**ATTENTION** debut du champ DESC peut contenir fin de CLMS **.
REVENDICATIONS
1. Vaccin acellulaire, caractérisé en ce qu'il comprend une association de: a) la fraction ribosomale d'au moins une souche de bactéries
pathogénes correspondant à l'affection à prévenir, et b) la fraction saccharidique extraite des membranes des bactéries
d'au moins une souche bactérienne choisie parmi les genres
Kiebsiella, Serratia et Corynebacterium.
2. Vaccin acellulaire selon la revendication 1, caractérisé en ce que la fraction saccharidique est extraite des membranes d'au moins une couche bactérienne choisie parmi: Klebsiellapneumoniae, Klebsiella rhinoscleromatis. Serratia corallina, Serratia indica, Serratia marcescens. Serratia plymuthica. Corynebacterium avidum. Coryne bacterium ho vis. Corynebacterium enzymicum, Corynebacterium equi,
Corynebacterium fascians. Corynebacterium flaccumfaciens. Corynebacterium flavidum. Corynebacterium fusiforme, Corynebacterium granulosum, Corynebacterium helvolum, Corynebacterium hypertrophicans, Corynebacteriun2 insidiosum, Corynebacterium liquefaciens,
Corynebacterium parvum.
Corynebacterium parvum infectiosum. Corynebacterium paurometabolum. Corynebacterium pyogenes. Coryne bacterian tumescens. Corynebacterium xerosis.
3. Vaccin selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il contient, en outre, la fraction saccharidique extraite des membranes des bactéries dont on extrait les ribosomes.
4. Vaccin selon l'une des revendications I à 3, caractérisé en ce que le rapport en poids entre la fraction ribosomale et la fraction saccharidique est compris entre 0,5 et 1.
5. Vaccin selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la fraction saccharidique est extraite des membranes de Klebsiella pneumoniae.
6. Vaccin selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vaccin broncho-ORL qui comprend la fraction ribosomale extraite de: Klebsiella pneumoniae, Diplococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes groupe A12, Hemophilus influenzae.
7. Vaccin selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vaccin dentaire dans lequel les fractions ribosomales sont extraites de: Actinomyces viscosus, Rothia dentocariosa, Streptococ cas inarnils, Streptococcus salivarius, [ Lactobaclllus casei.
8. Vaccin selon l'une des revendications 4 ou 5, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vaccin vétérinaire qui comprend à titre de fraction ribosomale des ribosomes extraits de: Pasteurella hemolytica Hl, Pasteurella multocida A1 -1048, Pasteurella ,nultocida A3-Al 3.
9. Procédé d'obtention du vaccin selon la revendication 1, caractérisé en ce que la fraction saccharidique est obtenue par extraction d'une suspension aqueuse de membranes à l'aide de phénol, les saccharides étant prélevés dans la phase aqueuse, et en ce que la fraction ribosomale est préparée par extraction des cellules bactériennes broyées par un tampon contenant HCI, MgCl2, NaCI et du dodécylsulfate de sodium et précipitation de la phase aqueuse homogène obtenue par du polyéthyléneglycol et de l'alcool éthylique, les ribosomes étant présents dans le précipité.
10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'extraction de la fraction saccharidique est conduite à une température comprise entre 60 et 70' C.
11. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le tampon comprend de l'acide chlorhydrique M/100, MgCl2, 0,01 M,
NaCI 9 g/l et du dodécylsulfate de sodium, 5 g/l.
12. Procédé selon l'une des revendications 9 ou 11, caractérisé en ce que le précipité obtenu est ensuite repris dans un tampon contenant HCI, MgCl2 NaCl et du dodécylsulfate de sodium, puis est reprécipité à l'aide d'alcool éthylique.
La présente invention concerne de nouveaux vaccins à base de fractions ribosomales associées à des fractions saccharidiques membranaires constituées de polysaccharides et de lipopolysaccharides membranaires.
Les vaccins anciens constitués de germes morts atténués ou de lysats microbiens ont un pouvoir vaccinant inférieur à celui des germes vivants. On a donc recherché de nouveaux vaccins ayant une meilleure activité antigénique que celle des vaccins connus.
La présente invention est issue de travaux montrant que les
ribosomes des cellules bactériennes portent l'activité vaccinante et
que cette dernière ne se manifeste qu'avec un adjuvant d'immunité.
Dans le cas présent, cet adjuvant soluble est extrait des membranes
cellulaires des bactéries sous forme de fraction saccharidique.
Le vaccin acellulaire selon l'invention est caractérisé dans la
revendication 1; le procédé d'invention dudit vaccin est caractérisé
dans la revendication 9.
La présente invention concerne, notamment, un vaccin dans
lequel la fraction saccharidique est extraite des membranes des
bactéries d'au moins une souche bactérienne choisie parmi les genres:
Klebsiella pneumoniae, Klebsiella rhinoscleromatis, Serratia corallina,
Serratia indica, Serratia marcescens, Serratiaplymuthica, Corynebac
terium avidum, Corynebacterium bovis, Corynebacterium enzymicum.
Corynebacterium equi, Corynebacteriumfascians, Corynebacterium flaccumfaciens, Corynebacteriumflavidum, Corynebacteriumfusiforme, Corynebacterium granulosum, Corynebacterium helvolum,
Corynebacterium hypertrophicans, Corynebacterium insidiosum, Corynebacterium liquefaciens, Corynebacterium parvum, Corynebacterium parvum infectiosum, Corynehacterium pauromernbotum, Corynebacte
riumpyogenes, Corynebacterium tumescens, Corynebacterium xerosis.
Dans un mode de mise en oeuvre préféré du procédé selon la présente invention, la fraction saccharidique utilisée comme adjuvant est extraite des membranes de Kiebsiella pneumoniae.
Dans un mode de mise en oeuvre particulier de l'invention, on utilise comme adjuvant, outre la fraction saccharidique membranaire précédente, une fraction saccharidique membranaire extraite des bactéries correspondant aux ribosomes utilisés.
Dans les vaccins selon la présente invention, le rapport en poids entre la fraction ribosomale et la fraction saccharidique est compris, de préférence, entre 0,5 et 1.
La dose unitaire de vaccin pourra, bien entendu, varier en fonction des nécessités du traitement ou du mode d'administration.
On donne, ci-après, des exemples de dosages qui ne sont, bien entendu, pas limitatifs; ainsi, I'invention concerne notamment: Un vaccin broncho-ORL ayant la composition suivante:
Fractions ribosomales
- Ribosomes de Klebsiella pneumoniae . . . . 3,5 g
- Ribosomes de Diplococcus pneumoniae . 3,0 3,0 wg
- Ribosomes de Streptococcus pyogenes groupe A12 . . . . . . . . . . . . . 3,0 g
- Ribosomes d'Hemophllus i'zfiuenzae . . . . . 0,5 g l0,Oag
Adjuvant solubles
- Fraction saccharidique membranaire de Kleb
siella pneumoniae . . . . . . . . . . . . 15,0 g
1 dose . . . . . . . . . . . . . . . . .
. 25,0 g
de principe
actif pur - Un vaccin dentaire ayant la composition suivante:
Fractions ribosomales
- Ribosomes d'Actinomyces viscosus. . . . . . 1,2 g
- Ribosomes de Rothia dentocariosa . . . . . . 1,2 pg
- Ribosomes de Streptococcus mutans . . . . . 0,8 g Ribosomes de Streptococcus salivarius . . . . 1,0 g
- Ribosomes de Lactobacillus casei . . . . . . 1,2 g 5,4 cul
Adjuvant soluble
¯¯ Fraction saccharidique membranaire de Kleb
siella pneumoniae. . . . 9,6 Fg
l dose. . . . . . . 15,0 g
de principe
actif pur
- Un vaccin vétérinaire ayant la composition suivante:
Fractions ribosomales Ribosomes de Pasteurdla hemolytica H1 . . . 3,0 g
ribosomes de Pasteurella multocida H1-1048 . 3,0 Fg
Ribosomes de Pasteurella multocida A,-A13 . . 3,0 ,ug
9,0 g
Adjuvant soluble
fraction saccharidique membranaire de Kleb
siella pneumoniae . . . . . . . . . 13,5 g
fraction saccharidique membranaire de Pasteu rella hemolvtica H, . . . . . .
. 1,0 g
¯¯ Fraction saccharidique membranaire de Pasteu
rella multocida Al-1048 . . . . . . . . 1,0 g
Fraction saccharidique membranaire de Pasteu rella multocida A3-A 13 . . . . . . . . 1,0 g
16,5 g
I dose. . . . . . . . . . . . . . . . . .
. 25,5 sag
de principe
actif pur
Bien entendu, les vaccins selon la présente invention peuvent être utilisés suivant leurs éléments constituants, comme cela est connu dans le domaine des vaccins, pour le traitement ou la prévention de différentes maladies; ainsi, le vaccin broncho-ORL, tel qu'il a été défini précédemment, peut permettre de traiter ou de prévenir les rhino-trachéo-bronchites chroniques, les asthmes intriqués de bronchites, les bronchectasies, les pneumopathies virales surinfectées de même que les sinusites et les rhino-pharyngo-laryngites.
Pour ce qui concerne le vaccin dentaire, il permet de prévenir les principales affections buccales banales.
Les vaccins selon la présente invention se présentent, de préférence, sous forme d'aérosols. Toutefois, il est possible de prévoir d'autres formes galéniques. Ainsi, certains des vaccins selon l'invention doivent être utilisés par voie parentérale, par exemple par injection.
Il n'est pas, bien entendu, nécessaire ici de reprendre la liste des composants pouvant entrer dans la composition de l'excipient du vaccin selon l'invention; il s'agit là d'enseignements de la technique des vaccins ou de la pharmacie galénique qui sont bien connus.
En général, les deux composants du vaccin seront conservés sous forme de solution, mais peuvent être lyophilisés lors de la préparation du vaccin; il suffit de mélanger les différents composants du vaccin dans les proportions déterminées.
Les normes analytiques du produit obtenu peuvent être déterminées de la façon suivante: le titre en ribosomes de la fraction ribosomale est calculé à partir du titre en ARN de la façon suivante:
titre en ARN x 100 titre en ribosomes
70
Le titre en ARN est, pour sa part, mesuré par dosage spectrophotométrique du complexe phosphomolybdique par comparaison avec un ARN étalon de Klebsiella de titre connu déterminé, lui, par dosage du phosphore.
Le titre en protéines de la fraction ribosomale est déterminé par colorimétrie au biuret comparativement à une gamme d'albumine étalon.
Le pourcentage d'ARN dans la somme ARN + protéines varie de 55 à 65% environ.
Le titre en saccharides de l'adjuvant est déterminé à partir du titre en glucose mesuré par dosage colorimétrique à l'anthrone de la façon suivante:
titre en glucose x 100
titre en saccharides =
50
Une préparation étalon de saccharide très purifiée à servi à déterminer le titre en glucose des saccharides, qui est de 50% par cette méthode de dosage.
A titre d'exemple, on décrit ci-après le mode de mise en oeuvre préféré du procédé selon la présente invention permettant de préparer des vaccins selon la présente invention.
Préparation d'une solution aqueuse de ribosomes
On cultive de façon connue les différentes souches dont on désire extraire les ribosomes sur des milieux de croissance appropriés dans des fermenteurs.
Les cellules bactériennes sont recueillies après culture sur un appareil de centrifugation Westfalia ou Sharples, puis lavées par centrifugation avec du sérum physiologique froid à une température de l'ordre de 4 C.
Le concentrat bactérien ainsi obtenu peut être conservé congelé à
- 20 C s'il n'est pas utilisé immédiatement.
Comme pour l'extraction des saccharides, I'extraction des ribosomes peut être conduite sur un mélange des différentes souches, mais on préfère traiter chaque souche séparément, de façon à faciliter le contrôle du produit obtenu; dans ce dernier cas, les ribosomes et/ou les saccharides seront mélangés en fin d'extraction pour constituer le vaccin.
On effectue sur le concentrat bactérien obtenu un prélèvement qui permet de déterminer le poids sec de cellules après dessiccation à l'étuve (le rapport cellules sèches/cellules humides varie de 20 à 25%).
Un autre prélèvement est destiné au contrôle de pureté de la culture et à l'identification de la souche.
Le concentrat bactérien obtenu précédemment est ensuite désintégré; pour cela, on opère de la façon suivante:
pour une petite quantité de cellules humides (inférieure à 50 g), les cellules sont dispersées à raison de 1 g (poids humide) dans 4 ml du tampon tris-HCl-M/100, pH 7,2 contenant:
MgCl2,6H2O 0,01 M
NaCI 9 g/l
dodécylsulfate de sodium 5 g/l
Lorsque la suspension est bien homogène, elle est soumise à une désintégration par des ultrasons durant trois fois 10 min en maintenant dans un bain de glace; on utilise par exemple un appareil à ultrasons Sonnimasse 500 T.
Pour des quantités de cellules plus importantes (supérieures à 50 g), les cellules décongelées sont dispersées dans le même tampon que précédemment et dans les mêmes proportions, puis sont homogé néisées par agitation vive 10 min dans un réacteur à grande vitesse.
Elles sont ensuite soumises à un broyage au Manton-Gaulin à froid (5 cycles pour chaque souche). On élimine les plus gros débris cellulaires par passage sur un appareil Sharples, puis le surnageant est soumis à une centrifugation à 4' C durant 30 min à 30 000 g (centrifugeuse Beckman 521-B avec rotor 6 x 250 ml JA 14).
Le culot de centrifugation est éliminé et le surnageant contenant les ribosomes est conservé à 4 C.
Extraction des ribosomes
Au surnageant précédent, on ajoute 100 g/l de polyéthylèneglycol 4000 (PEG 4000 - Merck) puis, après dissolution complète, 1 volume d'alcool éthylique 95% à -20 C.
On laisse ensuite reposer 20 min à froid, puis on recueille le précipité sur Sharples à 4' C (le surnageant est éliminé).
Le précipité est alors repris en solution dans le même volume du tampon utilisé pour le broyage (tris-HCl, MgCl2. NaCI, SDS 0,5%) par agitation dans le réacteur à température ambiante pendant 30 à
60 min. (Le lavage à température ambiante a pour fonction
d'éliminer les protéines non ribosomales.)
0,8 volume d'alcool éthylique 95% à -20" C est ensuite ajouté et
on laisse précipiter pendant 30 min à 10 C.
Le précipité de ribosomes est recueilli sur Sharples et le surnageant éliminé (sans réfrigération, pour empêcher la précipitation du
SDS). Le culot de ribosomes est repris dans du tampon (MgCl2, 0,02
M; KCI, 0,02 M; pH 7) à 4 C Åa raison de 2 ml pour 1 gdecellules
humides de départ (agitation moyenne 2 à 4 h).
La reprise précédente est soumise à une centrifugation de 45 min
à 30 000 g et à OC C (élimination du SDS résiduel).
Le culot est éliminé et le surnageant est conservé.
Un prélèvement est réalisé (1 à 2 ml), sur lequel on détermine le titre en ARN, le titre en protéines et le nombre de doses par millilitre.
On conserve les ribosomes dans des flacons plasma stériles à
-20 Cen attendant de les utiliser.
Prepararion d'une suspension aqueuse de membranes
Les cellules après culture sont recueillies par centrifugation sur
Westfalia ou Sharples, puis lavées par centrifugation avec du sérum physiologique froid. Le concentrat bactérien obtenu peut être conservé -20 C.
Sur un prélèvement, on détermine le résidu sec par dessiccation à l'étuve et on réalise des contrôles bactériologiques de pureté et d'identité.
Les cellules décongelées sont suspendues dans du tampon froid à raison de 1 g de cellules dans 4 ml de tampon.
La formule du tampon est la suivante:
tris-Hcl 0,01 M, pH 7
NaCI 9 g/l
MgCl2,6H2O 0,01 M
Le broyage est réalisé au Manton-Gaulin (3 cycles à la pression maximale). Les cellules intactes ainsi que les débris cellulaires sont éliminés par passage sur Sharples, et le surnageant est conservé à 4 C.
Les membranes sont alors recueillies par centrifugation, 45 min à 30 000 g à 4i C (Beckman J 21 - B - rotor JA 14). Le surnageant est éliminé (une fraction peut être conservée pour la préparation d'ARN ribosomal étalon pour le contrôle analytique). Le culot est conservé pour l'extraction de l'adjuvant soluble. Les culots sont remis en suspension dans de l'eau distillée à raison de 2,5 ml par gramme de cellules humides de départ (homogénéisation au Turrax à 1 à 2 min).
Extraction des saccharides
On ajoute à la suspension aqueuse obtenue précédemment 1 volume de phénol-eau (à 90% de phénol) préalablement thermostaté à ¯ 80 C, puis on porte le mélange pendant 5 min à 65" C en agitant vigoureusement.
On refroidit aussitôt rapidement vers 0" C.
Pour les petits volumes, on sépare la phase aqueuse par centrifugation, 5 min à 5000 tr/min à 0" C, dans des pots inox. La phase aqueuse supérieure est ensuite recueillie.
Pour les volumes plus importants, on sépare la phase aqueuse par passage sur séparation liquide-liquide Westfalia ou Sharpies.
La phase phénolique est éliminée.
Le phénol résiduel de la phase aqueuse est éliminé par dialyse contre de l'eau courante pendant 24 à 48 h, soit dans un tube à dialyse pour les petits volumes, soit sur un dialyseur à plaque (type
Sartorius) pour les volumes plus importants.
Les légères précipitations qui se forment pendant la dialyse sont ensuite éliminées par une centrifugation à 10 000 g de 30 min à OC.
Le surnageant est conservé congelé à - 20" C dans des flacons plasma stériles.
Un prélèvement de 1 ou 2 ml est fait pour le contrôle analytique.
Les vaccins selon la présente invention sont utiles aussi bien en médecine humaine qu'en médecine vétérinaire.
1) Etude du pouvoir immunogénique du vaccin vétérinaire cité précédemment
Cette étude a pour but de contrôler l'apparition et la persistance des anticorps spécifiques dans le sérum des souris vaccinées.
On utilise des souris femelles de race Swiss pesant 20 + 2 g maintenues dans des cages par 10 avec une nourriture sous forme de
bouchons (régime UAR souris) et de l'eau de boisson, dans une
animalerie à température constante 22 + 1" C, sous 40 à 60%
d'humidité.
Immunisation des animaux
Par voie sous-cutanée, on injecte à chaque animal la dose de vaccin sous un volume de 0,2 ml.
Le rythme des injections est le suivant:
- 5 inoculations en 15 d (soit une injection tous les 3 d),
- un repos d'une semaine,
- 2 inoculations en 8 d (injection de rappel),
- ponction par les sinus rétro-orbitraire, 10 d au moins et 15 d
au plus après la dernière injection de rappel.
Méthode de recherche des anticorps
Le sérum de chaque souris vaccinée est étudié en immunoélectrodiffusion selon la technique de Laurell.
Chaque sérum d'animal est étudié contre l'antigène de la Pasteurella dont sont issus les saccharides membranaires Pasteurella hemolytica H1 et Pasteurella multocida A3.
De la même manière, on étudie chaque sérum contre l'ensemble des Pasteurella dont sont extraits les ribosomes de la préparation.
L'antigène choisi est incorporé à un gel d'agarose à 1%, en tampon véronal pH 8,6. Ce gel est coulé sur une plaque de verre de
1,5 x 90 x 110 mu.
On dépose 7 FI du sérum de chaque souris dans les puits préalablement creusés dans le gel.
Le dépôt s'effectue à la cathode. La migration dure 9h sous courant continu avec une différence de potentiel de2 à 3 V/cm.
En fin de migration, les plaques sont lavées et séchées et les immuno précipités sont révélés par coloration sur bleu de Coomassie brillant.
Résultats:
On observe la présence d'immuno précipités spécifiques entre les anticorps du sérum des souris traitées et l'antigène révélateur en forme de rocket dont la hauteur est représentative de la quantité d'anticorps contenue dans le sérum des animaux vaccinés.
Ici, on observe sur toutes les plaques des résultats hautement significatifs avec le sérum des souris vaccinées, par rapport aux sérums des souris témoins qui confirment le haut pouvoir vaccinant des compositions selon l'invention.
2) Etude du pouvoir immunogénique du vaccin dentaire cité précédemment
De la même façon que dans 1, on utilise des souris femelles de race Swiss pesant 20 + 2 g maintenues dans des cages par 5 avec une nourriture sous forme de bouchons (régime UAR souris) et de l'eau de boisson dans une animalerie à température constante 22 + 1" C sous 40 à 60% d'humidité.
Immunisation des animaux
Par voie sous-cutanée, on injecte à chaque animal la dose de vaccin sous un volume de 0,2 ml. (I1 faut noter que des essais effectués avec des rapports de fraction ribosomale/fraction sacchari dique de 1/1, 1/1,5 et 1/2 ont montré que la composition citée précédemment, 1/1,5, donnait les meilleurs résultats.)
Le rythme des injections est le suivant:
- 5 inoculations en 15 d (soit une injection tous les 3 d),
- un repos d'une semaine,
- 2 inoculations en 8 d (injection de rappel),
ponction par les sinus rétro-orbitaires, 10 d au moins et 15 d
au plus après la dernière injection de rappel.
Méthode de recherche des anticorps
Le sérum de chaque souris vaccinée est étudié en immunoélectrodiffusion selon la technique de Laurell.
L'antigène correspondant à chaque germe dont sont issus les ribosomes est incorporé à un gel d'agarose à 1% en tampon véronal pH 8,6. Ce gel est coulé sur une plaque de verre de 1,5 x 90 x 110 mm.
On dépose 7 pI du sérum de chaque souris dans les puits préalablement creusés dans le gel.
Le dépôt s'effectue à la cathode. La migration dure 9h sous courant continu avec une différence de potentiel de 2 à 3 V/cm.
En fin de migration, les plaques sont lavées et séchées et les immuno précipités sont révélés par coloration au bleu de Coomassie brillant.
Résultats:
On observe la présence d'immuno précipités spécifiques entre les anticorps du sérum des souris traitées et l'antigène révélateur en forme de rocket dont la hauteur est représentative de la quantité d'anticorps contenue dans le sérum des animaux vaccinés.
On observe sur toutes les plaques des résultats hautement significatifs avec le sérum des souris vaccinées par rapport aux sérums des souris témoins, résultats qui montrent le haut pouvoir vaccinant des vaccins selon l'invention.
** ATTENTION ** start of the DESC field may contain end of CLMS **.
CLAIMS
1. Acellular vaccine, characterized in that it comprises a combination of: a) the ribosomal fraction of at least one strain of bacteria
pathogens corresponding to the condition to be prevented, and b) the saccharide fraction extracted from the membranes of bacteria
at least one bacterial strain chosen from the genera
Kiebsiella, Serratia and Corynebacterium.
2. Acellular vaccine according to claim 1, characterized in that the saccharide fraction is extracted from the membranes of at least one bacterial layer chosen from: Klebsiellapneumoniae, Klebsiella rhinoscleromatis. Serratia corallina, Serratia indica, Serratia marcescens. Serratia plymuthica. Corynebacterium avidum. Coryne bacterium ho vis. Corynebacterium enzymicum, Corynebacterium equi,
Corynebacterium fascians. Corynebacterium flaccumfaciens. Corynebacterium flavidum. Corynebacterium fusiforme, Corynebacterium granulosum, Corynebacterium helvolum, Corynebacterium hypertrophicans, Corynebacteriun2 insidiosum, Corynebacterium liquefaciens,
Corynebacterium parvum.
Corynebacterium parvum infectiosum. Corynebacterium paurometabolum. Corynebacterium pyogenes. Coryne bacterian tumescens. Corynebacterium xerosis.
3. Vaccine according to one of claims 1 or 2, characterized in that it also contains the saccharide fraction extracted from the membranes of the bacteria from which the ribosomes are extracted.
4. Vaccine according to one of claims I to 3, characterized in that the weight ratio between the ribosomal fraction and the saccharide fraction is between 0.5 and 1.
5. Vaccine according to one of claims 1 to 4, characterized in that the saccharide fraction is extracted from the membranes of Klebsiella pneumoniae.
6. Vaccine according to claim 5, characterized in that it is a broncho-ENT vaccine which comprises the ribosomal fraction extracted from: Klebsiella pneumoniae, Diplococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes group A12, Hemophilus influenzae.
7. Vaccine according to claim 5, characterized in that it is a dental vaccine in which the ribosomal fractions are extracted from: Actinomyces viscosus, Rothia dentocariosa, Streptococ cas inarnils, Streptococcus salivarius, [Lactobaclllus casei.
8. Vaccine according to one of claims 4 or 5, characterized in that it is a veterinary vaccine which comprises as ribosomal fraction ribosomes extracted from: Pasteurella hemolytica Hl, Pasteurella multocida A1 -1048, Pasteurella , nultocida A3-Al 3.
9. A method of obtaining the vaccine according to claim 1, characterized in that the saccharide fraction is obtained by extraction of an aqueous suspension of membranes using phenol, the saccharides being taken from the aqueous phase, and in that that the ribosomal fraction is prepared by extraction of the comminuted bacterial cells with a buffer containing HCl, MgCl2, NaCl and sodium dodecylsulfate and precipitation of the homogeneous aqueous phase obtained with polyethylene glycol and ethyl alcohol, the ribosomes being present in the precipitate.
10. Method according to claim 9, characterized in that the extraction of the saccharide fraction is carried out at a temperature between 60 and 70 'C.
11. Method according to claim 9, characterized in that the buffer comprises hydrochloric acid M / 100, MgCl2, 0.01 M,
NaCl 9 g / l and sodium dodecyl sulfate, 5 g / l.
12. Method according to one of claims 9 or 11, characterized in that the precipitate obtained is then taken up in a buffer containing HCl, MgCl2 NaCl and sodium dodecylsulfate, then is reprecipitated using ethyl alcohol.
The present invention relates to new vaccines based on ribosomal fractions associated with membrane saccharide fractions consisting of polysaccharides and membrane lipopolysaccharides.
Old vaccines consisting of attenuated dead germs or microbial lysates have a lower immunizing power than that of live germs. We therefore looked for new vaccines with better antigenic activity than that of known vaccines.
The present invention is the result of work showing that the
bacterial cell ribosomes carry the vaccinating activity and
that the latter is manifested only with an adjuvant of immunity.
In the present case, this soluble adjuvant is extracted from the membranes
cellular bacteria as a saccharide fraction.
The acellular vaccine according to the invention is characterized in the
claim 1; the method of invention of said vaccine is characterized
in claim 9.
The present invention relates, in particular, to a vaccine in
which the saccharide fraction is extracted from the membranes of
bacteria of at least one bacterial strain chosen from the genera:
Klebsiella pneumoniae, Klebsiella rhinoscleromatis, Serratia corallina,
Serratia indica, Serratia marcescens, Serratiaplymuthica, Corynebac
terium avidum, Corynebacterium bovis, Corynebacterium enzymicum.
Corynebacterium equi, Corynebacteriumfascians, Corynebacterium flaccumfaciens, Corynebacteriumflavidum, Corynebacteriumfusiforme, Corynebacterium granulosum, Corynebacterium helvolum,
Corynebacterium hypertrophicans, Corynebacterium insidiosum, Corynebacterium liquefaciens, Corynebacterium parvum, Corynebacterium parvum infectiosum, Corynehacterium pauromernbotum, Corynebacte
riumpyogenes, Corynebacterium tumescens, Corynebacterium xerosis.
In a preferred embodiment of the process according to the present invention, the saccharide fraction used as an adjuvant is extracted from the membranes of Kiebsiella pneumoniae.
In a particular embodiment of the invention, an adjuvant is used, in addition to the preceding membrane saccharide fraction, a membrane saccharide fraction extracted from bacteria corresponding to the ribosomes used.
In the vaccines according to the present invention, the weight ratio between the ribosomal fraction and the saccharide fraction is preferably between 0.5 and 1.
The unit dose of vaccine may, of course, vary depending on the needs of the treatment or the mode of administration.
Examples of dosages are given below which are, of course, not limiting; thus, the invention relates in particular to: A broncho-ENT vaccine having the following composition:
Ribosomal fractions
- Ribosomes of Klebsiella pneumoniae. . . . 3.5g
- Ribosomes of Diplococcus pneumoniae. 3.0 3.0 wg
- Ribosomes of Streptococcus pyogenes group A12. . . . . . . . . . . . . 3.0g
- Ribosomes of Hemophllus i'zfiuenzae. . . . . 0.5 g l0, Oag
Soluble admixture
- Kleb membrane saccharide fraction
siella pneumoniae. . . . . . . . . . . . 15.0 g
1 dose. . . . . . . . . . . . . . . . .
. 25.0 g
of principle
pure active - A dental vaccine with the following composition:
Ribosomal fractions
- Ribosomes of Actinomyces viscosus. . . . . . 1.2g
- Ribosomes of Rothia dentocariosa. . . . . . 1.2 pg
- Ribosomes of Streptococcus mutans. . . . . 0.8 g Ribosomes of Streptococcus salivarius. . . . 1.0 g
- Ribosomes of Lactobacillus casei. . . . . . 1.2 g 5.4 ass
Soluble admixture
¯¯ Saccharidic membrane fraction of Kleb
siella pneumoniae. . . . 9.6 Fg
l dose. . . . . . . 15.0 g
of principle
pure active
- A veterinary vaccine having the following composition:
Ribosomal fractions Ribosomes of Pasteurdla hemolytica H1. . . 3.0g
ribosomes of Pasteurella multocida H1-1048. 3.0 Fg
Ribosomes of Pasteurella multocida A, -A13. . 3.0, ug
9.0 g
Soluble admixture
Kleb membrane saccharide fraction
siella pneumoniae. . . . . . . . . 13.5g
membrane saccharide fraction of Pasteu rella hemolvtica H,. . . . . .
. 1.0 g
¯¯ Saccharidic membrane fraction of Pasteu
rella multocida Al-1048. . . . . . . . 1.0 g
Saccharidic membrane fraction of Pasteu rella multocida A3-A 13. . . . . . . . 1.0 g
16.5g
I dose. . . . . . . . . . . . . . . . . .
. 25.5 sag
of principle
pure active
Of course, the vaccines according to the present invention can be used according to their constituent elements, as is known in the field of vaccines, for the treatment or prevention of various diseases; thus, the broncho-ENT vaccine, as defined above, can be used to treat or prevent chronic rhino-tracheobronchitis, entangled asthma of bronchitis, bronchiectasis, viral pneumonia as well as sinusitis and nasopharyngolaryngitis.
Regarding the dental vaccine, it helps prevent the main common oral diseases.
The vaccines according to the present invention are preferably in the form of aerosols. However, it is possible to provide other dosage forms. Thus, some of the vaccines according to the invention must be used parenterally, for example by injection.
It is not, of course, necessary here to repeat the list of components which may enter into the composition of the excipient of the vaccine according to the invention; these are lessons in the technique of vaccines or pharmaceutical dosage which are well known.
In general, both components of the vaccine will be stored as a solution, but may be freeze-dried during preparation of the vaccine; it is sufficient to mix the different components of the vaccine in the proportions determined.
The analytical standards of the product obtained can be determined as follows: the ribosome titer of the ribosomal fraction is calculated from the RNA titer as follows:
RNA titer x 100 ribosome titer
70
The RNA titer is, for its part, measured by spectrophotometric determination of the phosphomolybdic complex by comparison with a standard Klebsiella RNA of known titer determined, itself, by determination of phosphorus.
The protein titer of the ribosomal fraction is determined by biuret colorimetry compared to a range of standard albumin.
The percentage of RNA in the RNA + protein sum varies from approximately 55 to 65%.
The saccharide titer of the adjuvant is determined from the glucose titer measured by colorimetric determination with an anthone as follows:
glucose titer x 100
saccharide titer =
50
A standard preparation of highly purified saccharide used to determine the glucose titer of saccharides, which is 50% by this assay method.
By way of example, the preferred embodiment of the method according to the present invention is described below, making it possible to prepare vaccines according to the present invention.
Preparation of an aqueous solution of ribosomes
The various strains from which the ribosomes are to be extracted are cultivated in a known manner on appropriate growth media in fermenters.
The bacterial cells are collected after culture on a Westfalia or Sharples centrifuge, then washed by centrifugation with cold physiological saline at a temperature of the order of 4 C.
The bacterial concentrate thus obtained can be stored frozen at
- 20 C if not used immediately.
As for the extraction of saccharides, the extraction of the ribosomes can be carried out on a mixture of the different strains, but it is preferred to treat each strain separately, so as to facilitate the control of the product obtained; in the latter case, the ribosomes and / or the saccharides will be mixed at the end of extraction to constitute the vaccine.
A sample is taken from the bacterial concentrate obtained which makes it possible to determine the dry weight of cells after drying in an oven (the dry cell / wet cell ratio varies from 20 to 25%).
Another sample is intended for checking the purity of the culture and for identifying the strain.
The bacterial concentrate obtained previously is then disintegrated; for this, we operate as follows:
for a small quantity of wet cells (less than 50 g), the cells are dispersed at a rate of 1 g (wet weight) in 4 ml of the tris-HCl-M / 100 buffer, pH 7.2 containing:
0.01 M MgCl2.6H2O
NaCI 9 g / l
sodium dodecyl sulfate 5 g / l
When the suspension is well homogeneous, it is subjected to disintegration by ultrasound for three times 10 min while maintaining in an ice bath; for example, an Sonnimasse 500 T ultrasonic device is used.
For larger quantities of cells (greater than 50 g), the thawed cells are dispersed in the same buffer as above and in the same proportions, then are homogenized by vigorous stirring for 10 min in a high-speed reactor.
They are then subjected to cold Manton-Gaulin grinding (5 cycles for each strain). The largest cellular debris is removed by passage through a Sharples device, then the supernatant is subjected to centrifugation at 4 ° C for 30 min at 30,000 g (Beckman 521-B centrifuge with rotor 6 x 250 ml JA 14).
The centrifugation pellet is eliminated and the supernatant containing the ribosomes is stored at 4 C.
Ribosome extraction
To the preceding supernatant, 100 g / l of polyethylene glycol 4000 (PEG 4000 - Merck) are added, then, after complete dissolution, 1 volume of 95% ethyl alcohol at -20 C.
It is then left to stand for 20 min in the cold, then the precipitate is collected on Sharples at 4 ° C. (the supernatant is removed).
The precipitate is then taken up in solution in the same volume of the buffer used for grinding (tris-HCl, MgCl2. NaCl, 0.5% SDS) by stirring in the reactor at room temperature for 30 to
60 mins. (Washing at room temperature has the function
to eliminate non-ribosomal proteins.)
0.8 volume of 95% ethyl alcohol at -20 "C is then added and
allowed to precipitate for 30 min at 10 C.
The ribosome precipitate is collected on Sharples and the supernatant removed (without refrigeration, to prevent precipitation of the
SDS). The pellet of ribosomes is taken up in buffer (MgCl2, 0.02
M; KCI, 0.02 M; pH 7) at 4 C at the rate of 2 ml per 1 g of cells
wet start (average agitation 2 to 4 h).
The previous run is subjected to a 45 min centrifugation
at 30,000 g and at OC C (elimination of residual SDS).
The pellet is eliminated and the supernatant is kept.
A sample is taken (1 to 2 ml), on which the RNA titer, the protein titer and the number of doses per milliliter are determined.
Ribosomes are stored in sterile plasma vials at
-20 C while waiting to use them.
Preparation of an aqueous suspension of membranes
The cells after culture are collected by centrifugation on
Westfalia or Sharples, then washed by centrifugation with cold physiological serum. The bacterial concentrate obtained can be stored at -20 C.
On a sample, the dry residue is determined by drying in an oven and bacteriological checks of purity and identity are carried out.
The thawed cells are suspended in cold buffer at the rate of 1 g of cells in 4 ml of buffer.
The buffer formula is as follows:
0.01 M tris-Hcl, pH 7
NaCI 9 g / l
0.01 M MgCl2.6H2O
The grinding is carried out with Manton-Gaulin (3 cycles at maximum pressure). The intact cells as well as the cellular debris are eliminated by passage on Sharples, and the supernatant is stored at 4 C.
The membranes are then collected by centrifugation, 45 min at 30,000 g at 4i C (Beckman J 21 - B - rotor JA 14). The supernatant is eliminated (a fraction can be kept for the preparation of standard ribosomal RNA for analytical control). The pellet is kept for the extraction of the soluble adjuvant. The pellets are resuspended in distilled water at a rate of 2.5 ml per gram of starting wet cells (homogenization with Turrax at 1 to 2 min).
Saccharide extraction
To the aqueous suspension obtained above, 1 volume of phenol-water (90% phenol) is previously thermostated at ¯ 80 ° C., then the mixture is brought to 5 "at 65" C. with vigorous stirring.
It is immediately cooled to around 0 "C.
For small volumes, the aqueous phase is separated by centrifugation, 5 min at 5000 rpm at 0 "C, in stainless steel pots. The upper aqueous phase is then collected.
For larger volumes, the aqueous phase is separated by passing over Westfalia or Sharpies liquid-liquid separation.
The phenolic phase is eliminated.
The residual phenol in the aqueous phase is removed by dialysis against running water for 24 to 48 h, either in a dialysis tube for small volumes, or on a plate dialyzer (type
Sartorius) for larger volumes.
The light precipitation that forms during dialysis is then eliminated by centrifugation at 10,000 g for 30 min at OC.
The supernatant is stored frozen at -20 "C in sterile plasma vials.
A 1 or 2 ml sample is taken for analytical control.
The vaccines according to the present invention are useful both in human medicine and in veterinary medicine.
1) Study of the immunogenic power of the veterinary vaccine mentioned above
The purpose of this study is to control the appearance and persistence of specific antibodies in the serum of vaccinated mice.
We use female Swiss mice weighing 20 + 2 g kept in cages by 10 with food in the form of
caps (PSU mouse diet) and drinking water, in a
pet store at constant temperature 22 + 1 "C, under 40 to 60%
humidity.
Animal immunization
Subcutaneously, each animal is injected with the dose of vaccine in a volume of 0.2 ml.
The rhythm of the injections is as follows:
- 5 inoculations in 15 d (one injection every 3 d),
- a week's rest,
- 2 inoculations in 8 d (booster injection),
- puncture by retro-orbital sinuses, at least 10 d and 15 d
at most after the last booster injection.
Antibody testing method
The serum of each vaccinated mouse is studied in immunoelectrodiffusion according to the Laurell technique.
Each animal serum is studied against the Pasteurella antigen from which the membrane saccharides Pasteurella hemolytica H1 and Pasteurella multocida A3 are derived.
In the same way, each serum is studied against all of the Pasteurella from which the ribosomes of the preparation are extracted.
The selected antigen is incorporated into a 1% agarose gel, in veronal buffer pH 8.6. This gel is poured onto a glass plate of
1.5 x 90 x 110 mu.
7 μl of the serum of each mouse is deposited in the wells previously dug in the gel.
The deposit is made at the cathode. The migration lasts 9 hours under direct current with a potential difference of 2 to 3 V / cm.
At the end of migration, the plates are washed and dried and the immuno precipitates are revealed by staining on brilliant Coomassie blue.
Results:
The presence of specific immuno-precipitates is observed between the antibodies in the serum of the treated mice and the revealing antigen in the form of rocket, the height of which is representative of the quantity of antibody contained in the serum of the vaccinated animals.
Here, highly significant results are observed on all the plates with the serum of the vaccinated mice, compared with the sera of the control mice which confirm the high vaccinating power of the compositions according to the invention.
2) Study of the immunogenic power of the dental vaccine mentioned above
In the same way as in 1, female mice of the Swiss breed weighing 20 + 2 g are used, maintained in cages by 5 with food in the form of plugs (mouse UAR diet) and drinking water in a pet store in constant temperature 22 + 1 "C at 40 to 60% humidity.
Animal immunization
Subcutaneously, each animal is injected with the dose of vaccine in a volume of 0.2 ml. (It should be noted that tests carried out with ribosomal fraction / sacchari dic fraction ratios of 1/1, 1 / 1.5 and 1/2 have shown that the composition cited above, 1 / 1.5, gives the best results. .)
The rhythm of the injections is as follows:
- 5 inoculations in 15 d (one injection every 3 d),
- a week's rest,
- 2 inoculations in 8 d (booster injection),
puncture via retro-orbital sinuses, at least 10 d and 15 d
at most after the last booster injection.
Antibody testing method
The serum of each vaccinated mouse is studied in immunoelectrodiffusion according to the Laurell technique.
The antigen corresponding to each germ from which the ribosomes are derived is incorporated into a 1% agarose gel in veronal buffer pH 8.6. This gel is poured onto a glass plate 1.5 x 90 x 110 mm.
7 μl of the serum of each mouse is deposited in the wells previously dug in the gel.
The deposit is made at the cathode. The migration lasts 9 hours under direct current with a potential difference of 2 to 3 V / cm.
At the end of migration, the plates are washed and dried and the immuno precipitates are revealed by staining with brilliant Coomassie blue.
Results:
The presence of specific immuno-precipitates is observed between the antibodies in the serum of the treated mice and the revealing antigen in the form of rocket, the height of which is representative of the quantity of antibody contained in the serum of the vaccinated animals.
Highly significant results are observed on all the plates with the serum of the vaccinated mice compared to the sera of the control mice, results which show the high vaccinating power of the vaccines according to the invention.