DE2633690A1 - Verfahren zur selektiven veresterung der primaeren alkoholfunktionen von diholosiden, die dabei erhaltenen produkte und ihre therapeutische verwendung - Google Patents
Verfahren zur selektiven veresterung der primaeren alkoholfunktionen von diholosiden, die dabei erhaltenen produkte und ihre therapeutische verwendungInfo
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Description
AGElTCE NATIONALE DE VALORISATION DE LA EEOHERGHE (ANVAR)
92 522 Neuilly stir Seine / Frankreich
Verfahren zur selektiven Veresterung der primären Alkoholfunktionen
von Diholosiden, die dabei erhaltenen !Produkte und ihre therapeutische Verwendung
Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur selektiven Veresterung der primären Alkoholfunkiabnen von Diholosiden,
die bei Durchführung dieses Verfahrens erhaltenen Produkte sowie ihre therapeutische Verwendung·
Die biologischen Eigenschaften von bestimmten Estern von Diholosiden und insbesondere des "Cord Factors", des von
Mycobakterienstämmen isolierten toxischen G-lycolipids,
UJL
- UND WECHSEL-BANK MÜNCHEN 324/88.1
der als einer der Hauptfaktoren angesehen wird, die für die Virulenz der Mycobakterien verantwortlich sind und
dessen Struktur von E. Lederer (vgl. "Biochim. Biophys. Acta", 20, 299-309 (1956), und "Festschrift Arthur Stoll",
Seite 384--39A (1957)) als diejenige des 6,6'-Dimycolats
von Trehalose aufgeklärt worden ist, sind der Ausgangspunkt für zahlreiche Forschungsarbeiten, die dem "Cord Factor",
seiner Synthese und derjenigen einiger seiner niederen Homologen gewidmet worden sind·
Der "Cord Factor" zeichnet sich durch seine charakteristische Eigenschaft aus, die Virulenz von geschwächten Tuberkelbazillenstämmen
zu erhöhen: beispielsweise in der Weise, daß mit B.C.G. infizierte Tiere durch subletale Dosen des "Cord
Factas" getötet werden können; darüber hinaus zeichnet sich der "Cord Factor" noch durch die Tatsache aus, daß er die
einzige Lipidfraktion des Tuberkelbazillus darstellt, die toxisch ist.
Zunächst wurde vorgeschlagen, das 6,6'-Dimycolat von Trehalose
durch Veresterung der Trehalose mit einer vorher acetylierten Hydroxy-3-methoxy-x-myeolansäure herzustellen; eine solche
Synthese führt jedoch zu einem Gemisch der 6-Mono-, 6,6'-Di-
und 6,6',2I-Trimycolate von Trehalose, in dem die 6-Mono-
und die. 6,6lf2l-Trimycolate viel weniger aktiv sind als das
6,6'-Dimycolat; man erhält dabei ein Gemisch, dessen Aktivität,
sehr viel geringer ist als diejenige des "Cord Factors", und in dem Maße, wie man das 6,6'-Dimycolat durch Chromatographie
von dem Gemisch abtrennt, werden die erzielten Ausbeuten geringer.
Man hat daher versucht, auf spezifischere Weise das 6,6'-Dimycolat
von Trehalose zu synthetisieren durch Umsetzung eines Ealiummyeolats mit der Ditosyl-6,61-trehalose, die
Ausbeuten an dem6,6'-Mycolat von Trehalose waren jedoch
sehr gering (in der Größenordnung von 1 %) aufgrund der
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Tatsache, daß die geringe Menge des erhaltenen Produktes noch immer durch Stereoisomere verunreinigt war und durch
das Auftreten einer nukleophilen intramolekularen Konkurrenzsubstitution· Es wurde daher ein anderes Verfahren vorgeschlagen,
das darin besteht, daß man Dijod-o^'-hexaacetyl^,?^^1 ,·
31 ,4-'-trehalose mit einem Silbermycolat behandelt, dabei erhält
man jedoch das 6,6'-Dimycolat von Trehalose in ebenso schlechten Ausbeuten wie bei dem weiter oben beschriebenen
Verfahren·
Darüber hinaus haben zwei der Erfinder (Raoul Toubiana und
Marie-Josephe Toubiana) ein Syntheseverfahren weiterentwickelt, bei dem ein niederes Homologes des G^e'-Dimycolats von Trehalose,
d.h. das 6,6f-Dipalmitat von Trehalose, das eine charakteristische
biologische Aktivität aufweist, die analog zu derjenigen des 6,6'-Dimycolats von Trehalose ist, umgeestert wird; dieses
Verfahren, das darin besteht, daß man Methylpalmitat und Trehalose 6 Stunden lang in Gegenwart von Kaliumcarbonat bei
vermindertem Druck oder in Gegenwart von Molekularsieben auf 10O0C erwärmt, führt zu einem Gemisch aus den Tetra-, Tri-,
Di- und Monopalmitaten von Trehalose neben nicht-umgesetzter
x'rehalosec. In dem Maße, wie die Dipalmitate von Trehalose aus
dem Gemisch isoliert werden können, liegen sie in Form eines Isomerengemisches, d.ho der 6,6'-, 6,2- und 2,2'-Dipalmitate
von Trehalose vor, unter denen das 6,6'-Dipalmitat, das allein
eine biologische Aktivität aufweist, die analog zu derjenigen des 6,6f-Dimycolats ist, von den anderen Bestandteilen des
Gemisches praktisch nicht trennbar ist wegen fehlender Selek-" tivität des Umesterungsverfahrens.
Andere Autoren (D.T. Hurst und AoG. Mc Innes, "Canadian
Journal of Chemistry", Band 4-3, 2004-2011 (1965)), deren Arbeiten auf der partiellen Hydrolyse von durch Trimethylsilylgruppen
blockierten Hydroxylgruppierungen beruhten, haben die Herstellung von Methyl^^j^-tri-O-trimethylsilyld-D-glucopyranosid
beschrieben, bei dem es sich um ein Mono-
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holosid handelt, durch bevorzugte Meiaanolyse des das primäre
OH "blockierenden Trimethylsilylrestes in der 6-Stellung
des Derivats von Methyl-a-D-glucopyranosids, in dem alle
OH-Gruppen durch Trimethylsilylgruppen substituiert sind.
Obgleich von diesen Autoren zum Zeitpunkt ihrer Veröffentlichung
die Hypothese aufgestellt wurde, die im übrigen bis heute nicht bestätigt werden konnte, daß das von ihnen vorgeschlagene
Verfahren, das darin bestand, die primäre Alkoholfunktion des genannten Monoholosids, dessen sämtliche primäre
und sekundäre Alkoholfunktionen vorher mit einer Trimethylsilylgruppe
blockiert worden waren, auf jede beliebige polyhydroxylierte Verbindung angewendet werden kann, hat sich
später gezeigt, daß die Anwesenheit von mehr als einer primären Alkoholfunktion, beispielsweise die Multiplikation durch zwei
oder mehr primäre Alkoholfunktionen, die Anwendung dieses Verfahrens schwierig macht und insbesondere dann, wenn man
langkettige Säuren einsetzt, die für ihre mittelmäßige Reaktionsfähigkeit bekannt sind.
Deshalb konnte, obgleich dem "Oord Factor", d.h. dem 6,6'-Dimycolat
von Trehalosef der in spezifischen Fraktionen von
Tuberkulosemycobakterien enthalten ist, eine therapeutische Aktivität und insbesondere eine verkleinernde Wirkung auf
Krebstumoren zugeschrieben werden konnte (vgl. A. Bekierkunst, Ii. Wang, R. Toubiana und E. Lederer, "Infection and Immunity",
Band 10, Nr. 5, Seiten 1044-1050 (1974)) und obgleich bekannt
war, daß bestimmte synthetische Analoga des natürlichen "Cord Factors" eine unterdrückende Wirkung auf das Wachstum
von Tumorzellen bei Mäusen ausüben (vgl. E. Yarkoni, A. Biekerkunst, J. Asselineau, R. Toubiana, M.J. Toubiana und
E. Lederer, "Journal of the Rational Cancer Institute", jjji, ITr. 2, 717-720 (1973)), da es bisher unmöglich war, auf
synthetischem Wege das 6,6'-Dimycolat von Trehalose anders
zu erhalten als verunreinigt durch seine vollständig inaktiven Isomeren (wie z.B. das 2,2I-Dimycolat) und wenig aktiven
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6-Monomycolate und 6,6'-2-TrIBIyC ο late, die therapeutische
Aktivität eines synthetisch reinen 6,6'-Dimycolats von Trehalose und insbesondere diejenige eines synthetisch
reinen 6,6'-Dipalmitats von Trehalose bisher nicht verifiziert
werden.
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren zum selektiven Verestern der primären Alkoholfunktionen
von Diholosiden anzugeben, mit dessen Hilfe es möglich ist, insbesondere die Ester, speziell die langkettigen Ester dieser
Diholoside in reinem Zustand mit ausgezeichneten Ausbeuten herzustellen, welche die Durchführung der Synthese der gewünschten
Diholosidester in industriellem Maßstabe unter wirtschaftlich zufriedenstellenden Bedingungen erlauben·
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum selektiven Verestern der primären Alkoholfunktionen von Diholosiden,
das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine substituierte oder unsubstituierte Fettsäure in Form eines ihrer Halogenide
oder eines ihrer Alkalisalze mit einem Diholosid umsetzt, in dem die sechs sekundären OH-Gruppen silyliert sind und
in dem die beiden primären OH-Gruppen frei sind oder durch eine reaktionsfähige Gruppe, z.B. ein Halogenatom oder eine
analoge Gruppe, substituiert sind9 anschließend die sekundären
OH-Gruppen des veresterten Produktes desilyliert und das erhaltene
Produkt durch Chromatographie reinigt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der
Erfindung wird die Veresterung bei erhöhter Temperatur, vorzugsweise zwischen 65 und 9O0C durchgeführt.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung wird die Veresterung in Gegenwart einer
katalytischen Menge Pyridin durchgeführt·
Erfindungsgemäß werden die in dem Veresterungsverfahren einge-
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setzten Reagentien in stöchiometrischen Mengen eingeführt.
Erfindungsgemäß handelt es sich dann, wenn zum Verestern der
primären Hydroxylgruppen der Trehalose eine Fettsäure verwendet wird, dabei um eine substituierte Säure und sie wird
zweckmäßig unter den Fettsäuren ausgewählt, die eine oder mehrere Hydroxylgruppen aufweisen·
Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung wird eine solche substituierte Fettsäure unter den
ß-hydroxylierten Fettsäuren ausgewählte
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens
der Erfindung geht der Veresterungsstufe eine chromatographische Reinigung des hexasilylierten Diholosids an einer
Säule voraus, das anschließend verestert wirdo
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung ist die Chromatographiesäule mit Silicagel gefüllt, das durch
Neutralisation durch Waschen mit Wasser und anschließendes Reaktivieren durch 1 /2 - bis 1 -stündiges Erhitzen auf
1200C modifiziert worden ist.
Gemäß einer anderen vorteilhaften Ausfuhrungsform der Erfindung
wird das Silicagel in einer Menge verwendet, die nicht mehr als dem 20-fachen des Gewichtes des zu chromatographierenden
Produktes entsprichto
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens der Erfindung wird das in 6,6'-Stellung dihalogenierte Hexamethylsilyldiholosid,
das verestert worden ist, erhalten durch Desacetylierung des als Ausgangsmaterial verwendeten
2,2l,3,3'-4-,4l-Hexaacetyl-6,6l-dihalogen-diholosids und anschließende
Methylsiljrlierung des durch Desacetylierung der Ausgangsverbindung erhaltenen 2,2*,3,3',4,4-' -Hexahydroxy-
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6,6'-dihalogen-6,6'-didesoxy-diholosids·
Bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erhält man reine Diholosidester und insbesondere symmetrische 6,6'-Diholosidester,
speziell das a-D-Trehalose-6,6'-dipalmitat$
dessen Schmelzpunkt 154· bis 1580G beträgt, und das a-D-iDrehalose-6,6f-dimycolat,
dessen Schmelzpunkt 40 bis 44°C beträgt o
Das einen Gegenstand der vorliegenden Erfindung bildende
erfindungsgemäße Verfahren umfaßt zweckmäßig die folgenden
Stufen:
Erfindungsgemäß kann die Hexatrimethylsilylierung eines
Diholosids nach einem der beiden nachfolgend beschriebenen
Verfahren durchgeführt werden:
A) Herstellung eines 2,2' ,3,5' ,4-,4'-Hexa(trimethylsilyl)-öl-6,6'-a,a~diholosids
durch direkte Silylierung eines Diholosids __»__-_________
1.) Herstellung eines 2,2' ,3,3f ,4-,4' ,6,6'-0cta(trimethylsilyl)-ajLa-diholosids
Man läßt ein handelsübliches Diholosid, zweckmäßig gelöst in
Pyridin, 12 Stunden lang bei "umgebungstemperatur mit Trimethylsilylchlorid
und Hexamethyldisilazan reagieren, danach entfernt man das Lösungsmittel unter Vakuum, senkt die Temperatur
auf O0C, extrahiert dann in Gegenwart von Eis das dabei
erhaltene Produkt mit einem geeigneten Lösungsmittel, wie Z0B0
Hexan, und trocknet es«.
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2.) Herstellung eines 2,2' ,3,3' ,^'-HexaCtrimethylsilyl)-α,α-diholosids
Das in der obigen Stufe (1) erhaltene 2,2' ,3,3' ,4-,4· ,6,6'-Octa(trimethylsilyl)-oc,a-diholosid
wird anschließend auf selektive Weise an den primären OH-Gruppen durch Kaliumcarbonat
in methanolischer Lösung mehrere Stunden lang bei einer Temperatur
von etwa O0C desilyliert und anschließend mit Essigsäure
neutralisiert· Mach dem Extrahieren mit einem geeigneten Lösungsmittel, wie z.B. Hexan, wird die an den primären
Alkoholfunktionen selektiv desilylierte Verbindung getrocknet, beispielsweise über Magnesiumsulfat,
3.) Reinigung durch Chromatographie
Vor der Veresterung des Diholosids, dessen reaktionsfähige
Gruppen mit Ausnahme derjenigen, die verestert werden sollen, durch Silylierung blockiert worden sind, wird dieses gereinigt,
um die Spezifität für das Endprodukt noch zu verbessern. Diese Reinigung erfolgt durch Chromatographieren an einer Säule,
die mit einem speziell behandelten Adsorptionsmittel, wie Z0B.
einem Silicagel (z.B. Merck, Teilchengröße 0,063 mm), das durch Waschen mit Wasser (und anschließendes Absaugen) vollständig
neutralisiert und ^nach 1 Stunde lang bei 1200C reaktiviert
worden ist, gefüllt ist. Das Adsorptionsmittel liegt in der Säule in einer Menge vor, die so berechnet ist, daß sie
höchstens dem 20-fachen des Gewichtes des zu chromatographierenden
Produktes entspricht und die Dauer der Chromatographie herabgesetzt wird.
Während man es bisher als unmöglich angesehen hatte, Verbindungen
zu Chromatographieren, die Silylschutzgruppen tragen, weil unter den üblichen Betriebsbedingungen die OH-Gruppen
regeneriert werden, ist es als Folge der mit dem Adsorptionsmittel durchgeführten Behandlung in Verbindung mit den einge-
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setzten Mengen des Adsorptionsmittels möglich, die chromatographische
Reinigung der Hexamethylsilylverbindung durchzuführen,
ohne daß eine Desilylierung auftritt„
B) Herstellung eines in ö^'-Stellung halogenieren 2,2",3,3',-4,4l-Hexa(trimethylsilyl)-a,a-diholosids
durch Silylierung eines 2,2',3,3' ,4,4'-Hexaacyl-6,6'-dihalogen-6,6'-didesoxy-α,α-diholosids
1.) Desacylierung eines 2,2*,3>3',4,4'-Hexaaeyl-6,6'-dihalogen-
Ein 2,21,3,3',4,4-'-Hexaacyl-6,6·-dihalogen-6,6'-didesoxy-a,adiholosid
(die Herstellung der 2,2' ,3,3' ,4,4'-Hexaacetylöiö'-dibrom-öjö'-didesoxy-ajcc-tetrahalose
ist von S. Hanessian, M.M. Pompidom und P. LavallSe in "Garbohy. Res.", 24, 45 (1972),
beschrieben), gelöst beispielsweise in Methanol^ wird etwa 2 Stunden lang bei Umgebungstemperatur mit Natriummethylat
behandelt, dann wird die Lösung mit einem basischen anionischen Ionenaustauscherharz (wie es z.B. von der Firma Dow Chemical
unter der Bezeichnung "DOWEX" 50 W χ 4200.400 mesh (Teilchengröße
0,035 mm) vertrieben wirdVund bis zur Trockne eingeengte Bei dem dabei erhaltenen 2,2',3,3',4,4'-Hexahydroxy-6,6·-
dihalogen-6,61-didesoxy-a,a-diholosid handelt es sich um einen
pulverförmigen Feststoff·
2.) Silylierung des 2,2' ,3,3' ^^'
Man erhält das 2,2S3,3'S^»^'
gen-6,61-didesoxy-a,a-diholosid dadurch, daß man das 2,2', 3,3',4,4'-Hexahydroxy-6,6*-dihalogen-6,6'-didesoxy-a,adiholosid etwa 12 Stunden, lang bei Umgebungstemperatur mit Trimethylsilylchlorid, gelöst in Pyridin, in Gegenwart von Hexamethylsilazan behandelt«
gen-6,61-didesoxy-a,a-diholosid dadurch, daß man das 2,2', 3,3',4,4'-Hexahydroxy-6,6*-dihalogen-6,6'-didesoxy-a,adiholosid etwa 12 Stunden, lang bei Umgebungstemperatur mit Trimethylsilylchlorid, gelöst in Pyridin, in Gegenwart von Hexamethylsilazan behandelt«
*;neutralisiert
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IIo Veresterung des gegebenenfalls halogenierten Hexatrimethyldiholosdds
Die Umsetzung der Fettsäure in Form ihres Chlorids oder in Form eines ihrer Alkalisalze mit 2,2' ,3j3' ,^-,^-'-HeXatrimethylsilyl-diholosid,
das zwei freie primäre Hydroxylgruppen oder zwei Halogenatome in der 6,6'-Stellung aufweist, erfolgt durch
2- bis 5-stündiges Erwärmen auf eine Temperatur zwischen 65 und 90°G in. einem Lösungsmittel, wie z.B. Benzol oder Hexamethylphosphortriamid,
vorzugsweise in Gegenwart einer katalytischen Menge Pyridin, das im Falle der Durchführung der Veresterung
mit einem Fettsäurechlorid das Chlorid wegfängt unter Freisetzung der -CO-Gruppe des Fettsäureresteso Die Fettsäure
und das Diholosid werden in stöchiometrischen Mengen eingesetzt,
Es sei darauf hingewiesen, daß eine direkte selektive Veresterung
eines Diholosids mit einem Säureehlorid bisher als unmöglich angesehen wurde, da die Veresterung mit einem Säureehlorid
keine Selektivität versprach, während es nun aber durch, vorherige Einführung von Trimethylsilyl-Schutzgruppen möglich,
ist, die gewünschte selektive Veresterung in der 6,6'-Stellung durchzuführen·
Wenn man jedoch, eine Fettsäure verwendet, die durch eine reaktionsfähige
Gruppe, wie z.B. eine Hydroxylgruppe, ersetzt ist, hat man den Vorteil, daß man sie in Form eines ihrer Alkalisalze,
insbesondere in Form ihres Natriumsalzes, verwenden
kann, das man mit dem in 6,6'-Stellung dihalogenierten Hexatrimethylsilyldiholosids
reagieren lassen kann, wobei die Veresterungsreaktion, die in der 6,6'-Stellung selektiv ist,
von der Bildung eines Alkalihalogenide begleitet iste
IHe Desilylierung des Hexatrimethylsilyldiesters des Diholo-
£ids
Die Desilylierung wird durch etwa 2-stündiges Erwärmen etwa
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bei Rückflußtemperatur in Gegenwart einer Mischung von Methanol und Wasser oder von Methanol, Benzol und Wasser
durchgeführt o
IVo Reinigung durch Chromatographie
Die erhaltene Verbindung wird durch Chromatographie an einer Adsorptionsmxttelsaule, wie ζ·Β· Silicagel der Firma Merck
teilchengröße 0,063 mm), durchgeführt, wobei der Chromatographie
gegebenenfalls eine Filtrierung über ein geeignetes Absorptionsmittel vorangeht» Auf diese Weise erhält man ein reines Produkt,
das keine Verunreinigung durch Isomere enthält, mit zufriedenstellenden Ausbeuten in der Größenordnung von 50
bis 70 %, dessen biologische und therapeutische Aktivitäten
durch die Anwesenheit von verunreinigenden Agentien nicht verändert werden.
Außer den vorstehend beschriebenen Merkmalen umfaßt die Erfindung
noch andere Merkmale, die aus der folgenden Beschreibung hervorgehen.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere neue Verfahren zur selektiven Veresterung der primären Alkoholfunktionen
von Diholosiden unter Anwendung der vorstehend beschriebenen Verfahrensmaßnahmen sowie der zu ihrer Verwendung geeigneten
Mittel und die bei diesen Verfahren erhaltenen Produkte sowie die für die Verwendung dieser Produkte geeigneten Mittel.
Die Erfindung wird durch die nachfolgende Beschreibung von Beispielen zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens
näher erläuterto Es sei jedoch darauf hingewiesen, daß diese
Beispiele und die entsprechenden beschreibenden Abschnitte nur der Erläuterung der Erfindung dienen, daß diese jedoch
keineswegs darauf beschränkt ist.
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Beispiel 1 *
1«) Herstellung von 2,3,4-,6,2· ,3' ,4-' ,6f-0cta(trimethylsilyl)-α,α-trehalose
Zu 1 g handelsüblichem Trehalosedihydrat C12H22O11^H2O,
wie es von der Firma Societe Fluka vertrieben wird, gelöst in
100 ecm frisch destilliertem Pyridin, gibt man 20 ecm Trimethylsilylchlorid
und 40 ecm Hexamethyldisalazan, wie sie von der Firma Societe Pierce vertrieben werden, zu. Nach einer
Nacht bei Umgebungstemperatur wird das Lösungsmittel unter ölpumpenvakuum entfernt, anschließend wird Eis zugegeben und
das Produkt wird zweimal mit Hexan extrahierte Nach dem !Trocknen über Magnesiumsulfat wird das Lösungsmittel eingedampft
und die letzten Spuren Pyridin werden unter Ölpumpenvakuum entfernt« Dabei erhält man 2,1 g Substanz, die sofort
kristallisierte Nach der Kristallisation in Methanol hat die gewünschte Verbindung die folgenden physikalischen Konstanten:
C36H86°11Si8
F: 80 - 82°C
[alp - + 95° (c = 1, CHCl3)
Massenspektrum: (M+) m/e = 918
Oxoniumion: m/e = 4-51
Element ar analyse für
ber.: C 4-7,01 H 9,4-3
gef.: 4-6,91 9,29 %
gef.: 4-6,91 9,29 %
2o) Herstellung von 2,3,4-,2' ,3* ,4-'-Hexa(trimethylsilyl)-
Zu 660 mg der in der obigen Stufe 1 erhaltenen Verbindung, gelöst in 22 ecm Methanol gibt man 22 ecm einer methanolischen
Lösung von Kaliumcarbonat (4-,5 g/l) zu. Die Heaktions
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mischung wird 2 Stunden lang (mit einem Eis/Salz-Gemisch) bei O0G gehalten, dann mit 2 ecm Essigsäure neutralisiert·
Das Methanol wird unter Wasserstrahlpumpenvakuum entfernt, es wird Eis zugegeben und das Produkt wird zweimal mit Hexan
extrahiert, anschließend über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wird eingedampft und man erhält 550 mg
Substanz, die sofort kristallisiert·
3.) Reinigung der Hexatrimethylsilylverbindung durch Chromatographie
Die Ohromatographie wird an Silicagel der Firma Merck (Teilchengröße
0,063 mm) durchgeführt, das vorher mit destilliertem Wasser gewaschen worden ist, um jede Spur restlicher technischer
Säure zu entfernen, und anschließend eine Stunde lang bei 1200O reaktivierte In dem gleichen Sinne und unter Berücksichtigung
der Hydrolyserisiken, die bei einem längeren Kontakt mit dem Adsorptionsmittel auftreten können, wird die
Ohromatographie schnell durchgeführt.
Sie wird an einer behandelten Silicagelkolonne mit 300mg Produkt auf 6 g Silicagel (dem 20-fachen des Gewichts des
zu chromatographierenden Produktes) durchgeführte Die Vorläufe werden alle 20 ecm abgenommen«, Das Produkt tritt in
den Fraktionen 10, 11 und 12 aus, Die Fraktionen 10, 11 und
12 (253 mg, Ausbeute 90 %) die in einer dünnen Schicht homogen sind (Entwicklungslösungsmittel? Hexan/Äther =
70/30) werden vereinigt und in Methanol kristallisiert. Dabei erhält man die folgenden physikalischen Konstantens
C3OH7O°11Si6
F. 115-1180O
°
F. 115-1180O
°
Ca]D = + 100° (c = 1, 5
Massenspektrum: (M+) m/e = 774-Oxoniumion: m/e = 379
Elementaranalyse für ^g^
beroi C 46947 H 9,10
gef.: 46,52 9,03 %
Massenspektrum: (M+) m/e = 774-Oxoniumion: m/e = 379
Elementaranalyse für ^g^
beroi C 46947 H 9,10
gef.: 46,52 9,03 %
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4.) Herstellung der 6i6l-I)ipalmito2;l-ajta-trehalos_e_
Die Umsetzung von Palmitoylchlorid mit der obigen Verbindung
führt zur 2,3,4,2·,3',4'-Hexa(trimethylsilyl)-6,6'-dipalmitoyl-α,α-trehalose,
die nicht charakterisiert wurde·
Die Hydrolysereaktion der restlichen Trimethylsilylgruppen
wird sofort anschließend unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: zu 270 mg der oben erhaltenen Verbindung,
gelöst in 5 ecm Benzol und 0,5 ecm Pyridin, gibt man 216
mg handelsübliches Palmitoylchlorid (Pluka), gelöst in 2 ecm
wasserfreiem Benzol, zu. Die Lösung wird anschließend 2 1/2 Stunden lang auf 80°C erwärmt. Nach dem Eliminieren des Lösungsmittels
unter Vakuum erhält man eine Lösung des Produkts in 0,30 ecm Methanol, dem man 3 ecm Wasser zusetzt,und man
bringt 2 Stunden lang zum Sieden. Das wäßrige Methanol wird unter Vakuum entfernt und das dabei erhaltene Produkt wird
durch Chromatographie an einer Silicagelsäule (Davison 100/200, vertrieben von der Firma Societe Touzart und
und Matignon) gereinigt. Die Chromatographie wird an einer Silieagelsäule mit 200 mg Produkt auf 7,5 S Silicagel
durchgeführt 0
Die Vorläufe werden alle 20 ecm abgenommene Das Produkt tritt
in den Fraktionen 17 bis 31 aus. Die in einer dünnen Schicht
homogenen Fraktionen 17 bis 31 (Entwicklungslösungsmittel:
Methanol/GHClj/Benzol/Wasser = 6/20/20/6 Tropfen) werden miteinander
vereinigt (170 mg, Ausbeute 58 %) und in absolutem
Methanol kristallisiert. Die physikalischen Konstanten der 6,6f-Dipalmitoyl-(x,a-trehalose sind folgende:
°44H82°13 | 158C | JC |
F. 154 - | 80° | ( c |
[a]D = + | ||
= 1,
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Massenspektrum der Hexaacetylverbindung: (M+) m/e = IO7O
Oxoniumion: m/e = 527
Element ar analyse für Cc-glU^O^q:
ber.: C 62,76 H 8,85
gef.: 62,87 8,87 %·
Die Fraktion 32, die eine Mischung des Dipalmitoylderivats
und des Monopalmitoylderivats (80 mg) darstellt, kann erneut chromatographiert werden und man erhält dabei 30 mg zusätzliches
Dipalmitoylprodukto
_(Stamm_Brevanne)_
Die Extraktion und Reinigung der Mycolsäure sind in der Literatur beschrieben, wie nachfolgend kurz zusammengefaßt:
Mycolsäure wird erhalten durch Verseifung der Wachse C des
Tuberkelbazillus (bezüglich der Nomenklatur der Wachse des Tuberkelbazillus und des Verlaufs der Verseifung vglo
A.H. Ethemadi, These 1965).
Zur Gewinnung einer in einer dünnen Schicht homogenen Säure ist eine Reihe von drei Chromatographien erforderliche Die
massenspektrometrische Analyse zeigt, daß es sich dabei um ein Homologengemisch handelt, wahrscheinlich von C™ bis
Cqq, von denen das wichtigste die Cg^-Verbindung zu sein
scheint, das aber alle drei Sauerstoffatome aufweist, wobei das hauptsächliche Homologe die folgende Formel hat:
CH,- ( CH0 ) Λ Q-CH-CH- ( CH0 ),,. -CH-CH- ( CH0 ) Λ „-CH-CH-COOH
CHp CHp OH
709807/ 1019
F. 55 - 570C
Ca]Jf = + 2,8° 5
2.) Herstellung dej^ Natriummy_coljits
Zu einer Lösung von 150 mg Mycolsäure in 2 ecm Chloroform
und einem Tropfen Phenolphthalein gibt man 1,35 ecm einer
methanolischen 0,85 b- NaOH-Lösung zu (Umschlag des Phenolphthaleins).
Nach einer Nacht im Kühlschrank wird der gebildete Niederschlag abgesaugt und man erhält 80 mg Natriummycolat.
3.) Herstellung von 2,2%3,3S4,4'--Hexatrimethylsilyl-6,6I-
Die Herstellung dieser Verbindung erfolgt in drei Stufen,
die nachfolgend beschrieben werden:
3.1: Herstellung der 2,2' ,3,3' ,^,V-
Die Herstellung dieser Verbindung, <fte der nachfolgend angege
benen Formel entspricht:
CH2Br OAO
OAC
OAC
ist in der Literatur beschrieben (vgl. S. Hanessian, M.M.
Pompidom und P. Lavallee, "Carbohyd. Res.", 24, 45 (1972)).
3.2: Desa£etylierung der Verbindung_der_Pormel I
Herstellung von 2,2',3,3',4,4l-Hexahydroxy-6,6l-dibrom-6,6'-didesoxy-a-trehalose
der nachfolgend angegebenen
Formel_II
7 0 9 8 0 7/1019
II
Zu 100 mg der Verbindung der Formel I, gelöst in 10 ecm
wasserfreiem Methanol, gibt man 10 Tropfen einer Natriummet
hylat lösung (140 mg Natrium in 10 ecm wasserfreiem Methanol)
zu und läßt 2 Stunden lang "bei Umgebungstemperatur stehen. Die Lösung wird anschließend mit "Dowex" 50 W χ 4 200.400 mesh
(80 mg) neutralisiert, filtriert und das 3?iltrat wird bis zur Trockne eingedampft. Dabei erhält man 80 mg eines pulverförmigen
Feststoffes, der so wie er ist ohne weitere Reinigung behandelt wird.
3.3: Sil.ylie_rung der Verbindung_d£r_Formel II__
Herstellung von 2,(2' ,3,3' ,4,4'-Hexatrimethylsilyl-6,6!
dibrom-6,6'-didesoxy-a-trehalose der nachfolgend auge=
gebenen Formel ΙΙΙ__
CH2Br
III
R = - Si
Die Verbindung der Formel II (80 mg), gelöst in 5 ecm einer
Lösung von Trimethylsilylchlorid und Eexadimethylsilazan in Pyridin>wird eine Nacht lang bei Umgebungstemperatur
stehen gelassen. Nach Zugabe von Eis wird das Produkt mit Hexan extrahierte Nach dem Trocknen über Magnesiumsulfat wird
das Lösungsmittel abgedampft und die letzten Spuren Pyridin werden unter Ölpumpenvakuum entfernt. Dabei erhält man 110 mg
Substanz, die sofort kristallisieren. Nach der Kristallisation in Methanol hat die Verbindung (quantitative Ausbeute)
die folgenden physikalischen Konstanten:
709807/1019
C30H66°9Br2Si6
F. 140-142°C
D
F. 140-142°C
D
Ca]1, » + 95° (ο - 1, CHClx)
Massenspektrum: (M+0) m/e 998
Oxoniumion: m/e 441
Elementaranalyse für C^0Hg6OqBrpSig
ber.: C 40,07 H 7,40 Br 17,77 gef.: 39,90 7,35 17,50%
Elementaranalyse für C^0Hg6OqBrpSig
ber.: C 40,07 H 7,40 Br 17,77 gef.: 39,90 7,35 17,50%
4.) Vere£terung der Verbmdung_der_Formel III
myc
Eine Lösung von 80 mg Natrium/οlat in 1 ecm Hexamethylphosphortriamid (HMPA), das über Lithiumaluminiumhydrid (LiAlH2.) destilliert worden ist, wird in einem Ölbad auf 700C gebracht. Zu dieser Lösung, die schnell trübe wird, tropft man 30 mg der Verbindung III, gelöst in 0,5 ecm HMPA zu„ Fach der Zugabe der Verbindung III, die etwa 1 Stunde dauert, setzt man die Erwärmung 3 Stunden lang fort. Man extrahiert mit Äther und gibt anschließend Eis zu.
Eine Lösung von 80 mg Natrium/οlat in 1 ecm Hexamethylphosphortriamid (HMPA), das über Lithiumaluminiumhydrid (LiAlH2.) destilliert worden ist, wird in einem Ölbad auf 700C gebracht. Zu dieser Lösung, die schnell trübe wird, tropft man 30 mg der Verbindung III, gelöst in 0,5 ecm HMPA zu„ Fach der Zugabe der Verbindung III, die etwa 1 Stunde dauert, setzt man die Erwärmung 3 Stunden lang fort. Man extrahiert mit Äther und gibt anschließend Eis zu.
5o) Desilylierung von 2,2' ,3,3' ,4-,41 -Hexatrimethylsilyl-
Der Ätherextrakt wird anschließend (2 Stunden lang bei Rückflußtemperatur
in Gegenwart von 10 ecm Methanol, 10 ecm Benzol und 0,5 ecm Wasser) desilyliert. Das Lösungsmittel wird
danach unter Vakuum entfernte
6.) Reinigung des; Tr£hal£sedimveolats
Man filtriert über 2 g Silicagel (Davison 100/200, Touzart
und Matignon). Die erste HexaasLution (70 mg) wird erneut gereinigt»
Man ehromatographiert an 3 g Silicagel (Merck, Teilchengröße 0,063 mm)ο Das Produkt wird mit Chloroform eluiert, dem 0,6 %
Methanol zugesetzt worden sind« Dabei erhält man 35 mg eines
709807/101 9
in dünner Schicht homogenen amorphen Produkts (Ausbeute 33 %)
mit dem gleichen Rf-Wert wie der natürliche ^Gord Factor".
Nach dem Auflösen in üther und nach der Zugabe von Methanol
entsteht ein Niederschlag, der zentrifugiert und dann von seiner Mutterlauge dekantiert wird· Nach dem Trocknen im
EsdJckator liegt der erhaltene synthetische "Cord Factor" in
Form eines weißen Pulvers vor·
C180H346°15
F. 400C
Ca]J0 - + 28°
Elementaranalyse für ci80H34-6°15 ^i ^0 CH2^:
ber.: C 78,59 H 12,68
gef.i 78,05 12,50%
Aus der vorstehenden Beschreibung geht hervor, daß unabhängig von der angewendeten Art der Durchführung die unter Anwendung
des erfindungsgemäßen Verfahrens erhaltenen Diholosiddiester reine Produkte darstellen, die eine zusätzliche (hilfreiche)
Aktivität und insbesondere eine ausgeprägtere immunotherapeutische Aktivität aufweisen, wie sie bei den nach den bisher
bekannten Verfahren erhaltenen Syntheseprodukten nicht auftrat,
Die Erfindung wurde zwar vorstehend unter Bezugnahme auf bevorzugte
Ausführungsformen näher erläutert, es ist Jedoch selbstverständlich, daß sie darauf keineswegs beschränkt ist,
sondern daß diese in vielfacher Hinsicht abgeändert und modifiziert
werden können, ohne daß dadurch der Rahmen der vorliegenden Erfindung verlassen wird.
Patentansprüche:
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Claims (1)
- Patentansprüche( Λ») Verfahren zur selektiven Veresterung der primären lÖJcoholfunktionen von Diholosiden, dadurch gekennzeichnet, daß man eine substituierte oder unsubstituierte Fettsäure in Form eines ihrer Halogenide oder eines ihrer Alkalisalze mit einem Diholosid umsetzt, in dem die sechs sekundären OH-Gruppen silyliert sind und in dem die beiden primären OH-Gruppen frei oder durch eine reaktionsfähige Gruppe, wie z.B. ein Halogenatom oder einen analogen Best, substituiert sind, daß man anschließend die sekundären OH-Gruppen des veresterten Produktes desilyliert und das erhaltene Produkt durch Chromatographie reinigt.2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Veresterung bei erhöhter Temperatur, vorzugsweise zwischen 65 und 900C,durchführt.3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Veresterung in Gegenwart einer katalytischen Menge Pyridin durchführt.4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die für die Veresterung verwendeten Reagentien in stochiometrischen Mengen einführte5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Fettsäure, die zum Verestern der primären Hydroxylgruppen des Diholosids eingesetzt wird, eine substituierte Säure verwendet, die ausgewählt wird aus den Fettsäuren, die eine oder mehrere Hydroxylgruppen tragen.6. Verfahren nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet, daß man die substituierte Fettsäure unter den ß-hydroxylierten Fettsäuren auswählt«709807/10197. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man vor Durchführung der Veresterung das Hexasilyldiholosid einer chromatographischen Reinigung an einer Säule unterzieht, "bevor man es danach veresterte8, Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Chromatographiesäule verwendet, die mit SiIicagel gefüllt ist, das durch Neutralisation durch Waschen mit Wasser, anschließende Reaktivierung durch 1/2- bis 1-stündiges Erwärmen auf 1200O und gegebenenfalls nachfolgende partielle Desaktivierung durch Rehydratation modifiziert worden ist.9o Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man das Silicagel in einer Menge verwendet, die nicht mehr als dem 20-fachen des Gewichtes des zu chromatographierenden Pro dukt e s ent sp ric ht „1Oo Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das in 6,6'-Stellung dihalogenierte Hexamethylsilyldiholosid, das verestert wird, hergestellt worden ist durch Desacetylierung des als Ausgangsmaterial verwendeten 2,2' ,3,3' »4-»4'~ Hexaalkyl-6,6'-dihalogen-diholosids und anschließende Methylsilylierung des 2,2' ,3i3 ' ^,V-Hexahydroxy-G^-dihalogen-6,6'-didesoxy-diholosids, das d^irch Desalkylierung der dabei erhaltenen Verbindung hergestellt worden ist.11. Reine, mit einer Fettsäure veresterte Diholoside, dadurch gekennzeichnet, daß sie nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10 hergestellt worden sind·12. Verbindung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es sich dabei um die reine 6,6'-Dipalmitoyl-ouD-trehalose mit einem Schmelzpunkt von 154· bis 1580C handelt.7 09807/10 1913» Verbindung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es sich dabei um die reine synthetische 6,6'-Dimycoloyla-D-trehalose mit einem Schmelzpunkt von 40 bis 44° C handelt,didesoxy-a,a-diholosid als Ausgangsprodukt für die Synthese der a,a-Diholosid-6,6'-diester.15. 2,2« ,3,3' ,4,4-'-Hexatrimethylsilyl-6,6'-dialkyl-6,6»- didesoxy-a,oc-diholosid als Ausgangsprodukt für die Synthese der a,a-Diholosid-6,6'-diester.16. 2,2',3,3',^j^'-sid als Ausgangsprodukt für die Synthese der α,α-Diholosid-6,6'-diester.17o 2,2' ,3,3* »4-,4' ,6,6'-0cta(trimethylsilyl)-a,a-diholosid als Ausgangsprodukt für die Synthese der a,a-Diholosid-6,6'-diester.18« 2,2' ,3,3' ,4-,4-' ,6,6'-0cta(trimethylsilyl)-a,a-trehalose als Ausgangsprodukt für die Synthese der 6,6'-Dipalmitoyla-D-trehalose·19. 2,2' ,3,3' ,^^'-trehalose als Ausgangsprodukt für die Synthese der 6,6'-dipalmitoyl-a-D-trehalose.20. 2,2',3,3',4,4'-Hexa(trimethylsilyl)-6,6l-dibrom-6,6l didesoxy-oc-trehalose als Ausgangsprodukt für die Synthese der 6,6'-dimycoloyl-a-D-trehalose.21. 2,2',3,3',4,4'-Hexa(trimethylsilyl)-6,6'-dipalmitoyl a-trehalose als Ausgangsprodukt für die Synthese der 6,6'-Dipalmitoyl-a-D-trehalose·709807/101922. 2,2',3,3*,4,4l-Hexa(trimethylsilyl)-6,6I-dimycoloyl-α-trehalose als Ausgangsprodukt für die Synthese der 6,6'-Dimycoloyl-a-D-trehalose. ; .23· Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, daß es aus der reinen e^'-Dipalmitoyl-a-D-trehalose gemäß Anspruch 12 besteht·24. Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, daß es aus der' reinen synthetischen 6t6l-Dimycoloyl-a-D-trehalose gemäß Anspruch 13 besteht«25. Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, daß es als aktive Bestandteile mindestens eine der Verbindungen nach mindestens einem der Ansprüche 11 bis 13 enthält.709807/1019
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR7523578A FR2319373A1 (fr) | 1975-07-29 | 1975-07-29 | Nouveau procede d'esterification selective des fonctions alcool primaire de diholosides et produits ainsi obtenus |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
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DE2633690A1 true DE2633690A1 (de) | 1977-02-17 |
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ID=9158463
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19762633690 Withdrawn DE2633690A1 (de) | 1975-07-29 | 1976-07-27 | Verfahren zur selektiven veresterung der primaeren alkoholfunktionen von diholosiden, die dabei erhaltenen produkte und ihre therapeutische verwendung |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
BE (1) | BE844272A (de) |
DE (1) | DE2633690A1 (de) |
FR (1) | FR2319373A1 (de) |
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DE3315264A1 (de) * | 1982-04-29 | 1983-12-01 | Ribi Immunochem Research, Inc.,, 59840 Hamilton, Mont. | Verfahren zur reinigung von rohen trehalosedimycolaten |
EP0356154A2 (de) * | 1988-08-26 | 1990-02-28 | Sawai Pharmaceutical Co., Ltd. | Trehalosderivate |
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JPS533514A (en) * | 1976-06-25 | 1978-01-13 | Ichirou Azuma | Adjuvant containing sugarlipid as effective component |
US4574058A (en) * | 1978-02-24 | 1986-03-04 | Ciba-Geigy Corporation | Antigen derivatives and processes for their preparation |
HU186585B (en) * | 1978-05-18 | 1985-08-28 | Ciba Geigy Ag | Process for producing new muramil-peptide derivatives |
FR2477551A1 (fr) * | 1980-03-10 | 1981-09-11 | Anvar | Nouveaux derives de l'a, a'-trehalose et medicaments les contenant |
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GB2133399B (en) * | 1982-10-08 | 1985-08-07 | Ss Pharmaceutical Co | A,a-trehalose-6,6'-middle chained aliphatic acid diester and a pharmaceutical agent containing the same |
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CH77A (de) * | 1889-01-09 | Christian Herren | Wurzelschneidmaschine | |
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-
1975
- 1975-07-29 FR FR7523578A patent/FR2319373A1/fr active Granted
-
1976
- 1976-07-19 BE BE1007514A patent/BE844272A/xx unknown
- 1976-07-27 DE DE19762633690 patent/DE2633690A1/de not_active Withdrawn
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US5049664A (en) * | 1988-08-26 | 1991-09-17 | Sawai Pharmaceutical Co., Ltd. | Trehalose derivatives |
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Also Published As
Publication number | Publication date |
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FR2319373A1 (fr) | 1977-02-25 |
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