DE3318567A1 - Therapeutische zusammensetzung enthaltend gereinigtes, entgiftetes endotoxin, zellwandgeruest und trehalosedimycolat - Google Patents
Therapeutische zusammensetzung enthaltend gereinigtes, entgiftetes endotoxin, zellwandgeruest und trehalosedimycolatInfo
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Description
THERAPEUTISCHE ZUSAMMENSETZUNG ENTHALTEND GEREINIGTES, ENTGIFTETES ENDOTOXIN, ZELLWANDGERÜST UND
TREHALOSEDIMYCOLAT
Gegenstand der Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung,enthaltend
gereinigtes, entgiftetes Endotoxin (RDE), Zellwandgerüst (CWS) und Trehalosedimycolat
(TDM). Das in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung verwendete RDE ist dadurch gekennzeichnet, daß es kein
nachweisbares 2_Keto -3-deoxyoctanoat, zwischen etwa und 475 nM/mg Phosphor und zwischen etwa 1700 und 2000
nM/mg Fettsäuren enthält. Die Zusammensetzung ist bei der Remission und/oder Rückbildung von Krebstumoren in
Warmblütern wirksam.
Endotoxische Extrakte, die aus Enterobacteriaciae einschließlieh
verwandte Organismen und Mutanten erhalten werden, sind bekannt. Solche Extrakte sind in der Immunotherapie bei
verschiedenen immunogenen Tumoren (s. Peptides as Requirement for Immunotherapy of the Guinea-Pig Line-10
Tumor with Endotoxins; Ribi, et al, Cancer Immunol. Immunother., Band 7, S. 43-58, 1979) verwendet worden. Diese
Endotoxinextrakte sind jedoch erwiesenermaßen hoch toxisch, weshalb ihre Verwendung bei der Behandlung von
Krebstumoren beschränkt ist. Es sind Versuche unternommen worden, die Endotoxine zu entgiften, ohne deren tumorrückbildende
Eigenschaft zu beeinträchtigen. Wie von Ribi, et al, aufgezeigt, führten die zur Entgiftung von
Endotoxin bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung seiner Adjuvantizität bekannten chemischen Verfahren, wie z.B.
Succinylierung und Phthalylierung zum Verlust sowohl der Endotoxizität als auch der tumorrückbildenden Eigenschaften.
Demzufolge blieben die bisher unternommenen Versuche zur Herstellung eines Endotoxinprodukts mit hoher
tumorrückbildender Eigenschaft und geringer oder keiner Toxizität ohne Erfolg.
-S-
Die Kombination von Zellwandgerüst und Trehalosedimycolat
ist bekannt (s„ Biologically Active Components from Mycobacterial Cell Walls. II Supression and Regression
of Strain-2 Guinea Pig Hepatoma; Meyer, et al, Journal of the National Cancer Institute, Band 52, Nr. 1, Januar
1974, und Mycobacterial Cell Wall Components in Tumor Supression and Regression; Ribi, et al, National Cancer
Institute Monograph Nr. 39, S. 115-120, Oktober 1972).
Unter Zellwandgerüst versteht man im wesentlichen eine Zellwand, aus der ein großer Anteil der normalerweise darin
enthaltenen Proteine und Lipide entfernt wurden. Es handelt sich dabei um ein polymeres Mycolsäurearabinogalactanmucopeptid,
das Trehalosemycolatreste ("P3") und unverdaute Tuberculoproteine enthält. Zellwandgerüst erhält
man aus den Mycobakterien M. smegmatis, M. phlei, Nocardia
rubra, Nocardia asteroides, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium parvum, M. kansasii, M. tuberculosis
(Stamm H 37 RV und Ayoma B), und M. bovis Stamm BCG, jedoch nicht ausschließlich nur aus diesen. Außerdem kann
es auch noch aus Nicht-Mycobakterien wie E. coli, B.
abortus und Coxiella burnettii hergestellt werden.
Das Zellwandgerüst wird hergestellt, indem man zuerst
Bakterien, wie z.B. M. bovis, Stamm BCG (bacillus Calmette-Guerin)
züchtet und aberntet. Der erhaltene Vollzellrückstand wird dann auf einen Zellfraktionator (Ribi Cell
Fractionator (Sorvall, Model RF-I)) aufgegeben, der die
Zellen aufbricht und die äußere Umhüllung bzw. Zellwand von protoplasmatischen Verunreinigungen abtrennt. Die
erhaltenen Zellwände werden danach einer Reihe von Lösungsmittelextraktionen
und enzymatischen Behandlungen (z.B. mit Trypsin und/oder Chymotrypsin) unterworfen, wodurch
man dann das gereinigte Zellwandgerüst erhält.
Trehalosedimycolat (TDM) kann aus Organismen wie z.B. M.avium, M. phlei, M. tuberculosis (Stamm H 37 RV und
Ayoma B), M. bovis Stamm BCG, M. smegmatis, M. kansasii,
Nocardia rubra und Corynebacterium diphtheriae hergestellt
werden.
Die Bakterien, wie z.B. M. avium, werden gezüchtet, abgeerntet
und dann durch Hitzeeinwirkung abgetötet. Die Zellmasse wird mit verschiedenen Lösungsmitteln extrahiert,
wonach die aktive, in einem Lösungsmittel lösliehe Fraktion extrahiert wird. Das Extrakt wird durch
eine Reihe von Lösungsmittelextraktionen gereinigt, wodurch man TDM erhält (s. Biologically Active Components
from Mycobacterial Cell Walls. I. Isolation and Composition of Cell Wall Skeleton and Component P ,- Azuma,
et al., Journal of the National Cancer Institute", Band 52, S. 95-101, 1974). Wie in dieser Literaturstelle beschrieben
wird, können die TDM dann weiter durch Zentrifugalchromatographie an feinverteiltem Silikagel gereinigt
werden.
Die wie oben beschrieben hergestellten CWS- und TDM-Komponenten können in Form einer Öltröpfchenemulsion zur
Herstellung einer antitumoral wirksamen injizierbaren Zusammensetzung
verwendet werden (s. Immunotherapy with Non-viable Microbial Components; Ribi, et al; Annals of
the New York Academy of Science, Band 227, S. 228-238, 20. September 1976).
Erfindungsgegenstand ist daher die Bereitstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die gereinigtes, entgiftetes
Endotoxin, Zellwandgerüst und Trehalosedimycolat enthält, welche bei der Behandlung von mit Krebs befallenen
Geweben bei Warmblütern und Menschen wirksam ist.
Ein weiterer Erfindungsgegenstand ist die Bereitstellung
einer pharmazeutischen Zusammenstellung, die diese Komponenten enthält, wobei die schädlichen Nebenwirkungen, die
normalerweise mit Endotoxinen verbunden sind, eliminiert
werden.
Endotoxinextrakte des als Ausgangsmaterial für die Herstellung von gereinigtem, entgiftetem Endotoxin (RDE)
verwendeten Typs können, wie eingangs bereits erwähnt, aus Enterobacteriaciae einschließlich verwandten Organismen und Mutanten
erhalten werden. Die nachfolgenden Gattungen sind Beispiele für verwendbare Mikroorganismen:
Salmonella, Shigella, Escherichia, Bruceila, Bordetella,
Citrobacter, Pseudomnas, Pasturella, Neisseria, Proteus, Klebsiella und Serratia.
Folgende Spezies eignen sich besonders für den Einsatz in vorliegender Erfindung:
S.minnesota, S.typhimurium, B.pertussis, B.abortus,
S.enteritidis, E.coli, S.typhi, S.marcescens, S.typhosa,
Shigella flexni und S.abortus equi.
Die als Ausgangsmaterial verwendeten endotoxischen Extrakte
können durch eines der nachfolgenden bekannten Verfahren hergestellt werden:
1) Webster, M„E„, Sagin, J„F„, Landy, M., and Johnson,
A.G., J.Immunol. 1955, 744,55.
2) Westphal, 0., Luderitz, 0„, and Bister, F., Z.
Naturforsch, 76 148 (1952). 3) Westphal, Oo, Pyrogens, Polysaccharides in Biology, Tr. Second Macy Conference (George F. Springer, ed.), Madison, N.J. Madison printing Co., 1957, 115.
4) Galanos, C, Luderitz, Ο., Westphal, 0., Eur. J.
Biochem, 9. 245 (1969) .
5) Chen, CHo, Johnson, A.G., Kasai, N., Key, B.A.,
5) Chen, CHo, Johnson, A.G., Kasai, N., Key, B.A.,
Levin, J., Nowotny, A-, J. Infect. Pis 128 543 (1973).
6) Ribi, E., Haskins, W.T., Landy, M., Milner, K.
C, The Journal of Experimental Medicine 114 647 (1961).
7) Leive, L., Biochem. Biophys. Res. Comm. 21 290
(1967).
8) Ribi, E., Milner, K.C, and Perrine, T., J.
Immunol. .82 75 (1959) .
Das von Chen et al beschriebene Verfahren, nämlich die Methanol-Chloroform-Ausfällung, stellt die bevorzugte
Methode zur Gewinnung des endotoxischen Extrakts dar.
Das Methanol-Chloroform-Präzipitat (MCP) wird mit einer
organischen oder anorganischen Säure umgesetzt und anschließend lyophilisiert, um ein hydrolysiertes Roh-Lipid
A mit verringerter Toxizität und Pyrogenizität, verglichen
mit dem Ausgangsmaterial Endotoxin, zu erhalten. Das erhaltene Material wird daraufhin mit einem Lösungsmittel
behandelt, welches fähig ist, besonders Fettsäuren und andere Verunreinigungen, jedoch nicht das Roh-Lipid
A, zu lösen. Der Phosphatgehalt im entgifteten, gereinigten Lipid A beträgt etwa die Hälfte der im toxischen
Endotoxin festgestellten Konzentration, was darauf schließen läßt, daß der Phosphatgehalt mit den toxischen
Wirkungen von Endotoxinen in Beziehung steht.
Die für die Reaktion mit MCP bevorzugt verwendeten anorganischen Säuren sind Salzsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure;
die bevorzugten organischen Säuren sind Toluolsulfonsaure. oder Trichloressigsäure. Die Reaktion
kann bei einer beliebigen Temperatur zwischen etwa 90 C und 130°C während einer für die Durchführung der Hydrolyse
ausreichenden Zeitspanne, gewöhnlich zwischen etwa 15 und 60 Minuten, durchgeführt werden.
Die Herstellung von rohem, entgiftetem Endotoxin kann durch Reaktion des Ausgangsmaterials mit der Säure in
Anwesenheit eines organischen Lösungsmittels wie z.B. Chloroform, Methanol, Äthanol oder Verbindungen davon
erfolgen.
Das erhaltene Roh-Lipid A wird in Azeton, dem bevorzugten
Lösungsmittel zur Lösung von Fettsäuren und anderen Verunreinigungen, gelöst. Das Lösungsmittel wird daraufhin
entfernt, um rohes, entgiftetes Endotoxin zu erhalten.
Das rohe, entgiftete Endotoxin wird anschließend in einem Lösungsmittel gelöst und die Lösung durch eine geeignete
Chromatographiesäule, wie z.B. eine Molekularausschluß-Chromatographiesäule, geschickt, um die RDE-Fraktionen
abzutrennen, welche nach der Entfernung des Lösungsmittels miteinander vereinigt werden. Gemäß einer Ausführungsform wird die rohe, entgiftete Endotoxinlösung in Anwesenheit
eines Lösungsmittels wie z.B. Chloroform, Methanol, Azeton, Pyridin, Äther, Essigsäure oder Gemische
davon, durch eine Sephadexsäule geschickt. Der Säulendruck kann variieren, er liegt aber vorzugsweise im Be-
reich zwischen Atmosphärendruck und 70 N/cm , und die Fließgeschwindigkeit
liegt etwa zwischen 0,1 und 10 ml/Min.
Gemäß einer anderen Ausführungsform wird die rohe, entgiftete
Endotoxinlösung unter den gleichen Druckbedingungen wie bei der oben beschriebenen Sephadexsäule durch
eine DEAE-Zellulosesäule geschickt. Die Fließgeschwindigkeit
wird zwischen etwa 2 und 15 ml/Min, gehalten. Die Lösungsmittel sind ebenfalls die gleichen, wie sie bei
der Sephadexsäule verwendet werden, obgleich allen Gemischen Wasser und/oder Diäthylamin in einer Konzentration
bis zu etwa 1% zugegeben werden kann.
Bei weiteren Verfahren zur Herstellung von RDE aus rohem, entgiftetem Endotoxin wird unter anderem die
Lösung durch eine Niederdruck-60-Säule mit Silikagelteilchen
mit einer Teilchengröße zwischen ungefähr 25 /um und 63 yum unter Verwendung eines Lösungsmittels
aus Chloroform, Methanol, Wasser und Ammoniumhydroxyd geschickt. Das bevorzugte Volumenverhältnis der Lösungsmitte !komponenten beträgt etwa 50:25:4:2.
RDE, CWS und TDM werden miteinander kombiniert, um eine
IQ Zusammensetzung mit hoher antitumoraler Wirksamkeit zu
erhalten.Mit der erfindungsgemäßen Zusammensetzung können
unter anderem Krebsarten,wie die folgenden tierischen Tumore, z.B. Rinder-Schuppenzell-Karzinom, Rinder-Fibrosarkcm,
Pferde-Sarkoid, Pferde-Melanom, Pferde-Schuppenzell-'Karzinom,
Hunde-Mamma-Tumore, Hunde-Adenom und Hunde-Melanom,
sowie menschliche Tumore, wie z.B. Brusttumore, Lungentumore, Coleo-Rectal-Tumor, malignes
Melanom, Schuppenzell-Karzinome und Ovarial-Tumore, behandelt werden. Die Zusammensetzung wird durch Injektion
in einem pharmazeutisch geeigneten Mittel, wie z. B. in einer Öltropfchenemulsion, verabreicht. Vorzugsweise
erfolgt die Verabreichung direkt in den Tumor unter den nachfolgend näher beschriebenen Bedingungen.
Die Zusammensetzung kann, beispielsweise mittels eines Lyophilisationsverfahrens, stabilisiert und nachfolgend
ohne Verlust an Wirksamkeit in den ursprünglichen Zustand zurückversetzt werden.
Die RDE-Menge in einer einfachen Injektion für die Behandlung von Tieren liegt zwischen etwa 6,25 und 250
yug/ml. Die Menge an CWS beträgt zwischen etwa 125 und
750 ^ug/ml.und die des TDM ebenfalls zwischen etwa 125
und 250 /ug/ml. Die Anzahl an Millilitern des biologisch
in den Tumor injizierten Präparats wird von der Tumorgröße bestimmt, wobei im Einzelnen auf die Werte in
| 0-1 | cm |
| 1-2 | cm |
| 2-3 | cm |
| 3-5 | cm |
| 5-8 | cm |
•«J
-leder nachstehenden Tabelle verwiesen wird.
Dosis bei Tieren je nach Tumorqröße
Dosis bei Tieren je nach Tumorqröße
Durchmesser des Tumors (cm) Menge des zu injizierenden
biologischen Präparats
bis zu 0,5 ml
0,5 bis 2,5 ml
2,5 bis 5 ml
5 bis 10 ml
10 bis 15 ml
größer als 8 cm 15 bis 20 ml
0,5 bis 2,5 ml
2,5 bis 5 ml
5 bis 10 ml
10 bis 15 ml
größer als 8 cm 15 bis 20 ml
Die maximale Dosis pro Injektion beträgt etwa 1500 μg
RDE, etwa 4500yug CWS und etwa 1500 /ig TDM. Die Behandlung
sieht bis zu 5, in 1-Wochenintervallen verabreichte
Injektionen vor.
Die Verabreichung der RDE-CWS-TDM-Zusammensetzung in einem geeigneten, injizierbaren Mittel, wie z.B. einer
Öltropfchenemulsion, kann direkt in den menschlichen
Tumor erfolgen. Die Menge an RDE bzw. CWS in einer einzigen Injektion liegt zwischen etwa 50 und 1000 ^Jg. Die
Menge an TDM in einer Injektion kann zwischen etwa 50 und 3OO /ig betragen. Die bevorzugte Dosierung an RDE
und TDM liegt im Bereich zwischen etwa 125 und 175 /ug,
während die bevorzugte Dosierung an CWS zwischen etwa 275 und 325 jag beträgt. Bei sämtlichen obengenannten
Dosierungsmengen für RDE, CWS und TDM wird vor der Verabreichung an einem Durchschnittserwachsenen mit einem
Gewicht von 70 kg ausgegangen. Die Injektionen werden höchstens 15 Mal einmal wöchentlich verabreicht. Gewöhnlich
empfiehlt sich die Verabreichung einer Zusammensetzung, die zwischen etwa 50 und 500 /ug/ml RDE, zwischen
etwa 50 und 500 /ug/ml CWS und zwischen etwa 50
λΟ " "
-Xi-
und 150 yug/ml TDM je Injektion enthält.
Wie oben beschrieben, kann die Zusammensetzung bei der Behandlung von Warmblütern und Menschen in Form
einer Oltröpfchenemulsion verwendet werden. Die verwendete Ölmenge liegt zwischen etwa 0,5 und 3,0
Vol.-%, bezogen auf das Gesamtvolumen der Zusammensetzung. Die bevorzugte Menge des zu verwendenden
Öls beträgt zwischen ungefähr 0,75 und 1,5 Vol.-%. Beispiele für solche Öle sind leichtes Mineralöl,
Squalane, 7-n-Hexyloctadecan, Conoco Superöl und
Drakeol 6 VR Mineralöl (hergestellt von der Pennreco Company, Butler, Pennsylvania).
Das homogenisiertes Öl enthaltende Gemisch wird anschließend mit einem Detergent, das vorher gegebenenfalls
in einer Salzlösung gelöst wird, vermischt. Die durchschnittliche Menge des Detergents beträgt
zwischen etwa 0,02 und 0,2 Vol.-%, und die bevorzugte Menge beträgt zwischen etwa 0,10 und 0,20
Vol.-%, bezogen auf das Gesamtvolumen der Zusammensetzung.
Es können alle üblichen Detergentien verwendet werden, wie z.B. Tween-80 und Arlacel (hergestellt
von Atlas Chemical Company).
Das nach dem Zusatz des Reinigungsmittels erhaltene Gemisch wird dann homogenisiert, wodurch man eine Suspension
mit einem hohen Prozentsatz an mit RDE und CWS überzogenen Öltröpfchen erhält, was sich unter dem Mikroskop
nachweisen läßt.
Die nachfolgenden Beispiele dienen lediglich der Illustration und schränken die in den Ansprüchen beanspruchte
Erfindung nicht ein.
λλ
Herstellung von rohem, entgiftetem Endotoxin.
Eine 650 mg-Probe eines gemäß dem Verfahren von Chen, et al J. Infect. Pis. 128 543 (1973) hergestellten Methanol-Chloroform-Präzipitats
wurde in 150 ml 0,IN HCl in einem mit einem Kondensator versehenen
Dreihals-Rundboden-Kolben suspendiert und in ein Beschallungsgerät getaucht. Nach der Beschallung. wurde die Glasvorrichtung
in ein Ölbad, dessen Temperatur bei 120°C gehalten wurde, versenkt, wodurch die Innentemperatur des
Kolbens sich dem Siedepunkt der Lösung näherte oder ihn überschritt. Durch Anbringen eines mit einer Stickstoffgasquelle
verbundenen Kapillarröhrchens am Kolben durch einen der Hälse wurde die Überhitzungsgefahr so
gering wie möglich gehalten. Während des Hydrolyseverfahrens erfolgte ein kontinuierlicher Stickstofffluß.
Die Hydrolyse dauerte 30 Minuten. Die Lösung wurde in einem Eisbad gekühlt, schallbehandelt, um die Feststoffe
zu dispergieren, und in Corex-Röhrchen verteilt.
E>er Kolben wurde mit destilliertem Wasser gewaschen, um
alle den Seitenwänden des Kolbens anhaftenden Feststoffe zu beseitigen, und die Waschflüssigkeit der Suspension in
den Corex-Röhrchen zugegeben. Anschließend wurde bei 12.000 Upnt während 80 Minuten zentrifugiert. Der Überstand
wurde abdekantiert und verworfen. Der Feststoffrückstand wurde erneut in destilliertem Wasser suspendiert,
schallbehandelt, bis eine gute Verteilung der Suspension erreicht war, und erneut zentrifugiert. Die Zentrifugierung
wurde daraufhin wiederholt. Der Rückstand wurde in destilliertem Wasser aufgenommen, gefriergetrocknet und
lyophilisiert, wodurch 382 mg rohes Lipid A erhalten wurden. 150 mg dieser Substanz wurden zwecks Entfernung der Fett-•
säuren mit kaltem (0 C) Azeton behandelt, schallbe-
/a
- 13 -
handelt und durch eine Whatmann Nr. 1-Gravitationsfiltriervorrichtung
bei 5 C abfiltriert. Nach dem Trocknen blieben 100 mg rohes, entgiftetes Endotoxin zurück.
Beispiel 2
Herstellung von rohem, entgiftetem Endotoxin.
Herstellung von rohem, entgiftetem Endotoxin.
Eine 120 mg-Probe eines MCP (Methanol-Chloroform-Präzipitats)
wurde in 12 ml absolutem Methanols suspendiert, zwecks Dispersion der Feststoffe schallbehandelt
und in 6 1x10 cm große Schraubverschlußampullen verteilt.
Jeder Ampulle wurden 2 ml 0,2N HCl zugegeben, und die
erhaltene Suspension wurde während 45 Minuten in einem Bad mit kochendem Wasser bebrütet. Nach der Hydrolyse
wurden die Ampullen in einem Eiswasserbad gekühlt und bei 2500 Ump während etwa 10 Minuten zentrifugiert. Der
Überstand wurde abdekantiert und dem Rückstand wurden 5 ml eines Chloroform-Methanol-Gemisches (2:1) zugegeben,
um die Auflösung zu bewerkstelligen. Jeder Ampulle wurden 2 ml Wasser zugegeben,und die Lösung wurde vermischt. Die
Zweiphasen-Lösung wurde erneut bei 2500 Upm während 10 Minuten zentrifugiert. Die obere wäßrige Phase wurde verworfen,
und jeder Ampulle wurde 1 ml eines Chloroform-Methanol-Gemisches (4:1) zugegeben, woraufhin klare Lösungen
erhalten wurden. Die Lösungen wurden anschließend vereinigt, und das Lösungsmittel wurde an einem Rotationsverdampfer
eingedampft. Der Rückstand wurde unter Hochvakuumbedingungen getrocknet und lyophilisiert, worauf
man 45 mg rohes Lipid A erhielt. 20 mg davon wurden mit kaltem (O0C) Azeton behandelt, schallbehandelt
und durch eine Whatmann Nr 1-Gravitationsfiltriervorrichtung
bei 5 C abfiltriert. Nach dem T. rohes, entgiftetes Endotoxin zurück.
tung bei 5 C abfiltriert. Nach dem Trocknen blieben 13 mg
A3
Herstellung von RDE (gereinigtes, entgiftetes Endotoxin).
110 g LH-20-100 (Teilchengröße: 25-100 pm nach Pharmacia)
wurden mit 6OO ml einer Chloroform-Methanol-Lösung (2:1) vermischt und anschließend 3O Minuten stehengelassen. Die
dadurch erhaltene Aufschlämmung wurde in eine 25 χ 1000 mm
große, mit Druckfittings ausgestattete Glaschromatographiesäule (BRL Laboratories) gegeben. Nach erfolgter Beschickung
wurde die Säule durch ein Teflon-Druckrohr an eine Pumpe (ISCO Model 132) angeschlossen. 400 ml eines Chloroform-Methanol-Gemisches
(4:1) wurden mit einer Geschwindigkeit von 3 ml/min durch die Säule gepumpt. 100 mg des
nach Beispiel 1 hergestellten rohen, entgifteten Endotoxins wurden über ein Rohr zur Probenvolumenbestimmung in
2,5 ml eines Chloroform-Methanol-Gemisches (4:1) auf die Säule aufgegeben. Der Zufluß wurde auf 1 ml/min reduziert,
und, nachdem eine Menge von 15Ο ml Eluierungsmittel erhalten worden war, wurde der Abfluß mit einem Fraktionssammler
verbunden. Es wurden 4 ml Fraktionen gesammelt und gereinigte, entgiftete Endotoxinfraktionen durch Dünnschicht-Chromatographie-Analyse
ermittelt (E. Merck, Dicke: 0,25 mm, Chloroform/Methanol/H^O/NH.OH (50:25/4:2) als
Eluierungsmittel).
Die gereinigten, entgifteten Endotoxinfraktionen wurden
vereinigt, und das Lösungsmittel wurde abgedampft, wonach 30 mg gereinigtes, entgiftetes Endotoxin in Form eines
weißen Pulvers zurückblieben.
Herstellung von RDE (gereinigtes, entgiftetes Endotoxin).
33 g DEAE-Zellulose (Whatmann DE-32) wurden in 150 ml
Eisessig suspendiert und während 10 Minuten schwach gerührt, woraufhin eine pulverige Aufschlämmung erhalten
wurde. Das Gemisch wurde über Nacht beiseite gestellt.
Die Aufschlämmung wurde in eine 25 χ 400 mm große Säule gegossen, wo sie sich unter Beklopfen absetzte, und
anschließend der Säureüberschuß abgezogen. Die Säule wurde zuerst mit 2000 ml Methanol und dann mit 200 ml
eines Chloroform-Methanol-Gemisches (4:1) gewaschen.
Eine 100 mg-Probe des gemäß Beispiel 1 hergestellten rohen, entgifteten Endotoxins wurde in 3 ml eines Chloroform-Methanol-Gemisches
(4:1) oder eines Chloroform-Methanol-Wasser-Gemisches (80:20:1) in die Säule gegeben.
Die Säule wurde zuerst mit 350 ml eines Chloroform-Methanol-Gemisches (4:1) und dann mit 300 ml eines Methanol-Wasser-Gemisches
(99:1) eluiert. Unter Verwendung eines Apparats mit linearem Gradienten wurde die Säule
mit 2000 ml eines linearen Gradienten, beginnend mit 100-%igem Methanol und schließlich mit 0,2 M Essigsäure in
Methanol, eluiert. Die Säule wurde bei einer Geschwindigkeit von 6 ml/min eluiert, und es wurden 15 ml an Fraktionen
gesammelt. Jede zweite Fraktion wurde gemäß dem Verfahren von Bartlett, G.R., J. Biol. Chem. 234, 466-471
(1959) auf ihren Gesamtgehalt an Phosphor untersucht. Die Fraktionen wurden vereinigt und an einem Rotationsverdampfer
fast bis zur Trockenheit abgedampft und in 10 ml eines Chloroform-Methanol-Gemisches (2:1) und 40 ml einer
0,001 M Essigsäure in einen Scheidetrichter aufgenommen.
Die untere Schicht wurde abgetrennt, durch ein Whatmann Nr 2-Filterpapier abfiltriert und bis zur Trockenheit abgedampft,
wonach 19,2 mg gereinigtes, entgiftetes Endotoxin erhalten wurden.
Sieben Schweinen vom 2-Guinea-Stamm mit Line-ΙΟ Tumorgewächsen
von etwa 9 mm wurde einmal eine Injektion mit 0,4 ml einer sterilen Öltropfchenemulsion, d.h. mit Drakeol
6 VR Mineralöl (Pennsylvania Refining Company, Butler, Pennsylvania) eines RDE, CWS und TDM enthaltenden Injek-
45- >6 -
tionsmittels direkt in das Tumorgewebe verabreicht.
Nach 3 Monaten wurden die Tiere untersucht und in allen Fällen eine totale Rückbildung des Tumorwachsturns festgestellt.
Bei Kontrollexperimenten wurde zwei Gruppen mit je
sieben Schweinen vom 2-Guinea-Stamm, die mit Line-lO
Tumorwachstum von .einer Größe zwischen 9 und 12 mm befallen waren, einmal eine Injektion mit 0,4 ml eines
50yug RDE und jeweils 50 /üg RDE und TDM enthaltenden
Injektionsmittels direkt in das Tumorgewebe verabreicht.
Nach Ablauf von 3 Monaten wurden die Tiere untersucht. Bei keinem Guinea-Schwein aus den beiden Gruppen mit
jeweils 7 Versuchstieren konnte auch nur das geringste Anzeichen einer Rückbildung des Tumorgewebes festgestellt
werden.
Claims (3)
1. Therapeutische Zusammensetzung enthaltend eine therapeutisch wirksame Menge an
a) gereinigtem, entgiftetem Endotoxin, das kein nachweisbares 2-Keto-3-deoxyoctanoat, jedoch zwischen 350 und
nM/mg Phosphor und zwischen etwa 1700 und 2000 nM/mg Fettsäuren
enthält;
b) Zellwandgerüst;
c) Trehalosedimycolat und einen pharmazeutisch geeigneten Träger.
2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die therapeutisch
wirksame Menge an gereinigtem, entgiftetem Endotoxin und Trehalosedimycolat bis zu etwa 1500 /ug und die therapeutisch
wirkungsvolle Menge an Zellwandgerüst bis etwa 4500 yug pro Injektion beträgt.
3. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß sie in lyophilisierter
Form oder in Form einer Öltröpfchenemulsion vorliegt.
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