JP2022542032A - 治療用ウイルスワクチン - Google Patents
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Abstract
本発明は、対象においてウイルス感染、特にヘルペスウイルス感染を治療するためのウイルスFc受容体又はその免疫原性断片に関する。本発明はまた、治療での使用のための、HSVウイルス由来のFc受容体又はその免疫原性断片及び前記HSVウイルス由来の結合パートナー又はその断片を含むか又はそれからなる、ヘテロ二量体に関する。【選択図】なし
Description
本発明は、対象におけるウイルス感染、特にヘルペスウイルス感染を治療するためのウイルスFc受容体又はその免疫原性断片に関する。
単純ヘルペスウイルス(HSV、HSV1及びHSV2を含む)は、ヘルペスウイルス科(Herpesviridae)のアルファヘルペスウイルス亜科(Alphaherpesvirinae)(α-ヘルペスウイルス)のメンバーである。単純ヘルペスウイルスは、機能性タンパク質をコードする少なくとも74の遺伝子を含有するエンベロープを持つ二本鎖DNAウイルスである。HSV1及びHSV2は粘膜上皮細胞に感染し、一次感染が起こった粘膜を神経支配する感覚ニューロンにおいて生涯の持続性感染を樹立する。HSV1とHSV2は双方とも、神経細胞体で樹立された潜伏期から定期的に再活性化することができ、口唇ヘルペス(単純疱疹)又は性器ヘルペス(GH)のいずれかを招く。
性器ヘルペスの世界的な有病率は、15歳から49歳の間の個体で4億1700万人と推定されるが、疾患の負担はアフリカにおいて不釣り合いに大きい。HSV1は、資源保有国における初回の性器ヘルペスの原因として、HSV2とおよそ同じくらい一般的である。再発感染については、HSV1後ではHSV2性器感染ほど一般的ではない。したがって、HSV2は依然として再発性器ヘルペスの優勢な原因のままである。重度で頻発の陰部潰瘍を有する感染個体もいれば、一方、軽度又は無症状感染を有する個体もいるが、全ての個体が性器ヘルペスをその親密なパートナーに伝染させるリスクがある。
再発GHとは、仙骨神経節からのHSV2(及びある程度のHSV1)の再活性化、これに続くニューロン軸索に沿ったウイルスカプシドの順方向の遊走の結果であり、したがって、ウイルス粒子の集合体、細胞間融合、ウイルス拡散及び生殖器粘膜からの周囲上皮細胞の感染にいたる。
抗ウイルス剤、例えばアシクロビル、バラシクロビル及びファムシクロビルは、一次感染又は再発感染の両方で及びHSV1又はHSV2の起源に関係なく、GHの治療に使用される。これらの薬物は、作用に関するそれらの生物学的メカニズムがウイルス複製機構をブロック又は妨害するので、宿主からウイルスを根絶はしない。無作為化比較試験が実証したところは、これら3種の薬物のいずれかを用いた短期治療によると、再発の症状又は臨床的兆候の開始後に早期に開始した場合、1～2日だけ症状再発の重症度が減少及び期間が短縮することが実証された。しかし、そのような断続的なレジメンによって1年当たりの再発数が減少することはない。
HSV再発向けの現在の治療オプションには、不完全な抗ウイルス有効性、短期間の有効性、治療レジメンへの遵守、抗ウイルス剤耐性の出現、治療の費用、及び副作用を含めて限界がある。現在のところ、症候再発の長期予防をもたらす戦略はまったく知られていない。
ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)は、ヘルペスウイルス科のβ-ヘルペスウイルス亜科の二本鎖DNAウイルスである。先天性HCMV感染は、新生児において難聴、視力喪失及び神経障害の主因である。加えて、HCMVは、免疫不全の個体、例えばAIDSの対象や移植レシピエントにおいて生命を危うくする病気を引き起こす。
したがって、当技術分野では、再発ヘルペスウイルス感染、特にHSV2、HSV1及びHCMVの各感染に関する改善された治療が必要である。
一態様では、本発明は、好ましくはウイルスに感染した対象を治療するための治療での使用のための、前記ウイルス由来のFc受容体(FcR)又はその免疫原性断片を提供する。
一態様では、本発明は、組換えウイルスFcR又はその免疫原性断片を提供し、ここで、ヒト抗体Fcドメインに結合するウイルスFcR又はその免疫原性断片の能力は、対応する天然ウイルスFc受容体と比較して減少又は消失している。
別の態様では、本発明は、治療での使用のための、HSVウイルス由来のFc受容体又はその免疫原性断片及び前記HSVウイルス由来の結合パートナー又はその断片を含むか又はそれらからなるヘテロ二量体を提供する。
さらなる態様では、本発明は、本発明のウイルスFc受容体若しくはその免疫原性断片又はヘテロ二量体をコードする核酸を提供する。
さらなる態様では、本発明は、本発明による核酸を含むベクターを提供する。
さらなる態様では、本発明は、本発明によるウイルスFc受容体若しくはその断片、ヘテロ二量体、核酸又はベクターを含む細胞を提供する。
一態様では、本発明は、本明細書に記載のウイルス由来のFc受容体若しくはその免疫原性断片又は核酸及び薬学的に許容される担体を含む、免疫原性組成物(又は「治療用ワクチン」)を提供する。適切には、免疫原性組成物は、薬学的に又は生理学的に許容される担体に懸濁又は溶解されることにより、対象への投与向けに調製することができる。
一態様では、本発明は、対象、好ましくはヒト対象において、再発ヘルペス感染の治療での使用のための、又は再発ヘルペスウイルス感染の頻度の予防又は減少の方法での使用のための、ヘルペスウイルスFc受容体若しくはその免疫原性断片又は前記ウイルスFcR若しくはその免疫原性断片をコードする核酸を提供する。
一態様では、本発明は、対象、好ましくはヒト対象において、再発HSV2感染の治療での使用のための、又は再発HSV2感染の頻度の予防又は減少の方法での使用のための、HSV2 gE2若しくはその免疫原性断片又は前記HSV2 gE2若しくはその免疫原性断片をコードする核酸を提供する。
一態様では、本発明は、対象、好ましくはヒト対象において、再発HSV2感染の治療での使用のための、又は再発HSV2感染の頻度の予防又は減少の方法での使用のための、HSV2 gE2/gI2ヘテロ二量体若しくはその免疫原性断片又は前記HSV2 gE2/gI2ヘテロ二量体若しくはその免疫原性断片をコードする核酸を提供する。
一態様では、本発明は、対象、好ましくはヒト対象において、再発HSV1感染の治療での使用のための、又は再発HSV1感染の頻度の予防又は減少の方法での使用のための、HSV1 gE1若しくはその免疫原性断片又は前記HSV1 gE1若しくはその免疫原性断片をコードする核酸を提供する。
一態様では、本発明は、対象、好ましくはヒト対象において、再発HSV1感染の治療での使用のための、又は再発HSV1感染の頻度の予防又は減少の方法での使用のための、HSV1 gE1/gI1ヘテロ二量体若しくはその免疫原性断片又は前記HSV1 gE1/gI1ヘテロ二量体若しくはその免疫原性断片をコードする核酸を提供する。
一態様では、本発明は、免疫原性組成物の製造での使用のための本明細書に記載の、ヘルペスウイルスFc受容体若しくはその免疫原性断片又は前記ウイルスFcR若しくはその免疫原性断片をコードする核酸を提供する。
一態様では、本発明は、ヘルペス感染又はヘルペス関連疾患の治療のための医薬の製造における本明細書に記載の、ヘルペスウイルスFc受容体若しくはその免疫原性断片又は前記ウイルスFcR若しくはその免疫原性断片をコードする核酸の使用を提供する。
一態様では、本発明は、免疫原性組成物の製造での使用のための本明細書に記載の、HSV2 gE2若しくはHSV2 gE2/gI2ヘテロ二量体、その免疫原性断片、又は前記HSV2 gE2若しくはその免疫原性断片をコードする核酸を提供する。
一態様では、本発明は、HSV2感染又はHSV2関連疾患の治療のための医薬の製造における本明細書に記載の、HSV2 gE2若しくはHSV2 gE2/gI2ヘテロ二量体、その免疫原性断片、又は前記HSV2 gE2若しくはHSV2 gE2/gI2ヘテロ二量体若しくはその免疫原性断片をコードする核酸の使用を提供する。
一態様では、本発明は、免疫原性組成物の製造での使用のための本明細書に記載の、HSV1 gE1若しくはHSV1 gE1/gI1ヘテロ二量体、その免疫原性断片、又は前記HSV1 gE1若しくはHSV1 gE1/gI1ヘテロ二量体若しくはその免疫原性断片をコードする核酸を提供する。
一態様では、本発明は、HSV1感染又はHSV1関連疾患の治療のための医薬の製造における本明細書に記載の、HSV1 gE1若しくはHSV1 gE1/gI1ヘテロ二量体、その免疫原性断片、又は前記HSV1 gE1若しくはHSV1 gE1/gI1ヘテロ二量体若しくはその免疫原性断片をコードする核酸の使用を提供する。
一態様では、本発明は、免疫学的に有効量の、ヘルペスウイルスFc受容体若しくはその免疫原性断片又は前記ウイルスFcR若しくはその免疫原性断片をコードする核酸を対象に投与する工程を含む、それを必要とする対象においてヘルペスウイルス感染又はヘルペスウイルス関連疾患を治療する方法を提供する。
一態様では、本発明は、免疫学的に有効量の、HSV2 gE2若しくはHSV2 gE2/gI2ヘテロ二量体、その免疫原性断片、又は前記HSV2 gE2若しくはHSV2 gE2/gI2ヘテロ二量体若しくはその免疫原性断片をコードする核酸を対象に投与する工程を含む、それを必要とする対象においてHSV2感染又はHSV2関連疾患を治療する方法を提供する。
一態様では、本発明は、免疫学的に有効量の、HSV1 gE1若しくはHSV1 gE1/gI1ヘテロ二量体、その免疫原性断片、又は前記HSV1 gE1若しくはHSV1 gE1/gI1ヘテロ二量体若しくはその免疫原性断片をコードする核酸を対象に投与する工程を含む、それを必要とする対象においてHSV1感染又はHSV1関連疾患を治療する方法を提供する。
一態様では、本明細書に記載のウイルスFc受容体又はその免疫原性断片及びアジュバントを含むか又はそれらからなるキットが提供される。
本発明は、ウイルス感染に対する、特にHSV1又はHSV2による再発感染及び関連する臨床的及び準臨床的兆候に対する治療用ワクチンにおける、ウイルスFc受容体又はその免疫原性断片、特にHSV1若しくはHSV2単独由来の又はその結合パートナーgIを備える糖タンパク質gEの使用に関する。
アルファヘルペスウイルス、例えば単純ヘルペスウイルス(HSV)は、上皮組織及び神経組織においてウイルス伝播を可能にする特殊なメカニズムを進化させてきた。一次感染は、粘膜上皮細胞への侵入、これに続くそれら細胞間での急速なウイルス伝播を伴う。ウイルスの複製と伝播に関するそういったフェーズの過程では、ウイルスがビリオンエンベロープとニューロン膜の融合によって感覚ニューロンに侵入し、その結果、カプシドが細胞質へと送達される。カプシドは、神経節の神経細胞体又は核に向かって微小管上での逆行性の軸索輸送を受け、そこで潜伏期が樹立される。後に、ニューロンの刺激を受けて、潜伏ウイルスが再活性化し、ウイルス粒子が産生され、この粒子は、細胞体から軸索先端への順行性方向で微小管上での高速軸索輸送を受ける。単純ヘルペスウイルス(HSV)及びその他のアルファヘルペスウイルスの生活史の重要なフェーズとは、潜伏期から再活性化し、次いで感染したニューロンから上皮組織に伝播する能力である。この伝播には、少なくとも2つのステップが関与する: (i)軸索先端への順行性輸送とこれに続く(ii)開口放出及び軸索から上皮細胞への細胞外伝播。HSV gE/gIは、2つのウイルス膜糖タンパク質gEとgIから形成されるヘテロ二量体である。HSV gE/gIヘテロ二量体は、ウイルス伝播を容易にすることが示されてきた。(Howard, Paul W., et al. "Herpes simplex virus gE/gI extracellular domains promote axonal transport and spread from neurons to epithelial cells." Journal of virology 88.19 (2014): 11178-11186.)
HSV1又はHSV2が感染細胞内で再活性化する場合、ウイルスは免疫システムに対してより認められやすくなり、したがってより受攻性となる。通常は、宿主IgGはビリオン上で又は感染細胞の細胞表面でウイルス抗原を認識し、宿主IgG Fcドメインは、NK細胞、顆粒細胞及びマクロファージ上のFcガンマ受容体と相互作用することにより重要な抗体エフェクター活性を媒介して、抗体依存性細胞傷害性(ADCC)を誘発することができ、且つ、マクロファージ、単球、好中球及び樹状細胞上のFcガンマ受容体と相互作用することにより重要な抗体エフェクター活性を媒介して、抗体依存性細胞ファゴサイトーシス(ADCP)を誘発することができる。
HSV1 gE又はHSV2 gEは、HSV1又はHSV2(それぞれ)糖タンパク質I(gI)と非共有結合のヘテロ二量体複合体を形成することができる。gEgIヘテロ二量体は、ウイルスFcガンマ受容体(FcγR)として機能し、ヒトIgGのFc部分と相互作用する能力を有することを意味する。実際、HSV1 gE若しくはHSV2 gE又はHSV1若しくはHSV2のgE/gIヘテロ二量体は、HSV感染細胞の細胞表面に提示される場合、そのFc部分を通して宿主IgGに結合する。gEとgIの間の相互作用は、gE単独と比較してFc結合親和性を約100倍だけ上昇させると考えられている。この相互作用は、免疫回避メカニズムに関連付けられてきた。実際、IgG Fabドメインを通してビリオン又は感染細胞上のHSV1又はHSV2の抗原(例えばgD)に結合することができるヒトIgGは、そのFcドメインを通してウイルスgE上のFc結合ドメインに結合することもでき、その結果、クラスリン媒介性メカニズムを通して免疫複合体のエンドサイトーシスを招く。このメカニズムは抗体バイポーラブリッジングと呼ばれ、自然免疫細胞の活性化と競合する主要な免疫回避戦略であると仮定されている。抗体Fc結合を通して、ウイルスFcγRは、補体結合及び抗体依存性細胞傷害性(ADCC)を含むIgG Fc媒介性活性を阻害し、ウイルスが免疫システムによる認識を回避することを可能にする。(Ndjamen, Blaise, et al. "The herpes virus Fc receptor gE-gI mediates antibody bipolar bridging to clear viral antigens from the cell surface." PLoS pathogens 10.3 (2014): e1003961.; Dubin, G., et al. "Herpes simplex virus type 1 Fc receptor protects infected cells from antibody-dependent cellular cytotoxicity." Journal of virology 65.12 (1991): 7046-7050.; Sprague, Elizabeth R., et al. "Crystal structure of the HSV1 Fc receptor bound to Fc reveals a mechanism for antibody bipolar bridging." PLoS biology 4.6 (2006): e148.)
HSV2予防的サブユニットgD2ワクチンは、ヒトの治験においてHSV-2の疾患又は感染を効率的に防止しなかった(Johnston, Christine, Sami L. Gottlieb, and Anna Wald. "Status of vaccine research and development of vaccines for herpes simplex virus." Vaccine 34.26 (2016): 2948-2952)。Matrix-M2を用いてアジュバント化された短縮型gD2抗原及びICP4.2抗原をベースとした別のHSV2ワクチン候補物質は、第2相治験で生殖器のHSV2排出及び病変率を減少させた(Van Wagoner, Nicholas, et al. "Effects of different doses of GEN-003, a therapeutic vaccine for genital herpes simplex virus-2, on viral shedding and lesions: results of a randomized placebo-controlled trial." The Journal of infectious diseases 218.12 (2018): 1890-1899.)。ウイルス侵入分子(gD2)とHSV2免疫回避をブロックする2つの抗原、補体を阻害するgC2及びgE2とを含む3価のアジュバント化ワクチンは、動物モデルで有効性を示した。(Awasthi, Sita, et al. "Blocking herpes simplex virus 2 glycoprotein E immune evasion as an approach to enhance efficacy of a trivalent subunit antigen vaccine for genital herpes." Journal of virology 88.15 (2014): 8421-8432.; Awasthi, Sita, et al. "An HSV2 trivalent vaccine is immunogenic in rhesus macaques and highly efficacious in guinea pigs." PLoS pathogens 13.1 (2017): e1006141.; Awasthi, Sita, et al. "A trivalent subunit antigen glycoprotein vaccine as immunotherapy for genital herpes in the guinea pig genital infection model." Human vaccines & immunotherapeutics 13.12 (2017): 2785-2793.; Hook, Lauren M., et al. "A trivalent gC2/gD2/gE2 vaccine for herpes simplex virus generates antibody responses that block immune evasion domains on gC2 better than natural infection." Vaccine 37.4 (2019): 664-669.)。
本発明者らは、gEのFc結合ドメインに対して免疫応答を方向付けることにより、上記の免疫回避メカニズム(抗体バイポーラブリッジング)を防止又は妨害することが可能であり、その結果、ウイルスタンパク質、特に免疫優性のHSV1 gD又はHSV2 gDの抗原への自然免疫がより強力となり得るのではないかと仮説を立てた。本発明者らはまた、ワクチン接種によるgE又はgE//gIヘテロ二量体の特異的ターゲティングにより、準優性な免疫応答、特に抗体依存性細胞傷害性(ADCC)及び抗体依存性細胞ファゴサイトーシス(ADCP)を増強し、免疫システムを保護メカニズムへと方向付けすることができるのではないかと仮説を立てた。理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らはしたがって、gE単独で又はそのヘテロ二量体結合パートナーgIとの組合せでワクチン接種による免疫応答を特異的に高めることにより、HSV1又はHSV2に感染した対象を効果的に治療することが可能であると考える。
ヘルペスウイルスによって既に感染した対象(血清陽性の対象)の治療については、対象が症候期であれそれとも無症候期であれ、本発明者らは、免疫優性抗原、例えばHSV gDを治療組成物に含める必要がないであろうと仮説を立てた。実際、gDは優性抗原であり、血清陽性の対象は、症候性にしろ無症候性にしろ、gDに対して高レベルの自然生成の中和抗体を既に有する(Cairns, Tina M., et al. "Patient-specific neutralizing antibody responses to herpes simplex virus are attributed to epitopes on gD, gB, or both and can be type specific." Journal of virology 89.18 (2015): 9213-9231.)。ウイルスFc受容体、例えばHSV gE又はHSV gE/gIに対して免疫応答を誘導することにより、本発明者らは、gE/gI免疫回避メカニズムが迂回されることになり、自然免疫は、特に免疫優性抗原、例えばgDに対して方向付けられる自然抗体応答は、その役割をより完全に果たすことになるであろうと仮説を立てた。本発明者らはまた、免疫回避メカニズムに作用することに加えて、gE又はgE/gIの抗原はまた、傷害性及び/又はファゴサイトーシスメカニズム(ADCC/ADCP)によって、感染細胞の破壊を招くと思われる液性応答(抗gE抗体又は抗gE抗体及び抗gI抗体)を誘導することができるのではないかと仮説を立てた。血清陽性の対象の場合、本発明者らは、ADCC及び/又はADCPメカニズムは、初期段階のウイルス複製を制御するのに、中和抗体メカニズム(例えば優性なHSV抗原gDによって駆動される応答)よりも効率的であり得るのではないかと仮説を立てた。最終的には、本発明者らはまた、gE抗原又はgE/gI抗原によるCD4+ T細胞の誘導も、再発HSV感染に対して役に立つであろうと仮説を立てた。
同様の免疫回避メカニズムが、ウイルスFc受容体として作用するgp34及びgp68を有するヒトサイトメガロウイルス(HCMV)で記載されている(Corrales-Aguilar, Eugenia, et al. "Human cytomegalovirus Fcγ binding proteins gp34 and gp68 antagonize Fcγ receptors I, II and III." PLoS pathogens 10.5 (2014): e1004131; Sprague, Elizabeth R., et al. "The human cytomegalovirus Fc receptor gp68 binds the Fc CH2-CH3 interface of immunoglobulin G." Journal of virology 82.7 (2008): 3490-3499.)。本発明者らは、HCMVのgp34若しくはgp68又はそれらの免疫原性断片が、HCMVによって感染した対象を治療するための治療用ワクチンとして働くことができるのではないかと仮説を立てる。
第1の態様では、本発明は、ウイルスに感染した対象を治療する際の使用のための、前記ウイルス由来のFc受容体又はその免疫原性断片を含むか又はそれらからなるタンパク質を提供する。
本明細書で使用される場合、「Fc受容体」(又は「FcR」)とは、ある特定の細胞の表面に見いだされ、抗体のFc領域に結合する能力を有するタンパク質である。Fc受容体は、認識する抗体のタイプに基づいて分類される。最も一般的なクラスの抗体であるIgGに結合するFc受容体は「Fc-ガンマ受容体」(又は「FcγR」)と呼ばれ、IgAに結合するFc受容体は「Fc-アルファ受容体」(又は「FcαR」)と呼ばれ、IgEに結合するFc受容体は「Fc-イプシロン受容体」(又は「FcεR」)と呼ばれる。本明細書では、内在性遺伝子の発現の結果として所与の多細胞生物から細胞の表面に提示されるFc受容体は、「宿主Fc受容体」と呼ばれる。宿主Fc受容体は、特に宿主免疫エフェクター細胞、例えばBリンパ球、濾胞樹状細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、ヒト血小板及び肥満細胞の表面に見いだされる。Fab領域を通して感染細胞又は侵入病原体に結合した抗体のFc領域への宿主Fc受容体の結合は、抗体媒介性細胞ファゴサイトーシス(ADCP)又は抗体依存性細胞傷害性(ADCC)による感染細胞又は侵入病原体のファゴサイトーシス又は破壊を誘発する。
適切には、FcR又はその免疫原性断片はサブユニット形態であり、このことは、それが全ウイルスの一部ではないことを意味する。適切には、FcR又はその免疫原性断片は単離されている。
一部のウイルス、特にヘルペスウイルスは、宿主IgGのFc部分に結合するウイルスFc受容体を発現し、それによって免疫エフェクター細胞上の宿主Fc受容体へのIgGの結合を防止するとともに、ウイルスが宿主のADCC又はADCP免疫応答を回避することを可能とする。本明細書で使用される場合、「ウイルスFc受容体」(又は「ウイルス由来のFc受容体」)とは、ウイルス起源のFc受容体である。本明細書で使用される場合、「ウイルスFcγR」とは、ウイルス起源のFcγRである。
一実施形態では、ウイルスFc受容体はヘルペスウイルス由来である。
本明細書で使用される場合、「ヘルペスウイルス」とは、ヘルペスウイルス科のメンバーであり、これには、単純ヘルペスウイルス(HSV)タイプ1及び2(それぞれHSV1及びHSV2)、ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)、エプスタイン-バーウイルス(EBV)及び水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)が含まれる。
好ましい実施形態では、ウイルスFc受容体は、HSV2、HSV1及びHCMVから選択されるヘルペスウイルス由来である。
一実施形態では、ウイルスFc受容体はウイルスFcγRである。好ましくは、ウイルスFcγRは、HSV2 gE2、HSV1 gE1、HCMV gp34及びHCMV gp68から選択される。
本明細書では、「HSV2 gE2」(又は「HSV2 gE」)とは、HSV2遺伝子US8によってコードされ、感染細胞の表面で提示され、ウイルスFcγRとして機能するHSV2 gE糖タンパク質である。適切には、HSV2 gE2は、表1に示されるHSV2 gE糖タンパク質、又はそれと少なくとも60%、65%、70%、75％、80％、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは99.5%同一であるそれ由来のバリアントから選択される。
好ましい実施形態では、HSV2 gE2は、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するHSV2系統SD90e由来のgE(Genbank受託番号AHG54732.1、UniProtKB受託番号: A7U881)、又はそれと少なくとも60%、65%、70%、75％、80％、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは99.5%同一であるそれ由来のバリアントである。
本明細書で使用される場合、「バリアント」とは、参照抗原配列とは配列において異なるが、参照抗原の少なくとも1つの本質的な特性を保持するペプチド配列である。ペプチドバリアントの配列の変化は限定的又は保存的とすることができ、その結果、参照ペプチドとバリアントの配列は全体として密接に類似しており、多くの領域で同一である。バリアント及び参照抗原は、任意の組合せで1つ以上の置換、付加又は欠失によってアミノ酸配列において異なることができる。抗原のバリアントは、天然に存在する例えば対立遺伝子バリアントであってもよく、天然に存在することが知られていないバリアントであってもよい。核酸及びポリペプチドの天然に存在しないバリアントは、突然変異誘発技法によって又は直接合成によって作製することができる。好ましい実施形態では、バリアントによって保持される本質的な特性とは、免疫応答、適切には液性応答又はT細胞応答を誘導する能力であり、この応答は参照抗原によって誘導される免疫応答に類似している。適切には、バリアントは、マウスにおいて液性応答又はT細胞応答を誘導するが、これは、参照抗原によって誘導される免疫応答に対して、10分の1より低いことはなく、より適切には5分の1より低いことはなく、2分の1より低いことはなく、又は低いことはない。
本明細書では、「HSV1 gE1」(又は「HSV1 gE」)とは、HSV1遺伝子US8によってコードされ、感染細胞の表面に提示され、ウイルスFcγRとして機能するHSV1 gE糖タンパク質である。適切には、HSV1 gE1は、配列番号3に示されるアミノ酸配列を有するHSV1系統KOS321由来のgE(UniProtKB受託番号: Q703E9)、又はそれと少なくとも60%、65%、70%、75％、80％、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは99.5%同一であるそれ由来のバリアントである。
本明細書では、「HCMV gp34」とは、感染細胞の表面に提示され、ウイルスFcγRとして機能するHCMV gp34糖タンパク質である。適切には、HCMV gp34は、配列番号5に示されるアミノ酸配列を有するHCMV系統AD169由来のgp34(UniProtKB受託番号: P16809、配列番号5)、又はそれと少なくとも60%、65%、70%、75％、80％、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは99.5%同一であるそれ由来のバリアントである。
本明細書では、「HCMV gp68」とは、感染細胞の表面に提示され、ウイルスFcγRとして機能するHCMV gp68糖タンパク質である。適切には、HCMV gp68は、配列番号6に示されるアミノ酸配列を有するHCMV系統AD169由来のgp68(UniProtKB受託番号: P16739、配列番号6)、又はそれと少なくとも60%、65%、70%、75％、80％、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは99.5%同一であるそれ由来のバリアントである。
一実施形態では、ウイルスFc受容体の免疫原性断片が使用される。
本明細書で使用される場合、「免疫原性断片」とは、宿主の免疫システムを刺激して液性及び/又は細胞性抗原特異的免疫応答(すなわち、天然に存在するポリペプチド、例えばウイルス又は細菌のタンパク質を特異的に認識する免疫応答)を行うことができる1つ以上のエピトープ(例えばリニア、コンホメーション又は双方)を含有する参照抗原の断片を指す。「エピトープ」とは、その免疫学的特異性を決定する抗原の部分である。T細胞及びB細胞のエピトープは、経験的に特定することができる(例えば、PEPSCAN又は同様の方法を使用して)。好ましい実施形態では、免疫原性断片は、免疫応答、適切には液性又はT細胞の応答を誘導するが、この応答は参照抗原によって誘導される免疫応答に類似している。適切には、免疫原性断片は、マウスにおいて液性応答又はT細胞応答を誘導するが、これは、参照抗原によって誘導される免疫応答に対して、10分の1よりも低いことはなく、より適切には5分の1よりも低いことはなく、2分の1よりも低いことはなく、又は低いことはない。
本明細書で使用される場合、「ウイルスFc受容体の免疫原性断片」とは、少なくとも10、15、20、30、40、50、60、100、200、300個以上のアミノ酸を有する天然に存在するウイルスFc受容体の断片、又は天然に存在するウイルスFc受容体と少なくとも60%、65%、70%、75％、80％、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は99.5%の配列同一性のアミノ酸配列を有するペプチドを(又は少なくとも約10、15、20、30、40、50、60個以上のアミノ酸を有する、天然に存在するウイルスFc受容体の断片を)指す。したがって、抗原性ウイルスFc受容体の免疫原性断片は、天然に存在するウイルスFc受容体の、少なくとも10個のアミノ酸の断片とすることができ、且つ1つ以上のアミノ酸置換、欠失又は付加を含むことができる。
コードされたウイルスFc受容体免疫原性断片のいずれもが、必要な場合に最初のメチオニン残基をさらに含むことができる。
適切には、ウイルスFc受容体又はその免疫原性断片は機能的な膜貫通ドメインを含まない。適切には、ウイルスFc受容体又はその免疫原性断片は細胞質ドメインを含まない。好ましくは、ウイルスFc受容体又はその免疫原性断片は機能的な膜貫通ドメインも細胞質ドメインも含まない。換言すれば、好ましい実施形態では、ウイルスFc受容体又は免疫原性断片はウイルスFcR外部ドメイン(又は細胞外ドメイン)からなる。より好ましくは、ウイルスFc受容体又は免疫原性断片は、HSV2 gE2外部ドメイン、HSV1 gE1外部ドメイン、HCMV gp34外部ドメイン又はHCMV gp68外部ドメインを含むか又はそれらからなる。
好ましい実施形態では、ウイルスFcR外部ドメインは、配列番号7(配列番号1のアミノ酸残基1～419に相当する)で示されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも60%、65%、70%、75％、80％、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは99.5%同一である配列を含むか又はそれらからなるHSV2 gE2外部ドメインである。適切には、ウイルスFcR外部ドメインは、表1又は図3に示される配列から選択される配列を有する。好ましい実施形態では、ウイルスFcR外部ドメインは、配列番号7と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%又は100%同一であるHSV2 gE2外部ドメインである。
適切には、ウイルスFc受容体HSV2外部ドメインは、配列番号7に示されるアミノ酸配列に対して、1個以上のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を含むことができる。
別の実施形態では、ウイルスFcR外部ドメインは、配列番号1のアミノ酸残基1～417に相当するアミノ酸配列、又はそれと少なくとも60%、65%、70%、75％、80％、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは99.5%同一である配列を含むか又はそれらからなるHSV2 gE2外部ドメインである。適切には、ウイルスFc受容体HSV2外部ドメインは、配列番号1のアミノ酸残基1～417に相当するアミノ酸配列に対して、1個以上のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を含むことができる。
別の実施形態では、ウイルスFcR外部ドメインは、配列番号9(配列番号3のアミノ酸残基1～421に相当する)で示されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも60%、65%、70%、75％、80％、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは99.5%同一である配列を含むか又はそれらからなるHSV1 gE1外部ドメインである。好ましい実施形態では、ウイルスFcR外部ドメインは、配列番号9と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%又は100%同一であるHSV1 gE1外部ドメインである。
適切には、ウイルスFc受容体HSV1外部ドメインは、配列番号9に示されるアミノ酸配列に対して、1個以上のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を含むことができる。
別の実施形態では、ウイルスFcR HSV1外部ドメインは、配列番号3のアミノ酸残基1～419に相当するアミノ酸配列、又はそれと少なくとも60%、65%、70%、75％、80％、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは99.5%同一である配列を含むか又はそれらからなる。適切には、ウイルスFc受容体HSV1外部ドメインは、配列番号3のアミノ酸残基1～419に相当するアミノ酸配列に対して、1個以上のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を含むことができる。
別の実施形態では、ウイルスFcR外部ドメインは、配列番号11(配列番号5のアミノ酸残基1～180に相当する)で示されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも60%、65%、70%、75％、80％、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは99.5%同一である配列を含むか又はそれらからなるHCMV gp34外部ドメインである。好ましい実施形態では、ウイルスFcR外部ドメインは、配列番号11と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%又は100%同一であるHCMV gp34外部ドメインである。
適切には、ウイルスFc受容体HCMV gp34外部ドメインは、配列番号11に示されるアミノ酸配列に対して、1個以上のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を含むことができる。
別の実施形態では、ウイルスFcR外部ドメインは、配列番号12で示されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも60%、65%、70%、75％、80％、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは99.5%同一である配列を含むか又はそれらからなるHCMV gp68外部ドメインである。好ましい実施形態では、ウイルスFcR外部ドメインは、配列番号12と少なくとも少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%又は100%同一であるHCMV gp68外部ドメインである。
適切には、ウイルスFc受容体HCMV gp68外部ドメインは、配列番号12(配列番号6のアミノ酸残基1～271に相当する)に示されるアミノ酸配列に対して、1個以上のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を含むことができる。
別の実施形態では、ウイルスFcRの免疫原性断片は、ウイルスFcR由来のFc結合ドメイン又はそれのバリアントを含むか又はそれらからなる。
一実施形態では、HSV2 FcRの免疫原性断片は、HSV2 gE由来のFc結合ドメイン、例えば、配列番号1のアミノ酸残基233～378に相当するアミノ酸配列、又はそれと少なくとも60%、65%、70%、75％、80％、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは99.5%同一である配列を含むか又はそれらからなる。適切には、ウイルスFc受容体HSV2 Fc結合ドメインは、配列番号1のアミノ酸残基233～378に相当するアミノ酸配列に対して、1個以上のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を含むことができる。
一実施形態では、HSV1 FcRの免疫原性断片は、HSV1 gE由来のFc結合ドメイン、例えば、配列番号3のアミノ酸残基235～380に相当するアミノ酸配列、又はそれと少なくとも60%、65%、70%、75％、80％、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは99.5%同一である配列を含むか又はそれらからなる。適切には、ウイルスFc受容体HSV1 Fc結合ドメインは、配列番号3のアミノ酸残基235～380に相当するアミノ酸配列に対して、1個以上のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を含むことができる。
好ましい実施形態では、ヒト抗体Fcドメインに結合するウイルスFc受容体又はその免疫原性断片の能力は、対応する天然ウイルスFc受容体と比較して減少又は消失している。適切には、ウイルスFc受容体又はその免疫原性断片は、ウイルスFc受容体又はその免疫原性断片の天然配列と比較して1個以上のアミノ酸置換、欠失又は挿入を含んでおり、この置換、欠失又は挿入によって、天然ウイルスFc受容体と比較してウイルスFcR又はその免疫原性断片と抗体Fcドメインと間の結合親和性が減少又は消失している。
ウイルスFcR又はその免疫原性断片と抗体Fcドメインとの間の結合親和性は、当業者によく知られている方法によって決定することができる。例えば、会合速度(kon)、解離速度(koff)、平衡解離定数(KD=koff/kon)及び平衡会合定数(KA=1/KD=kon/koff)を実施例3に記載のバイオレイヤー干渉計法によって決定する。
好ましい実施形態では、ウイルスFcR又はその免疫原性断片とヒトIgGとの間のkonは、対応する天然ウイルスFcRとヒトIgGとの間のkonよりも低い(遅いバインダー)。
好ましい実施形態では、ウイルスFcR又はその免疫原性断片とヒトIgGとの間のkoffは、対応する天然ウイルスFcRとヒトIgGとの間のkoffよりも高い(速いリリーサー)。
より好ましい実施形態では、ウイルスFcR又はその免疫原性断片とヒトIgGとの間のkonは、対応する天然ウイルスFcRとヒトIgGとの間のkonよりも低く、ウイルスFcR又はその免疫原性断片とヒトIgGとの間のkoffは、対応する天然ウイルスFcRとヒトIgGとの間のkoffよりも高い(遅いバインダー/速いリリーサー)。
好ましい実施形態では、ウイルスFcR又はその免疫原性断片とヒトIgGとの間の平衡解離定数(KD)は、対応する天然ウイルスFcRとヒトIgGとの間のKDよりも高い。
ウイルスFcR又はその免疫原性断片とヒトIgGとの間の相対親和性は、天然ウイルスFcRについて決定されたKDをウイルスFcR又はその免疫原性断片について決定されたKDにより除することによって決定することができる。
好ましい実施形態では、ウイルスFcR又はその免疫原性断片とヒトIgGとの間の相対親和性は、対応する天然ウイルスFcRとヒトIgGとの間の親和性の100%未満、例えば90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、15%又は10%未満である。より好ましい実施形態では、ウイルスFcR又はその免疫原性断片とヒトIgGとの間の相対親和性は、対応する天然ウイルスFcRとヒトIgGとの間の親和性の15%未満、より好ましくはさらに10%未満である。
好ましい実施形態では、ウイルスFcR又はその免疫原性断片とヒトIgGとの間の平衡解離定数(KD)は、2×10-7Mより高く、好ましくは5×10-7Mより高く、より好ましくは1×10-6Mより高い。
或いは、ウイルスFc受容体又はその免疫原性断片がヒト抗体Fcドメインに結合する能力は、実施例3及び4に記載のように、バイオレイヤー干渉計法アッセイで応答(nmで表現して)を測定することによって評価することができる。
好ましい実施形態では、ウイルスFc受容体又はその免疫原性断片とヒトIgGとの間の結合に相当するバイオレイヤー干渉計法アッセイにおける応答は、対応する天然ウイルスFc受容体で得られた応答の80%未満、適切には、70%、60%、50%、40%未満である。好ましい実施形態では、ウイルスFc受容体又はその免疫原性断片とヒトIgGとの間の結合に相当するバイオレイヤー干渉計法アッセイにおける応答は、0.4nmより低く、適切には0.3nm、0.2nm又は0.1nmより低い。
適切には、HSV2 gE2又はその免疫原性断片は、配列番号1に示されるHSV2 gE2配列のN241、H245、A246、A248、R314、P317、P318、P319、F322、R320、A337、S338又はV340から選択される位置に1つ以上の突然変異(挿入、置換又は欠失)を含む。
HSV2 gE2又はその免疫原性断片と抗体Fcドメインとの間の結合親和性を減少又は消失させるのに本明細書で使用することができる例示的な突然変異には、以下から選択される、配列番号1に示される配列の単一点置換突然変異が含まれる:
H245A、H245K、P317R、P319A、P319R、P319G、P319K、P319T、A337G、P319D、P319S、S338D、N241A、R320D、H245E、H245V、H245R、H245D、H245Q、H245G、H245I、H245K、H245S、H245T、A246W、A248K、A248T、A248G、R314A、R314N、R314D、R314Q、R314E、R314G、R314I、R314L、R314K、R314M、R314F、R314P、R314S、R314T、R314Y、R314V、P317N、P317G、P317I、P317L、P317K、P317F、P317S、P318R、P318D、P318Q、P318I、P318S、P318T、P318Y、P319L、R320A、R320S、R320N、R320Q、R320E、R320G、R320H、R320I、R320L、R320M、R320P、R320T、R320V、F322A、F322N、F322I、F322K、F322P、F322T、S338G、S338E、S338L、S338T、V340A、V340R、V340D、V340Q、V340M、V340F、V340P及びV340W。
H245A、H245K、P317R、P319A、P319R、P319G、P319K、P319T、A337G、P319D、P319S、S338D、N241A、R320D、H245E、H245V、H245R、H245D、H245Q、H245G、H245I、H245K、H245S、H245T、A246W、A248K、A248T、A248G、R314A、R314N、R314D、R314Q、R314E、R314G、R314I、R314L、R314K、R314M、R314F、R314P、R314S、R314T、R314Y、R314V、P317N、P317G、P317I、P317L、P317K、P317F、P317S、P318R、P318D、P318Q、P318I、P318S、P318T、P318Y、P319L、R320A、R320S、R320N、R320Q、R320E、R320G、R320H、R320I、R320L、R320M、R320P、R320T、R320V、F322A、F322N、F322I、F322K、F322P、F322T、S338G、S338E、S338L、S338T、V340A、V340R、V340D、V340Q、V340M、V340F、V340P及びV340W。
HSV2 gE2又はその免疫原性断片と抗体Fcドメインとの間の結合親和性を減少又は消失させるのに本明細書で使用することができる例示的な突然変異には、以下から選択される、配列番号1に示される配列の二重点置換突然変異も含まれる:
H245A及びP319A;H245A及びP319R;H245A及びP319G;H245A及びP319K;H245A及びP319T;N241A及びR320D;N241A及びP319D;A246W及びP317K;A246W及びP317F;A246W及びP317S;A246W及びR320D;A246W及びR320G;A246W及びR320T;A248K及びV340R;A248K及びV340M;A248K及びV340W;A248T及びV340R;A248T及びV340M;A248T及びV340W;A248G及びV340R;A248G及びV340M;A248G及びV340W;A248K及びF322A;A248K及びF322I;A248K及びF322P;A248T及びF322A;A248T及びF322I;A248T及びF322P;A248G及びF322A;A248G及びF322I;A248G及びF322P;H245A及びR320D;H245A及びR320G;H245A及びR320T;H245G及びR320D;H245G及びR320G;H245G及びR320T;H245S及びR320D;H245S及びR320G;H245S及びR320T;H245A及びP319G;H245A及びP319L;H245G及びP319G;H245G及びP319L;H245S及びP319G;H245S及びP319L;R314G及びP318R;R314G及びP318D;R314G及びP318I;R314L及びP318R;R314L及びP318D;R314L及びP318I;R314P及びP318R;R314P及びP318D;R314P及びP318I;R314G及びF322A;R314G及びF322I;R314G及びF322P;R314L及びF322A;R314L及びF322I;R314L及びF322P;R314P及びF322A;R314P及びF322I;R314P及びF322P;R314G及びV340R;R314G及びV340M;R314G及びV340W;R314L及びV340R;R314L及びV340M;R314L及びV340W;R314P及びV340R;R314P及びV340M;R314P及びV340W;P317K及びV340R;P317K及びV340M;P317K及びV340W;P317F及びV340R;P317F及びV340M;P317F及びV340W;P317S及びV340R;P317S及びV340M;P317S及びV340W;P317K及びS338G;P317K及びS338H;P317K及びS338L;P317F及びS338G;P317F及びS338H;P317F及びS338L;P317S及びS338G;P317S及びS338H;P317S及びS338L;P318R及びS338G;P318R及びS338H;P318R及びS338L;P318D及びS338G;P318D及びS338H;P318D及びS338L;P318I及びS338G;P318I及びS338H;P318I及びS338L;P319G及びV340R;P319G及びV340M;P319G及びV340W;P319L及びV340R;P319L及びV340M;P319L及びV340W;P317R及びP319D;P317R及びR320D;P319D及びR320D。
H245A及びP319A;H245A及びP319R;H245A及びP319G;H245A及びP319K;H245A及びP319T;N241A及びR320D;N241A及びP319D;A246W及びP317K;A246W及びP317F;A246W及びP317S;A246W及びR320D;A246W及びR320G;A246W及びR320T;A248K及びV340R;A248K及びV340M;A248K及びV340W;A248T及びV340R;A248T及びV340M;A248T及びV340W;A248G及びV340R;A248G及びV340M;A248G及びV340W;A248K及びF322A;A248K及びF322I;A248K及びF322P;A248T及びF322A;A248T及びF322I;A248T及びF322P;A248G及びF322A;A248G及びF322I;A248G及びF322P;H245A及びR320D;H245A及びR320G;H245A及びR320T;H245G及びR320D;H245G及びR320G;H245G及びR320T;H245S及びR320D;H245S及びR320G;H245S及びR320T;H245A及びP319G;H245A及びP319L;H245G及びP319G;H245G及びP319L;H245S及びP319G;H245S及びP319L;R314G及びP318R;R314G及びP318D;R314G及びP318I;R314L及びP318R;R314L及びP318D;R314L及びP318I;R314P及びP318R;R314P及びP318D;R314P及びP318I;R314G及びF322A;R314G及びF322I;R314G及びF322P;R314L及びF322A;R314L及びF322I;R314L及びF322P;R314P及びF322A;R314P及びF322I;R314P及びF322P;R314G及びV340R;R314G及びV340M;R314G及びV340W;R314L及びV340R;R314L及びV340M;R314L及びV340W;R314P及びV340R;R314P及びV340M;R314P及びV340W;P317K及びV340R;P317K及びV340M;P317K及びV340W;P317F及びV340R;P317F及びV340M;P317F及びV340W;P317S及びV340R;P317S及びV340M;P317S及びV340W;P317K及びS338G;P317K及びS338H;P317K及びS338L;P317F及びS338G;P317F及びS338H;P317F及びS338L;P317S及びS338G;P317S及びS338H;P317S及びS338L;P318R及びS338G;P318R及びS338H;P318R及びS338L;P318D及びS338G;P318D及びS338H;P318D及びS338L;P318I及びS338G;P318I及びS338H;P318I及びS338L;P319G及びV340R;P319G及びV340M;P319G及びV340W;P319L及びV340R;P319L及びV340M;P319L及びV340W;P317R及びP319D;P317R及びR320D;P319D及びR320D。
HSV2 gE2又はその免疫原性断片と抗体Fcドメインとの間の結合親和性を減少又は消失させるのに本明細書で使用することができる例示的な突然変異には、単独で又は置換突然変異との組合せで、配列番号1に示される配列の位置P319及び/又はR320での欠失突然変異、特に以下から選択される突然変異も含まれる:
P319欠失; R320欠失; P319欠失/R320欠失; P319欠失/R320欠失/P317G/P318G; P319欠失/R320欠失/P318E; P319欠失/R320欠失/P318G; P319欠失/R320欠失/P318K; P319欠失/R320欠失/P317R/P318E; P319欠失/R320欠失/P317R/P318G; P319欠失/R320欠失/P317R/P318K; P319欠失/R320欠失/P317G/P318K。
P319欠失; R320欠失; P319欠失/R320欠失; P319欠失/R320欠失/P317G/P318G; P319欠失/R320欠失/P318E; P319欠失/R320欠失/P318G; P319欠失/R320欠失/P318K; P319欠失/R320欠失/P317R/P318E; P319欠失/R320欠失/P317R/P318G; P319欠失/R320欠失/P317R/P318K; P319欠失/R320欠失/P317G/P318K。
HSV2 gE2又はその免疫原性断片と抗体Fcドメインとの間の結合親和性を減少又は消失させるのに本明細書で使用することができる例示的な突然変異には、以下から選択される挿入突然変異も含まれる:
・ 配列番号1のアミノ酸残基Y275とE276の間のペプチド配列LDIGEの挿入(275_インサート_LDIGE)、
・ 配列番号1のアミノ酸残基S289とP290の間のペプチド配列ADIGLの挿入(289_インサートADIGL)、
・ 配列番号1のアミノ酸残基A337とS338の間のペプチド配列ARAAの挿入(337_インサート_ARAA)、
・ 配列番号1のアミノ酸残基S338とT339の間のペプチド配列ARAAの挿入(338_インサート_ARAA)、及び
・ 配列番号1のアミノ酸残基H346とA347の間のペプチド配列ADITの挿入(346_インサート_ADIT)。
・ 配列番号1のアミノ酸残基Y275とE276の間のペプチド配列LDIGEの挿入(275_インサート_LDIGE)、
・ 配列番号1のアミノ酸残基S289とP290の間のペプチド配列ADIGLの挿入(289_インサートADIGL)、
・ 配列番号1のアミノ酸残基A337とS338の間のペプチド配列ARAAの挿入(337_インサート_ARAA)、
・ 配列番号1のアミノ酸残基S338とT339の間のペプチド配列ARAAの挿入(338_インサート_ARAA)、及び
・ 配列番号1のアミノ酸残基H346とA347の間のペプチド配列ADITの挿入(346_インサート_ADIT)。
好ましい実施形態では、HSV2 gE2又はその免疫原性断片は、以下から選択される、配列番号1に示される配列に関する突然変異又は突然変異の組合せを含む:
289_インサートADIGL;338_インサートARAA;H245K;P317R;P319R;P319G;P319K;H245A_P319R;H245A_P319G;H245A_P319K;H245A_P319T;P319D;S338D;R320D;N241A_R320D;A248K_V340M;P318Y;A248K_V340R;A248T_V340W;A248K_V340W;A246W_R320G;A246W_P317K;A246W_R320D;A246W_R320T;V340W;A248G_V340W;H245G_R320D;P318D;A246W_P317F;P319G_V340W;A248T_V340M;P317K_V340W;V340F;V340D;H245A_R320D;P317F_V340W;A246W_P317S;H245S_R320D;R314G_P318D;A248T;P318S;P317K;P317S_V340W;H245D;R314P_V340W;R314L_318D;P319L_V340W;P317F;P318D_S338G;R314G_V340W;P317K_S338H;R314L_V340W;P318R;P318Q;P317F_S338G;R314G_P318I;H245G_P319G;P317L;P318I;A248T_F322A;H245E;P318T;P318R_S338G;P318D_S338H;P317F_S338H;A248T_V340R;A248T_F322I;H245A_R320G;P318R_S338H;H245S_R320G;P317K_S338G;A248T_F322P;V340R;R314L_P318R;H245S_R320T;R314G_P318R;R320E;H245G_R320G;H245A_R320T;A246W;P318I_S338G;P317K_V340M;P317I;R320H;R314P_P318I;P318I_S338H;P317F_V340M;H245A_P319G;H245A_P319L;R320P;H245G_R320T;R314L_V340R;P319G_V340R;R314G_F322I;R314L_P318I;R320A;R314N;P317F_V340R;P318D_S338L;A248G_V340R;R314E;R314P_P318D;H245S_P319G;V340Q;A248K_F322I;R320G;H245S_P319L;R314F;P319L;P317K_S338L;P319L_V340M;P317G;R320S;R320Q;R314P_V340R;V340A;H245G_P319L;R320T;R314P_P318R;A248G_F322I;R320N;P317N;R314D;R314Y;R314P_F322I;P319G_V340M;P317S_V340R;R314V;P317R_P319D;P317R_R320D;P319D_R320D;Δ319_Δ320;P317G_P318G_Δ319_Δ320;P318E_Δ319_Δ320;P318G_Δ319_Δ320;P318K_Δ319_Δ320;P317R_P318E_Δ319_320;P317R_P318G_Δ319_Δ320及びP317G_P318K_Δ319_Δ320。(Δは欠失残基を意味する)。
289_インサートADIGL;338_インサートARAA;H245K;P317R;P319R;P319G;P319K;H245A_P319R;H245A_P319G;H245A_P319K;H245A_P319T;P319D;S338D;R320D;N241A_R320D;A248K_V340M;P318Y;A248K_V340R;A248T_V340W;A248K_V340W;A246W_R320G;A246W_P317K;A246W_R320D;A246W_R320T;V340W;A248G_V340W;H245G_R320D;P318D;A246W_P317F;P319G_V340W;A248T_V340M;P317K_V340W;V340F;V340D;H245A_R320D;P317F_V340W;A246W_P317S;H245S_R320D;R314G_P318D;A248T;P318S;P317K;P317S_V340W;H245D;R314P_V340W;R314L_318D;P319L_V340W;P317F;P318D_S338G;R314G_V340W;P317K_S338H;R314L_V340W;P318R;P318Q;P317F_S338G;R314G_P318I;H245G_P319G;P317L;P318I;A248T_F322A;H245E;P318T;P318R_S338G;P318D_S338H;P317F_S338H;A248T_V340R;A248T_F322I;H245A_R320G;P318R_S338H;H245S_R320G;P317K_S338G;A248T_F322P;V340R;R314L_P318R;H245S_R320T;R314G_P318R;R320E;H245G_R320G;H245A_R320T;A246W;P318I_S338G;P317K_V340M;P317I;R320H;R314P_P318I;P318I_S338H;P317F_V340M;H245A_P319G;H245A_P319L;R320P;H245G_R320T;R314L_V340R;P319G_V340R;R314G_F322I;R314L_P318I;R320A;R314N;P317F_V340R;P318D_S338L;A248G_V340R;R314E;R314P_P318D;H245S_P319G;V340Q;A248K_F322I;R320G;H245S_P319L;R314F;P319L;P317K_S338L;P319L_V340M;P317G;R320S;R320Q;R314P_V340R;V340A;H245G_P319L;R320T;R314P_P318R;A248G_F322I;R320N;P317N;R314D;R314Y;R314P_F322I;P319G_V340M;P317S_V340R;R314V;P317R_P319D;P317R_R320D;P319D_R320D;Δ319_Δ320;P317G_P318G_Δ319_Δ320;P318E_Δ319_Δ320;P318G_Δ319_Δ320;P318K_Δ319_Δ320;P317R_P318E_Δ319_320;P317R_P318G_Δ319_Δ320及びP317G_P318K_Δ319_Δ320。(Δは欠失残基を意味する)。
より好ましい実施形態では、HSV2 gE2又はその免疫原性断片は、338_インサートARAA; P317R; P319D; R320D; A248T_V340W; V340W; A248T; P318I及びA246Wから選択される配列番号1に示される配列に関する突然変異又は突然変異の組合せを含む。
上に列記の例示的な置換、選択及び挿入の突然変異に対して、他のHSV2 gE2配列、例えば、表1に列記されており図3に提供されるアラインメント上で示されている配列中の対応する突然変異も、本発明の範囲内である。
上に列記の例示的な単一及び二重置換突然変異並びに挿入突然変異の全ての可能な組合せもまた、本発明の範囲内である。
適切には、HSV1 gE1又はその免疫原性断片は、配列番号3に示されるHSV1 gE1配列のH247、P319及びP321から選択される位置に1つ以上の突然変異(挿入、置換又は欠失)を含む。
HSV1 gE1又はその免疫原性断片と抗体Fcドメインとの間の結合親和性を減少又は消失させるのに本明細書で使用することができる例示的な突然変異には、以下から選択される、配列番号3に示される配列の単一点置換突然変異: H247A、H247K、P319R、P321A、P321R、P321G、P321K、P321T、A339G、P321D、P321S、A340D、N243A及びR322D、並びに、以下から選択される、配列番号3に示される配列の二重点置換突然変異: H247A/P321A、H247A/P321R、H247A/P321G、H247A/P321K、H247A/P321T、N243A/R322D、N243A/P321D、H247G/P319G、P319G/P321G、A340G/S341G/V342Gが含まれる。
HSV1 gE1又はその免疫原性断片と抗体Fcドメインとの間の結合親和性を減少又は消失させるのに本明細書で使用することができる例示的な突然変異には、以下から選択される挿入突然変異も含まれる:
・ 配列番号3のアミノ酸残基Y277とE278の間のペプチド配列LDIGEの挿入(277_インサート_LDIGE);
・ 配列番号3のアミノ酸残基S291とP292の間のペプチド配列ADIGLの挿入(291_インサート_ADIGL);
・ 配列番号3のアミノ酸残基A339とA340の間のペプチド配列ARAAの挿入(339_インサート_ARAA);
・ 配列番号3のアミノ酸残基A340とS341の間のペプチド配列ARAAの挿入(340_インサート_ARAA); 及び
・ 配列番号3のアミノ酸残基D348とA349の間のペプチド配列ADITの挿入(348_インサート_ADIT)。
・ 配列番号3のアミノ酸残基Y277とE278の間のペプチド配列LDIGEの挿入(277_インサート_LDIGE);
・ 配列番号3のアミノ酸残基S291とP292の間のペプチド配列ADIGLの挿入(291_インサート_ADIGL);
・ 配列番号3のアミノ酸残基A339とA340の間のペプチド配列ARAAの挿入(339_インサート_ARAA);
・ 配列番号3のアミノ酸残基A340とS341の間のペプチド配列ARAAの挿入(340_インサート_ARAA); 及び
・ 配列番号3のアミノ酸残基D348とA349の間のペプチド配列ADITの挿入(348_インサート_ADIT)。
好ましい実施形態では、HSV1 gE1又はその免疫原性断片は、以下から選択される、配列番号3に示される配列に関する突然変異又は突然変異の組合せを含む: P321K; P321D; R322D; N243A_R322D; N243A_P321D; A340G_S341G_V342G; H247G_P319G; P321R; H247A_P321K; 291_インサートADIGL; 339_インサートARAA; P319R; P319G_P321G及びH247A_P321R。
より好ましい実施形態では、HSV1 gE1又はその免疫原性断片は、P321D; R322D; A340G_S341G_V342G及びP319Rから選択される、配列番号3に示される配列に関する突然変異又は突然変異の組合せを含む。
上に列記の例示的な単一及び二重置換突然変異並びに挿入突然変異に対して、他のHSV1 gE1配列中の対応する突然変異も、本発明の範囲内である。
上に列記の例示的な単一及び二重置換突然変異並びに挿入突然変異の全ての可能な組合せもまた、本発明の範囲内である。
好ましい実施形態では、ウイルスFc受容体又はその免疫原性断片がウイルスFcR外部ドメインである場合、抗体Fcドメインに結合する外部ドメインの能力は、天然ウイルスFc受容体と比較して減少又は消失している。適切には、ウイルスFcR外部ドメインは、ウイルスFcR外部ドメインの天然配列と比較して1個以上のアミノ酸置換、欠失又は挿入を含んでおり、この置換、欠失又は挿入によって、天然ウイルスFcRと比較してウイルスFcR外部ドメインと抗体Fcドメインと間の結合親和性が減少又は消失している。
ウイルスFcR外部ドメインと抗体Fcドメインとの間の結合親和性は、上記の方法によって決定することができる。
好ましい実施形態では、ウイルスFcR外部ドメインとヒトIgGとの間のkonは、対応する天然ウイルスFcR外部ドメインとヒトIgGとの間のkonよりも低い(遅いバインダー)。
好ましい実施形態では、ウイルスFcR外部ドメインとヒトIgGとの間のkoffは、対応する天然ウイルスFcR外部ドメインとヒトIgGとの間のkoffよりも高い(速いリリーサー)。
より好ましい実施形態では、ウイルスFcR外部ドメインとヒトIgGとの間のkonは、対応する天然ウイルスFcR外部ドメインとヒトIgGとの間のkonよりも低く、ウイルスFcR外部ドメインとヒトIgGとの間のkoffは、対応する天然ウイルスFcR外部ドメインとヒトIgGとの間のkoffよりも高い(遅いバインダー/速いリリーサー)。
好ましい実施形態では、ウイルスFcR外部ドメインとヒトIgGとの間の平衡解離定数(KD)は、対応する天然ウイルスFcR外部ドメインとヒトIgGとの間のKDよりも高い。
好ましい実施形態では、ウイルスFcR外部ドメインとヒトIgGとの間の相対親和性は、対応する天然ウイルスFcR外部ドメインとヒトIgGとの間の親和性の100%未満、例えば90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、15%又は10%未満である。より好ましい実施形態では、ウイルスFcR外部ドメインとヒトIgGとの間の相対親和性は、対応する天然ウイルスFcR外部ドメインとヒトIgGとの間の親和性の15%未満、より好ましくはさらに10%未満である。
好ましい実施形態では、ウイルスFcR外部ドメインとヒトIgGとの間の平衡解離定数(KD)は、2×10-7Mより高く、好ましく5×10-7Mより高く、より好ましくは1×10-6Mより高い。
或いは、ウイルスFcR外部ドメインがヒト抗体Fcドメインに結合する能力は、実施例3及び4に記載のように、バイオレイヤー干渉計法アッセイで応答(nmで表現して)を測定することによって評価することができる。好ましい実施形態では、ウイルスFcR外部ドメインとヒトIgGとの間の結合に相当するバイオレイヤー干渉計法アッセイにおける応答は、対応する天然ウイルスFcR外部ドメインで得られた応答の80%未満、適切には、70%、60%、50%、40%未満である。好ましい実施形態では、ウイルスFcR外部ドメインとヒトIgGとの間の結合に相当するバイオレイヤー干渉計法アッセイにおける応答は、0.6nmより低く、適切には0.5nm、0.4nm、0.3nm又は0.2nmより低い。
適切には、HSV2 gE2外部ドメインは、配列番号7に示されるHSV2 gE2外部ドメイン配列のN241、H245、A246、A248、R314、P317、P318、P319、F322、R320、A337、S338又はV340から選択される位置に1つ以上の突然変異(挿入、置換又は欠失)を含む。
HSV2 gE2外部ドメインと抗体Fcドメインとの間の結合親和性を減少又は消失させるのに本明細書で使用することができる例示的な突然変異には、以下から選択される、配列番号7に示される配列の単一点置換突然変異が含まれる:
H245A、H245K、P317R、P319A、P319R、P319G、P319K、P319T、A337G、P319D、P319S、S338D、N241A、R320D、H245E、H245V、H245R、H245D、H245Q、H245G、H245I、H245K、H245S、H245T、A246W、A248K、A248T、A248G、R314A、R314N、R314D、R314Q、R314E、R314G、R314I、R314L、R314K、R314M、R314F、R314P、R314S、R314T、R314Y、R314V、P317N、P317G、P317I、P317L、P317K、P317F、P317S、P318R、P318D、P318Q、P318I、P318S、P318T、P318Y、P319L、R320A、R320S、R320N、R320Q、R320E、R320G、R320H、R320I、R320L、R320M、R320P、R320T、R320V、F322A、F322N、F322I、F322K、F322P、F322T、S338G、S338E、S338L、S338T、V340A、V340R、V340D、V340Q、V340M、V340F、V340P及びV340W。
H245A、H245K、P317R、P319A、P319R、P319G、P319K、P319T、A337G、P319D、P319S、S338D、N241A、R320D、H245E、H245V、H245R、H245D、H245Q、H245G、H245I、H245K、H245S、H245T、A246W、A248K、A248T、A248G、R314A、R314N、R314D、R314Q、R314E、R314G、R314I、R314L、R314K、R314M、R314F、R314P、R314S、R314T、R314Y、R314V、P317N、P317G、P317I、P317L、P317K、P317F、P317S、P318R、P318D、P318Q、P318I、P318S、P318T、P318Y、P319L、R320A、R320S、R320N、R320Q、R320E、R320G、R320H、R320I、R320L、R320M、R320P、R320T、R320V、F322A、F322N、F322I、F322K、F322P、F322T、S338G、S338E、S338L、S338T、V340A、V340R、V340D、V340Q、V340M、V340F、V340P及びV340W。
HSV2 gE2外部ドメインと抗体Fcドメインとの間の結合親和性を減少又は消失させるのに本明細書で使用することができる例示的な突然変異には、以下から選択される、配列番号7に示される配列の二重点置換突然変異も含まれる:
H245A及びP319A; H245A及びP319R;H245A及びP319G;H245A及びP319K;H245A及びP319T;N241A及びR320D;N241A及びP319D;A246W及びP317K;A246W及びP317F;A246W及びP317S;A246W及びR320D;A246W及びR320G;A246W及びR320T;A248K及びV340R;A248K及びV340M;A248K及びV340W;A248T及びV340R;A248T及びV340M;A248T及びV340W;A248G及びV340R;A248G及びV340M;A248G及びV340W;A248K及びF322A;A248K及びF322I;A248K及びF322P;A248T及びF322A;A248T及びF322I;A248T及びF322P;A248G及びF322A;A248G及びF322I;A248G及びF322P;H245A及びR320D;H245A及びR320G;H245A及びR320T;H245G及びR320D;H245G及びR320G;H245G及びR320T;H245S及びR320D;H245S及びR320G;H245S及びR320T;H245A及びP319G;H245A及びP319L;H245G及びP319G;H245G及びP319L;H245S及びP319G;H245S及びP319L;R314G及びP318R;R314G及びP318D;R314G及びP318I;R314L及びP318R;R314L及びP318D;R314L及びP318I;R314P及びP318R;R314P及びP318D;R314P及びP318I;R314G及びF322A;R314G及びF322I;R314G及びF322P;R314L及びF322A;R314L及びF322I;R314L及びF322P;R314P及びF322A;R314P及びF322I;R314P及びF322P;R314G及びV340R;R314G及びV340M;R314G及びV340W;R314L及びV340R;R314L及びV340M;R314L及びV340W;R314P及びV340R;R314P及びV340M;R314P及びV340W;P317K及びV340R;P317K及びV340M;P317K及びV340W;P317F及びV340R;P317F及びV340M;P317F及びV340W;P317S及びV340R;P317S及びV340M;P317S及びV340W;P317K及びS338G;P317K及びS338H;P317K及びS338L;P317F及びS338G;P317F及びS338H;P317F及びS338L;P317S及びS338G;P317S及びS338H;P317S及びS338L;P318R及びS338G;P318R及びS338H;P318R及びS338L;P318D及びS338G;P318D及びS338H;P318D及びS338L;P318I及びS338G;P318I及びS338H;P318I及びS338L;P319G及びV340R;P319G及びV340M;P319G及びV340W;P319L及びV340R;P319L及びV340M;及びP319L;V340W;P317R及びP319D;P317R及びR320D;P319D及びR320D。
H245A及びP319A; H245A及びP319R;H245A及びP319G;H245A及びP319K;H245A及びP319T;N241A及びR320D;N241A及びP319D;A246W及びP317K;A246W及びP317F;A246W及びP317S;A246W及びR320D;A246W及びR320G;A246W及びR320T;A248K及びV340R;A248K及びV340M;A248K及びV340W;A248T及びV340R;A248T及びV340M;A248T及びV340W;A248G及びV340R;A248G及びV340M;A248G及びV340W;A248K及びF322A;A248K及びF322I;A248K及びF322P;A248T及びF322A;A248T及びF322I;A248T及びF322P;A248G及びF322A;A248G及びF322I;A248G及びF322P;H245A及びR320D;H245A及びR320G;H245A及びR320T;H245G及びR320D;H245G及びR320G;H245G及びR320T;H245S及びR320D;H245S及びR320G;H245S及びR320T;H245A及びP319G;H245A及びP319L;H245G及びP319G;H245G及びP319L;H245S及びP319G;H245S及びP319L;R314G及びP318R;R314G及びP318D;R314G及びP318I;R314L及びP318R;R314L及びP318D;R314L及びP318I;R314P及びP318R;R314P及びP318D;R314P及びP318I;R314G及びF322A;R314G及びF322I;R314G及びF322P;R314L及びF322A;R314L及びF322I;R314L及びF322P;R314P及びF322A;R314P及びF322I;R314P及びF322P;R314G及びV340R;R314G及びV340M;R314G及びV340W;R314L及びV340R;R314L及びV340M;R314L及びV340W;R314P及びV340R;R314P及びV340M;R314P及びV340W;P317K及びV340R;P317K及びV340M;P317K及びV340W;P317F及びV340R;P317F及びV340M;P317F及びV340W;P317S及びV340R;P317S及びV340M;P317S及びV340W;P317K及びS338G;P317K及びS338H;P317K及びS338L;P317F及びS338G;P317F及びS338H;P317F及びS338L;P317S及びS338G;P317S及びS338H;P317S及びS338L;P318R及びS338G;P318R及びS338H;P318R及びS338L;P318D及びS338G;P318D及びS338H;P318D及びS338L;P318I及びS338G;P318I及びS338H;P318I及びS338L;P319G及びV340R;P319G及びV340M;P319G及びV340W;P319L及びV340R;P319L及びV340M;及びP319L;V340W;P317R及びP319D;P317R及びR320D;P319D及びR320D。
HSV2 gE2外部ドメインと抗体Fcドメインとの間の結合親和性を減少又は消失させるのに本明細書で使用することができる例示的な突然変異には、単独で又は置換突然変異との組合せで、配列番号7に示される配列の位置P319及び/又はR320での欠失突然変異、特に以下から選択される突然変異も含まれる:
P319欠失; R320欠失; P319欠失/R320欠失; P319欠失/R320欠失/P317G/P318G; P319欠失/R320欠失/P318E; P319欠失/R320欠失/P318G; P319欠失/R320欠失/P318K; P319欠失/R320欠失/P317R/P318E; P319欠失/R320欠失/P317R/P318G; P319欠失/R320欠失/P317R/P318K; P319欠失/R320欠失/P317G/P318K。
P319欠失; R320欠失; P319欠失/R320欠失; P319欠失/R320欠失/P317G/P318G; P319欠失/R320欠失/P318E; P319欠失/R320欠失/P318G; P319欠失/R320欠失/P318K; P319欠失/R320欠失/P317R/P318E; P319欠失/R320欠失/P317R/P318G; P319欠失/R320欠失/P317R/P318K; P319欠失/R320欠失/P317G/P318K。
HSV2 gE2外部ドメインと抗体Fcドメインとの間の結合親和性を減少又は消失させるのに本明細書で使用することができる例示的な突然変異には、以下から選択される挿入突然変異も含まれる:
・ 配列番号7のアミノ酸残基Y275とE276の間のペプチド配列LDIGEの挿入(275_挿入_LDIGE)、
・ 配列番号7のアミノ酸残基S289とP290の間のペプチド配列ADIGLの挿入(289_挿入ADIGL)、
・ 配列番号7のアミノ酸残基A337とS338の間のペプチド配列ARAAの挿入(337_挿入_ARAA)、
・ 配列番号7のアミノ酸残基S338とT339の間の挿入ペプチド配列ARAA(338_挿入_ARAA)、及び
・ 配列番号7のアミノ酸残基H346とA347の間の挿入ペプチド配列ADIT(346_挿入_ADIT)。
・ 配列番号7のアミノ酸残基Y275とE276の間のペプチド配列LDIGEの挿入(275_挿入_LDIGE)、
・ 配列番号7のアミノ酸残基S289とP290の間のペプチド配列ADIGLの挿入(289_挿入ADIGL)、
・ 配列番号7のアミノ酸残基A337とS338の間のペプチド配列ARAAの挿入(337_挿入_ARAA)、
・ 配列番号7のアミノ酸残基S338とT339の間の挿入ペプチド配列ARAA(338_挿入_ARAA)、及び
・ 配列番号7のアミノ酸残基H346とA347の間の挿入ペプチド配列ADIT(346_挿入_ADIT)。
好ましい実施形態では、HSV2 gE2外部ドメインは、以下から選択される、配列番号7に示される配列に関する突然変異又は突然変異の組合せを含む:
289_インサートADIGL;338_インサートARAA;H245K;P317R;P319R;P319G;P319K;H245A_P319R;H245A_P319G;H245A_P319K;H245A_P319T;P319D;S338D;R320D;N241A_R320D;A248K_V340M;P318Y;A248K_V340R;A248T_V340W;A248K_V340W;A246W_R320G;A246W_P317K;A246W_R320D;A246W_R320T;V340W;A248G_V340W;H245G_R320D;P318D;A246W_P317F;P319G_V340W;A248T_V340M;P317K_V340W;V340F;V340D;H245A_R320D;P317F_V340W;A246W_P317S;H245S_R320D;R314G_P318D;A248T;P318S;P317K;P317S_V340W;H245D;R314P_V340W;R314L_318D;P319L_V340W;P317F;P318D_S338G;R314G_V340W;P317K_S338H;R314L_V340W;P318R;P318Q;P317F_S338G;R314G_P318I;H245G_P319G;P317L;P318I;A248T_F322A;H245E;P318T;P318R_S338G;P318D_S338H;P317F_S338H;A248T_V340R;A248T_F322I;H245A_R320G;P318R_S338H;H245S_R320G;P317K_S338G;A248T_F322P;V340R;R314L_P318R;H245S_R320T;R314G_P318R;R320E;H245G_R320G;H245A_R320T;A246W;P318I_S338G;P317K_V340M;P317I;R320H;R314P_P318I;P318I_S338H;P317F_V340M;H245A_P319G;H245A_P319L;R320P;H245G_R320T;R314L_V340R;P319G_V340R;R314G_F322I;R314L_P318I;R320A;R314N;P317F_V340R;P318D_S338L;A248G_V340R;R314E;R314P_P318D;H245S_P319G;V340Q;A248K_F322I;R320G;H245S_P319L;R314F;P319L;P317K_S338L;P319L_V340M;P317G;R320S;R320Q;R314P_V340R;V340A;H245G_P319L;R320T;R314P_P318R;A248G_F322I;R320N;P317N;R314D;R314Y;R314P_F322I;P319G_V340M;P317S_V340R;R314V;P317R_P319D;P317R_R320D;P319D_R320D;Δ319_Δ320;P317G_P318G_Δ319_Δ320;P318E_Δ319_Δ320;P318G_Δ319_Δ320;P318K_Δ319_Δ320;P317R_P318E_Δ319_320;P317R_P318G_Δ319_Δ320及びP317G_P318K_Δ319_Δ320。
289_インサートADIGL;338_インサートARAA;H245K;P317R;P319R;P319G;P319K;H245A_P319R;H245A_P319G;H245A_P319K;H245A_P319T;P319D;S338D;R320D;N241A_R320D;A248K_V340M;P318Y;A248K_V340R;A248T_V340W;A248K_V340W;A246W_R320G;A246W_P317K;A246W_R320D;A246W_R320T;V340W;A248G_V340W;H245G_R320D;P318D;A246W_P317F;P319G_V340W;A248T_V340M;P317K_V340W;V340F;V340D;H245A_R320D;P317F_V340W;A246W_P317S;H245S_R320D;R314G_P318D;A248T;P318S;P317K;P317S_V340W;H245D;R314P_V340W;R314L_318D;P319L_V340W;P317F;P318D_S338G;R314G_V340W;P317K_S338H;R314L_V340W;P318R;P318Q;P317F_S338G;R314G_P318I;H245G_P319G;P317L;P318I;A248T_F322A;H245E;P318T;P318R_S338G;P318D_S338H;P317F_S338H;A248T_V340R;A248T_F322I;H245A_R320G;P318R_S338H;H245S_R320G;P317K_S338G;A248T_F322P;V340R;R314L_P318R;H245S_R320T;R314G_P318R;R320E;H245G_R320G;H245A_R320T;A246W;P318I_S338G;P317K_V340M;P317I;R320H;R314P_P318I;P318I_S338H;P317F_V340M;H245A_P319G;H245A_P319L;R320P;H245G_R320T;R314L_V340R;P319G_V340R;R314G_F322I;R314L_P318I;R320A;R314N;P317F_V340R;P318D_S338L;A248G_V340R;R314E;R314P_P318D;H245S_P319G;V340Q;A248K_F322I;R320G;H245S_P319L;R314F;P319L;P317K_S338L;P319L_V340M;P317G;R320S;R320Q;R314P_V340R;V340A;H245G_P319L;R320T;R314P_P318R;A248G_F322I;R320N;P317N;R314D;R314Y;R314P_F322I;P319G_V340M;P317S_V340R;R314V;P317R_P319D;P317R_R320D;P319D_R320D;Δ319_Δ320;P317G_P318G_Δ319_Δ320;P318E_Δ319_Δ320;P318G_Δ319_Δ320;P318K_Δ319_Δ320;P317R_P318E_Δ319_320;P317R_P318G_Δ319_Δ320及びP317G_P318K_Δ319_Δ320。
より好ましい実施形態では、HSV2 gE2外部ドメインは、338_インサートARAA; P317R; P319D; R320D; A248T_V340W; V340W; A248T; P318I及びA246Wから選択される、配列番号7に示される配列に関する突然変異又は突然変異の組合せを含む。
上に列記の例示的な置換、欠失及び挿入の突然変異に対して、他のHSV2 gE2外部ドメイン配列、例えば、表1に列記されており図3に提供されるアラインメント上で示されている配列中の対応する突然変異も、本発明の範囲内である。
上に列記の例示的な単一及び二重置換突然変異並びに挿入突然変異の全ての可能な組合せもまた、本発明の範囲内である。
適切には、HSV1 gE1外部ドメインは、配列番号9に示されるHSV1 gE1外部ドメイン配列のH247、P319及びP321から選択される位置に1つ以上の突然変異(挿入、置換又は欠失)を含む。
HSV1 gE1外部ドメインと抗体Fcドメインとの間の結合親和性を減少又は消失させるのに本明細書で使用することができる例示的な突然変異には、以下から選択される、配列番号9に示される配列の単一点置換突然変異: H247A、H247K、P319R、P321A、P321R、P321G、P321K、P321T、A339G、P321D、P321S、A340D、N243A及びR322D、並びに、以下から選択される、配列番号9に示される配列の二重点置換突然変異: H247A/P321A、H247A/P321R、H247A/P321G、H247A/P321K、H247A/P321T、N243A/R322D、N243A/P321D、H247G/P319G、P319G/P321G、A340G/S341G/V342Gが含まれる。
HSV1 gE1外部ドメインと抗体Fcドメインとの間の結合親和性を減少又は消失させるのに本明細書で使用することができる例示的な突然変異には、以下から選択される挿入突然変異も含まれる:
・ 配列番号9のアミノ酸残基Y277とE278の間のペプチド配列LDIGEの挿入(277_インサート_LDIGE);
・ 配列番号9のアミノ酸残基S291とP292の間のペプチド配列ADIGLの挿入(291_挿入ADIGL);
・ 配列番号9のアミノ酸残基A339とA340の間のペプチド配列ARAAの挿入(339_インサート_ARAA);
・ 配列番号9のアミノ酸残基A340とS341の間のペプチド配列ARAAの挿入(340_インサート_ARAA); 及び
・ 配列番号9のアミノ酸残基D348とA349の間のペプチド配列ADITの挿入(348_インサート_ADIT)。
・ 配列番号9のアミノ酸残基Y277とE278の間のペプチド配列LDIGEの挿入(277_インサート_LDIGE);
・ 配列番号9のアミノ酸残基S291とP292の間のペプチド配列ADIGLの挿入(291_挿入ADIGL);
・ 配列番号9のアミノ酸残基A339とA340の間のペプチド配列ARAAの挿入(339_インサート_ARAA);
・ 配列番号9のアミノ酸残基A340とS341の間のペプチド配列ARAAの挿入(340_インサート_ARAA); 及び
・ 配列番号9のアミノ酸残基D348とA349の間のペプチド配列ADITの挿入(348_インサート_ADIT)。
好ましい実施形態では、HSV1 gE1外部ドメインは、以下から選択される、配列番号9に示される配列に関する突然変異又は突然変異の組合せを含む:
P321K; P321D; R322D; N243A_R322D; N243A_P321D; A340G_S341G_V342G; H247G_P319G; P321R; H247A_P321K; 291_インサートADIGL; 339_インサートARAA; P319R; P319G_P321G及びH247A_P321R。
P321K; P321D; R322D; N243A_R322D; N243A_P321D; A340G_S341G_V342G; H247G_P319G; P321R; H247A_P321K; 291_インサートADIGL; 339_インサートARAA; P319R; P319G_P321G及びH247A_P321R。
より好ましい実施形態では、HSV1 gE1外部ドメインは、P321D; R322D; A340G_S341G_V342G及びP319Rから選択される、配列番号9に示される配列に関する突然変異又は突然変異の組合せを含む。
上に列記の例示的な単一及び二重置換突然変異並びに挿入突然変異に対して、他のHSV1 gE1外部ドメイン配列中の対応する突然変異も、本発明の範囲内である。
上に列記の例示的な単一及び二重置換突然変異並びに挿入突然変異の全ての可能な組合せもまた、本発明の範囲内である。
好ましい実施形態では、ウイルスFc受容体又はその免疫原性断片は、前記ウイルス由来の結合パートナー又はその断片とのヘテロ二量体の一部である。
本明細書で使用される場合、「結合パートナー」とは、Fc受容体又はその免疫原性断片と非共有結合のヘテロ二量体複合体を形成するウイルスタンパク質(又は糖タンパク質)又はその断片である。
好ましい実施形態では、ウイルスFc受容体は、HSV2 gE2又はその免疫原性断片であり、結合パートナーは、HSV2 gI2又はその断片である。
本明細書では、「HSV2 gI2」(又は「HSV2 gI」)とは、HSV2遺伝子US7によってコードされ且つ感染細胞の表面に提示されるHSV2 gI糖タンパク質であり、その表面でこれはHSV2 gE2と会合してヘテロ二量体を形成する。適切には、HSV2 gI2は、表2に示されるHSV2 gI糖タンパク質、又はそれと少なくとも60%、65%、70%、75％、80％、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは99.5%同一であるであるそれ由来のバリアントから選択される。
好ましい実施形態では、HSV2 gI2は、配列番号2に示されるアミノ酸配列を有するHSV2系統SD90e由来のgI(Genbank受託番号AHG54731.1、UniProtKB受託番号: A8U5L5、配列番号2)、又はそれと少なくとも60%、65%、70%、75％、80％、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは99.5%同一であるそれ由来のバリアントである。
別の好ましい実施形態では、ウイルスFc受容体はHSV1 gE1又はその免疫原性断片であり、結合パートナーはHSV1 gI1又はその断片である。
本明細書では、「HSV1 gI1」(又は「HSV1 gI」)とは、HSV1遺伝子US7によってコードされ且つ感染細胞の表面に提示されるHSV1 gI糖タンパク質であり、その表面でこれはHSV1 gE1と会合してヘテロ二量体を形成する。適切には、HSV1 gI1は、配列番号4に示されるアミノ酸配列を有するHSV1系統17由来のgI(UniProtKB受託番号: P06487、配列番号4)、又はそれと少なくとも60%、65%、70%、75％、80％、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは99.5%同一であるそれ由来のバリアントである。
一実施形態では、ウイルスFcR結合パートナーの断片が使用される。
本明細書で使用される場合、タンパク質又はペプチドに適用される「断片」という用語は、より大きなタンパク質又はペプチドのうちのサブシーケンスを指す。タンパク質又はペプチドの「断片」とは、長さが少なくとも約10個のアミノ酸である(連続したアミノ酸として天然に存在する複数のアミノ酸、例えば単一のリニアエピトープの場合)、例えば、長さが少なくとも約15、20、30、40、50、60、100、200、300個以上のアミノ酸(及び中間の任意の整数値)である。
好ましい実施形態では、ウイルスFcR結合パートナー断片は免疫原性断片である。
本明細書で使用される場合、「ウイルスFcR結合パートナーの断片」とは、少なくとも10、15、20、30、40、50、60、100、200、300個以上のアミノ酸を有する天然に存在するウイルスFcR結合パートナーの断片、又は天然に存在するウイルスFcR結合パートナーと少なくとも60%、65%、70%、75％、80％、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は99.5%の配列同一性のアミノ酸配列を有するペプチドを(又は少なくとも約10、15、20、30、40、50、60個以上のアミノ酸を有する、天然に存在するウイルスFcR結合パートナーの断片を)指す。したがって、ウイルスFcR結合パートナーの断片は、天然に存在するウイルスFcR結合パートナーの、少なくとも10個のアミノ酸の断片とすることができ、且つ1つ以上のアミノ酸置換、欠失又は付加を含むことができる。
コードされたウイルスFcR結合パートナー断片のいずれもが、必要な場合に最初のメチオニン残基をさらに含むことができる。
膜貫通タンパク質は、通常の培養状態下で細胞膜を越えてまたがる能力を有する膜内在性タンパク質のタイプである。本明細書では、膜貫通ドメインとは、通常の培養状態下で細胞膜内にある膜貫通タンパク質のセクションである。本明細書では、細胞質ドメインとは、通常の培養状態下で細胞膜の細胞質側にある膜貫通タンパク質のセクションである。本明細書では、外部ドメインとは、通常の培養状態下で細胞膜の外側にある膜貫通タンパク質のセクションである。
適切には、ウイルスFcR結合パートナー又はその断片は膜貫通ドメインを含まない。適切には、ウイルスFcR結合パートナー又はその免疫原性断片は細胞質ドメインを含まない。好ましくは、ウイルスFcR結合パートナー又はその免疫原性断片は膜貫通ドメインも細胞質ドメインも含まない。換言すれば、好ましい実施形態では、ウイルスFcR結合パートナー又は免疫原性断片はウイルスFcR結合パートナー外部ドメイン(又は細胞外ドメイン)からなる。より好ましくは、ウイルスFcR結合パートナー又は免疫原性断片は、HSV2 gI2外部ドメイン及びHSV1 gI1外部ドメインから選択される。
好ましい実施形態では、ウイルスFcR結合パートナー外部ドメインは、配列番号8(配列番号2のアミノ酸残基1～256に相当する)で示されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも60%、65%、70%、75％、80％、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは99.5%同一である配列を含むか又はそれらからなるHSV2 gI2外部ドメインである。適切には、ウイルスFcR外部ドメインは、表2又は図4に示される配列から選択される配列を有する。好ましい実施形態では、ウイルスFcR外部ドメインは、配列番号8と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%又は100%同一であるHSV2 gE2外部ドメインである。
適切には、ウイルスFcR結合パートナーHSV2 gI2外部ドメインは、配列番号8に示されるアミノ酸配列に対して、1個以上のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を含むことができる。
別の実施形態では、ウイルスFcR結合パートナーは、配列番号2のアミノ酸残基1～262に相当するアミノ酸配列、又はそれと少なくとも60%、65%、70%、75％、80％、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは99.5%同一である配列を含むか又はそれらからなるHSV2 gI2外部ドメインである。適切には、ウイルスFcR結合パートナーHSV2 gI2外部ドメインは、配列番号2のアミノ酸残基1～262に相当するアミノ酸配列に対して、1個以上のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を含むことができる。
別の実施形態では、ウイルスFcR結合パートナー外部ドメインは、配列番号10(配列番号4のアミノ酸残基1～270に相当する)で示されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも60%、65%、70%、75％、80％、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは99.5%同一である配列を含むか又はそれらからなるHSV1 gI1外部ドメインである。好ましい実施形態では、ウイルスFcR外部ドメインは、配列番号10と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%又は100%同一であるHSV1 gE1外部ドメインである。
適切には、ウイルスFcR結合パートナーHSV1 gI1外部ドメインは、配列番号10に示されるアミノ酸配列に対して、1個以上のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を含むことができる。
別の実施形態では、ウイルスFcR結合パートナーは、配列番号4のアミノ酸残基1～276に相当するアミノ酸配列、又はそれと少なくとも60%、65%、70%、75％、80％、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは99.5%同一である配列を含むか又はそれらからなるHSV1 gI1外部ドメインである。適切には、ウイルスFcR結合パートナーHSV1 gI1外部ドメインは、配列番号4のアミノ酸残基1～276に相当するアミノ酸配列に対して、1個以上のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を含むことができる。
HSVに感染した対象においてgD、gB及びgCに対する抗体が検出され、程度は低いがgH/gLに対する抗体が検出される。優性な中和応答はgDに対するものであった(Cairns, Tina M., et al. "Dissection of the antibody response against herpes simplex virus glycoproteins in naturally infected humans." Journal of virology 88.21 (2014): 12612-12622.)。
一実施形態では、ウイルスFc受容体又はその免疫原性断片は、免疫優性ウイルス抗原との組合せで対象に投与されない。
免疫優性とは、病原体によって産生される抗原ペプチドの部分集団に対してのみ免疫応答が開始される免疫学的現象である。免疫優性は抗体媒介性及び細胞媒介性免疫について証明されてきた。本明細書で使用される場合、「免疫優性抗原」とは免疫優性エピトープを含む抗原である。対照的に、「準優性抗原」とは、免疫優性エピトープを含まない、又は換言すれば、準優性エピトープのみを含む抗原である。本明細書で使用される場合、「免疫優性エピトープ」とは、病原体からの他のエピトープと比較して、同じ病原体への免疫応答過程で抗体を中和することによって、優性に標的化されるか又はより高度に標的化されるエピトープである。本明細書で使用される場合、「準優性エピトープ」とは、病原体からの他のエピトープと比較して、同じ病原体への免疫応答過程で抗体を中和することによって、標的化されない又はより低い程度に標的化されるエピトープである。例えば、gD2はHSV2の免疫優性抗原であり、gD1はHSV1の免疫優性抗原である。対照的に、gB2、gC2、gE2/gI2及びgH2/gL2は、HSV2の準優性抗原であり、gB1、gCl、gE1/gI1及びgH1/gL1ヘテロ二量体はHSV1の準優性抗原である。
適切には、ウイルスFc受容体がHSV2 gE2又はHSV1 gE1である場合、Fc受容体又はその免疫原性断片は、HSV2 gD2若しくはHSV1 gD1、又は免疫優性エピトープを含むその断片と一緒に対象に投与されない。ウイルスFc受容体がHSV2 gE2である場合の特定の実施形態では、ウイルスFc受容体又はその免疫原性断片は、HSV2 gD2又は免疫優性エピトープを含むその断片と一緒に対象に投与されない。ウイルスFc受容体がHSV1 gE1である場合の別の特定の実施形態では、ウイルスFc受容体又はその免疫原性断片は、HSV1 gD1又は免疫優性エピトープを含むその断片と一緒に対象に投与されない。
一実施形態では、ウイルスFc受容体は水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)gEではない。
HSV1及びHSV2由来の糖タンパク質gCは、補体を阻害することによって免疫回避メカニズムにも関与している(Awasthi, Sita, et al. "Blocking herpes simplex virus 2 glycoprotein E immune evasion as an approach to enhance efficacy of a trivalent subunit antigen vaccine for genital herpes." Journal of virology 88.15 (2014): 8421-8432.)。
一実施形態では、ウイルスFc受容体はHSV2 gE2であり、HSV2 gC2又はその免疫原性断片と一緒に対象に投与される。
一実施形態では、ウイルスFc受容体はHSV1 gE1であり、HSV1 gC1又はその免疫原性断片と一緒に対象に投与される。
一態様では、本発明は、組換えウイルスFcR又はその免疫原性断片を提供し、ここで、ヒト抗体Fcドメインに結合するウイルスFcR又はその免疫原性断片の能力は、対応する天然ウイルスFc受容体と比較して減少又は消失している。
適切には、組換えウイルスFc受容体又はその免疫原性断片は、ウイルスFc受容体又はその免疫原性断片の天然配列と比較して1個以上のアミノ酸置換、欠失又は挿入を含んでおり、この置換、欠失又は挿入によって、天然ウイルスFc受容体と比較してウイルスFcR又はその免疫原性断片と抗体Fcドメインとの間の結合親和性が減少又は消失している。
好ましい実施形態では、組換えウイルスFcR又はその免疫原性断片とヒトIgGとの間のkonは、対応する天然ウイルスFcRとヒトIgGとの間のkonよりも低い(遅いバインダー)。好ましい実施形態では、組換えウイルスFcR又はその免疫原性断片とヒトIgGとの間のkoffは、対応する天然ウイルスFcRとヒトIgGとの間のkoffよりも高い(速いリリーサー)。より好ましい実施形態では、組換えウイルスFcR又はその免疫原性断片とヒトIgGとの間のkonは、対応する天然ウイルスFcRとヒトIgGとの間のkonよりも低く、組換えウイルスFcR又はその免疫原性断片とヒトIgGとの間のkoffは、対応する天然ウイルスFcRとヒトIgGとの間のkoffよりも高い(遅いバインダー/速いリリーサー)。
好ましい実施形態では、組換えウイルスFcR又はその免疫原性断片とヒトIgGとの間の平衡解離定数(KD)は、対応する天然ウイルスFcRとヒトIgGとの間のKDよりも高い。
好ましい実施形態では、組換えウイルスFcR又はその免疫原性断片とヒトIgGとの間の相対親和性は、対応する天然ウイルスFcRとヒトIgGとの間の親和性の100%未満、例えば90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、15%又は10%未満である。より好ましい実施形態では、組換えウイルスFcR又はその免疫原性断片とヒトIgGとの間の相対親和性は、対応する天然ウイルスFcRとヒトIgGとの間の親和性の15%未満、より好ましくはさらに10%未満である。
好ましい実施形態では、組換えウイルスFcR又はその免疫原性断片とヒトIgGとの間の平衡解離定数(KD)は、2×10-7Mより高く、好ましくは5×10-7Mより高く、より好ましくは1×10-6Mより高い。
或いは、ウイルスFcR又はその免疫原性断片がヒト抗体Fcドメインに結合する能力は、実施例3及び4に記載のように、バイオレイヤー干渉計法アッセイで応答(nmで表現して)を測定することによって評価することができる。
好ましい実施形態では、ウイルスFcR又はその免疫原性断片とヒトIgGとの間の結合に相当するバイオレイヤー干渉計法アッセイにおける応答は、対応する天然ウイルスFcRで得られた応答の80%未満、適切には、70%、60%、50%、40%未満である。好ましい実施形態では、ウイルスFcR又はその免疫原性断片とヒトIgGとの間の結合に相当するバイオレイヤー干渉計法アッセイにおける応答は、0.4nmより低く、適切には0.3nm、0.2nm又は0.1nmより低い。
好ましい実施形態では、組換えウイルスFcR又はその免疫原性断片は、HSV2 gE2又はその免疫原性断片である。適切には、組換えHSV2 gE2又はその免疫原性断片は、配列番号1に示されるHSV2 gE2配列のN241、H245、A246、A248、R314、P317、P318、P319、F322、R320、A337、S338又はV340から選択される位置に1つ以上の突然変異(挿入、置換又は欠失)を含む。
組換えHSV2 gE2又はその免疫原性断片と抗体Fcドメインとの間の結合親和性を減少又は消失させるのに本明細書で使用することができる例示的な突然変異には、以下から選択される、配列番号1に示される配列の単一点置換突然変異が含まれる:
H245A、H245K、P317R、P319A、P319R、P319G、P319K、P319T、A337G、P319D、P319S、S338D、N241A、R320D、H245E、H245V、H245R、H245D、H245Q、H245G、H245I、H245K、H245S、H245T、A246W、A248K、A248T、A248G、R314A、R314N、R314D、R314Q、R314E、R314G、R314I、R314L、R314K、R314M、R314F、R314P、R314S、R314T、R314Y、R314V、P317N、P317G、P317I、P317L、P317K、P317F、P317S、P318R、P318D、P318Q、P318I、P318S、P318T、P318Y、P319L、R320A、R320S、R320N、R320Q、R320E、R320G、R320H、R320I、R320L、R320M、R320P、R320T、R320V、F322A、F322N、F322I、F322K、F322P、F322T、S338G、S338E、S338L、S338T、V340A、V340R、V340D、V340Q、V340M、V340F、V340P及びV340W。
H245A、H245K、P317R、P319A、P319R、P319G、P319K、P319T、A337G、P319D、P319S、S338D、N241A、R320D、H245E、H245V、H245R、H245D、H245Q、H245G、H245I、H245K、H245S、H245T、A246W、A248K、A248T、A248G、R314A、R314N、R314D、R314Q、R314E、R314G、R314I、R314L、R314K、R314M、R314F、R314P、R314S、R314T、R314Y、R314V、P317N、P317G、P317I、P317L、P317K、P317F、P317S、P318R、P318D、P318Q、P318I、P318S、P318T、P318Y、P319L、R320A、R320S、R320N、R320Q、R320E、R320G、R320H、R320I、R320L、R320M、R320P、R320T、R320V、F322A、F322N、F322I、F322K、F322P、F322T、S338G、S338E、S338L、S338T、V340A、V340R、V340D、V340Q、V340M、V340F、V340P及びV340W。
組換えHSV2 gE2又はその免疫原性断片と抗体Fcドメインとの間の結合親和性を減少又は消失させるのに本明細書で使用することができる例示的な突然変異には、以下から選択される、配列番号1に示される配列の二重点置換突然変異も含まれる:
H245A及びP319A;H245A及びP319R;H245A及びP319G;H245A及びP319K;H245A及びP319T;N241A及びR320D;N241A及びP319D;A246W及びP317K;A246W及びP317F;A246W及びP317S;A246W及びR320D;A246W及びR320G;A246W及びR320T;A248K及びV340R;A248K及びV340M;A248K及びV340W;A248T及びV340R;A248T及びV340M;A248T及びV340W;A248G及びV340R;A248G及びV340M;A248G及びV340W;A248K及びF322A;A248K及びF322I;A248K及びF322P;A248T及びF322A;A248T及びF322I;A248T及びF322P;A248G及びF322A;A248G及びF322I;A248G及びF322P;H245A及びR320D;H245A及びR320G;H245A及びR320T;H245G及びR320D;H245G及びR320G;H245G及びR320T;H245S及びR320D;H245S及びR320G;H245S及びR320T;H245A及びP319G;H245A及びP319L;H245G及びP319G;H245G及びP319L;H245S及びP319G;H245S及びP319L;R314G及びP318R;R314G及びP318D;R314G及びP318I;R314L及びP318R;R314L及びP318D;R314L及びP318I;R314P及びP318R;R314P及びP318D;R314P及びP318I;R314G及びF322A;R314G及びF322I;R314G及びF322P;R314L及びF322A;R314L及びF322I;R314L及びF322P;R314P及びF322A;R314P及びF322I;R314P及びF322P;R314G及びV340R;R314G及びV340M;R314G及びV340W;R314L及びV340R;R314L及びV340M;R314L及びV340W;R314P及びV340R;R314P及びV340M;R314P及びV340W;P317K及びV340R;P317K及びV340M;P317K及びV340W;P317F及びV340R;P317F及びV340M;P317F及びV340W;P317S及びV340R;P317S及びV340M;P317S及びV340W;P317K及びS338G;P317K及びS338H;P317K及びS338L;P317F及びS338G;P317F及びS338H;P317F及びS338L;P317S及びS338G;P317S及びS338H;P317S及びS338L;P318R及びS338G;P318R及びS338H;P318R及びS338L;P318D及びS338G;P318D及びS338H;P318D及びS338L;P318I及びS338G;P318I及びS338H;P318I及びS338L;P319G及びV340R;P319G及びV340M;P319G及びV340W;P319L及びV340R;P319L及びV340M;P319L及びV340W;P317R及びP319D;P317R及びR320D;P319D及びR320D。
H245A及びP319A;H245A及びP319R;H245A及びP319G;H245A及びP319K;H245A及びP319T;N241A及びR320D;N241A及びP319D;A246W及びP317K;A246W及びP317F;A246W及びP317S;A246W及びR320D;A246W及びR320G;A246W及びR320T;A248K及びV340R;A248K及びV340M;A248K及びV340W;A248T及びV340R;A248T及びV340M;A248T及びV340W;A248G及びV340R;A248G及びV340M;A248G及びV340W;A248K及びF322A;A248K及びF322I;A248K及びF322P;A248T及びF322A;A248T及びF322I;A248T及びF322P;A248G及びF322A;A248G及びF322I;A248G及びF322P;H245A及びR320D;H245A及びR320G;H245A及びR320T;H245G及びR320D;H245G及びR320G;H245G及びR320T;H245S及びR320D;H245S及びR320G;H245S及びR320T;H245A及びP319G;H245A及びP319L;H245G及びP319G;H245G及びP319L;H245S及びP319G;H245S及びP319L;R314G及びP318R;R314G及びP318D;R314G及びP318I;R314L及びP318R;R314L及びP318D;R314L及びP318I;R314P及びP318R;R314P及びP318D;R314P及びP318I;R314G及びF322A;R314G及びF322I;R314G及びF322P;R314L及びF322A;R314L及びF322I;R314L及びF322P;R314P及びF322A;R314P及びF322I;R314P及びF322P;R314G及びV340R;R314G及びV340M;R314G及びV340W;R314L及びV340R;R314L及びV340M;R314L及びV340W;R314P及びV340R;R314P及びV340M;R314P及びV340W;P317K及びV340R;P317K及びV340M;P317K及びV340W;P317F及びV340R;P317F及びV340M;P317F及びV340W;P317S及びV340R;P317S及びV340M;P317S及びV340W;P317K及びS338G;P317K及びS338H;P317K及びS338L;P317F及びS338G;P317F及びS338H;P317F及びS338L;P317S及びS338G;P317S及びS338H;P317S及びS338L;P318R及びS338G;P318R及びS338H;P318R及びS338L;P318D及びS338G;P318D及びS338H;P318D及びS338L;P318I及びS338G;P318I及びS338H;P318I及びS338L;P319G及びV340R;P319G及びV340M;P319G及びV340W;P319L及びV340R;P319L及びV340M;P319L及びV340W;P317R及びP319D;P317R及びR320D;P319D及びR320D。
組換えHSV2 gE2又はその免疫原性断片と抗体Fcドメインとの間の結合親和性を減少又は消失させるのに本明細書で使用することができる例示的な突然変異には、単独で又は置換突然変異との組合せで、配列番号1に示される配列の位置P319及び/又はR320での欠失突然変異、特に以下から選択される突然変異も含まれる:
P319欠失; R320欠失; P319欠失/R320欠失; P319欠失/R320欠失/P317G/P318G; P319欠失/R320欠失/P318E; P319欠失/R320欠失/P318G; P319欠失/R320欠失/P318K; P319欠失/R320欠失/P317R/P318E; P319欠失/R320欠失/P317R/P318G; P319欠失/R320欠失/P317R/P318K; P319欠失/R320欠失/P317G/P318K。
P319欠失; R320欠失; P319欠失/R320欠失; P319欠失/R320欠失/P317G/P318G; P319欠失/R320欠失/P318E; P319欠失/R320欠失/P318G; P319欠失/R320欠失/P318K; P319欠失/R320欠失/P317R/P318E; P319欠失/R320欠失/P317R/P318G; P319欠失/R320欠失/P317R/P318K; P319欠失/R320欠失/P317G/P318K。
組換えHSV2 gE2又はその免疫原性断片と抗体Fcドメインとの間の結合親和性を減少又は消失させるのに本明細書で使用することができる例示的な突然変異には、以下から選択される挿入突然変異も含まれる:
・ 配列番号1のアミノ酸残基Y275とE276の間のペプチド配列LDIGEの挿入(275_インサート_LDIGE)、
・ 配列番号1のアミノ酸残基S289とP290の間のペプチド配列ADIGLの挿入(289_インサートADIGL)、
・ 配列番号1のアミノ酸残基A337とS338の間のペプチド配列ARAAの挿入(337_インサート_ARAA)、
・ 配列番号1のアミノ酸残基S338とT339の間のペプチド配列ARAAの挿入(338_インサート_ARAA)、及び
・ 配列番号1のアミノ酸残基H346とA347の間のペプチド配列ADITの挿入(346_インサート_ADIT)。
・ 配列番号1のアミノ酸残基Y275とE276の間のペプチド配列LDIGEの挿入(275_インサート_LDIGE)、
・ 配列番号1のアミノ酸残基S289とP290の間のペプチド配列ADIGLの挿入(289_インサートADIGL)、
・ 配列番号1のアミノ酸残基A337とS338の間のペプチド配列ARAAの挿入(337_インサート_ARAA)、
・ 配列番号1のアミノ酸残基S338とT339の間のペプチド配列ARAAの挿入(338_インサート_ARAA)、及び
・ 配列番号1のアミノ酸残基H346とA347の間のペプチド配列ADITの挿入(346_インサート_ADIT)。
好ましい実施形態では、組換えHSV2 gE2又はその免疫原性断片は、以下から選択される、配列番号1に示される配列に関する突然変異又は突然変異の組合せを含む:
289_インサートADIGL;338_インサートARAA;H245K;P317R;P319R;P319G;P319K;H245A_P319R;H245A_P319G;H245A_P319K;H245A_P319T;P319D;S338D;R320D;N241A_R320D;A248K_V340M;P318Y;A248K_V340R;A248T_V340W;A248K_V340W;A246W_R320G;A246W_P317K;A246W_R320D;A246W_R320T;V340W;A248G_V340W;H245G_R320D;P318D;A246W_P317F;P319G_V340W;A248T_V340M;P317K_V340W;V340F;V340D;H245A_R320D;P317F_V340W;A246W_P317S;H245S_R320D;R314G_P318D;A248T;P318S;P317K;P317S_V340W;H245D;R314P_V340W;R314L_318D;P319L_V340W;P317F;P318D_S338G;R314G_V340W;P317K_S338H;R314L_V340W;P318R;P318Q;P317F_S338G;R314G_P318I;H245G_P319G;P317L;P318I;A248T_F322A;H245E;P318T;P318R_S338G;P318D_S338H;P317F_S338H;A248T_V340R;A248T_F322I;H245A_R320G;P318R_S338H;H245S_R320G;P317K_S338G;A248T_F322P;V340R;R314L_P318R;H245S_R320T;R314G_P318R;R320E;H245G_R320G;H245A_R320T;A246W;P318I_S338G;P317K_V340M;P317I;R320H;R314P_P318I;P318I_S338H;P317F_V340M;H245A_P319G;H245A_P319L;R320P;H245G_R320T;R314L_V340R;P319G_V340R;R314G_F322I;R314L_P318I;R320A;R314N;P317F_V340R;P318D_S338L;A248G_V340R;R314E;R314P_P318D;H245S_P319G;V340Q;A248K_F322I;R320G;H245S_P319L;R314F;P319L;P317K_S338L;P319L_V340M;P317G;R320S;R320Q;R314P_V340R;V340A;H245G_P319L;R320T;R314P_P318R;A248G_F322I;R320N;P317N;R314D;R314Y;R314P_F322I;P319G_V340M;P317S_V340R;R314V;P317R_P319D;P317R_R320D;P319D_R320D;Δ319_Δ320;P317G_P318G_Δ319_Δ320;P318E_Δ319_Δ320;P318G_Δ319_Δ320;P318K_Δ319_Δ320;P317R_P318E_Δ319_320;P317R_P318G_Δ319_Δ320及びP317G_P318K_Δ319_Δ320。
289_インサートADIGL;338_インサートARAA;H245K;P317R;P319R;P319G;P319K;H245A_P319R;H245A_P319G;H245A_P319K;H245A_P319T;P319D;S338D;R320D;N241A_R320D;A248K_V340M;P318Y;A248K_V340R;A248T_V340W;A248K_V340W;A246W_R320G;A246W_P317K;A246W_R320D;A246W_R320T;V340W;A248G_V340W;H245G_R320D;P318D;A246W_P317F;P319G_V340W;A248T_V340M;P317K_V340W;V340F;V340D;H245A_R320D;P317F_V340W;A246W_P317S;H245S_R320D;R314G_P318D;A248T;P318S;P317K;P317S_V340W;H245D;R314P_V340W;R314L_318D;P319L_V340W;P317F;P318D_S338G;R314G_V340W;P317K_S338H;R314L_V340W;P318R;P318Q;P317F_S338G;R314G_P318I;H245G_P319G;P317L;P318I;A248T_F322A;H245E;P318T;P318R_S338G;P318D_S338H;P317F_S338H;A248T_V340R;A248T_F322I;H245A_R320G;P318R_S338H;H245S_R320G;P317K_S338G;A248T_F322P;V340R;R314L_P318R;H245S_R320T;R314G_P318R;R320E;H245G_R320G;H245A_R320T;A246W;P318I_S338G;P317K_V340M;P317I;R320H;R314P_P318I;P318I_S338H;P317F_V340M;H245A_P319G;H245A_P319L;R320P;H245G_R320T;R314L_V340R;P319G_V340R;R314G_F322I;R314L_P318I;R320A;R314N;P317F_V340R;P318D_S338L;A248G_V340R;R314E;R314P_P318D;H245S_P319G;V340Q;A248K_F322I;R320G;H245S_P319L;R314F;P319L;P317K_S338L;P319L_V340M;P317G;R320S;R320Q;R314P_V340R;V340A;H245G_P319L;R320T;R314P_P318R;A248G_F322I;R320N;P317N;R314D;R314Y;R314P_F322I;P319G_V340M;P317S_V340R;R314V;P317R_P319D;P317R_R320D;P319D_R320D;Δ319_Δ320;P317G_P318G_Δ319_Δ320;P318E_Δ319_Δ320;P318G_Δ319_Δ320;P318K_Δ319_Δ320;P317R_P318E_Δ319_320;P317R_P318G_Δ319_Δ320及びP317G_P318K_Δ319_Δ320。
より好ましい実施形態では、HSV2 gE2又はその免疫原性断片は、338_インサートARAA; P317R; P319D; R320D; A248T_V340W; V340W; A248T; P318I及びA246Wから選択される配列番号1に示される配列に関する突然変異又は突然変異の組合せを含む。
上に列記の例示的な単一及び二重置換、選択並びに突然変異並びに挿入突然変異に対して、他のHSV2 gE2配列、例えば、表1に列記されており図3に提供されるアラインメント上で示されている配列中の対応する突然変異も、本発明の範囲内である。
上に列記の例示的な単一及び二重置換突然変異並びに挿入突然変異の全ての可能な組合せもまた、本発明の範囲内である。
好ましい実施形態では、組換えHSV2 gE2又はその免疫原性断片は、本明細書に記載の組換えHSV2 gE2外部ドメインである。
別の実施形態では、組換えウイルスFcR又はその免疫原性断片は、組換えHSV1 gE1又はその免疫原性断片である。適切には、組換えHSV1 gE1又はその免疫原性ドメインは、配列番号3に示されるHSV1 gE1配列のH247、P319及びP321から選択される位置に1つ以上の突然変異(挿入、置換又は欠失)を含む。
組換えHSV1 gE1又はその免疫原性断片と抗体Fcドメインとの間の結合親和性を減少又は消失させるのに本明細書で使用することができる例示的な突然変異には、以下から選択される、配列番号3に示される配列の単一点置換突然変異: H247A、H247K、P319R、P321A、P321R、P321G、P321K、P321T、A339G、P321D、P321S、A340D、N243A及びR322D、並びに、以下から選択される、配列番号3に示される配列の二重点置換突然変異: H247A/P321A、H247A/P321R、H247A/P321G、H247A/P321K、H247A/P321T、N243A/R322D、N243A/P321D、H247G/P319G、P319G/P321G、A340G/S341G/V342Gが含まれる。
組換えHSV1 gE1又はその免疫原性断片と抗体Fcドメインとの間の結合親和性を減少又は消失させるのに本明細書で使用することができる例示的な突然変異には、以下から選択される挿入突然変異も含まれる:
・ 配列番号3のアミノ酸残基Y277とE278の間のペプチド配列LDIGEの挿入(277_インサート_LDIGE);
・ 配列番号3のアミノ酸残基S291とP292の間のペプチド配列ADIGLの挿入(291_インサート_ADIGL);
・ 配列番号3のアミノ酸残基A339とA340の間のペプチド配列ARAAの挿入(339_インサート_ARAA);
・ 配列番号3のアミノ酸残基A340とS341の間のペプチド配列ARAAの挿入(340_インサート_ARAA); 及び
・ 配列番号3のアミノ酸残基D348とA349の間のペプチド配列ADITの挿入(348_インサート_ADIT)。
・ 配列番号3のアミノ酸残基Y277とE278の間のペプチド配列LDIGEの挿入(277_インサート_LDIGE);
・ 配列番号3のアミノ酸残基S291とP292の間のペプチド配列ADIGLの挿入(291_インサート_ADIGL);
・ 配列番号3のアミノ酸残基A339とA340の間のペプチド配列ARAAの挿入(339_インサート_ARAA);
・ 配列番号3のアミノ酸残基A340とS341の間のペプチド配列ARAAの挿入(340_インサート_ARAA); 及び
・ 配列番号3のアミノ酸残基D348とA349の間のペプチド配列ADITの挿入(348_インサート_ADIT)。
好ましい実施形態では、HSV1 gE1又はその免疫原性断片は、以下から選択される、配列番号3に示される配列に関する突然変異又は突然変異の組合せを含む:
P321K; P321D; R322D; N243A_R322D; N243A_P321D; A340G_S341G_V342G; H247G_P319G; P321R; H247A_P321K; 291_インサートADIGL; 339_インサートARAA; P319R; P319G_P321G及びH247A_P321R。
P321K; P321D; R322D; N243A_R322D; N243A_P321D; A340G_S341G_V342G; H247G_P319G; P321R; H247A_P321K; 291_インサートADIGL; 339_インサートARAA; P319R; P319G_P321G及びH247A_P321R。
より好ましい実施形態では、HSV1 gE1又はその免疫原性断片は、P321D; R322D; A340G_S341G_V342G及びP319Rから選択される、配列番号3に示される配列に関する突然変異又は突然変異の組合せを含む。
上に列記の例示的な単一及び二重置換突然変異並びに挿入突然変異に対して、他のHSV1 gE1配列中の対応する突然変異も、本発明の範囲内である。
上に列記の例示的な単一及び二重置換突然変異並びに挿入突然変異の全ての可能な組合せもまた、本発明の範囲内である。
好ましい実施形態では、組換えHSV1 gE1又はその免疫原性断片は、本明細書に記載の組換えHSV1 gE1外部ドメインである。
好ましい実施形態では、組換えウイルスFcR又はその免疫原性断片は、前記ウイルス由来の結合パートナー又はその断片とのヘテロ二量体の一部である。
好ましい実施形態では、組換えウイルスFc受容体は組換えHSV2 gE2又はその免疫原性断片であり、結合パートナーは本明細書に記載のHSV2 gI2又はその断片である。
別の好ましい実施形態では、組換えウイルスFc受容体は組換えHSV1 gE1又はその免疫原性断片であり、結合パートナーはHSV1 gI1又はその断片又は本明細書に記載のその断片である。
別の態様では、本発明は、治療での使用のための、HSVウイルス由来のFc受容体又はその免疫原性断片及び前記HSVウイルス由来の結合パートナー又はその断片を含むか又はそれらからなるヘテロ二量体を提供する。
ヘテロ二量体の一実施形態では、ウイルスFc受容体はHSV2 gE2であり、結合パートナーはHSV2 gI2である。別の実施形態では、ウイルスFc受容体はHSV1 gE1であり、結合パートナーはHSV1 gI1である。
別の態様では、本発明は、HSVウイルス由来のFc受容体又はその免疫原性断片、前記HSVウイルス由来の結合パートナー又はその断片、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
医薬組成物の一実施形態では、ウイルスFc受容体はHSV2 gE2であり、結合パートナーはHSV2 gI2である。医薬組成物の別の実施形態では、ウイルスFc受容体はHSV1 gE1であり、結合パートナーはHSV1 gI1である。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のウイルス由来のFc受容体又はその免疫原性断片及び薬学的に許容される担体を含む免疫原性組成物を提供する。適切には、免疫原性組成物は、薬学的に又は生理学的に許容される担体に懸濁又は溶解されることにより、投与向けに調製することができる。好ましくは、本発明の免疫原性組成物は、治療用ワクチンとしての使用に適している。
「薬学的に許容される担体」には、組成物を投与される個体に有害な抗体の産生をそれ自体誘導しない任意の担体が含まれる。適切な担体は通常には、大型でゆっくりと代謝される巨大分子、例えば、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、ショ糖、トレハロース、乳糖及び脂質凝集体(例えば油滴又はリポソーム)である。そのような担体は当業者によく知られている。組成物はまた、薬学的に許容される希釈剤、例えば水、生理食塩水、グリセロール等を含有することができる。加えて、補助物質、例えば湿潤剤又は乳化剤、pH緩衝物質等が存在してもよい。無菌のパイロジェンフリーのリン酸緩衝生理食塩水が通常の担体である。適当な担体は多くの部分で投与経路次第であるとしてもよい。
適切には、ウイルスFc受容体又はその断片は、筋肉内、膣内、静脈内、腹腔内、皮下、経皮、皮内、鼻、腫瘍内又は経口の各投与を含む、当技術分野で知られている任意の経路によって対象に投与されることになる。
一実施形態では、対象は、脊椎動物、例えば哺乳動物、例えばヒト、非ヒト霊長類、又は獣医学的哺乳動物(家畜又は愛玩動物)である。好ましい実施形態では、対象はヒトである。
好ましい実施形態では、対象は、ウイルスFcR又はその免疫原性断片で治療される前に、ウイルス、例えばヘルペスウイルス、例えばHSV2、HSV1又はHCMVによって感染している(すなわち血清陽性である)。ウイルスFcR又はその免疫原性断片で治療される前にウイルスに感染した対象は、感染の臨床的兆候を示してもよく(症候性対象)、ウイルス感染の臨床的兆候を示さなくてもよい(無症候性対象)。一実施形態では、症候性対象は、臨床症状のない期間によって隔てられた経時的な感染の臨床症状を伴ういくつかのエピソード(再発)を示した。
一態様では、本発明は、対象、好ましくはヒト対象において、再発ヘルペス感染の治療での使用のための、又は再発ヘルペスウイルス感染の頻度の予防又は減少の方法での使用のための、ヘルペスウイルスFc受容体若しくはその免疫原性断片又は前記ウイルスFcR若しくはその免疫原性断片をコードする核酸を提供する。
一態様では、本発明は、対象、好ましくはヒト対象において、再発HSV2感染の治療での使用のための、又は再発HSV2感染の頻度の予防又は減少の方法での使用のための、HSV2 gE2若しくはその免疫原性断片又は前記HSV2 gE2若しくはその免疫原性断片をコードする核酸を提供する。
一態様では、本発明は、対象、好ましくはヒト対象において、再発HSV2感染の治療での使用のための、又は再発HSV2感染の頻度の予防又は減少の方法での使用のための、HSV2 gE2/gI2ヘテロ二量体若しくはその免疫原性断片又は前記HSV2 gE2/gI2ヘテロ二量体若しくはその免疫原性断片をコードする核酸を提供する。
一態様では、本発明は、対象、好ましくはヒト対象において、再発HSV1感染の治療での使用のための、又は再発HSV1感染の頻度の予防又は減少の方法での使用のための、HSV1 gE1若しくはその免疫原性断片又は前記HSV1 gE1若しくはその免疫原性断片をコードする核酸を提供する。
一態様では、本発明は、対象、好ましくはヒト対象において、再発HSV1感染の治療での使用のための、又は再発HSV1感染の頻度の予防又は減少の方法での使用のための、HSV1 gE1/gI1ヘテロ二量体若しくはその免疫原性断片又は前記HSV1 gE1/gI1ヘテロ二量体若しくはその免疫原性断片をコードする核酸を提供する。
一態様では、本発明は、免疫原性組成物の製造での使用のための本明細書に記載の、ヘルペスウイルスFc受容体若しくはその免疫原性断片又は前記ウイルスFcR若しくはその免疫原性断片をコードする核酸を提供する。
一態様では、本発明は、ヘルペス感染又はヘルペス関連疾患の治療のための医薬の製造における本明細書に記載の、ヘルペスウイルスFc受容体若しくはその免疫原性断片又は前記ウイルスFcR若しくはその免疫原性断片をコードする核酸の使用を提供する。
一態様では、本発明は、免疫原性組成物の製造での使用のための本明細書に記載の、HSV2 gE2若しくはHSV2 gE2/gI2ヘテロ二量体、その免疫原性断片、又は前記HSV2 gE2若しくはその免疫原性断片をコードする核酸を提供する。
一態様では、本発明は、HSV2感染又はHSV2関連疾患の治療のための医薬の製造における本明細書に記載の、HSV2 gE2若しくはHSV2 gE2/gI2ヘテロ二量体、その免疫原性断片、又は前記HSV2 gE2若しくはHSV2 gE2/gI2ヘテロ二量体又はその免疫原性断片をコードする核酸の使用を提供する。
一態様では、本発明は、免疫原性組成物の製造での使用のための本明細書に記載の、HSV1 gE1若しくはHSV1 gE1/gI1ヘテロ二量体、その免疫原性断片、又は前記HSV1 gE1若しくはHSV1 gE1/gI1ヘテロ二量体又はその免疫原性断片をコードする核酸を提供する。
一態様では、本発明は、HSV1感染又はHSV1関連疾患の治療のための医薬の製造における本明細書に記載の、HSV1 gE1若しくはHSV1 gE1/gI1ヘテロ二量体、その免疫原性断片、又は前記HSV1 gE1若しくはHSV1 gE1/gI1ヘテロ二量体又はその免疫原性断片をコードする核酸の使用を提供する。
一態様では、本発明は、免疫学的に有効量の、ヘルペスウイルスFc受容体若しくはその免疫原性断片又は前記ウイルスFcR若しくはその免疫原性断片をコードする核酸を対象に投与する工程を含む、それを必要とする対象においてヘルペスウイルス感染又はヘルペスウイルス関連疾患を治療する方法を提供する。
一態様では、本発明は、免疫学的に有効量の、HSV2 gE2若しくはHSV2 gE2/gI2ヘテロ二量体、その免疫原性断片、又は前記HSV2 gE2若しくはHSV2 gE2/gI2ヘテロ二量体若しくはその免疫原性断片をコードする核酸を対象に投与する工程を含む、それを必要とする対象においてHSV2感染又はHSV2関連疾患を治療する方法を提供する。
一態様では、本発明は、免疫学的に有効量の、HSV1 gE1若しくはHSV1 gE1/gI1ヘテロ二量体、その免疫原性断片、又は前記HSV1 gE1若しくはHSV1 gE1/gI1ヘテロ二量体若しくはその免疫原性断片をコードする核酸を対象に投与する工程を含む、それを必要とする対象においてHSV1感染又はHSV1関連疾患を治療する方法を提供する。
本明細書で使用される場合、「治療する」及び「治療」という用語並びにそれらに由来する単語は、状態の「治癒」が全ての個体で扱われること、又は所与の任意の集団での100%効果的な治療を意味するものではない。むしろ、当業者が有益な治療効果を有すると認める治療に関する様々な程度が存在する。この点で、本発明の方法及び使用は、そのような治療を必要とする対象におけるヘルペスウイルス感染、特にHSV2又はHSV1関連疾患の治療に関する任意のレベルを提供することができるとともに、ヘルペスウイルス感染、特にHSV2又はHSV1関連疾患の1つ以上の状態又は症状に関する重症度、期間又は経時的な再発の数の減少を含むことができる。
本明細書で使用される場合、「治療的免疫化」又は「治療的ワクチン接種」とは、投与の時点でウイルス、例えばヘルペスウイルス、特にHSV2又はHSV1に感染していることが知られている対象、好ましくはヒト対象へ本発明の免疫原性組成物を投与して、ウイルス感染又はウイルス関連疾患を治療することを指す。本明細書で使用される場合、「予防的免疫化」又は「予防的ワクチン接種」とは、投与の時点でウイルス、例えばヘルペスウイルス、特にHSV2又はHSV1に感染していなかった対象、好ましくはヒト対象へ本発明の免疫原性組成物を投与して、ウイルス感染又はウイルス関連疾患を防止することを指す。
本発明では、HSV感染の治療とは、潜在性HSV感染状態からの再活性化イベントを防止すること、又は初期段階でのウイルス複製を制御して、一次HSV感染に続いて起こるウイルス排出及び臨床的発現、すなわち再発HSV感染を減少させることを目的とする。したがって、治療によって、無症候性ウイルス排出を含めて、HSVの症候性及び無症候性の再活性化(再発HSV感染とも呼ばれる)のいずれか又は両方が防止される。それ故、治療によって、症候性個体における再活性化の後の再発HSV感染の重症度、期間、及び/又はエピソードの数を減少させることができる。無症候性再活性化と粘膜部位からの排出を防止することで、HSVウイルス(すなわちHSV2、HSV1又はその両方)に無感作の個体への感染の伝播を減少させる又は防止することもできる。これには、性交を通してのHSVの伝播、特にHSV2の伝播の予防が含まれるが、性交を通してのHSV1の可能性のある伝播の予防も含まれる。したがって、本発明の免疫原性構築物は、以下の有用な目標のいずれかを達成することができる: 無症候性ウイルス排出の防止又は減少、症候性疾患再発の減少又は防止、症候性疾患の期間又は重症度の減少、再発の頻度の減少、再発までの時間の延長、所与の時点で無再発である対象の割合の向上、抗ウイルス剤の使用の減少、性的パートナーどうしの伝播防止。HCMVの場合、HCMV Fc受容体ベースのワクチンが、特にHCMV血清陽性の対象に対して先天性HCMV感染を制御することができる。
特に、本明細書に記載のウイルス由来のFc受容体又はその免疫原性断片及び免疫原性組成物は、そのような治療を必要とする対象における再発ウイルス感染を治療するのに、治療用ワクチンとして有用である。好ましくは、対象はヒトである。
適切には、本明細書に記載のウイルス由来のFc受容体又はその免疫原性断片及び免疫原性組成物は、予防的ワクチンの一部ではない。
本明細書で提供される使用の方法は、HSV2感染及びHSV1感染の両方に(したがって、HSV2及びHSV1の関連疾患の両方、すなわち、それぞれ、性器ヘルペス及び口唇ヘルペスに)、又はHSV2感染に(したがって、性器ヘルペスの治療を主として目的とする)若しくはHSV1感染に(したがって、口唇ヘルペスの治療を主として目的とする)方向付けることができる。
「免疫学的有効量」とは、この量の抗原(又は抗原を含有する免疫原性組成物)の対象への投与が、単回の用量で又はシリーズの一部としてのいずれかで、対象において投与された抗原に対して測定可能な免疫応答を誘導するのに効果的であることを意図する。この量は、治療される個体の健康及び身体状態、年齢、治療される個体の分類学的群(例えばヒト、非ヒト霊長類等)、個体の免疫システムの抗体を合成する能力、所望される予防の程度、組成物又はワクチンの製剤、治療する医者による医学的状況の評価、疾患の重症度、投与される化合物の効力、投与の様式、及び他の関連因子に応じて異なる。本明細書に開示のワクチンは典型的には治療用である。一部の実施形態では、本明細書に開示の免疫原性組成物は、ヘルペスウイルス感染に対する効果的な免疫応答、すなわち、ヘルペスウイルス感染、例えば再発HSV感染の治療又は予防に十分な応答を誘導することができる。本明細書に記載の核酸構築物を含む免疫原性組成物又はワクチンのさらなる使用が、明細書内で後述されて提供される。本明細書に記載のウイルス由来のFc受容体又はその免疫原性断片及び免疫原性組成物は、治療目的向けの経時的なウイルスFc受容体又はその免疫原性断片の反復送達を含むレジメンでの使用に適していることが容易に理解されるであろう。適切には、プライムブーストレジメンを使用することができる。プライムブーストとは、同一個体において別々の2つの免疫応答を誘発することを指す: (i)免疫システムの第1のプライミング、これに続く(ii)一次免疫応答が樹立されて数週間又は数か月後の免疫システムの二次又はブースティング。好ましくは、ブースティング組成物は、プライミング組成物を対象に投与して約2～約12週間後、例えば、プライミング組成物を投与して約2、3、4、5又は6週間後に投与される。一実施形態では、ブースティング組成物は、プライミング組成物の1か月又は2か月後に投与される。一実施形態では、第1のブースティング組成物は、プライミング組成物の1か月又は2か月後に投与され、第2のブースティング組成物は、第1のブースティング組成物の1か月又は2か月後に投与される。
投薬量は、主として要因に、例えば投与経路、治療される状態、対象の年齢、体重及び健康に左右されることになり、したがって対象によって異なってもよい。例えば、ウイルス由来のFc受容体又はその免疫原性断片の治療有効な成人投薬量は、1～250μg、例えば2～100μgのウイルスFcR又はその免疫原性断片、例えば約5、10、20、30、40、50、60、70、80、90又は100μgのウイルスFcR又はその免疫原性断片を含有することができる。
ウイルスFcR結合パートナー又はその断片がウイルスFcR又はその免疫原性断片と一緒に対象に投与される場合、ウイルスFcR結合パートナー又はその断片の治療有効な成人投薬量は、5～250μg、例えば10～100μgのウイルスFcR結合パートナー又はその断片、例えば、約10、20、30、40、50、60、70、80、90又は100μgのウイルスFcR結合パートナー又はその断片を含有することができる。
好ましい実施形態では、ウイルスFcR結合パートナー又はその断片がウイルスFcR又はその免疫原性断片と一緒に対象に投与される場合、ウイルスFcR免疫原性断片とウイルスFcR結合パートナー又はその断片との用量は、化学量論的比約1:1である。
一般的に、ヒト用量は0.1mlから2mlの間の体積になる。したがって、本明細書に記載の組成物は、例えば、個々の成分又は組み合わされた免疫原性成分あたり約0.1、0.15、0.2、0.5、1.0、1.5又は2.0mlのヒト用量の体積で製剤化することができる。
当業者であれば、投与経路及び治療される対象に応じて、これらの用量を調整することができる。
ウイルス由来のFc受容体又はその免疫原性断片に対する治療的免疫応答をモニタリングして、もしあればブースターの必要性を決定することができる。免疫応答の(例えば、CD4+ T細胞応答、CD8+ T細胞応答、血清中の抗体価の)評価に続いて、場合によるブースター免疫化を投与することができる。
本発明によるウイルスFc受容体又はその断片に対する免疫応答を評価するのに適したin vitro又はin vivo試験方法は、当業者に知られている。例えば、ウイルスFc受容体又はその断片は、目的の特定のリンパ球タイプ、例えばB細胞、T細胞、T細胞株及びT細胞クローンの増殖又はエフェクター機能の誘導に及ぼすその効果について試験することができる。例えば、免疫されたマウス由来の脾臓細胞を単離することができ、本発明によるウイルスFc受容体又はその断片を含有する自己標的細胞を細胞傷害性Tリンパ球が溶解する能力を評価することができる。加えて、Tヘルパー細胞の分化を、細胞質サイトカイン染色及びフローサイトメトリー解析によってCD4+ T細胞中のTH1(IL-2、TNF-α及びIFN-γ)サイトカインの増殖又は産生を測定することによって、解析することができる。本発明によるウイルスFc受容体又はその断片を、例えば、流入領域リンパ節におけるB細胞の活性化を調べることによって、血清中の目的のHSV抗原に特異的な抗体のB細胞産生を測定することによって立証されるように、液性免疫応答を誘導する能力について試験することもできる。こういったアッセイは、例えば、免疫個体由来の末梢Bリンパ球を使用して行うことができる。
さらなる態様では、本発明は、本発明のウイルスFc受容体若しくはその免疫原性断片又はヘテロ二量体をコードする核酸を提供する。好ましい実施形態では、本発明の核酸は、治療での使用のためのものであり、適切にはウイルスに感染した対象を治療する際の使用のためのものである。
「核酸」という用語は一般に、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、及び/又はそれらのアナログを含有する、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を意味する。これには、DNA、RNA、DNA/RNAハイブリッドが含まれる。それにはまた、DNA又はRNAのアナログ、例えば、改変骨格(例えば、ペプチド核酸(PNA)又はホスホロチオエート)又は改変塩基を含有するものが含まれる。したがって、本開示の核酸には、mRNA、DNA、cDNA、組換え核酸、分枝核酸、プラスミド、ベクター等が含まれる。核酸がRNAの形態をとる場合、それは5'キャップを有しても有さなくてもよい。本明細書に開示の核酸分子は、種々の形態をとることができる(例えば、一本鎖、二本鎖)。核酸分子は環状であっても分枝であってもよいが、一般的には直線状となる。
本明細書で使用される核酸は、精製又は実質的に精製された形態で、すなわち、他の核酸を実質的に含まずに(例えば、天然に存在する核酸を含まない)提供されるのが好ましく、一般に少なくとも約50%純粋(重量で)、通常は少なくとも約90%純粋である。
本発明の核酸分子は、組換え生成、化学合成、又は他の合成手段を含めて適切な任意の手段によって生成することができる。適切な生成技法は当業者によく知られている。典型的には、本発明の核酸は、組換え形態、すなわち天然に存在しない形態となる。例えば、核酸は、ウイルスFc受容体若しくはその断片又はヘテロ二量体をコードする核酸配列に加えて、1つ以上の異種核酸配列(例えば、別の抗原をコードする配列及び/又は制御配列、例えばプロモーター若しくは内部リボソーム侵入部位)を含むことができる。核酸の配列又は化学構造は、ウイルスFc受容体若しくはその断片又はヘテロ二量体をコードする天然に存在する配列と比較して、改変することができる。
核酸分子の配列は、例えば、核酸の発現又は複製の有効性を向上させるために、又は分解に対するさらなる安定性又は耐性をもたらすために改変することができる。
ウイルスFc受容体若しくはその断片又はヘテロ二量体をコードする核酸分子は、コドン最適化することができる。「コドン最適化」とは、核酸の翻訳有効性及び/又は半減期を向上させることができるコドン使用頻度に対する改変を意図する。(例えば約30個以上のアデノシン残基の)ポリAテールを、RNAの3'末端に結合させてその半減期を向上させることができる。RNAの5'末端は、m7G(5')ppp(5')N(キャップ0構造)の構造を備える改変リボヌクレオチド又はその誘導体でキャップすることができ、この改変リボヌクレオチド又はその誘導体は、RNA合成中に組み込んでもよく、RNA転写後に酵素的に操作してもよい(例えば、mRNAトリホスファターゼ、グアニリルトランスフェラーゼ及びグアニン-7-メチルトランスフェラーゼからなるワクシニアウイルスキャッピング酵素(VCE)を使用することによるが、このVCEが、N7-モノメチル化キャップ0構造の構築を触媒する)。キャップ0構造は、RNA分子の安定性及び翻訳有効性を維持する上で重要な役割を担う。RNA分子の5'キャップは2'-O-メチルトランスフェラーゼによってさらに改変することができ、このことによってキャップ1構造(m7Gppp [m2'-O]N)の生成がもたらされ、これは翻訳有効性をさらに向上させることができる。
核酸は、1つ以上のヌクレオチドアナログ又は改変ヌクレオチドを含むことができる。本明細書で使用される場合、「ヌクレオチドアナログ」又は「改変ヌクレオチド」とは、ヌクレオシド(例えば、シトシン(C)、チミン(T)又はウラシル(U))、アデニン(A)又はグアニン(G))の窒素含有塩基の中に又は上に1つ以上の化学改変(例えば置換)を含有するヌクレオチドを指す。ヌクレオチドアナログは、ヌクレオシドの糖部分(例えば、リボース、デオキシリボース、改変リボース、改変デオキシリボース、6員糖アナログ、又は開鎖糖アナログ)又はホスフェートの中に又は上にさらなる化学改変を含有することができる。ヌクレオチド並びに改変ヌクレオチド及び改変ヌクレオシドの調製は当技術分野でよく知られており、以下の参考文献を参照のこと: 米国特許第4,373,071号、第4,458,066号、第4,500,707号、第4,668,777号、第4,973,679号、第5,047,524号、第5,132,418号、第5,153,319号、第5,262,530号、第5,700,642号。多数の改変ヌクレオシド及び改変ヌクレオチドが市販されている。
改変ヌクレオシド及びヌクレオチドに組み込むことができ、mRNA分子中に存在することができる改変核酸塩基には、以下が含まれる:
m5C(5-メチルシチジン)、m5U(5-メチルウリジン)、m6A(N6-メチルアデノシン)、s2U(2-チオウリジン)、Um(2'-0-メチルウリジン)、m1A(1-メチルアデノシン); m2A(2-メチルアデノシン); Am(2-1-O-メチルアデノシン); ms2m6A(2-メチルチオ-N6-メチルアデノシン); i6A(N6-イソペンテニルアデノシン); ms2i6A(2-メチルチオ-N6イソペンテニルアデノシン); io6A(N6-(cis-ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン); ms2io6A(2-メチルチオ-N6-(cis-ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン); g6A(N6-グリシニルカルバモイルアデノシン); t6A(N6-トレオニルカルバモイルアデノシン); ms2t6A(2-メチルチオ-N6-トレオニルカルバモイルアデノシン); m6t6A(N6-メチル-N6-トレオニルカルバモイルアデノシン); hn6A(N6-ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン); ms2hn6A(2-メチルチオ-N6-ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン); Ar(p)(2'-0-リボシルアデノシン(ホスフェート)); I(イノシン); mi1(1-メチルイノシン); m'1m(1,2'-0-ジメチルイノシン); m3C(3-メチルシチジン); Cm(2T-0-メチルシチジン); s2C(2-チオシチジン); ac4C(N4-アセチルシチジン); L5C(5-ホルミルシチジン); m5Cm(5,2-O-ジメチルシチジン); ac4Cm(N4アセチル2TOメチルシチジン); k2C(リシジン); m1G(1-メチルグアノシン); m2G(N2-メチルグアノシン); m7G(7-メチルグアノシン); Gm(2'-0-メチルグアノシン); m22G(N2,N2-ジメチルグアノシン); m2Gm(N2,2'-0-ジメチルグアノシン); m22Gm(N2,N2,2'-0-トリメチルグアノシン); Gr(p)(2'-0-リボシルグアノシン(ホスフェート)); yW(ワイブトシン); o2yW(ペルオキシワイブトシン); OHyW(ヒドロキシワイブトシン); OHyW*(低修飾(undermodified)ヒドロキシワイブトシン); imG(ワイオシン); mimG(メチルグアノシン); Q(キューオシン); oQ(エポキシキューオシン); galQ(ガルタクトシルキューオシン); manQ(マンノシル-キューオシン); preQo(7-シアノ-7-デアザグアノシン); preQi(7-アミノメチル-7-デアザグアノシン); G*(アルカエオシン); D(ジヒドロウリジン); m5Um(5,2'-0-ジメチルウリジン); s4U(4-チオウリジン); m5s2U(5-メチル-2-チオウリジン); s2Um(2-チオ-2'-0-メチルウリジン); acp3U(3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)ウリジン); ho5U(5-ヒドロキシウリジン); mo5U(5-メトキシウリジン); cmo5U(ウリジン5-オキシ酢酸); mcmo5U(ウリジン5-オキシ酢酸メチルエステル); chm5U(5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウリジン)); mchm5U(5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウリジンメチルエステル); mcm5U(5-メトキシカルボニルメチルウリジン); mcm5Um(S-メトキシカルボニルメチル-2-O-メチルウリジン); mcm5s2U(5-メトキシカルボニルメチル-2-チオウリジン); nm5s2U(5-アミノメチル-2-チオウリジン); mnm5U(5-メチルアミノメチルウリジン); mnm5s2U(5-メチルアミノメチル-2-チオウリジン); mnm5se2U(5-メチルアミノメチル-2-セレノウリジン); ncm5U(5-カルバモイルメチルウリジン); ncm5Um(5-カルバモイルメチル-2'-0-メチルウリジン); cmnm5U(5-カルボキシメチルアミノメチルウリジン); cnmm5Um(5-カルボキシメチル1アミノメチル-2-L-Oメチルウリジン); cmnm5s2U(5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン); m62A(N6,N6-ジメチルアデノシン); Tm(2'-0-メチルイノシン); m4C(N4-メチルシチジン); m4Cm(N4,2-0-ジメチルシチジン); hm5C(5-ヒドロキシメチルシチジン); m3U(3-メチルウリジン); cm5U(5-カルボキシメチルウリジン); m6Am(N6,T-0-ジメチルアデノシン); rn62Am(N6,N6,0-2-トリメチルアデノシン); m2'7G(N2,7-ジメチルグアノシン); m2'2'7G(N2,N2,7-トリメチルグアノシン); m3Um(3,2T-0-ジメチルウリジン); m5D(5-メチルジヒドロウリジン); L5Cm(5-ホルミル-2'-0-メチルシチジン); m1Gm(1,2'-0-ジメチルグアノシン); m'Am(1,2-O-ジメチルアデノシン)イリノメチルウリジン); tm5s2U(S-タウリノメチル-2-チオウリジン); iniG-14(4-デメチルグアノシン); imG2(イソグアノシン); ac6A(N6-アセチルアデノシン)、ヒポキサンチン、イノシン、8-オキソ-アデニン、その7-置換誘導体、ジヒドロウラシル、シュードウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-アミノウラシル、5-(Ci-Ce)-アルキルウラシル、5-メチルウラシル、5-(C2～C6)-アルケニルウラシル、5-(C2～Ce)-アルキニルウラシル、5-(ヒドロキシメチル)ウラシル、5-クロロウラシル、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-ヒドロキシシトシン、5-(Ci～C6)-アルキルシトシン、5-メチルシトシン、5-(C2～C6)-アルケニルシトシン、5-(C2～C6)-アルキニルシトシン、5-クロロシトシン、5-フルオロシトシン、5-ブロモシトシン、N2-ジメチルグアニン、7-デアザグアニン、8-アザグアニン、7-デアザ-7-置換グアニン、7-デアザ-7(C2～C6)アルキニルグアニン、7-デアザ-8-置換グアニン、8-ヒドロキシグアニン、6-チオグアニン、8-オキソグアニン、2-アミノプリン、2-アミノ-6-クロロプリン、2,4-ジアミノプリン、2,6-ジアミノプリン、8-アザプリン、置換7-デアザプリン、7-デアザ-7-置換プリン、7-デアザ-8-置換プリン、水素(脱塩基残基(abasic residue))、m5C、m5U、m6A、s2U、W、又は2'-0-メチル-U。これらの改変核酸塩基及びそれらの対応するリボヌクレオシドの多くは商業的供給者から入手可能である。
m5C(5-メチルシチジン)、m5U(5-メチルウリジン)、m6A(N6-メチルアデノシン)、s2U(2-チオウリジン)、Um(2'-0-メチルウリジン)、m1A(1-メチルアデノシン); m2A(2-メチルアデノシン); Am(2-1-O-メチルアデノシン); ms2m6A(2-メチルチオ-N6-メチルアデノシン); i6A(N6-イソペンテニルアデノシン); ms2i6A(2-メチルチオ-N6イソペンテニルアデノシン); io6A(N6-(cis-ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン); ms2io6A(2-メチルチオ-N6-(cis-ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン); g6A(N6-グリシニルカルバモイルアデノシン); t6A(N6-トレオニルカルバモイルアデノシン); ms2t6A(2-メチルチオ-N6-トレオニルカルバモイルアデノシン); m6t6A(N6-メチル-N6-トレオニルカルバモイルアデノシン); hn6A(N6-ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン); ms2hn6A(2-メチルチオ-N6-ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン); Ar(p)(2'-0-リボシルアデノシン(ホスフェート)); I(イノシン); mi1(1-メチルイノシン); m'1m(1,2'-0-ジメチルイノシン); m3C(3-メチルシチジン); Cm(2T-0-メチルシチジン); s2C(2-チオシチジン); ac4C(N4-アセチルシチジン); L5C(5-ホルミルシチジン); m5Cm(5,2-O-ジメチルシチジン); ac4Cm(N4アセチル2TOメチルシチジン); k2C(リシジン); m1G(1-メチルグアノシン); m2G(N2-メチルグアノシン); m7G(7-メチルグアノシン); Gm(2'-0-メチルグアノシン); m22G(N2,N2-ジメチルグアノシン); m2Gm(N2,2'-0-ジメチルグアノシン); m22Gm(N2,N2,2'-0-トリメチルグアノシン); Gr(p)(2'-0-リボシルグアノシン(ホスフェート)); yW(ワイブトシン); o2yW(ペルオキシワイブトシン); OHyW(ヒドロキシワイブトシン); OHyW*(低修飾(undermodified)ヒドロキシワイブトシン); imG(ワイオシン); mimG(メチルグアノシン); Q(キューオシン); oQ(エポキシキューオシン); galQ(ガルタクトシルキューオシン); manQ(マンノシル-キューオシン); preQo(7-シアノ-7-デアザグアノシン); preQi(7-アミノメチル-7-デアザグアノシン); G*(アルカエオシン); D(ジヒドロウリジン); m5Um(5,2'-0-ジメチルウリジン); s4U(4-チオウリジン); m5s2U(5-メチル-2-チオウリジン); s2Um(2-チオ-2'-0-メチルウリジン); acp3U(3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)ウリジン); ho5U(5-ヒドロキシウリジン); mo5U(5-メトキシウリジン); cmo5U(ウリジン5-オキシ酢酸); mcmo5U(ウリジン5-オキシ酢酸メチルエステル); chm5U(5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウリジン)); mchm5U(5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウリジンメチルエステル); mcm5U(5-メトキシカルボニルメチルウリジン); mcm5Um(S-メトキシカルボニルメチル-2-O-メチルウリジン); mcm5s2U(5-メトキシカルボニルメチル-2-チオウリジン); nm5s2U(5-アミノメチル-2-チオウリジン); mnm5U(5-メチルアミノメチルウリジン); mnm5s2U(5-メチルアミノメチル-2-チオウリジン); mnm5se2U(5-メチルアミノメチル-2-セレノウリジン); ncm5U(5-カルバモイルメチルウリジン); ncm5Um(5-カルバモイルメチル-2'-0-メチルウリジン); cmnm5U(5-カルボキシメチルアミノメチルウリジン); cnmm5Um(5-カルボキシメチル1アミノメチル-2-L-Oメチルウリジン); cmnm5s2U(5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン); m62A(N6,N6-ジメチルアデノシン); Tm(2'-0-メチルイノシン); m4C(N4-メチルシチジン); m4Cm(N4,2-0-ジメチルシチジン); hm5C(5-ヒドロキシメチルシチジン); m3U(3-メチルウリジン); cm5U(5-カルボキシメチルウリジン); m6Am(N6,T-0-ジメチルアデノシン); rn62Am(N6,N6,0-2-トリメチルアデノシン); m2'7G(N2,7-ジメチルグアノシン); m2'2'7G(N2,N2,7-トリメチルグアノシン); m3Um(3,2T-0-ジメチルウリジン); m5D(5-メチルジヒドロウリジン); L5Cm(5-ホルミル-2'-0-メチルシチジン); m1Gm(1,2'-0-ジメチルグアノシン); m'Am(1,2-O-ジメチルアデノシン)イリノメチルウリジン); tm5s2U(S-タウリノメチル-2-チオウリジン); iniG-14(4-デメチルグアノシン); imG2(イソグアノシン); ac6A(N6-アセチルアデノシン)、ヒポキサンチン、イノシン、8-オキソ-アデニン、その7-置換誘導体、ジヒドロウラシル、シュードウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-アミノウラシル、5-(Ci-Ce)-アルキルウラシル、5-メチルウラシル、5-(C2～C6)-アルケニルウラシル、5-(C2～Ce)-アルキニルウラシル、5-(ヒドロキシメチル)ウラシル、5-クロロウラシル、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-ヒドロキシシトシン、5-(Ci～C6)-アルキルシトシン、5-メチルシトシン、5-(C2～C6)-アルケニルシトシン、5-(C2～C6)-アルキニルシトシン、5-クロロシトシン、5-フルオロシトシン、5-ブロモシトシン、N2-ジメチルグアニン、7-デアザグアニン、8-アザグアニン、7-デアザ-7-置換グアニン、7-デアザ-7(C2～C6)アルキニルグアニン、7-デアザ-8-置換グアニン、8-ヒドロキシグアニン、6-チオグアニン、8-オキソグアニン、2-アミノプリン、2-アミノ-6-クロロプリン、2,4-ジアミノプリン、2,6-ジアミノプリン、8-アザプリン、置換7-デアザプリン、7-デアザ-7-置換プリン、7-デアザ-8-置換プリン、水素(脱塩基残基(abasic residue))、m5C、m5U、m6A、s2U、W、又は2'-0-メチル-U。これらの改変核酸塩基及びそれらの対応するリボヌクレオシドの多くは商業的供給者から入手可能である。
核酸成分の例示的な有効量は、1ng～100μgの間、例えば1ng～1μg(例えば、100ng～1μg)の間、又は1μg～100μgの間、例えば、10ng、50ng、100ng、150ng、200ng、250ng、500ng、750ng又は1μgとすることができる。核酸の有効量はまた、1μgから500μg、例えば1μg～200μgの間、例えば10～100μgの間、例えば1μg、2μg、5μg、10μg、20μg、50μg、75μg、100μg、150μg又は200μgを含むことができる。或いは、核酸の例示的な有効量は、100μg～1mgの間、例えば、100μgから500μg、例えば、100μg、150μg、200μg、250μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg又は1mgとすることができる。
好ましい実施形態では、核酸は本発明によるヘテロ二量体をコードし、ここで、ウイルスFcR又はその免疫原性断片の発現は、サブゲノムプロモーター、適切には配列番号126に示される26Sサブゲノムプロモーター又はそれと少なくとも60%、65%、70%、75％、80％、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは99.5%同一であるそれ由来のバリアントの制御下にある。
好ましい実施形態では、ウイルスFcR又はその免疫原性断片及びその結合パートナー又はその断片は、内部リボソーム侵入部位(IRES)配列によって隔てられる。好ましい実施形態では、IRES配列は、IRES EV71配列である。好ましい実施形態では、IRES配列は、配列番号127に示される配列、又はそれと少なくとも60%、65%、70%、75％、80％、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは99.5%同一であるそれ由来のバリアントを含むか又はそれからなる。
別の実施形態では、ウイルスFcR又はその免疫原性断片及びその結合パートナー又はその断片をコードする配列は、2つの2A「自己切断」ペプチド配列によって隔てられる。一実施形態では、2A「自己切断」ペプチド配列は、配列番号124に示される配列、又はそれと少なくとも60%、65%、70%、75％、80％、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは99.5%同一であるそれ由来のバリアントを適切には含むか又はそれらからなるGSG-P2A配列である。一実施形態では、2A「自己切断」ペプチド配列は、配列番号125に示される配列、又はそれと少なくとも60%、65%、70%、75％、80％、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは99.5%同一であるそれ由来のバリアントを適切には含むか又はそれらからなる、F2A配列である。
さらに別の実施形態では、ウイルスFcR又はその免疫原性断片及びその結合パートナー又はその断片をコードする配列は、2つのサブゲノムプロモーターによって隔てられている。一実施形態では、サブゲノムプロモーターは、配列番号126に示される配列、又はそれと少なくとも60%、65%、70%、75％、80％、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは99.5%同一であるそれ由来のバリアントを適切には含むか又はそれらからなる、26Sサブゲノムプロモーターである。
本発明の核酸分子は、例えば、RNAであってもDNA、例えばプラスミドDNAであってもよい。好ましい実施形態では、核酸分子はRNA分子である。より好ましい実施形態では、RNA分子は自己増幅RNA分子(「SAM」)である。
自己増幅(又は自己複製)RNA分子は当技術分野でよく知られており、例えばアルファウイルス由来である複製エレメントを使用し、構造ウイルスタンパク質を目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列で置換することによって生成することができる。自己増幅RNA分子は通常、細胞への送達後に直接翻訳することができる+鎖分子であり、この翻訳によってRNA依存性RNAポリメラーゼがもたらされ、送達されたRNAからアンチセンス転写物とセンス転写物の両方が生成される。このようにして、送達されたRNAによって、複数の娘RNAの生成という結果につながる。これらの娘RNA、並びに共線性のサブゲノム転写物は、それら自体が翻訳されてコードされたポリペプチドのin situ発現をもたらすことができるか、又は転写されて送達されたRNAと同じセンスを備える転写物をさらにもたらすことができ、これが翻訳され、その結果抗原のin situ発現がもたらされる。この配列の転写に関する全体的な結果は、導入されたレプリコンRNAの数の膨大な増幅であり、したがってコードされた抗原が細胞の主たるポリペプチド産物となる。この様式で自己複製を行うための適切な一システムは、アルファウイルスベースのレプリコンを使用することである。これらのレプリコンは、細胞への送達後にレプリカーゼ(又はレプリカーゼ転写酵素)の翻訳を導く+鎖RNAである。レプリカーゼは、ポリタンパク質として翻訳され、これは自己切断して複製複合体をもたらし、この複合体によって+鎖の送達されたRNAのゲノム鎖コピーが創り出される。これらの-鎖転写物はそれら自体が転写されて、+鎖親RNAのさらなるコピーを与え、また、抗原をコードするサブゲノム転写物も与えることができる。したがって、サブゲノム転写物の翻訳は、感染細胞による抗原のin situ発現を招く。適切なアルファウイルスレプリコンは、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、東部馬脳炎ウイルス、ベネズエラ馬脳炎ウイルス等由来のレプリカーゼを使用することができる。突然変異型又は野生型ウイルス配列を使用することができ、例えば、レプリコンにはVEEVの弱毒化TC83突然変異体が使用されてきた。WO2005/113782を参照のこと。
一実施形態では、本明細書に記載の自己増幅RNA分子は、自己増幅RNA分子及びウイルスFc受容体若しくはその断片又はヘテロ二量体由来のRNAを転写することができるRNA依存性RNAポリメラーゼをコードする。ポリメラーゼは、例えば、アルファウイルスタンパク質nsP1、nsP2、nsP3及びnsP4のうちの1つ以上を含むアルファウイルスレプリカーゼとすることができる。
好ましい実施形態では、自己増幅RNA分子はアルファウイルス由来のRNAレプリコンである。
天然アルファウイルスゲノムは、非構造レプリカーゼポリタンパク質に加えて、構造ビリオンタンパク質をコードするのに対し、ある特定の実施形態では、自己増幅RNA分子はアルファウイルス構造タンパク質をコードしない。したがって、好ましい自己増幅RNAは、細胞内でのそれ自体のゲノムRNAコピーの産生を招くことができるが、RNA含有ビリオンの産生を招くことはできない。これらのビリオンを産生することができないことは、野生型アルファウイルスとは異なり、自己増幅RNA分子はそれ自体を感染型で永続化させることができないということを意味する。野生型ウイルスでの永続化に必要であるアルファウイルス構造タンパク質は、本開示の自己増幅RNAには存在せず、それらの場所は目的の免疫原をコードする遺伝子によって占有され、その結果、サブゲノム転写物は構造アルファウイルスビリオンタンパク質よりもむしろ免疫原をコードする。したがって、本発明で有用な自己増幅RNA分子は、2つのオープンリーディングフレームを有することができる。第1の(5')オープンリーディングフレームはレプリカーゼをコードし、第2の(3')オープンリーディングフレームは抗原をコードする。一部の実施形態では、RNAは、例えば、さらなる抗原をコードするために又はアクセサリーポリペプチドをコードするために、さらなる(例えば、下流の)オープンリーディングフレームを有することができる。
適切には、本明細書に開示の自己増幅RNA分子は、RNAのin vivo翻訳を増強することができる5'キャップ(例えば、7-メチルグアノシン)を有する。自己増幅RNA分子は3'ポリAテールを有することができる。自己増幅RNA分子はまた、その3'末端の近傍にポリAポリメラーゼ認識配列(例えば、AAUAAA)を含むことができる。自己増幅RNA分子は種々の長さを有することができるが、典型的には5000～25000ヌクレオチド長である。自己増幅RNA分子は典型的には一本鎖となる。
適切には、自己複製RNAは、5'から3'へのウイルス非構造タンパク質1-4(nsP1-4)をコードするVEEV TC-83レプリコン、これに続くサブゲノムプロモーター、及びgEgIヘテロ二量体をコードする構築物(又はインサート)を含むか又はそれらからなる。好ましい実施形態では、インサートは、上述のサブゲノムプロモーターの制御下にあるgE外部ドメイン配列、これに続いてIRES調節配列、これに続いてgI外部ドメイン配列を含むか又はそれからなる。好ましい実施形態では、IRES配列はIRES EV71配列である。好ましい実施形態では、IRES配列は、配列番号127に示される配列、又はそれと少なくとも60%、65%、70%、75％、80％、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは99.5%同一であるそれ由来のバリアントを含むか又はそれらからなる。
空のSAMをコードするDNAを図39及び配列番号130に示す。対応する空のSAMを配列番号133に示す。構築物は、ヌクレオチド7561の直後に挿入されることになる。したがって、SAMは、5'から3'までに3つの領域を含むことができ、第1の領域は挿入点までの配列(例えば、配列番号133のヌクレオチド1～7561、本明細書では配列番号134)を含み、第2の領域はgEgIヘテロ二量体をコードするインサートを含み、第3の領域は挿入点の後の配列(例えば、配列番号133のヌクレオチド7562～7747、本明細書では配列番号135)を含む。したがって、SAMをコードするDNAは、5'から3'までに3つの領域を含むことができ、第1の領域は挿入点までの配列(例えば、配列番号130のヌクレオチド1～7561、本明細書では配列番号131)を含み、第2の領域はgEgIヘテロ二量体をコードするインサートを含み、第3の領域は挿入点の後の配列(例えば、配列番号130のヌクレオチド7562～9993、本明細書では配列番号132)を含む。
一実施形態では、VEEV TC-83レプリコンは、図39及び配列番号130に示されるDNA配列を有し、gEgIヘテロ二量体抗原をコードする構築物は残基7561の直後に挿入される。一実施形態では、VEE TC-83レプリコンは配列番号133に示されるRNA配列を有し、抗原をコードする構築物は残基7561の直後に挿入される。
自己増幅RNAは、in vitro転写(IVT)によって適宜調製することができる。IVTでは、細菌中でプラスミド形態で創り出され且つ増殖された、又は合成的に創り出された(例えば、遺伝子合成及び/又はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)工学的方法によって)、(cDNA)鋳型を使用することができる。例えば、DNA依存性RNAポリメラーゼ(例えばバクテリオファージT7、T3又はSP6 RNAポリメラーゼ)を使用して、DNA鋳型から自己増幅RNAを転写することができる。必要に応じて、適当なキャッピング及びポリA付加反応を使用することができる(レプリコンのポリAはDNA鋳型内で普通にはコード化されているが)。これらのRNAポリメラーゼは、転写された5'ヌクレオチド(複数可)に対してストリンジェントな要件を有する場合があり、一部の実施形態では、これらの要件は、IVT転写RNAがそのセルフコード化レプリカーゼ用の基質として効率的に機能できることを確保するために、コードされたレプリカーゼの要件と一致する必要がある。
自己増幅RNAは、(任意の5'キャップ構造に加えて)改変核酸塩基を有する1つ以上のヌクレオチドを含むことができる。本発明で使用されるRNAは、ヌクレオシド間のホスホジエステルリンケージのみを理想的には含むが、一部の実施形態では、ホスホルアミデート、ホスホロチオエート、及び/又はメチルホスホネートリンケージを含有することができる。
本発明の核酸分子は、ウイルス又は非ウイルス送達システムを伴うことができる。送達システム(本明細書では送達ビヒクルとも呼ばれる)は、コードされたウイルスFc受容体若しくはその断片又はヘテロ二量体の免疫原性を増強するアジュバント効果を有することができる。例えば、核酸分子は、リポソーム、非毒性の生分解性ポリマー微粒子又はウイルスレプリコン粒子(VRP)にカプセル化することができ、又はカチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体化することができる。一部の実施形態では、核酸分子は、例えば、カチオン性ナノエマルジョン(CNE)送達システム又は脂質ナノ粒子(LNP)送達システムを形成するように、非ウイルス送達材料を伴う。一部の実施形態では、核酸分子は非ウイルス送達システムを伴っている、すなわち、核酸分子はウイルスカプシドを実質的に含まない。或いは、核酸分子はウイルスレプリコン粒子を伴うことができる。他の実施形態では、核酸分子はネイキッド核酸、例えばネイキッドRNA(例えば、mRNA)を含むことができる。
好ましい実施形態では、RNA分子又は自己増幅RNA分子は、例えばカチオン性ナノエマルジョン(CNE)又は脂質ナノ粒子(LNP)を形成するように、非ウイルス送達材料を伴う。
CNE送達システム及びその調製方法についてはWO2012/006380に記載されている。CNE送達システムでは、抗原をコードする核酸分子(例えば、RNA)は、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体化している。カチオン性水中油型エマルジョンを使用して、負に帯電した分子、例えばRNA分子を細胞に送達することができる。エマルジョン粒子は、オイルコアとカチオン性脂質を含む。カチオン性脂質は、負に帯電した分子と相互作用し、それによって分子をエマルジョン粒子に固定することができる。有用なCNEのさらなる詳細については、WO2012/006380、WO2013/006834、及びWO2013/006837に見いだすことができる(それぞれの内容はその全体が本明細書に組み込まれる)。
したがって、一実施形態では、ウイルスFc受容体若しくはその断片又はヘテロ二量体をコードするRNA分子、例えば自己増幅RNA分子は、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体化することができる。粒子は典型的には、25℃で液相にあるオイルコア(例えば植物油又はスクアレン)、カチオン性脂質(例えばリン脂質)、及び場合により界面活性剤(例えばソルビタントリオレエート、ポリソルベート80)を含む。ポリエチレングリコールを含まれてもよい。一部の実施形態では、CNEは、スクアレン及びカチオン性脂質、例えば1,2-ジオレオイルオキシ-3-(トリメチルアンモニオ)プロパン(DOTAP)を含む。一部の好ましい実施形態では、送達システムは非ウイルス送達システム、例えばCNEであり、核酸分子は自己増幅RNA(mRNA)を含む。このことは、液性及び細胞性免疫応答を誘発する上で特に効果的であり得る。
LNP送達システム及び非毒性の生分解性高分子微粒子、並びにそれらの調製方法は、WO2012/006376(LNP及び微粒子送達システム); Geall et al. (2012) PNAS USA. Sep 4; 109(36): 14604-9 (LNP送達システム); 及びWO2012/006359(微粒子送達システム)に記載されている。LNPは非ビリオンリポソーム粒子であり、この中に核酸分子(例えばRNA)をカプセル化することができる。粒子は一部の外部RNA(例えば粒子の表面上に)を含むことができるが、RNAの少なくとも半分(理想的にはその全て)がカプセル化されている。リポソーム粒子は例えば、双性イオン性、カチオン性及びアニオン性脂質の混合物で形成することができ、これらは飽和であっても不飽和であってもよく、例えば、DSPC(双性イオン性、飽和)、DlinDMA(カチオン性、不飽和)、及び/又はDMG(アニオン性、飽和)である。本発明での使用のための好ましいLNPには、場合により少なくとも1つのカチオン性脂質(例えば、DOTAP、DSDMA、DODMA、DLinDMA、DLenDMA等)との組合せで、リポソームを形成することができる両親媒性脂質が含まれる。DSPC、DlinDMA、PEG-DMG及びコレステロールの混合物は特に効果的である。その他の有用なLNPは以下に記載されている: WO2012/006376; WO2012/030901; WO2012/031046; WO2012/031043; WO2012/006378; WO2011/076807; WO2013/033563; WO2013/006825; WO2014/136086; WO2015/095340; WO2015/095346; WO2016/037053。一部の実施形態では、LNPはRV01リポソームである。以下の参考文献を参照のこと: WO2012/006376及びGeall et al. (2012) PNAS USA. Sep 4; 109(36): 14604-9。
投薬量は、主として要因に、例えば投与経路、治療される状態、対象の年齢、体重及び健康に左右されることになり、したがって対象によって異なってもよい。例えば、本発明の核酸の治療有効な成人投薬量は、核酸の0.5～50μg、例えば1～30μg、例えば約1、3、5、10、15、20、25又は30μgを含有することができる。
さらなる態様では、本発明は、本発明による核酸を含むベクターを提供する。
本発明による使用のためのベクターは、ネイキッドDNA又はRNA、プラスミド、ウイルス、コスミド、ファージベクター、例えばラムダベクター、人工染色体、例えばBAC(細菌人工染色体)又はエピソームを始めとする適切な任意の核酸分子とすることができる。或いは、ベクターは、無細胞のin vitro転写又は発現向けの転写ユニット及び/又は発現ユニット、例えばT7適合性システムとすることができる。ベクターは、単独で又は他のベクター、例えばアデノウイルス配列若しくは断片との組合せで、又は非アデノウイルス配列由来のエレメントとの組合せで使用することができる。適切には、ベクターは、野生型配列と比較して実質的に変更されており(例えば、遺伝子又は機能領域が欠失及び/又は不活性化されており)、宿主細胞に導入される場合、挿入されたポリヌクレオチド配列を複製及び発現する。
さらなる態様では、本発明は、本発明によるウイルスFc受容体又はその断片、ヘテロ二量体、核酸又はベクターを含む細胞を提供する。
本発明によるウイルスFc受容体若しくはその免疫原性断片、ウイルスFcR結合パートナー若しくはその断片又はヘテロ二量体は、組換え技術によって適切に生成される。「組換え」とは、ポリヌクレオチドが、クローニング、制限若しくはライゲーションのステップ、又は自然界に見られるポリヌクレオチドとは明確に異なるポリヌクレオチドをもたらす他の手順のうちの少なくとも1つの生成物であることを意味する。組換えベクターとは組換えポリヌクレオチドを含むベクターである。
一実施形態では、本発明によるヘテロ二量体は、マルチシストロン性ベクターから発現される。適切には、ヘテロ二量体は、ウイルスFcR又はその免疫原性断片及びその結合パートナー又はその断片をコードする核酸配列が内部リボソーム侵入部位(IRES)配列によって隔てられている単一のベクターから発現される(Mokrejs, Martin, et al. "IRESite: the database of experimentally verified IRES structures (www. iresite. org)." Nucleic acids research 34.suppl_1 (2006): D125-D130.)。好ましい実施形態では、IRESはIRES EV71配列である。好ましい実施形態では、IRESは配列番号127に示される配列、又はそれと少なくとも60%、65%、70%、75％、80％、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは99.5%同一であるそれ由来のバリアントを含むか又はそれらからなる。
或いは、2つの核酸配列は、ウイルス2A又は「2A様」の配列によって隔てることができ、これによって、別々の2つのポリペプチドの生成がもたらされる。2A配列は、口蹄疫ウイルス、ウマ鼻炎Aウイルス、トセア・アシグナ(Thosea asigna)ウイルス及びブタスコウイルス-1を含めて、種々のウイルス由来のものが知られている。例えば、Szymczak et al., Nature Biotechnology 22:589-594 (2004)、Donnelly et al., J Gen Virol.; 82(Pt 5): 1013-25 (2001)を参照のこと。
場合により、発現及び回復を促進するために、Fc受容体若しくはその免疫原性断片及び/又はウイルスFcR結合パートナー若しくはその断片は、N末端にシグナルペプチドを含むことができる。シグナルペプチドは、当技術分野で知られている多数のシグナルペプチドの内から選択することができ、通常は、組換え発現のために選択されたシステムでの生成及びプロセシングを容易にするために選択される。一実施形態では、シグナルペプチドは、天然ウイルスFcタンパク質又は結合パートナーに天然に存在するものである。系統SD90e由来のHSV2 gEのシグナルペプチドは、配列番号1の残基1～20に位置する。他のHSV系統由来のgEタンパク質向けのシグナルペプチドは、配列アラインメントによって特定することができる。系統SD90e由来のHSV2 gIのシグナルペプチドは、配列番号2の残基1～20に位置する。他のHSV系統由来のgIタンパク質向けのシグナルペプチドは、配列アラインメントによって特定することができる。
場合により、Fc受容体若しくはその免疫原性断片及び/又はウイルスFcR結合パートナー若しくはその断片は、タンパク質の検出(例えば、モノクローナル抗体による検出向けのエピトープタグ)及び/又は精製(例えば、ニッケルキレート樹脂上での精製を可能にするポリヒスチジンタグ)を容易にすることができるタグを構成するアミノ酸配列の付加を、含むことができる。ある特定の実施形態では、切断可能型リンカーを使用することができる。これにより、例えばリンカーを切断することができる作用剤の添加によって、タグを精製複合体から分離することが可能になる。いくつかの異なる切断可能型リンカーは、当業者にとって公知である。
本明細書の宿主細胞を適切な状態下で培養する場合、核酸は、Fc受容体若しくはその免疫原性断片、ウイルスFcR結合パートナー若しくはその断片、及び/又はヘテロ二量体の両ペプチドを発現することができる。次いで、Fc受容体若しくはその免疫原性断片、ウイルスFcR結合パートナー若しくはその断片、及び/又はヘテロ二量体を宿主細胞から分泌させることができる。適切な宿主細胞には、例えば以下が含まれる:
昆虫細胞(例えば、ネッタイシマカ(Aedes aegypti)、オートグラファ・カリフォルニアカ(Autographa californica)、カイコ(Bombyx mori)、キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)、ツマジロクサヨトウ(Spodoptera frugiperda)及びイラクサギンウワバ(Trichoplusia ni))、哺乳動物細胞(例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ及びげっ歯類(例えば、ハムスター))、鳥類細胞(例えば、ニワトリ、アヒル及びガチョウ)、細菌(例えば、大腸菌(E. coli))、枯草菌(Bacillus subtilis)及び連鎖球菌の種(Streptococcus spp.))、酵母細胞(例えば、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・マルトーサ(Candida maltosa)、ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenual polymorpha)、クルイベロマイセス・フラギリス(Kluyveromyces fragilis)、クルイベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、ピキア・ギリエルモンディ(Pichia guillerimondii)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe)及びヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica))、テトラヒメナ(Tetrahymena)細胞(例えば、テトラヒメナ・サーモフィラ(Tetrahymena thermophila))、又はそれらの組合せ。適切には、宿主細胞は、グリコシル化を媒介する酵素を有するものである必要がある。細菌宿主は、宿主細胞がグリコシル化酵素を導入するように改変されていない限り、そのような改変タンパク質には一般には適しておらず、代わりに、真核生物宿主、例えば、昆虫細胞、鳥類細胞又は哺乳動物細胞を使用する必要がある。
昆虫細胞(例えば、ネッタイシマカ(Aedes aegypti)、オートグラファ・カリフォルニアカ(Autographa californica)、カイコ(Bombyx mori)、キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)、ツマジロクサヨトウ(Spodoptera frugiperda)及びイラクサギンウワバ(Trichoplusia ni))、哺乳動物細胞(例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ及びげっ歯類(例えば、ハムスター))、鳥類細胞(例えば、ニワトリ、アヒル及びガチョウ)、細菌(例えば、大腸菌(E. coli))、枯草菌(Bacillus subtilis)及び連鎖球菌の種(Streptococcus spp.))、酵母細胞(例えば、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・マルトーサ(Candida maltosa)、ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenual polymorpha)、クルイベロマイセス・フラギリス(Kluyveromyces fragilis)、クルイベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、ピキア・ギリエルモンディ(Pichia guillerimondii)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe)及びヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica))、テトラヒメナ(Tetrahymena)細胞(例えば、テトラヒメナ・サーモフィラ(Tetrahymena thermophila))、又はそれらの組合せ。適切には、宿主細胞は、グリコシル化を媒介する酵素を有するものである必要がある。細菌宿主は、宿主細胞がグリコシル化酵素を導入するように改変されていない限り、そのような改変タンパク質には一般には適しておらず、代わりに、真核生物宿主、例えば、昆虫細胞、鳥類細胞又は哺乳動物細胞を使用する必要がある。
適切な昆虫細胞発現システム、例えばバキュロウイルスシステムは当業者に知られており、例えば、Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987)に記載されている。適切な昆虫細胞には、例えば、Sf9細胞、Sf21細胞、Tn5細胞、シュナイダーS2細胞、及びHigh Five細胞(親のイラクサギンウワバBTI-TN-5B1-4細胞株(Invitrogen)に由来するクローン分離株)が含まれる。
鳥類細胞発現システムも当業者に知られており、例えば、米国特許第5,340,740号; 第5,656,479号; 第5,830,510号; 第6,114,168号; 及び第6,500,668号; 欧州特許第EP 0787180B号; 欧州特許出願第EP03291813.8号; WO 03/043415; 及びWO 03/076601に記載されている。適切な鳥類細胞には、例えば、ニワトリ胚性幹細胞(例えば、EBx(登録商標)細胞)、ニワトリ胚性線維芽細胞、ニワトリ胚性胚細胞、アヒル細胞(例えばAGE1.CR及びAGE1.CR.pIX細胞株(ProBioGen)、これらは、例えばVaccine 27:4975-4982 (2009)及びWO2005/042728に記載されている)、EB66細胞等が含まれる。
好ましくは、宿主細胞は哺乳動物細胞(例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ及び齧歯動物(例えばハムスター))である。適切な哺乳動物細胞には、例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ヒト胎児腎臓細胞(HEK-293細胞、通常には剪断アデノウイルス5型DNAによって形質転換されている)、NIH-3T3細胞、293-T細胞、Vero細胞、ヒーラ細胞、PERC.6細胞(ECACC寄託番号96022940)、Hep G2細胞、MRC-5(ATCC CCL-171)、WI-38(ATCC CCL-75)、胎児アカゲザル肺細胞(ATCC CL-160)、マディン-ダービーウシ腎臓(「MDBK」)細胞、マディン-ダービーイヌ腎臓(「MDCK」)細胞(例えば、MDCK(NBL2)、ATCC CCL34; 又はMDCK33016、DSM ACC 2219)、仔ハムスター腎臓(BHK)細胞、例えばBHK21-F、HKCC細胞等が含まれる。
ある特定の実施形態では、ウイルスFc受容体若しくはその免疫原性断片、ウイルスFcR結合パートナー若しくはその断片、及び/又はヘテロ二量体をコードする組換え核酸は、選択された原核生物又は真核生物の宿主細胞における発現向けにコドン最適化される。
ウイルスFc受容体若しくはその免疫原性断片、ウイルスFcR結合パートナー若しくはその断片、及び/又はヘテロ二量体は、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー(例えば、本明細書に記述のタグ付けシステムのいずれかを使用して)、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、及びレクチンクロマトグラフィーを含めて、当技術分野でよく知られるいくつかの方法のいずれかによって組換え細胞培養物から回収及び精製することができる。タンパク質リフォールディングステップを、成熟タンパク質の立体配置を完成する上で、所望により使用することができる。最後に、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を最終精製ステップで用いることができる。上述の参考文献に加えて、例えば以下に記載のものを含めて、様々な精製方法が当技術分野でよく知られる: Sandana (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.; 及びBollag et al. (1996) Protein Methods, 2nd Edition Wiley-Liss, NY; Walker (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harris and Angal (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, U.K.; Scopes (1993) Protein Purification: Principles and Practice 3rd Edition Springer Verlag, NY; Janson and Ryden (1998) Protein Purification: Principles, High Resolution Methods and Applications, Second Edition Wiley-VCH, NY; 及びWalker (1998) Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ。
「精製」又は「精製する」という用語は、組成物又は宿主細胞又は培養物から、その存在が所望ではない成分を除去するプロセスを指す。精製とは相対用語であり、望ましくない成分の全ての痕跡が組成物から除去されていることを必要とはしない。ワクチン生産の文脈では、精製には、遠心分離、透析、イオン交換クロマトグラフィー、及びサイズ排除クロマトグラフィー、親和性精製又は沈殿などのプロセスが含まれる。したがって、「精製された」という用語は絶対的な純度を必要としない、むしろ、それは相対用語として意図されている。実質的に純粋な核酸又はタンパク質の調製物は、所望の核酸又はタンパク質が調製物の総核酸含有量のうちの少なくとも50%を占めているように精製することができる。ある特定の実施形態では、実質的に純粋な核酸又はタンパク質は、調製物の総核酸又はタンパク質の含有量のうちの少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、又は少なくとも95%以上を占めることになる。なんらの精製ステップにも供されなかった免疫原性分子又は抗原又は抗体(すなわち、自然界で見られるままの分子)は、医薬品(例えばワクチン)使用には適していない。
適切には、ウイルスFc受容体若しくはその免疫原性断片、ウイルスFcR結合パートナー若しくはその断片、及び/又はヘテロ二量体の回収収率は、1リットルあたり2mgより高く、好ましくは1リットルあたり5、10、15又は20mgより高く、より好ましくは、1リットルあたり25mgよりさらに高い。
適切には、ウイルスFc受容体若しくはその免疫原性断片、ウイルスFcR結合パートナー若しくはその断片、及び/又はヘテロ二量体の凝集レベルは、20%より低く、好ましくは15又は10%より低く、より好ましくは5%よりさらに低い。
好ましい実施形態では、ウイルスFc受容体又はその断片は、アジュバントと一緒に対象に投与される。本明細書で使用される「アジュバント」とは、意図された対象、例えばヒト対象において抗原に対する免疫応答を増強する組成物を指す。
適切なアジュバントの例には、それらに限定されないが、無機アジュバント(例えば無機金属塩、例えばリン酸アルミニウム又は水酸化アルミニウム)、有機アジュバント(例えばサポニン、例えばQS21、又はスクアレン)、オイルベースのアジュバント(例えばフロイント完全アジュバント及びフロイント不完全アジュバント)、水中油型エマルジョン、サイトカイン(例えばIL-1β、IL-2、IL-7、IL-12、IL-18、GM-CFS及びIFN-γ)粒子アジュバント(例えば免疫刺激複合体(ISCOMS)、リポソーム又は生分解性ミクロスフェア)、ビロソーム、細菌アジュバント(例えばモノホスホリルリピドA、例えば3-de-O-アシル化モノホスホリルリピドA (3D-MPL)、又はムラミルペプチド)、合成アジュバント(例えば非イオン性ブロックコポリマー、ムラミルペプチドアナログ又は合成リピドA)、合成ポリヌクレオチドアジュバント(例えばポリアルギニン又はポリリシン)、Toll様受容体(TLR)アゴニスト(TLR-1、TLR-2、TLR-3、TLR-4、TLR-5、TLR-6、TLR-7、TLR-8及びTLR-9の各アゴニストを含む)及び非メチル化CpGジヌクレオチド(「CpG」)を含有する免疫賦活性オリゴヌクレオチドが含まれる。
好ましい実施形態では、アジュバントは、TLRアゴニスト及び/又は免疫学的に活性なサポニンを含む。好ましくはなおも、アジュバントは、リポソーム製剤中のTLRアゴニスト及びサポニンを含むか又はそれらからなることができる。TLRアゴニストとサポニンとの比は5:1、4:1、3:1、2:1又は1:1とすることができる。
アジュバントにおけるTLRアゴニストの使用は当技術分野でよく知られており、例えばLahiri et al. (2008) Vaccine 26:6777によってレビューされている。アジュバント効果を得るために刺激することができるTLRには、TLR2、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8及びTLR9が含まれる。TLR2、TLR4、TLR7及びTLR8の各アゴニスト、特にTLR4アゴニストが好ましい。
適切なTLR4アゴニストにはリポ多糖、例えばモノホスホリルリピドA(MPL)及び3-O-脱アシル化モノホスホリルリピドA(3D-MPL)が含まれる。米国特許第4,436,727号にはMPLとその製造が開示されている。米国特許第4,912,094号及び再審査証明書第B1 4,912,094号には、3D-MPL及びその製造方法が開示されている。別のTLR4アゴニストは、合成リピドA様分子であるグルコピラノシルリピドアジュバント(GLA)である(例えば、Fox et al. (2012) Clin. Vaccine Immunol 19:1633を参照のこと)。さらなる実施形態では、TLR4アゴニストは、合成TLR4アゴニスト、例えば構造においてMPL及び3D-MPLと類似する合成二糖分子であってもよく、又はTLR4アゴニストは、合成単糖分子、例えば、例えばWO9850399、WO0134617、WO0212258、WO3065806、WO04062599、WO06016997、WO0612425、WO03066065及びWO0190129に開示されるアミノアルキルグルコサミニドホスフェート(AGP)化合物であってもよい。そのような分子もまた、リピドA模倣体として科学文献及び特許文献に記載されている。リピドA模倣体は適切には、リピドAと一部の機能的及び/又は構造的活性を共有しており、一態様では、TLR4受容体によって認識される。本明細書に記載のAGPは、当技術分野ではリピドA模倣体と呼ばれることもある。好ましい実施形態では、TLR4アゴニストは、3D-MPLである。TLR4アゴニスト、例えば3-O-脱アシル化モノホスホリルリピドA(3D-MPL)及びワクチンにおけるアジュバントとしてのその使用が、WO 96/33739及びWO2007/068907に例えば記載されており且つAlving et al. (2012) Curr Opin in Immunol 24:310でレビューされている。
適切には、アジュバントは、免疫学的に活性なサポニン、例えば免疫学的に活性なサポニン画分、例えばQS21を含む。
サポニンを含むアジュバントが当技術分野で記載されてきた。サポニンについては以下に記載されている: Lacaille-Dubois and Wagner (1996) A review of the biological and pharmacological activities of saponins, Phytomedicine vol 2:363。サポニンは、ワクチンにおけるアジュバントとして知られている。例えば、Quil A(南米の樹木キラヤ・サポナリア・モリナ(Quillaja Saponaria Molina)の樹皮に由来する)は、アジュバント活性を有すると1974年にDalsgaardら("Saponin adjuvants", Archiv. fur die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlin, 243)に報告された。Quil Aと関連した無毒でアジュバント活性を保持するQuil Aの精製画分がHPLCによって単離された(Kensil et al. (1991) J. Immunol. 146: 431)。Quil A画分についてはまた、US 5,057,540及び"Saponins as vaccine adjuvants", Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2):1-55にも記載されている。
本発明での使用にとって適切な、そのような2つのQuil A画分が、QS7及びQS21(QA-7及びQA-21としても知られる)である。QS21は、本発明での使用のための免疫学的に活性な好ましいサポニン画分である。QS21はKensil (2000) In O'Hagan: Vaccine Adjuvants: preparation methods and research protocols, Homana Press, Totowa, New Jersey, Chapter 15でレビューされている。Quil A、例えばQS21及びQS7の画分を含む粒子状アジュバントシステムが、例えば、WO 96/33739、WO 96/11711及びWO2007/068907に記載されている。
他の成分に加えて、アジュバントは好ましくはステロールを含む。ステロールの存在は、サポニンを含む組成物の反応原性をさらに低下させ得る。例えばEP0822831を参照のこと。適切なステロールとしては、ベータ-シトステロール、スティグマステロール、エルゴステロール、エルゴカルシフェロール及びコレステロールが含まれる。コレステロールが特に適切である。適切には、免疫学的に活性なサポニン画分はQS21であり、QS21:ステロールの比は、1:100から1:1w/w、例えば1:10から1:1w/w、例えば1:5から1:1w/wである。
好ましい実施形態では、アジュバントは、TLR4アゴニスト及び免疫学的に活性なサポニンを含む。より好ましい実施形態では、TLR4アゴニストは3D-MPLであり、免疫学的に活性なサポニンはQS21である。
一部の実施形態では、アジュバントは、例えば、スクアレン、アルファ-トコフェロール及び界面活性剤(例えば、WO95/17210を参照のこと)を含む水中油型エマルジョンの形態で、又はリポソームの形態で提供される。リポソームでの提供が好ましい。
本明細書で用いられる場合の「リポソーム」という用語は、水性の内部を囲む単層又は多層(特に、形成される脂質膜の数に応じて、2、3、4、5、6、7、8、9又は10層)の脂質構造を指す。リポソーム及びリポソーム製剤は、当技術分野でよく知られている。リポソームでの提供は、例えば、WO 96/33739及びWO2007/068907に記載されている。リポソームを形成することができる脂質には、脂肪又は脂肪様特性を有する全ての物質が含まれる。リポソーム中の脂質を構成することができる脂質は、グリセリド、グリセロリン脂質、グリセロホスフィノ脂質、グリセロホスホノ脂質、スルホリピド、スフィンゴ脂質、リン脂質、イソプレノリド、ステロイド、ステアリン、ステロール、アルケオリピド、合成カチオン性脂質及び炭水化物含有脂質を含む群から選択することができる。本発明の特定の実施形態では、リポソームはリン脂質を含む。適切なリン脂質には(限定されないが): ホスファチジルコリンの合成における中間体であるホスホコリン(PC); 天然リン脂質誘導体: 卵ホスホコリン、卵ホスホコリン、大豆ホスホコリン、水素化大豆ホスホコリン、天然リン脂質としてのスフィンゴミエリン; 及び合成リン脂質誘導体: ホスホコリン(ジデカノイル-L-a-ホスファチジルコリン[DDPC]、ジラウロイルホスファチジルコリン[DLPC]、ジミリストイルホスファチジルコリン[DMPC]、ジパルミトイルホスファチジルコリン[DPPC]、ジステアロイルホスファチジルコリン[DSPC]、ジオレオイルホスファチジルコリン[DOPC]、1-パルミトイル,2-オレオイルホスファチジルコリン[POPC]、ジエライドイルホスファチジルコリン[DEPC])、ホスホグリセロール(1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホグリセロール[DMPG]、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホグリセロール[DPPG]、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホグリセロール[DSPG]、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホグリセロール[POPG])、ホスファチジン酸(1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジン酸[DMPA]、ジパルミトイルホスファチジン酸[DPPA]、ジステアロイル-ホスファチジン酸[DSPA])、ホスホエタノールアミン(1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン[DMPE]、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン[DPPE]、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン[DSPE]、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン[DOPE])、ホスホセリン、ポリエチレングリコール[PEG]リン脂質が含まれる。
リポソームのサイズは、リン脂質の組成及びその調製のために使用される方法に応じて、30nmから数μmで変化してもよい。本発明の特定の実施形態では、リポソームのサイズは、50nm～500nmの範囲となり、さらなる実施形態では、50nm～200nmである。動的レーザー光散乱は、当業者であればよく知られているリポソームのサイズを測定するのに使用される方法である。
特に適切な実施形態では、本発明において用いられるリポソームは、DOPC及びステロール、特にコレステロールを含む。したがって、特定の実施形態では、本発明の組成物は、本明細書に記載の任意の量でリポソームの形態にあるQS21を含み、ここで、前記リポソームはDOPC及びステロール、特にコレステロールを含む。
より好ましい実施形態では、アジュバントはリポソーム製剤中に3D-MPL及びQS21を含む。
一実施形態では、アジュバントは、リポソーム製剤中に25～75、例えば35～65マイクログラム(例えば約又は正確に50マイクログラム)の3D-MPL、及び25～75、例えば35～65(例えば約又は正確に50マイクログラム)のQS21を含む。
別の実施形態では、アジュバントは、リポソーム製剤中に12.5～37.5、例えば20～30マイクログラム(例えば約又は正確に25マイクログラム)の3D-MPL、及び12.5～37.5、例えば20～30マイクログラム(例えば約又は正確に25マイクログラム)のQS21を含む。
本発明の別の実施形態では、アジュバントは水中油型エマルジョンを含むか又はそれからなる。適切には、水中油型エマルジョンは、代謝可能な油及び乳化剤を含む。特に適切な代謝可能な油はスクアレンである。スクアレン(2,6,10,15,19,23-ヘキサメチル-2,6,10,14,18,22-テトラコサヘキサエン)は、サメ肝油に大量に、オリーブ油、小麦胚芽油、米糠油及び酵母では少量で見いだされる不飽和油である。一実施形態では、代謝可能な油は、免疫原性組成物中に組成物の総体積の0.5%～10%(v/v)の量で存在する。特に適切な乳化剤は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(ポリソルベート80又はツイーン80)である。一実施形態では、乳化剤は、免疫原性組成物中に組成物の総体積の0.125～4%(v/v)の量で存在する。水中油型エマルジョンはトコールを場合により含むことができる。トコールは当技術分野でよく知られており、EP0382271 B1に記載されている。適切には、トコールは、アルファ-トコフェロール又はその誘導体、例えばアルファ-トコフェロールコハク酸エステル(ビタミンEコハク酸エステルとしても知られる)とすることができる。一実施形態では、トコールは、アジュバント組成物中に免疫原性組成物の総体積の0.25%～10%(v/v)の量で存在する。水中油型エマルジョンはまた場合によりソルビタントリオレエート(SPAN 85)を含むことができる。
水中油型エマルジョンでは、油と乳化剤は水性担体に含まれている必要がある。水性担体は、例えばリン酸緩衝生理食塩水又はクエン酸塩とすることができる。
特に、本発明で使用される水中油型エマルジョンシステムは、サブミクロンの範囲の小さい油滴サイズを有する。適切には液滴サイズは、直径が120～750nmの範囲となり、より具体的には120～600nmのサイズとなる。さらにより具体的には、水中油型エマルジョンは、強度でそのうちの少なくとも70%が直径500nm未満であり、より具体的には強度でそのうちの少なくとも80%が直径300nm未満であり、より具体的には強度でそのうちの少なくとも90%が直径120～200nmの範囲にある油滴を含有する。
ウイルスFc受容体又はその断片及びアジュバントは、別々に保存され、対象に投与する前に(即座に(ex tempo))混合することができることが理解されるであろう。ウイルスFc受容体又はその断片及びアジュバントはまた、個別でしかし同時に対象に投与することができる。
一態様では、本明細書に記載のウイルスFc受容体又はその免疫原性断片及びアジュバントを含むか又はそれらからなるキットを提供する。
配列比較
密接に関連する2つポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列を比較する目的で、第1の配列と第2の配列との間の「配列同一性」又は「%同一性」は、アラインメントプログラム、例えば標準設定を使用したBLAST(登録商標)(blast.ncbi.nlm.nih.govで入手可能、最終アクセス日: 2016年9月12日)を使用して求めることができる。パーセンテージ同一性は、同一である残基の数をアラインメントの長さで除して、100を乗じたものである。同一性の代替の定義は、同一である残基の数をアラインメントをとった残基の数で除して、100を乗じたものである。代替の方法はギャップ法(gapped method)を使用することを含むが、この場合、アラインメントにおけるギャップ、例えば、他方の配列に対する一方の配列中の欠失が考慮される。ポリペプチド又はポリヌクレオチドの配列は、それらがそれらの全長にわたって100%の配列同一性を共有する場合、他方のポリペプチド又はポリヌクレオチドの配列と同一であると言われる。
密接に関連する2つポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列を比較する目的で、第1の配列と第2の配列との間の「配列同一性」又は「%同一性」は、アラインメントプログラム、例えば標準設定を使用したBLAST(登録商標)(blast.ncbi.nlm.nih.govで入手可能、最終アクセス日: 2016年9月12日)を使用して求めることができる。パーセンテージ同一性は、同一である残基の数をアラインメントの長さで除して、100を乗じたものである。同一性の代替の定義は、同一である残基の数をアラインメントをとった残基の数で除して、100を乗じたものである。代替の方法はギャップ法(gapped method)を使用することを含むが、この場合、アラインメントにおけるギャップ、例えば、他方の配列に対する一方の配列中の欠失が考慮される。ポリペプチド又はポリヌクレオチドの配列は、それらがそれらの全長にわたって100%の配列同一性を共有する場合、他方のポリペプチド又はポリヌクレオチドの配列と同一であると言われる。
2つの配列間の「差異」とは、例えば、他方の配列と比較した、一方の配列のある位置における単一アミノ酸残基の挿入、欠失又は置換を指す。
第1の参照ポリペプチド配列を第2の比較ポリペプチド配列と比較する目的で、第2の配列を作製するために第1の配列に対してなされた付加、置換及び/又は欠失の数を確認することができる。付加とは、第1のポリペプチドの配列への1個のアミノ酸残基の付加である(第1のポリペプチドのいずれかの末端での付加を含む)。置換とは、異なる1個のアミノ酸残基による第1のポリペプチドの配列中の1個のアミノ酸残基の置換である。欠失とは、第1のポリペプチドの配列からの1個のアミノ酸残基の欠失である(第1のポリペプチドのいずれかの末端での欠失を含む)。
適切には本発明の配列における置換は、保存的置換とすることができる。保存的置換は、置換されるアミノ酸と類似の物理化学的特性を有する別のアミノ酸によるアミノ酸の置換を含む(例えば、Stryer et al, Biochemistry, 5th Edition 2002, pages 44-49を参照のこと)。好ましくは、保存的置換は以下からなる群から選択される置換である: (i)塩基性アミノ酸の別の異なる塩基性アミノ酸による置換、(ii)酸性アミノ酸の別の異なる酸性アミノ酸による置換、(iii)芳香族アミノ酸の別の異なる芳香族アミノ酸の置換、(iv)非極性脂肪族アミノ酸の別の異なる非極性脂肪族アミノ酸による置換、及び(v)極性非荷電アミノ酸の別の異なる極性非荷電アミノ酸による置換。塩基性アミノ酸は、アルギニン、ヒスチジン及びリシンからなる群から選択されることが好ましい。酸性アミノ酸は、アスパラギン酸又はグルタミン酸であることが好ましい。芳香族アミノ酸は、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンからなる群から選択されることが好ましい。非極性脂肪族アミノ酸は、アラニン、バリン、ロイシン、メチオニン及びイソロイシンからなる群から選択されることが好ましい。極性非荷電アミノ酸は、セリン、スレオニン、システイン、プロリン、アスパラギン及びグルタミンからなる群から選択されることが好ましい。保存的アミノ酸置換とは対照的に、非保存的アミノ酸置換とは、上に概説の保存的置換(i)から(v)に該当しない任意のアミノ酸による1個のアミノ酸の交換である。
用語
「コードする」とは、生物学的プロセス、例えばペプチド又はタンパク質の合成における他のポリマー及び巨大分子の合成用の鋳型として機能する、ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列の固有の特性を指す。二本鎖ヌクレオチド分子のコード鎖(この配列は配列表で通常には提供される)と非コード鎖(遺伝子又はcDNAの転写用の鋳型として使用される)はどちらも、ペプチド又はタンパク質をコードすると呼んでもよい。特に明記しない限り、本明細書で使用される場合、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」には、互いに縮重型であり、同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列が含まれる。
「コードする」とは、生物学的プロセス、例えばペプチド又はタンパク質の合成における他のポリマー及び巨大分子の合成用の鋳型として機能する、ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列の固有の特性を指す。二本鎖ヌクレオチド分子のコード鎖(この配列は配列表で通常には提供される)と非コード鎖(遺伝子又はcDNAの転写用の鋳型として使用される)はどちらも、ペプチド又はタンパク質をコードすると呼んでもよい。特に明記しない限り、本明細書で使用される場合、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」には、互いに縮重型であり、同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列が含まれる。
本明細書で使用される「発現」又は「発現する」という用語は、その作動可能に連結されたプロモーターによって駆動される特定のヌクレオチド配列の転写及び/又は翻訳として定義される。
本開示の文脈において特に説明がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。分子生物学の一般用語の定義は、Benjamin Lewin, Genes V, published by Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); 及びRobert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)に見いだすことができる。
「a」、「an」及び「the」という単数形の用語は、文脈から明確に別義が示されていない限り、複数の指示対象を含む。同様に、文脈から明確に別義が示されていない限り、「又は」という単語は「及び」を含むことが意図される。「複数」という用語は2つ以上を指す。核酸又はポリペプチドに対して与えられている全ての塩基サイズ又はアミノ酸サイズ及び全ての分子量又は分子質量値は近似であり、説明のために提供されていることがさらに理解されるべきである。加えて、物質、例えば抗原の濃度又はレベルに関して与えられている数値限定は近似であることが意図される。したがって、濃度が少なくとも(例えば)200pgであると指示されている場合は、濃度は少なくとも概ね(approximately)(又は「約(about)」又は「およそ(～)」)200pgであると理解されるべきであることが意図される。
「含む(comprises)」という用語は「含む(includes)」を意味する。したがって、文脈から明確に別義が示されていない限り、「comprises」という単語及びその変化形、例えば「comprise」及び「comprising」は、表明された化合物若しくは組成物(例えば、核酸、ポリペプチド、抗原)若しくはステップ、又は化合物群若しくはステップ群を包含することを意味するが、他の任意の化合物、組成物、ステップ、又はこれらの群を排除することを意味しないと理解されるであろう。
本明細書で提供されるアミノ酸配列は、当技術分野で知られるように、一文字又は三文字の命名法のいずれかによって指定される(例えば、Eur. J. Biochem. 138:9-37(1984)を参照のこと)。
本開示の実行又は試験にあたっては、本明細書に記載するものと類似又は等価の方法及び材料を使用することができるが、適切な方法及び材料について下に記載する。
次に、本発明について以下の非限定的な例によってさらに説明する。
[実施例]
[実施例1]
マウスにおけるアジュバント化HSV2 gE及びgEgIヘテロ二量体タンパク質の免疫原性
材料及び方法
・ 試験された治験薬及び製剤
本明細書で試験されるHSV2 gEは、配列番号7(外部ドメイン)に示されるアミノ酸配列を有した。
[実施例1]
マウスにおけるアジュバント化HSV2 gE及びgEgIヘテロ二量体タンパク質の免疫原性
材料及び方法
・ 試験された治験薬及び製剤
本明細書で試験されるHSV2 gEは、配列番号7(外部ドメイン)に示されるアミノ酸配列を有した。
本明細書で試験されるHSV2 gEgIヘテロ二量体は、配列番号8(外部ドメイン)に示されるアミノ酸配列を有するHSV2 gIと非共有結合の複合体に会合した配列番号7(外部ドメイン)に示されるアミノ酸配列を有するHSV2 gEからなった。
HSV2 gE(464μg/mL)及びgEgIヘテロ二量体(824μg/mL)の各タンパク質を、Expi293F発現システムを使用してヒト胎児腎臓293F細胞(HEK293F)で産生させ、pH7.5の20mM Hepes-150mM NaCl-5%グリセロール溶液中で製剤化した。
AS01は、MPL、QS-21及びリポソーム(50μL中にMPL 5μg及びQS-21 5μg)を含有するアジュバントシステムである。
・研究モデル
この研究には、CB6F1マウス(C57Bl/6及びBalb/Cマウスのハイブリッド)を使用した。CB6F1マウスは、アジュバント化タンパク質及びウイルスベクターを含む種々のタイプの免疫原を用いるワクチン接種後に、強力なCD4+/CD8+T細胞及び体液性免疫応答を生成することがわかっている。CD4+T細胞及び抗体応答を誘導する能力は、これらのマウス及びヒトの間で同等の傾向を示した。
この研究には、CB6F1マウス(C57Bl/6及びBalb/Cマウスのハイブリッド)を使用した。CB6F1マウスは、アジュバント化タンパク質及びウイルスベクターを含む種々のタイプの免疫原を用いるワクチン接種後に、強力なCD4+/CD8+T細胞及び体液性免疫応答を生成することがわかっている。CD4+T細胞及び抗体応答を誘導する能力は、これらのマウス及びヒトの間で同等の傾向を示した。
・免疫学的読み出し情報
ELISAによって測定される総gE及びgI特異的IgG結合抗体
総gE又はgI特異的IgG抗体の定量化を、間接ELISAを使用して実施した。HSV2由来の組換えgE(約51kDa)又はgIタンパク質(約46kDa)を、コーティング抗原として使用した。これらのタンパク質は、HEK293F細胞においてExpi293F発現システムを使用して産生された。
ELISAによって測定される総gE及びgI特異的IgG結合抗体
総gE又はgI特異的IgG抗体の定量化を、間接ELISAを使用して実施した。HSV2由来の組換えgE(約51kDa)又はgIタンパク質(約46kDa)を、コーティング抗原として使用した。これらのタンパク質は、HEK293F細胞においてExpi293F発現システムを使用して産生された。
ポリスチレン96ウェルELISAプレート(Nunc F96 Maxisorpカタログ439454)を、炭酸/重炭酸50mM pH9.5緩衝剤(GSK社内)で2μg/mL(gE)及び1μg/mL(gI)の濃度に希釈した100μL/ウェルの抗原を用いてコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、コーティング溶液を除去し、プレートを、PBS(ブロッキング緩衝剤)(ref 232100、Becton Dickinson、米国)で希釈した200μL/ウェルのDifkomilk 10%を用いて37℃で1時間ブロッキングした。ブロッキング溶液を除去し、コーティングされたプレートに3倍血清希釈物(PBS+0.1% Tween20+1% BSA緩衝剤、GSK社内中)を添加し、37℃で1時間インキュベートした。プレートを、PBS 0.1% Tween20(洗浄緩衝剤)を用いて4回洗浄し、ペルオキシダーゼ(Peroxydase)でコンジュゲート化したAffiniPureヤギ抗マウスIgG(H+L)(ref 115-035-003、Jackson、米国)を二次抗体として使用した。ウェルあたり100マイクロリットルの、PBS+0.1% Tween20+1% BSA緩衝剤で1:500の濃度に希釈した二次抗体を各ウェルに添加しプレートを37℃で45分間インキュベートした。
次いで、プレートを、洗浄緩衝剤を用いて4回及び脱イオン水を用いて2回洗浄し、100μL/ウェルのクエン酸ナトリウム0.1M pH5.5緩衝剤(GSK社内)で希釈した75%単一成分TMBペルオキシダーゼELISA基質(ref 172-1072、Bio-Rad、米国)の溶液とともに、RT(室温)で15分間インキュベートした。酵素的発色現象をウェルあたり100μLの0.4N硫酸1M(H2SO4)を用いて停止させ、プレートを、Versamax ELISAリーダーを使用して450/620nmの吸光度で読み取った。
光学密度(OD)をキャプチャし、SoftMaxPro GxP v5.3ソフトウェアを使用して分析した。標準曲線は、4パラメーターロジスティック回帰フィットを参照標準に適用することによって作成した。試料中の抗体価は、標準曲線の補間によって算出した。試料の抗体価は、標準曲線の20～80%ダイナミックレンジ内に入った希釈物から得られた値を平均することによって得た。力価は、EU/mL(mLあたりのELISA単位)で表した。
ICSアッセイによって測定されたHSV2 gE及びgI特異的CD4+/CD8+T細胞免疫応答
IL-2及び/又はIFN-γ及び/又はTNF-αを産生するgE特異的CD4+及びCD8+T細胞の頻度を、HSV2 gE又はgIペプチドプールを用いるex-vivo刺激後のプライム免疫化の14、28及び42日後に採取した脾細胞において評価した。
IL-2及び/又はIFN-γ及び/又はTNF-αを産生するgE特異的CD4+及びCD8+T細胞の頻度を、HSV2 gE又はgIペプチドプールを用いるex-vivo刺激後のプライム免疫化の14、28及び42日後に採取した脾細胞において評価した。
脾細胞の単離- 免疫化の14日、28日又は42日後のいずれかで個々のマウスから脾臓を採取し、RPMI添加剤(グルタミン、ペニシリン/ストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸及び2-メルカプトエタノール)を添加したRPMI1640培地(=RPMI/添加剤)に入れた。組織グラインダーを使用して各脾臓から細胞懸濁液を調製した。脾臓細胞懸濁液を濾過し(セルストレーナー、100μm)、次いで、フィルターを40mLの冷PBS-EDTA 2mMを用いてすすいだ。遠心分離(335g、4℃で10分間)後、細胞を7mLの冷PBS-EDTA 2mMに再懸濁した。第2の洗浄ステップをこれまでに記載されたように実施し、最後に細胞を、5% FCSを添加したRPMI/添加剤2mLに再懸濁した。次いで、細胞懸濁液を細胞計数(MACSQuantアナライザーを使用する)のためにPBS緩衝剤(190μL)で20×希釈した(10μL)。計数後、細胞を遠心分離(335g、RTで10分間)し、5% FCSを添加したRPMI/添加剤に107個細胞/mLで再懸濁した。
細胞調製- 新鮮脾細胞を丸底96ウェルプレートに106個細胞/ウェル(100μL)で播種した。次いで、
- 15merの、HSV2由来のgEタンパク質の配列に広がる重複ペプチドプール(ウェルあたりペプチドあたり1μg/mL)、
- 15merの、HSV2由来のgIタンパク質の配列に広がる重複ペプチドプール(ウェルあたりペプチドあたり1μg/mL)、
- 15merの、ヒトβ-アクチンタンパク質の配列に広がる重複ペプチドプール(ウェルあたりペプチドあたり1μg/mL)(無関係の刺激)、
- RPMI/添加剤培地(アッセイの陰性対照として)、
- PMA- それぞれ、0.25μg/mL及び2.5μg/mLの作業濃度のイオノマイシン溶液(アッセイの陽性対照として)
のいずれかの100μLを含有する、ウェルあたり1μg/mLの抗CD28(クローン37.51)及び抗CD49d抗体((クローン9C10(MFR4.B))を用いて細胞を6時間(37℃、5% CO2)刺激した。
- 15merの、HSV2由来のgEタンパク質の配列に広がる重複ペプチドプール(ウェルあたりペプチドあたり1μg/mL)、
- 15merの、HSV2由来のgIタンパク質の配列に広がる重複ペプチドプール(ウェルあたりペプチドあたり1μg/mL)、
- 15merの、ヒトβ-アクチンタンパク質の配列に広がる重複ペプチドプール(ウェルあたりペプチドあたり1μg/mL)(無関係の刺激)、
- RPMI/添加剤培地(アッセイの陰性対照として)、
- PMA- それぞれ、0.25μg/mL及び2.5μg/mLの作業濃度のイオノマイシン溶液(アッセイの陽性対照として)
のいずれかの100μLを含有する、ウェルあたり1μg/mLの抗CD28(クローン37.51)及び抗CD49d抗体((クローン9C10(MFR4.B))を用いて細胞を6時間(37℃、5% CO2)刺激した。
2時間のex vivo刺激後、5% FCSを添加したRPMI/添加剤で1/200希釈されたブレフェルジンA(Golgi plug ref 555029、BD Bioscience)をさらに4時間添加して、サイトカイン分泌を阻害した。次いで、プレートを、一晩のインキュベーションのために4℃に移した。
細胞内サイトカイン染色- 4℃で一晩インキュベートした後、細胞をV底96ウェルプレートに移し、遠心分離し(189g、4℃で2分間)、250μLの冷PBS+1% FCS(フロー緩衝剤)で洗浄した。第2の遠心分離(189g、4℃で2分間)後、細胞を50μLの、1/50希釈した抗CD16/32抗体(クローン2.4G2)を含有するフロー緩衝剤に再懸濁して、非特異的抗体結合をブロッキングした(4℃で10分間)。次いで、50μLの、マウス抗CD4-V450抗体(1/100に希釈したクローンRM4-5)、抗CD8-PerCp-Cy5.5抗体(1/50に希釈したクローン53-6.7)及びLive/Dead(商標)Fixable Yellow死滅細胞染色(1/500)を含有するフロー緩衝剤を、4℃で暗所で30分間添加した。インキュベーション後、各ウェル中に100μLのフロー緩衝剤を添加し、次いで、細胞を遠心分離した(189g、4℃で5分間)。第2の洗浄ステップを、200μLのフロー緩衝剤を用いて実施し、遠心分離後、細胞を固定し、200μLのCytofix-Cytoperm溶液を暗所で4℃で20分間添加することによって透過処理した。プレート遠心分離(500g、4℃で5分間)後、細胞を200μLのPerm/Wash緩衝剤を用いて洗浄し、遠心分離し(500g、4℃で5分間)、50μLの、マウス抗IL2-FITC(クローンJES6-5H4、1/400希釈)、抗IFN-γ-APC(クローンXMG1.2、1/200希釈)及び抗TNF-α-PE(クローンMP6-XT22、1/700希釈)抗体を含有するPerm/Wash緩衝剤に、暗所で4℃で1時間再懸濁した。インキュベーション後、各ウェル中に100μLの、フロー緩衝剤を添加し、次いで、細胞を、200μLのPerm/Wash緩衝剤を用いて最後に洗浄し(遠心分離500g、4℃で5分間)、220μLのPBSに再懸濁した。
細胞取得及び分析- 染色された細胞を、LSRIIフローサイトメーターを使用するフローサイトメトリー及びFlowJoソフトウェアによって分析した。生細胞を、Live/Dead染色を用いて同定し、次いで、前方/側方散乱光(FSC/SSC)ゲーティングに基づいてリンパ球を単離した。3時点から、取得の際に約5000のCD4+/CD8+T細胞事象で取得を実施した。IFN-γ+/-IL-2+/-及びTNF-α+/-産生細胞のパーセンテージをCD4+及びCD8+T細胞集団で算出した。各試料について、ペプチドプール刺激後に検出された特異的シグナルから培地刺激後に検出された非特異的シグナルを除去した。
免疫蛍光(mmunofluorescent)アッセイによって流入領域リンパ節において測定された濾胞性BヘルパーCD4+T細胞及び活性化B細胞
免疫化後10日目のマウスのDLN(左腸骨)において、Tfh CD4+T及び活性化B細胞のパーセンテージを調べた。AS01及びNaCl免疫化マウスを陰性対照群として使用した。
免疫化後10日目のマウスのDLN(左腸骨)において、Tfh CD4+T及び活性化B細胞のパーセンテージを調べた。AS01及びNaCl免疫化マウスを陰性対照群として使用した。
流入領域リンパ節からの細胞の単離- AS01アジュバント化gE及びgE/gIタンパク質で免疫した個々のマウスから、免疫化の10日後に左腸骨リンパ節を採取した。単離細胞の数が少ないために、両対照群(NaCl及びAS01注射マウス)について、鼠経及び膝窩リンパ節とともに左及び右腸骨をプールして、免疫蛍光染色及びフローサイトメトリー取得のために利用可能な免疫細胞数を増大させた。
リンパ節を600μLのRPMI/添加剤中に入れ、組織グラインダーを使用して細胞懸濁液を調製し、濾過し(セルストレーナー(cell stainer)100μm)、0.5mLの冷PBS-EDTA 2mMを用いてすすいだ。遠心分離(335g、4℃で5分間)後、細胞を0.5mLの冷PBS-EDTA 2mMに再懸濁し、氷上に5分間置いた。第2の洗浄ステップをこれまでに記載されたように実施し、細胞を、5% FCSを添加したRPMI/添加剤0.5mLに再懸濁した。最後に、細胞懸濁液を、細胞計数(MACSQuantアナライザーを使用する)のためにPBS緩衝剤(190μL)で20×希釈した(10μL)。
計数後、細胞を遠心分離(335g、RTで5分間)し、5% FCSを添加したRPMI/添加剤に2.5×107個細胞/mLで再懸濁した。
免疫染色- 新鮮細胞(100μL中の、2.5×106個細胞/ウェル)をV底96ウェルプレートに移し、遠心分離(400g、4℃で5分間)し、200μLのPBS緩衝剤中で洗浄した。第2の遠心分離(400g、4℃で5分間)後、細胞を200μLのPBS緩衝剤に再懸濁し、最後の洗浄ステップを実施した(400g、4℃で5分間)。次いで、細胞を100μLの、PBS緩衝剤で1/1000希釈したFixableViability染料eFluor 780に再懸濁し、RTで暗所で15分間インキュベートした。
インキュベーション後、細胞を遠心分離(400g、4℃で5分間)し、50μLの、抗CD16/32抗体(1/50に希釈したクローン2.4G2)、ラット抗CD4-PECy7(1/100に希釈したクローンRM4-5)、ラット抗マウスIgG2a CD19 FITC(1/200に希釈したクローン1D3/CD19)、ラット抗マウスCXCR5ビオチン(1/50に希釈したクローン2G8)、ハムスター抗マウスCD279(PD-1)BV421(1/250に希釈したクローンJ43)、ラット抗マウスIgG2a F4/80 APC/cy7(1/50に希釈したクローンBM8)抗体を含有するフロー緩衝剤(PBS+1% FCS)を4℃で暗所で45分間添加した。
インキュベーション後、各ウェル中に100μLのフロー緩衝剤を添加し、次いで、細胞を遠心分離した(400g、4℃で5分間)。第2の洗浄ステップを、200μLのフロー緩衝剤を用いて実施し、遠心分離後、50μLの、ストレプトアビジン-APC(1/200に希釈した)を含有するフロー緩衝剤を、4℃、暗所で30分間添加した。
インキュベーション後、各ウェル中に100μLのフロー緩衝剤を添加し、次いで、細胞を遠心分離した(400g、4℃で5分間)。第2の洗浄ステップを、200μLのフロー緩衝剤を用いて実施し、遠心分離後、細胞を固定し、200μLのeBioscience(商標)固定/透過処理(Thermofisher、ref 00-5523-00)溶液を暗所、4℃で30分間添加することによって透過処理した。プレート遠心分離(400g、4℃で5分間)後、細胞を200μLの透過処理緩衝剤1×(eBioscience(商標))を用いて洗浄し、遠心分離(400g、4℃で5分間)し、100μLの、マウス抗BCL6-PE(1/50に希釈したクローンK112-91)抗体を含有する透過処理緩衝剤1×(eBioscience(商標))に暗所で4℃で45分間再懸濁した。
インキュベーション後、各ウェル中に100μLの、透過処理緩衝剤1×(eBioscience(商標))を添加し、遠心分離(400g、4℃で5分間)し、次いで、細胞を200μLの透過処理緩衝剤1×(eBioscience(商標))を用いて最後に2回洗浄し(遠心分離400g、4℃で5分間)、フローサイトメトリー取得のために220μLのPBSに再懸濁した。
細胞取得及び分析- 染色された細胞を、LSRIIフローサイトメーター及びFlowJoソフトウェアを使用してフローサイトメトリーによって分析した。生細胞をLive/Dead染色を用いて同定し、次いで、リンパ球を前方/側方散乱光(FSC/SSC)ゲーティングに基づいて単離した。
Tfh CD4+T細胞を単離するために、総生存CD4+T細胞で取得を実施し、PD-1/CXCR5陽性細胞のパーセンテージを算出した。
活性化B細胞を単離するために、総生存CD19+B細胞で取得を実施し、PD-1/CXCR5/BCL6陽性細胞のパーセンテージを算出した。
mFcγRIVに結合し、活性化するワクチン誘導性抗体の測定(マウスFcγRIV ADCCリポーターバイオアッセイ-Promega)
Promega laboratoiresによって開発された、マウスFcγRIV抗体依存性細胞傷害性(ADCC)リポーターバイオアッセイ(カタログ番号M1201)は、マウスFcγRIV(mFcγRIV)に特異的に結合し、活性化するFcドメインを有する抗体及び他の生物製剤の効力及び安定性を測定するために使用できる生物発光細胞ベースアッセイである。mFcγRIVは、マウスADCCに関与する受容体であり、ヒトにおけるADCCに関与する主要なFc受容体であるヒトFcγRIIIaと関連する。
Promega laboratoiresによって開発された、マウスFcγRIV抗体依存性細胞傷害性(ADCC)リポーターバイオアッセイ(カタログ番号M1201)は、マウスFcγRIV(mFcγRIV)に特異的に結合し、活性化するFcドメインを有する抗体及び他の生物製剤の効力及び安定性を測定するために使用できる生物発光細胞ベースアッセイである。mFcγRIVは、マウスADCCに関与する受容体であり、ヒトにおけるADCCに関与する主要なFc受容体であるヒトFcγRIIIaと関連する。
手短には、最初にATCC laboratoriesから購入したBALB/cマウス由来の3T3細胞(クローンA31、ATCC ref CCL-163)をHSV感染培地(DMEM+10%非補完性FBS+2mM L-グルタミン+1%ペニシリン(Pennicilin)/ストレプトマイシン(streptamycin))中で調製し、平底白色96ウェルプレート(Corning、ref CLS3917)中に10000個細胞/ウェル(100μL)の濃度で播種した。次いで、各ウェル中に100マイクロリットル(100μL)のHSV2 MS系統(ATCC、ref VR-540)を2の多重感染度(MOI)で添加し、細胞を37℃-5% CO2で14時間30分間インキュベートした。エッジ副作用を避けるためにプレートのエッジは使用しなかった。
インキュベーション後、HSV2感染3T3細胞(標的細胞(T))を、200μLのPBSを用いて洗浄し、各ウェルに25μLのPromegaアッセイ緩衝剤((96% RPMI 1640培地(36mL)+4%低IgG血清(1.5mL)を添加した。個々のマウス血清を、丸底96ウェルプレート(Nunc、ref 168136)中でPromegaアッセイ緩衝剤で2倍の段階希釈によって希釈し(1/1で開始する希釈)、70μLの各血清希釈物を対応するウェルに移した。次いで、各ウェルに25μLの、マウスFcγRIVを発現する遺伝子操作されたルシフェラーゼリポーターJurkat細胞((エフェクター細胞(E))を添加し(E/T 6.6/1)、プレートを37℃-5% CO2で6時間インキュベートした。
インキュベーション後、プレートをRTに15分間静置し、各ウェルに75μLのBio-Glow試薬を添加した。最後に、プレートをRTで20分間インキュベートし、Synergy H1マイクロプレートリーダー(bioTek(商標))を使用して読み出した。各マウスの曲線下面積(AUC)を、GraphPad Prismソフトウェアを使用することによって算出した。NACl試料の平均の3倍STD偏差を陽性閾値として使用して、AUCを算出した。NaCl対照群では、1の値をAUCのすべての負の値について任意に設定した。
HSV2 MS系統に対する中和抗体を測定するための細胞ベースアッセイ
中和アッセイを開発して、異なる動物種から得た血清試料において中和抗体価を検出し、定量化した。血清(50μL/ウェル)を、平底96ウェルプレート(Nunclon Delta Surface、Nunc、Denmark、ref 167008)中でHSV培地(1%ネオマイシン及び1%ゲンタマイシンを添加したDMEM)で2倍段階希釈(1/10で開始する希釈)によって希釈した。次いで、血清を、2%のモルモット血清補体(Harlan、ref C-0006E)を添加したHSV培地で予め希釈した、400 TCID50/50μL/ウェルのHSV2 MS系統(ref ATCC VR-540)とともに37℃(5% CO2)で2時間インキュベートした。プレートのエッジは使用せず、各プレートの1つのカラムを、ウイルス及び血清を含まないまま(TC)又はウイルスを含むが血清を含まない(TV)とし、それぞれ、感染の陰性又は陽性対照として使用した。アッセイの陽性対照血清は、異なる用量(0.22、0.66、2、6μg/用量)のHSV2 gD/AS01(2.5μg)で免疫され、第2の(14PII)又は第3の(14PIII)免疫化の14日後に採取されたマウスから得たプールされた血清試料である。
中和アッセイを開発して、異なる動物種から得た血清試料において中和抗体価を検出し、定量化した。血清(50μL/ウェル)を、平底96ウェルプレート(Nunclon Delta Surface、Nunc、Denmark、ref 167008)中でHSV培地(1%ネオマイシン及び1%ゲンタマイシンを添加したDMEM)で2倍段階希釈(1/10で開始する希釈)によって希釈した。次いで、血清を、2%のモルモット血清補体(Harlan、ref C-0006E)を添加したHSV培地で予め希釈した、400 TCID50/50μL/ウェルのHSV2 MS系統(ref ATCC VR-540)とともに37℃(5% CO2)で2時間インキュベートした。プレートのエッジは使用せず、各プレートの1つのカラムを、ウイルス及び血清を含まないまま(TC)又はウイルスを含むが血清を含まない(TV)とし、それぞれ、感染の陰性又は陽性対照として使用した。アッセイの陽性対照血清は、異なる用量(0.22、0.66、2、6μg/用量)のHSV2 gD/AS01(2.5μg)で免疫され、第2の(14PII)又は第3の(14PIII)免疫化の14日後に採取されたマウスから得たプールされた血清試料である。
抗体ウイルス混合物のインキュベーション後、各プレートの各ウェルに10000個のVero細胞/100μLを添加し、プレートを37℃、5% CO2下で4日間インキュベートした。感染の4日後、プレートから上清を除去し、細胞を、HSV顕色培地(1%ネオマイシン及び1%ゲンタマイシン+2% FBSを添加したDMEM)で15×希釈したWST-1溶液(細胞生存力を測定するための試薬、Roche、ref 11644807001)とともに37℃(5% CO2)で8時間インキュベートした。中和抗体価を算出するために、データのセットを、「ウイルスを含まない細胞」ウェル及び「血清を含まない細胞」ウェルにおけるWST-1 O.D.の平均に基づいて、それぞれ0及び100%細胞変性効果(CPE)に正規化した。次いで、希釈iでのCPEの阻害のパーセンテージは、以下によって与えられた:
阻害%=(O.D.i-平均O.D.血清を含まない細胞)/(平均O.D.ウイルスを含まない細胞-平均O.D.血清を含まない細胞)
阻害%=(O.D.i-平均O.D.血清を含まない細胞)/(平均O.D.ウイルスを含まない細胞-平均O.D.血清を含まない細胞)
次いで、CPEの50%低減をもたらす希釈の逆数を、Softmaxproソフトウェアを用い非線形回帰を使用して外挿した。
・統計的方法
IgG抗体応答については、群(HSV2 gE、HSV2 gE/gI及びNaCl)、時点及びその相互作用を固定効果として含めることによって、並びに時点(動物が同定された)の反復測定を考慮することによって、log10力価に対して二元配置分散分析(ANOVA)モデルをあてはめる。
IgG抗体応答については、群(HSV2 gE、HSV2 gE/gI及びNaCl)、時点及びその相互作用を固定効果として含めることによって、並びに時点(動物が同定された)の反復測定を考慮することによって、log10力価に対して二元配置分散分析(ANOVA)モデルをあてはめる。
CD4+T細胞応答については、群(HSV2 get、HSV2 gE/gi及びNaCl)、時点及びその相互作用を固定効果として含めることによって、log10頻度に対して二元配置分散分析(ANOVA)モデルをあてはめる。
幾何平均及びその95%CI並びにNaClに対するgE(又はgE/gI)の幾何平均比及びその90%CIが、すべての時点についてこれらのモデルから導かれる。
時点比較のために、幾何平均比*及びその95%CIもこれらのモデルから導かれる。
*用量II(又はI)後のgE(又はgE/gI)に対する用量III(又はII)後のgE(又はgE/gI)
*用量II(又はI)後のgE(又はgE/gI)に対する用量III(又はII)後のgE(又はgE/gI)
NaCl閾値は、数日にわたるNaClデータのP95をベースとする。HSV2 gE特異的CD4+T細胞応答について0.19%、HSV2 gI特異的CD4+T細胞応答について0.32%、及びβ-アクチンCD4+T細胞応答について0.30%に設定される。
研究デザイン
未処置の雌性CB6F1マウス6～8週齢(n=20/群1～2)に、50μLのAS01を用いてアジュバント化された、5μg/用量の組換えHSV2 gE(群1)又はHSV2 gE/gIヘテロ二量体(群2)タンパク質を用いて0、14及び28日目に腓腹筋中に筋肉内(i.m.)に注射した。陰性対照群として、マウスに、50μLのNaCl 150mM溶液(群4)を用いて0、14及び28日目にi.m.注射した。さらなる群のマウス(n=4/群3)に、AS01単独を用いて0日目にのみi.m注射し、陰性対照群として使用して、DLN(流入領域リンパ節)における濾胞性BヘルパーCD4+T細胞活性化B細胞応答の誘導を評価した。
未処置の雌性CB6F1マウス6～8週齢(n=20/群1～2)に、50μLのAS01を用いてアジュバント化された、5μg/用量の組換えHSV2 gE(群1)又はHSV2 gE/gIヘテロ二量体(群2)タンパク質を用いて0、14及び28日目に腓腹筋中に筋肉内(i.m.)に注射した。陰性対照群として、マウスに、50μLのNaCl 150mM溶液(群4)を用いて0、14及び28日目にi.m.注射した。さらなる群のマウス(n=4/群3)に、AS01単独を用いて0日目にのみi.m注射し、陰性対照群として使用して、DLN(流入領域リンパ節)における濾胞性BヘルパーCD4+T細胞活性化B細胞応答の誘導を評価した。
第1の免疫化後10日目に、DLN(左腸骨結節)における濾胞性BヘルパーCD4+T細胞活性化B細胞応答を調べるために、gE及びgEgI/AS01免疫化群(群1～2)中の8匹のマウス及び対照免疫化群(群3～4)中の4匹のマウスを選別した。
第1の(14PI)、第2の(14PII)及び第3の(14PIII)免疫化後14日目に、群1～2及び4中の4匹のマウスを選別して、脾臓におけるgE及びgI特異的CD4+/CD8+T細胞応答を評価した。
最後に、第1の(14PI)、第2の(14PII)及び第3の(14PIII)免疫化の14日後に各群(4匹のマウス/群)において血清を採取して、総抗gE及びgI特異的IgG抗体応答及びその潜在的細胞傷害活性をマウスADCCリポーターバイオアッセイを使用することによって調べた。
CD4+T細胞結果(D28及びD42時点での)のため、及びIgG抗体応答(D14、D28及びD42時点での)のために、この研究(実験A)から得たデータを、これまでの実験(実験B)から得たデータとともにプールした。
結果
・組換えHSV2 gE及びgE/gIタンパク質は、gE及びgI特異的CD4+/CD8+T細胞応答を誘導する
・組換えHSV2 gE及びgE/gIタンパク質は、gE及びgI特異的CD4+/CD8+T細胞応答を誘導する
雌性近交系CB6F1マウスに、50μLのAS01を用いてアジュバント化された、5μgのHSV2 gE(n=20/群1)又はHSV2 gE/gIタンパク質(n=20/群2)のいずれかを用いて0、14及び28日目にi.m注射した。免疫化の同一スケジュールで、マウスのさらなる群に、生理食塩水溶液(NaCl 150mM)を用いてi.m注射し、陰性対照として使用した(n=16/群4)。第1の、第2の及び第3の免疫化の14日後、エンドポイント分析のために各群の4匹の動物を選別した。HSV2 gE又はgIペプチドプールを用いるex-vivo刺激後、IL-2+/-IFN-γ+/-及び/又はTFN-α+/-を発現するワクチン特異的CD4+及びCD8+T細胞を同定するために脾臓を個々に採取し、処理した。
図5に例示されるように、実験Aについて、AS01アジュバント化HSV2 gE及びHSV2 gE/gIタンパク質の両方とも、NaCl対照群と比較して、第1の、第2の及び第3の免疫化後にHSV2 gE抗原に向けた強力なCD4+T細胞応答を誘導した。NaCl群に対するgE及びgE/gI免疫化群の間で算出された、gE特異的CD4+T細胞応答の幾何平均比(GMR)は、すべて10倍より上であった(表3)。AS01アジュバント化HSV2 gE免疫化群において、及びより少ない程度ではあるが、AS01アジュバント化HSV2 gE/gI免疫化群において、第1のものと比較して2倍付加された値の第3の用量(PIII/PI)が観察されるようである(2.43及び1.79のGMR)(表4)。gE特異的CD4+T細胞応答に関して、第2の(28日目)及び第3の免疫化(42日目)後に実験(実験A及び実験B)のプールについて同一結果が観察される(図6)(表4)。
実験Aについて、AS01アジュバント化HSV2 gE/gIタンパク質で免疫されたマウスでは、第1の、第2の及び第3の免疫化後にgI特異的CD4+T細胞応答が検出された。異なる時点の、NaCl群に対するgE/gI免疫化群の間で算出されたgI特異的CD4+T細胞応答のGMRはすべて、8倍より上であった(図7)(表5)。結果は、第1のものと比較して第3の用量の2倍の増大を示唆する(表6)。
最後に、実験Aでは、AS01アジュバント化HSV2 gE及びgE/gIタンパク質を用いる2又は3免疫化後に、gE特異的であるが、gI特異的ではないCD8+T細胞が検出された(図8～図9)。
・組換えHSV2 gE及びgE/gIタンパク質は、流入領域リンパ節において濾胞性BヘルパーCD4+T細胞拡大増殖及び活性化B細胞を促進する
雌性近交系CB6F1マウスに、左腓腹筋に50μLのAS01を用いてアジュバント化された5μgのHSV2 gE(n=20/群1)又はgE/gI(n=20/群2)タンパク質で0日目にi.m免疫した。免疫化の同一スケジュールで、マウスの2つのさらなる群に(n=4/群)、生理食塩水溶液(NaCl 150mM)を用いて(n=16/群4)又は50μLのAS01単独(n=4/群3)を用いてi.m注射し、陰性対照として使用した。
雌性近交系CB6F1マウスに、左腓腹筋に50μLのAS01を用いてアジュバント化された5μgのHSV2 gE(n=20/群1)又はgE/gI(n=20/群2)タンパク質で0日目にi.m免疫した。免疫化の同一スケジュールで、マウスの2つのさらなる群に(n=4/群)、生理食塩水溶液(NaCl 150mM)を用いて(n=16/群4)又は50μLのAS01単独(n=4/群3)を用いてi.m注射し、陰性対照として使用した。
免疫化の10日後、エンドポイント分析のためにgE及びgE/gI-AS01免疫化群中の8匹のマウス並びに両陰性対照群中の4匹のマウスを選別した。左腸骨流入領域リンパ節を採取して、濾胞性BヘルパーCD4+T(Tfh)細胞(CD4+/CXCR5+/PD-1+)及び活性化B細胞(CD19+/CXCR5+/Bcl6+)の頻度を評価した。単離細胞の数が少ないために、両対照群(NaCl及びAS01注射されたマウス)について、鼠経及び膝窩リンパ節とともに左及び右腸骨をプールして、免疫蛍光染色及びフローサイトメトリー取得のために利用可能な免疫細胞数を増大させた。
マウスのAS01及びNaCl処置群と比較して、AS01アジュバント化HSV2 gE又はgE/gI免疫化群の両方でTfh及び活性化B細胞のより高い頻度が検出された(図10及び図11)。Tfh及び活性化B細胞のレベルは、マウスのAS01とNaCl処置群の間で同様であり、これは、これら両集団の細胞の非特異的活性化は、アジュバント単独を用いた場合には生じなかったということを示唆する。
濾胞性BヘルパーCD4+Tは、CD4+T細胞の特殊化されたサブセットであり、防御免疫において重要な役割を果たし、B細胞が抗体産生性形質細胞及び長命のメモリーB細胞を生成するのを助ける。流入領域リンパ節におけるこれら両方の細胞タイプの検出は、AS01アジュバント化gE又はgEgIヘテロ二量体タンパク質の両方が高品質抗原特異的抗体を誘導し得ることを示唆する。
・組換えHSV2 gE及びgE/gIタンパク質は、gE及び/又はgI特異的IgG抗体を誘導した
雌性近交系CB6F1マウスに、50μLのAS01を用いてアジュバント化された、5μgのHSV2 gE(n=20/群1)又はgE/gI(n=20/群2)タンパク質で0、14及び28日目にi.m免疫した。免疫化の同一スケジュールを用いて、マウスのさらなる群に、生理食塩水溶液(NaCl 150mM)をi.m注射し、陰性対照として使用した(n=16/群4)。第1の、第2の及び第3の免疫化の14日後、各群中の4匹の動物を血清採取のために出血させ、総HSV2 gE及びgI特異的IgG抗体応答を間接ELISAによって評価した。
雌性近交系CB6F1マウスに、50μLのAS01を用いてアジュバント化された、5μgのHSV2 gE(n=20/群1)又はgE/gI(n=20/群2)タンパク質で0、14及び28日目にi.m免疫した。免疫化の同一スケジュールを用いて、マウスのさらなる群に、生理食塩水溶液(NaCl 150mM)をi.m注射し、陰性対照として使用した(n=16/群4)。第1の、第2の及び第3の免疫化の14日後、各群中の4匹の動物を血清採取のために出血させ、総HSV2 gE及びgI特異的IgG抗体応答を間接ELISAによって評価した。
実験Aについて、AS01アジュバント化HSV2 gE及びHSV2 gE/gIタンパク質の両方が、第1の(14日目)、第2の(28日目)及び第3の免疫化(42日目)後に高力価の総gE特異的IgG抗体を誘導した(図12)。NaCl群に対するgEとgE/gI免疫化群の間で算出された、gE特異的IgG力価のGMRはすべて、1780倍より上であった(表7を参照のこと)。gE特異的抗体のレベルは、免疫化マウスの両群について第1の免疫化と比較して第2の免疫化後に19倍より多く増大された(それぞれ、gE及びgE/gI群について、63.68及び19.29のGMR)(表8)。プールされた実験(実験A及び実験B)において同様の結果が観察された(図13)。NaCl群に対するgE及びgE/gI免疫化群の間で算出された、gE特異的IgG力価のGMRはすべて、1963倍より上であった(表7を参照のこと)。さらに、本発明者らは、gE特異的抗体のレベルは、免疫化マウスの両群について第1の免疫化と比較して第2の免疫化後に増大し(21.28のGMR;表8)、gE特異的抗体の強度は、HSV2 gE/gIタンパク質で免疫したマウスの群において第2の及び第3の免疫化の間でのみ増加した(2.15のGMR)(表8)ということを確認した。
実験Aについて、gI特異的IgG抗体応答は、AS01アジュバント化HSV2 gE/gIタンパク質で免疫されたマウスにおいて第1の(14日目)、第2の(28日目)及び第3の免疫化(42日目)後に検出された(図14)。NaCl群に対して算出されたgI特異的IgG力価のGMRはすべて、161倍より上であった(表9)。gI特異的抗体の力価は、第1の免疫化と比較して第2の免疫化後に29倍より多く増大された(表10)。
・非中和gE及び/又はgI特異的抗体は、マウスFcγRIVに結合できる
細胞ベースアッセイによってHSV2 MSウイルスに対する中和抗体応答を評価し、抗体依存性細胞傷害性リポーターバイオアッセイ(Promega)を使用することによってマウスFcγRIV結合性活性を評価した。
細胞ベースアッセイによってHSV2 MSウイルスに対する中和抗体応答を評価し、抗体依存性細胞傷害性リポーターバイオアッセイ(Promega)を使用することによってマウスFcγRIV結合性活性を評価した。
第1の(14日目)、第2の(28日目)及び第3の免疫化(42日目)後に、AS01アジュバント化組換えHSV2 gE及びHSV2 gE/gIタンパク質で免疫されたマウスの両群において、HSV2 MS系統に対する非中和抗体応答を検出した(図15)。興味深いことに、NaCl対照群と比較して、gE/gI特異的抗体は、両免疫化群において各時点(14PI、14PII、14PIII)でFcγRIV発現性Jurkat細胞株に結合できた(ルシフェラーゼリポーターバイオアッセイ)(図16)。これらの結果は、組換えHSV2 gE及びHSV2 gE/gIタンパク質が、Fc結合後のFcγRIV発現性細胞の活性化に続いて、HSV-2感染細胞の細胞破壊(ADCC)を駆動できる可能性がある非中和抗体を誘導したことを示唆する。
[実施例2]
慢性性器HSV2感染症のモルモットモデルにおけるAS01アジュバント化HSV2 gE又はgE/gIヘテロ二量体タンパク質の治療的有効性評価
材料及び方法
・試験された治験薬及び製剤
本明細書において試験されるHSV2 gEは、配列番号7(外部ドメイン)に示されるアミノ酸配列を有した。
慢性性器HSV2感染症のモルモットモデルにおけるAS01アジュバント化HSV2 gE又はgE/gIヘテロ二量体タンパク質の治療的有効性評価
材料及び方法
・試験された治験薬及び製剤
本明細書において試験されるHSV2 gEは、配列番号7(外部ドメイン)に示されるアミノ酸配列を有した。
HSV2 MS系統(7.38 log TCID50/mL)は、ATCC laboratoriesから最初に購入し(ATCC参照:VR-540)、1% L-グルタミン、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、20% NBCSを添加したBiorich-DMEM培地中で保存した。
本明細書において試験されるHSV2 gEgIヘテロ二量体は、配列番号8(外部ドメイン)に示されるアミノ酸配列を有するHSV2 gIと非共有結合の複合体に会合した配列番号7(外部ドメイン)に示されるアミノ酸配列を有するHSV2 gEからなる。
HSV2 gE(920μg/mL)及びgEgIヘテロ二量体(824μg/mL)タンパク質を、Expi293F発現システムを使用してヒト胎児腎臓293F細胞(HEK293F)で産生させ、pH7.5の20mM Hepes-150mM NaCl-5%グリセロール溶液中で製剤化した。
HSV2組換えgDタンパク質(gD2t)は、PBS緩衝剤中で保存した(1mg/mL)。
AS01は、MPL、QS-21及びリポソーム(500μL中に50μg MPL及び50μg QS-21)を含有するアジュバントシステムである。
・研究モデル
小さい動物モデル(マウス、コットンラット及びモルモット)は性器ヘルペスワクチン研究のための有用なツールであるということは広く受け入れられている。文献において、モルモットモデルは、アジュバント化糖タンパク質ワクチン候補の有効性に取り組むための適切なモデルであることが実証されている(Skoberne & al 2013. An Adjuvanted Herpes Simplex Virus 2 Subunit Vaccine Elicits a T Cell Response in Mice and Is an Effective Therapeutic Vaccine in Guinea Pigs. Journal of Virology. 2013April;87(7):3930-3942)。モルモットの性器感染は、ヒト疾患において見られるものに酷似する神経所見を有する自然治癒性外陰腟炎をもたらす。ウイルスは、感覚神経節中の細胞体及び脊髄中の自律神経ニューロンへ逆行性輸送によって輸送される。感染のこの相の間に、ウイルスは、潜在感染を確立し、ヒトと同様に、動物は、ウイルスの自然発症的、断続的な再活性化を受ける。すべてのこれらの理由のために、AS01アジュバント化組換えHSV2 gE及びgE/gIタンパク質の治療的有効性に取り組むために、この研究において慢性性器感染のモルモットモデルが選択された。
小さい動物モデル(マウス、コットンラット及びモルモット)は性器ヘルペスワクチン研究のための有用なツールであるということは広く受け入れられている。文献において、モルモットモデルは、アジュバント化糖タンパク質ワクチン候補の有効性に取り組むための適切なモデルであることが実証されている(Skoberne & al 2013. An Adjuvanted Herpes Simplex Virus 2 Subunit Vaccine Elicits a T Cell Response in Mice and Is an Effective Therapeutic Vaccine in Guinea Pigs. Journal of Virology. 2013April;87(7):3930-3942)。モルモットの性器感染は、ヒト疾患において見られるものに酷似する神経所見を有する自然治癒性外陰腟炎をもたらす。ウイルスは、感覚神経節中の細胞体及び脊髄中の自律神経ニューロンへ逆行性輸送によって輸送される。感染のこの相の間に、ウイルスは、潜在感染を確立し、ヒトと同様に、動物は、ウイルスの自然発症的、断続的な再活性化を受ける。すべてのこれらの理由のために、AS01アジュバント化組換えHSV2 gE及びgE/gIタンパク質の治療的有効性に取り組むために、この研究において慢性性器感染のモルモットモデルが選択された。
・免疫学的読み出し情報
性器皮膚疾患の測定
急性HSV2感染の間に(D0～D14)、動物を、外性器皮膚疾患について0～4の重症度スケールを使用して毎日評価した:
- 0:疾患なし
- 1:紅斑及び/又は腫脹、
- 2:1つ～最大3つの小さい小水疱、
- 3:3つより多い小さい小水疱又は1つの大きな融合した小水疱
- 4:会陰部の重症の小水疱-潰瘍性皮膚疾患。
性器皮膚疾患の測定
急性HSV2感染の間に(D0～D14)、動物を、外性器皮膚疾患について0～4の重症度スケールを使用して毎日評価した:
- 0:疾患なし
- 1:紅斑及び/又は腫脹、
- 2:1つ～最大3つの小さい小水疱、
- 3:3つより多い小さい小水疱又は1つの大きな融合した小水疱
- 4:会陰部の重症の小水疱-潰瘍性皮膚疾患。
急性感染及び第1のワクチン接種用量の投与からの回復後、次いで、動物を同一重症度スケールを使用して再発性ヘルペス疾患の証拠について20日目～70日目に毎日試験した。
ELISAによって測定される総gE及びgI特異的IgG抗体の評価
総gE又はgI特異的IgG抗体の定量化を、上記の実施例1に記載されるように間接ELISAを使用して実施した。
総gE又はgI特異的IgG抗体の定量化を、上記の実施例1に記載されるように間接ELISAを使用して実施した。
ワクチン特異的T細胞の増殖率を測定することによるHSV2 gE及びgI特異的CD4+/CD8+T細胞応答
脾臓におけるHSV特異的CD4+/CD8+T細胞の頻度を、gE又はgI特異的ペプチドプールを用いるex vivo刺激の4日後にCD4+及びCD8+T細胞の総増殖率を測定することによって評価した。ロジスティック上の理由のために、各群中の動物の半分をHSV2負荷後70日目に、半分を74日目に選別した。
脾臓におけるHSV特異的CD4+/CD8+T細胞の頻度を、gE又はgI特異的ペプチドプールを用いるex vivo刺激の4日後にCD4+及びCD8+T細胞の総増殖率を測定することによって評価した。ロジスティック上の理由のために、各群中の動物の半分をHSV2負荷後70日目に、半分を74日目に選別した。
AS01製剤化gE又はgE/gI免疫化モルモットにおける特異的CD4+/CD8+T細胞応答を同定するためのカットオフは、gE又はgI又はβ-アクチンペプチドプールを用いる脾細胞のex-vivo刺激後にNaCl処置群において検出されたCD4+/CD8+T細胞応答の95パーセンタイル(P95)に対応する。
脾細胞の単離- HSV2負荷70又は74日後に個々のモルモットから脾臓を採取し、RPMI添加剤(グルタミン、ペニシリン/ストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸及び2-メルカプトエタノール)を添加した冷RPMI 1640培地(=RPMI/添加剤)中に入れた。個々の脾臓を組織の小片に切断し、組織グラインダーを使用して細胞懸濁液を調製した。次いで、各細胞懸濁液を濾過し(セルストレーナー(cell stainer)100μM)、フィルターを50mLの冷PBS-EDTA 2mMを用いてすすいだ。遠心分離(335g、4℃で8分間)後、細胞を、4mLのBD Pharm Lyse緩衝剤(赤血球(red blood)溶解緩衝剤1×濃縮物)に15秒間再懸濁し、35mLの冷PBS-EDTA 2mMを添加して反応を阻害した。次いで、細胞懸濁液を新しいファルコン管に移し、濾過し(セルストレーナー(cell stainer)100μM)、1mLのPBS-EDTA 2mMを用いてすすいだ。遠心分離(335g、4℃で8分間)後、細胞を5mLのPBS-EDTA 2mMに再懸濁し、細胞計数(MACSQuantアナライザーを使用する)のためにPBS緩衝剤(190μL)で20倍希釈した(10μL)。計数後、細胞懸濁液を、PBS-EDTA 2mMを添加することによって107個細胞/mLの最終濃度で調製した。
ex-vivo標識及びペプチド刺激- 脾細胞のex-vivo標識を、CellTrace Violet増殖キット(ThermoFisher Scientific、ref C34557)を使用して実施した。2000万個の細胞(107個細胞/mLで2mL)を、細胞懸濁液にCell trace Violet溶液(4mMで2mL)を添加し、暗所、37℃で15分間インキュベートすることによって標識した。この15分のインキュベーション期間の間に、細胞を5分毎に混合した。次いで、8mLの、10% FCSを添加した冷RPMI/添加剤を氷上で5分間添加して、溶液中の任意の遊離染料をクエンチした。細胞を2回洗浄し(1400rpm、4℃で10分間)、5% FCSを添加した冷RPMI/添加剤1mLに再懸濁した。次いで、細胞を細胞計数(MACSQuantアナライザーを使用する)のためにPBS緩衝剤(190μL)で20×希釈し(10μL)、ウェルあたりおよそ500000個細胞(5×105個細胞/ウェル)で丸底96ウェルプレート中に播種し、
- 15merの、HSV2 gE及びgE/gIヘテロ二量体タンパク質の全アミノ酸配列に広がる重複ペプチドプール(ペプチドあたり1μg/mL)、
- アッセイの陽性対照として使用した2μg/mLの作業濃度のコンカナバリンA(ConA)溶液、
- アッセイの無関係のペプチドプールとして使用した、15merの、ヒトβ-アクチンタンパク質の配列に広がる重複ペプチドプール(ペプチドあたり1μg/mL)、
- 陰性対照として使用した細胞培地
の100μLを用いて4日間(37℃、5% CO2)刺激した。
- 15merの、HSV2 gE及びgE/gIヘテロ二量体タンパク質の全アミノ酸配列に広がる重複ペプチドプール(ペプチドあたり1μg/mL)、
- アッセイの陽性対照として使用した2μg/mLの作業濃度のコンカナバリンA(ConA)溶液、
- アッセイの無関係のペプチドプールとして使用した、15merの、ヒトβ-アクチンタンパク質の配列に広がる重複ペプチドプール(ペプチドあたり1μg/mL)、
- 陰性対照として使用した細胞培地
の100μLを用いて4日間(37℃、5% CO2)刺激した。
CD4+/CD8+T細胞増殖を評価するための細胞外染色- T細胞増殖(37℃、5%CO2)の4日後、細胞をV底96ウェルプレートに移し、遠心分離(2000rpm、4℃で3分間)し、250μLの冷PBS+1% FCSで洗浄した。第2の遠心分離(2000rpm、4℃で3分間)後、細胞を、50μLの、1/50希釈した抗CD16/32抗体(クローン2.4G2)を含有するフロー緩衝剤(冷PBS 1%、FCS)に再懸濁して、非特異的抗体結合をブロッキングした(4℃で10分間)。次いで、50μLの、マウス抗モルモットCD4-PE抗体(1/50に希釈したクローンCT7-アイソタイプIgG1)及びマウス抗モルモットCD8-FITC抗体(1/100に希釈したクローンCT6-アイソタイプIgG1)を含有するフロー緩衝剤を暗所、4℃で30分間添加した。インキュベーション期間後、細胞を200μLのフロー緩衝剤を用いて2回洗浄し、遠心分離(2000rpm、4℃で3分間)し、Fixable Near-IR死滅細胞染色溶液(冷PBSで1/5000に希釈した)を暗所、4℃で30分間添加した。30分後、各ウェル中に100μLのフロー緩衝剤を添加し、次いで、細胞を遠心分離(2000rpm、4℃で3分間)し、200μLのPBSに最後に再懸濁した。
HSV特異的T細胞活性化を評価するための細胞取得及び分析- 染色された細胞をフローサイトメトリーによって取得し、生データをFlowJoソフトウェアを使用して分析した。Live/Dead染色を用いて生細胞を同定し、次いで、FSC/SSCゲーティングに基づいてリンパ球を単離した。生存CD4+T及びCD8+T細胞集団を単離するための連続ゲーティングを実施することによって総増殖率を算出した。各試料について、培地処置試料において検出されたCD4+及びCD8+T細胞の非特異的増殖率をワクチン特異的ペプチドプールを用いて刺激された試料から除去した。
HSV2 MS系統に対する中和抗体を測定するための細胞ベースアッセイ
血清における中和抗体価の検出及び定量化を上記の実施例1に記載されたように実施した。
血清における中和抗体価の検出及び定量化を上記の実施例1に記載されたように実施した。
・統計的方法
膣内HSV2負荷の14日後の無作為化
HSV2負荷のために使用される110匹のモルモットの中で、生存した64匹について、無作為化し、[0～14]日目にわたる累積病変スコアに基づいて4群のうちの1つに割り当てた。無作為化後の各群における[0～14]日目にわたる累積スコアの平均及びばらつきが表11に提示されている。
膣内HSV2負荷の14日後の無作為化
HSV2負荷のために使用される110匹のモルモットの中で、生存した64匹について、無作為化し、[0～14]日目にわたる累積病変スコアに基づいて4群のうちの1つに割り当てた。無作為化後の各群における[0～14]日目にわたる累積スコアの平均及びばらつきが表11に提示されている。
統計的方法論
AS01/gE(群1)中の2匹の動物、AS01/gE/gI(群2)中の1匹及びAS01/gD2t(群3)群中の1匹を、無作為化後であるが脾臓採取前に倫理的理由のために安楽死させ、すべての分析から除外した。
AS01/gE(群1)中の2匹の動物、AS01/gE/gI(群2)中の1匹及びAS01/gD2t(群3)群中の1匹を、無作為化後であるが脾臓採取前に倫理的理由のために安楽死させ、すべての分析から除外した。
標準化累積病変スコアの群比較- 病変の重症度(0～4にスコア化)の毎日のスコアを、目的の異なる日数の間隔の間すべての動物において合計し、これが累積病変スコアに対応する。これらの累積スコアがコンピュータによって計算される目的の日数の間隔は、[0～14]、[34～47]、[48～70]及び[34～70]である。
20、34及び48日目にワクチン接種を用いて、試験されたワクチン接種効果は以下である:
[34～70]:第2の及び第3のワクチン接種効果
[34～47]:第2のワクチン接種効果のみ
[48～70]:第3のワクチン接種効果のみ。
[34～70]:第2の及び第3のワクチン接種効果
[34～47]:第2のワクチン接種効果のみ
[48～70]:第3のワクチン接種効果のみ。
日数の間隔[0～14]は、無作為化前の疾患のベースライン(急性期)に対応する。
各期間の日数は異なるので、得られた個々の累積スコアを間隔の日数で除して、標準化累積スコアを提供する。
病変スコア(標準化累積スコア)に対するワクチンの影響を評価するために、異なる共分散分析(ANCOVA)モデルを実施する:
・モデル1では、ベースライン共変数([0～14]日目での標準化累積スコア)について調整しながら、応答変数として[34～70]日目での標準化累積スコアを、予測変数として群(4群HSV2感染)を使用して、組み合わされた第2の及び第3のワクチン接種効果を試験する。実際、ベースライン共変数が応答と中程度に相関する場合には、共変数の相違に起因し得る応答値間の相違を除外することができ、これは、群効果のより正確な推定につながる。
・モデル2では、第2のワクチン接種用量の効果のみを試験する。このモデルでは、ベースライン共変数について調整しながら[34～47]日目での標準化累積スコアに対する群の効果を試験する。
・モデル3では、第3のワクチン接種用量の効果のみを試験する。このモデルでは、ベースライン共変数について調整しながら[48～70]日目での標準化累積スコアに対する群の効果を試験する。
・モデル1では、ベースライン共変数([0～14]日目での標準化累積スコア)について調整しながら、応答変数として[34～70]日目での標準化累積スコアを、予測変数として群(4群HSV2感染)を使用して、組み合わされた第2の及び第3のワクチン接種効果を試験する。実際、ベースライン共変数が応答と中程度に相関する場合には、共変数の相違に起因し得る応答値間の相違を除外することができ、これは、群効果のより正確な推定につながる。
・モデル2では、第2のワクチン接種用量の効果のみを試験する。このモデルでは、ベースライン共変数について調整しながら[34～47]日目での標準化累積スコアに対する群の効果を試験する。
・モデル3では、第3のワクチン接種用量の効果のみを試験する。このモデルでは、ベースライン共変数について調整しながら[48～70]日目での標準化累積スコアに対する群の効果を試験する。
各群における平均、ワクチン未接種群と比較されたワクチン接種されたものの相違並びにそのそれぞれの90%CI及びp値(劣性検定の片側評価として)が、これらのモデルから導かれる。各モデルにおいて群間の異なる分散が想定される。ワクチン未接種群と比較されたワクチン接種されたものの低減%もコンピュータによって計算される。
病変を有する日数の群比較- [0～14]、[34～47]、[48～70]及び[34～70]日目の間隔の間すべての動物において病変を有する日数(重症度に関わらず)を合計した。上記の3モデルを、標準化累積病変スコアの代わりにこの新規変数を使用して実施した。
病変再発の群比較- 前日にスコアが0に等しく、当日に0を超えるごとに再発が生じたものとした。すべての動物の再発数は、[34～70]日目の間隔の間各群について報告される。
CD8+/CD4+T細胞増殖率- 分析は、脾臓試料において採取されたCD4+及びCD8+T細胞応答に関して別個に実施する。培地を、比計算において参照として使用する(比=刺激/培地)。NaCl群におけるデータに基づいてCD8+及びCD4+T結果についてカットオフが決定される。
Elisa力価- 各IgG抗体応答(gE-又はgI-特異的)について、群(HSV2 gE、HSV2 gE/gI、ワクチン未接種及びNaCl)、時点及びその相互作用を固定効果として含めることによって、並びに時点(動物が同定された)の反復測定を考慮することによって、log10力価に対して二元配置分散分析(ANOVA)モデルをあてはめる。これらのモデルから幾何平均及びその95%CIが導かれる。
ワクチン未接種群に対するワクチン接種の比較のために、ワクチン未接種群に対するgE (又はgE/gI)の幾何平均比及びその95%CIが、すべての時点についてこれらのモデルから導かれる。
時点比較のために、幾何平均比(用量II(又はI)後のgE(又はgE/gI)に対する用量III(又はII)後のgE(又はgE/gI))及びその95%CIもこれらのモデルから導かれる。
中和力価- PIII(70～74日目)時点のみを分析する。群(HSV2 gE、HSV2 gE/gI、ワクチン未接種)を固定効果として含めること及び群間の異なるばらつきを想定することによって、log10力価に対して一元分散分析(ANOVA)モデルをあてはめる。このモデルから幾何平均及びその95%CIが導かれる。NaCl群は、この群ではばらつきが観察されなかったのでこのモデルには含まれなかった。
ワクチン未接種群に対するワクチン接種の比較のために、ワクチン未接種群に対するgE、gE/gI又はgD2tの幾何平均比及びその95%CIが、このモデルから導かれる。
研究デザイン
9～12週齢の雌性非近交系Hartleyモルモットを、Charles River laboratories(Crl:HA)から入手した。動物を、所定の病原体不在条件で組織内の動物施設で維持された。モルモット(n=110)を、HSV2 MS系統(105pfu-100μL)を用いて0日目に膣内(Ivag)感染させ、重症度スケールを使用して14日間(感染後0日目～14日目)毎日評価された累積病変スコアに基づいて4つの異なる群に無作為化した。このスケールでは、病変は、無疾患を表す0から会陰部のレベルでの重症の小水疱-潰瘍性皮膚疾患を表す4の範囲である。HSV2に感染しなかった、又は重症すぎる臨床症状を発症した動物は、無作為化の前に研究から除外するか、又は倫理的理由のために安楽死させた。
9～12週齢の雌性非近交系Hartleyモルモットを、Charles River laboratories(Crl:HA)から入手した。動物を、所定の病原体不在条件で組織内の動物施設で維持された。モルモット(n=110)を、HSV2 MS系統(105pfu-100μL)を用いて0日目に膣内(Ivag)感染させ、重症度スケールを使用して14日間(感染後0日目～14日目)毎日評価された累積病変スコアに基づいて4つの異なる群に無作為化した。このスケールでは、病変は、無疾患を表す0から会陰部のレベルでの重症の小水疱-潰瘍性皮膚疾患を表す4の範囲である。HSV2に感染しなかった、又は重症すぎる臨床症状を発症した動物は、無作為化の前に研究から除外するか、又は倫理的理由のために安楽死させた。
感染後20、34及び48日目に、3群のモルモットに、500μLのAS01(50μg MPL及び50μg QS-21)アジュバント化組換えHSV2 gE(20μg/用量-n=15/群1)又はAS01(50μg MPL及び50μg QS-21)アジュバント化組換えHSV2 gE/gI(40μg/用量-n=16/群2)又はAS01(50μg MPL及び50μg QS-21)アジュバント化組換えHSV2 gD2tタンパク質(20μg/用量-n=12/群3臨床的治療的有効性の点で陽性対照)のいずれかを用いて筋肉内に(i.m.)注射した。ワクチン未接種HSV2感染群(n=17/群4)中のモルモットに、生理食塩水溶液(NaCl 150mM)を用いて注射した。ワクチン未接種及び非感染モルモットを、免疫学的読み出し情報の陰性対照として使用した(n=5/群5)。すべての動物を感染後20日目～70日目に毎日スコア化して、重症度スケールを使用して再発性臨床病変の重症度を評価した。倫理的理由のために、感染の急性期(D5～D14)の間毎日及び感染の慢性期の間、週に1回、体重評価を実施した。血清試料を、HSV2感染後33日目(13PI)、46日目(12PII)及び70/74日目(22/26PIII)に群1～2及び4において個々に採取し、一方で、群3からのものは、HSV2感染後70/74日目(22/26PIII)のみで採取した。最後に、すべての動物を感染後70又は74日目に選別して、脾臓においてワクチン特異的CD4+/CD8+T細胞応答を評価した(群1～5)。
結果
・AS01製剤化gE又はgE/gIヘテロ二量体タンパク質は、HSV2感染モルモットにおいて全身性ワクチン特異的T細胞応答を誘導した
雌性非近交系モルモット(n=110)を、HSV2 MS系統(105pfu-100μL)を用いて0日目に膣内(Ivag)感染させ、4つの異なる群に無作為化した。感染後20、34及び48日目に、500μLのAS01アジュバント化組換えHSV2 gE(20μg/用量-n=15/群1)又はAS01アジュバント化組換えHSV2 gE/gI(40μg/用量-n=16群2)のいずれかを用いて2群のモルモットに筋肉内(i.m.)注射した。ワクチン未接種HSV2感染群(n=17/群4)中のモルモットに生理食塩水溶液(NaCl 150mM)を注射した。ワクチン未接種及び非感染モルモットを、免疫学的読み出し情報の陰性対照として使用した(n=5/群5)。HSV2感染の70及び74日後、動物を選別して、gE及びgI特異的CD4+/CD8+T細胞応答を評価した。脾臓を採取し、gE/gI特異的CD4+及びCD8+T細胞の総増殖率をex-vivoペプチドプール刺激の4日後に評価した。
・AS01製剤化gE又はgE/gIヘテロ二量体タンパク質は、HSV2感染モルモットにおいて全身性ワクチン特異的T細胞応答を誘導した
雌性非近交系モルモット(n=110)を、HSV2 MS系統(105pfu-100μL)を用いて0日目に膣内(Ivag)感染させ、4つの異なる群に無作為化した。感染後20、34及び48日目に、500μLのAS01アジュバント化組換えHSV2 gE(20μg/用量-n=15/群1)又はAS01アジュバント化組換えHSV2 gE/gI(40μg/用量-n=16群2)のいずれかを用いて2群のモルモットに筋肉内(i.m.)注射した。ワクチン未接種HSV2感染群(n=17/群4)中のモルモットに生理食塩水溶液(NaCl 150mM)を注射した。ワクチン未接種及び非感染モルモットを、免疫学的読み出し情報の陰性対照として使用した(n=5/群5)。HSV2感染の70及び74日後、動物を選別して、gE及びgI特異的CD4+/CD8+T細胞応答を評価した。脾臓を採取し、gE/gI特異的CD4+及びCD8+T細胞の総増殖率をex-vivoペプチドプール刺激の4日後に評価した。
説明的観点から、ワクチン未接種モルモット群(NaCl処置又はHSV2感染群)と比較して、gE又はgI抗原に対して特異的に検出されたCD4+T細胞の総増殖率は、AS01-gE又はAS01-gE/gIタンパク質で免疫されたモルモットの群においてわずかに増大した(図17A)。ワクチン未接種HSV2感染群中の3匹の動物のみが、幾分かのgI及びgE特異的CD4+T細胞応答を示し、これは、HSV2ウイルスが、モルモットではgE及びgI抗原に対する一貫したCD4+T細胞応答を天然には誘導しないことを示唆する(図17)。
・AS01製剤化gE又はgE/gIヘテロ二量体タンパク質は、HSV2感染モルモットにおいて非中和ワクチン特異的IgG抗体のレベルを増大した
雌性モルモット(n=110)に、HSV2 MS株(105pfu-100μL)を用いて0日目に膣内(Ivag)感染させ、4つの異なる群に無作為化した。感染後20、34及び48日目に、3群のモルモットに、500μLのAS01アジュバント化組換えHSV2 gE(20μg/用量-n=15/群1)又はAS01アジュバント化組換えHSV2 gE/gI(40μg/用量-n=16/群2)又はAS01アジュバント化組換えHSV2 gD2tタンパク質(20μg/用量-n=12/群3臨床的治療的有効性の点で陽性対照)のいずれかを用いて筋肉内に(i.m.)注射した。ワクチン未接種HSV2感染群(n=17/群4)中のモルモットに生理食塩水溶液(NaCl 150mM)を用いて注射し、ワクチン未接種及び非感染モルモットを陰性対照(n=5/群5)として使用した。HSV2感染後33日目(13PI)、46日目(12PII)及び70/74日目(22/26PIII)に、すべての群内の個々の動物から血清試料を採取して、ELISAによって総gE及びgI特異的IgG抗体応答を評価し、HSV2 MS系統に対するこれらの抗体の中和活性を感染後70/74日目(22/26PIII)でのみ評価した。ワクチン未接種HSV2感染群中の1匹の個体から得た時点13PIの血清(4.7)は適切に採取されず、この分析では評価されなかった。
雌性モルモット(n=110)に、HSV2 MS株(105pfu-100μL)を用いて0日目に膣内(Ivag)感染させ、4つの異なる群に無作為化した。感染後20、34及び48日目に、3群のモルモットに、500μLのAS01アジュバント化組換えHSV2 gE(20μg/用量-n=15/群1)又はAS01アジュバント化組換えHSV2 gE/gI(40μg/用量-n=16/群2)又はAS01アジュバント化組換えHSV2 gD2tタンパク質(20μg/用量-n=12/群3臨床的治療的有効性の点で陽性対照)のいずれかを用いて筋肉内に(i.m.)注射した。ワクチン未接種HSV2感染群(n=17/群4)中のモルモットに生理食塩水溶液(NaCl 150mM)を用いて注射し、ワクチン未接種及び非感染モルモットを陰性対照(n=5/群5)として使用した。HSV2感染後33日目(13PI)、46日目(12PII)及び70/74日目(22/26PIII)に、すべての群内の個々の動物から血清試料を採取して、ELISAによって総gE及びgI特異的IgG抗体応答を評価し、HSV2 MS系統に対するこれらの抗体の中和活性を感染後70/74日目(22/26PIII)でのみ評価した。ワクチン未接種HSV2感染群中の1匹の個体から得た時点13PIの血清(4.7)は適切に採取されず、この分析では評価されなかった。
各群における幾何平均(GM)の分析は、13PI免疫化で検出されたgE特異的IgG抗体の力価は、ワクチン未接種HSV2感染群と比較してAS01-gE及びAS01-gE/gIワクチン接種群において約25～31倍高かったことを明らかにする(図18A及び図19A)。興味深いことに、gE特異的IgG抗体応答は、AS01-gE及びAS01-gE/gIワクチン接種群の両方について第2の免疫化後に有意にブーストされた(抗体価は、gEについて7.91倍及びgE/gIについて3.85倍増大した)。しかし、第3の免疫化は、これらの両群のワクチン接種モルモットにおいてgE特異的抗体のレベルを増大しなかった(図18A及び図19B)。
AS01-gE/gI免疫化群のGMは、第1の免疫化の13日後(13PI)にワクチン未接種HSV2感染群と比較して約21倍増大であった(図18B及び図19C)。この場合には、gI特異的IgG抗体力価は、AS01-gE/gIタンパク質で免疫したHSV2感染モルモットにおいて第2の(3.93倍PI対PII)及び第3の免疫化(2.31倍PII対PIII)後に有意に増大した(図18及び図19D)。
最後に、中和アッセイによるgE及びgI特異的抗体応答の機能性の評価は、HSV2感染AS01-gE又はAS01-gE/gIワクチン接種群及びワクチン未接種HSV2感染群の間で同様のレベルの中和抗体価を示した。これは、gE又はgE/gIワクチン候補が自然中和抗体応答を増大しないことを示唆し、これは、AS01-gE及びAS01-gE/gIワクチン候補が中和抗体応答を誘導しないことを示唆する。最後に、予想通り、AS01-gD2t製剤は、ワクチン未接種HSV2感染群と比較してより高いレベルの中和抗体価を誘発できた(11.69倍増大した)(図20A及び図20B)。
・AS01製剤化gE又はgE/gIヘテロ二量体タンパク質は、性器再発性HSV2病変頻度に対して治療効果を示す
雌性モルモット(n=110)を、HSV2 MS株(105pfu-100μL)を用いて0日目に膣内(Ivag)感染させ、4つの異なる群に無作為化した。感染後20、34及び48日目に、3群のモルモットに、500μLのAS01アジュバント化組換えHSV2 gE(20μg/用量-n=15/群1)又はAS01アジュバント化組換えHSV2 gE/gI(40μg/用量-n=16/群2)又はAS01アジュバント化組換えHSV2 gD2tタンパク質(20μg/用量-n=12/群3臨床的治療的有効性の点で陽性対照)のいずれかを用いて筋肉内に(i.m.)注射した。ワクチン未接種HSV2感染群中のモルモットに生理食塩水溶液(NaCl 150mM)を注射し、陰性対照として使用した(n=17/群4)。スコア化システムを使用することによってモルモット(群1～4)における性器HSV2再活性化の臨床評価を20日目～70日目に毎日実施して、外陰部のレベルで性器病変の重症度を評価した。第2のワクチン接種日(34日目)で開始し、研究の最後(70日目)までの期間についてワクチン有効性を試験した。各個々の動物の毎日の病変スコア(0～4の範囲)をこの期間について累積した(図21)。標準化累積スコアを提供するために個々の累積スコアを期間の日数で除した。
雌性モルモット(n=110)を、HSV2 MS株(105pfu-100μL)を用いて0日目に膣内(Ivag)感染させ、4つの異なる群に無作為化した。感染後20、34及び48日目に、3群のモルモットに、500μLのAS01アジュバント化組換えHSV2 gE(20μg/用量-n=15/群1)又はAS01アジュバント化組換えHSV2 gE/gI(40μg/用量-n=16/群2)又はAS01アジュバント化組換えHSV2 gD2tタンパク質(20μg/用量-n=12/群3臨床的治療的有効性の点で陽性対照)のいずれかを用いて筋肉内に(i.m.)注射した。ワクチン未接種HSV2感染群中のモルモットに生理食塩水溶液(NaCl 150mM)を注射し、陰性対照として使用した(n=17/群4)。スコア化システムを使用することによってモルモット(群1～4)における性器HSV2再活性化の臨床評価を20日目～70日目に毎日実施して、外陰部のレベルで性器病変の重症度を評価した。第2のワクチン接種日(34日目)で開始し、研究の最後(70日目)までの期間についてワクチン有効性を試験した。各個々の動物の毎日の病変スコア(0～4の範囲)をこの期間について累積した(図21)。標準化累積スコアを提供するために個々の累積スコアを期間の日数で除した。
ベースライン間隔(0～14:無作為化前)と、34～70日目の間に累積されたスコアの間に正の相関が観察され(図22)、これは、ワクチン接種前に重症及び頻繁な病変を示すモルモットは、同様にワクチン接種後に重症及び頻繁な病変を示す傾向があるということを示す。このベースラインについて調整しながら34～70日目の間の標準化累積スコアに対するワクチン接種の効果を試験した。結果は、性器ヘルペスの臨床所見の点でAS01-gE及びAS01-gE/gIワクチン候補の両方について、ワクチン接種の明らかな治療効果を示した(図23A及び図23B)。ワクチン未接種HSV2感染群と比較して、AS01-gE、AS01-gE/gI及びAS01-gD2tを用いる治療的免疫化は、[34～70]日目に対して平均標準化累積病変スコアをそれぞれ56%、45%及び53%有意に低減した(図23C)。すべてのワクチン接種群間で累積病変スコアの有意差は観察されず、これは、AS01-gE及びAS01-gE/gIワクチン候補及びAS01-gD2t陽性対照群の同様の治療的有効性を示唆する可能性がある(図24)。
標準化累積病変スコアは、病変を有する日の頻度及び重症度を組み合わせたので、各群において[34～70]の期間中で性器病変を有する日の総数を算出して、ワクチンのヘルペス再活性化の持続期間及び/又は数に影響を及ぼす能力を評価した。予想通り、ワクチン未接種のものと比較してすべてのワクチン接種群において病変を有する日の頻度も有意に低減した(図25A及び図25B)。ワクチン未接種HSV2感染群と比較して、病変を有する日の総数が、それぞれAS01-gE、AS01-gE/gI及びAS01-gD2t群において47%、37%及び52%低減された(図25B)。さらに、再活性化エピソードの数は、ワクチン接種群と比較してワクチン未接種HSV2感染モルモットにおいて低いようである(図26)。これらのデータは、HSV2ワクチン候補は、モルモットモデルにおいて性器ヘルペス再活性化の持続期間及び/又は数を有意に低減できるということを示唆する。
第2のワクチン接種用量を[34～47]日目の期間で評価し、第3のものは、[48～70]日目の期間で評価した。結果は、試験したすべてのワクチン候補について、ワクチン接種の治療効果が、第2のワクチン接種用量後にすでに観察されたことを示す。ワクチン未接種HSV2感染群と比較して、AS01-gE、AS01-gE/gI及びAS01-gD2tを用いる治療的免疫化は、平均標準化累積病変スコアを[34～47]日目にわたってそれぞれ51%、48%及び51%有意に低減した(図27)。すべてのワクチン接種群において第3の免疫化後に同様のデータが観察された。実際、ワクチン未接種HSV2感染群と比較して、AS01-gE、AS01-gE/gI及びAS01-gD2tを用いる治療的免疫化は、平均標準化累積病変スコアを[48～70]日目にわたってそれぞれ61%、44%及び55%有意に低減した(図27)。これは、第3のワクチン接種用量は、ワクチンの治療効果に依然として影響を及ぼすということを示す可能性がある。
[実施例3]
HSV1及びHSV2 gEgI突然変異体
・gEのIgG Fcドメインに結合する能力を妨げる又は制限する目的の、HSV1及びHSV2 gE突然変異体の設計
ペプチド挿入突然変異体- gE/gI複合体を保ちながらgE Fc結合機能の喪失をもたらすHSV1 gEペプチド挿入突然変異体は、Polcicova K. et al., The extracellular domain of Herpes simplex virus gE is indispensable for efficient cell to cell spread: Evidence for gE/gI receptors. 2005. J. Virol., Vol 79(18), pp11990-12001から公知である。HSV1系統KOS321(UniProtKB受託番号Q703E9)由来のgE中の適したペプチド挿入突然変異として以下が挙げられる:
・配列番号3のアミノ酸残基Y277とE278の間に挿入されたLDIGE(277_insert_LDIGE)、
・配列番号3のアミノ酸残基S291とP292の間に挿入されたADIGL(291_insert_ADIGL)、
・配列番号3のアミノ酸残基A339とA340の間に挿入されたARAA(339_inset_ARAA)、
・配列番号3のアミノ酸残基A340とS341の間に挿入されたARAA(340_inset_ARAA)及び
・配列番号3のアミノ酸残基D348とA349の間に挿入されたADIT(348_insert_ADIT)。
HSV1及びHSV2 gEgI突然変異体
・gEのIgG Fcドメインに結合する能力を妨げる又は制限する目的の、HSV1及びHSV2 gE突然変異体の設計
ペプチド挿入突然変異体- gE/gI複合体を保ちながらgE Fc結合機能の喪失をもたらすHSV1 gEペプチド挿入突然変異体は、Polcicova K. et al., The extracellular domain of Herpes simplex virus gE is indispensable for efficient cell to cell spread: Evidence for gE/gI receptors. 2005. J. Virol., Vol 79(18), pp11990-12001から公知である。HSV1系統KOS321(UniProtKB受託番号Q703E9)由来のgE中の適したペプチド挿入突然変異として以下が挙げられる:
・配列番号3のアミノ酸残基Y277とE278の間に挿入されたLDIGE(277_insert_LDIGE)、
・配列番号3のアミノ酸残基S291とP292の間に挿入されたADIGL(291_insert_ADIGL)、
・配列番号3のアミノ酸残基A339とA340の間に挿入されたARAA(339_inset_ARAA)、
・配列番号3のアミノ酸残基A340とS341の間に挿入されたARAA(340_inset_ARAA)及び
・配列番号3のアミノ酸残基D348とA349の間に挿入されたADIT(348_insert_ADIT)。
HSV2 gE突然変異体の生成のための第1のアプローチは、図1に示されるアラインメントに基づくHSV2 gEの対応する残基の後ろへのペプチドの挿入をベースとした:
・配列番号1のアミノ酸残基Y275とE276の間に挿入されたLDIGE(275_insert_LDIGE)、
・配列番号1のアミノ酸残基S289とP290の間に挿入されたADIGL(289_insert ADIGL)、
・配列番号1のアミノ酸残基A337とS338の間に挿入されたARAA(337_insert_ARAA)、
・配列番号1のアミノ酸残基S338とT339の間に挿入されたARAA(338_insert_ARAA)、及び
・配列番号1のアミノ酸残基H346とA347の間に挿入されたADIT(346_insert_ADIT)。
・配列番号1のアミノ酸残基Y275とE276の間に挿入されたLDIGE(275_insert_LDIGE)、
・配列番号1のアミノ酸残基S289とP290の間に挿入されたADIGL(289_insert ADIGL)、
・配列番号1のアミノ酸残基A337とS338の間に挿入されたARAA(337_insert_ARAA)、
・配列番号1のアミノ酸残基S338とT339の間に挿入されたARAA(338_insert_ARAA)、及び
・配列番号1のアミノ酸残基H346とA347の間に挿入されたADIT(346_insert_ADIT)。
単一点突然変異-ヒトIgG(hIgG)の435位のヒスチジン残基は、hIgG FcドメインのHSV1 gEgI複合体への結合にとって必須であると同定されている(Chapman T.L. et al., Characterization of the interaction between the Herpes simplex virus type I Fc receptor and immunoglobulin G. 1999. JBC., Vol 274 (11), pp 6911-6919)。HSV-1 gEgI/Fc複合体(PDB 2GJ7)の結晶構造及びMOE(Molecular Operating Environment)ソフトウェア(Chemical Computing Group)を使用して、hIgG残基H435との結合が生じる区域内のHSV1 gE FcRにおいて3つの位置(配列番号3のH247、P319及びP321)を同定し、これは、gEの全体的なフォールディングを保ちながらgEのhIgG Fcドメインへの結合に影響を及ぼし得る。図1で示されるアラインメントに基づいて、これらの位置は、配列番号1に示されるHSV2 gE配列の残基H245、P317及びP319に対応する。
8つのHSV1 gE単一点突然変異体(H247A、H247K、P319R、P321A、P321R、P321G、P321K及びP321T)及び5つのHSV1 gE二重点突然変異体(H247A-P321A、H247A-P321R、H247A-P321G、H247A-P321K及びH247A-P321T)は、gE安定性に対して影響を有さない、gE/Fc結合界面に対して負の影響を有するとコンピュータで検証した。対応するHSV2 gE単一点突然変異体(H245A、H245K、P317R、P319A、P319R、P319G、P319K及びP319T)及び二重点突然変異体(H245A-P319A、H245A-P319R、H245A-P319G、H245A-P319K及びH245A-P319T)も設計した。
HSV-1 gEgI/Fc複合体(PDB 2GJ7)の結晶構造及びPDBePISAウェブサイト(http://www.ebi.ac.uk/msd-srv/prot_int/pistart.html)を使用して、gE/Fc界面(32位置が同定された)を同定した。2D構造に関与しない位置のみを維持し、gEのフォールディングに対して最小のあり得る影響しか有さないように、Rosetta高分子モデリングソフトウェア(http://www.rosettacommons.org)を用いる構造分析を実施した。6つの単一点突然変異(A339G、P321D、P321S、A340D、N243A及びR322D)及び2つの二重点突然変異(N243A-R322D及びN243A-P321D)は、gEの全体的なフォールドに対して負の影響を有さない、またgE-Fc界面に対して負の影響を有さないとコンピュータで検証した(Rosettaを使用してコンピュータによって計算した)。対応するHSV2 gE単一点突然変異(A337G、P319D、P319S、S338D、N241A及びR320D)及び二重点突然変異(N241A/R320D及びN241A/P319D)も設計した。
HSV-2 gEタンパク質(単独又はIgG Fcと複合体形成された)を、MOEソフトウェアを使用してモデル化した、図28を参照のこと。上記で同定された突然変異体(HSV1 gEgI/Fc複合体の結晶構造を使用して)を、この新規モデルを用いてコンピュータで確認した。
MOEを使用してHSV-2 gE/Fc結合界面の徹底分析を実施し、突然変異の新規位置を、gE結合(Fcループ)に関与するとFcにおいて同定された3つのループのうち1つとのその潜在的相互作用のために興味深いものとして同定した。すべてのこれまでに同定された及び新規に同定された位置で徹底的な突然変異スキャニング(MOEの残基スキャンツールを使用して)を実施し、以下の77のさらなる単一点突然変異を、gE安定性に対して影響を有さず、gE/Fc結合界面に対して負の影響を有するとコンピュータで検証した:H245E、H245V、H245R、H245D、H245Q、H245G、H245I、H245K、H245S、H245T、A246W、A248K、A248T、A248G、R314A、R314N、R314D、R314Q、R314E、R314G、R314I、R314L、R314K、R314M、R314F、R314P、R314S、R314T、R314Y、R314V、P317N、P317G、P317I、P317L、P317K、P317F、P317S、P318R、P318D、P318Q、P318I、P318S、P318T、P318Y、P319L、R320A、R320S、R320N、R320Q、R320E、R320G、R320H、R320I、R320L、R320M、R320P、R320T、R320V、F322A、F322N、F322I、F322K、F322P、F322T、S338G、S338E、S338L、S338T、V340A、V340R、V340D、V340Q、V340M、V340F、V340P及びV340W。
少なくとも2つのFcループに影響を及ぼすアミノ酸位置を、二重突然変異体の設計のために選択した:A246/P317、A246/R320、A248/V340、A248/F322、H245/R320、H245/P319、R314/P318、R314/V340、R314/F322、P317/V340、P317/S338、P317/F322、P318/S338及びP319/V340。
以下のさらなる二重点突然変異を、gE安定性に対して影響を有さず、gE/Fc結合界面に対して負の影響を有するとコンピュータで検証した:A246W/P317K;A246W/P317F;A246W/P317S;A246W/R320D;A246W/R320G;A246W/R320T;A248K/V340R;A248K/V340M;A248K/V340W;A248T/V340R;A248T/V340M;A248T/V340W;A248G/V340R;A248G/V340M;A248G/V340W;A248K/F322A;A248K/F322I;A248K/F322P;A248T/F322A;A248T/F322I;A248T/F322P;A248G/F322A;A248G/F322I;A248G/F322P;H245A/R320D;H245A/R320G;H245A/R320T;H245G/R320D;H245G/R320G;H245G/R320T;H245S/R320D;H245S/R320G;H245S/R320T;H245A/P319G;H245A/P319L;H245G/P319G;H245G/P319L;H245S/P319G;H245S/P319L;R314G/P318R;R314G/P318D;R314G/P318I;R314L/P318R;R314L/P318D;R314L/P318I;R314P/P318R;R314P/P318D;R314P/P318I;R314G/F322A;R314G/F322I;R314G/F322P;R314L/F322A;R314L/F322I;R314L/F322P;R314P/F322A;R314P/F322I;R314P/F322P;R314G/V340R;R314G/V340M;R314G/V340W;R314L/V340R;R314L/V340M;R314L/V340W;R314P/V340R;R314P/V340M;R314P/V340W;P317K/V340R;P317K/V340M;P317K/V340W;P317F/V340R;P317F/V340M;P317F/V340W;P317S/V340R;P317S/V340M;P317S/V340W;P317K/S338G;P317K/S338H;P317K/S338L;P317F/S338G;P317F/S338H;P317F/S338L;P317S/S338G;P317S/S338H;P317S/S338L;P318R/S338G;P318R/S338H;P318R/S338L;P318D/S338G;P318D/S338H;P318D/S338L;P318I/S338G;P318I/S338H;P318I/S338L;P319G/V340R;P319G/V340M;P319G/V340W;P319L/V340R;P319L/V340M;及びP319L/V340W。
・HSV2 gEgI突然変異体の組換え発現
クローニング- 表12に記載される遺伝子を、ヒトタンパク質発現のためにコドン最適化し、合成し、EcoRI/NotI制限部位を使用してGENEWIZによるpmaxCloning(商標)ベクター(Lonza、カタログVDC-1040)にクローニングした。pmaxCloning(商標)ベクター骨格は、タンパク質発現のためのサイトメガロウイルス最初期プロモーター(PCMV IE)、増強された遺伝子発現のためのキメライントロン及び大腸菌(E. coli)における増殖のためのpUC複製起点を含有する。細菌プロモーター(P)は、大腸菌におけるカナマイシン耐性遺伝子発現を提供する。多重クローニング部位(MCS)は、CMVプロモーター及びSV40ポリアデニル化シグナル(SV40ポリA)の間に位置する。
クローニング- 表12に記載される遺伝子を、ヒトタンパク質発現のためにコドン最適化し、合成し、EcoRI/NotI制限部位を使用してGENEWIZによるpmaxCloning(商標)ベクター(Lonza、カタログVDC-1040)にクローニングした。pmaxCloning(商標)ベクター骨格は、タンパク質発現のためのサイトメガロウイルス最初期プロモーター(PCMV IE)、増強された遺伝子発現のためのキメライントロン及び大腸菌(E. coli)における増殖のためのpUC複製起点を含有する。細菌プロモーター(P)は、大腸菌におけるカナマイシン耐性遺伝子発現を提供する。多重クローニング部位(MCS)は、CMVプロモーター及びSV40ポリアデニル化シグナル(SV40ポリA)の間に位置する。
各構築物は、表12に示されるような突然変異を有するHSV2 gE外部ドメインをコードする配列(配列番号7)及びIRES配列によって分離されたHSV2 gI外部ドメインをコードする配列(配列番号8)を含んでいた。すべての構築物は、gI外部ドメインのC末端に6×His-タグを含んでいた。
組換えタンパク質発現- 組換えタンパク質発現のためにExpi293F(商標)細胞(ThermoFisher、カタログA14528)を使用した。細胞培養及びトランスフェクションを、製造業者の使用説明書に従って実施した。要約すると、トランスフェクションの前日に、TC20(商標)自動細胞計数機器(Bio-Rad)を使用して細胞密度及び生存力を評価した。細胞を新鮮な予め加温したExpi293(商標)発現培地(ThermoFisher、カタログA1435102)に2×106個細胞/mLの密度で播種し、加湿8% CO2インキュベーター中、37℃/110rpmで培養した。トランスフェクションの当日に、細胞密度及び生存力を評価し(生存力≧95%)、細胞を、新鮮な予め加温したExpi293(商標)発現培地で3×106個細胞/mLの最終密度に希釈した。トランスフェクションエンハンサー及びExpiFectamine 293トランスフェクション試薬を備えるExpiFectamine(商標)293トランスフェクションキット(Thermofisher、カタログA14524)を使用して、トランスフェクションを実施した。概説すると、プラスミドDNA及びトランスフェクション試薬を、OptiMEM培地(Thermofisher、カタログ31985062)で別個に希釈し、RTで5分間インキュベートした(1mLの細胞培養物あたり1μgのプラスミドDNAを使用した)。次いで、両混合物を組み合わせ、RTでさらに20分間インキュベートした。細胞にExpiFectamine(商標)293及びプラスミドDNA複合体溶液を注意深く添加した。細胞を加湿8% CO2インキュベーター中、37℃/110rpmで培養した。トランスフェクション後1日目(トランスフェクション後18～22時間)、ExpiFectamine(商標)293トランスフェクションエンハンサー1/2を添加した。トランスフェクション後4日目、4℃/5000×gで10分間の遠心分離によって細胞を回収した(細胞生存力は、異なる候補について45～75%の間であった)。細胞ペレットを廃棄し、上清にcOmplete(商標)プロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche、カタログ11697498001)を添加した。
SDS-PAGE及びウェスタンブロットによるタンパク質発現の分析- 回収時のタンパク質発現レベルを評価するために、細胞培養上清をSDS-PAGE及びウェスタンブロットによって分析した。上清試料を、NuPAGE(商標)LDS試料緩衝剤(4×)-1M DTT(Invitrogen(商標)、カタログNP0007)と混合し(1:3)、95℃で5分間インキュベートした。10μLの各試料を、4～20%のCriterion(商標)TGX Stain-Free(商標)タンパク質ゲル(Bio-Rad、カタログ567-8094)中にロードした。ゲルをTGS(Trys-グリシン-SDS)ランニング緩衝剤中、250Vで25分間泳動した。ウェスタンブロット分析のために、1/2000希釈のマウスモノクローナル抗ポリヒスチジンペルオキシダーゼ抗体(Sigma、カタログA7058-1VL)を使用し、続いて、1-Step(商標)Ultra TMB-ブロッティング溶液(ThermoFisher、カタログ37574)を用いて顕色させた。SDS-PAGE画像の取得を、Gel Doc(商標)EZ Gelシステム(Bio-Rad)を用い、染色のない技術を使用して実施した。ウェスタンブロット画像は、Amersham(商標)Imager 600(GE Healthcare、Life Sciences)で取得した。図29を参照のこと。目的のバンド(gI、6×His-タグを含有するタンパク質であるので)のウェスタンブロットパターンは、不均一にグリコシル化されたタンパク質のパターンに対応する。gE及びgIのMWは、それぞれ、45.5kDa及び27kDaである。NetNGlyc 1.0によるタンパク質N-グリコシル化予測は、gEについて2つの部位のもの及びgIについて4つの部位のものである。O-グリコシル化については、NetOGlyc 4.0を使用する予測によって、gEについて12の部位及びgIについて20の部位がある。
・HSV2 gEgI突然変異体の精製
培養物を4℃、5000gで10分間遠心分離した。上清を採取し、20mMビシンpH8.3/0.2mM 4-(2-アミノエチル)ベンゼンスルホニルフルオリドヒドロクロリド(Sigma)の添加後に、0.22μMフィルター(Sartorius)を通した。次いで、固定化金属親和性クロマトグラフィー(IMAC)と、それに続くサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によってタンパク質を精製した。
培養物を4℃、5000gで10分間遠心分離した。上清を採取し、20mMビシンpH8.3/0.2mM 4-(2-アミノエチル)ベンゼンスルホニルフルオリドヒドロクロリド(Sigma)の添加後に、0.22μMフィルター(Sartorius)を通した。次いで、固定化金属親和性クロマトグラフィー(IMAC)と、それに続くサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によってタンパク質を精製した。
HTP発現(24ディープウェル形式での2.5mlの培養物)での突然変異体の精製を、Phytips(PhyNexus)によって、又はThompsonフィルタープレートによって実施した。培養上清に0.2mMの4-(2-アミノエチル)ベンゼンスルホニルフルオリドヒドロクロリド(AEBSF)(Sigma)及び20mMビシンpH8.3を添加した。80ulのNickel Sepharose Excel(GE)を有するPhytipsを緩衝剤A(20mMビシン、500mM NaCl、20mMイミダゾール、pH8.3)で平衡化した。次いで、培養上清を吸引し、Phytips中に分配することによって目的のタンパク質をキャプチャした。キャプチャ後、Phytipsを緩衝剤Aを用いて洗浄し、300μLの緩衝剤B(20mMビシン、500mM NaCl 500mMイミダゾール、pH8.3)を用いてタンパク質を溶出した。フィルタープレート精製では、緩衝剤A(20mMビシン、500mM NaCl、20mMイミダゾール、pH8.3)で予め平衡化されたNickel Sepharose Excel(GE)スラリー200ulを、培養上清に添加した。900rpmで90分振盪した後、試料を96 DW Thompsonフィルタープレートに移し、陰圧下で1mlの緩衝剤Aを用いて3回洗浄した。2回の110ulの緩衝剤B(20mMビシン、500mM NaCl 500mMイミダゾール、pH8.3)を用いて遠心分離(800gで10分間)によってタンパク質を溶出し、PD multitrap G-25で脱塩した。タンパク質をSDS-PAGE及びSEC(superdex 200 Increase 5/150(GE)又はBEH200 (Waters))で分析した。
あるいは、小規模発現(100ml培養物)での突然変異体の精製を、緩衝剤A(20mMビシン、500mM NaCl、20mMイミダゾール、pH8.3)で予め平衡化されたNickel Sepharose Excel(GE)3mlが充填された重力流カラムによって実施した。試料をロードした後、15CVの緩衝剤Aを用いて樹脂を洗浄し、5CVの緩衝剤B(20mMビシン、500mM NaCl 500mMイミダゾール、pH8.3)を用いてタンパク質を溶出した。次いで、4℃、3000gで10KDaのカットオフを有するVivaspin 20を使用してタンパク質を濃縮した。濃縮された試料を、0.75ml/分の流速で緩衝剤C(20mMビシン、150mM NaCl、pH8.3)で平衡化されたSuperdex 200 increase 10/300(GE)上にロードした。目的のタンパク質に対応する画分を一緒にプールし、0.22μM濾過し、-80℃で保存した。
大規模発現(1L～2Lの培養物)での野生型及び突然変異体の精製を、AKTA FPLCクロマトグラフィーシステム(GE)を使用して、緩衝剤A(20mMビシン、500mM NaCl、20mMイミダゾール、pH8.3)で予め平衡化されたNickel Sepharose Excel(GE)20mlが充填されたXK16/20カラムを使用して実施した。カラム上に12ml/分の流速で上清をロードした。樹脂を15CVの緩衝剤Aを用いて洗浄し、10CVの緩衝剤B(20mMビシン、500mM NaCl、500mMイミダゾール、pH8.3)を用い、12ml/分の流速を用いてタンパク質を溶出した。次いで、4℃、3000gで10KDaのカットオフを有するVivaspin 20を使用してタンパク質を濃縮した。濃縮された試料を、2.6ml/分の流速で緩衝剤C(20mMビシン、150mM NaCl、pH8.3)で平衡化されたHiLoad 26/600 Superdex 200pg(GE)上にロードした。目的のタンパク質に対応する画分を一緒にプールし、0.22uM濾過し、-80℃で保存した。
RCDCアッセイ(Biorad)によってタンパク質濃度を、SDS PAGEによって純度を決定した。
HSV39を除く、すべてのタンパク質を単分散試料として精製した(図30及び表13)。精製されたタンパク質の凝集及び収量は、突然変異体の間で変動した(表13)。
・HSV-2 gEgI機能的ノックアウト突然変異体の生物物理的特徴付け
材料及び方法
組換え突然変異体gEgIタンパク質- 特に記述されない限り、精製タンパク質は、20mMビシン pH8.3 150mM NaCl中で維持した。
材料及び方法
組換え突然変異体gEgIタンパク質- 特に記述されない限り、精製タンパク質は、20mMビシン pH8.3 150mM NaCl中で維持した。
試薬及び消耗品- ヒトIgGアイソタイプ対照(ThermoFischer Scientific、ref. 12000C)、動態緩衝剤(Pall Fortebio、ref 18-1105)、Prometheus NT.Plex nanoDSFグレード高感度キャピラリーチップ(Nanotemper technologies、ref. PR-AC006)、Octet Red Dip&Read Ni-NTAバイオセンサー(Pall Fortebio、ref. 18-5101)
実験手順
バイオレイヤー干渉法-すべてのIgG結合測定のためにOctet Red機器(Pall-ForteBio、Menlo Park、USA)を使用した。すべての測定は、動態緩衝剤(Kinetic Buffer)(KB)(Pall-ForteBio、Menlo Park、USA)5×中で行い、1000rpmの一定撹拌を常に維持した。突然変異体タンパク質を、KB 5×中で50μg/mlの固定濃度で調製し、Ni-NTAセンサーチップ上に120秒間固定化した。緩衝剤溶液中での60秒間のセンサーチップのインキュベーションによって結合していないリガンドの洗浄を実施した。100μg/ml IgG KB 5×溶液へ300秒間の浸漬した際に、IgGへの結合をモニタリングした。KB 5x緩衝剤中に400秒間浸漬した際に解離をモニタリングした。
バイオレイヤー干渉法-すべてのIgG結合測定のためにOctet Red機器(Pall-ForteBio、Menlo Park、USA)を使用した。すべての測定は、動態緩衝剤(Kinetic Buffer)(KB)(Pall-ForteBio、Menlo Park、USA)5×中で行い、1000rpmの一定撹拌を常に維持した。突然変異体タンパク質を、KB 5×中で50μg/mlの固定濃度で調製し、Ni-NTAセンサーチップ上に120秒間固定化した。緩衝剤溶液中での60秒間のセンサーチップのインキュベーションによって結合していないリガンドの洗浄を実施した。100μg/ml IgG KB 5×溶液へ300秒間の浸漬した際に、IgGへの結合をモニタリングした。KB 5x緩衝剤中に400秒間浸漬した際に解離をモニタリングした。
NanoDSF- タンパク質溶液をガラスキャピラリーにロードし、NanoDSF NT-Plex機器(Nanotemper Technologies、Munich、Germany)内で線形加熱プロセスに付した(1℃/分で20～95℃)。加熱プロセスの間、330nmでの蛍光強度を常に記録した。温度に対してプロットされた蛍光強度の一次微分係数を使用して、融解の温度Tmを決定した。
実験結果
BLI(バイオレイヤー干渉法、Pall ForteBio)を使用して、HEK細胞において小規模で発現された25の突然変異体タンパク質のIgG結合特性をWTタンパク質対照に対して記録した。タンパク質を、Octet Red BLIシステムのNi-NTA官能基付与センサーチップに固定化した。結合していないものを洗浄除去した後、タンパク質をヒトIgG溶液中で決定された期間インキュベートし、結合の動態学を記録した。その後、センサーチップをIgG溶液から取り出し、緩衝剤中に入れて、gEgI構築物からのIgGの解離を記録した(表14、図31を参照のこと)。
BLI(バイオレイヤー干渉法、Pall ForteBio)を使用して、HEK細胞において小規模で発現された25の突然変異体タンパク質のIgG結合特性をWTタンパク質対照に対して記録した。タンパク質を、Octet Red BLIシステムのNi-NTA官能基付与センサーチップに固定化した。結合していないものを洗浄除去した後、タンパク質をヒトIgG溶液中で決定された期間インキュベートし、結合の動態学を記録した。その後、センサーチップをIgG溶液から取り出し、緩衝剤中に入れて、gEgI構築物からのIgGの解離を記録した(表14、図31を参照のこと)。
構築物HSV41、45、49、57、61は、対照と比較してより遅いバインダー及びより迅速なリリーサーに対応するグラフの領域に分離されたので、それらを選択した(図31を参照のこと)。HSV44も、その高いkoff値のために選択した。これら6つの構築物の相対親和性は、対照のものの1%～17%の範囲である。これら6つの構築物をより大規模に発現させ、特徴付けして、その生物物理学的特性を確認した。BLI分析によって、HSV44を除くそれらがすべて有意に変更されたIgG結合挙動を呈示することが示唆された(図32)。次いで、6つの構築物を動的走査蛍光法(固有のTrp蛍光を使用する)によって分析した(表15)。タンパク質の融解の温度を決定し、WT対照と比較した。データによって、突然変異体の融解温度のわずかな低下が示唆された。このシフトされたTmは、WTのものよりもわずかに安定性の低いタンパク質フォールディングを示唆するが、シフトはタンパク質フォールディングの大きな不安定化を示すほど十分には顕著でなかった。したがって、6つの構築物は、前臨床研究においてさらに使用するための十分なフォールディング安定性を有すると考えられる。
・さらなるHSV-2 gEgI突然変異
上記で報告された25のHSV-2 gEgI突然変異体の特徴付け結果に基づいて、本発明者らは、設計され、上記で記載されたさらなる突然変異の中で、以下は、gEのIgG Fcドメインに結合する能力を低減する可能性があると考えた(すべての位置は、配列番号1に示される配列に関するものである):P317K、R320N、R320S、R320E、R320G、R320D/H245S、R320D/H245G、R320D/H245A、P317K/V340M、P317K/V340R、P317K/S338G、P319G/H245A、P319G/H245S、P319G/V340R、P319G/V340M、P318R、H245G、H245S、R320G/H245A、R320G/H245G、R320G/H245S、R320T/H245A、R320T/H245G、R320T/H245S、P318R/R314G及びP318R/S338G。
上記で報告された25のHSV-2 gEgI突然変異体の特徴付け結果に基づいて、本発明者らは、設計され、上記で記載されたさらなる突然変異の中で、以下は、gEのIgG Fcドメインに結合する能力を低減する可能性があると考えた(すべての位置は、配列番号1に示される配列に関するものである):P317K、R320N、R320S、R320E、R320G、R320D/H245S、R320D/H245G、R320D/H245A、P317K/V340M、P317K/V340R、P317K/S338G、P319G/H245A、P319G/H245S、P319G/V340R、P319G/V340M、P318R、H245G、H245S、R320G/H245A、R320G/H245G、R320G/H245S、R320T/H245A、R320T/H245G、R320T/H245S、P318R/R314G及びP318R/S338G。
これらの結果に基づいて、本発明者らはまた、以下のさらなるHSV2 gE突然変異もまた、gEのIgG Fcドメインに結合する能力を低減するのに適する可能性があると考えた(すべての位置は、配列番号1に示される配列に関するものである):
- P317R/P319D、
- P317R/R320D、
- P319D/R320D、
- アミノ酸残基P319の欠失、
- アミノ酸残基R320の欠失、
- アミノ酸残基P319及びR320の欠失、
- アミノ酸残基P319及びR320の欠失並びに点突然変異P317G及びP318G、
- アミノ酸残基P319及びR320の欠失並びに点突然変異P318E、
- アミノ酸残基P319及びR320の欠失並びに点突然変異P318G、
- アミノ酸残基P319及びR320の欠失並びに点突然変異P318K、
- アミノ酸残基P319及びR320の欠失並びに点突然変異P317R及びP318E、
- アミノ酸残基P319及びR320の欠失並びに点突然変異P317R及びP318G、
- アミノ酸残基P319及びR320の欠失並びに点突然変異P317R及びP318K。
- P317R/P319D、
- P317R/R320D、
- P319D/R320D、
- アミノ酸残基P319の欠失、
- アミノ酸残基R320の欠失、
- アミノ酸残基P319及びR320の欠失、
- アミノ酸残基P319及びR320の欠失並びに点突然変異P317G及びP318G、
- アミノ酸残基P319及びR320の欠失並びに点突然変異P318E、
- アミノ酸残基P319及びR320の欠失並びに点突然変異P318G、
- アミノ酸残基P319及びR320の欠失並びに点突然変異P318K、
- アミノ酸残基P319及びR320の欠失並びに点突然変異P317R及びP318E、
- アミノ酸残基P319及びR320の欠失並びに点突然変異P317R及びP318G、
- アミノ酸残基P319及びR320の欠失並びに点突然変異P317R及びP318K。
[実施例4]
HSV2及びHSV1 gEgI突然変異体の発現、精製及び生物物理学的特徴付け
材料及び方法
組換えタンパク質発現- 組換えタンパク質発現のために、Expi293F(商標)細胞(ThermoFisher、カタログA14528)及びExpiCHO-S(商標)(ThermoFisher、カタログA29127)発現システムを使用した。
HSV2及びHSV1 gEgI突然変異体の発現、精製及び生物物理学的特徴付け
材料及び方法
組換えタンパク質発現- 組換えタンパク質発現のために、Expi293F(商標)細胞(ThermoFisher、カタログA14528)及びExpiCHO-S(商標)(ThermoFisher、カタログA29127)発現システムを使用した。
・Expi293F(商標)細胞
細胞培養及びトランスフェクションを、製造業者の使用説明書に従って実施した。小規模発現のためには、ディープウェルにおいて(0.5mlをトランスフェクトし、中規模生産(30ml～1Lの範囲)のために、製造業者の使用説明書によって推奨されるような適応した体積の振盪フラスコ中で培養を実施した。要約すると、Expi293-F(商標)細胞について、トランスフェクションの前日に、TC20(商標)自動細胞計数機器(Bio-Rad)を使用して細胞密度及び生存力を評価した。細胞を新鮮な予め加温したExpi293(商標)発現培地(ThermoFisher、カタログA1435102)に2×106個細胞/mLの密度で播種し、加湿8% CO2インキュベーター中、37℃/110rpmで培養した。トランスフェクションの当日に、細胞密度及び生存力を評価し(生存力≧95%)、細胞を、新鮮な予め加温したExpi293(商標)発現培地で3×106個細胞/mLの最終密度に希釈した。トランスフェクションエンハンサー及びExpiFectamine 293トランスフェクション試薬を含有するExpiFectamine(商標)293トランスフェクションキット(Thermofisher、カタログA14524)を使用して、トランスフェクションを実施した。概説すると、プラスミドDNA及びトランスフェクション試薬を、OptiMEM培地(Thermofisher、カタログ31985062)で別個に希釈し、RTで5分間インキュベートした(1mLの細胞培養物あたり1μgのプラスミドDNAを使用した)。次いで、組み合わせた両混合物を、RTでさらに20分間インキュベートした。細胞にExpiFectamine(商標)293及びプラスミドDNA複合体溶液を注意深く添加した。細胞を加湿8% CO2インキュベーター中、37℃/110rpmで培養した。トランスフェクション後1日目(トランスフェクション後18～22時間)、ExpiFectamine(商標)293トランスフェクションエンハンサー1/2を添加した。トランスフェクション後4日目、4℃/5000×gで10分間の遠心分離によって細胞を回収した(細胞生存力は、異なる候補について45～75%の間であった)。細胞ペレットを廃棄し、上清にcOmplete(商標)プロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche、カタログ11697498001)を添加した。
細胞培養及びトランスフェクションを、製造業者の使用説明書に従って実施した。小規模発現のためには、ディープウェルにおいて(0.5mlをトランスフェクトし、中規模生産(30ml～1Lの範囲)のために、製造業者の使用説明書によって推奨されるような適応した体積の振盪フラスコ中で培養を実施した。要約すると、Expi293-F(商標)細胞について、トランスフェクションの前日に、TC20(商標)自動細胞計数機器(Bio-Rad)を使用して細胞密度及び生存力を評価した。細胞を新鮮な予め加温したExpi293(商標)発現培地(ThermoFisher、カタログA1435102)に2×106個細胞/mLの密度で播種し、加湿8% CO2インキュベーター中、37℃/110rpmで培養した。トランスフェクションの当日に、細胞密度及び生存力を評価し(生存力≧95%)、細胞を、新鮮な予め加温したExpi293(商標)発現培地で3×106個細胞/mLの最終密度に希釈した。トランスフェクションエンハンサー及びExpiFectamine 293トランスフェクション試薬を含有するExpiFectamine(商標)293トランスフェクションキット(Thermofisher、カタログA14524)を使用して、トランスフェクションを実施した。概説すると、プラスミドDNA及びトランスフェクション試薬を、OptiMEM培地(Thermofisher、カタログ31985062)で別個に希釈し、RTで5分間インキュベートした(1mLの細胞培養物あたり1μgのプラスミドDNAを使用した)。次いで、組み合わせた両混合物を、RTでさらに20分間インキュベートした。細胞にExpiFectamine(商標)293及びプラスミドDNA複合体溶液を注意深く添加した。細胞を加湿8% CO2インキュベーター中、37℃/110rpmで培養した。トランスフェクション後1日目(トランスフェクション後18～22時間)、ExpiFectamine(商標)293トランスフェクションエンハンサー1/2を添加した。トランスフェクション後4日目、4℃/5000×gで10分間の遠心分離によって細胞を回収した(細胞生存力は、異なる候補について45～75%の間であった)。細胞ペレットを廃棄し、上清にcOmplete(商標)プロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche、カタログ11697498001)を添加した。
・ExpiCHO-S(商標)細胞
細胞培養及びトランスフェクションを、製造業者の使用説明書に従って実施した。要約すると、ExpiCHO-S(商標)細胞について、トランスフェクションの前日に、TC20(商標)自動細胞計数機器(Bio-Rad)を使用して細胞密度及び生存力を評価した。細胞を新鮮な予め加温したExpiCHO(商標)発現培地(ThermoFisher、カタログA2910001)に3～4×106個細胞/mLの密度で播種し、加湿8% CO2インキュベーター中、37℃/110rpmで培養した。トランスフェクションの当日に、細胞密度及び生存力を評価し(生存力≧95%)、細胞を、新鮮な予め加温したExpiCHO(商標)発現培地で6×106個細胞/mLの最終密度に希釈した。トランスフェクションエンハンサー及びExpiFectamine CHOトランスフェクション試薬を含有するExpiFectamine(商標)CHOトランスフェクションキット(Thermofisher、カタログA29129)を使用して、トランスフェクションを実施した。概説すると、プラスミドDNA及びトランスフェクション試薬を、冷OptiPRO(商標)培地(Thermofisher、カタログ12309-050)で別個に希釈し、RTで5分以内インキュベートした(1mLの細胞培養物あたり0.8μgのプラスミドDNAを使用した)。次いで、組み合わせた両混合物を、RTでさらに1～5分間インキュベートした。細胞にExpiFectamine(商標)CHO及びプラスミドDNA複合体溶液を注意深く添加した。細胞を加湿8% CO2インキュベーター中、37℃/110rpmで培養した。トランスフェクション後1日目(トランスフェクション後18～22時間)、ExpiFectamine(商標)CHOトランスフェクションエンハンサー及びExpiCHO(商標)Feedを添加した。トランスフェクション後6日目、4℃/4000～5000×gで30分間の遠心分離によって細胞を回収した(細胞生存力は、異なる候補について40～80%の間の範囲であった)。細胞ペレットを廃棄し、上清にcOmplete(商標)プロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche、カタログ11697498001)を添加した。
細胞培養及びトランスフェクションを、製造業者の使用説明書に従って実施した。要約すると、ExpiCHO-S(商標)細胞について、トランスフェクションの前日に、TC20(商標)自動細胞計数機器(Bio-Rad)を使用して細胞密度及び生存力を評価した。細胞を新鮮な予め加温したExpiCHO(商標)発現培地(ThermoFisher、カタログA2910001)に3～4×106個細胞/mLの密度で播種し、加湿8% CO2インキュベーター中、37℃/110rpmで培養した。トランスフェクションの当日に、細胞密度及び生存力を評価し(生存力≧95%)、細胞を、新鮮な予め加温したExpiCHO(商標)発現培地で6×106個細胞/mLの最終密度に希釈した。トランスフェクションエンハンサー及びExpiFectamine CHOトランスフェクション試薬を含有するExpiFectamine(商標)CHOトランスフェクションキット(Thermofisher、カタログA29129)を使用して、トランスフェクションを実施した。概説すると、プラスミドDNA及びトランスフェクション試薬を、冷OptiPRO(商標)培地(Thermofisher、カタログ12309-050)で別個に希釈し、RTで5分以内インキュベートした(1mLの細胞培養物あたり0.8μgのプラスミドDNAを使用した)。次いで、組み合わせた両混合物を、RTでさらに1～5分間インキュベートした。細胞にExpiFectamine(商標)CHO及びプラスミドDNA複合体溶液を注意深く添加した。細胞を加湿8% CO2インキュベーター中、37℃/110rpmで培養した。トランスフェクション後1日目(トランスフェクション後18～22時間)、ExpiFectamine(商標)CHOトランスフェクションエンハンサー及びExpiCHO(商標)Feedを添加した。トランスフェクション後6日目、4℃/4000～5000×gで30分間の遠心分離によって細胞を回収した(細胞生存力は、異なる候補について40～80%の間の範囲であった)。細胞ペレットを廃棄し、上清にcOmplete(商標)プロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche、カタログ11697498001)を添加した。
SDS-PAGE及びウェスタンブロットによるタンパク質発現の分析- 回収時のタンパク質発現レベルを評価するために、細胞培養上清をSDS-PAGE及びウェスタンブロットによって分析した。上清試料を、NuPAGE(商標)LDS試料緩衝剤(4×)-1M DTT(Invitrogen(商標)、カタログNP0007)と混合し(1:3)、95℃で5分間インキュベートした。10μLの各試料を、4～20%のCriterion(商標)TGX Stain-Free(商標)タンパク質ゲル(Bio-Rad、カタログ567-8094)中にロードした。ゲルをTGS(Trys-グリシン-SDS)ランニング緩衝剤中、250Vで25分間泳動した。ウェスタンブロット分析のために、1/2000希釈のマウスモノクローナル抗ポリヒスチジンペルオキシダーゼ抗体(Sigma、カタログA7058-1VL)を使用し、続いて、1-Step(商標)Ultra TMB-ブロッティング溶液(ThermoFisher、カタログ37574)を用いて顕色させた。SDS-PAGE画像取得を、Gel Doc(商標)EZ Gelシステム(Bio-Rad)を用い、染色のない技術を使用して実施した。ウェスタンブロット画像は、Amersham(商標)Imager 600(GE Healthcare、Life Sciences)で取得した。目的のバンド(gI、6×His-タグを含有するタンパク質であるので)のウェスタンブロットパターンは、不均一にグリコシル化されたタンパク質のパターンに対応する。gE及びgIのMWは、それぞれ、45.5kDa及び27kDaである。NetNGlyc 1.0によるタンパク質N-グリコシル化予測部位は、gEについて2つの部位のもの及びgIについて4つの部位のものである。O-グリコシル化については、NetOGlyc 4.0を使用する予測によって、gEについて12の部位及びgIについて20の部位がある。
HSV2 gEgI突然変異体の精製- 実施例3を参照のこと
Octetによるバイオレイヤー干渉法- Ni-NTAセンサー(Pall、18-5101番)を、Octet Red 96e(Pall)機器を使用する測定を開始する前のRTでの動態緩衝剤(Pall、18-1105番)1×中での少なくとも30分間のインキュベーションによって予め湿潤させた。すべての試料、標準及び対照を、Greiner black 96-wマイクロプレート(Greiner、655076番)のウェルにおいて動態緩衝剤1×で200μLの最終体積に希釈した。すべての測定は、30℃で実施し、試験試料を含有するマイクロプレートは、一定の1000rpm振盪下で維持した。Octetは、ディスポーザブルチップの形状のバイオセンサーを使用し、Octet Red96eは、8つのチップを並行して読み取る。測定後、センサーを交換した。
ワークフローは以下とした：
ワークフローは以下とした：
分析ソフトウェアデータ分析HTバージョン10.0.3.7を使用して、実験データを再調査し、分析物含量を算出した。ランキング目的のために、応答(会合期間の最後の結合シグナル)のみを使用した。親和性値(KD)を生成したが、選択された候補の低いシグナル強度を考慮すると不正確と思われた。
Nano-DSF- Prometheus NT.Plex機器(NanoTemper Technologies)を使用して、トリプトファン残基に由来する固有の蛍光を使用することによって試料の融解プロファイルを決定した。試験キャピラリーに10μLの試料を充填し、試料ホルダー上に置いた。25～95℃への1℃/分の温度勾配を適用し、330及び350nmで固有のタンパク質蛍光を記録した。350nmでは散乱光も検出される。測定の完了後、実験シグナルの一次微分係数の算出によってTm(融解の温度)及びTon(融解転移の開始)を自動的に決定した。この読み出しはDSFと最良に相関していたということが観察されたので、本実験では算出のために330nmシグナルのみを使用した。
DSF(動的走査蛍光法)- DSFは、方法論が外因性染料Sypro Orangeを使用する点を除いてnanoDSFと同様である。タンパク質試料を加熱すると、染料、最初に埋められていた内側の疎水性パッチが溶媒に対して露出するようになり、蛍光性になる。
Sypro Orange(DMSO中5000×濃縮、Thermo)をタンパク質試料に添加し(最終濃度2×)、次いで、試料をLightCycler 480II(Roche)機器において温度勾配(周囲(ambiant)～95℃、1分あたり1℃)に付した。加熱の間、蛍光(励起498nm、発光630nm)を常に記録した。蛍光シグナルの二次微分係数によって、Tmの決定が可能となった。
DLS(動的光散乱)- DLSは、タンパク質溶液から散乱された光のゆらぎの時間的パターンを使用して、試料中のタンパク質粒子のサイズの分布を推測する。この技術は、凝集体の存在に対して極めて感度が高く、ストレス試験の間の凝集体の形成を評価するために使用できる。
Wyatt DynaPro II機器でタンパク質溶液を分析し、ソフトウェアDynamics(Wyatt)を使用することによって生データを粒径分布に変換した。
UPLC-SEC-UV- UPLC-SEC-UV測定のために使用したクロマトグラフィーシステムは、クォータナリポンプ及びDAD検出器を備えたAgilent 1290 Infinity II機器とした。タンパク質を50mmプレカラムを備えた分析用SECカラム(Waters BEH200、150×4.6mm)上に注入した。30℃の温度で0.3ml/分の20mMビシンpH8.3 150mM NaCl移動相を用いてカラムを溶出した(アイソクラティックモード)。実行タイプは10分とした。溶出プロファイルは、280nmでのUVの一定記録で確立した。
結果
・HSV2 gEgI突然変異体
175のgEgI突然変異体HSV2 gEgI構築物を生成し、精製した。各構築物は、表16で示されるような突然変異を有するHSV2 gE外部ドメインをコードする配列(配列番号7)及びIRES配列によって分離されたHSV2 gI外部ドメインをコードする配列(配列番号8)を含んでいた。すべての構築物は、gI外部ドメインのC末端に6×Hisタグを含んでいた。
・HSV2 gEgI突然変異体
175のgEgI突然変異体HSV2 gEgI構築物を生成し、精製した。各構築物は、表16で示されるような突然変異を有するHSV2 gE外部ドメインをコードする配列(配列番号7)及びIRES配列によって分離されたHSV2 gI外部ドメインをコードする配列(配列番号8)を含んでいた。すべての構築物は、gI外部ドメインのC末端に6×Hisタグを含んでいた。
精製後、すべての試料をOctetによって分析して、ヒトIgG結合の残存する生物活性を記録した。実施例3において試験された突然変異のないgEgI(HRV4)及びP317R突然変異体(HSV45)を対照として使用した。精製後のBLIデータ並びにタンパク質濃度を表16に提示する。
次いで、構築物のうち48を、nanoDSFによって分析して鋳型タンパク質HSV2 WTで観察されたタンパク質シグネチャーの保存を評価した。構築物のほとんどは67℃付近のTm値を示し、65℃未満のTmを有する少数の構築物のみはコンホメーションの変化を示唆した。注目すべきことに、試料セットに挿入された陽性対照はすべて、極めて再現性のあるTmを提示した(表17)。
高収量及び低ヒトIgG結合及び/又は高Tmを提示するものの中で10の構築物を、大容量で生成した。構築物の構造品質を評価するために、構築物をさらなる特徴付けに付した。Octetを使用して、gEgIヘテロ二量体及びgE Fc結合ドメインに結合するコンホメーションモノクローナル抗体の結合を探索した。DLSをストレス試験と組み合わせて使用して、リードのコロイド安定性を評価した。データセットの組み合わされた観点は、表18に提示されている。
さらなるHSV2 gEgI突然変異体を生成し、精製した。各構築物は、表19で示されるような突然変異を有するHSV2 gE外部ドメインをコードする配列(配列番号7)及びIRES配列によって分離されたHSV2 gI外部ドメインをコードする配列(配列番号8)を含んでいた。すべての構築物は、gI外部ドメインのC末端に6×Hisタグを含んでいた。
ハイスループット小規模発現後、2つの異なるモダリティを使用してタンパク質を精製し、いずれかのタンパク質を、Phy-tips(IMAC機能性を有する小体積の樹脂を含むピペットチップ)によって、又は同様のIMAC性能を有するフィルタープレートを使用して抽出した。
タンパク質含量を決定するために、UPLC-SEC-UVによってタンパク質を分析した。具体的には、タンパク質を凝集体とモノマーに分離した。タンパク質含量は、モノマーの観察されたピーク面積をベースとした。算出されたタンパク質含量がPhy Tipsと比較して平均で4倍及び5倍の間高かったので、Phy-tipsの代わりにフィルタープレートを使用することによって、発現上清からのより多くのタンパク質の抽出が可能となることが観察された(図33)。したがって、すべての特徴付け測定は、フィルタープレート又はPhytipsの間で並行していたので、フィルタープレートデータのみを後に考慮した。
次いで、構築物のヒトIgGに結合する能力に対する突然変異の影響を、BLI(Octet)によって評価した。ヒトIgGに対する固定化gEgIタンパク質の相対結合応答を測定した(図34)。
突然変異体候補をさらに評価するために、nanoDSFを実施して、タンパク質フォールディングの安定性を測定した。330nmでの蛍光は、これまでの実験によって、この波長が染料ベースのDSFのような他の方法論と相関していたと示されているので主要な読み出しと考えられた。PN94、PN95及びPN100は、最低のTm値を示し、これは、他のタンパク質に対してより安定性の低いフォールディングを示唆する(図35)。
各構築物について収集された情報(タンパク質含量、BLI応答、nanoDSF)を、表20にまとめた。
・HSV1 gEgI突然変異体
32のHSV1突然変異体gEgI構築物を、HSV2 gEgI構築物について上記で記載されたように生成した。各構築物は、表21に示されるような突然変異を有するHSV1 gE外部ドメインをコードする配列(配列番号9)及びIRES配列によって分離されたHSV2 gI外部ドメインをコードする配列(配列番号10)を含んでいた。すべての構築物は、gI外部ドメインのC末端に6×Hisタグを含んでいた。
32のHSV1突然変異体gEgI構築物を、HSV2 gEgI構築物について上記で記載されたように生成した。各構築物は、表21に示されるような突然変異を有するHSV1 gE外部ドメインをコードする配列(配列番号9)及びIRES配列によって分離されたHSV2 gI外部ドメインをコードする配列(配列番号10)を含んでいた。すべての構築物は、gI外部ドメインのC末端に6×Hisタグを含んでいた。
精製スキームの最後に、比色法によってタンパク質濃度を決定した(図36を参照のこと)。
精製後、すべての試料をOctetによって分析して、ヒトIgG結合の残存生物活性を記録した。次いで、DSFを使用して、突然変異体HSV1 gEgI構築物のフォールディングの品質をさらに探索した(図37)。
[実施例5]
HSV gEgIヘテロ二量体の発現のためのバイシストロニックSAMベクター
材料及び方法
・SAM特徴付け
RNAゲル電気泳動
RNA試料を1%アガロースゲルにおいて分析した。RNA試料を以下の通りに調製した:100～500ngのRNAを、3uLのローディング緩衝剤(50mM EDTA pH8、30w/v%スクロース、0.05%ブロモフェノールブルー)及び水と混合して、10uLの最終体積とした。試料を50℃で20分間変性させた。アガロースゲルを、Northern Max Glyゲルランニング緩衝剤(Invitrogen(商標))中、130Vで45分間泳動した。
HSV gEgIヘテロ二量体の発現のためのバイシストロニックSAMベクター
材料及び方法
・SAM特徴付け
RNAゲル電気泳動
RNA試料を1%アガロースゲルにおいて分析した。RNA試料を以下の通りに調製した:100～500ngのRNAを、3uLのローディング緩衝剤(50mM EDTA pH8、30w/v%スクロース、0.05%ブロモフェノールブルー)及び水と混合して、10uLの最終体積とした。試料を50℃で20分間変性させた。アガロースゲルを、Northern Max Glyゲルランニング緩衝剤(Invitrogen(商標))中、130Vで45分間泳動した。
タンパク質発現分析:ウェスタンブロット
0日目に、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞を、T225フラスコ中、増殖培地(DMEM高グルコース(Gibco(商標))、1% L-グルタミン、1% Pen-Strep(Corning(登録商標))、5% FBS(Gibco(商標)))中に1×107個で播種した。トリプシン処理のために、培地を除去し、細胞を5mLのPBSを用いて洗浄した。PBS洗浄液を除去し、5mLの予熱トリプシン(Gibco(商標))を添加し、プレート中に徹底的に広げた。トリプシンを除去し、プレートを37℃で1～2分間維持した。次いで、細胞を10mLの増殖培地に再懸濁した。細胞を計数し、新規フラスコ中に必要な濃度で播種した。次いで、細胞を37℃、5% CO2で約20時間インキュベートした。
0日目に、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞を、T225フラスコ中、増殖培地(DMEM高グルコース(Gibco(商標))、1% L-グルタミン、1% Pen-Strep(Corning(登録商標))、5% FBS(Gibco(商標)))中に1×107個で播種した。トリプシン処理のために、培地を除去し、細胞を5mLのPBSを用いて洗浄した。PBS洗浄液を除去し、5mLの予熱トリプシン(Gibco(商標))を添加し、プレート中に徹底的に広げた。トリプシンを除去し、プレートを37℃で1～2分間維持した。次いで、細胞を10mLの増殖培地に再懸濁した。細胞を計数し、新規フラスコ中に必要な濃度で播種した。次いで、細胞を37℃、5% CO2で約20時間インキュベートした。
1日目に、6ウェルプレートの各ウェルに(エレクトロポレーションあたり1つのウェル)2mLの増殖培地(DMEM高グルコース、1% L-グルタミン、1% Pen-Strep、1% FBS)を添加することによって、プレートを準備した。プレートを37℃のインキュベーター中で保温した。エレクトロポレーション装置(BIO-RAD Gene Pulser Xcell)を120V、25msパルス、0.0パルス間隔、2mmキュベットのために1パルスを送達するように準備した。キュベットにラベルを付け、氷上で維持した。
増殖期の細胞をBHK増殖培地中に回収し、細胞計数機器を使用して計数した。上記と同じトリプシン処理プロトコールに従って細胞をトリプシン処理した。次いで、細胞を462×gで3分間遠心分離した。培地を吸引し、細胞を20mLの冷Opti-MEM培地(Gibco(商標))を用いて1回洗浄した。細胞を462×gで5分間再度遠心分離した。培地を吸引し、細胞をエレクトロポレーションあたり1×106個細胞あたり0.25mLになるようにOpti-MEM培地に再懸濁した。標準及び陰性対照となるエレクトロポレーションも準備した。
各試料について、0.1又は2μgのRNAを250μLの細胞と混合し、混合物を4～5回穏やかにピペッティングした。細胞及びRNA混合物を2mmキュベットに移し、上記のパラメーターを使用してエレクトロポレーションの1回のパルスに付した。細胞を室温で10分間静置させた。1つのキュベットからの細胞を予め加温した6ウェルプレートの1つのウェルに添加し、プレートを前後に、次いで、左右に45°の角度で傾けて、細胞を均一に分配した。2日目に(エレクトロポレーション後17時間)、細胞培養上清を採取し、10倍濃縮し、タンパク質を脱グリコシル化する(deglycosilate)ために製造業者の使用説明書に従ってPNGase(NEB)を処置した。上清を異なる濃度でウェスタンブロットによって分析した。一次ウサギ抗gE及び抗gI及びマウス抗HA抗体を1:1000希釈物で、マウス/ウサギ抗アクチンを1:5000で使用した。二次Licor抗体を1:15000で使用した。
結果
WO2005/113782に記載されたようなSAMベクターVEEV TC-83を、gEgIヘテロ二量体をクローニングするためのバックグラウンド構築物として使用した。このSAMベクターは、5'から3'に非コード配列、ウイルス非構造タンパク質1～4(nsP1～4)をコードする配列、サブゲノムプロモーター、gE外部ドメイン、調節エレメント及びgI外部ドメインをコードする構築物を含む挿入部位、非コード配列並びにポリ(A)テールを含む。空のSAMをコードするDNAは、配列番号130及び図39に示され、対応する空のSAMは、配列番号134に示されている。挿入部位は、ヌクレオチド7561の直後である。gE及びgIをコードする配列をコドン最適化した。P317R突然変異を有するgE外部ドメインをコードする例示的コドン最適化DNA配列は、配列番号128に示されている。gI外部ドメインをコードする例示的コドン最適化DNA配列は、配列番号129に示されている。
WO2005/113782に記載されたようなSAMベクターVEEV TC-83を、gEgIヘテロ二量体をクローニングするためのバックグラウンド構築物として使用した。このSAMベクターは、5'から3'に非コード配列、ウイルス非構造タンパク質1～4(nsP1～4)をコードする配列、サブゲノムプロモーター、gE外部ドメイン、調節エレメント及びgI外部ドメインをコードする構築物を含む挿入部位、非コード配列並びにポリ(A)テールを含む。空のSAMをコードするDNAは、配列番号130及び図39に示され、対応する空のSAMは、配列番号134に示されている。挿入部位は、ヌクレオチド7561の直後である。gE及びgIをコードする配列をコドン最適化した。P317R突然変異を有するgE外部ドメインをコードする例示的コドン最適化DNA配列は、配列番号128に示されている。gI外部ドメインをコードする例示的コドン最適化DNA配列は、配列番号129に示されている。
・調節エレメントの選択
gEgI(gE wt及びgE_P317R突然変異体)ヘテロ二量体を発現させるためにバイシストロニックSAMベクターを調製した。各ベクターについて、gE発現は、単一26Sサブゲノム(sugenomic)プロモーター(配列番号126)によって駆動され、4つの調節エレメントを、gI発現について試験した:配列内リボソーム進入部位:IRES EV71(配列番号127)、2つの2A「自己切断性」ペプチド配列:GSG-P2A(配列番号124)及びF2A(配列番号125)及び第2の26Sサブゲノムプロモーター(配列番号126)(図38A)。さらに、gE及びgIタンパク質のC末端にHA-タグを有するベクターを生成した(図38B)。
gEgI(gE wt及びgE_P317R突然変異体)ヘテロ二量体を発現させるためにバイシストロニックSAMベクターを調製した。各ベクターについて、gE発現は、単一26Sサブゲノム(sugenomic)プロモーター(配列番号126)によって駆動され、4つの調節エレメントを、gI発現について試験した:配列内リボソーム進入部位:IRES EV71(配列番号127)、2つの2A「自己切断性」ペプチド配列:GSG-P2A(配列番号124)及びF2A(配列番号125)及び第2の26Sサブゲノムプロモーター(配列番号126)(図38A)。さらに、gE及びgIタンパク質のC末端にHA-タグを有するベクターを生成した(図38B)。
gE及びgI発現レベルに対する調節エレメントの影響
PNGaseを用いて処置されたBHK細胞上清からのgE及びgI発現レベルを、近赤外ウェスタンブロット検出を使用して可視化し(図40左)、それから強度シグナルを抽出した(図40右)。さらに、IRESは他の調節エレメントを上回り、より多くのgE及びgIタンパク質を生成した。wtとP317R突然変異体gEgIの間で発現レベルにおいて有意差は観察されなかった。
PNGaseを用いて処置されたBHK細胞上清からのgE及びgI発現レベルを、近赤外ウェスタンブロット検出を使用して可視化し(図40左)、それから強度シグナルを抽出した(図40右)。さらに、IRESは他の調節エレメントを上回り、より多くのgE及びgIタンパク質を生成した。wtとP317R突然変異体gEgIの間で発現レベルにおいて有意差は観察されなかった。
異なる調節エレメント下でのgE:gI化学量論決定
gE:gI化学量論を評価するために、gE及びgIタンパク質のC末端にHA-タグを有するベクターを生成した。それらは、単一抗体(抗HA)を用いて同一ゲルでgE及びgIの検出を可能にし、ひいては、相対定量化を可能にするという利点を提示する。HAタグを有する構築物は、タグのないIRES構築物(示されていないデータ)と同様のin vitro効力を提示した(J2陽性細胞%)。近赤外ウェスタンブロット検出を使用して、相対タンパク質発現及び化学量論測定を定量化した。WB条件は、HAタグのない構築物のものと同一であった(図41A)。gE-HA及びgI-HAバンドのシグナル(図41B)を抽出し、強度値をgE-HA強度レベルによって正規化した(図41C)。IRESは他の調節エレメントを上回り、同等量のSAMベクターのためにトランスフェクトされた細胞の上清においてより多くのgIを生成し、他の調節エレメントの1:0.5と比較して1:1のgE:gI比に達した。
gE:gI化学量論を評価するために、gE及びgIタンパク質のC末端にHA-タグを有するベクターを生成した。それらは、単一抗体(抗HA)を用いて同一ゲルでgE及びgIの検出を可能にし、ひいては、相対定量化を可能にするという利点を提示する。HAタグを有する構築物は、タグのないIRES構築物(示されていないデータ)と同様のin vitro効力を提示した(J2陽性細胞%)。近赤外ウェスタンブロット検出を使用して、相対タンパク質発現及び化学量論測定を定量化した。WB条件は、HAタグのない構築物のものと同一であった(図41A)。gE-HA及びgI-HAバンドのシグナル(図41B)を抽出し、強度値をgE-HA強度レベルによって正規化した(図41C)。IRESは他の調節エレメントを上回り、同等量のSAMベクターのためにトランスフェクトされた細胞の上清においてより多くのgIを生成し、他の調節エレメントの1:0.5と比較して1:1のgE:gI比に達した。
・突然変異体gEgI SAMベクター
HSV2 gE wt外部ドメイン(配列番号7)又は突然変異体gE外部ドメイン(ectodmain)及びHSV2 gI wt外部ドメイン(配列番号8)をコードするバイシストロニックSAMベクター並びにHSV1 gE wt外部ドメイン(配列番号9)又は突然変異体gE外部ドメイン及びHSV1 gI wt外部ドメイン(配列番号10)をコードするバイシストロニックSAMベクターを上記のように調製した。すべてのベクターについて、gE発現は、S26サブゲノムプロモーター(配列番号126)によって駆動され、gI発現は、配列内リボソーム進入部位(IRES EV71、配列番号127)によって駆動された。各ベクター中に存在するHSV2 gE突然変異を、表22に提示する。HSV2 gE突然変異は、配列番号7に対してである。HSV1 gE突然変異は、配列番号9に対してである。
HSV2 gE wt外部ドメイン(配列番号7)又は突然変異体gE外部ドメイン(ectodmain)及びHSV2 gI wt外部ドメイン(配列番号8)をコードするバイシストロニックSAMベクター並びにHSV1 gE wt外部ドメイン(配列番号9)又は突然変異体gE外部ドメイン及びHSV1 gI wt外部ドメイン(配列番号10)をコードするバイシストロニックSAMベクターを上記のように調製した。すべてのベクターについて、gE発現は、S26サブゲノムプロモーター(配列番号126)によって駆動され、gI発現は、配列内リボソーム進入部位(IRES EV71、配列番号127)によって駆動された。各ベクター中に存在するHSV2 gE突然変異を、表22に提示する。HSV2 gE突然変異は、配列番号7に対してである。HSV1 gE突然変異は、配列番号9に対してである。
RNAパターン均一性評価
RNAパターン均一性を研究するために、RNA試料を1%アガロースゲルで分析した。RNA試料は以下の通りに調製した:100～500ngのRNAを、3μLのローディング緩衝剤(50mM EDTA pH8、30w/v%スクロース、0.05%ブロモフェノールブルー)及び水と混合して、10μLの最終体積とした。試料を50℃で20分間変性させた。アガロースゲルを、Northern Max Glyゲルランニング緩衝剤(Invitrogen(商標))中、130Vで45分間泳動した。
RNAパターン均一性を研究するために、RNA試料を1%アガロースゲルで分析した。RNA試料は以下の通りに調製した:100～500ngのRNAを、3μLのローディング緩衝剤(50mM EDTA pH8、30w/v%スクロース、0.05%ブロモフェノールブルー)及び水と混合して、10μLの最終体積とした。試料を50℃で20分間変性させた。アガロースゲルを、Northern Max Glyゲルランニング緩衝剤(Invitrogen(商標))中、130Vで45分間泳動した。
結果:すべてのHSV SAM候補(HSV2及びHSV1)は、アガロースゲル分析で同様の均一性パターンを提示した(図42)。主なバンドは、大きな分解を伴わずにすべての構築物について観察された。
ウェスタンブロットによるタンパク質発現評価
異なるHSV SAM構築物から所与の抗原を発現する細胞の能力を、以下のとおりに評価した。0日目に、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞を、T225フラスコ中、増殖培地(DMEM高グルコース(Gibco(商標))、1% L-グルタミン、1% Pen-Strep(Corning(登録商標))、5% FBS(Gibco(商標)))中に1×107個で播種した。トリプシン処理のために、培地を除去し、細胞を5mLのPBSを用いて洗浄した。PBS洗浄液を除去し、5mLの予熱トリプシン(Gibco(商標))を添加し、プレート中に徹底的に広げた。トリプシンを除去し、プレートを37℃で1～2分間維持した。次いで、細胞を10mLの増殖培地に再懸濁した。細胞を計数し、新規フラスコ中に必要な濃度で播種した。次いで、細胞を37℃、5% CO2で約20時間インキュベートした。
異なるHSV SAM構築物から所与の抗原を発現する細胞の能力を、以下のとおりに評価した。0日目に、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞を、T225フラスコ中、増殖培地(DMEM高グルコース(Gibco(商標))、1% L-グルタミン、1% Pen-Strep(Corning(登録商標))、5% FBS(Gibco(商標)))中に1×107個で播種した。トリプシン処理のために、培地を除去し、細胞を5mLのPBSを用いて洗浄した。PBS洗浄液を除去し、5mLの予熱トリプシン(Gibco(商標))を添加し、プレート中に徹底的に広げた。トリプシンを除去し、プレートを37℃で1～2分間維持した。次いで、細胞を10mLの増殖培地に再懸濁した。細胞を計数し、新規フラスコ中に必要な濃度で播種した。次いで、細胞を37℃、5% CO2で約20時間インキュベートした。
1日目に、6ウェルプレートの各ウェルに(エレクトロポレーションあたり1つのウェル)2mLの増殖培地(DMEM高グルコース、1% L-グルタミン、1% Pen-Strep、1% FBS)を添加することによって、プレートを準備した。プレートを37℃のインキュベーター中で保温した。エレクトロポレーション装置を120V、25msパルス、0.0パルス間隔、2mmキュベットのために1パルスを送達するように準備した。キュベットにラベルを付け、氷上で維持した。増殖期の細胞をBHK増殖培地中に回収し、細胞計数機器を使用して計数した。上記のような同一のトリプシン処理プロトコールに従って細胞をトリプシン処理した。次いで、細胞を462×gで3分間遠心分離した。培地を吸引し、細胞を20mLの冷Opti-MEM培地(Gibco(商標))を用いて1回洗浄した。細胞を462×gで5分間再度遠心分離した。培地を吸引し、細胞をエレクトロポレーションあたり1×106個細胞あたり0.25mLになるようにOpti-MEM培地に再懸濁した。標準及び陰性対照エレクトロポレーションも準備した。
各試料について、2μgのRNAを250μLの細胞と混合し、混合物を4～5回穏やかにピペッティングした。細胞及びRNA混合物を2mmキュベットに移し、上記のパラメーターを使用してエレクトロポレーションの1回のパルスに付した。細胞を室温で10分間静置させた。1つのキュベットからの細胞を予め加温した6ウェルプレートの1つのウェルに添加し、プレートを前後に、次いで、左右に45°の角度で傾けて、細胞を均一に分配した。2日目に(エレクトロポレーション後17時間)、細胞培養上清を採取し、異なる濃度でウェスタンブロットによって分析した。使用した一次抗体は、ウサギ抗gE及び抗gIポリクローナル血清であった(社内で生成された)。
結果:WB分析の際にすべてのHSV SAM候補(HSV2及びHSV1)についてgE及びgI発現が検出された(図43)。候補にわたって同様の発現レベルが観察され、タンパク質分解は検出されなかった。WB検出のために使用されたウサギポリクローナル血清は、HSV2組換えgE及びgIタンパク質に対して産生されたということは留意されるべきである。したがって、HSV1について観察されたより低い反応性(図43C、抗gI)は、この事実によって説明され得る。
脂質ナノ粒子(LNP)SAM候補特徴付け
SAMを用いるLNPの調製は、脂質(カチオン性脂質、両イオン性脂質、コレステロール及びPEG-脂質コンジュゲート)がエタノール性溶液に溶解され、SAMが、水性緩衝溶液中にある微小流体混合によってLNPを調製する確立された方法に従った。エタノール性及び水性溶液を、微小流体混合チャンバーを使用して迅速に一緒に混合した。SAMによって捕捉された脂質ナノ粒子は、混合物中で過飽和脂質の核形成によって自発的に形成される。脂質の縮合及び沈殿によってSAMが捕捉され、脂質ナノ粒子が形成される。LNPの短期間の成熟後、次いで、SAM-LNPの緩衝剤を保存緩衝剤に交換した。SAM-LNP溶液を、サイズ、脂質含量、RNA捕捉及びin vitro効力について特徴付けした。
SAMを用いるLNPの調製は、脂質(カチオン性脂質、両イオン性脂質、コレステロール及びPEG-脂質コンジュゲート)がエタノール性溶液に溶解され、SAMが、水性緩衝溶液中にある微小流体混合によってLNPを調製する確立された方法に従った。エタノール性及び水性溶液を、微小流体混合チャンバーを使用して迅速に一緒に混合した。SAMによって捕捉された脂質ナノ粒子は、混合物中で過飽和脂質の核形成によって自発的に形成される。脂質の縮合及び沈殿によってSAMが捕捉され、脂質ナノ粒子が形成される。LNPの短期間の成熟後、次いで、SAM-LNPの緩衝剤を保存緩衝剤に交換した。SAM-LNP溶液を、サイズ、脂質含量、RNA捕捉及びin vitro効力について特徴付けした。
サイズ及び多分散- 動的光散乱(DLS)を使用して、SAM LNP粒子サイズ及びサイズの分布(多分散指数)を測定した。SAM LNP材料を、LNP保持緩衝剤で希釈し、低体積キュベットに添加した。試料を、Malvern Zetasizer光散乱機器を製造業者の使用説明書に従って使用して測定した。粒子サイズは、多分散指数(PDI)を有するZ平均として報告された。
SAM LNP調製物のin vitro効力- BHK細胞を適当な密度で培養し、3倍希釈を使用して培養培地中のSAM LNPを用いて処置し、8点用量曲線を作成した。LNPを用いる細胞の処置を一晩(18時間)進行させた。翌日、細胞を染色し(社内で生成されたウサギ抗gE及び/又は抗gIポリクローナル血清)、ハイコンテントイメージャーを用いて分析し、用量フィッティング曲線への非線形回帰によってEC50値を決定した。効力を、96ウェルプレートのウェルにおいて培養細胞の50%をトランスフェクトするのに必要なSAM LNPの用量(EC50)として決定した。
RNA捕捉- LNP内にカプセル封入されたSAMのパーセンテージをQuant-iT Ribogreen RNA試薬キットによって決定した。RiboGreen染料(低蛍光性)は、RNAと選択的に相互作用し、その際、その蛍光が増大する。したがって、RiboGreen染料を用いて処置された試料の蛍光を、RiboGreenを用いて処置された標準RNAの蛍光と相関させることによってRNA濃度を決定できる(これは製造業者の使用説明書に従って行われた)。Triton X-100の存在下及び不在下でSAM濃度を比較することによってRNAカプセル封入を決定した。Triton X-100は、LNPを破壊し、SAMを放出する。Triton X-100の不在下では、染料は、溶媒が到達可能なRNAとのみ相互作用し、これには、LNPの外側のSAM、LNP表面に結合されたSAM又は膜の不完全によって染料に到達可能なLNPの表層に位置するSAMが含まれ得る。Triton Xを含まない試料から得られたRNA濃度は、「カプセル封入されていない」と解釈された。Triton X処置された試料から測定されたRNA濃度(すなわち、LNPが破壊され、総SAMが放出された場合)は、全RNA量(LNPの外側及び内側)を表す。
結果:各LNPのサイズを、散乱の強度に基づく平均流体力学直径を提供した動的光散乱(DLS)及びLNPサイズの不均一性の尺度である多分散指数によって決定した。各LNP調製物は、120nm付近のサイズを有しており、低PDI値を有し、これは、各調製物のサイズ分布が狭く分散していることを示す。各LNP調製物はまた、80%よりも多いRNA捕捉を有していた。in vitro効力を決定した。このアッセイによって、細胞培養物におけるgE及び/又はgI発現が決定された(表は、gIのEC50値としてのデータを表す)。材料の効力は、96ウェルプレートの1つのウェルにおいて培養された細胞の50%をトランスフェクトするのに必要な用量として報告された。すべてのHSV SAM LNP候補が、強力なEC50応答を提供した(表23)。
[実施例6]
CB6F1マウスにおけるAS01アジュバント化組換えgEgIタンパク質の、及びLNP製剤化SAM gEgI構築物の免疫原性評価
材料及び方法
・被験製品
AS01アジュバント化HSV1及びHSV2 gEgI(実施例6.1、6.2及び6.4)
HSV1及びHSV2 gEgIを、実施例3及び4に記載されたようにExpiHEK293F(商標)又はExpiCHO(商標)発現システムを使用することによって生成した。
CB6F1マウスにおけるAS01アジュバント化組換えgEgIタンパク質の、及びLNP製剤化SAM gEgI構築物の免疫原性評価
材料及び方法
・被験製品
AS01アジュバント化HSV1及びHSV2 gEgI(実施例6.1、6.2及び6.4)
HSV1及びHSV2 gEgIを、実施例3及び4に記載されたようにExpiHEK293F(商標)又はExpiCHO(商標)発現システムを使用することによって生成した。
AS01は、QS-21(キラヤ(Quillaja saponaria)の樹皮から精製されたトリテルペングリコシド)及びMPL(3-DモノホスホリルリピドA)を含有するリポソームベースのアジュバントシステム(AS)であり、これらの免疫増強剤の媒体としてリポソーム及び等張剤としてNaClを含む緩衝剤を有する。AS01bアジュバントシステムの単回ヒト用量(0.5mL)は、50μgのQS-21及び50μgのMPLを含有する。マウスに注射される体積は、用量あたり5μg QS-21及び5μg MPLに対応するヒト用量の1/10である。
LNP製剤化SAM HSV1及びHSV2 gEgI(実施例6.3、6.5及び6.6)
LNP製剤化SAM HSV1及びHSV2 gEgIベクターを、実施例5に記載されるように調製した。
LNP製剤化SAM HSV1及びHSV2 gEgIベクターを、実施例5に記載されるように調製した。
・動物モデル
これらの研究では、CB6F1マウス(C57Bl/6とBalb/Cマウスのハイブリッド)を使用した。CB6F1マウスは、アジュバント化タンパク質及びウイルスベクターを含む種々のタイプの免疫原を用いるワクチン接種後に、強力なCD4+/CD8+T細胞及び体液性免疫応答を生成することがわかっている。それにもかかわらず、ヒトにおける予測される応答と比較して、これらのマウスにおいて生成したワクチン誘導性免疫応答のプロファイルは、TLR発現、HLAバックグラウンド及び抗原提示に関する何らかの相違によって影響を受け得る。しかし、CD4+/CD8+T免疫応答を誘導する能力は、これらのマウスとヒトの間で同等の傾向を示した。
これらの研究では、CB6F1マウス(C57Bl/6とBalb/Cマウスのハイブリッド)を使用した。CB6F1マウスは、アジュバント化タンパク質及びウイルスベクターを含む種々のタイプの免疫原を用いるワクチン接種後に、強力なCD4+/CD8+T細胞及び体液性免疫応答を生成することがわかっている。それにもかかわらず、ヒトにおける予測される応答と比較して、これらのマウスにおいて生成したワクチン誘導性免疫応答のプロファイルは、TLR発現、HLAバックグラウンド及び抗原提示に関する何らかの相違によって影響を受け得る。しかし、CD4+/CD8+T免疫応答を誘導する能力は、これらのマウスとヒトの間で同等の傾向を示した。
・免疫学的読み出し情報
ELISAによる総抗HSV1又は抗HSV2 gE及びgI特異的IgG抗体の検出
総抗HSV2 gE又はgI特異的IgG抗体(実施例6.1、6.2及び6.3)の定量化を、間接ELISAを使用して実施した。組換えHSV-2 gE(約51kDa)又はgIタンパク質(約46kDa)をコーティング抗原として使用した。これらのタンパク質は、ExpiHEK293F(商標)発現システムを使用して産生した。
ELISAによる総抗HSV1又は抗HSV2 gE及びgI特異的IgG抗体の検出
総抗HSV2 gE又はgI特異的IgG抗体(実施例6.1、6.2及び6.3)の定量化を、間接ELISAを使用して実施した。組換えHSV-2 gE(約51kDa)又はgIタンパク質(約46kDa)をコーティング抗原として使用した。これらのタンパク質は、ExpiHEK293F(商標)発現システムを使用して産生した。
総抗HSV-1gEgI特異的IgG抗体(実施例6.4及び6.5)の定量化を、間接ELISAを使用して実施した。HSV-1からの組換えgEgIヘテロ二量体タンパク質をコーティング抗原として使用した。このタンパク質は、ExpiCHO(商標)発現システムを使用して産生した。
ポリスチレン96ウェルELISAプレート(Nunc F96 Maxisorpカタログ439454)を、100μL/ウェルの、炭酸/重炭酸50mM pH9.5緩衝剤(internal)で2μg/mLの濃度に希釈した抗原(HSV2 gE又はHSV1gEgI)及び1μg/mL(HSV2 gI)を用いてコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、コーティング溶液を除去し、プレートを、200μL/ウェルの、PBS(ブロッキング緩衝剤)(ref 232100、Becton Dickinson、USA)で希釈したDifkomilk 10%を用いて37℃で1時間ブロッキングした。インキュベーション後、ブロッキング溶液を除去し、各血清試料の3倍段階希釈(PBS+0.1% Tween20+1% BSA緩衝剤、internalで)を実施し、コーティングされたプレートに添加し、37℃で1時間インキュベートした。次いで、プレートをPBS 0.1% Tween20(洗浄緩衝剤)を用いて4回洗浄し、セイヨウワサビペルオキシダーゼ(Peroxydase)がコンジュゲートしたAffiniPureヤギ抗マウスIgG(H+L)(ref 115-035-003、Jackson、USA)を二次抗体として使用した。ウェルあたり100マイクロリットルの、PBS+0.1% Tween20+1% BSA緩衝剤で1:500の濃度で希釈した二次抗体を各ウェルに添加し、プレートを37℃で45分間インキュベートした。
次いで、プレートを洗浄緩衝剤を用いて4回及び脱イオン水を用いて2回洗浄し、100μL/ウェルの、クエン酸ナトリウム0.1M pH5.5緩衝剤(internal)で希釈した75%の単一成分TMBペルオキシダーゼELISA基質(ref 172-1072、Bio-Rad、USA)の溶液とともにRT(室温)で15分間インキュベートした。酵素的発色現象をウェルあたり100μLの0.4N硫酸1M(H2SO4)を用いて停止させ、Versamax ELISAリーダーを使用して450/620nmの吸光度でプレートを読み出した。
光学密度(OD)をキャプチャし、SoftMaxPro GxP v5.3ソフトウェアを使用して分析した。標準曲線は、4パラメーターロジスティック回帰フィットを参照標準結果に適用することによって作成した(HSV2抗gEの参照標準=20180011 14PIII-AS01/gE(5μgの各々/用量)で免疫したマウス1.1～1.20のプール;HSV2 抗gIの参照標準=20190021 14PII-AS01/gI(5μgの各々/用量)で免疫したマウス2.1～2.5のプール;HSV1 gEgIの参照標準:20200023 14PIII-AS01-HSV-1 gE/gI HEK(5μgの各々/用量)で免疫したマウス1.1～1.20のプール。試料における抗体価は、標準曲線の補間によって算出した。試料の抗体価は、標準曲線の20～80%ダイナミックレンジ内に入った希釈物から得た値を平均化することによって得た。力価は、EU/mL(mL当たりのELISAユニット)で表された。
ICSアッセイによって測定されたHSV2又はHSV1 gE及びgI特異的CD4+/CD8+T細胞応答
IL-2及び/又はIFN-γ及び/又はTNF-αを産生するgE及びgI特異的CD4+及びCD8+T細胞の頻度を、HSV2/HSV1 gE又はgIペプチドプールを用いるex-vivo刺激後の第2の(実施例6.5)又は第3の免疫化後の脾細胞において評価した。
IL-2及び/又はIFN-γ及び/又はTNF-αを産生するgE及びgI特異的CD4+及びCD8+T細胞の頻度を、HSV2/HSV1 gE又はgIペプチドプールを用いるex-vivo刺激後の第2の(実施例6.5)又は第3の免疫化後の脾細胞において評価した。
脾細胞の単離:第2の(実施例6.5)又は第3の免疫化後14日(実施例6.1、6.2及び6.4)又は21日(実施例6.3及び6.5)に個々のマウスから脾臓を採取し、RPMI添加剤(グルタミン、ペニシリン/ストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸及び2-メルカプトエタノール)を添加したRPMI1640培地(=RPMI/添加剤)に入れた。組織グラインダーを使用して各脾臓から細胞懸濁液を調製した。脾臓の細胞懸濁液を濾過し(セルストレーナー(cell stainer)100μm)、次いで、フィルターを40mLの冷PBS-EDTA 2mMを用いてすすいだ。遠心分離(335g、4℃で10分間)後、細胞を7mLの冷PBS-EDTA 2mMに再懸濁した。第2の洗浄ステップをこれまでに記載されたように実施し、最後に、細胞を1mLの、5% FCSを添加したRPMI/添加剤に再懸濁した(Capricorn scientific、FBS-HI-12A)。細胞懸濁液を次いで、細胞計数(MACSQuantアナライザーを使用する)のためにPBS緩衝剤(190μL)で20×(10μL)希釈した。計数後、細胞を遠心分離(335g、RTで10分間)し、5% FCSを添加したRPMI/添加剤に107個細胞/mLで再懸濁した。
細胞調製:新鮮脾細胞を丸底96ウェルプレートに106個細胞/ウェル(100μL)で播種した。次いで、
実施例6.1、6.2、6.3及び6.6については、
- 15merの、HSV2由来のgEタンパク質の配列をカバーする重複ペプチドプール(ウェルあたりペプチドあたり1μg/mL)、
- 15merの、HSV2由来のgIタンパク質の配列をカバーする重複ペプチドプール(ウェルあたりペプチドあたり1μg/mL)、
- 15merの、ヒトβ-アクチンタンパク質の配列をカバーする重複ペプチドプール(ウェルあたりペプチドあたり1μg/mL)(無関係の刺激)、
- RPMI/添加剤培地(アッセイの陰性対照として)、
- PMA-それぞれ、0.25μg/mL及び2.5μg/mLの作業濃度のイオノマイシン溶液(Sigma、P8139) (アッセイの陽性対照として)、
実施例6.4及び6.5については、
- 15merの、HSV-1由来のgEタンパク質の配列をカバーする重複ペプチドプール(ウェルあたりペプチドあたり1μg/mL)、
- 15merの、HSV-1由来のgIタンパク質の配列をカバーする重複ペプチドプール(ウェルあたりペプチドあたり1μg/mL)、
- 15merの、ヒトβ-アクチンタンパク質の配列をカバーする重複ペプチドプール(ウェルあたりペプチドあたり1μg/mL)(無関係の刺激)、
- RPMI/添加剤培地(アッセイの陰性対照として)、
- PMA-それぞれ、0.25μg/mL及び2.5μg/mLの作業濃度のイオノマイシン溶液(Sigma、P8139)(アッセイの陽性対照として)
のいずれかの100μLを含有する、ウェルあたり1μg/mLの抗CD28(BD Biosciences、クローン37.51)及び抗CD49d抗体(BD Biosciences、クローン9C10(MFR4.B))を用いて細胞を6時間刺激した(37℃、5% CO2)。
実施例6.1、6.2、6.3及び6.6については、
- 15merの、HSV2由来のgEタンパク質の配列をカバーする重複ペプチドプール(ウェルあたりペプチドあたり1μg/mL)、
- 15merの、HSV2由来のgIタンパク質の配列をカバーする重複ペプチドプール(ウェルあたりペプチドあたり1μg/mL)、
- 15merの、ヒトβ-アクチンタンパク質の配列をカバーする重複ペプチドプール(ウェルあたりペプチドあたり1μg/mL)(無関係の刺激)、
- RPMI/添加剤培地(アッセイの陰性対照として)、
- PMA-それぞれ、0.25μg/mL及び2.5μg/mLの作業濃度のイオノマイシン溶液(Sigma、P8139) (アッセイの陽性対照として)、
実施例6.4及び6.5については、
- 15merの、HSV-1由来のgEタンパク質の配列をカバーする重複ペプチドプール(ウェルあたりペプチドあたり1μg/mL)、
- 15merの、HSV-1由来のgIタンパク質の配列をカバーする重複ペプチドプール(ウェルあたりペプチドあたり1μg/mL)、
- 15merの、ヒトβ-アクチンタンパク質の配列をカバーする重複ペプチドプール(ウェルあたりペプチドあたり1μg/mL)(無関係の刺激)、
- RPMI/添加剤培地(アッセイの陰性対照として)、
- PMA-それぞれ、0.25μg/mL及び2.5μg/mLの作業濃度のイオノマイシン溶液(Sigma、P8139)(アッセイの陽性対照として)
のいずれかの100μLを含有する、ウェルあたり1μg/mLの抗CD28(BD Biosciences、クローン37.51)及び抗CD49d抗体(BD Biosciences、クローン9C10(MFR4.B))を用いて細胞を6時間刺激した(37℃、5% CO2)。
ex vivo刺激の2時間後、5% FCSを添加したRPMI/添加剤で1/200希釈されたブレフェルジンA(Golgi plug ref 555029、BD Bioscience)をさらに4時間添加して、サイトカイン分泌を阻害した。次いで、プレートを、一晩インキュベーションのために4℃で移した。
細胞内サイトカイン染色:4℃で一晩インキュベートした後、細胞をV底96ウェルプレートに移し、遠心分離し(189g、4℃で5分間)、250μLの冷PBS+1% FCS(フロー緩衝剤)で洗浄した。第2の遠心分離(189g、4℃で5分間)後、細胞を50μLの、1/50希釈した抗CD16/32抗体(BD Biosciences、クローン2.4G2)を含有するフロー緩衝剤に再懸濁して、非特異的抗体結合をブロッキングした(4℃で10分間)。次いで、50μLの、マウス抗CD4-V450抗体(1/100に希釈したBD Biosciences、クローンRM4-5)、抗CD8-PerCp-Cy5.5抗体(1/50に希釈したBD Biosciences、クローン53-6.7)及びLive/Dead Fixable Yellow死滅細胞染色(1/500に希釈した、Molecular probes、L34959)を含有するフロー緩衝剤を、4℃で暗所で30分間添加した。インキュベーション後、各ウェル中に100μLのフロー緩衝剤を添加し、次いで、細胞を遠心分離した(189g、4℃で5分間)。第2の洗浄ステップを、200μLのフロー緩衝剤を用いて実施し、遠心分離後、細胞を固定し、200μLのCytofix-Cytoperm溶液(BD Biosciences、554722)を暗所で4℃で20分間添加することによって透過処理した。プレート遠心分離(500g、4℃で5分間)後、細胞を200μLのPerm/Wash緩衝剤(BD Biosciences、554723)を用いて洗浄し、遠心分離し(500g、4℃で5分間)、50μLの、マウス 抗IL2-FITC(1/400に希釈したBD Biosciences、クローンJES6-5H4)、抗IFN-γ-APC(1/200に希釈したBD Biosciences、クローンXMG1.2)及び抗TNF-α-PE(1/700に希釈したBD Biosciences、クローンMP6-XT22)抗体を含有するPerm/Wash緩衝剤に、暗所で4℃で1時間再懸濁した。インキュベーション後、各ウェル中に100μLの、フロー緩衝剤を添加し、次いで、細胞を、200μLのPerm/Wash緩衝剤を用いて最後に洗浄し(遠心分離500g、4℃で5分間)、220μLのPBSに再懸濁した。
細胞取得及び分析:染色された細胞を、LSRIIフローサイトメーターを使用するフローサイトメトリー及びFlowJoソフトウェアによって分析した。生細胞を、Live/Dead染色を用いて同定し、次いで、前方/側方散乱光(FSC/SSC)ゲーティングに基づいてリンパ球を単離した。約20,000のCD4+/CD8+T細胞事象で取得を実施した。IFN-γ+/-IL-2+/-及びTNF-α+/-産生細胞のパーセンテージをCD4+及びCD8+T細胞集団で算出した。各試料について、ペプチドプール刺激後に検出された特異的シグナルから培地刺激後に検出された非特異的シグナルを除去した。
マウスFcγRIIIに結合し、活性化する、ポリクローナル血清の能力の評価(ADCC様バイオアッセイ- Promega- 実施例6.2及び6.3)
Promega laboratoryによって開発された、マウスFcγRIII抗体依存性細胞傷害性(ADCC)リポーターバイオアッセイ(カタログ番号M1201)は、改変Jurkatリポーター細胞によって発現されたマウスFcγRIIIに特異的に結合し、活性化する抗体の能力を測定するために使用できる生物発光細胞ベースアッセイである。
Promega laboratoryによって開発された、マウスFcγRIII抗体依存性細胞傷害性(ADCC)リポーターバイオアッセイ(カタログ番号M1201)は、改変Jurkatリポーター細胞によって発現されたマウスFcγRIIIに特異的に結合し、活性化する抗体の能力を測定するために使用できる生物発光細胞ベースアッセイである。
概説すると、最初にATCC laboratoriesから購入した3T3細胞(クローンA31、ATCC ref CCL-163)をDMEM+10% 非補完性FBS+1% L-グルタミン2mM+1%ペニシリン/ストレプトマイシン培地で増殖させ、実験の0日目にT175フラスコ中に2×106個細胞で播種して、細胞が翌日の間、最適増殖期にあることを確実にした。
1日目に、各ウェル(エレクトロポレーションあたり1つのウェル)に2mLの増殖培地(DMEM (Prep Mil、Log377BA)、1% L-グルタミン2mM(Prep Mil、Log010D)、10%の超低IgG FBS(Gibco、A33819-01))を添加することによって6ウェルプレートを準備した。プレートを37℃インキュベーター(5% CO2)中で保温した。エレクトロポレーション装置(Gene Pulser、BIO-RAD)を325V、350μF電気容量、無限抵抗、4mmキュベットのために1パルスを送達するように準備した。増殖期の3T3細胞を増殖培地中に回収し、細胞計数機器(TC20、BIO-RAD)を使用して計数した。各エレクトロポレーションのために、5×105個の3T3細胞(1×106個細胞/mLで500uLの細胞)及び20ugのHSV2 gEgIプラスミドDNA(1ug/uLで20uL;gEgI DNAプラスミドのロット番号:P940)を使用した。陰性対照としては、10uLの水を使用した。細胞及びHSV2 gEgIプラスミドDNA混合物を4mmキュベット(Gene Pulserエレクトロポレーションキュベット、BIO-RAD)に移し、直ちに、上記のパラメーターを使用するエレクトロポレーションの1パルスに付した。エレクトロポレーション後、すべてのキュベットをプールして、細胞懸濁液をホモジナイズし、500μLの細胞懸濁液/ウェルを6ウェルプレート中の2mLの予め加温した培地に移した。インキュベーションの前に、6ウェルプレートを前後左右に数回スライドさせて、細胞を均一に分配し、次いで、37℃、5% CO2で48時間インキュベートした。
48時間のインキュベーション後、異なる6ウェルプレートからHSV2 gEgIをトランスフェクトされた3T3細胞(標的細胞(T))を採取し、プールした。細胞懸濁液を遠心分離(RTで10分間、340g)し、細胞計数(TC20、BIO-RAD)のためにPromegaアッセイ緩衝剤(96% RPMI(G7080)+4%の低IgG血清(G7110);Promega)に再懸濁した。次いで、Promegaアッセイ緩衝剤で96,000個/mLの3T3細胞の溶液を調製し、この懸濁液の25μL(24,000個細胞/25μL/ウェル)を96ウェルプレート中に添加した。丸底96ウェルプレート(Nunc、ref 168136)において、Promegaアッセイ緩衝剤で200μL中の各マウス血清試料の3倍段階希釈(希釈1/500で開始する)を実施し、各希釈物の25μLをすでにHSV2 gEgIでトランスフェクトされた3T3細胞を含有する対応するウェルに移した。最後に、各ウェルに、25μLの、240,0000個細胞/mL(60,000個細胞/25μL/ウェル)の濃度のマウスFcγRIIIを発現する遺伝子操作されたJurkat細胞(エフェクター細胞(E))を添加し(約E/T 2,5/1)、プレートを37℃-5% CO2で6時間インキュベートした。
インキュベーション後、プレートをRTに15分間静置し、各ウェルに75μLのBio-Glow試薬を添加した。最後にプレートをRTで20分間インキュベートし、ルミノメーター(BioTek Synergy H1)を使用して読み出した。
ワクチン特異的抗体の、gEgIタンパク質によるヒトIgG Fc結合を減少させる能力を評価するための競合的ELISA法
組換えHSV2又はHSV1 gEgIタンパク質によるin vitro hIgG抗体結合を減少させる、種々の群のマウスにおいて採取されたポリクローナル血清の能力を競合的ELISA法によって調べた。ExpiHEK293F(商標)発現システムを使用して生成された組換えHSV2 gEgIタンパク質を、実施例6.1、6.2、6.3及び6.6のためにコーティング抗原として使用した。ExpiCHO(商標)発現システムを使用して生成された組換えHSV1 gEgIタンパク質を、実施例6.4及び6.5のためにコーティング抗原として使用した。
組換えHSV2又はHSV1 gEgIタンパク質によるin vitro hIgG抗体結合を減少させる、種々の群のマウスにおいて採取されたポリクローナル血清の能力を競合的ELISA法によって調べた。ExpiHEK293F(商標)発現システムを使用して生成された組換えHSV2 gEgIタンパク質を、実施例6.1、6.2、6.3及び6.6のためにコーティング抗原として使用した。ExpiCHO(商標)発現システムを使用して生成された組換えHSV1 gEgIタンパク質を、実施例6.4及び6.5のためにコーティング抗原として使用した。
ポリスチレン96ウェルELISAプレート(Nunc F96 Maxisorpカタログ439454)を、50μL/ウェルの、遊離カルシウム/マグネシウムPBS緩衝剤(internal)で2μg/mL(実施例6.1、6.4及び6.5)又は4μg/mL(実施例6.2、6.3及び6.6)の濃度に希釈したHSV2(実施例6.1、6.2、6.3及び6.6)又はHSV1(実施例6.4及び6.5)gEgIタンパク質を用いてコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、コーティング溶液を除去し、プレートを100μL/ウェルの、0.1% Tween-20+1% BSAを添加したPBS(ブロッキング緩衝剤-ref TR021、社内)とともに37℃で1時間ブロッキングした。
・実施例6.1用:
ブロッキング溶液を除去し、コーティングされたプレートに、50μL/ウェルの、ブロッキング緩衝剤で0.5μg/mLに希釈されたビオチン化hIgG抗体(Invitrogen、ref 12000C、社内でビオチン化)を添加し、37℃で2時間インキュベートした。別の96ウェルプレートでは、各群のマウスについて、11,4691EU/mLのgE ELISA力価で正規化された2匹のマウスの血清のいくつかのプールをブロッキング緩衝剤で希釈(体積/体積)した。次いで、各プールの血清について、ブロッキング緩衝剤で2倍の段階希釈を行った。コーティングされたプレートでの2時間のhIgGインキュベーション後、50μLの各血清希釈物をそれぞれのウェルに添加して競合を可能にし、プレートを37℃で22時間インキュベートした。
ブロッキング溶液を除去し、コーティングされたプレートに、50μL/ウェルの、ブロッキング緩衝剤で0.5μg/mLに希釈されたビオチン化hIgG抗体(Invitrogen、ref 12000C、社内でビオチン化)を添加し、37℃で2時間インキュベートした。別の96ウェルプレートでは、各群のマウスについて、11,4691EU/mLのgE ELISA力価で正規化された2匹のマウスの血清のいくつかのプールをブロッキング緩衝剤で希釈(体積/体積)した。次いで、各プールの血清について、ブロッキング緩衝剤で2倍の段階希釈を行った。コーティングされたプレートでの2時間のhIgGインキュベーション後、50μLの各血清希釈物をそれぞれのウェルに添加して競合を可能にし、プレートを37℃で22時間インキュベートした。
22時間のインキュベーション後、プレートをPBS 0.1% Tween20(洗浄緩衝剤)を用いて4回洗浄し、50μL/ウェルの、2000倍希釈したストレプトアビジン-セイヨウワサビペルオキシダーゼ(Peroxydase)AMDEX(Amersham、ref RPN4401V)を添加し、37℃で30分間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄緩衝剤を用いて4回洗浄した。最後に、50μL/ウェルの、クエン酸ナトリウム0.1M pH5.5緩衝剤(ref TR003、GSK社内)で希釈した75%の単一成分TMBペルオキシダーゼELISA基質(ref 172-1072、Bio-Rad、USA)を室温で10分間添加した。酵素的発色現象を50μL/ウェルの0.4N硫酸1M(H2SO4)を用いて停止させ、プレートをVersamax ELISAリーダーを使用して450/620nmの吸光度で読み出した。光学密度(OD)をキャプチャし、エクセルプログラムを用いて曲線にあてはめた。
ICSアッセイによって流入領域リンパ節において測定された濾胞性BヘルパーCD4+T細胞応答(実施例6.6)
第1の免疫化後10及び16日目に5μgのLNP製剤化SAM-gE_P317R_gIワクチンで免疫されたマウスの流入領域リンパ節(iliac)において濾胞性BヘルパーCD4+T(Tfh)細胞応答を調べた。NaCl処置マウスを陰性対照として使用した。
第1の免疫化後10及び16日目に5μgのLNP製剤化SAM-gE_P317R_gIワクチンで免疫されたマウスの流入領域リンパ節(iliac)において濾胞性BヘルパーCD4+T(Tfh)細胞応答を調べた。NaCl処置マウスを陰性対照として使用した。
・実施例6.2～6.6用:
96ウェル透明V底ポリプロピレンマイクロプレート(Falcon、ref 353263)において、60μL/ウェルで、各個々の血清についてブロッキング緩衝剤での2倍の段階希釈(希釈1/10で開始する)を調製し、60μL/ウェルの、ブロッキング緩衝剤で0.7μg/mLで予め希釈されたビオチン化-hIgG抗体(Invitrogen、ref 12000C、社内でビオチン化)と混合した。
96ウェル透明V底ポリプロピレンマイクロプレート(Falcon、ref 353263)において、60μL/ウェルで、各個々の血清についてブロッキング緩衝剤での2倍の段階希釈(希釈1/10で開始する)を調製し、60μL/ウェルの、ブロッキング緩衝剤で0.7μg/mLで予め希釈されたビオチン化-hIgG抗体(Invitrogen、ref 12000C、社内でビオチン化)と混合した。
次いで、ブロッキング緩衝剤とともに1時間のインキュベーション後、コーティングされたプレートからブロッキング溶液を除去し、100μLの、hIgG及びマウス両方の血清を含有する混合物を対応するHSV2又はHSV1 gEgIコーティングされたウェルに移し、37℃で24時間インキュベートした。アッセイの陽性対照は、別の研究からの抗gEgI血清試料のプールであった。アッセイの陰性対照は、1/1000希釈され、hIgGとも混合された無関係のHPV血清試料のプールであった。
24時間のインキュベーション後、プレートをPBS 0.1%+Tween20(洗浄緩衝剤)を用いて4回洗浄し、50μL/ウェルの、2000×希釈されたストレプトアビジン-セイヨウワサビペルオキシダーゼ(Peroxydase)AMDEX(Amersham、ref RPN4401V)をウェルに添加し、プレートを37℃で30分間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄緩衝剤を用いて4回洗浄し、50μL/ウェルの、クエン酸ナトリウム0.1M pH5.5緩衝剤(internal)で希釈した75%の単一成分TMBペルオキシダーゼELISA基質(ref 172-1072、Bio-Rad、USA)を含有する溶液を室温で10分間添加した。酵素的発色現象を50μL/ウェルの0.4N硫酸1M(H2SO4)を用いて停止させ、プレートをVersamax ELISAリーダーを使用して450/620nmの吸光度で読み出した。光学密度(OD)をキャプチャし、エクセルプログラムを用いて曲線にあてはめた。
力価は、試料希釈によってシグナルの50%(すなわち、ED50)が達成される有効希釈として表わされた。
各プレートについて、参照試料(すなわち、無関係の血清)を使用して、以下の式:
ED50=OD0%+0.5×(OD100%-OD0%)
[式中、OD100%は、同様の試料を用いて得られる最高ODであり、OD0%は、最低の到達可能なシグナルである]
を使用して参照ED50を推定した。各プレートについて、前者は6回の繰り返しを平均化する(平均する)ことによって得られ、後者はゼロに設定された。
ED50=OD0%+0.5×(OD100%-OD0%)
[式中、OD100%は、同様の試料を用いて得られる最高ODであり、OD0%は、最低の到達可能なシグナルである]
を使用して参照ED50を推定した。各プレートについて、前者は6回の繰り返しを平均化する(平均する)ことによって得られ、後者はゼロに設定された。
試料ED50力価を、プレート内のED50推定値に最も近い左右の測定値間の線形補間によってコンピュータによって計算した。非変換OD及び対数ベース10変換希釈で、stats R基本パッケージの近似関数を用いて近似が得られた。
以下の場合には試料に力価を割り当てなかった:
・ED50を上回る又は下回る測定値が入手可能ではなかった、
・曲線が少なくとも2回ED50と交差した、及び
・ED50に最も近い希釈ステップのうち1つ(左又は右)が欠落していた
・ED50を上回る又は下回る測定値が入手可能ではなかった、
・曲線が少なくとも2回ED50と交差した、及び
・ED50に最も近い希釈ステップのうち1つ(左又は右)が欠落していた
流入領域リンパ節からの細胞の単離:第1の免疫化の10及び16日後に5μgのLNP製剤化SAM-gE_P317R_gIヘテロ二量体で免疫された個々のマウスから左及び右腸骨リンパ節を採取し、プールし、以下の通りに処理した。単離された細胞数が少ないために、左及び右腸骨をNaCl対照群では鼠経及び膝窩リンパ節とともにプールして、免疫蛍光染色及びフローサイトメトリー取得のために利用可能な免疫細胞数を増大させた。
リンパ節を検体採取の間600μLのRPMI/添加剤中に入れた。組織採取後、組織グラインダーを使用して細胞懸濁液を調製し、細胞懸濁液を濾過し(セルストレーナー(cell stainer)100μm)、0.5mLの冷PBS-EDTA 2mMを用いてすすいだ。遠心分離(335g、5分間)後、細胞を0.5mLの冷PBS-EDTA 2mMに再懸濁し、氷上に5分間置いた。第2の洗浄ステップをこれまでに記載されたように実施し、細胞を0.5mLの、5%の不活性化FCS(Capricorn、FBS-HI-12A)を添加したRPMI/添加剤に再懸濁した。最後に、細胞計数(MACSQuantアナライザーを使用する)のために細胞懸濁液をPBS緩衝剤(190μL)で20×(10μL)希釈した。
計数後、細胞を遠心分離(335g、RTで5分間)し、5%の不活性化FCSを添加したRPMI/添加剤に2.5×107個細胞/mLで再懸濁した。
免疫染色:新鮮細胞(100μLの2.5×106細胞/ウェル)をV底96ウェルプレートに移し、遠心分離(400g、4℃で5分間)し、200μLのPBS緩衝剤で洗浄した。第2の遠心分離(400g、4℃で5分間)後、細胞を200μLのPBS緩衝剤に再懸濁し、最後の洗浄ステップを実施した(400g、4℃で5分間)。次いで、細胞を100μLの、PBS緩衝剤で1/1000希釈されたFixable Viability染料eFluor 780(eBioscience、65-0865-18)に再懸濁し、RT、暗所で15分間インキュベートした。
インキュベーション後、細胞を遠心分離(400g、4℃で5分間)し、100μLの、抗CD16/32抗体(1/50に希釈したBD biosciences、クローン2.4G2)、ラット抗CD4-PECy7(1/100に希釈したBD biosciences、クローンRM4-5)、ラット抗マウスIgG2a CD19 FITC(1/200に希釈したBiolegend、クローン1D3/CD19)、ラット抗マウスCXCR5ビオチン(1/50に希釈したBD biosciences、クローン2G8)、ハムスター抗マウスCD279(PD-1)BV421(1/250に希釈したBD biosciences、クローンJ43)抗体を含有するフロー緩衝剤(PBS+1% FCS)を4℃、暗所で45分間添加した。
インキュベーション後、各ウェルに100μLのフロー緩衝剤を添加し、次いで、細胞を遠心分離(400g、4℃で5分間)した。200μLのフロー緩衝剤を用いて第2の洗浄ステップを実施し、遠心分離後、100μLの、ストレプトアビジン-APC(フロー緩衝剤で1/200希釈された)を含有するフロー緩衝剤を4℃、暗所で30分間添加した。
インキュベーション後、各ウェルに100μLのフロー緩衝剤を添加し、次いで、細胞を遠心分離(400g、4℃で5分間)した。200μLのフロー緩衝剤を用いて第2の洗浄ステップを実施し、遠心分離後、200μLのeBioscience(商標)固定/透過処理(Thermofisher、ref 00-5523-00)溶液を添加することによって、細胞を4℃、暗所で30分間固定し、透過処理した。プレート遠心分離(400g、4℃で5分間)後、200μLの透過処理緩衝剤(Thermofisher、ref 00-5523-00)を用いて細胞を洗浄し、遠心分離(400g、4℃で5分間)し、100μLの、マウス抗BCL6-PE(1/50に希釈したBD Biosciences、クローンK112-91)抗体を含有する透過処理緩衝剤に、暗所、4℃で45分再懸濁した。
インキュベーション後、各ウェルに100μLの透過処理緩衝剤(Thermofisher、ref 00-5523-00)を添加し、遠心分離(400g、4℃で5分間)し、次いで、200μLの透過処理緩衝剤を用いて細胞を最後に洗浄し(遠心分離400g、4℃で5分間)、フローサイトメトリー取得のために220μLのPBSに再懸濁した。
細胞取得及び分析:染色された細胞を、LSRIIフローサイトメーターを使用するフローサイトメトリー及びFlowJoソフトウェアによって分析した。生細胞をLive/Dead染色を用いて同定し、次いで、前方/側方散乱光(FSC/SSC)ゲーティングに基づいてリンパ球を単離した。
取得は、総生存CD4+T細胞で実施し、Tfh細胞のパーセンテージをPD-1/CXCR5/BCL6陽性細胞でのゲーティングによって評価した。
活性化B細胞を単離するために、取得を総生存CD19+B細胞で実施し、活性化B細胞のパーセンテージをCXCR5/BCL6陽性細胞でのゲーティングによって評価した。
in vitro HSV2及びHSV1中和アッセイ
異なる動物種から得た血清試料においてHSV2(実施例6.1、6.2、6.3及び6.6)又はHSV1(実施例6.4、6.5)中和抗体価を検出し、定量化するために、in vitro中和アッセイを開発した。平底96ウェルプレート(Nunclon Delta Surface、Nunc、Denmark、ref 167008)においてHSV培地(1%ネオマイシン及び1%ゲンタマイシンを添加したDMEM)で2倍の段階希釈を実施することによって、血清(開始希釈1/10で50μL/ウェル)を希釈した。次いで、血清を、400 TCID50/50μL/ウェルの、2%のモルモット血清補体(Harlan、ref C-0006E)を添加したHSV培地で予め希釈した、HSV2 MS系統(ref ATCC VR-540)(実施例6.1、6.2、6.3)又はHSV1系統(ref ATCC VR-1789)(実施例6.4、6.5)とともに37℃(5% CO2)で2時間インキュベートした。プレートのエッジは使用せず、各プレートの1つのカラムをウイルス及び血清を含まずに(TC)又は、ウイルスを有するが血清を含まずに(TV)残し、それぞれ感染の陰性又は陽性対照として使用した。アッセイの陽性対照血清は、異なる用量(0.22、0.66、2、6μg/用量)のHSV2 gD/AS01(2.5μg)で免疫されたマウスから得た、第2の(14PII)又は第3の(14PIII)免疫化の14日後に採取されたプールされた血清試料であった。抗体-ウイルス混合物のインキュベーション後、各プレートの各ウェルに10,000個Vero細胞/100μLを添加し、プレートを5% CO2下37℃で4日間インキュベートした。感染の4日後、プレートから上清を除去し、細胞をHSV顕色培地(1%ネオマイシン及び1%ゲンタマイシン+2% FBSを添加したDMEM)で15×希釈したWST-1溶液(細胞生存力を測定するための試薬、Roche、ref 11644807001)とともに37℃(5% CO2)で5時間インキュベートした。
異なる動物種から得た血清試料においてHSV2(実施例6.1、6.2、6.3及び6.6)又はHSV1(実施例6.4、6.5)中和抗体価を検出し、定量化するために、in vitro中和アッセイを開発した。平底96ウェルプレート(Nunclon Delta Surface、Nunc、Denmark、ref 167008)においてHSV培地(1%ネオマイシン及び1%ゲンタマイシンを添加したDMEM)で2倍の段階希釈を実施することによって、血清(開始希釈1/10で50μL/ウェル)を希釈した。次いで、血清を、400 TCID50/50μL/ウェルの、2%のモルモット血清補体(Harlan、ref C-0006E)を添加したHSV培地で予め希釈した、HSV2 MS系統(ref ATCC VR-540)(実施例6.1、6.2、6.3)又はHSV1系統(ref ATCC VR-1789)(実施例6.4、6.5)とともに37℃(5% CO2)で2時間インキュベートした。プレートのエッジは使用せず、各プレートの1つのカラムをウイルス及び血清を含まずに(TC)又は、ウイルスを有するが血清を含まずに(TV)残し、それぞれ感染の陰性又は陽性対照として使用した。アッセイの陽性対照血清は、異なる用量(0.22、0.66、2、6μg/用量)のHSV2 gD/AS01(2.5μg)で免疫されたマウスから得た、第2の(14PII)又は第3の(14PIII)免疫化の14日後に採取されたプールされた血清試料であった。抗体-ウイルス混合物のインキュベーション後、各プレートの各ウェルに10,000個Vero細胞/100μLを添加し、プレートを5% CO2下37℃で4日間インキュベートした。感染の4日後、プレートから上清を除去し、細胞をHSV顕色培地(1%ネオマイシン及び1%ゲンタマイシン+2% FBSを添加したDMEM)で15×希釈したWST-1溶液(細胞生存力を測定するための試薬、Roche、ref 11644807001)とともに37℃(5% CO2)で5時間インキュベートした。
中和抗体価を算出するために、それぞれ0及び100%細胞変性効果(CPE)に対する「ウイルスをを含まない細胞」ウェル及び「血清を含まない細胞」ウェルにおけるWST-1光学密度(O.D.)の平均に基づいて、データのセットを正規化した。次いで、希釈iでのCPEの阻害のパーセンテージを、以下によって得た:
阻害%=(O.D.i-平均O.D.血清を含まない細胞)/(平均O.D.ウイルスを含まない細胞-平均O.D.血清を含まない細胞)
阻害%=(O.D.i-平均O.D.血清を含まない細胞)/(平均O.D.ウイルスを含まない細胞-平均O.D.血清を含まない細胞)
次いで、CPEの50%低減を与える希釈の逆数を、Softmaxproソフトウェアを用い非線形回帰を使用して外挿した。
統計的手法
[実施例6.1]
gE若しくはgI特異的IgG、又は中和抗体の力価とCD4+/CD8+T細胞の応答の%の分布は正規対数型であると仮定した。
[実施例6.1]
gE若しくはgI特異的IgG、又は中和抗体の力価とCD4+/CD8+T細胞の応答の%の分布は正規対数型であると仮定した。
抗体(gE又はgI特異的)応答については、群(NaCl群を除く全群)、時点(14日目PI及び14日目PII)、及びそれらの相互作用を固定効果として含め、時点の反復測定を考慮することによって(動物を同定し、時点間の相関をモデル化した)、log10力価に対して二元配置分散分析(ANOVA)モデルをあてはめた。時点ごとに異なる分散も仮定した。gE応答については、各ワクチン群の間に分散の不均一性を示す明確な証拠が検出されなかったため、各ワクチン群で同じ分散を仮定する。対照的に、gI応答については、群間で異なる分散が検出され、モデル化されている。幾何平均とその95%CI、及びgE/gI非突然変異タンパク質に対するgE/gI突然変異タンパク質(mutHSV41、mutHSV45、mutHSV57又はmutHSV61)の幾何平均比とその90%CIが、各時点におけるこれらのモデルから導き出される。
CD4+T細胞応答の%については、群(NaCl群を除く全群)、刺激(gE又はgI)、及びそれらの相互作用を固定効果として含め、刺激の反復測定を考慮することによって(動物を同定し、刺激間の相関をモデル化した)、log10頻度に対して二元配置分散分析(ANOVA)モデルをあてはめた。刺激ごとに異なる分散も仮定した。分散の不均一性の明確な証拠が検出されなかったため、すべてのワクチン群で同じ分散を仮定する。幾何平均とその95%CI、及びgE/gI非突然変異タンパク質に対するgE/gI突然変異タンパク質(mutHSV41、mutHSV45、mutHSV57又はmutHSV61)の幾何平均比とその90%CIが、これらのモデルから導き出される。
CD4+T細胞応答及びCD8+T細胞応答の両方の%について、NaCl閾値は、NaCl陰性対照群の刺激全体のデータのP95に基づいている。
CD8+T細胞応答の%の結果は、明確な応答が検出されなかったため、記述的な方法でのみ示されている。
[実施例6.2]
各応答の分布は正規対数型であると仮定した。
各応答の分布は正規対数型であると仮定した。
各ワクチン特異的IgG抗体応答(gE又はgI)について、群(NaCl群を除く全群)、時点(14日目(14PI)、28日目(14PII)、42日目(14PIII))、及びそれらの相互作用を固定効果として含めることによって、log10力価に対して二元配置分散分析(ANOVA)モデルをあてはめた。NaCl群は応答や変動が(ほとんど)見られなかったため、含めなかった。分散共分散モデルの選択は、AICC基準と個々のデータプロットの検討に基づいて行った。
時点のgE特異的分散共分散は、不均一複合対称性(Heterogenous Compound Symmetry)によってモデル化されている。
CSH-不均一CS:複合対称性は時点間の相関が同じであることを考慮し、不均一は各時点に異なる分散を仮定したことを表す。ワクチン群ごとに異なる分散共分散行列がモデル化され、群間で異なる分散と異なる時点の相関を示している。
時点のgI特異的分散共分散は、不均一1次自己回帰(Heterogenous First Order Autoregressive)ARH(1)構造によってモデル化された。
ARH(1)-不均一AR(1):自己回帰構造では、相関は隣接する時間で最も高くなり、時点間の距離が長くなると系統的に相関が減少すると考えられる。不均一とは、時点ごとに異なる分散を仮定したことを表す。ワクチン群ごとに同一の分散共分散行列がモデル化され、群間で同一の分散を示している。
幾何平均とその95%CIはこれらのモデルから導かれる。
ANOVAモデルにNaCl群が含まれていないにもかかわらず、ワクチン接種群とNaCL対照群との比較を以下のように計算した。上記のモデルから得られたワクチン接種群の幾何平均及び95%CIを、最後の時点で、gEについてはNaCl投与群すべてに与えられた力価で、gIについてはNaCl投与群の幾何平均力価で除した。結果として得られた比は、幾何平均比とそれに対応する95%CIとして理解されるべきである。
ワクチン接種群の直接比較(最後の時点)と、各群内の時点比較(PII/PI、PIII/PII、PIII/PI)については、すべての幾何平均比とその95%CIがモデルから導かれた。
gE又はgI特異的CD4+T細胞応答の%については、群(NaCl群を含む全群)を固定効果として含めることによって、log10頻度に対して一元配置分散分析(ANOVA)モデルをあてはめた。明確な分散の不均一性は検出されなかったため、異なる群間で同一の分散を仮定した。CD4+及びCD8+T細胞応答の両方の%について、NaCl閾値は、NaCl陰性対照群の刺激全体のデータのP95に基づくものとした。gI特異的CD8+T細胞については、すべてのワクチン接種群で応答がP95NaCl閾値を下回ったため、モデル化は行わなかった。幾何平均と幾何平均比(対応する95%CI)はこれらのモデルから導かれた。
pAbによるヒトIgG Fc結合の解離を評価するために,各試料についてED50応答を算出した。この応答については、群(NaCl群を除く全群)を固定効果として含めることによって、log10値に対して一元配置分散分析(ANOVA)モデルをあてはめた。各群の異なる分散をモデル化した。幾何平均と幾何平均比(対応する95%CI)はこれらのモデルから導かれた。
中和抗体の力価については、群(NaCl群を除く全群)を固定効果として含めることによって、log10値に対して一元配置分散分析(ANOVA)モデルをあてはめた。各群の異なる分散をモデル化した。幾何平均と幾何平均比(対応する95%CI)はこれらのモデルから導かれた。
探索的研究のため、多重度の調整は行っていない。
[実施例6.3]
各応答の分布は正規対数型であると仮定した。
各応答の分布は正規対数型であると仮定した。
各IgG抗体応答(gE又はgI特異的)について、群(NaCl群を除く全群)、時点(21日目(21PI)、42日目(21PII)、63日目(21PIII))、及びそれらの相互作用を固定効果として含めることによって、log10力価に対して二元配置分散分析(ANOVA)モデルをあてはめた。NaCl群は応答や変動が見られなかったため、含めなかった。分散共分散モデルの選択は、AICC基準と個々のデータプロットの検討に基づいて行った。
各応答について、時点の分散共分散を複合対称性行列でモデル化した。
CS-複合対称性
複合対称性は、時点間の同一の分散と同一の相関を考慮している。ワクチン群ごとに同一の分散共分散行列がモデル化され、群間で同一の分散を示している。
複合対称性は、時点間の同一の分散と同一の相関を考慮している。ワクチン群ごとに同一の分散共分散行列がモデル化され、群間で同一の分散を示している。
幾何平均とその95%CIはこれらのモデルから導かれる。
ANOVAモデルにNaCl群が含まれていないにもかかわらず、ワクチン接種群とNaCL対照群との比較を以下のように計算した。上記のモデルから得られたワクチン接種群の幾何平均及び95%CIを、最後の時点で、NaCl投与群すべてに与えられた力価で除した。結果として得られた比は、対応する95%CIを伴う幾何平均比として理解されるべきである。
ワクチン接種群の直接比較(最後の時点)と、各群内の時点比較(PII/PI、PIII/PII、PIII/PI)については、すべての幾何平均比とその95%CIがモデルから導かれた。
CD4+/CD8+T細胞応答(gE又はgI特異的)の各ワクチン特異的%については、群(NaCl群を含む全群)を固定効果として含めることによって、log10頻度に対して一元配置分散分析(ANOVA)モデルをあてはめた。HSV-2 gE特異的CD4+T細胞応答の%については明確な分散の不均一性は検出されなかったため、異なる群間で同一の分散を仮定した。その他の応答については、異なる群で異なる分散をモデル化した。CD4+及びCD8+T細胞応答の両方の%について、NaCl閾値は、NaCl陰性対照群の刺激全体のデータのP95に基づいていた。HSV-2 gI特異的CD8+T細胞の%については、すべてのワクチン接種群で応答がP95NaCl閾値を下回ったため、モデル化は行わなかった。幾何平均と幾何平均比(対応する95%CI)はこれらのモデルから導かれた。
HSV-2 MS特異的中和抗体の力価については、群(NaCl群を除く全群)を固定効果として含めることによって、log10値に対して一元配置分散分析(ANOVA)モデルをあてはめた。明確な分散の不均一性は検出されなかったため、異なる群間で同一の分散を仮定した。幾何平均と幾何平均比(対応する95%CI)はこれらのモデルから導かれた。
探索的研究のため、多重度の調整は行っていない。
[実施例6.4]
各応答の分布は正規対数型であると仮定した。
各応答の分布は正規対数型であると仮定した。
抗HSV-1 gE/gI特異的抗体(pAb)応答について、群(NaCl群を除く全群)、時点(13日目(13PI)、27日目(13PII)、42日目(14PIII))、及びそれらの相互作用を固定効果として含めることによって、log10力価に対して二元配置分散分析(ANOVA)モデルをあてはめた。NaCl群は応答や変動が見られなかったため、含めなかった。分散共分散モデルの選択は、AICC基準と個々のデータプロットの検討に基づいて行った。
時点の分散共分散を非構造化行列でモデル化した。:
非構造化行列は、異なる分散を考慮し、時点の各ペアに固有の相関を推定する。ワクチン群ごとに同一の分散共分散行列がモデル化され、群間で同一の分散を示している。
幾何平均とその95%CIはこのモデルから導かれる。
ANOVAモデルにNaCl群が含まれていないにもかかわらず、ワクチン接種群とNaCL対照群との比較を以下のように計算した。上記のモデルから得られたワクチン接種群の幾何平均及び95%CIを、最後の時点で、NaCl投与群全員に与えられた力価で除した。結果として得られた比は、幾何平均比とそれに対応する95%CIとして理解されるべきである。
ワクチン接種群の直接比較(最後の時点)と、各群内の時点比較(PII/PI、PIII/PII、PIII/PI)については、すべての幾何平均比とその95%CIがモデルから導かれた。
CD4+/CD8+T細胞応答(gE又はgI特異的)の各ワクチン特異的%については、群(NaCl群を含む全群)を固定効果として含めることによって、log10頻度に対して一元配置分散分析(ANOVA)モデルをあてはめた。明確な分散の不均一性は検出されなかったため、異なる群間で同一の分散を仮定した。CD4+及びCD8+T細胞応答の両方の%について、NaCl閾値は、NaCl陰性対照群の刺激全体のデータのP95に基づくものとした。HSV-1 gE特異的CD8+T細胞の%については、すべてのワクチン接種群で応答がP95NaCl閾値を下回ったため、モデル化は行わなかった。幾何平均と幾何平均比(対応する95%CIを伴う)はこれらのモデルから導かれた。
pAbによるヒトIgG Fc結合の解離を評価するために,各試料についてED50応答を算出した。この応答については、群(NaCl群を除く全群)を固定効果として含めることによって、log10値に対して一元配置分散分析(ANOVA)モデルをあてはめた。明確な分散の不均一性は検出されなかったため、異なる群間で同一の分散を仮定した。幾何平均と幾何平均比(対応する95%CI)はこれらのモデルから導かれた。
HSV-1特異的中和抗体の力価については、群(NaCl群を除く全群)を固定効果として含めることによって、log10値に対して一元配置分散分析(ANOVA)モデルをあてはめた。明確な分散の不均一性は検出されなかったため、異なる群間で同一の分散を仮定した。幾何平均と幾何平均比(対応する95%CI)はこれらのモデルから導かれた。
探索的研究のため、多重度の調整は行っていない。
[実施例6.5]
各応答の分布は正規対数型であると仮定した。
各応答の分布は正規対数型であると仮定した。
抗HSV-1 gE/gI特異的ポリクローナル抗体(pAb)応答について、群(NaCl群を除く全群)、時点(28日目(28PI)、49日目(21PII))、及びそれらの相互作用を固定効果として含めることによって、log10力価に対して二元配置分散分析(ANOVA)モデルをあてはめる。NaCl群は応答や変動が見られなかったため、含めなかった。分散共分散モデルの選択は、AICC基準と個々のデータプロットの検討に基づいて行った。
時点の分散共分散を複合対称性行列でモデル化した:
CS-複合対称性
複合対称性は、時点間の同一の分散と同一の相関を考慮している。ワクチン群ごとに同一の分散共分散行列がモデル化され、群間で同一の分散を示している。
複合対称性は、時点間の同一の分散と同一の相関を考慮している。ワクチン群ごとに同一の分散共分散行列がモデル化され、群間で同一の分散を示している。
幾何平均とその95%CIはこのモデルから導かれる。
ANOVAモデルにNaCl群は含まれていなかったが、ワクチン接種群とNaCL対照群との比較を以下のように計算した。上記のモデルから得られたワクチン接種群の幾何平均及び95%CIを、最後の時点で、NaCl投与群全員に与えられた力価で除した。結果として得られた比は、対応する95%CIを伴う幾何平均比として理解されるべきである。
ワクチン接種群の直接比較(最後の時点)と、各群内の時点比較(PII/PI)については、すべての幾何平均比とその95%CIがモデルから導かれた。
CD4+/CD8+T細胞応答(gE又はgI特異的)の各ワクチン特異的%については、群(NaCl群を含む全群)を固定効果として含めることによって、log10頻度に対して一元配置分散分析(ANOVA)モデルをあてはめた。各応答については、異なる群で異なる分散をモデル化した。CD4+及びCD8+T細胞応答の両方の%について、NaCl閾値は、NaCl陰性対照群の刺激全体のデータのP95に基づいている。HSV-1 gECD8+T細胞の%については、すべてのワクチン接種群でほとんどの応答がP95NaCl閾値を下回ったため、モデル化は行わなかった。幾何平均と幾何平均比(対応する95%CIを伴う)はこれらのモデルから導かれた。
pAbによるヒトIgG Fc結合の解離を評価するために、各試料についてED50応答を算出した。この応答については、群(NaCl群を除く全群)を固定効果として含めることによって、log10値に対して一元配置分散分析(ANOVA)モデルをあてはめた。明確な分散の不均一性は検出されなかったため、異なる群間で同一の分散を仮定した。幾何平均と幾何平均比(対応する95%CI)はこれらのモデルから導かれた。
HSV-1特異的中和抗体の力価については、群(NaCl群を除く全群)を固定効果として含めることによって、log10値に対して一元配置分散分析(ANOVA)モデルをあてはめた。明確な分散の不均一性は検出されなかったため、異なる群間で同一の分散を仮定した。幾何平均と幾何平均比(対応する95%CI)はこれらのモデルから導かれた。
探索的研究のため、多重度の調整は行っていない。
結果
実施例6.1-gE Fc結合ドメイン内に一点の突然変異又はアミノ酸挿入を有するAS01アジュバント化組換えHSV2 gEgIタンパク質
研究デザイン
Harlan laboratory(OlaHsd)から入手した6～8週齢の雌のCB6F1純系マウスを無作為に研究群(n=8/群1～5及びn=4/群6)に割り当て、所定の病原体不在条件で組織内の動物施設で飼育した。CB6F1マウス(群1～5)は、0日目と14日目に、0.2μgのAS01(5μg)に製剤化した非突然変異型又は突然変異型のgEgIヘテロ二量体で筋肉内(i.m)に免疫した。さらに、同じ免疫化スケジュールで生理食塩水(150mM NaCl)をi.m注射したマウス群を、陰性対照群(群6)とした。
実施例6.1-gE Fc結合ドメイン内に一点の突然変異又はアミノ酸挿入を有するAS01アジュバント化組換えHSV2 gEgIタンパク質
研究デザイン
Harlan laboratory(OlaHsd)から入手した6～8週齢の雌のCB6F1純系マウスを無作為に研究群(n=8/群1～5及びn=4/群6)に割り当て、所定の病原体不在条件で組織内の動物施設で飼育した。CB6F1マウス(群1～5)は、0日目と14日目に、0.2μgのAS01(5μg)に製剤化した非突然変異型又は突然変異型のgEgIヘテロ二量体で筋肉内(i.m)に免疫した。さらに、同じ免疫化スケジュールで生理食塩水(150mM NaCl)をi.m注射したマウス群を、陰性対照群(群6)とした。
体液性免疫応答(総gEgI特異的IgG抗体及び抗体機能)を評価するために、1回目及び2回目の免疫後14日目に血清試料を採取した。最後に、2回目の免疫後14日目に脾臓を採取し、gE及びgI抗原に対する生体外の全身性CD4+/CD8+T細胞応答を評価した。
各gEgIヘテロ二量体は、非突然変異、又は後述するような突然変異を有するHSV2 gE外部ドメインをコードする配列(配列番号7)と、HSV2 gI外部ドメインをコードする配列(配列番号8)を含んでいた。
- 群1:unmut_gEgI(非突然変異gE)
- 群2:mutHSV41_gEgI(残基338と339との間にARAAの挿入)
- 群3:mutHSV45_gEgI(P317R突然変異)
- 群4:mutHSV57_gEgI(P319D突然変異)
- 群5:mutHSV61_gEgI(R320D突然変異)
- 群1:unmut_gEgI(非突然変異gE)
- 群2:mutHSV41_gEgI(残基338と339との間にARAAの挿入)
- 群3:mutHSV45_gEgI(P317R突然変異)
- 群4:mutHSV57_gEgI(P319D突然変異)
- 群5:mutHSV61_gEgI(R320D突然変異)
gE及びgI特異的IgG抗体応答
14日目(14PI)及び28日目(14PII)に血清試料を採取し、ELISAによりHSV2抗gE特異的(図44A)又はgI特異的(図44B)IgG抗体の総力価を評価した。2回の免疫後、AS01アジュバント化HSV2突然変異及び非突然変異gEgIのすべての群で、総gE特異的及びgI特異的IgG抗体の高い力価が誘導されたが、NaCl対照群では応答が検出されなかった。
14日目(14PI)及び28日目(14PII)に血清試料を採取し、ELISAによりHSV2抗gE特異的(図44A)又はgI特異的(図44B)IgG抗体の総力価を評価した。2回の免疫後、AS01アジュバント化HSV2突然変異及び非突然変異gEgIのすべての群で、総gE特異的及びgI特異的IgG抗体の高い力価が誘導されたが、NaCl対照群では応答が検出されなかった。
HSV2 MS株(ウイルス量400 TCID50)に対する中和抗体応答(ED50)を、2回目の免疫後14日目(14PII)に評価した。仮説通り、HSV2 MS株に対する中和抗体応答は、2回目の免疫後14日目(28日目)に採取した試験対象の血清のいずれにも検出されなかった(図45)。
異なるAS01アジュバント化HSV2突然変異gEgIタンパク質をマウスに2回目の免疫後14日目に採取した血清が、gE Fc結合ドメインによるhIgG結合を競合して減少させる能力を競合ELISAで評価した。この実験では、2匹のマウスの血清を、同じ抗gE IgG力価である57.345EU/mLで正規化したプールを各群で複数回行った(4プール/群)。興味深いことに、同等の抗gE IgG力価では、HSV2 gEgIタンパク質の異なる突然変異型で免疫したマウスのすべての群において、gEgIタンパク質によるhIgG Fc結合を解離させる抗gEgIポリクローナル抗体の能力は同様であると考えられた。(図46)。さらに、突然変異gEgIタンパク質で免疫したマウス群と非突然変異gEgIタンパク質で免疫したマウス群の間にも差は認められなかった。これらの結果は、gE Fc結合ドメインに1点の突然変異又はアミノ酸挿入を行ってヒトIgG Fcに対する結合力を低下させても、gEgI抗原がhIgG Fc結合を介してgEgIが媒介するHSV2の免疫回避を不利益に妨害し得る抗体応答を特異的に誘導する能力を妨げなかったことを示唆している。
全体として、gEgI特異的抗体の機能は、AS01アジュバント化HSV2突然変異gEgIタンパク質と非突然変異gEgIタンパク質で免疫したマウス群で類似していると考えられた。
CD4+及びCD8+T細胞応答
2回目(28日目)の免疫後に脾臓を採取し、gE及びgIペプチドプールでT細胞を生体外で刺激した後、gEgI特異的T細胞のパーセンテージを評価した。
2回目(28日目)の免疫後に脾臓を採取し、gE及びgIペプチドプールでT細胞を生体外で刺激した後、gEgI特異的T細胞のパーセンテージを評価した。
AS01アジュバント化HSV2非突然変異及び突然変異gEgIで免疫したマウスでは、すべての群でHSV2 gE及びgI抗原に対して強いCD4+T細胞応答が誘導された。予想通り、NaCl対照群ではgEgI特異的T細胞応答は検出されなかった(図47A)。AS01アジュバント化HSV2突然変異及び非突然変異gEgIタンパク質で免疫したマウスのいずれの群においても、2回の免疫後に一貫したgE又はgI特異的CD8+T細胞応答は誘導されなかった(図47B)。CD4+T細胞応答に対する突然変異/挿入の影響を評価するために、突然変異型gEgIで免疫したマウス群(群2～5)と非突然変異型gEgIタンパク質で免疫したマウス群(群1)との間で、gE又はgI特異的CD4+T細胞応答の%の幾何平均比(90%CIを伴う)を計算した(図48)。
実施例6.2-AS01アジュバント化組換えHSV2 gEgI突然変異体
研究デザイン
Harlan laboratory(OlaHsd)から入手した6～8週齢の雌のCB6F1純系マウスを無作為に研究群(n=6/群1～5、n=4/群6)に割り当て、所定の病原体不在条件で組織内の動物施設で飼育した。CB6F1マウス(群1～5)を、0、14、28日目に、AS01(5μg)に製剤化した5μgの異なるHSV2 gEgI突然変異体で筋肉内(i.m)に免疫した。さらに、同じ免疫化スケジュールで生理食塩水(150mM NaCl)をi.m注射したマウス群を、陰性対照群(群6)とした。
研究デザイン
Harlan laboratory(OlaHsd)から入手した6～8週齢の雌のCB6F1純系マウスを無作為に研究群(n=6/群1～5、n=4/群6)に割り当て、所定の病原体不在条件で組織内の動物施設で飼育した。CB6F1マウス(群1～5)を、0、14、28日目に、AS01(5μg)に製剤化した5μgの異なるHSV2 gEgI突然変異体で筋肉内(i.m)に免疫した。さらに、同じ免疫化スケジュールで生理食塩水(150mM NaCl)をi.m注射したマウス群を、陰性対照群(群6)とした。
HSV2 gE及びgI特異的IgG抗体応答を測定し、ワクチン特異的ポリクローナル抗体の機能を明らかにするため、初回免疫後14日目、28日目、42日目(14PI、14PII、14PIII)に血清試料を採取した。3回目の免疫後14日目に脾臓を採取し(14PIII)、HSV2 gE及びgI抗原に対する生体外の全身性CD4+/CD8+T細胞応答を評価した。
各gEgIヘテロ二量体は、後述するような突然変異を有するHSV2 gE外部ドメインをコードする配列(配列番号7)と、HSV2 gI外部ドメインをコードする配列(配列番号8)を含んでいた。
- 群1:V340W
- 群2:A248T
- 群3:A246W
- 群4:P318I
- 群5:A248T_V340W
- 群1:V340W
- 群2:A248T
- 群3:A246W
- 群4:P318I
- 群5:A248T_V340W
gE及びgI特異的IgG抗体応答
HSV2 gE及びgI特異的IgG抗体応答をELISAで調べた。
HSV2 gE及びgI特異的IgG抗体応答をELISAで調べた。
NaCl対照群と比較して、3回目の免疫後14日目にAS01アジュバント化HSV2 gEgIのすべての突然変異型によって、高いHSV2 gE又はgI特異的IgG抗体応答が誘導された(gEについてはすべてのGMRが34.000を超え、gIについてはすべてのGMRが6000を超えた)(図49)。予想通り、NaCl対照群ではgE又はgI応答は見られなかった。AS01アジュバント化HSV2 gEgI突然変異タンパク質で免疫したマウスのすべての群において、HSV2 gE及びgI特異的IgG抗体応答のレベルは、2回目の免疫後(28日目(14PII))に、1回目の免疫(14日目(14PI))と比較して増加し、その倍数は5～63倍であった。また、すべてのHSV2 gEgI突然変異体では、2回目の免疫(28日目(14PII))と比較して3回目の免疫(42日目(14PIII))でHSV2 gE特異的抗体応答の追加免疫効果が認められ、その倍数は2～4倍であった。
ワクチン特異的抗体の機能について、3回目の免疫後14日目に採取した血清でを調べた。まず、HSV2 MSウイルスを中和するpAbの能力を調べた。AS01アジュバント化HSV2 gEgIタンパク質の異なる突然変異型で免疫したマウスのすべての群で、HSV2 MS株に対する低いが一貫した中和抗体応答が検出された。(図50)。
次いで、異なるHSV2 gEgI突然変異体で免疫したマウスの血清が、HSV2 gEgIタンパク質によるhIgG Fc結合を競合して減少させる能力を、in vitroで、競合ELISAによって評価した。HSV2 gEgIのすべての異なる突然変異型は、HSV2 gEgIタンパク質によるhIgG Fc結合を減少させることができるワクチン特異的ポリクローナル抗体応答を誘発した。HSV2 gEgIタンパク質によるhIgG Fc結合の解離曲線は、すべてのマウス群間で非常によく類似していた(図51、図52)。
最後に、3回目の免疫後14日目に誘導されたワクチン特異的抗体応答の能力について、Jurkatレポーター細胞株によって発現されたマウスFcγRIIIとin vitroで結合し、活性化することを調べた。図53A～Eに示したデータは、異なる突然変異型のAS01-gEgIタンパク質で免疫したマウスのすべての群が、FcγRIIIを発現するJurkatレポーター細胞に特異的に結合し、活性化することができるHSV2 gEgI特異的抗体応答を誘導できることを示唆している。予想通り、ワクチン非接種マウスの血清ではFcγRIIIの活性化は検出されなかった。FcγRIIIの活性化に関しては、マウスの異なる群間で大きな違いは見られなかった(図53F)。
結論として、これらのデータは、AS01/HSV2 gEgIタンパク質のすべての異なる突然変異型が、FcγRIIIに結合して活性化し、HSV2 gEgIタンパク質によるヒトIgG Fc結合を減少させ、低強度のHSV2 MSウイルスを中和することができるワクチン特異的抗体を誘導できることを示唆している。
CD4+及びCD8+T細胞応答
NaCl対照群と比較して、AS01アジュバント化HSV2 gEgIの異なる突然変異型で免疫したマウスのすべての群で、3回目の免疫後14日目に高いワクチン特異的CD4+T細胞応答及びgE特異的CD8+T細胞応答が検出された。NaCl対照群と比較して、いずれのワクチン接種群でもgI特異的CD8+T細胞応答は検出されなかった(図54)。
NaCl対照群と比較して、AS01アジュバント化HSV2 gEgIの異なる突然変異型で免疫したマウスのすべての群で、3回目の免疫後14日目に高いワクチン特異的CD4+T細胞応答及びgE特異的CD8+T細胞応答が検出された。NaCl対照群と比較して、いずれのワクチン接種群でもgI特異的CD8+T細胞応答は検出されなかった(図54)。
実施例6.3-LNP-製剤化SAM HSV2 gEgI突然変異体
研究デザイン
Harlan laboratory(OlaHsd)から入手した6～8週齢の雌のCB6F1純系マウスを無作為に研究群(n=6/群1～6、n=4/群7)に割り当て、所定の病原体不在条件で組織内の動物施設で飼育した。CB6F1マウス(群1～6)を、0、21、42日目に、0.8μgの脂質ナノ粒子(LNP)に製剤化した異なるSAM HSV2 gEgI突然変異体で筋肉内(i.m)に免疫した。さらに、同じ免疫化スケジュールで生理食塩水(150mM NaCl)をi.m注射したマウス群を、陰性対照群(群7)とした。
研究デザイン
Harlan laboratory(OlaHsd)から入手した6～8週齢の雌のCB6F1純系マウスを無作為に研究群(n=6/群1～6、n=4/群7)に割り当て、所定の病原体不在条件で組織内の動物施設で飼育した。CB6F1マウス(群1～6)を、0、21、42日目に、0.8μgの脂質ナノ粒子(LNP)に製剤化した異なるSAM HSV2 gEgI突然変異体で筋肉内(i.m)に免疫した。さらに、同じ免疫化スケジュールで生理食塩水(150mM NaCl)をi.m注射したマウス群を、陰性対照群(群7)とした。
gE及びgI特異的IgG抗体応答を測定し、ワクチン特異的ポリクローナル抗体の機能を明らかにするため、初回免疫後21日目、42日目、63日目(21PI、21PII、21PIII)に血清試料を採取した。初回免疫後63日目に脾臓を採取し(21PIII)、HSV2 gE及びgI抗原に対する生体外の全身性CD4+/CD8+T細胞応答を評価した。
各gEgI突然変異体は、後述するような突然変異を有するHSV2 gE外部ドメインをコードする配列(配列番号7)と、HSV2 gI外部ドメインをコードする配列(配列番号8)を含んでいた。
- 群1:V340W
- 群2:A248T
- 群3:A246W
- 群4:P318I
- 群5:A248T_V340W
- 群6:残基338と339との間にARAAの挿入
- 群1:V340W
- 群2:A248T
- 群3:A246W
- 群4:P318I
- 群5:A248T_V340W
- 群6:残基338と339との間にARAAの挿入
gE及びgI特異的IgG抗体応答
HSV2 gE及びgIワクチン特異的IgG抗体応答をELISAで調べた。予想通り、NaCl対照群ではHSV2 gE特異的又はgI応答が見られなかった(全マウスで20EU/mL未満)のに対し、LNP-製剤化SAM HSV2 gEgIワクチン接種マウスでは、最終時点で30,000EU/mLを超える応答が見られた。3回目の免疫後21日目に、NaCl対照群と比較して、高いHSV2 gE又はgI特異的IgG抗体応答が、異なるLNP-製剤化SAM HSV2 gEgIベクターで免疫したマウスのすべての群で誘導された(図55)。LNP-製剤化SAM HSV2 gEgI突然変異体で免疫したマウスのすべての群において、HSV2 gE及びgI特異的IgG抗体応答のレベルは、2回目の免疫後(42日目(21PII))に、1回目の免疫(21日目(21PI))と比較して増加し、その倍数は2～8倍であった。
HSV2 gE及びgIワクチン特異的IgG抗体応答をELISAで調べた。予想通り、NaCl対照群ではHSV2 gE特異的又はgI応答が見られなかった(全マウスで20EU/mL未満)のに対し、LNP-製剤化SAM HSV2 gEgIワクチン接種マウスでは、最終時点で30,000EU/mLを超える応答が見られた。3回目の免疫後21日目に、NaCl対照群と比較して、高いHSV2 gE又はgI特異的IgG抗体応答が、異なるLNP-製剤化SAM HSV2 gEgIベクターで免疫したマウスのすべての群で誘導された(図55)。LNP-製剤化SAM HSV2 gEgI突然変異体で免疫したマウスのすべての群において、HSV2 gE及びgI特異的IgG抗体応答のレベルは、2回目の免疫後(42日目(21PII))に、1回目の免疫(21日目(21PI))と比較して増加し、その倍数は2～8倍であった。
ワクチン特異的抗体の機能について、3回目の免疫後21日目に採取した血清でを調べた。まず、HSV2 MSウイルスを中和するpAbの能力を調べた。異なるLNP-製剤化SAM-HSV2 gEgIベクターで免疫したマウスのすべての群で、HSV2 MS株に対する低い中和抗体応答が検出された。その結果、異なる突然変異体の間で抗体中和活性に差がないことが示唆された(GMRが2倍以下、すべてのCIが1を含む)(図56)。
次いで、異なるLNP-製剤化SAM-HSV2 gEgI突然変異体候補で免疫したマウスの血清が、HSV2 gEgIタンパク質によるhIgG Fc結合を競合して減少させる能力を、in vitroで、競合ELISAによって評価した。すべてのLNP-SAM HSV2 gEgI突然変異体は、HSV2 gEgIタンパク質によるin vitroでのhIgG Fc結合を減少させることができるワクチン特異的ポリクローナル抗体応答を誘発した。HSV2 gEgIタンパク質によるhIgG Fc結合の解離曲線は、すべてのマウス群間で非常によく類似しており、ED50を計算すると、マウス群間で類似した応答が見られた(図57、図58)。
最後に、3回目の免疫後14日目に誘導されたワクチン特異的抗体応答の能力について、Jurkatレポーター細胞株によって発現されたマウスFcγRIIIとin vitroで結合し、活性化することを調べた。図59A～Fに示したデータは、異なるLNP-SAM HSV2 gEgI突然変異体で免疫したマウスのすべての群が、FcγRIIIを発現するJurkatレポーター細胞に特異的に結合し、活性化することができるHSV2 gEgI特異的抗体応答を誘導できることを示唆していた。予想通り、ワクチン非接種マウスの血清ではFcγRIIIの活性化は検出されなかった。FcγRIIIの活性化に関しては、マウスの異なる群間で大きな違いは見られなかった(図59G)。
結論として、これらのデータは、すべての異なるLNP-SAM HSV2 gEgI突然変異体が、FcγRIIIに結合して活性化し、HSV2 gEgIタンパク質によるヒトIgG Fc結合を減少させ、低強度のHSV2 MSウイルスを中和することができるワクチン特異的抗体を誘導できることを示唆している。
CD4+及びCD8+T細胞応答
NaCl対照群と比較して、異なるLNP-製剤化SAM HSV2 gEgI突然変異体で免疫したマウスのすべての群で、高いHSV2 gI特異的CD4+T細胞応答が検出された(図60A)。高レベルのHSV2 gE特異的CD8+T細胞応答は、NaCl対照群と比較して、すべてのワクチン接種群で検出された(GMRは約100、CIは1を含まない)。NaCl陰性対照群と比較して、いずれのワクチン接種群でもHSV2 gI特異的CD8+T細胞応答は検出されなかった(図60B)。
NaCl対照群と比較して、異なるLNP-製剤化SAM HSV2 gEgI突然変異体で免疫したマウスのすべての群で、高いHSV2 gI特異的CD4+T細胞応答が検出された(図60A)。高レベルのHSV2 gE特異的CD8+T細胞応答は、NaCl対照群と比較して、すべてのワクチン接種群で検出された(GMRは約100、CIは1を含まない)。NaCl陰性対照群と比較して、いずれのワクチン接種群でもHSV2 gI特異的CD8+T細胞応答は検出されなかった(図60B)。
実施例6.4 - AS01アジュバント化組換えHSV1 gEgI突然変異体
研究デザイン
Harlan laboratory(OlaHsd)からの6～8週齢の雌性CB6F1近交系マウスを研究群(n=6/群1～6; n=4/群7)に無作為に割り当て、所定の病原体不在条件で、組織内の動物施設で飼育した。CB6F1マウス(群1～6)を、非突然変異型(群1) 5μgで又はAS01中で製剤化されたHSV1 gEgIの様々な突然変異型(群2～6)(5μg)で、0、14及び28日目に筋肉内(i.m)で免疫した。マウスのさらなる群に、同じ免疫化スケジュールで生理食塩水(NaCl 150mM)をi.m注射し、この群を陰性対照群(群7)として使用した。
研究デザイン
Harlan laboratory(OlaHsd)からの6～8週齢の雌性CB6F1近交系マウスを研究群(n=6/群1～6; n=4/群7)に無作為に割り当て、所定の病原体不在条件で、組織内の動物施設で飼育した。CB6F1マウス(群1～6)を、非突然変異型(群1) 5μgで又はAS01中で製剤化されたHSV1 gEgIの様々な突然変異型(群2～6)(5μg)で、0、14及び28日目に筋肉内(i.m)で免疫した。マウスのさらなる群に、同じ免疫化スケジュールで生理食塩水(NaCl 150mM)をi.m注射し、この群を陰性対照群(群7)として使用した。
血清試料を、プライム免疫化後13、27及び42日目(13PI、13PII、14PIII)に採取して、両方の抗HSV1 gEgI特異的IgG抗体応答を測定した。ワクチン特異的抗体の機能についても、3回目の免疫化の14日後に採取した血清試料で調べた。HSV1 gE、HSV1 gIの抗原に対するex-vivo、全身性CD4+ T細胞及びCD8+ T細胞の応答を評価するために、3回目の免疫化後の14日目(14PIII)に脾臓を採取した。
各gEgIヘテロ二量体は、下記のように、非突然変異の又は突然変異を有するHSV1 gE外部ドメイン(配列番号9)をコードする配列、及びHSV1 gI外部ドメイン(配列番号10)をコードする配列を含んだ:
- 群1: 突然変異なし
- 群2: P319R
- 群3: P321D
- 群4: R322D
- 群5: N243A_R322D
- 群6: A340G_S341G_V342G
- 群1: 突然変異なし
- 群2: P319R
- 群3: P321D
- 群4: R322D
- 群5: N243A_R322D
- 群6: A340G_S341G_V342G
gEgI特異的IgG抗体応答
HSV1 gEgI-ワクチン特異的IgG抗体応答をELISAによって調べた。予想通り、NaCl対照群ではHSV1特異的gEgI応答は観察されなかった(全てのマウスで<30EU/ml)。NaCl対照群と比較して、高い抗HSV1 gEgIワクチン特異的IgG抗体応答が、3回目の免疫化後の14日目で本研究において試験された全てのAS01アジュバント化HSV1 gEgIタンパク質(非突然変異型及び突然変異型)によって誘導された(全GMR>80,000)(図61)。HSV1 gEgIタンパク質の様々な突然変異型又は非突然変異型で免疫されたマウスの全群で、抗HSV1 gEgI特異的IgG抗体応答は、1回目の免疫化(l3日目(13PI))と比較して2回目の免疫化(27日目(13PII))後に、68から145の範囲の増加倍率で向上した。
HSV1 gEgI-ワクチン特異的IgG抗体応答をELISAによって調べた。予想通り、NaCl対照群ではHSV1特異的gEgI応答は観察されなかった(全てのマウスで<30EU/ml)。NaCl対照群と比較して、高い抗HSV1 gEgIワクチン特異的IgG抗体応答が、3回目の免疫化後の14日目で本研究において試験された全てのAS01アジュバント化HSV1 gEgIタンパク質(非突然変異型及び突然変異型)によって誘導された(全GMR>80,000)(図61)。HSV1 gEgIタンパク質の様々な突然変異型又は非突然変異型で免疫されたマウスの全群で、抗HSV1 gEgI特異的IgG抗体応答は、1回目の免疫化(l3日目(13PI))と比較して2回目の免疫化(27日目(13PII))後に、68から145の範囲の増加倍率で向上した。
ワクチン特異的抗体の機能について、3回目の免疫化後の14日目に採取した血清で調べた。最初に、HSV1ウイルスを中和するpAbの能力について調べた。HSV1 VR-1789系統に対する一貫した中レベルの中和抗体応答が、様々な型のAS01アジュバント化HSV1 gEgIタンパク質で免疫されたマウスの全群で検出された(図62)。
次いで、様々な型のHSV1 gEgIタンパク質で免疫されたマウスからの血清がHSV1 gEgIタンパク質によるhIgG Fc結合と競合しこれを減少させる能力について、競合ELISAによってin vitroで評価した。全てのHSV1 gEgIタンパク質(突然変異及び非突然変異)が、HSV1 gEgIタンパク質によるhIgG Fc結合を減少させることができるワクチン特異的ポリクローナル抗体を誘発した。同じ血清希釈で、HSV1 gEgIタンパク質上のhIgG Fc結合のレベルは、HSV1 gEgI免疫マウスの様々な群間で非常に類似していた(図63、図64)。
CD4+ T細胞及びCD8+ T細胞の応答
NaCl対照群と比較して、AS01アジュバント化HSV1 gEgIタンパク質(非突然変異型及び突然変異型)で免疫されたマウスの全群で、3回目の免疫化の14日後に、ワクチン接種群とNaCl群の間で18.5から63の範囲の増加倍率でより高いHSV1 gE及びgI特異的CD4+T細胞応答が検出された。全体として、結果が示唆するところは、HSV1 gEgIタンパク質の様々な突然変異型と非突然変異HSV1 gEgI候補物質の間での極めて類似したワクチン特異的CD4+T細胞応答である(図65A)。
NaCl対照群と比較して、AS01アジュバント化HSV1 gEgIタンパク質(非突然変異型及び突然変異型)で免疫されたマウスの全群で、3回目の免疫化の14日後に、ワクチン接種群とNaCl群の間で18.5から63の範囲の増加倍率でより高いHSV1 gE及びgI特異的CD4+T細胞応答が検出された。全体として、結果が示唆するところは、HSV1 gEgIタンパク質の様々な突然変異型と非突然変異HSV1 gEgI候補物質の間での極めて類似したワクチン特異的CD4+T細胞応答である(図65A)。
HSV1 gE特異的CD8+T細胞応答は、NaCl対照群と比較してワクチン接種群のいずれにおいても検出されず、gI特異的CD8+T細胞応答は、NaCl対照群と比較して全てのワクチン接種群で単に統一性なく検出された(図65B)。
実施例6.5 - LNP製剤化SAM HSV1 gEgI突然変異体
研究デザイン
Harlan laboratory(OlaHsd)からの6～8週齢の雌性CB6F1近交系マウスを研究群(n=6/群1～5; n=6/群6)に無作為に割り当て、所定の病原体不在条件で、組織内の動物施設で飼育した。CB6F1マウス(群1～5)を、脂質ナノ粒子(LNP)中で製剤化された様々な型のSAM HSV1 gEgI突然変異体1μgで、0及び28日目に筋肉内(i.m)で免疫した。マウスのさらなる群に、同じ免疫化スケジュールで生理食塩水(NaCl 150mM)をi.m注射し、この群を陰性対照群(群6)として使用した。
研究デザイン
Harlan laboratory(OlaHsd)からの6～8週齢の雌性CB6F1近交系マウスを研究群(n=6/群1～5; n=6/群6)に無作為に割り当て、所定の病原体不在条件で、組織内の動物施設で飼育した。CB6F1マウス(群1～5)を、脂質ナノ粒子(LNP)中で製剤化された様々な型のSAM HSV1 gEgI突然変異体1μgで、0及び28日目に筋肉内(i.m)で免疫した。マウスのさらなる群に、同じ免疫化スケジュールで生理食塩水(NaCl 150mM)をi.m注射し、この群を陰性対照群(群6)として使用した。
血清試料を、プライム免疫化後28日目及び49日目(28PI、21PII)に採取して、両方の抗HSV1 gEgI特異的IgG抗体応答を測定した。ワクチン特異的抗体の機能についても、2回目の免疫化の21日後に採取した血清試料で調べた。HSV1 gE、HSV1 gIの抗原に対するex-vivo、全身性CD4+ T細胞及びCD8+ T細胞の応答を評価するために、2回目の免疫化後の21日目(21PII)に脾臓を採取した。
各gEgIヘテロ二量体は、下記のように、突然変異を有するHSV1 gE外部ドメイン(配列番号9)をコードする配列、及びHSV1 gI外部ドメイン(配列番号10)をコードする配列を含んだ:
- 群1: P319R
- 群2: P321D
- 群3: R322D
- 群4: N243A_R322D
- 群5: A340G_S341G_V342G
- 群1: P319R
- 群2: P321D
- 群3: R322D
- 群4: N243A_R322D
- 群5: A340G_S341G_V342G
gEgI特異的IgG抗体応答
HSV1 gEgI特異的IgG抗体応答のレベルをについて、ELISAによって調べた。2回目の免疫化後の21日目、全てのLNP/SAM-HSV1 gEgIワクチン接種群は、NaCl対照群と比較して強力な抗HSV1 gEgI特異的抗体応答を発達させた(600,000EU/mLを超える応答、全GMR>18,000)。予想通り、NaCl対照群ではHSV1 gEgI特異的応答は観察されなかった(全てのマウスで<40EU/ml)。LNP製剤化SAM-HSV1 gEgIベクターの様々な突然変異型で免疫されたマウスの全群において、抗HSV1 gEgI特異的IgG抗体応答が、1回目の免疫化(28日目(28PI))と比較して、12から16の範囲の増加倍率で2回目の免疫化(49日目(21PII))後に向上した(図66)。
HSV1 gEgI特異的IgG抗体応答のレベルをについて、ELISAによって調べた。2回目の免疫化後の21日目、全てのLNP/SAM-HSV1 gEgIワクチン接種群は、NaCl対照群と比較して強力な抗HSV1 gEgI特異的抗体応答を発達させた(600,000EU/mLを超える応答、全GMR>18,000)。予想通り、NaCl対照群ではHSV1 gEgI特異的応答は観察されなかった(全てのマウスで<40EU/ml)。LNP製剤化SAM-HSV1 gEgIベクターの様々な突然変異型で免疫されたマウスの全群において、抗HSV1 gEgI特異的IgG抗体応答が、1回目の免疫化(28日目(28PI))と比較して、12から16の範囲の増加倍率で2回目の免疫化(49日目(21PII))後に向上した(図66)。
ワクチン特異的抗体の機能について、2回目の免疫化後の21日目に採取した血清で調べた。最初に、HSV1ウイルスを中和するポリクローナルAbsの能力について各群のマウスに対して調べた。HSV1 VR-1789系統に対する低いが一貫した中和抗体応答が、LNP製剤化SAM-HSV1 gEgIベクターの様々な突然変異型で免疫されたマウスの全群で検出された(図67)。
次いで、様々なLNP製剤化SAM-HSV1 gEgI突然変異体で免疫されたマウスからの血清が、HSV1 gEgIタンパク質によるhIgG Fc結合と、in vitroで、競合しこれを減少させる能力について、競合ELISAによって評価した。全てのLNP/SAM HSV1 gEgI突然変異体が、HSV1 gEgIタンパク質によるhIgG Fc結合を減少させることができるワクチン特異的ポリクローナル抗体応答を誘発した(図68、図69)。結果が示唆するところは、様々な候補物質間で、HSV1 gEgIタンパク質によるhIgG Fc結合の解離曲線に差がないことであり(全CIが1を含有してGMRは1に近い)、このことによって、全ての候補物質がHSV1 gEgIタンパク質によるhIgG Fcの解離に同様に影響を与えることができることが示唆される。
結論として、これらの結果が示唆するところは、LNP-SAM HSV1 gEgIベクターの全突然変異型が、低強度でHSV1ウイルスを中和することが可能であるとともにHSV1 gEgIタンパク質によるhIgG Fc結合を強力に減少させることが可能である、ワクチン特異的ポリクローナル抗体応答を、誘導することができることである。
CD4+ T細胞及びCD8+ T細胞の応答
NaCl対照群と比較して、LNP製剤化SAM-HSV1 gEgIベクターの様々な突然変異型で免疫されたマウスの全群で、2回目の免疫化の21日後に、より高いHSV1 gE特異的CD4+T細胞応答が検出された。NaCl対照群と比較して、LNP製剤化SAM HSV1 gEgIベクターの様々な突然変異型で免疫されたマウスの全群で、高いHSV1 gI特異的CD4+/CD8+T細胞応答が検出された。様々な突然変異体間で、ワクチン特異的CD4+T細胞及びCD8+T細胞の応答の強度に差は観察されなかった(図70)。
NaCl対照群と比較して、LNP製剤化SAM-HSV1 gEgIベクターの様々な突然変異型で免疫されたマウスの全群で、2回目の免疫化の21日後に、より高いHSV1 gE特異的CD4+T細胞応答が検出された。NaCl対照群と比較して、LNP製剤化SAM HSV1 gEgIベクターの様々な突然変異型で免疫されたマウスの全群で、高いHSV1 gI特異的CD4+/CD8+T細胞応答が検出された。様々な突然変異体間で、ワクチン特異的CD4+T細胞及びCD8+T細胞の応答の強度に差は観察されなかった(図70)。
実施例6.6 - CB6F1マウスにおけるLNP製剤化SAM gEgI P317R構築物
研究デザイン
P317R gEgIヘテロ二量体は、P317R突然変異を伴うHSV2 gE外部ドメインをコードする配列(配列番号7)及びHSV2 gI外部ドメインをコードする配列(配列番号8)を含んだ。
研究デザイン
P317R gEgIヘテロ二量体は、P317R突然変異を伴うHSV2 gE外部ドメインをコードする配列(配列番号7)及びHSV2 gI外部ドメインをコードする配列(配列番号8)を含んだ。
Harlan laboratory(OlaHsd)からの6～8週齢の雌性CB6F1近交系マウスを研究群(n=24/群1、n=8/群2～4、n=12/群5)に無作為に割り当て、所定の病原体不在条件で、組織内の動物施設で飼育した。CB6F1マウス(群1～4)を、脂質ナノ粒子(LNP)中で製剤化されたSAM-gE_P317R/gIワクチンの異なる4つの用量(群1: 5μg; 群2: 1μg; 群3: 0.1μg及び群4 0.01μg)で、0、21及び42日目に筋肉内(i.m)で免疫した。マウスのさらなる群に、同じ免疫化スケジュールで生理食塩水(NaCl 150mM)をi.m注射し、この群を陰性対照群(群5)として使用した。
1回目の免疫化後10日目及び16日目(10PI/16PI)に、LNP/SAM-gE_P317R/gI(群1)5μgで免疫された群からの8匹のマウス及びNaCl対照群(群5)からの4匹のマウスを、濾胞性BヘルパーCD4+ T(Tfh)細胞及び流入領域腸骨リンパ節(DLN)における活性化B細胞の存在に関する探索的調査向けに選別した。
次いで、1回目の(21PI)、2回目の(21PII)及び3回目の(21PIII)各免疫化後21日目に、血清試料を異なる4群(n=8 群1～4及びn=4 群5)で採取し、総抗gE特異的IgG抗体(Ab)及び総gI特異的IgG抗体(Ab)の応答を評価した。ワクチン特異的抗体の機能について、3回目の免疫化後の21日目の血清でのみ調べた。HSV-2 MSウイルスを中和し(中和アッセイ)且つHSV-2 gE/gIタンパク質上のヒトIgG Fc結合を減少させる、ワクチン特異的ポリクローナル抗体応答の能力について調べた。最後に、PIII免疫化21日目に全てのマウスを選別して、脾臓におけるgE特異的及びgI特異的T細胞応答を評価した。
gEgI特異的IgG抗体応答
NaCl対照群と比較して、より高いHSV-2 gE特異的又はHSV-2 gI特異的IgG抗体応答が、試験されたワクチン用量に関わらず、3回目の免疫化後の21日目にLNP/SAM-gE_P317R/gIヘテロ二量体で誘導された。予想通り、NaCl対照群ではgE特異的又はgI特異的応答は観察されなかった。LNP/SAM-gE_P317R/gIワクチンで免疫されたマウスの全群で、HSV-2 gE特異的及びHSV-2 gI特異的IgG抗体応答のレベルが、1回目の免疫化(21日目(21PI))と比較して3回目の免疫化(21PIII)後に向上した。gE抗体応答及びgI抗体応答の強度に正のワクチン用量効果が見られた(図71)。
NaCl対照群と比較して、より高いHSV-2 gE特異的又はHSV-2 gI特異的IgG抗体応答が、試験されたワクチン用量に関わらず、3回目の免疫化後の21日目にLNP/SAM-gE_P317R/gIヘテロ二量体で誘導された。予想通り、NaCl対照群ではgE特異的又はgI特異的応答は観察されなかった。LNP/SAM-gE_P317R/gIワクチンで免疫されたマウスの全群で、HSV-2 gE特異的及びHSV-2 gI特異的IgG抗体応答のレベルが、1回目の免疫化(21日目(21PI))と比較して3回目の免疫化(21PIII)後に向上した。gE抗体応答及びgI抗体応答の強度に正のワクチン用量効果が見られた(図71)。
ワクチン特異的抗体の機能について、3回目の免疫化後の21日目に採取した血清でのみ調べた。これに関連して、HSV-2 MSウイルスを中和し且つHSV-2 gE/gIタンパク質によるin-vitroヒトIgG Fc結合を減少させる、ポリクローナル抗体応答の能力について調べた。
HSV-2 MS系統に対する低いが一貫した中和抗体応答が、LNP/SAM-gE_P317R/gIワクチン5、1及び0.1μgで免疫されたマウスの群で検出された。HSV-2 MS中和抗体価の強度に正のワクチン用量効果が見られた(図72)。
次いで、異なる用量のLNP/SAM-gE_P317R/gIワクチンで免疫されたマウスで採取した、HSV-2 gE/gIタンパク質によるhIgG Fc結合と競合しこれを減少させる血清の能力について、競合ELISAによってin vitroで評価した。ワクチン接種マウスの全群において、ワクチン特異的ポリクローナル抗体応答は、HSV-2 gEgIタンパク質によるhIgG Fc結合を減少させることができた(図73)。正のワクチン用量効果が、HSV-2 gE/gIタンパク質によるhIgG Fc結合を減少させるワクチン特異的ポリクローナル抗体応答の能力でも見いだされた(図74)。
結論として、これらのデータが示唆するところは、LNP/SAM-gE_P317R/gIワクチンが、HSV-2 gE/gIタンパク質によるヒトIgG Fc結合を減少させることが可能であるとともに低強度でHSV-2 MSウイルスを中和することが可能であるワクチン特異的抗体を誘導することができることである。最後に、正のワクチン用量効果が抗体応答及び抗体機能のレベルで観察された。
細胞性免疫応答
NaCl対照群と比較して、異なる用量のLNP/SAM gE_P317R/gIで免疫されたマウスの全群において、3回目の免疫化の21日後に、より高いgI特異的CD4+T細胞応答及びgE特異的CD8+T細胞応答が検出された。非常に低レベルのgE特異的CD4+T細胞が、NaCl対照群と比較してのLNP/SAM-gE_P317R/gIワクチン5又は1μgで免疫されたマウスの群で検出された。gI特異的CD8+T細胞応答は、LNP/SAM-gE_317R/gIワクチンで免疫されたマウスの群では検出されなかった(図75、図76)。正のワクチン用量効果が、gI特異的CD4+T細胞応答及びgE特異的CD8+T細胞応答の強度で見いだされた。
NaCl対照群と比較して、異なる用量のLNP/SAM gE_P317R/gIで免疫されたマウスの全群において、3回目の免疫化の21日後に、より高いgI特異的CD4+T細胞応答及びgE特異的CD8+T細胞応答が検出された。非常に低レベルのgE特異的CD4+T細胞が、NaCl対照群と比較してのLNP/SAM-gE_P317R/gIワクチン5又は1μgで免疫されたマウスの群で検出された。gI特異的CD8+T細胞応答は、LNP/SAM-gE_317R/gIワクチンで免疫されたマウスの群では検出されなかった(図75、図76)。正のワクチン用量効果が、gI特異的CD4+T細胞応答及びgE特異的CD8+T細胞応答の強度で見いだされた。
1回目の免疫化の10日及び16日後、LNP/SAM-gE_P317R/gIワクチンで免疫された8匹のマウス及びNaCl対照群の4匹のマウスを選別して、B濾胞性ヘルパーCD4+T細胞(Tfh - CD4+/CXCR5+/PD-1+/Bcl6+)及び腸骨流入領域リンパ節における活性化B細胞(CD19+/CXCR5+/Bcl6+)の存在について調べた。NaCl対照群と比較して、LNP/SAM-gE_P317R/gIワクチン5μgで免疫されたマウスの群では、1回目の免疫化後の10及び16日目に流入領域リンパ節でより高い頻度のTfh細胞及び活性化B細胞が検出された(図77)。NaCl対照群では応答は検出されなかった。
Claims (23)
- ウイルスに感染した対象を治療する際の使用のための、前記ウイルス由来のFc受容体又はその免疫原性断片。
- 前記Fc受容体はヘルペスウイルス由来である、好ましくはHSV2、HSV1又はHCMV由来である、請求項1に記載の使用のためのFc受容体又はその免疫原性断片。
- 前記Fc受容体はHSV2 gE2、HSV1 gE1、HCMV gp34及びHCMV gp68から選択される、請求項2に記載の使用のためのFc受容体又はその免疫原性断片。
- 前記Fc受容体又はその免疫原性断片は、HSV2 gE2外部ドメイン、HSV1 gE1外部ドメイン、HCMV gp34外部ドメイン及びHCMV gp68外部ドメインから選択される、請求項1から3のいずれか一項に記載の使用のためのFc受容体又はその免疫原性断片。
- 前記Fc受容体又はその免疫原性断片は、配列番号7に示されるアミノ酸配列を有するHSV2 gE2外部ドメイン、又はそれと少なくとも90%同一であるそのバリアントである、請求項4に記載の使用のためのFc受容体又はその免疫原性断片。
- 前記Fc受容体又はその免疫原性断片は、前記ウイルス由来の結合パートナー又はその断片とのヘテロ二量体の一部であり、好ましくは、
- Fc受容体はHSV2 gE2若しくはその免疫原性断片であり、結合パートナーはHSV2 gI2若しくはその断片であるか、又は
- Fc受容体はHSV1 gE1若しくはその免疫原性断片であり、結合パートナーはHSV1 gI1若しくはその断片である、
請求項5に記載の使用のためのFc受容体又はその免疫原性断片。 - 前記結合パートナー又はその断片は、HSV2 gI2外部ドメイン及びHSV1 gI1外部ドメインから選択される、請求項6に記載の使用のためのFc受容体又はその免疫原性断片。
- 前記結合パートナー又はその断片は、配列番号8に示されるアミノ酸配列を有するHSV2 gI2外部ドメイン、又はそれと少なくとも90%同一であるそのバリアントである、請求項7に記載の使用のためのFc受容体又はその免疫原性断片。
- 前記結合パートナー又はその断片は、アジュバント、好ましくはTLR4アゴニスト及び免疫学的に活性なサポニンを含むアジュバント、より好ましくはリポソーム製剤中に3D-MPL及びQS21を含むアジュバントと一緒に対象に投与される、
請求項1から8のいずれか一項に記載の使用のためのFc受容体又はその免疫原性断片。 - 前記使用は免疫優性ウイルス抗原の対象への投与を含まず、
特にFc受容体がHSV2 gE2又はHSV1 gE1である場合、Fc受容体又はその免疫原性断片は、HSV2 gD2若しくはHSV1 gD1(それぞれ)又は免疫優性領域を含むその断片と一緒に対象に投与されない、
請求項1から9のいずれか一項に記載の使用のためのFc受容体又はその免疫原性断片。 - 前記Fc受容体はVZV gEではない、請求項1から10のいずれか一項に記載の使用のためのFc受容体又はその免疫原性断片。
- 前記Fc受容体はHSV2 gE2及びHSV1 gE1から選択され、
前記Fc受容体は、(それぞれ)HSV2 gC2若しくはその免疫優性断片又はHSV1 gC1若しくはその免疫原性断片と一緒に対象に投与される、
請求項1から11のいずれか一項に記載の使用のためのFc受容体又はその免疫原性断片。 - 組換えウイルスFcR又はその免疫原性断片であって、前記組換えウイルスFcR又はその免疫原性断片のヒト抗体Fcドメインに結合する能力が、対応する天然ウイルスFc受容体と比較して減少又は消失している、組換えウイルスFcR又はその免疫原性断片。
- HSV2 gE2又はその免疫原性断片であり、前記HSV2 gE2又はその免疫原性断片は、289_インサートADIGL;338_インサートARAA;H245K;P317R;P319R;P319G;P319K;H245A_P319R;H245A_P319G;H245A_P319K;H245A_P319T;P319D;S338D;R320D;N241A_R320D;A248K_V340M;P318Y;A248K_V340R;A248T_V340W;A248K_V340W;A246W_R320G;A246W_P317K;A246W_R320D;A246W_R320T;V340W;A248G_V340W;H245G_R320D;P318D;A246W_P317F;P319G_V340W;A248T_V340M;P317K_V340W;V340F;V340D;H245A_R320D;P317F_V340W;A246W_P317S;H245S_R320D;R314G_P318D;A248T;P318S;P317K;P317S_V340W;H245D;R314P_V340W;R314L_318D;P319L_V340W;P317F;P318D_S338G;R314G_V340W;P317K_S338H;R314L_V340W;P318R;P318Q;P317F_S338G;R314G_P318I;H245G_P319G;P317L;P318I;A248T_F322A;H245E;P318T;P318R_S338G;P318D_S338H;P317F_S338H;A248T_V340R;A248T_F322I;H245A_R320G;P318R_S338H;H245S_R320G;P317K_S338G;A248T_F322P;V340R;R314L_P318R;H245S_R320T;R314G_P318R;R320E;H245G_R320G;H245A_R320T;A246W;P318I_S338G;P317K_V340M;P317I;R320H;R314P_P318I;P318I_S338H;P317F_V340M;H245A_P319G;H245A_P319L;R320P;H245G_R320T;R314L_V340R;P319G_V340R;R314G_F322I;R314L_P318I;R320A;R314N;P317F_V340R;P318D_S338L;A248G_V340R;R314E;R314P_P318D;H245S_P319G;V340Q;A248K_F322I;R320G;H245S_P319L;R314F;P319L;P317K_S338L;P319L_V340M;P317G;R320S;R320Q;R314P_V340R;V340A;H245G_P319L;R320T;R314P_P318R;A248G_F322I;R320N;P317N;R314D;R314Y;R314P_F322I;P319G_V340M;P317S_V340R;R314V;P317R_P319D;P317R_R320D;P319D_R320D;Δ319_Δ320;P317G_P318G_Δ319_Δ320;P318E_Δ319_Δ320;P318G_Δ319_Δ320;P318K_Δ319_Δ320;P317R_P318E_Δ319_320;P317R_P318G_Δ319_Δ320及びP317G_P318K_Δ319_Δ320から選択される、配列番号1に示される配列に関する突然変異又は突然変異の組合せを含む、請求項13に記載の組換えウイルスFcR又はその免疫原性断片。
- 治療での使用のための、HSVウイルス由来のFc受容体又はその免疫原性断片及び前記HSVウイルス由来の結合パートナー又はその断片を含むか、又はそれらからなるヘテロ二量体。
- - Fc受容体はHSV2 gE2であり、結合パートナーはHSV2 gI2であるか、又は
- Fc受容体はHSV1 gE1であり、結合パートナーはHSV1 gI1である、
請求項15に記載の使用のためのヘテロ二量体。 - HSVウイルス由来のFc受容体又はその免疫原性断片、前記HSVウイルス由来の結合パートナー又はその断片、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
- - Fc受容体はHSV2 gE2であり、結合パートナーはHSV2 gI2であるか、又は
- Fc受容体はHSV1 gE1であり、結合パートナーはHSV1 gI1である、
請求項17に記載の医薬組成物。 - 治療での使用のための、請求項1から12のいずれか一項に記載のウイルスFc受容体若しくはその免疫原性断片、請求項13若しくは14に記載の組換えウイルスFc受容体若しくはその免疫原性断片、又は請求項15に記載のヘテロ二量体をコードする核酸。
- 請求項15に記載のヘテロ二量体をコードしており、
ここで、ウイルスFcR又はその免疫原性断片及びこれの結合パートナー又はその断片をコードする配列が、内部リボソーム侵入部位(IRES)配列によって隔てられている、
請求項19に記載の核酸。 - 前記核酸がRNA分子である、請求項19又は20に記載の使用のための核酸。
- 前記RNA分子は自己増幅性RNA分子である、請求項21に記載の使用のための核酸。
- 前記RNA分子又は自己増幅RNA分子は、例えばカチオン性ナノエマルジョン(CNE)又は脂質ナノ粒子(LNP)を形成するように、非ウイルス性送達材料を伴う、請求項21又は22に記載の使用のための核酸。
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