolom voor moleculaire restrictie, waardoor men het ZOE in fracties scheidt, welke na verwijderen van het oplosmiddel gecombineerd worden. Bij een uitvoeringsvorm leidt men een oplossing van het ruwe ontgifte endotoxine door een kolom Sephadex met chloroform, methanol, pyridine, ether of azijnzuur of een combinatie daarvan als loopvloeistof. De druk in de kolom kan variëren maar ligt in het algemeen tussen de atmosferische en 7 ato, en het debiet ligt tussen 0,1 en 10 ml/min.

20 Bij een andere uitvoeringsvorm wordt een oplossing van het ruwe ontgifte hydrolyseproduct van een endotoxine door een kolom DEAE-cellulose geleid, onder dezelfde druk als bij de kolom Sephadex. Het debiet kan tussen 2 en 15 ml/min. ingesteld worden. Ook de loopvloeistoffen zijn dezelfde, hoewel hier water en/of diëthylamine tot een concentratie van ongeveer 1% toegevoegd kunnen worden.

Andere methoden voor het bereiden van ZOE uit ruw ontgift hydrolyseproduct van een endotoxine 25 omvatten het leiden van de oplossing onder lage druk door een kolom silicagel 60 met deeltjes tussen 15 en 16 pm, waarbij de loopvloeistof uit chloroform, methanol, water en ammonia bestaat, bij voorkeur in een volumeverhouding van ongeveer 50:25:4:2.

Het volgens de uitvinding bereide ZOE wordt dan met CWS samengevoegd tot een preparaat met sterke werking tegen tumoren. De soorten kanker die met de ZOE-CWS-preparaten bestreden kunnen worden zijn 30 dierlijke tumoren zoals opperhuid carcinoom en bindweefselsarcoom bij runderen, sarcoom, melanoom en opperhuid-carcinoom bij paarden en melkkliertumor, adenoom en melanoom bij honden, en ook menselijke tumoren zoals die aan borsten, longen, dikke darm, endeldarm en ovarium, kwaadaardig melanoom en opperhuid-carcinoom.

Het preparaat wordt bij voorkeur in een farmaceutisch aanvaardbaar medium zoals een emulsie direct in 35 de tumor geïnjicieerd onder hierna nog aan te geven omstandigheden. Dat preparaat kan gestabiliseerd worden, bijvoorbeeld door vriesdrogen, waarna men het zonder verlies van sterkte weer kan aanmaken.

De hoeveelheid ZOE in één enkele injectie ligt bij de behandeling van dieren tussen 6,25 en 250 pg/ml, en de hoeveelheid CWS tussen 125 en 750 pg/ml. Het aantal milliliters preparaat dat men in de tumor moet injiciëren wordt bepaald door de grootte van de tumor, ongeveer als volgt: 40

Diameter van de tumor (cm) Te injiciëren hoeveelheid 0-1 cm tot 0,5 ml 45 1-2 cm 0,5 tot 2,5 ml 2- 3 cm 2,5 tot 5 ml 3- 5 cm 5 tot 10 ml 5-8 cm 10 tot 15 ml meer dan 8 cm 15 tot 20 ml 50 -

Per injectie doseert men maximaal 1500 pg ZOE en 4500 pg CWS. Een volledige behandeling omvat tot vijf injecties, die om de week toegediend worden.

Voor de behandeling van menselijke tumoren gebruikt men het ZOE-CWS-preparaat in een daarvoor

Na indiening van de onderhavige octrooiaanvrage is gebleken, dat het product volgens de onderhavige aanvrage monofosforyllipide A is.

4 194865 4

geschikt medium zoals een emulsie van olie in water. Een volwassene van zo 70 kg krijgt van zowel ZOE

als CWS tussen 50 en 1000 pg, bij voorkeur tussen 275 en 325 pg. De injecties worden eenmaal per week * toegediend, tot een totaal van 15 injecties. In het algemeen verdient het de voorkeur per injectie tussen 50 en 500 pg/ml ZOE en tussen 50 en 500 pg/ml CWS toe te dienen.

5 Zoals reeds aangegeven kan het preparaat voor het behandelen van warmbloedige dieren en mensen de vorm hebben van een emulsie van olie in water. De hoeveelheid olie ligt dan tussen 0,5 en 3,0 vol.% op totaal, bij voorkeur tussen 0,75 en 1,5 vol.%. Voorbeelden van geschikte oliën zijn lichte minerale olie, squalaan, 7-n-hexyloctadecaan, Conocosuperoil (lichte minerale olie, aardoliedestillaat) en Drakeol 6 VR (minerale olie, aardoliedestillaat van de Pennreco Company te Bulter, Pennsylvanië). Aan het gehomogeni-10 seerde, olie bevattende mengsel wordt dan een oppervlak-actieve stof toegevoegd, die eventueel voor mengen in een zoutoplossing opgelost was. De hoeveelheid oppervlak-actieve stof ligt in het algemeen tussen 0,02 en 0,20 vol.%, bij voorkeur tussen 0,10 en 0,20 vol.%, betrokken op het totale preparaat. Elk pharmaceutisch aanvaardbaar detergens kan hiervoor gebruikt worden, waaronder Tween-80 (polyoxyethy-leen sorbitan mono-oleaat) en Arlacel (sorbitan sesquioleaat of alkylether van sorbitan) (van de Atlas 15 Chemical Company).

Het mengsel wordt dan gehomogeniseerd tot een suspensie waarin een hoog percentage der oliedruppeltjes met ZOE en CWS bekleed is, wat men onder een microscoop kan zien.

De uitvinding wordt nu nader toegelicht door de volgende, niet beperkende voorbeelden. Hierbij betreffen de voorbeelden I en II de bereiding van tussenproducten.

20

Voorbeeld I

Bereiding van ruw ontgift hydrolyseproduct van endotoxine van Salmonella minnesota R595.

In een driehalskolf met koeler werd in 150 ml 0,1 N HCI 650 mg volgens Chen c.s. (J. Infect. Dis. 128 (1973) (suppl) S 43-S 51 met methanol en chloroform verkregen neerslag gesuspendeerd. De kolf bracht 25 men in een "sonicator”, en na het toepassen van supersone trillingen bracht men de glazen kolf in een oliebad dat op 120°C gehouden werd, zodat de inhoud van de kolf aan de kook kwam. Oververhitting van de oplossing werd beperkt door via een capillair in één van de zijhalzen stikstof door te leiden; dit doorblazen gebeurde tijdens de gehele hydrolyse, welke 30 minuten duurde.

Daarna werd de oplossing met een ijsbad afgekoeld, opnieuw aan supersone trillingen onderworpen, en 30 over Corex (merknaam) buizen verdeeld. De kolf werd met gedestilleerd water nagespoeld om al de vaste stof van de zijkanten af te krijgen en dat werd ook in de corexbuizen gebracht. Deze werden 80 minuten op 12000 rpm gecentrifugeerd. De bovenstaande vloeistof werd afgeschonken en weggedaan. Het vaste residu werd opnieuw in gedestilleerd water gesuspendeerd, supersoon getrild totdat de suspensie goed gedisper-geerd was, en weer gecentrifugeerd. Dit centrifugerend uitwassen werd nog eens herhaald. Het residu werd 35 toen in gedestilleerd water opgenomen, ingevroren en gevriesdroogd wat 382 mg ruw hydrolyseproduct gaf.

Van dit materiaal werd 150 mg met koud aceton van 0°C uitgetrokken, om vetzuren te verwijderen, supersoon getrild, en bij 5°C door Whatman papier no. 1 gefiltreerd. Na drogen was er 100 mg ruw ontgift hydrolyseproduct van een endotoxine.

40 Voorbeeld II

Bereiding van ruw ontgift hydrolyseproduct van een endotoxine.

Van het met methanol en chloroform verkregen neerslag werd 120 mg gesuspendeerd in 12 ml absolute methanol, dit werd supersoon getrild zodat alle vaste stof goed gedispergeerd raakte, en die dispersie werd over zes centrifugebuizen (van 1x10 cm met schroefdoppen) verdeeld. Aan elke buis werd nog 2 ml 0,2 N 45 HCI toegevoegd, waarna de buizen 45 minuten in kokend water gehouden werden. Na de hydrolyse werden de buizen in ijswater afgekoeld en 10 minuten op 2500 rpm gecentrifugeerd. De bovenstaande vloeistof werd weggedaan en aan elk residu werden 5 ml chloroform/methanol 2:1 en 2 ml water toegevoegd. Na goed omschudden werden die buizen 10 minuten op 2500 rpm gecentrifugeerd. Er werd een tweefasen-systeem verkregen. De bovenstaande waterfasen werden weggedaan en in elke buis werd 1 ml chloroform/ 50 methanol 4:1 toegevoegd, wat tot heldere oplossingen leidde. Deze werden bij elkaar gedaan en in een draaiverdamper drooggedampt. Het residu werd onder hoog vacuüm gedroogd en gevriesdroogd, wat 45 mg ruw hydrolyseproduct gaf. Hiervan werd 20 mg met koud aceton van 0°C geëxtraheerd, supersoon getrild en bij 5°C door papier Whatman no. 1 gefiltreerd. Na opdrogen had men 13 mg ruw ontgift hydrolyseproduct van een endotoxine.

Claims (5)

20 Een suspensie van 33 g DEAE-cellulose (DE-32 van Whatman) in 150 ml ijsazijn werd 10 minuten zachtjes geschud, en na een nacht bewaren in een kolom van 25 x 400 mm geschonken. Onder zacht kloppen liet men bezinken waarna men overmaat zuur liet weglopen. De kolom werd met 2000 ml methanol uitgewassen, gevolgd door 200 ml chloroform/methanol 4:1. Een monster van 100 mg ruw hydrolyseproduct van een endotoxine, dat overeenkomstig voorbeeld I bereid was, werd in 3 ml chloroform/methanol 4:1 toegevoegd 25 (chloroform/methanol/water 80:20:1 had ook gekund). De kolom werd geëlueerd met 350 ml chloroform/ methanol 4:1 gevolgd door 300 ml methanol/water 99:1. Met een apparaat voor een lineaire gradiënt werd de kolom daarna uitgespoeld met 2000 ml vloeistof, welke in het begin 100% methanol was en aan het eind een oplossing van 0,2 M azijnzuur in methanol. Dit gebeurde met een debiet van 6 ml/min. en er werden fracties van 15 ml opgevangen. Om de andere fractie werd op totaal gehalte aan fosfor geanalyseerd (met 30 de methode van G.R. Bartlett, beschreven in J. Biol. Chem. 234 (1959) 466-471). De juiste fracties werden gecombineerd en in een draaiverdamper bijna droog gedampt. De residuen werden opgenomen in mengsels van 10 ml chloroform/methanol 2:1 en 40 ml 0,001 M azijnzuur. In een scheidtrechter werden de onderlagen afgetapt en deze werden door Whatman no. 2 papier gefiltreerd en drooggedampt, wat in totaal 19,2 mg gezuiverd niet giftig hydrolyseproduct van een endotoxine gaf. 35 Voorbeeld V Er waren dertien cavia’s "Stam 2” met ”Line-10” tumoren van ongeveer 9 mm. Direct in de tumor kregen ze elk een injectie van 0,4 ml steriele emulsie van Drakeol 6 VR (een minerale olie van de Pennsylvania Refining Company, te Butler, Pennsylvanië) met in elk 50 pm ZOE en 50 pg CWS. 40 Na 3 maanden wachten werden de dieren beoordeeld, en in 12 van de 13 dieren was een totale teruggang van de tumor opgetreden. Bij een blanco proef kregen 6 cavia’s ’’stam 2” met "Line-10” tumoren van ongeveer 9 mm elk direct in de tumor een injectie van 0,4 ml die alleen 50 pg ZOE bevatte; na 3 maanden vertoonde geen van de zes tumoren enige teruggang. 45

1. Werkwijze voor het bereiden van een niet-giftig hydrolyseproduct van een endotoxine (ZOE), waarbij belangrijke biologische eigenschappen van het endotoxine behouden zijn gebleven, door uit Gram-negatieve 50 bacteriën gewonnen en gezuiverd endotoxine in waterbevattend milieu met een zuur te hydrolyseren, hierna de waterbevattende fase met hierin opgeloste stoffen te verwijderen, het vaste residu te vriesdrogen, het gevriesdroogde product te extraheren met een oplosmiddel voor het verwijderen van daarin aanwezige vetzuren, en daarna het product aan verdere bewerkingen te onderwerpen om een gezuiverd niet-giftig hydrolyseproduct van endotoxine te verkrijgen, met het kenmerk, dat men: 55 a) de hydrolyse gedurende 10 tot 60 minuten bij 90 tot 130°C bij een pH van 0 tot 2 uitvoert; b) het hydrolyseproduct van stap a) isoleert, wast en vriesdroogt; c) het ruwe product van stap b) met een eerste oplosmiddel extraheert ter verwijdering van de daarin 4 194865 6 aanwe2ige vetzuren, zonder het ZOE op te lossen; d) het residu van stap c) oplost in een tweede oplosmiddel, en e) de2e oplossing door een kolom chromatograteert ter verkrijging van een product dat de biologische activiteit van het uitgangsendotoxine behouden heeft, dat per milligram 350 tot 475 nmol fosfor en 1700 5 tot 2000 nmol vetzuur bevat en waarin geen 2-keto-3-deoxyoctonaat is aan te tonen.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij het bij stap a) toegepaste zuur zoutzuur, zwavelzuur, fosforzuur, tolueensulfonzuur of trichloorazijnzuur is, het bij stap c) gebruikte oplosmiddel aceton is en het bij stap d) gebruikte oplosmiddel methanol, chloroform, pyridine, ether, azijnzuur of een mengsel daarvan is, bij voorkeur een mengsel van chloroform en methanol.

3. Farmaceutisch preparaat met werking tegen tumoren dat celwandskelet en een farmaceutisch aanvaardbare drager bevat, met het kenmerk, dat het tevens gezuiverd niet-giftig hydrolyseproduct van een endotoxine verkregen volgens de werkwijze van conclusie 1 of 2 bevat.

4. Farmaceutisch preparaat volgens conclusie 3, waarbij het preparaat de vorm heeft van een gevriesdroogd preparaat of van een olie-in-wateremulsie.

5. Farmaceutisch preparaat volgens conclusie 3 of 4, waarbij het preparaat tot 1500 pg gezuiverd niet-giftig hydrolyseproduct van een endotoxine en tot 4500 pg celwandskelet per injectie bevat.