JPH0645643B2 - エキナセアプルプレアまたはエキナセアアングスティフォリアの細胞培養物からの免疫刺激作用性ポリサッカライド、その製造方法及びこれを含む製剤 - Google Patents

エキナセアプルプレアまたはエキナセアアングスティフォリアの細胞培養物からの免疫刺激作用性ポリサッカライド、その製造方法及びこれを含む製剤

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JPH0645643B2 JP61280949A JP28094986A JPH0645643B2 JP H0645643 B2 JPH0645643 B2 JP H0645643B2 JP 61280949 A JP61280949 A JP 61280949A JP 28094986 A JP28094986 A JP 28094986A JP H0645643 B2 JPH0645643 B2 JP H0645643B2
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    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0087—Glucomannans or galactomannans; Tara or tara gum, i.e. D-mannose and D-galactose units, e.g. from Cesalpinia spinosa; Tamarind gum, i.e. D-galactose, D-glucose and D-xylose units, e.g. from Tamarindus indica; Gum Arabic, i.e. L-arabinose, L-rhamnose, D-galactose and D-glucuronic acid units, e.g. from Acacia Senegal or Acacia Seyal; Derivatives thereof

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はエキナセアプルプリア［Echinaceaprupurea(Li
nne)Moench］またはエキナセアアングスティフォリア
［Echinacea angustifolia(De Vandolle)］の細胞培養
物からの新しい免疫刺激作用性ポリサッカライド、その
製造方法ならびにこのポリサッカライドを含有する薬剤
に関係する。
［従来の技術］ 治療的概念としての免疫刺激は医学界で以前から知れて
いる。一般に治療的概念としての免疫刺激とは、それ自
体ごく僅かな抗原作用を有するかまたは抗原作用を全く
有しないが、非特異的または特異的な方法で身体に固有
な防御機構を誘発しうる物質の注入を意味する。現在の
知識によると、多くの物質が免疫防御を刺激しうるもの
であり、特に例えばＡｌ（ＯＨ）3、ＭｇＳＯ4、ベリリ
ウム、マイコバクテリアを添加した、または添加しない
植物油、ならびに一連の植物成分のような種々の物質を
挙げることができる。これに関連して特に、その免疫刺
激作用が集中的に研究されているレクチン物質群に言及
する。レクチン（フィトヘマグルチン）は植物性蛋白質
すなわち糖蛋白質である。免疫刺激作用を有する他の植
物成分としては、高級植物、低級及び高級菌類、地衣類
ならびに藻類からポリサッカライドが単離され、研究さ
れている。一連の免疫刺激全体については、例えばChed
id.L等の「免疫刺激（Immunstimulation）」Springer出
版社（ハイデルベルグ、ニューヨーク）1980年；（Heid
elberger,M.）の「ポリサッカライドの構造と免疫特異
性（Structure and Immunological Specificity of Pol
ysaccarides）」Fortschritle d chem.Org.Naturst.42
巻，288頁（1982）；Drews,H.の「免疫刺激の可能性（M
oglichkeit der Immunstimulation）」Swiss Pharma 2,
9,(49)(1980)によって、詳細に述べられている。
免疫刺激性物質の正確な作用機構は、多くの場合、現在
までに決定的には解明されていない。これらの物質は一
般に、免疫適格細胞の増殖に特に影響を与えるが、記憶
反応を後に残さない。このことは、免疫刺激性物質の作
用対象としてマクロファージ及び顆粒球ならびにＴ−及
びＢ−リンパ球が重要であることを意味する。免疫刺激
物の作用は直接的または間接的な方法で、例えば補体系
を介してまたはリンパ球を介して、インターフェロンま
たはリボゾーム酵素（例えば、リンホキン、コロニー刺
激性因子等）の産生を介して、ならびにマクロ及びミク
ロ食細胞の増大を介して行われる。この場合に、非特異
的及び特異的な防御機構のために常に、カスケード効果
及び幾つかの防御系の同時緩衝を考慮すべきである。
医学界では、混合感染症、慢性、持続性、化学療法耐性
の細菌感染症及びウィルス感染症の治療ならびに危険状
態にある患者における偶発的な感染症の予防、悪性疾患
の治療及び或る範囲での自己免疫疾患の治療も特に、免
疫刺激の好ましい用途であると判明している。免疫増殖
抑制療法におけるこの療法に関連する免疫抑制を一部代
償するために、免疫刺激を同様に用いることもできる。
植物系出発物質からポリサッカライドの単離に関して
は、文献に一連の抽出方法が挙げられている。Whistle
r,R.L.,Sannella,J.L.,「炭水化物化学における方法（M
ethods in Carbohydrate Chemistry）」編集者：Whistl
er,R.L.,Bemiller,J.N.,Ｖ巻、34〜36頁、Academic Pre
ss（ニューヨーク）（1965）；Tomoda M.,Shimada,K.,S
aizo,Y.,Sugi,M.,Chem.Pharm.Bull.28(10),2933頁（198
0）。
問題の植物系物質をポリサッカライドの種類に応じて、
冷水、熱水、食塩水溶液、稀薄な酸もしくは苛性アルカ
リ溶液、またはジメチルスルホキシドによって抽出す
る。このようにして得られた溶液から一般に、重金属塩
または第四アンモニウム塩で錯塩を形成し、アルコール
による沈澱によってポリサッカライド粗フラクションを
得る。次にポリサッカライド粗フラクションをイオン交
換、ゲル濾過及びバイオアフィニティクロマトグラフィ
によって分離する。
天然の植物系出発物質からポリサッカライドを公知の方
法によって単離する場合には、次のような欠点に不可避
に直面することになる。抽出時に同時に生成する親油性
付随物質（例えばばクロロフィル）は分離が困難である
か、または有機溶剤による時間のかかる抽出後に初めて
分離が可能であることが判明している。天然の植物系出
発物質の性状に依存して、同一の植物材料でも精製法が
異なると、再三再四、質的にも量的にも異なる組成のポ
リサッカライド粗フラクションを得る。さらに重大な欠
点は特定の種類のポリサッカライドの単離に不可避なア
ルカリ性または酸性の抽出剤の使用が絶対に必要である
ことである。この抽出剤の使用によって、ポリサカライ
ドの一次、二次または三次構造が変化して、免疫刺激作
用に影響を与える。
［発明が解決しようとする問題点］ 本発明の目的は、前記欠点を有さず、高級値物から簡単
で効果的なポリサッカライド製造を可能にするような、
高級植物からのポリサッカライド製造法を提供すること
である。
本発明の他の目的は、ヒトの治療に用いるために免疫刺
激剤又は免疫モジュレータを提供することである。
［問題点を解決するための手段］ 本発明では、出発物質として植物系細胞培養物を用いる
が、これを用いることの特別な利点は常に一定の化学的
組成と収率で目的生成物が得られることにある。さら
に、細胞培養物を用いる場合には前記親油性付随物質が
生成しないかまたはごく僅少の割合で生成するにすぎな
い。細胞培養物の他の利点は、目的のポリサッカライド
が細胞を囲む培地中に直接生ずるので、次の精製を比較
的簡単な方法で実施できることである。これには、多量
のポリサッカライドを培地中に析出することによる、植
物系細胞の特別な機能が関係する。
本発明の方法の他の利点は、ポリサッカライド単離時間
が短縮され、一部では強力な抽出剤による出発物質の処
理が避けられるため、加工の範囲における目的生成物の
人為構造物の形成が排除されることである。
以下では、エキナセアプルプレアから誘導された植物系
細胞培養物を調製する方法と次にこの細胞培養物から免
疫刺激性ポリサッカライドを得る方法を例示する。
［実施例］ 細胞培養物を調製するための出発物質としては、エキナ
セアプルプレア（Echinacea purpurea）またはエキナセ
アアングスティフォリア（Echinacea angustifolia）生
活体から無菌の幼芽、葉、花、茎または根部分を用い
て、最初にこれを固体培地上で刺激してカルスを形成さ
せた。
このために、エキナセアプルプレアの幼芽、葉、花、茎
又は根部分を寒天含有リンスマイヤースコーク（Linsma
ier Skoog）培地 ［Hinsmaier,F.M.,F.Skoog,Physilo.Plant.18,100(196
5)］に移植し、この培地にオキシン例えば、2,4−ジク
ロルフェノキシ酢酸、を添加して24℃において14〜28日
間インキュベートした。オキシンは質的に変化しうる。
「植物培養ハンドブック（Handbook of Plant Cultur
e）」（編集者：David,A.Evans,William R.Sharp,Phill
ip V.Ammirato及びYasuyuki Yamada,１巻）Macmillan P
ublishing Co.Macmillan社の１部門（ニューヨーク）に
述べられているように、他の培地を用いて、カルス培養
物及び細胞培養物を製造することもできる。
最初のカルスが約14日後に形成された後、これを液体培
地に移す。この細胞培養物は懸濁培養物であり、これを
１または1.5のエーレンマイヤーフラスコに液体培
地約250ｍまたは1000ｍとともに入れ、100回転／分
で振とうする。22〜28℃において約14日間インキュベー
トした後に懸濁培養物を濾別する。細胞残渣を重量測定
のために凍結乾燥し、濾別した培地を再使用する。
Ａ）細胞培養基からのポリサッカライドの単離以下に述
べる操作の全ては、他に記載しないかぎり、４〜８℃に
おいて実施する。
ａ）ポリサッカライド−粗フラクションの単離全体で20
の細胞懸濁培養物から細胞と細胞成分を濾別し、残渣
を蒸溜水５で後洗浄する。
細胞残渣を重量測定のために冷凍し、凍結乾燥する。こ
れによって凍結乾燥した細胞材料約270gが得られる。一
緒にした濾液（20）に、絶えず攪拌しながら、３倍量
のエタノール（95％）を３ずつまでの少量ずつ加え
る。一晩放置して形成された沈澱を先ず最初に注意して
デカンテーションし、次に上澄液の遠心分離によって分
離する（10,000回転：分／30分間）。一緒にした遠心分
離物を蒸溜水４中に溶かし、水冷しながら15％トリク
ロロ酢酸を7.5％の最終濃度になるまでゆっくりと加
え、１時間後に遠心分離する。ゲル状態沈澱を廃棄し、
透明な上澄を分け、３倍量のエタノール（95％）を加え
て沈澱を形成させる。形成された沈澱を12時間後に遠心
分離し、一緒にして、最初から入れられた量の1/20の酢
酸ナトリウム溶液（２％）中に入れる。この溶液を４℃
において８時間攪拌してから濾過する。次に濾液に１倍
量のエタノール（95％）を加え、12時間放置し、生成し
た沈澱を遠心分離し、1/10量の蒸溜水に入れ、脱イオン
に対して２日間透析してから凍結乾燥する（１：１沈
澱）。
エタノールによる最後の１：１沈澱の上澄に1.5倍量の
エタノール（95％）を加え、48時間放置する。次に沈澱
を遠心分離し、蒸溜水中に溶解し、48時間透析し、凍結
乾燥する。次の収量、すなわち１：１沈澱：2g、凍結乾
燥した細胞成分に基づいて約１％、１：４沈澱：1g、凍
結乾燥した細胞成分に基づいて約0.5％が得られる。
凍結乾燥残渣 270g b)次にポリサッカライド粗フラクションを単離するため
に、トリクロロ酢酸沈澱を省略して短縮した方法を説明
する。
全体で10の細胞懸濁培養物から細胞成分を濾別し、残
渣を蒸溜水で後洗浄する。細胞残渣を重量測定のために
再び凍結乾燥し（凍結乾燥した細胞物質 約120g）、一
緒にした濾液に３倍量のエタノール（95％）を少量ずつ
加える。生成した沈澱を先ず第一に注意してデカンテー
ションし、次に遠心分離（10,000回転／分、30分間）に
よって上澄液から分離する。一緒にした遠心分離物を蒸
溜水に溶かし、不溶な成分を遠心分離し（10,000回転、
30分間）、上澄液に１倍量のエタノール（95％）を加え
る。生成した沈澱を12時間後に遠心分離し、次に遠心分
離物を蒸溜水に溶かし、この溶液を脱イオン水に対して
48時間透析し、次に凍結乾燥する。１：１沈澱の上澄に
1.5倍量のエタノール（95％）を加え、生成した沈澱を4
8時間後に遠心分離し（10,000回転／分、30分間）、蒸
溜水中に溶かし、脱イオン水に対して48時間透析してか
ら凍結乾燥する（１：４沈澱）。
収量： １：１沈澱：1.5g、凍結乾燥細胞材料基準で約1.2％ １：４沈澱：0.7g、凍結乾燥細胞材料基準で約0.5％ 凍結乾燥残渣：120g Ｂ）中性ポリサッカライドと他の３種類のポリサッカラ
イド（Ｂ〜Ｄ）の１：１沈澱からの製造 ａ）前分離 例えばアセテート型のＤＥＡＥ−セファロース CL−6B
−カラムのような陰イオン交換カラムに１：１沈澱の水
溶液を供給する。水性溶出液中に、右旋性の中性ポリサ
ッカライドフラクション（Ａ）が得られる。酸性ポリサ
ッカライドフラクションの溶出は０〜0.75ＭのＮａＣｌ
勾配によって行われる。
約0.2ＭのＮａＣｌ濃度の場合には、左旋性ポリサッカ
ライドフラクション（Ｂ）が溶出し、約0.4Ｍの塩濃度
の場合には、他の２種類の右旋性ポリサッカライドフラ
クション（Ｃ、Ｄ）が得られる。
ｂ）陰イオン交換クロマトグラフィとゲル濾過とによる
中性ポリサッカライドＡの精製 なお存在する酸性ポリサッカライド部分を分離するため
に、実施例a)で得たポリサッカライドフラクションＡに
対して先ず第一に、例えばＤＥＡＥ−セファロース CL
−6BとＤＥＡＥ−トリスアクリル Ｍによる陰イオン交
換クロマトグラフィを行い、両カラムをＨ2Ｏで溶出す
る。このようにして精製した中性フラクションＡを次
に、セファクリル Ｓ−400によるゲル濾過によってさ
らに精製する。これによって、旋光性を有しない低分子
量成分を右旋性ポリサッカライドから分離することがで
きる。精製したポリサッカライドＡを均一性に関して検
査し、分子量を測定する。
収率：凍結乾燥細胞材料100g基準で約0.07％ Ｃ）１：４沈澱からのポリサッカライドＥとＦの製造 a)前分離 ＤＥＡＥ−セファロース CL−6Bによる陰イオン交換ク
ロマトグラフィによって、水性溶出液中に右旋性ポリサ
ッカライド（Ｅ）が得られる。約0.2ＭのＮａＣｌ濃度
による溶出によると、左旋性の酸性ポリサッカライド
（ポリサッカライド（Ｆ）が得られる。
b)ポリサッカライドフラクションＥとＦの精製 ポリサッカライドＥは、例えば溶離剤として0.2ＭＮａ
Ｃｌ溶液を用いるウルトロゲル（Ultrogel） ＡｃＡに
よるゲル濾過によって精製する。ポリサッカライドＥは
カラムの排除容積中に存在し、旋光性を有しない低分子
量の付随物質はフラクション領域またはカラムの全容積
中に存在する。酸性ポリサッカライドＦに対しては、例
えばＤＥＡＥ−トリサクリル（Trisacryl） Ｍによる
第２陰イオン交換クロマトグラフィを行う。純水によっ
て溶出すると、溶出液中にごく微量の痕跡が存在する。
0.2ＭのＮａＣｌ濃度では比較的対照的なピークとして
ポリサッカライドＦが溶出する。次に両ポリサッカライ
ドに対して、溶離剤として0.2ＭＮａＣｌ溶液を用いる
セファクリル（Sephacryl） Ｓ400によるゲル濾過をさ
らに行う。
収率：ポリサッカライドＥ 0.18％ ポリサッカライドＦ 0.14％ （それぞれ凍結乾燥細胞材料100g基準） Ｄ）添付図の方法による中性ポリサッカライドと酸性ポ
リサッカライドとの工業的分離 1.細胞懸濁液を濾過または遠心分離によって、細胞残渣
と細胞を含まない培地とに分離し、細胞残渣を廃棄した
後に、最初の細胞懸濁液量の約75〜85重量％を通常占め
る無細胞培地を、下記の５に述べるように、脱蛋白する
ことができる（工程1.1）。ここではこの段階を省略す
ることができるが、工程５では実施しなければならな
い。
2.細胞フラグメントまたは蛋白質析出による残留濁りは
貫流分離装置、特にチャンパーセパレータまたはトレー
セパレータでの清澄化によって除去し、分離した固体を
廃棄する。工程1.1で脱蛋白が実施されていない場合に
は、この段階を省略することができる。
3.コロイド状溶解成分ならびに高分子量化合物（分子量
＞106ダルトン）はマイクロ濾過によって濾過する（工
程３）。孔度≧0.1μｍの管状または毛管状モジュール
のポリスルホン膜を用いるのが好ましい。この場合に分
離限界＞105ダルトンの限外濾過膜を選択することもで
きる。
4.高い収率を得るために、前記最少量に達した保持物に
対して、脱イオン水による透析濾過を実施する。浸透物
と透析濾過物を一緒にし、保持物を廃棄する。
一緒にした浸透物を先ず最初に限外濾過によって濃縮し
（出発量と装置サイズとに応じて、濃縮係数10〜50
0）、次に、100μｓ／cmより低い導電率に達するまで、
脱イオン水によって透析濾過する。浸透物は廃棄する。
濃縮に用いる膜は10,000ダルトン以下の分離限界を有す
るべきである。管状、毛管状またはラセン巻き状モジュ
ールのポリスルホンまたはセルロースアセテート製膜を
用いるのが好ましい。
透析濾過の代りに、透析またはゲル濾過を選択すること
もできる。
5.濃縮保持物に対しては、1.1ですでに実施しないかぎ
りは、脱蛋白を行う。このために２種類の方法が用いら
れる。
5.1.90℃〜130℃の温度に加熱 5.2.冷却後に濾過または遠心分離によって沈澱を分離す
る。又は 5.1.トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を7.5重量％の濃度にな
るまで溶液に添加 5.2.４℃に少くとも12時間放置 5.3.沈澱を濾別または遠心分離 5.4.導電率＜100μｓ／cmになるまで清澄化溶液を脱イ
オン水に対して透析 6.弱陰イオン交換体において濃縮保持物を最初に溶離剤
として水を用いて溶出して、ポリサッカライドフラクシ
ョンＡに相当する中性ポリサッカライドフラクションを
得、次に０〜４モル液の塩勾配（酢酸ナトリウム、Ｎａ
Ｃｌ等）によって溶出して、酸性ポリサッカライドフラ
クション（ポリサッカライドフラクションＦに相当）を
得る。
7.各フラクションを必要に応じて、５に述べたように、
脱蛋白する。
8.各フラクションに対して、４に述べたように、限外濾
過と透析濾過とを行う。
9.次に生成物を凍結乾燥、真空乾燥または噴霧乾燥によ
って乾燥する。
得られる収量はその都度の醗酵沈積物の質に依存して、
各フラクションに対して最初の懸濁液量基準で約10〜10
0ppmになる。
Ｅ）単離ポリサッカライドの構造 a)ポリサッカライドＡとＥ 1.分子量測定 ポリサッカライドＡとＥの分子量測定は溶離剤として水
または0.2Ｍ ＮａＣｌ溶液を用いるセファクリル（Sep
hacryl） Ｓ 400によるゲルクロマトグラフィならび
にＨＰＬＣによって行う。
使用したＨＰＬＣ系： a)μ−Porasil-Gpc-60＋μ−Bondagel E 125 b)μ−Bondagel E 125＋５−Bondagel E 500 Fa.Waters. 緩衝系：0.2Ｍまたは0.5Ｍリン酸塩緩衝液 pH＝6.0 対照物質：Dextran T 10,T 40,T,70,T 110,T 500,T 200
0 この方法によってポリサッカライドＥの平均分子量は10
000（範囲：５〜15000）及びポリサッカライドＡの平均
分子量は25000（範囲：20〜30000）と測定された。
２．構造 両ポリサッカライドは、質量分析法、ガスクロマトグラ
フィー法およびＮＭＲ法により組成、構造解析され、そ
の結果は、0.1：0.4：１：1.5の比のフコース、ガラク
トース、キシロース、及びグルコースから構成されるフ
コガラクトキシログルカンである。
ポリサッカライドの主鎖は、約65％までがＣ−６位置で
分岐している（１→４）−β−結合グルコース単位から
成る。
側鎖はかなり種々な組成であり、３糖単位の最大鎖長を
有する。最も簡単な場合には、末端キシロースがグルカ
ン骨格のＣ−６に直接結合している。しかし、この他に
ガラクトース（１→２）−キシロース−、フコース−
（１→２）−ガラクトース−（１→２）−キシロース−
及びガラクトース−（１→２）−ガラクトース−（１→
２）−キシロース側鎖も存在する。単離したオリゴサッ
カライドに基づいて、ポリサッカライドの大部分がヘプ
タ及びデカサッカライドの繰り返し単位から構成されて
いると推定することができる。
ポリサッカライドＡもポリサッカライドＢも約８％まで
アセチル化されている。
ポリサッカライドＡとＥの基本構造： b)ポリサッカライドＦの基本構造 1.実施例a)に述べたように、ポリサッカライドＦの平均
分子量は使用した緩衝系に応じて、75000（範囲：65000
〜85000）（0.5Ｍリン酸塩緩衝液pH6.0）または110,000
（範囲：100000〜120000）（0.2Ｍリン酸塩緩衝液pH6.
0）と測定された。
又、ポリサッカライドＦの同定は、質量分析法、ガスク
ロマトグラフィー法、ＮＭＲ法で行った。その結果、ポ
リサッカライドＦは酸性アラビノガラクタンを示す。こ
の基本骨格はラムノガラクツロナンによって相互に結合
されている（１→３）β−結合ガラクトース鎖から成っ
ている。
（１→３）−β−ガラクタン鎖のガラクトース単位は１
つおきにＣ−６原子を介して、（１→６）−β−ガラク
トース側鎖と結合する。これはまたほぼ70％までＣ−３
位置において末端アラビノースと結合する。
このポリサッカライド成分の他に、さらに長く、強く分
岐した（１→５）−α−アラビナン鎖が検出される。こ
のアラビナン部分はアラビノガラクタン部分またはラム
ノガラクツロナン部分に結合することができる。
ポリサッカライドＦのアラビノガラクタン部分の構造 ポリサッカライドＦのラムノガラクツロナン部分の基本
構造 ポリサッカライドＦのアラビナン部分の基本構造 Ｆ）単離ポリサッカライドの薬理学的作用 今まで物質の免疫刺激作用を検査するための特異的試験
方法は存在しなかったので、単核系の機能状態及び能力
に対する化合物または植物エキスの影響ならびにＴ−リ
ンパ球及びＢ−リンパ球の刺激可能性の測定を可能にす
るような、進歩的なインビトロ及びインビボ方法が今日
まで用いられている。
a)Brandtによる顆粒球テスト ［Brnadt,h.,Scand.J.,Haematol（別巻）２（1967）］ Brandtによる顆粒球テストでは、インビトロ実験におい
てヒト血清から得た顆粒球フラクションによって食細胞
化した酵母細胞数または細菌数を顕微鏡下で測定する。
特定のポリサッカライドフラクションによる食作用増加
％を測定する。
b)免疫刺激性物質の作用を測定するための他のテスト
は、いわゆるカーボンクリアランステストである。この
方法では動物の血液からの炭素粒子除去速度を分光測光
法によって測定する。この除去速度が食作用活性の尺度
である ［Biozzi,G.,Benacerraf,B.,Halpern,B.N.,Br.J.Exp,Pa
thol,34巻，441頁（1953）］。
次の表２では、細胞培養物からのポリサッカライドフラ
クションがマウスの炭素除去に及ぼす影響を示す。
体重を顧慮して、DREWS(115)により修正 免疫学的研究では、顆粒球テストの培地からの１：１沈
澱生成物は１：４沈澱生成物よりも明白に高い食作用速
度を示した。同じ活性の差異が１：１または１：４沈澱
生成物から単離した各成分においても認めることができ
た。
ポリサッカライドＡ エタノールによる１：１沈澱から単離したポリサッカラ
イドＡは１：４沈澱からのポリサッカライドＥに比べ
て、顆粒球テストとカーボンクリアランステストとで一
致して、明白に高い免疫刺激性を示した。
ポリサッカライドＦ ポリサッカライドＦは用いたテスト系において他の被検
アラビノガラクタンと同様に、中程度にのみ活性である
ことが判明したが、ＴＮＦテスト（腫瘍壊死因子テス
ト）では明白な作用を示した。
c)腫瘍細胞に対する直接の細胞毒性に関するマクロファ
ージ活性化は次の文献により測定した：Stimpl,M.,Proksch,A.,Wagner,H.及びLohmann-Matthes,
M.L.,Infection and Immunity 46巻、845頁（1984）。
この実験でポリサッカライドＡは２×105個のマクロフ
ァージにつき６〜50μｇの希釈度までにおいて、２×10
5個のマウス腹腔マクロファージをP 815腫瘍細胞に対す
る完全細胞毒性までに活性化した。
b)ポリサッカライドＦの毒性テスト 試験動物にねずみを用い、その半致死量（L.D.50）を求
めたところ、1000mg／kgであった。
又、ねずみにポリサッカライドＦを投与し、更に４週間
その毒性を試験したが如何なる害も認められなかった。
又、ビーグル犬についても毒性テストを実施したが、１
日当り１〜4mgの投与では何の害も認められなかった。
本発明によるポリサッカライドは、一般には併用投与が
好ましいとしても、純品としてまたは製剤として投与す
ることもできる。特に、次のような組成物としての複合
剤が有利である： (1)本発明によるポリサッカライドを単独または互いに
組合せて含有し、 (2)このために適した一種類以上の結合剤、キャリヤー
及び／または他の助剤、ならびに (3)他の治療的有効物質を任意に含有する組成物 キャリヤ、結合剤及び／または助剤は、組成物または製
剤の他の成分と調和し、被治療生体に不利な影響を与え
ないように、薬剤学的及び薬学的に適合しうるものでな
ければならない。
これらの組成物には、経口投与または非経口投与（皮
下、皮内、筋肉内及び静脈内投与を含める）に適した組
成物を全て含むが、最高に適した投与経路は患者の症状
に依存する。
組成物は一回投与量として存在する。組成物の製造は製
薬界でそれ自体公知の方法を用いて行われる。全ての方
法には、本発明によるポリサッカライド（すなわち、有
効物質）をキャリヤー、結合剤及び／または助剤（これ
らは補助成分である）と混合するか、または一体化する
段階が含まれる。一般に、有効物質に液状キャリヤーも
しくは微粒状キャリヤーまたは両方を密接に混合し、次
に必要な場合には得られた生成物を好ましい投与形態に
することによって、組成物を製造する。経口投与に適し
た本発明による組成物はそれぞれ本発明による有効物質
の所定量を含む、カプセル剤、カシェ剤または錠剤のよ
うな一定量単位として、ならびに粉剤または顆粒剤とし
て、液剤または水性もしくは非水性の懸濁液として、ま
たは流動性水中油滴型乳剤もしくは流動性油中水滴型乳
剤として提供される。
有効物質は巨丸剤またはペースト剤としても存在しう
る。
錠剤は任意に１種類以上の通常の助剤を加えて、プレス
または成形によって製造することができる。
非経口投与に適した組成物は水性媒質または非水性媒質
中の無菌注入溶液、酸化防止剤、緩衝液、細胞増殖抑制
剤及び、ヒト生体を顧慮して組成物を等張性にする溶解
物質を含有する。さらに本発明によるポリサッカライド
は懸濁剤及び増粘剤を含みうる、水性媒質または非水性
媒質中の無菌懸濁液として存在しうる。組成物は例えば
アンプルまたは密封ビンの形態で１回投与量または数回
投与量として存在するか、あるいは凍結乾燥形として保
存して、使用直前に例えば注入用に適した水のような、
無菌の液状キャリヤーを加えて投与することのみが必要
であるようにする。上記種類の無菌の粉剤、顆粒剤及び
錠剤から、使用直前に注入溶液及び懸濁液を調製するこ
とができる。
本発明による製剤は前記成分の他に、いま問題の組成物
に適した他の成分を含有することもできる。従って、例
えば経口ルートで投与されるべき製剤は香料を含有する
ことができる。
投与に適した有効物質量はその都度の治療領域に依存し
て変化する。一般に一回投与組成物の有効物質濃度は全
組成物の５〜95％である。このことは一回投与の場合
に、体重1kgにつき１〜50mgの量に相当する。しかし、
この用量は使用する用途、患者の症状及び治療領域に依
存して広範囲に変動しうる。
【図面の簡単な説明】
図は中性ポリサッカライドと酸性ポリサッカライドとの
工業的分離を図示した工程図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヒルデベルト ヴアーグネル 西ドイツ国 8211 ブライトブルン ヒー ムジー，ネルケンヴエーク (72)発明者 マインハルト ハー・ツエンク 西ドイツ国 8000 ミユンヘン 60，プフ アイフエストルシユトラーセ 17 (72)発明者 ホルゲル オツツ 西ドイツ国 3254 エメルタール １，ビ ユケベルシユトラーセ (72)発明者 ベルント ブリユンメル 西ドイツ国 2083 ハルシユテンベーク, ノイエル ルルーペルヴエーク 33 (56)参考文献 西独国特許出願公開3217214（1983) （ＤＥ，Ａ) Ａｒｚｎｅｉｍ−Ｆｏｒｓｃｈ．／Ｄｒ ｕｇ Ｒｅｓ．，34（▲Ｉ▼），659−661 （1984) Ａｒｚｎｅｉｍ．−Ｆｏｒｓｃｈ．／Ｄ ｒｕｇ Ｒｅｓ．，35（▲ＩＩ▼）．1069 −1075（1985)

Claims (18)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】0.2Ｍリン酸塩緩衝液を用いた場合に平均
    分子量が110,000（範囲：100,000〜120,000）であり、
    次の部分：イ )次式のアラビノガラクタン部分： ロ)次式のラムノグラクツロナン部分： ハ)次式のアラビナン部分： からその基本構造が本質的に構成されることを特徴とす
    る、免疫刺激作用を有するポリサッカライド。
  2. 【請求項２】エキナセアプルプレアまたはエキナセアア
    ングスティフォリアから単離することを特徴とする特許
    請求の範囲第１項に記載のポリサッカライド。
  3. 【請求項３】次の段階、すなわち a)エキナセアプルプレアまたはエキナセアアングスティ
    フォリアの無菌化した幼芽、葉、花、茎又は根部分であ
    る植物系出発物質を出発物質として用い、 b)培地でカルスを形成させ、 c)形成したカルスから細胞懸濁液用の一次細胞をそれ自
    体公知の方法によって得、 d)22〜28℃に12〜20日、好ましくは14日間放置した細胞
    培養物を濾別し、細胞残渣を重量測定のために凍結乾燥
    し、 e)細胞培養物上澄に２〜４倍量、好ましくは３倍量のエ
    タノールを加え、 f)生成した沈殿を遠心分離によって分離し、次に蒸留水
    中に入れ、 g)15％トリクロロ酢酸を7.5％の最終濃度になるまで加
    え、放置し、次に遠心分離し、 h)遠心分離後に得られた上澄に３〜６倍量好ましくは４
    倍量のエタノールを加え、生成した沈殿を12時間の放置
    時間後に遠心分離し、次に２％酢酸ナトリウム溶液中に
    入れ、この溶液を８時間攪拌してから濾過し、 i)濾液に0.5〜1.5倍量、好ましくは１倍量のエタノール
    を加え、12時間放置し、生成した沈殿を遠心分離し、最
    初の量の1/8〜1/10の蒸留水中に入れ、脱イオン水に対
    して２日間透析し、次に凍結乾燥し、 j)最初のアルコール沈殿の上澄に1.5倍量〜2.5倍量、好
    ましくは２倍量のエタノールを加え、溶液を48時間放置
    し、沈殿を遠心分離し、蒸留水に溶かし、溶液を脱イオ
    ン水に対して48時間透析し、次に凍結乾燥すること、 を特徴とする、 0.2Ｍリン酸塩緩衝液を用いた場合に平均分子量が110,0
    00（範囲：100,000〜120,000）であり、次の部分：イ )次式のアラビノガラクタン部分： ロ)次式のラムノグラクツロナン部分： ハ)次式のアラビナン部分： からその基本構造が本質的に構成される免疫刺激作用を
    有するポリサッカライドの製造方法。
  4. 【請求項４】次の段階、すなわち、 a)エキナセアプルプレアまたはエキナセアアングスティ
    フォリアの無菌化した幼芽、葉、花、茎又は根部分であ
    る植物系出発物質を出発物質として用い、 b)培地でカルスを形成させ、 c)形成したカルスから細胞懸濁培養物を濾別し、 d)濾液に２〜４倍量、好ましくは３倍量のエタノールを
    加え、生成する沈殿を最初はデカンテーションによっ
    て、次に遠心分離によって分離し、 e)遠心分離物を水中に溶かし、不溶性成分を遠心分離
    し、上澄に0.5〜1.5倍量、好ましくは１倍量のエタノー
    ルを加え、48時間放置し、 f)生成した沈殿を遠心分離し、次に蒸留水に溶かし、溶
    液を脱イオン水に対して48時間透析し、次に凍結乾燥
    し、 g)最初のエタノール沈殿の上澄に1.5〜2.5倍量、好まし
    くは２倍量のエタノールを加え、12時間放置し、生成し
    た沈殿を遠心分離し、次に蒸留水中に溶かし、脱イオン
    水に対して48時間透析し、次に凍結乾燥すること、 を特徴とする0.2Ｍリン酸塩緩衝液を用いた場合に平均
    分子量が110,000（範囲：100,000〜120,000）であり、
    次の部分：イ )次式のアラビノガラクタン部分： ロ)次式のラムノグラクツロナン部分： ハ)次式のアラビナン部分： からその基本構造が本質的に構成される免疫刺激作用を
    有するポリサッカライドの製造方法。
  5. 【請求項５】エタノールによる１：１沈殿からのポリサ
    ッカライドに対して、 水溶液からの陰イオン交換クロマトグラフィを行い、 溶離剤としてH2Oを用いて、最初のポリサッカライドフ
    ラクションを単離し、 ０〜0.75ＭのNaCl勾配によって他の酸性ポリサッカライ
    ドの溶出を行う、 ことを特徴とする、ポリサッカライドを精製するための
    特許請求の範囲第３項記載の方法。
  6. 【請求項６】エタノールによる１：１沈殿からのポリサ
    ッカライドに対して、 水溶液からの陰イオン交換クロマトグラフィを行い、 溶離剤としてH2Oを用いて、最初のポリサッカライドフ
    ラクションを単離し、 ０〜0.75ＭのNaCl勾配によって他の酸性ポリサッカライ
    ドの溶出を行う、 ことを特徴とする、ポリサッカライドを精製するための
    特許請求の範囲第４項記載の方法。
  7. 【請求項７】１：１沈殿からの中性ポリサッカライドを
    次の精製段階、すなわち ポリサッカライドに対して先ず第一に、溶離剤としてH2
    Oを用いる陰イオン交換クロマトグラフィを行い、 一緒にしたポリサッカライド含有フラクションに対して
    他の陰イオン交換クロマトグラフィを行い、H2Oで溶出
    し、 一緒にしたポリサッカライドフラクションを溶離剤とし
    てH2Oまたは0.2Ｍ NaClを用いてゲルクロマトグラフィ
    によってさらに精製すること、 によって単離することを特徴とする特許請求の範囲第３
    項記載の方法。
  8. 【請求項８】１：１沈殿からの中性ポリサッカライドを
    次の精製段階、すなわち ポリサッカライドに対して先ず第一に、溶離剤としてH2
    Oを用いる陰イオン交換クロマトグラフィを行い、 一緒にしたポリサッカライド含有フラクションに対して
    他の陰イオン交換クロマトグラフィを行い、H2Oで溶出
    し、 一緒にしたポリサッカライドフラクションを溶離剤とし
    てH2Oまたは0.2Ｍ NaClを用いてゲルクロマトグラフィ
    によってさらに精製すること、 によって単離することを特徴とする特許請求の範囲第４
    項記載の方法。
  9. 【請求項９】１：４沈殿からのポリサッカライドを次の
    精製段階、すなわち 先ず第一に陰イオン交換クロマトグラフィによって溶離
    剤としてH2Oを用いて中性ポリサッカライドを分離し、 ０〜0.4ＭのNaCl濃度勾配を用いて酸性ポリサッカライ
    ドを溶出し、 溶離剤として0.2Ｍ NaClまたはH2Oを用いてゲル濾過ク
    ロマトグラフィによって、中性ポリサッカライドをさら
    に精製し、 偶然に存在する中性ポリサッカライドを分離するため
    に、最初にH2Oを用いて、酸性ポリサッカライドに新た
    な陰イオン交換クロマトグラフィを行い、次に０〜0.4
    ＭのNaCl勾配を用いて酸性ポリサッカライドを溶出し、 両ポリサッカライドに対して、溶離剤として0.2Ｍ NaC
    l溶液を用いた新たなゲル濾過クロマトグラフィを行う
    こと、 によって単離することを特徴とする特許請求の範囲第３
    項記載の方法。
  10. 【請求項１０】１：４沈殿からのポリサッカライドを次
    の精製段階、すなわち 先ず第一に陰イオン交換クロマトグラフィによって溶離
    剤としてH2Oを用いて中性ポリサッカライドを分離し、 ０〜0.4ＭのNaCl濃度勾配を用いて酸性ポリサッカライ
    ドを溶出し、 溶離剤として0.2Ｍ NaClまたはH2Oを用いてゲル濾過ク
    ロマトグラフィによって、中性ポリサッカライドをさら
    に精製し、 偶然に存在する中性ポリサッカライドを分離するため
    に、最初にH2Oを用いて、酸性ポリサッカライドに新た
    な陰イオン交換クロマトグラフィを行い、次に０〜0.4
    ＭのNaCl勾配を用いて酸性ポリサッカライドを溶出し、 両ポリサッカライドに対して、溶離剤として0.2Ｍ NaC
    l溶液を用いた新たなゲル濾過クロマトグラフィを行う
    こと、 によって単離することを特徴とする特許請求の範囲第４
    項記載の方法。
  11. 【請求項１１】ポリサッカライドを沈殿させるためにア
    セトン、硫酸アンモニウム、セチルトリメチルアンモニ
    ウムブロミド、Ca2Cl2またはフェーリング溶液を用いる
    ことを特徴とする、特許請求の範囲第３項記載の方法。
  12. 【請求項１２】ポリサッカライドを沈殿させるためにア
    セトン、硫酸アンモニウム、セチルトリメチルアンモニ
    ウムブロミド、Ca2Cl2またはフェーリング溶液を用いる
    ことを特徴とする、特許請求の範囲第４項記載の方法。
  13. 【請求項１３】次の段階、すなわち a)エキナセアプルプレアまたはエキナセアアングスティ
    フォリアの無菌化幼芽、葉、花、茎、又は根部分の植物
    系出発物質を出発物質として用い、これを寒天含有培地
    でカルス形成させ、生成したカルスから細胞懸濁液用の
    一次細胞をそれ自体公知の方法によって得、細胞懸濁培
    養物を22〜28℃において12〜20日、好ましくは14日間放
    置した後に濾別し、細胞残渣を廃棄し、 b)細胞フラグメントまたは蛋白質析出による培地の残留
    濁りを還流分離装置、特にチャンバセパレータまたはト
    レーセパレータにおける清澄化によって除去し、分離し
    た固体を廃棄し、 c)コロイド状溶解成分または高分子化合物（分子量＞10
    6ダルトン）をマイクロ濾過によって除去し、このとき
    に好ましくは孔度≧0.1μｍの管状または毛管状モジュ
    ールのポリスルホン膜または分離限界＞105ダルトンの
    限外濾過膜を用い、 d)予定最少容量に達した場合の保持物を脱イオン水によ
    って透析濾過し、浸透液と透析濾過液を一緒にし、保持
    物を廃棄し、一緒にした浸透液を限外濾過によって濃縮
    し（出発量と装置サイズに応じて濃縮係数10〜500）、
    次に100μｓ／cmより低い導電率に達するまで脱イオン
    水によって透析濾過し、浸透液を捨て、 e)次の段階、すなわち ｅ．１．90〜130℃の温度に加熱し、 ｅ．２．冷却後に沈殿を分離するために濾過もしくは遠
    心分離するか、または ｅ．１．溶液に7.5重量％濃度になるまで、トリクロロ
    酢酸（ＴＣＡ）を加え、 ｅ．２．４℃に少なくとも12時間放置し、 ｅ．３．沈殿を濾過または遠心分離し、 ｅ．４．透明な溶液を導電率＜100μｓ／cmになるまで
    脱イオン水によって透析すること によって濃縮保持物に対して脱蛋白を行い、 f)弱陰イオン交換体における濃縮保持物を中性ポリサッ
    カライド（明細書記載のポリサッカライドＡに相当）を
    得るために、溶離剤として水を用いて溶出し、次に酸性
    ポリサッカライド（ポリサッカライドＦに相当）を得る
    ために０〜４モル液の塩勾配（酢酸ナトリウム、NaCl
    等）によって溶出し、 g)各フラクションを上記e)におけるように任意に脱蛋白
    し、 h)各フラクションに対して、d)におけるように限外濾過
    及び透析濾過を行い、 i)次に生成物を凍結乾燥、真空乾燥または噴霧乾燥によ
    って乾燥させること、 を特徴とする0.2Ｍリン酸塩緩衝液を用いた場合に平均
    分子量が110,000（範囲：100,000〜120,000）であり、
    次の部分：イ )次式のアラビノガラクタン部分： ロ)次式のラムノグラクツロナン部分： ハ)次式のアラビナン部分： からその基本構造が本質的に構成される免疫刺激作用を
    有するポリサッカライドの製造方法。
  14. 【請求項１４】段階e)の蛋白を段階a)に続いて実施する
    ことを特徴とする特許請求の範囲第13項記載の方法。
  15. 【請求項１５】段階d)で分離限界10000ダルトン以下の
    管状、毛管状またはラセン巻き状モジュールのポリスル
    ホンまたはセルロースアセテート製膜を用いることを特
    徴とする、特許請求の範囲第13項記載の方法。
  16. 【請求項１６】段階d)で、透析濾過の代りに、透析また
    はゲル濾過による脱塩を行うことを特徴とする特許請求
    の範囲第13項記載の方法。
  17. 【請求項１７】通常の薬剤学的に適合するキャリアまた
    は助剤の他に、0.2Ｍリン酸塩緩衝液を用いた場合に平
    均分子量が110,000（範囲：100,000〜120,000）であ
    り、次の部分：イ )次式のアラビノガラクタン部分： ロ)次式のラムノグラクツロナン部分： ハ)次式のアラビナン部分： からその基本構造が本質的に構成されるポリサッカライ
    ドを含有することを特徴とする免疫刺激剤。
  18. 【請求項１８】ヒトの治療法においてＴＮＦ（腫瘍壊死
    因子）の活性化及び／または適格細胞からの放出のため
    に用いられることを特徴とする特許請求の範囲第(17)項
    記載の免疫刺激剤。
JP61280949A 1985-11-27 1986-11-27 エキナセアプルプレアまたはエキナセアアングスティフォリアの細胞培養物からの免疫刺激作用性ポリサッカライド、その製造方法及びこれを含む製剤 Expired - Lifetime JPH0645643B2 (ja)

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