JP2017205126A - 抗原送達プラットフォーム - Google Patents

Abstract

【課題】抗原送達プラットフォームの提供。
【解決手段】本開示は、ヘルペスウイルスタンパク質、特にｉｎ ｖｉｖｏにおいて複合
体を形成するタンパク質を細胞に送達するためのプラットフォームを提供する。いくつか
の実施形態では、これらのタンパク質およびそれらが形成する複合体は、強力な中和抗体
を引き起こす。したがって、開示されるプラットフォームを使用するヘルペスウイルスタ
ンパク質の提示は、ワクチン開発に有用な広く強力な免疫応答の生成を可能にする。一態
様では、本発明は、第１のヘルペスウイルス（たとえばＣＭＶ）タンパク質またはその断
片をコードする第１の配列および第２のヘルペスウイルス（たとえばＣＭＶ）タンパク質
またはその断片をコードする第２の配列を含有する組換えポリシストロニック核酸分子で
ある。
【選択図】なし

Description

関連出願
この出願は、２０１０年１０月１１日に出願された米国仮特許出願第６１／３９１，９
６０号（この全体の教示は、参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。

ヘルペスウイルスは、蔓延しており、最悪の場合、主に、免疫無防備状態の個体（たと
えば移植レシピエントおよびＨＩＶに感染した個体）において、実質的な病的状態および
死亡に至り得る、ヒトにおける広範囲の疾患を引き起こす。ヒトは、少なくとも８つのヘ
ルペスウイルスによる感染に感受性である。単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１、Ｈ
ＨＶ−１）、単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２、ＨＨＶ−２）、および水痘帯状疱
疹ウイルス（ＶＺＶ、ＨＨＶ−３）は、アルファサブファミリーウイルスであり、サイト
メガロウイルス（ＣＭＶ、ＨＨＶ−５）ならびにロゼオロウイルス（ＨＨＶ−６およびＨ
ＨＶ−７）は、ベータサブファミリーウイルスであり、エプスタインバーウイルス（ＥＢ
Ｖ、ＨＨＶ−４）およびカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ、ＨＨＶ−８）は、
ヒトに感染するガンマサブファミリーウイルスである。

ＣＭＶ感染は、免疫無防備状態の個体（たとえば移植レシピエントおよびＨＩＶに感染
した個体）において、実質的な病的状態および死亡に至り、先天性感染症は、新生児にお
いて、神経学的な発生において重篤な欠陥をもたらし得る。ＣＭＶエンベロープ糖タンパ
ク質ｇＢ、ｇＨ、ｇＬ、ｇＭ、およびｇＮは、それらがウイルス表面上に発現されるので
、魅力的なワクチン候補を代表し、防御的なウイルス中和体液性免疫応答を引き起こすこ
とができる。いくつかのＣＭＶワクチン戦略は、有力な抗体応答を誘発することができる
主な表面糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）を標的にしてきた。（非特許文献１）。ＣＭＶ糖タンパ
ク質ｇＢは、中和抗体応答を誘発することができ、ＣＭＶ陽性患者由来の血清における線
維芽細胞の感染を中和する抗体の大部分は、ｇＢに対して指向性である（非特許文献２）
。同様に、ｇＨおよびｇＭ／ｇＮは、自然感染に対する免疫応答の標的であることが報告
されている（非特許文献３；非特許文献４）。

ＣＭＶタンパク質の複合体もまた、それらがウイルス生活環における重要なプロセスに
関与するように思われるので、魅力的なワクチン候補である。たとえば、ｇＨ／ｇＬ／ｇ
Ｏ複合体は、線維芽細胞および上皮／内皮細胞侵入の両方において重要な役割を有するよ
うに思われる。一般的なモデルは、ｇＨ／ｇＬ／ｇＯ複合体が線維芽細胞の感染を媒介す
ることを示唆する。ｈＣＭＶ ｇＯヌル突然変異体は、線維芽細胞上に小さなプラークお
よび非常に低い力価のウイルスを産生し、侵入における役割を示す（Ｄｕｎｎ（２００３
年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １００巻：１４２２３
〜２８頁；Ｈｏｂｏｍ（２０００年）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．７４巻：７７２０〜２９頁）。
最近の研究は、ｇＯが、ｇＨ／ｇＬと共にビリオンの中に組み込まれないが、分子シャペ
ロンとして作用し得、ＥＲからゴルジ体へのｇＨ／ｇＬエクスポートおよびビリオンの中
への組み込みを増大させることを示唆する（Ｒｙｃｋｍａｎ（２００９年）Ｊ． Ｖｉｒ
ｏｌ ８２巻：６０〜７０頁）。パルスチェイス実験によって、少量のｇＯは、長い期間
、ｇＨ／ｇＬに結合したままであるが、ほとんどのｇＯは、それが細胞外のビリオンにお
いて見いだされずまた細胞から分泌もされないので、ｇＨ／ｇＬ／ｇＯ複合体から解離す
るおよび／または分解されることが示された。ｇＯをＣＭＶ（ＴＲ）の臨床株から欠失さ
せた場合、それらのウイルス粒子は、ビリオンの中に組み込まれるｇＨ／ｇＬの量が著し
く低下した。さらに、また、ｇＯをＴＲウイルスから欠失させると、上皮および内皮細胞
への侵入をも阻害され、ｇＨ／ｇＬもまた、上皮／内皮細胞侵入に必要とされることが示
唆された（Ｗｉｌｌｅ（２０１０年）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．８４巻（５号）：２５８５〜９
６頁）。

ＣＭＶ ｇＨ／ｇＬはまた、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１Ａ（本明細書
でＵＬ１３１とも呼ばれる）と結合することができ、上皮細胞、内皮細胞、および樹状細
胞を含むいくつかの細胞型への侵入に必要とされる五量体複合体を形成する（Ｈａｈｎら
（２００４年）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．７８巻（１８号）：１００２３〜３３頁；Ｗａｎｇお
よびＳｈｅｎｋ（２００５年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ
１０２巻（５０号）：１８１５３〜８頁；Ｇｅｒｎａら（２００５年）．Ｊ． Ｇｅｎ．
Ｖｉｒｏｌ．８４巻（Ｐｔ ６）：１４３１〜６頁；Ｒｙｃｋｍａｎら（２００８年）
Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．８２巻：６０〜７０頁）。対照的に、この複合体は、線維芽細胞の感
染に必要とされない。実験用ｈＣＭＶ分離株は、ＵＬ１２８〜ＵＬ１３１遺伝子座におい
て突然変異を持ち、突然変異は、培養線維芽細胞におけるほんの数回の継代後に臨床分離
株において生じる（Ａｋｔｅｒら（２００３年）Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ．８４巻（
Ｐｔ ５）：１１１７〜２２頁）。自然感染の間に、五量体複合体は、非常に高い効力で
、上皮細胞、内皮細胞（および五量体複合体がウイルス侵入を媒介する潜在的な任意の他
の細胞型）の感染を中和する抗体を誘発する（Ｍａｃａｇｎｏら（２０１０年）Ｊ． Ｖ
ｉｒｏｌ．８４巻（２号）：１００５〜１３頁）。この複合体に対する抗体が、上皮細胞
の感染を中和するヒト血清の能力に著しく寄与するようにも思われる（Ｇｅｎｉｎｉら（
２０１１年）Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｖｉｒｏｌ．５２巻（２号）：１１３〜８頁）。

特許文献１は、ｇＨおよびｇＬを含有するある種のＣＭＶタンパク質複合体を作製する
方法を開示する。複合体は、ｇＨおよびｇＬが同時発現されるように、ｇＨをコードする
ＤＮＡ構築物およびｇＬをコードするＤＮＡ構築物を細胞の中に導入することによって産
生される。

特許文献２は、ＣＭＶタンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子を記載する。この文書
によれば、異なるＣＭＶタンパク質をコードする別個のＤＮＡ分子の組み合わせは、コー
ドされるＣＭＶタンパク質の同時発現を引き起こすために細胞の中に導入することができ
る。ｇＭおよびｇＮがこのように同時発現された場合、それらは、ジスルフィド結合した
複合体を形成した。ｇＭ／ｇＮ複合体を産生するＤＮＡ構築物またはｇＢをコードするＤ
ＮＡ構築物により免疫化されたウサギは、等価な中和抗体応答をもたらした。

米国特許第５，７６７，２５０号明細書 国際公開第２００４／０７６６４５号

ＧｏおよびＰｏｌｌａｒｄ、ＪＩＤ（２００８年）１９７巻：１６３１〜１６３３頁 Ｂｒｉｔｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９０年）６４：１０７９〜８５ Ｕｒｂａｎら、Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ．（１９９６年）７７巻（Ｐｔ．７）：１５３７〜４７頁 Ｍａｃｈら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．（２０００年）７４巻（２４号）：１１８８１〜９２頁

２つ以上のヘルペスウイルスタンパク質をコードする核酸、同じ細胞において２つ以上
のヘルペスウイルスタンパク質を発現する方法、およびより良好な免疫応答をもたらす免
疫化方法に対する必要性が存在する。

本発明は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）タンパク質などの２つ以上のヘルペスウイ
ルスタンパク質、特に、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて複合体を形成するタンパク質を細胞に同
時送達（ｃｏ−ｄｅｌｉｖｅｒｙ）するためのプラットフォームに関する。一態様では、
本発明は、第１のヘルペスウイルス（たとえばＣＭＶ）タンパク質またはその断片をコー
ドする第１の配列および第２のヘルペスウイルス（たとえばＣＭＶ）タンパク質またはそ
の断片をコードする第２の配列を含有する組換えポリシストロニック核酸分子である。

たとえば、本発明は、ａ）ヘルペスウイルス由来の第１のタンパク質またはその断片を
コードする第１のヌクレオチド配列およびｂ）ヘルペスウイルス由来の第２のタンパク質
またはその断片をコードする第２のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む自己
複製ＲＮＡ分子を提供する。自己複製ＲＮＡ分子が適した細胞の中に導入された場合に、
第１および第２のヘルペスウイルスタンパク質またはその断片が、第１および第２のタン
パク質または断片を含有する細胞において複合体を形成するのに十分な量で産生されるよ
うに、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列が１つまたは複数の制御エ
レメントに作動可能に連結されている。好ましくは、第１のタンパク質および第２のタン
パク質は、同じタンパク質でも同じタンパク質の断片でもなく、第１のタンパク質は、第
２のタンパク質の断片ではなく、第２のタンパク質は、第１のタンパク質の断片ではない
。第１のヌクレオチド配列は、第１の制御エレメントに作動可能に連結することができ、
第２のヌクレオチド配列は、第２の制御エレメントに作動可能に連結することができる。

自己複製ＲＮＡ分子は、当該ヘルペスウイルス由来の第３のタンパク質またはその断片
をコードする第３のヌクレオチド配列、任意選択で、当該ヘルペスウイルス由来の第４の
タンパク質またはその断片をコードする第４のヌクレオチド配列、および任意選択で、当
該ヘルペスウイルス由来の第５のタンパク質またはその断片をコードする第５のヌクレオ
チド配列をさらに含むことができる。ヘルペスウイルス由来の追加のタンパク質または断
片をコードする配列（つまり第３のヌクレオチド配列、第４のヌクレオチド配列、および
第５のヌクレオチド配列）が存在する場合、これらの配列は、１つまたは複数の制御エレ
メントに作動可能に連結されている。ペンタシストロニック（ｐｅｎｔａｃｉｓｔｒｏｎ
ｉｃ）構築物の一例では、第１のヌクレオチド配列は、第１の制御エレメントに作動可能
に連結され、第２のヌクレオチド配列は、第２の制御エレメントに作動可能に連結され、
第３のヌクレオチド配列は、第３の制御エレメントに作動可能に連結され、第４のヌクレ
オチド配列は、第４の制御エレメントに作動可能に連結され、第５のヌクレオチド配列は
、第５の制御エレメントに作動可能に連結されている。構築物中に存在する制御エレメン
ト（たとえば第１、第２、第３、第４、および第５の制御エレメント）は、サブゲノム（
ｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ）プロモーター、ＩＲＥＳ、およびウイルス（たとえばＦＭＤＶ）
２Ａ部位から成る群から独立して選択することができる。

ヘルペスウイルスは、ＨＳＶ−１、１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ１型、ＥＢＶ２型
、ＣＭＶ、ＨＨＶ−６ Ａ型、ＨＨＶ−６ Ｂ型、ＨＨＶ−７、およびＨＨＶ−８であり
得る。いくつかの実施形態では、組換えポリシストロニック核酸分子（たとえば自己複製
ＲＮＡ）は、これらのヘルペスウイルスのいずれか１つのｇＨまたはその断片およびｇＬ
またはその断片をコードする。より特定の実施形態では、ヘルペスウイルスは、ＣＭＶま
たはＶＺＶである。

組換えポリシストロニック核酸分子（たとえば自己複製ＲＮＡ）が、２つ以上のＶＺＶ
タンパク質をコードする場合、タンパク質は、ｇＢ、ｇＥ、ｇＨ、ｇＩ、ｇＬ、およびそ
の断片（たとえば少なくとも１０アミノ酸の）から成る群から選択することができる。い
くつかの実施形態では、組換えポリシストロニック核酸分子（たとえば自己複製ＲＮＡ）
は、ＶＺＶ ｇＨまたはその断片およびＶＺＶ ｇＬまたはその断片をコードする。

具体例では、本発明は、ａ）第１のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）タンパク質または
その断片をコードする第１の配列およびｂ）第２のＣＭＶタンパク質またはその断片をコ
ードする第２の配列を含むポリヌクレオチドを含む自己複製ＲＮＡ分子を提供する。自己
複製ＲＮＡ分子が適した細胞の中に導入された場合に、第１および第２のＣＭＶタンパク
質が、第１および第２のＣＭＶタンパク質または断片を含有する細胞において複合体を形
成するのに十分な量で産生されるように、第１の配列および第２の配列が１つまたは複数
の制御エレメントに作動可能に連結されている。

第１のＣＭＶタンパク質および第２のＣＭＶタンパク質は、ｇＢ、ｇＨ、ｇＬ；ｇＯ；
ｇＭ、ｇＮ；ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１、および前述のもののいずれか１つの
断片から成る群から独立して選択される。好ましくは、第１のＣＭＶタンパク質および第
２のＣＭＶタンパク質は、同じタンパク質でも同じタンパク質の断片でもなく、第１のＣ
ＭＶタンパク質は、第２のＣＭＶタンパク質の断片ではなく、第２のＣＭＶタンパク質は
、第１のＣＭＶタンパク質の断片ではない。所望の場合、自己複製ＲＮＡ分子は、第３の
ＣＭＶタンパク質をコードする第３の配列をさらに含むことができ、第３の配列は、制御
エレメントに作動可能に連結されている。同様に、追加のＣＭＶタンパク質をコードする
追加の配列（たとえば第４のＣＭＶタンパク質をコードする第４の配列、第５のＣＭＶタ
ンパク質をコードする第５の配列）を含むことができる。制御エレメントは、サブゲノム
プロモーターおよびＩＲＥＳおよびウイルス２Ａ部位から成る群から独立して選択するこ
とができる。

いくつかの実施形態では、自己複製核酸分子は、ＣＭＶタンパク質ｇＨおよびｇＬをコ
ードする。他の実施形態では、自己複製ＲＮＡ分子は、ＣＭＶタンパク質ｇＨ、ｇＬ、お
よびｇＯをコードする。他の実施形態では、自己複製ＲＮＡ分子は、ＣＭＶタンパク質ｇ
Ｈ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１をコードする。

自己複製ＲＮＡ分子は、アルファウイルスレプリコンであり得る。そのような場合には
、アルファウイルスレプリコンは、アルファウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の形態で
送達することができる。自己複製ＲＮＡ分子はまた、「裸の」ＲＮＡ分子の形態とするこ
ともできる。

本発明はまた、本明細書において記載される自己複製ＲＮＡ分子をコードする組換えＤ
ＮＡ分子にも関する。いくつかの実施形態では、組換えＤＮＡ分子は、プラスミドである
。いくつかの実施形態では、組換えＤＮＡ分子は、コードされる自己複製ＲＮＡ分子の転
写を駆動する哺乳動物プロモーターを含む。

本発明はまた、本明細書において記載される自己複製ＲＮＡ分子および薬学的に許容さ
れるビヒクルを含む組成物にも関する。自己複製ＲＮＡ分子は、「裸の」ものであり得る
。いくつかの実施形態では、組成物は、ＣＭＶタンパク質ｇＨおよびｇＬをコードする自
己複製ＲＮＡ分子を含む。他の実施形態では、組成物は、ＣＭＶタンパク質ｇＢをコード
する自己複製ＲＮＡ分子をさらに含む。組成物はまた、リポソーム、ポリマーナノ粒子、
水中油型カチオン性ナノエマルジョン、またはその組み合わせなどのＲＮＡ送達系を含有
することができる。たとえば、自己複製ＲＮＡ分子は、リポソーム中に被包され得る。

ある実施形態では、組成物は、２つ以上のＣＭＶタンパク質をコードするアルファウイ
ルスレプリコンを含有するＶＲＰを含む。いくつかの実施形態では、ＶＲＰは、ＣＭＶ
ｇＨおよびｇＬをコードするレプリコンを含む。所望の場合、組成物は、ＣＭＶ ｇＢを
コードするレプリコンを含有する第２のＶＲＰをさらに含むことができる。組成物はまた
、アジュバントをも含むことができる。

本発明はまた、ＣＭＶタンパク質複合体を形成するための方法にも関する。いくつかの
実施形態では、２つ以上のＣＭＶタンパク質をコードする自己複製ＲＮＡは、細胞に送達
され、細胞は、ＣＭＶタンパク質の発現に適した条件下で維持され、ここで、ＣＭＶタン
パク質複合体が形成される。他の実施形態では、２つ以上のＣＭＶタンパク質をコードす
る自己複製ＲＮＡを含有するＶＲＰは、細胞に送達され、細胞は、ＣＭＶタンパク質の発
現に適した条件下で維持され、ここでＣＭＶタンパク質複合体が形成される。方法は、ｉ
ｎ ｖｉｖｏにおいて、細胞においてＣＭＶタンパク質複合体を形成するために使用する
ことができる。

本発明はまた、個体において免疫応答を誘発するための方法にも関する。いくつかの実
施形態では、２つ以上のＣＭＶタンパク質をコードする自己複製ＲＮＡは、個体に投与さ
れる。自己複製ＲＮＡ分子は、リポソームなどのＲＮＡ送達系を含有する組成物として投
与することができる。他の実施形態では、２つ以上のＣＭＶタンパク質をコードする自己
複製ＲＮＡを含有するＶＲＰは、個体に投与される。好ましい実施形態では、自己複製Ｒ
ＮＡ分子は、ＣＭＶタンパク質ｇＨおよびｇＬをコードする。好ましくは、誘発された免
疫応答は、中和抗ＣＭＶ抗体の産生を含む。より好ましくは、中和抗体は、補体非依存性
である。

本発明はまた、細胞の中へのＣＭＶ侵入を阻害するための方法であって、細胞をｇＨお
よびｇＬなどの２つ以上のＣＭＶタンパク質をコードする自己複製ＲＮＡ分子と接触させ
ることを含む方法にも関する。細胞は、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、およびその組
み合わせから成る群から選択することができる。いくつかの実施形態では、細胞は、２つ
以上のＣＭＶタンパク質をコードする自己複製ＲＮＡを含有するＶＲＰと接触させられる
。

本発明はまた、免疫応答を誘発するまたは細胞の中へのＣＭＶ侵入を阻害するために、
細胞においてＣＭＶタンパク質複合体を形成する、２つ以上のＣＭＶタンパク質をコード
する自己複製ＲＮＡ分子（たとえばＶＲＰ、自己複製ＲＮＡ分子を含む組成物、およびリ
ポソーム）の使用にも関する。
例えば、本願発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
ａ）ヘルペスウイルス由来の第１のタンパク質もしくはその断片をコードする第１のヌ
クレオチド配列またはその断片および
ｂ）上記ヘルペスウイルス由来の第２のタンパク質もしくはその断片をコードする第２
のヌクレオチド配列またはその断片
を含むポリヌクレオチドを含む自己複製ＲＮＡ分子であって、
上記自己複製ＲＮＡ分子が適した細胞の中に導入された場合に、上記第１のヘルペスウ
イルスタンパク質またはその断片および上記第２のヘルペスウイルスタンパク質またはそ
の断片が、上記第１のタンパク質または断片および上記第２のタンパク質または断片を含
有する上記細胞における複合体の形成に十分な量で産生されるように、上記第１のヌクレ
オチド配列および上記第２のヌクレオチド配列が１つまたは複数の制御エレメントに作動
可能に連結されている、自己複製ＲＮＡ分子。
（項目２）
上記第１のタンパク質および上記第２のタンパク質が、同じタンパク質でも同じタンパ
ク質の断片でもなく、上記第１のタンパク質が、上記第２のタンパク質の断片ではなく、
上記第２のタンパク質が、上記第１のタンパク質の断片ではないという条件を有する、項
目１に記載の自己複製ＲＮＡ分子。
（項目３）
上記第１のヌクレオチド配列が、第１の制御エレメントに作動可能に連結され、上記第
２のヌクレオチド配列が、第２の制御エレメントに作動可能に連結されている、項目１ま
たは２に記載の自己複製ＲＮＡ分子。
（項目４）
上記ヘルペスウイルス由来の第３のタンパク質またはその断片をコードする第３のヌク
レオチド配列をさらに含み、上記第３のヌクレオチド配列は、制御エレメントに作動可能
に連結されている、項目１〜３のいずれか一項に記載の自己複製ＲＮＡ分子。
（項目５）
上記第３のヌクレオチド配列が、第３の制御エレメントに作動可能に連結されている、
項目４に記載の自己複製ＲＮＡ分子。
（項目６）
上記ヘルペスウイルス由来の第４のタンパク質またはその断片をコードする第４のヌク
レオチド配列をさらに含み、上記第４のヌクレオチド配列が、制御エレメントに作動可能
に連結されている、項目４または５に記載の自己複製ＲＮＡ分子。
（項目７）
上記第４のヌクレオチド配列が、第４の制御エレメントに作動可能に連結されている、
項目６に記載の自己複製ＲＮＡ分子。
（項目８）
上記ヘルペスウイルス由来の第５のタンパク質またはその断片をコードする第５のヌク
レオチド配列をさらに含み、上記第５のヌクレオチド配列が、制御エレメントに作動可能
に連結されている、項目６または７に記載の自己複製ＲＮＡ分子。
（項目９）
上記第５のヌクレオチド配列が、第５の制御エレメントに作動可能に連結されている、
項目８に記載の自己複製ＲＮＡ分子。
（項目１０）
上記制御エレメントが、サブゲノムプロモーター、ＩＲＥＳ、およびウイルス２Ａ部位
から成る群から独立して選択される、項目１〜９のいずれか一項に記載の自己複製ＲＮＡ
分子。
（項目１１）
上記ヘルペスウイルスが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）である、項目１〜１０のい
ずれか一項に記載の自己複製ＲＮＡ分子。
（項目１２）
上記第１のタンパク質または断片、上記第２のタンパク質または断片、上記第３のタン
パク質または断片、上記第４のタンパク質または断片、および上記第５のタンパク質また
は断片が、ｇＢ、ｇＨ、ｇＬ；ｇＯ；ｇＭ、ｇＮ；ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１
、および前述のもののいずれか１つの断片から成る群から独立して選択される、項目１１
に記載の自己複製ＲＮＡ分子。
（項目１３）
上記第１のタンパク質または断片が、ｇＨまたはその断片であり、上記第２のタンパク
質または断片が、ｇＬまたはその断片である、項目１１に記載の自己複製ＲＮＡ分子。
（項目１４）
上記第１のタンパク質または断片が、ｇＨまたはその断片であり、上記第２のタンパク
質または断片が、ｇＬまたはその断片であり、上記第３のタンパク質または断片が、ｇＯ
またはその断片である、項目１１に記載の自己複製ＲＮＡ分子。
（項目１５）
上記第１のタンパク質または断片が、ｇＨまたはその断片であり、上記第２のタンパク
質または断片が、ｇＬまたはその断片であり、上記第３のタンパク質または断片が、ＵＬ
１２８またはその断片であり、上記第４のタンパク質または断片が、ＵＬ１３０またはそ
の断片であり、上記第５のタンパク質または断片が、ＵＬ１３１またはその断片である、
項目１１に記載の自己複製ＲＮＡ分子。
（項目１６）
上記ヘルペスウイルスが、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）である、項目１０に記載の
自己複製ＲＮＡ分子。
（項目１７）
上記第１のタンパク質または断片、上記第２のタンパク質または断片、上記第３のタン
パク質または断片、上記第４のタンパク質または断片、および上記第５のタンパク質また
は断片が、ｇＢ、ｇＥ、ｇＨ、ｇＩ、ｇＬ、および前述のもののいずれか１つの断片から
成る群から独立して選択される、項目１６に記載の自己複製ＲＮＡ分子。
（項目１８）
上記第１のタンパク質または断片が、ｇＨまたはその断片であり、上記第２のタンパク
質または断片が、ｇＬまたはその断片である、項目１６に記載の自己複製ＲＮＡ分子。
（項目１９）
アルファウイルスレプリコンである、項目１〜１８のいずれか一項に記載の自己複製Ｒ
ＮＡ分子。
（項目２０）
項目１９に記載のアルファウイルスレプリコンを含むアルファウイルスレプリコン粒子
（ＶＲＰ）。
（項目２１）
項目２０に記載のＶＲＰおよび薬学的に許容されるビヒクルを含む組成物。
（項目２２）
第２のＶＲＰをさらに含み、上記第２のＶＲＰは、上記ヘルペスウイルス由来のタンパ
ク質またはその断片をコードする自己複製ＲＮＡ分子を含有する、項目２１に記載の組成
物。
（項目２３）
アジュバントをさらに含む、項目２１または２２に記載の組成物。
（項目２４）
項目１〜１９のいずれか一項に記載の自己複製ＲＮＡおよび薬学的に許容されるビヒク
ルを含む組成物。
（項目２５）
上記ヘルペスウイルス由来のタンパク質またはその断片をコードする第２の自己複製Ｒ
ＮＡ分子をさらに含む、項目２４に記載の組成物。
（項目２６）
ＲＮＡ送達系をさらに含む、項目２４または２５に記載の組成物。
（項目２７）
上記ＲＮＡ送達系が、リポソーム、ポリマーナノ粒子、水中油型カチオン性ナノエマル
ジョン、またはその組み合わせである、項目２６に記載の組成物。
（項目２８）
上記送達系が、水中油型カチオン性ナノエマルジョンである、項目２６に記載の組成物
。
（項目２９）
タンパク質複合体を形成する方法であって、細胞に項目２０に記載のＶＲＰを送達する
工程およびアルファウイルスレプリコンの発現に適した条件下で上記細胞を維持する工程
を含み、ここでタンパク質複合体が形成される、方法。
（項目３０）
上記細胞が、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるものである、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
タンパク質複合体を形成する方法であって、細胞に項目１〜１９のいずれか一項に記載
の自己複製ＲＮＡを送達する工程および上記自己複製ＲＮＡの発現に適した条件下で上記
細胞を維持する工程を含み、ここでタンパク質複合体が形成される、方法。
（項目３２）
上記細胞が、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるものである、項目２１に記載の方法。
（項目３３）
細胞へのヘルペスウイルス侵入を阻害する方法であって、上記細胞を項目１〜１９のい
ずれか一項に記載の自己複製ＲＮＡと接触させる工程を含む、方法。
（項目３４）
細胞へのヘルペスウイルス侵入を阻害する方法であって、上記細胞を項目２０に記載の
ＶＲＰと接触させる工程を含む、方法。
（項目３５）
上記細胞が、上皮細胞、内皮細胞、および線維芽細胞から成る群から選択される、項目
３３または項目３４に記載の方法。
（項目３６）
上記細胞が、上皮細胞である、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
上記細胞が、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるものである、項目３３〜３６のいずれか一項に記
載の方法。
（項目３８）
個体において免疫応答を誘発する方法であって、項目２０に記載のＶＲＰまたは項目２
１〜２３のいずれか一項に記載の組成物を上記個体に投与する工程を含む、方法。
（項目３９）
個体において免疫応答を誘発する方法であって、項目１〜１９のいずれか一項に記載の
自己複製ＲＮＡ分子または項目２４〜２８のいずれか一項に記載の組成物を上記個体に投
与する工程を含む、方法。
（項目４０）
上記免疫応答が、中和抗体の産生を含む、項目３８または３９に記載の方法。
（項目４１）
上記中和抗体が、補体非依存性である、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
項目１〜１９のいずれか一項に記載の自己複製ＲＮＡ分子をコードする組換えＤＮＡ分
子。
（項目４３）
上記組換えＤＮＡ分子が、プラスミドである、項目４２に記載の組換えＤＮＡ分子。
（項目４４）
細胞においてタンパク質複合体を形成するための、項目１〜１９のいずれか一項に記載
の自己複製ＲＮＡまたは項目２０に記載のＶＲＰの使用。
（項目４５）
細胞へのヘルペスウイルス侵入を阻害するための、項目１〜１９のいずれか一項に記載
の自己複製ＲＮＡまたは項目２０に記載のＶＲＰの使用。
（項目４６）
個体において免疫応答を誘発するための、項目１〜１９のいずれか一項に記載の自己複
製ＲＮＡ、項目２０に記載のＶＲＰ、または項目２１〜２８のいずれか一項に記載の組成
物の使用。

図１は、標的細胞の中へのＣＭＶ侵入に関与する公知の糖タンパク質複合体を同定するＣＭＶの図である。エンベロープ糖タンパク質は、それらがウイルス表面上に発現され、防御的で長く持続するウイルス中和体液性免疫応答を引き起こすことができるので、魅力的なワクチン候補に相当する。これらのプロセスを媒介する構造糖タンパク質は、２つのクラスに分けることができる；ヘルペスウイルスファミリーの全体にわたって保存されるものおよびそうでないもの。保存されるものの中には、ｇＢ、ｇＨ、ｇＬ、ｇＭ、およびｇＮがある。これらの糖タンパク質の多くは、ウイルス表面への局在化を促進し、ウイルスの付着、侵入、および細胞融合においてそれらの機能を実行するために、互いに複合体を形成する（ｇＨ／ｇＬ／±ｇＯ；ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１；ｇＭ／ｇＮ）。 図２Ａ〜２Ｆは、ＣＭＶ構築物の図である。図２Ａ、実施例１において記載されるｇＢ構築物（「ｇＢ ＦＬ」、完全長ｇＢ；可溶性ｇＢ「ｇＢ ｓｏｌ ７５０」および「ｇＢ ｓｏｌ ６９２」）の図。ｇＢの２つの異なる可溶性バージョンを構築した；ｇＢ ｓｏｌ ７５０は、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠き、ｇＢ ｓｏｌ ６９２もまた、疎水性領域を欠き、Ｒｅａｐら （２００７年）Ｃｌｉｎ． Ｖａｃｃ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４巻：７４８〜５５頁において記載されるｇＢ ｓｏｌに類似する。図２Ｂ、ウイルス複製粒子（ＶＲＰ）を産生するために使用されるｇＢレプリコンベクターの図。図２Ｃ、実施例１において記載されるｇＨ構築物（「ｇＨ ＦＬ」、完全長ｇＨ；可溶性ｇＨ「ｇＨ ｓｏｌ」）の図。膜貫通ドメインを欠くｇＨの単一の可溶性バージョンを構築した。図２Ｄ、ＶＲＰを産生するために使用されるｇＨレプリコンベクターの図。図２Ｅ、実施例１において記載されるｇＬ構築物の図。図２Ｆ、ＶＲＰを産生するために使用されるｇＬレプリコンベクターの図。図２Ｂ、２Ｄ、および２Ｆにおいて、「ＮＳＰ１」、「ＮＳＰ２」、「ＮＳＰ３」、および「ＮＳＰ４」は、それぞれウイルスの複製に必要とされる、アルファウイルス非構造タンパク質１〜４である。 図２Ａ〜２Ｆは、ＣＭＶ構築物の図である。図２Ａ、実施例１において記載されるｇＢ構築物（「ｇＢ ＦＬ」、完全長ｇＢ；可溶性ｇＢ「ｇＢ ｓｏｌ ７５０」および「ｇＢ ｓｏｌ ６９２」）の図。ｇＢの２つの異なる可溶性バージョンを構築した；ｇＢ ｓｏｌ ７５０は、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠き、ｇＢ ｓｏｌ ６９２もまた、疎水性領域を欠き、Ｒｅａｐら （２００７年）Ｃｌｉｎ． Ｖａｃｃ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４巻：７４８〜５５頁において記載されるｇＢ ｓｏｌに類似する。図２Ｂ、ウイルス複製粒子（ＶＲＰ）を産生するために使用されるｇＢレプリコンベクターの図。図２Ｃ、実施例１において記載されるｇＨ構築物（「ｇＨ ＦＬ」、完全長ｇＨ；可溶性ｇＨ「ｇＨ ｓｏｌ」）の図。膜貫通ドメインを欠くｇＨの単一の可溶性バージョンを構築した。図２Ｄ、ＶＲＰを産生するために使用されるｇＨレプリコンベクターの図。図２Ｅ、実施例１において記載されるｇＬ構築物の図。図２Ｆ、ＶＲＰを産生するために使用されるｇＬレプリコンベクターの図。図２Ｂ、２Ｄ、および２Ｆにおいて、「ＮＳＰ１」、「ＮＳＰ２」、「ＮＳＰ３」、および「ＮＳＰ４」は、それぞれウイルスの複製に必要とされる、アルファウイルス非構造タンパク質１〜４である。 図２Ａ〜２Ｆは、ＣＭＶ構築物の図である。図２Ａ、実施例１において記載されるｇＢ構築物（「ｇＢ ＦＬ」、完全長ｇＢ；可溶性ｇＢ「ｇＢ ｓｏｌ ７５０」および「ｇＢ ｓｏｌ ６９２」）の図。ｇＢの２つの異なる可溶性バージョンを構築した；ｇＢ ｓｏｌ ７５０は、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠き、ｇＢ ｓｏｌ ６９２もまた、疎水性領域を欠き、Ｒｅａｐら （２００７年）Ｃｌｉｎ． Ｖａｃｃ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４巻：７４８〜５５頁において記載されるｇＢ ｓｏｌに類似する。図２Ｂ、ウイルス複製粒子（ＶＲＰ）を産生するために使用されるｇＢレプリコンベクターの図。図２Ｃ、実施例１において記載されるｇＨ構築物（「ｇＨ ＦＬ」、完全長ｇＨ；可溶性ｇＨ「ｇＨ ｓｏｌ」）の図。膜貫通ドメインを欠くｇＨの単一の可溶性バージョンを構築した。図２Ｄ、ＶＲＰを産生するために使用されるｇＨレプリコンベクターの図。図２Ｅ、実施例１において記載されるｇＬ構築物の図。図２Ｆ、ＶＲＰを産生するために使用されるｇＬレプリコンベクターの図。図２Ｂ、２Ｄ、および２Ｆにおいて、「ＮＳＰ１」、「ＮＳＰ２」、「ＮＳＰ３」、および「ＮＳＰ４」は、それぞれウイルスの複製に必要とされる、アルファウイルス非構造タンパク質１〜４である。 図３Ａおよび３Ｂは、ｇＢ（ＦＬ、ｓｏｌ ７５０、ｓｏｌ ６９２）またはｇＨ（ＦＬ、ｓｏｌ）ＶＲＰにより免疫化したマウスが、モルモット補体の存在下において、中和性である抗体応答を誘発したことを示す図である。中和アッセイは、ＡＲＰＥ−１９上皮細胞の感染前に、マウス血清およびモルモット補体と共に、ＣＭＶウイルス株ＴＢ４０ＵＬ３２Ｅ−ＧＦＰ（高感度緑色蛍光タンパク質−ＧＦＰをコードする、Ｓａｍｐａｉｏら（２００５年）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．７９巻（５号）：２７５４〜６７頁）をあらかじめインキュベートすることによって行った。感染の５日後に、ＧＦＰ陽性細胞の数を決定した。図３Ａ、補体の存在下においてＡＲＰＥ−１９細胞において分析したすべての血清についての血清希釈曲線（ｓｅｒｕｍ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ）。図３Ｂ、血清試料についての５０％中和力価。免疫前血清と共にインキュベートしたウイルスは、低希釈（１：４０〜１：８０）で低度の中和をもたらした。ｇＢ（ＦＬ、ｓｏｌ ７５０、ｓｏｌ ６９２）血清は、１：１８００〜１：２１００の５０％中和力価で非常に強力な中和活性を有した。ｇＢ免疫化マウスはすべて、同様の中和プロファイルをもたらした。ｇＨ（ＦＬ、ｓｏｌ）血清は、約１：１６０で５０％中和力価で中和活性を有した。実施例１を参照されたい。 図３Ａおよび３Ｂは、ｇＢ（ＦＬ、ｓｏｌ ７５０、ｓｏｌ ６９２）またはｇＨ（ＦＬ、ｓｏｌ）ＶＲＰにより免疫化したマウスが、モルモット補体の存在下において、中和性である抗体応答を誘発したことを示す図である。中和アッセイは、ＡＲＰＥ−１９上皮細胞の感染前に、マウス血清およびモルモット補体と共に、ＣＭＶウイルス株ＴＢ４０ＵＬ３２Ｅ−ＧＦＰ（高感度緑色蛍光タンパク質−ＧＦＰをコードする、Ｓａｍｐａｉｏら（２００５年）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．７９巻（５号）：２７５４〜６７頁）をあらかじめインキュベートすることによって行った。感染の５日後に、ＧＦＰ陽性細胞の数を決定した。図３Ａ、補体の存在下においてＡＲＰＥ−１９細胞において分析したすべての血清についての血清希釈曲線。図３Ｂ、血清試料についての５０％中和力価。免疫前血清と共にインキュベートしたウイルスは、低希釈（１：４０〜１：８０）で低度の中和をもたらした。ｇＢ（ＦＬ、ｓｏｌ ７５０、ｓｏｌ ６９２）血清は、１：１８００〜１：２１００の５０％中和力価で非常に強力な中和活性を有した。ｇＢ免疫化マウスはすべて、同様の中和プロファイルをもたらした。ｇＨ（ＦＬ、ｓｏｌ）血清は、約１：１６０で５０％中和力価で中和活性を有した。実施例１を参照されたい。 図４Ａは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または赤色蛍光タンパク質（ｍＣｈｅｒｒｙ）をコードするモノシストロニックレプリコンならびにＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙをコードするバイシストロニックレプリコンの略図である。「ＮＳＰ１」、「ＮＳＰ２」、「ＮＳＰ３」、および「ＮＳＰ４」は、それぞれ、アルファウイルス非構造タンパク質１〜４である。ポリシストロニックアルファウイルスレプリコン系は、目的の遺伝子を駆動する複数のサブゲノムプロモーターを収容するように既存のアルファウイルスレプリコン系に対して修飾を成すことによって設計した。 図４Ｂは、モノおよびバイシストロニックＲＮＡを含有するＶＲＰに感染したＢＨＫＶ細胞のＦＡＣＳ分析を示す蛍光プロットである。ポリシストロニックアルファウイルスＶＲＰは、ＧＦＰ ＶＲＰ＋ｍＣｈｅｒｒｙ ＶＲＰの同時感染（２６．３０％）よりも、ほぼ等しい量で両方の目的の遺伝子を発現する、より多くの細胞をもたらす（ＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙ；７２．４８％）。実施例２を参照されたい。 図５Ａは、ｇＨ／ｇＬおよびｇＨ／ｇＬ／ｇＯをコードするポリシストロニックアルファウイルスレプリコン構築物の構築の略図である。 図５Ｂは、ｇＨ／ｇＬがｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて複合体を形成することを示す。ｇＨ、ｇＬ、ｇＯ、ｇＨ／ｇＬ、またはｇＨ／ｇＬ／ｇＯをコードするレプリコンを含有するＶＲＰは、ＢＨＫＶ細胞において産生した。結果として生じるＶＲＰは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて複合体形成を実証するためにＡＲＰＥ−１９細胞を感染させるために使用した。アルファウイルス感染ＡＲＰＥ−１９細胞を収集し、ｇＨおよびｇＬの存在について分析した。ｇＨ／ｇＬをコードするＶＲＰに感染したＡＲＰＥ−１９細胞は、ｇＨ／ｇＬのジスルフィド結合複合体を産生した（ＤＴＴ、熱の非存在下において見られる）。ｇＯは、ｇＨ／ｇＬ結合を検出可能な程度に改変しなかった。左手のブロットは、ｇＨタンパク質の発現を示す。右手のブロットは、ｇＬタンパク質の発現を示す。分子量マーカーは、ブロットの間に示す。●＝単量体ｇＨ、●●＝単量体ｇＬ、＜＝ヘテロ二量体（ｇＨ＋ｇＬ）、＊＝ヘテロ二量体の二量体。 図５Ｃは、ＶＲＰに感染したＢＨＫＶ細胞由来のｇＨおよびｇＨ／ｇＬ複合体の免疫沈降を示す。免疫沈降は、対照としてマウスＩｇＧ抗体（レーン２、４、７、および１０）またはｇＨを免疫沈降させるマウス抗ｇＨ抗体（Ｇｅｎｗａｙ）（レーン３、５、８、および１１）を使用して実行した。ウエスタンブロットは、プールしたウサギ抗ｇＬ抗体およびウサギ抗ｇＨ抗体を使用して実行した。レーン１、６、および９は、参照のためのｇＨタンパク質（上方のバンド 約７５ｋＤａ）およびｇＬタンパク質（下方のバンド 約３０ｋＤａ）を示す。レーン２および３は、ｇＨ−ＶＲＰに感染した溶解産物である。レーン２は、対照抗体がｇＨを免疫沈降させなかったことを示す。レーン３は、抗ｇＨ抗体がｇＨを免疫沈降させたことを示す。レーン４および５は、ｇＬ−ＶＲＰのみに感染した溶解産物からのものである。ｇＨタンパク質は、免疫沈降しなかった。レーン７および８は、バイシストロニックｇＨ／ｇＬ−ＶＲＰに感染した溶解産物からのものである。レーン８は、ｇＬがｇＨ抗体を使用して免疫沈降したことを示す。（アスタリスクを参照されたい）。レーン１０および１１は、トリシストロニックｇＨ／ｇＬ／ｇＯ−ＶＲＰに感染した溶解産物からのものである。レーン１１は、ｇＬがｇＨ抗体を使用して免疫沈降したことを示す。（アスタリスクを参照されたい）。分子量マーカーもまた示す（ＭＷ）。実施例３を参照されたい。 図６は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてｇＨ／ｇＬ複合体形成に影響を及ぼすＶＲＰが、ｇＢ ＶＲＰに対する応答より質的かつ量的に優れた、ＣＭＶに対する強力な免疫応答を誘発することを示す。図６Ａおよび図６Ｂは、補体の存在下（図６Ａ）または非存在下（図６Ｂ）においてＡＲＰＥ−１９細胞のＴＢ４０−ＵＬ３２−ＥＧＦＰ感染の中和における、ｇＨ、ｇＬ、ｇＯ、ｇＨ＋ｇＬ、ｇＨ＋ｇＬ＋ｇＯ、ｇＨ／ｇＬ、およびｇＨ／ｇＬ／ｇＯ ＶＲＰ免疫化マウスについての血清希釈曲線を示す。血清の様々な希釈物は、モルモット補体の存在下または非存在下においてＴＢ４０ＵＬ３２Ｅ−ＧＦＰと共にあらかじめインキュベートし、その後、ＡＲＰＥ−１９上皮細胞に追加した。ウイルスによる５日の感染後に、ＧＦＰ陽性細胞を数えた。図６Ｃは、補体の存在下または非存在下において得られる５０％の中和力価を示すグラフである。「３ｗｐ３」、３回目の免疫化の３週間後。単一のＣＭＶタンパク質を発現するＶＲＰ（ｇＨ、ｇＬ、ｇＯ ＶＲＰまたはｇＨ、ｇＬ、およびｇＯ ＶＲＰの同時投与）は、ｇＨのみのものを超えて中和活性を増強しなかった。対照的に、バイシストロニックｇＨ／ｇＬまたはトリシストロニックｇＨ／ｇＬ／ｇＯ ＶＲＰにより免疫化したマウス由来の血清は、強力な中和応答を実証した。さらに、強力な中和応答は、モルモット補体の存在下および非存在下において類似しており、ポリシストロニックＶＲＰが補体非依存性免疫応答を成功裏に誘発したことを示した。実施例４を参照されたい。 図６は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてｇＨ／ｇＬ複合体形成に影響を及ぼすＶＲＰが、ｇＢ ＶＲＰに対する応答より質的かつ量的に優れた、ＣＭＶに対する強力な免疫応答を誘発することを示す。図６Ａおよび図６Ｂは、補体の存在下（図６Ａ）または非存在下（図６Ｂ）においてＡＲＰＥ−１９細胞のＴＢ４０−ＵＬ３２−ＥＧＦＰ感染の中和における、ｇＨ、ｇＬ、ｇＯ、ｇＨ＋ｇＬ、ｇＨ＋ｇＬ＋ｇＯ、ｇＨ／ｇＬ、およびｇＨ／ｇＬ／ｇＯ ＶＲＰ免疫化マウスについての血清希釈曲線を示す。血清の様々な希釈物は、モルモット補体の存在下または非存在下においてＴＢ４０ＵＬ３２Ｅ−ＧＦＰと共にあらかじめインキュベートし、その後、ＡＲＰＥ−１９上皮細胞に追加した。ウイルスによる５日の感染後に、ＧＦＰ陽性細胞を数えた。図６Ｃは、補体の存在下または非存在下において得られる５０％の中和力価を示すグラフである。「３ｗｐ３」、３回目の免疫化の３週間後。単一のＣＭＶタンパク質を発現するＶＲＰ（ｇＨ、ｇＬ、ｇＯ ＶＲＰまたはｇＨ、ｇＬ、およびｇＯ ＶＲＰの同時投与）は、ｇＨのみのものを超えて中和活性を増強しなかった。対照的に、バイシストロニックｇＨ／ｇＬまたはトリシストロニックｇＨ／ｇＬ／ｇＯ ＶＲＰにより免疫化したマウス由来の血清は、強力な中和応答を実証した。さらに、強力な中和応答は、モルモット補体の存在下および非存在下において類似しており、ポリシストロニックＶＲＰが補体非依存性免疫応答を成功裏に誘発したことを示した。実施例４を参照されたい。 図６は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてｇＨ／ｇＬ複合体形成に影響を及ぼすＶＲＰが、ｇＢ ＶＲＰに対する応答より質的かつ量的に優れた、ＣＭＶに対する強力な免疫応答を誘発することを示す。図６Ａおよび図６Ｂは、補体の存在下（図６Ａ）または非存在下（図６Ｂ）においてＡＲＰＥ−１９細胞のＴＢ４０−ＵＬ３２−ＥＧＦＰ感染の中和における、ｇＨ、ｇＬ、ｇＯ、ｇＨ＋ｇＬ、ｇＨ＋ｇＬ＋ｇＯ、ｇＨ／ｇＬ、およびｇＨ／ｇＬ／ｇＯ ＶＲＰ免疫化マウスについての血清希釈曲線を示す。血清の様々な希釈物は、モルモット補体の存在下または非存在下においてＴＢ４０ＵＬ３２Ｅ−ＧＦＰと共にあらかじめインキュベートし、その後、ＡＲＰＥ−１９上皮細胞に追加した。ウイルスによる５日の感染後に、ＧＦＰ陽性細胞を数えた。図６Ｃは、補体の存在下または非存在下において得られる５０％の中和力価を示すグラフである。「３ｗｐ３」、３回目の免疫化の３週間後。単一のＣＭＶタンパク質を発現するＶＲＰ（ｇＨ、ｇＬ、ｇＯ ＶＲＰまたはｇＨ、ｇＬ、およびｇＯ ＶＲＰの同時投与）は、ｇＨのみのものを超えて中和活性を増強しなかった。対照的に、バイシストロニックｇＨ／ｇＬまたはトリシストロニックｇＨ／ｇＬ／ｇＯ ＶＲＰにより免疫化したマウス由来の血清は、強力な中和応答を実証した。さらに、強力な中和応答は、モルモット補体の存在下および非存在下において類似しており、ポリシストロニックＶＲＰが補体非依存性免疫応答を成功裏に誘発したことを示した。実施例４を参照されたい。 図７は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてｇＨ／ｇＬ複合体形成に影響を及ぼすＶＲＰが、ＭＲＣ−５線維芽細胞の細胞の感染を強力に中和する抗体を誘発したことを示す図である。図７Ａは、補体の非存在下におけるＭＲＣ−５細胞における、ｇＨ、ｇＬ、ｇＯ、ｇＨ＋ｇＬ、ｇＨ＋ｇＬ＋ｇＯ、ｇＨ／ｇＬ、およびｇＨ／ｇＬ／ｇＯ ＶＲＰ免疫化マウスについての血清希釈曲線を示す。血清の様々な希釈物は、モルモット補体の存在下または非存在下においてＴＢ４０ＧＦＰと共にあらかじめインキュベートし、その後、ＭＲＣ−５線維芽細胞の細胞に追加した。ウイルスによる５日の感染後に、ＧＦＰ陽性細胞を数えた。図７Ｂは、補体の非存在下においてＭＲＣ−５線維芽細胞の細胞モデルにおいて得られた５０％の中和力価を示すグラフである。「３ｗｐ３」、３回目の免疫化の３週間後。単一のＣＭＶタンパク質を発現するＶＲＰ（ｇＨ、ｇＬ、ｇＯ ＶＲＰまたはｇＨ、ｇＬ、およびｇＯ ＶＲＰの同時投与）は、ｇＨのみのものを超えて中和活性を増強しなかった。対照的に、バイシストロニックｇＨ／ｇＬまたはトリシストロニックｇＨ／ｇＬ／ｇＯ ＶＲＰにより免疫化したマウス由来の血清は、非常に強力な中和応答を実証した。実施例４を参照されたい。 図７は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてｇＨ／ｇＬ複合体形成に影響を及ぼすＶＲＰが、ＭＲＣ−５線維芽細胞の細胞の感染を強力に中和する抗体を誘発したことを示す図である。図７Ａは、補体の非存在下におけるＭＲＣ−５細胞における、ｇＨ、ｇＬ、ｇＯ、ｇＨ＋ｇＬ、ｇＨ＋ｇＬ＋ｇＯ、ｇＨ／ｇＬ、およびｇＨ／ｇＬ／ｇＯ ＶＲＰ免疫化マウスについての血清希釈曲線を示す。血清の様々な希釈物は、モルモット補体の存在下または非存在下においてＴＢ４０ＧＦＰと共にあらかじめインキュベートし、その後、ＭＲＣ−５線維芽細胞の細胞に追加した。ウイルスによる５日の感染後に、ＧＦＰ陽性細胞を数えた。図７Ｂは、補体の非存在下においてＭＲＣ−５線維芽細胞の細胞モデルにおいて得られた５０％の中和力価を示すグラフである。「３ｗｐ３」、３回目の免疫化の３週間後。単一のＣＭＶタンパク質を発現するＶＲＰ（ｇＨ、ｇＬ、ｇＯ ＶＲＰまたはｇＨ、ｇＬ、およびｇＯ ＶＲＰの同時投与）は、ｇＨのみのものを超えて中和活性を増強しなかった。対照的に、バイシストロニックｇＨ／ｇＬまたはトリシストロニックｇＨ／ｇＬ／ｇＯ ＶＲＰにより免疫化したマウス由来の血清は、非常に強力な中和応答を実証した。実施例４を参照されたい。 図８Ａおよび８Ｂは、ポリシストロニックＶＲＰの送達によって誘発された中和抗体が交差中和抗体であったことを示すグラフである。ｇＨ／ｇＬおよびｇＨ／ｇＬ／ｇＯ ＶＲＰにより免疫化したマウス由来の血清は、ＩＥ−１中和アッセイにおいて、モルモット補体の非存在下において、ＡＲＰＥ−１９上皮細胞（図８Ａ）およびＭＲＣ−５線維芽細胞の細胞（図８Ｂ）の両方において、ＣＭＶのＴＢ４０ＵＬ３２Ｅ−ＧＦＰおよびＶＲ１８１４臨床株を中和することができた。 図８Ａおよび８Ｂは、ポリシストロニックＶＲＰの送達によって誘発された中和抗体が交差中和抗体であったことを示すグラフである。ｇＨ／ｇＬおよびｇＨ／ｇＬ／ｇＯ ＶＲＰにより免疫化したマウス由来の血清は、ＩＥ−１中和アッセイにおいて、モルモット補体の非存在下において、ＡＲＰＥ−１９上皮細胞（図８Ａ）およびＭＲＣ−５線維芽細胞の細胞（図８Ｂ）の両方において、ＣＭＶのＴＢ４０ＵＬ３２Ｅ−ＧＦＰおよびＶＲ１８１４臨床株を中和することができた。 図９は、ｇＨ ＦＬ／ｇＬに対して引き起こされた中和抗体が、補体非依存性であり、力価において自然免疫に類似していたことを示すグラフである。マウスは、最終的な採血（ｂｌｅｅｄ）前に、１×１０^６ ＩＵでｇＢ ＦＬまたはｇＨ ＦＬ／ｇＬ ＶＲＰにより３回３週間間隔で免疫化した。血清は、中和アッセイにおいて、モルモット補体の存在下および非存在下において、ＡＲＰＥ−１９細胞のＴＢ４０ＵＬ３２Ｅ−ＥＧＦＰ ＣＭＶ感染を中和する能力について分析した。ｇＢによって引き起こされた抗体と異なり、ｇＨ ＦＬ／ｇＬによって引き起こされた抗体は、補体非依存性である。さらに、これらのワクチン接種したマウスにおけるｇＨ ＦＬ／ｇＬ抗体は、自然に感染したヒト被験体において見つけられるものに力価において類似していた。 図１０は、ｐＶＣＲ修飾ｇＨ−ＳＧＰｇＬ−ＳＧＰｇＯについてのプラスミドマップを示す。 図１１は、ｐＶＣＲ修飾ｇＨ−ＳＧＰｇＬについてのプラスミドマップを示す。 図１２は、ｐＶＣＲ修飾ｇＨ ｓｏｌ−ＳＧＰｇＬについてのプラスミドマップを示す。 図１３は、ｐＶＣＲ修飾ｇＨ ｓｏｌ−ＳＧＰｇＬ−ＳＧＰｇＯについてのプラスミドマップを示す。 図１４Ａ〜１４Ｇは、ＣＭＶ表面糖タンパク質Ｈ（ｇＨ）およびＣＭＶ表面糖タンパク質Ｌ（ｇＬ）をコードするＡ１６０自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号＿＿＿＿＿＿）を示す。ｇＨおよびｇＬをコードするヌクレオチド配列に下線を引く。 図１４Ａ〜１４Ｇは、ＣＭＶ表面糖タンパク質Ｈ（ｇＨ）およびＣＭＶ表面糖タンパク質Ｌ（ｇＬ）をコードするＡ１６０自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号＿＿＿＿＿＿）を示す。ｇＨおよびｇＬをコードするヌクレオチド配列に下線を引く。 図１４Ａ〜１４Ｇは、ＣＭＶ表面糖タンパク質Ｈ（ｇＨ）およびＣＭＶ表面糖タンパク質Ｌ（ｇＬ）をコードするＡ１６０自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号＿＿＿＿＿＿）を示す。ｇＨおよびｇＬをコードするヌクレオチド配列に下線を引く。 図１４Ａ〜１４Ｇは、ＣＭＶ表面糖タンパク質Ｈ（ｇＨ）およびＣＭＶ表面糖タンパク質Ｌ（ｇＬ）をコードするＡ１６０自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号＿＿＿＿＿＿）を示す。ｇＨおよびｇＬをコードするヌクレオチド配列に下線を引く。 図１４Ａ〜１４Ｇは、ＣＭＶ表面糖タンパク質Ｈ（ｇＨ）およびＣＭＶ表面糖タンパク質Ｌ（ｇＬ）をコードするＡ１６０自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号＿＿＿＿＿＿）を示す。ｇＨおよびｇＬをコードするヌクレオチド配列に下線を引く。 図１４Ａ〜１４Ｇは、ＣＭＶ表面糖タンパク質Ｈ（ｇＨ）およびＣＭＶ表面糖タンパク質Ｌ（ｇＬ）をコードするＡ１６０自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号＿＿＿＿＿＿）を示す。ｇＨおよびｇＬをコードするヌクレオチド配列に下線を引く。 図１４Ａ〜１４Ｇは、ＣＭＶ表面糖タンパク質Ｈ（ｇＨ）およびＣＭＶ表面糖タンパク質Ｌ（ｇＬ）をコードするＡ１６０自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号＿＿＿＿＿＿）を示す。ｇＨおよびｇＬをコードするヌクレオチド配列に下線を引く。 図１５Ａ〜１５Ｈは、ＣＭＶ表面糖タンパク質Ｈの可溶性形態（ｇＨｓｏｌ）およびＣＭＶ表面糖タンパク質Ｌ（ｇＬ）をコードするＡ３２２自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号＿＿＿＿＿＿）を示す。ｇＨｓｏｌおよびｇＬをコードするヌクレオチド配列に下線を引く。 図１５Ａ〜１５Ｈは、ＣＭＶ表面糖タンパク質Ｈの可溶性形態（ｇＨｓｏｌ）およびＣＭＶ表面糖タンパク質Ｌ（ｇＬ）をコードするＡ３２２自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号＿＿＿＿＿＿）を示す。ｇＨｓｏｌおよびｇＬをコードするヌクレオチド配列に下線を引く。 図１５Ａ〜１５Ｈは、ＣＭＶ表面糖タンパク質Ｈの可溶性形態（ｇＨｓｏｌ）およびＣＭＶ表面糖タンパク質Ｌ（ｇＬ）をコードするＡ３２２自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号＿＿＿＿＿＿）を示す。ｇＨｓｏｌおよびｇＬをコードするヌクレオチド配列に下線を引く。 図１５Ａ〜１５Ｈは、ＣＭＶ表面糖タンパク質Ｈの可溶性形態（ｇＨｓｏｌ）およびＣＭＶ表面糖タンパク質Ｌ（ｇＬ）をコードするＡ３２２自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号＿＿＿＿＿＿）を示す。ｇＨｓｏｌおよびｇＬをコードするヌクレオチド配列に下線を引く。 図１５Ａ〜１５Ｈは、ＣＭＶ表面糖タンパク質Ｈの可溶性形態（ｇＨｓｏｌ）およびＣＭＶ表面糖タンパク質Ｌ（ｇＬ）をコードするＡ３２２自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号＿＿＿＿＿＿）を示す。ｇＨｓｏｌおよびｇＬをコードするヌクレオチド配列に下線を引く。 図１５Ａ〜１５Ｈは、ＣＭＶ表面糖タンパク質Ｈの可溶性形態（ｇＨｓｏｌ）およびＣＭＶ表面糖タンパク質Ｌ（ｇＬ）をコードするＡ３２２自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号＿＿＿＿＿＿）を示す。ｇＨｓｏｌおよびｇＬをコードするヌクレオチド配列に下線を引く。 図１５Ａ〜１５Ｈは、ＣＭＶ表面糖タンパク質Ｈの可溶性形態（ｇＨｓｏｌ）およびＣＭＶ表面糖タンパク質Ｌ（ｇＬ）をコードするＡ３２２自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号＿＿＿＿＿＿）を示す。ｇＨｓｏｌおよびｇＬをコードするヌクレオチド配列に下線を引く。 図１５Ａ〜１５Ｈは、ＣＭＶ表面糖タンパク質Ｈの可溶性形態（ｇＨｓｏｌ）およびＣＭＶ表面糖タンパク質Ｌ（ｇＬ）をコードするＡ３２２自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号＿＿＿＿＿＿）を示す。ｇＨｓｏｌおよびｇＬをコードするヌクレオチド配列に下線を引く。 図１６Ａ〜１６Ｈは、ＣＭＶ表面糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）をコードするＡ３２３自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号＿＿＿＿＿＿）を示す。ｇＢをコードするヌクレオチド配列に下線を引く。 図１６Ａ〜１６Ｈは、ＣＭＶ表面糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）をコードするＡ３２３自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号＿＿＿＿＿＿）を示す。ｇＢをコードするヌクレオチド配列に下線を引く。 図１６Ａ〜１６Ｈは、ＣＭＶ表面糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）をコードするＡ３２３自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号＿＿＿＿＿＿）を示す。ｇＢをコードするヌクレオチド配列に下線を引く。 図１６Ａ〜１６Ｈは、ＣＭＶ表面糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）をコードするＡ３２３自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号＿＿＿＿＿＿）を示す。ｇＢをコードするヌクレオチド配列に下線を引く。 図１６Ａ〜１６Ｈは、ＣＭＶ表面糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）をコードするＡ３２３自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号＿＿＿＿＿＿）を示す。ｇＢをコードするヌクレオチド配列に下線を引く。 図１６Ａ〜１６Ｈは、ＣＭＶ表面糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）をコードするＡ３２３自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号＿＿＿＿＿＿）を示す。ｇＢをコードするヌクレオチド配列に下線を引く。 図１６Ａ〜１６Ｈは、ＣＭＶ表面糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）をコードするＡ３２３自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号＿＿＿＿＿＿）を示す。ｇＢをコードするヌクレオチド配列に下線を引く。 図１６Ａ〜１６Ｈは、ＣＭＶ表面糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）をコードするＡ３２３自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号＿＿＿＿＿＿）を示す。ｇＢをコードするヌクレオチド配列に下線を引く。 図１７Ａおよび１７Ｂは、ＶＲＰまたは自己複製ＲＮＡにより免疫化されたマウス由来の血清の５０％の中和性の力価を示すヒストグラムである。図１７Ａは、ＡＲＰＥ−１９細胞上でのヒトＣＭＶ株ＴＢ４０ＵＬ３２Ｅ−ＥＧＦＰ（「ＴＢ４０）に対する５０％の中和性の力価を示し、図１７Ｂは、ＡＲＰＥ−１９細胞上でのヒトＣＭＶ株８８１９に対する５０％の中和性の力価を示す。 図１８は、５つのＣＭＶタンパク質をコードするペンタシストロニックＲＮＡレプリコン、Ａ５２６、Ａ５２７、Ａ５５４、Ａ５５５、およびＡ５５６の図である。サブゲノムプロモーターは、矢印によって示され、他の制御エレメントは標識される。 図１９は、Ａ５２７ ＲＮＡレプリコンによりトランスフェクトされたＢＨＫＶ細胞が、ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合体を発現することを示す蛍光ヒストグラムである。細胞染色は、五量体複合体上に存在するコンフォメーション性エピトープ（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｅｐｉｔｏｐｅ）に結合する抗体を使用して実行した（Ｍａｃａｇｎｏ（２０１０年）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．８４巻（２号）：１００５〜１３頁）。 図２０は、図およびグラフである。図は、ＣＭＶ ｇＨおよびｇＬをコードするバイシストロニックＲＮＡレプリコン、Ａ１６０およびＡ５３１〜Ａ５３７を示す。グラフは、レプリコンを含有するＶＲＰにより免疫化されたマウス由来の免疫血清の中和活性を示す。 図２１は、ＶＺＶタンパク質をコードしたモノシストロニックＲＮＡレプリコンまたはＶＺＶ ｇＥおよびｇＩもしくはｇＨおよびｇＬをコードしたバイシストロニックＲＮＡレプリコンにより免疫化されたマウス由来の免疫血清において抗ＶＺＶタンパク質抗体応答を示すグラフである。マウスは、ＣＮＥと共に処方された７μｇ ＲＮＡにより免疫化した（実施例７を参照されたい）。 図２２は、ＶＺＶタンパク質をコードしたモノシストロニックＲＮＡレプリコンまたはＶＺＶ ｇＥおよびｇＩもしくはｇＨおよびｇＬをコードしたバイシストロニックＲＮＡレプリコンにより免疫化されたマウス由来の免疫血清において抗ＶＺＶタンパク質抗体応答を示すグラフである。マウスは、ＣＮＥと共に処方された１μｇ ＲＮＡにより免疫化した（実施例７を参照されたい）。

本発明は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）タンパク質などのヘルペスウイルスタンパ
ク質、特に、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて複合体を形成するタンパク質を細胞に同時送達する
ためのプラットフォームを提供する。いくつかの実施形態では、これらのタンパク質およ
びそれらが形成する複合体は、強力な中和抗体を誘発する。ヘルペスウイルス（たとえば
ＣＭＶ）タンパク質、特に、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて複合体を形成するもの（たとえばｇ
Ｈ／ｇＬ）の同時送達によってもたらされる免疫応答は、他のアプローチを使用してもた
らされる免疫応答より優れたものとなり得る。たとえば、ＣＭＶのｇＨおよびｇＬの両方
をコードするＲＮＡ分子（たとえばレプリコン）は、ｇＢをコードするＲＮＡ分子、ｇＨ
をコードするＲＮＡ分子、ｇＬをコードするＲＮＡ分子、またはさらにｇＨまたはｇＬを
個々にコードするＲＮＡ分子の混合物と比較して、より良好な中和性の力価および／また
は防御免疫を誘発することができる。さらに、ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／Ｕ
Ｌ１３１をコードするレプリコンは、ｇＨ／ｇＬのみをコードするものより優れた応答を
提供することができる。

一般的な態様では、本発明は、２つ以上のヘルペスウイルス（たとえばＣＭＶ）タンパ
ク質を細胞に送達するためのプラットフォームに関する。プラットフォームは、第１のヘ
ルペスウイルス（たとえばＣＭＶ）タンパク質またはその断片をコードする第１の配列お
よび第２のヘルペスウイルス（たとえばＣＭＶ）タンパク質またはその断片をコードする
第２の配列を含有する組換えポリシストロニック核酸分子を含む。所望の場合、追加のタ
ンパク質をコードする１つまたは複数の追加の配列、たとえば、第３のヘルペスウイルス
（たとえばＣＭＶ）タンパク質またはその断片、第４のヘルペスウイルス（たとえばＣＭ
Ｖ）タンパク質またはその断片、第５のヘルペスウイルス（たとえばＣＭＶ）タンパク質
またはその断片などは、組換えポリシストロニック核酸分子において存在することができ
る。ヘルペスウイルス（たとえばＣＭＶ）タンパク質またはその断片をコードする配列は
、ヘルペスウイルス（たとえばＣＭＶ）タンパク質または断片が組換えポリシストロニッ
ク核酸を含有する細胞によって産生されるように、１つまたは複数の適した制御エレメン
トに作動可能に連結されている。

本明細書において記載されるポリシストロニック核酸において、コードされる第１およ
び第２のヘルペスウイルスタンパク質または断片ならびにコードされる第３、第４、およ
び第５のヘルペスウイルスタンパク質または断片は、存在する場合、一般的に、また好ま
しくは、同じヘルペスウイルス由来のものである。ある例において、ポリシストロニック
ベクターによってコードされるヘルペスウイルスタンパク質または断片はすべて、ＣＭＶ
タンパク質またはＶＺＶタンパク質である。

本明細書において記載される組換えポリシストロニック核酸分子は、細胞に、２つ以上
のヘルペスウイルス（たとえばＣＭＶ）タンパク質をコードする配列を送達し、かつｉｎ
ｖｉｖｏにおいて２つ以上のヘルペスウイルス（たとえばＣＭＶ）タンパク質を含有す
るタンパク質複合体の形成をもたらすのに十分なレベルでヘルペスウイルス（たとえばＣ
ＭＶ）タンパク質の発現を駆動する利点を提供する。このアプローチを使用して、２つ以
上のコードされるヘルペスウイルス（たとえばＣＭＶ）タンパク質は、ヘルペスウイルス
（たとえばＣＭＶ）タンパク質複合体（たとえばｇＨ／ｇＬ）の形成に十分な細胞内レベ
ルで発現させることができる。たとえば、コードされるヘルペスウイルス（たとえばＣＭ
Ｖ）タンパク質またはその断片は、適切な発現制御配列（たとえばプロモーター、ＩＲＥ
Ｓ、２Ａ部位など）を選択することによって、実質的に同じレベルでまたは所望の場合、
異なるレベルで発現させることができる。これは、非効率的で、非常に変わりやすいもの
となり得る、異なるヘルペスウイルス（たとえばＣＭＶ）をコードする２つ以上の個々の
ＤＮＡ分子を同じ細胞に同時送達することよりも、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてタンパク質複
合体を産生するための著しくより効率的な方法である。たとえば、国際公開第２００４／
０７６６４５号を参照されたい。

組換えポリシストロニック核酸分子は、ＤＮＡ（たとえばプラスミドもしくはウイルス
ＤＮＡ）またはＲＮＡなどの任意の所望の核酸に基づくものであり得る。任意の適したＤ
ＮＡまたはＲＮＡは、ヘルペスウイルス（たとえばＣＭＶ）タンパク質またはその断片を
コードするオープンリーディングフレームを持つ核酸ベクターとして使用することができ
る。適した核酸ベクターは、１つを超えるタンパク質遺伝子を持ち、その発現を駆動する
ための能力を有する。そのような核酸ベクターは、当技術分野において公知であり、たと
えばプラスミド、ワクシニアウイルスベクター（たとえばＮＹＶＡＣ、米国特許第５，４
９４，８０７号を参照されたい）およびポックスウイルスベクター（たとえばＡＬＶＡＣ
カナリアポックスベクター、Ｓａｎｏｆｉ Ｐａｓｔｅｕｒ）などのＤＮＡウイルスから
得られるＤＮＡ、ならびにアルファウイルスなどの適したＲＮＡウイルスから得られるＲ
ＮＡを含む。所望の場合、組換えポリシストロニック核酸分子は、修飾することができる
、たとえば、本明細書においてさらに記載される修飾核酸塩基および／または連結を含有
することができる。好ましくは、ポリシストロニック核酸分子は、ＲＮＡ分子である。

いくつかの態様では、組換えポリシストロニック核酸分子は、プラスミドＤＮＡなどの
ＤＮＡ分子である。そのようなＤＮＡ分子は、たとえば、ポリシストロニックレプリコン
をコードし、レプリコンの転写を駆動する哺乳動物プロモーターを含有することができる
。組換えポリシストロニック核酸分子またはこのタイプは、哺乳動物に投与され得、その
後、ヘルペスウイルスタンパク質を発現するポリシストロニックレプリコンを産生するよ
うにｉｎ ｓｉｔｕにおいて転写され得る。

いくつかの態様では、本発明は、ヘルペスウイルスｇＨまたはその断片およびヘルペス
ウイルスｇＬまたはその断片をコードする配列を含有するポリシストロニック核酸分子で
ある。ｇＨおよびｇＬタンパク質またはその断片は、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、
ＥＢＶ１型、ＥＢＶ２型、ＣＭＶ、ＨＨＶ−６ Ａ型、ＨＨＶ−６ Ｂ型、ＨＨＶ−７、
ＫＳＨＶ、およびその他同種のものなどの任意の所望のヘルペスウイルス由来のものであ
り得る。好ましくは、ヘルペスウイルスは、ＶＺＶ、ＨＳＶ−２、ＨＳＶ−１、ＥＢＶ（
１型もしくは２型）、またはＣＭＶである。より好ましくは、ヘルペスウイルスは、ＶＺ
Ｖ、ＨＳＶ−２、またはＣＭＶである。さらにより好ましくは、ヘルペスウイルスは、Ｃ
ＭＶである。ｇＨおよびｇＬタンパク質ならびにこれらのウイルス由来のタンパク質をコ
ードする核酸の配列は、当技術分野において周知である。例示的な配列は、表１で特定さ
れる。ポリシストロニック核酸分子は、表１に開示されるｇＨタンパク質をコードする第
１の配列もしくはその断片またはそれと少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、
９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含有するこ
とができる。ポリシストロニック核酸分子はまた、表１に開示されるｇＬタンパク質をコ
ードする第２の配列もしくはその断片またはそれと少なくとも約９０％、９１％、９２％
、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を
も含有することができる。

本発明の本記載において、特定の配列成分は、核酸の明確な記載を容易にするために「
第１の配列」、「第２の配列」などと呼ばれる。第１および第２の配列は、任意の所望の
順序または方向で現れ得、特定の順序または方向は、「第１の」、「第２の」などの語に
よって意図されないことが理解される。同様に、タンパク質複合体は、複合体において存
在するタンパク質、たとえばｇＨ／ｇＬを列挙することによって言及される。これは、複
合体において存在するタンパク質によって複合体を記載するように意図され、タンパク質
の相対量または組換え核酸上でタンパク質をコードする配列の順序もしくは方向を示すも
のではない。

ＣＭＶタンパク質をコードする配列を含有するアルファウイルスＶＲＰおよび自己複製
ＲＮＡなどのある種の好ましい実施形態は、本明細書においてさらに記載される。そのよ
うな好ましい実施形態におけるＣＭＶタンパク質をコードする配列は、他のヘルペスウイ
ルス由来のｇＨおよびｇＬなどのタンパク質をコードする配列と交換することができるこ
とが意図される。

アルファウイルスＶＲＰプラットフォーム
いくつかの実施形態では、ＣＭＶタンパク質は、下記に記載されるポリシストロニック
レプリコン（またはベクター）を用いるアルファウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）を使
用して、細胞に送達される。本明細書において使用されるように、「ポリシストロニック
」は、バイシストロニックベクターおよび３つ以上のシストロンを含むベクターを含む。
ポリシストロニックベクターにおけるシストロンは、同じＣＭＶ株または異なるＣＭＶ株
由来のＣＭＶタンパク質をコードすることができる。シストロンは、任意の５’−３’の
順序で方向づけることができる。ＣＭＶタンパク質をコードする任意のヌクレオチド配列
は、タンパク質を産生するために使用することができる。２つ以上のＣＭＶタンパク質ま
たはその断片をコードするポリシストロニック核酸を調製するのに有用な例示的な配列は
、本明細書において記載される。

本明細書において使用されるように、用語「アルファウイルス」は、当技術分野におけ
るその通常の意味を有し、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ；たとえばＴｒｉｎｉｄ
ａｄ ｄｏｎｋｅｙ、ＴＣ８３ＣＲなど）、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、シンドビ
スウイルス、ロスリバーウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、チク
ングニヤウイルス、Ｓ．Ａ．ＡＲ８６ウイルス、エバーグレイズウイルス、ムカンボウイ
ルス、バーマ森林ウイルス、ミッデルブルグウイルス、ピクスナウイルス、オニオニオン
ウイルス、ゲタウイルス、サギヤマウイルス、ベバルウイルス、マヤロウイルス、ユナウ
イルス、アウラウイルス、ワタロアウイルス、バンバンキウイルス（Ｂａｎｂａｎｋｉ
ｖｉｒｕｓ）、キジラガチウイルス（Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈ ｖｉｒｕｓ）、ハイランド
Ｊウイルス、フォートモーガンウイルス（Ｆｏｒｔ Ｍｏｒｇａｎ ｖｉｒｕｓ）、ヌド
ゥムウイルス、およびバギークリークウイルス（Ｂｕｇｇｙ Ｃｒｅｅｋ ｖｉｒｕｓ）
などの様々な種を含む。アルファウイルスという用語はまた、１つを超えるアルファウイ
ルス由来のゲノム配列を含有するキメラアルファウイルス（たとえばＰｅｒｒｉら、（２
００３年）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．７７巻（１９号）：１０３９４〜４０３頁によって記載さ
れるもの）をも含んでいてもよい。

「アルファウイルスレプリコン粒子」（ＶＲＰ）または「レプリコン粒子」は、アルフ
ァウイルス構造タンパク質によりパッケージされたアルファウイルスレプリコンである。

「アルファウイルスレプリコン」（または「レプリコン」）は、標的細胞においてｉｎ
ｖｉｖｏにおいてそれ自体の増幅を指示することができるＲＮＡ分子である。レプリコ
ンは、ＲＮＡ増幅を触媒するポリメラーゼ（複数可）（ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、
ｎｓＰ４）をコードし、コードされるポリメラーゼ（複数可）によって認識され、利用さ
れる、複製に必要とされるシスＲＮＡ配列を含有する。アルファウイルスレプリコンは、
典型的に、次の順序付けられたエレメントを含有する：複製のためにシスで必要とされる
５’ウイルス配列、生物学的に活性なアルファウイルス非構造タンパク質（ｎｓＰ１、ｎ
ｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）をコードする配列、複製のためにシスで必要とされる３’
ウイルス配列、およびポリアデニレートトラクト（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｅ ｔｒａ
ｃｔ）。アルファウイルスレプリコンはまた、異種ヌクレオチド配列の発現を指示する１
つまたは複数のウイルスサブゲノム「ジャンクション領域」プロモーターを含有してもよ
く、これは、ある実施形態において、発現されることとなるサブゲノム断片および異種配
列（複数可）のウイルス転写を増大させるまたは低下させるために修飾されてもよい。下
記に記載される他の制御エレメントを使用することができる。

ＣＭＶタンパク質をコードするアルファウイルスレプリコンは、ＶＲＰを産生するため
に使用される。そのようなアルファウイルスレプリコンは、少なくとも２つのＣＭＶタン
パク質またはその断片をコードする配列を含む。これらの配列は、同じまたは異なるもの
であり得る、サブゲノムプロモーター、ＩＲＥＳ（たとえばＥＭＣＶ、ＥＶ７１）、およ
びウイルス２Ａ部位などの１つまたは複数の適した制御エレメントに作動可能に連結され
ている。本明細書において開示されるポリシストロニックベクターを使用するこれらの複
合体の成分の送達は、所望の相対量で２つ以上のＣＭＶタンパク質をコードする核酸配列
を提供するための効率的な方法であるのに対して、複数のアルファウイルス構築物が、複
合体形成のための個々のＣＭＶタンパク質を送達するために使用される場合、ＶＲＰの効
率的な同時送達が、必要とされるであろう。

適した制御エレメントの任意の組み合わせもまた、任意の順序で使用することができる
。一例では、単一のサブゲノムプロモーターは、２つの異なるＣＭＶタンパク質をコード
する２つの配列に作動可能に連結されており、ＩＲＥＳは、２つのコード配列の間に位置
づけられる。他の例では、２つの異なるＣＭＶタンパク質をコードする２つの配列は、別
々のプロモーターに作動可能に連結されている。他の例では、２つの異なるＣＭＶタンパ
ク質をコードする２つの配列は、単一のプロモーターに作動可能に連結されている。２つ
の異なるＣＭＶタンパク質をコードする２つの配列は、ウイルス２Ａ部位をコードするヌ
クレオチド配列を通して互いに連結されており、したがって、両方のＣＭＶタンパク質の
アミノ酸配列を含有する単一のアミノ酸鎖をコードする。この文脈におけるウイルス２Ａ
部位は、コードされるポリプロテインから２つのＣＭＶタンパク質を生成するために使用
される。

サブゲノムプロモーター
ジャンクション領域プロモーターとしても公知であるサブゲノムプロモーターは、タン
パク質発現を調節するために使用することができる。アルファウイルスのサブゲノムプロ
モーターは、アルファウイルスの構造タンパク質の発現を調節する。Ｓｔｒａｕｓｓおよ
びＳｔｒａｕｓｓ、「Ｔｈｅ ａｌｐｈａｖｉｒｕｓｅｓ： ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓ
ｉｏｎ， ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ」 Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ Ｒｅｖ．１９９４年 ９月；５８巻（３号）：４９１〜５６２頁を参照されたい。
ポリシストロニックポリヌクレオチドは、任意のアルファウイルス由来のサブゲノムプロ
モーターを含むことができる。２つ以上のサブゲノムプロモーターがポリシストロニック
ポリヌクレオチドにおいて存在する場合、そのプロモーターは、同じかまたは異なるもの
であり得る。たとえば、サブゲノムプロモーターは、配列ＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡ
ＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡ（配列番号＿＿＿）を有することができる。ある実施形態では、サ
ブゲノムプロモーターは、タンパク質のウイルス転写を増大させるまたは低下させるため
に修飾することができる。米国特許第６，５９２，８７４号を参照されたい。

内部リボソーム導入部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｅｎｔｒｙ ｓｉ
ｔｅ）（ＩＲＥＳ）
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の制御エレメントは、内部リボソーム導入部
位（ＩＲＥＳ）である。ＩＲＥＳは、複数のタンパク質が単一のｍＲＮＡ転写物から作製
されるのを可能にする。なぜなら、リボソームがそれぞれのＩＲＥＳに結合し、真核細胞
においてタンパク質の翻訳を開始するために通常必要とされる５’キャップの非存在下に
おいて翻訳を開始するからである。たとえば、ＩＲＥＳは、ＥＶ７１またはＥＭＣＶであ
り得る。

ウイルス２Ａ部位
ＦＭＤＶ ２Ａタンパク質は、非構造タンパク質（ＦＭＤＶ ２Ｂ）からＦＭＤＶの構
造タンパク質を隔てるための役目をする短いペプチドである。このペプチドに対する初期
の研究は、それが自己触媒プロテアーゼとして作用することを示唆したが、他の研究（た
とえばＤｏｎｎｅｌｌｙら、（２００１年）、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２巻、１０１
３〜１０２５頁）は、この短い配列およびこれに続くＦＭＤＶ ２Ｂの単一のアミノ酸（
Ｇｌｙ）が、翻訳の停止−開始点（ｓｔｏｐ−ｓｔａｒｔ）として作用することを示唆す
る。厳密な作用様式にかかわらず、配列を、２つのポリペプチドの間に挿入し、単一のオ
ープンリーディングフレームからの複数の個々のポリペプチドの産生を達成することがで
きる。本発明との関連において、ＦＭＤＶ ２Ａ配列を、少なくとも２つのＣＭＶタンパ
ク質をコードする配列の間に挿入することができ、単一のオープンリーディングフレーム
の一部としてそれらの合成を可能にする。たとえば、オープンリーディングフレームは、
ウイルス２Ａ部位をコードする配列によって隔てられたｇＨタンパク質およびｇＬタンパ
ク質をコードしてもよい。単一のｍＲＮＡは、その後、翻訳ステップの間に転写され、ｇ
ＨおよびｇＬペプチドは、ウイルス２Ａ部位の活性により別々に産生される。任意の適し
たウイルス２Ａ配列が使用されてもよい。多くの場合、ウイルス２Ａ部位は、コンセンサ
ス配列Ａｓｐ−Ｖａｌ／Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏを含み、
ここでＸは、任意のアミノ酸である（配列番号＿＿＿）。たとえば、口蹄疫ウイルス２Ａ
ペプチド配列は、ＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号＿＿＿）である。Ｔｒｉｃｈａｓら、「Ｕ
ｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｖｉｒａｌ ２Ａ ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｏｒ ｂｉｃｉｓｔｒｏｎ
ｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ」 ＢＭＣ Ｂｉ
ｏｌ．２００８年９月１５日；６巻：４０頁およびＨａｌｐｉｎら、「Ｓｅｌｆ−ｐｒｏ
ｃｅｓｓｉｎｇ ２Ａ−ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎｓ−−ａ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃｏ
−ｏｒｄｉｎａｔｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ
ｓ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ」 Ｐｌａｎｔ Ｊ．１９９９年２月；
１７巻（４号）：４５３〜９頁を参照されたい。

いくつかの実施形態では、アルファウイルスレプリコンは、ＶＥＥ−シンドビスキメラ
レプリコン（ＶＣＲ）またはＶＥＥ株ＴＣ８３レプリコン（ＴＣ８３Ｒ）またはＴＣ８３
−シンドビスキメラレプリコン（ＴＣ８３ＣＲ）などのキメラレプリコンである。いくつ
かの実施形態では、ＶＣＲは、ＶＥＥレプリコンのｎｓＰ３における配列の代わりに、ま
た３’末端に、シンドビスレプリコン由来のパッケージングシグナルおよび３’ＵＴＲを
含有する；Ｐｅｒｒｉら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．７７巻、１０３９４〜４０３頁、２００３
年を参照されたい。いくつかの実施形態では、ＴＣ８３ＣＲは、ＶＥＥ株ＴＣ８３レプリ
コンのｎｓＰ３における配列の代わりに、また３’末端に、シンドビスレプリコン由来の
パッケージングシグナルおよび３’ＵＴＲを含有する。

ＶＲＰの産生
ＶＲＰを調製するための方法は、当技術分野において周知である。いくつかの実施形態
では、アルファウイルスは、パッケージング細胞を使用してＶＲＰに構築される。「アル
ファウイルスパッケージング細胞」（または「パッケージング細胞」）は、１つまたは複
数のアルファウイルス構造タンパク質発現カセットを含有し、アルファウイルスレプリコ
ン、真核生物層状ベクター開始系（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｌａｙｅｒｅｄ ｖｅｃｔｏ
ｒ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）（たとえば米国特許第５，８１４，４８２号
）、または組換えアルファウイルス粒子の導入後に組換えアルファウイルス粒子を産生す
る細胞である。１つまたは複数の異なるアルファウイルス構造タンパク質カセットは、ア
ルファウイルス構造タンパク質を提供することによって「ヘルパー」としての役目をする
。「アルファウイルス構造タンパク質カセット」は、１つまたは複数のアルファウイルス
構造タンパク質をコードし、アルファウイルスレプリカーゼ認識配列の少なくとも１つ、
５つまでのコピー（つまり１、２、３、４、または５）を含む発現カセットである。構造
タンパク質発現カセットは、典型的に、５’から３’に、アルファウイルスＲＮＡの転写
を開始する５’配列、任意選択のアルファウイルスサブゲノム領域プロモーター、アルフ
ァウイルス構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列、３’非翻訳領域（これはまた
、ＲＮＡ転写をも指示する）、およびポリＡトラクト（ｐｏｌｙＡ ｔｒａｃｔ）を含む
。たとえば、国際公開第２０１０／０１９４３７号を参照されたい。

好ましい実施形態では、２つの異なるアルファウイルス構造タンパク質カセット（「分
割された」不完全ヘルパー）は、複製能力のあるウイルスを産生し得る組換え事象を最小
限にするために、パッケージング細胞において使用される。いくつかの実施形態では、ア
ルファウイルス構造タンパク質カセットは、カプシドタンパク質（Ｃ）をコードするが、
どちらの糖タンパク質（Ｅ２およびＥ１）もコードしない。いくつかの実施形態では、ア
ルファウイルス構造タンパク質カセットは、カプシドタンパク質およびＥ１またはＥ２糖
タンパク質のいずれか（両方ではない）をコードする。いくつかの実施形態では、アルフ
ァウイルス構造タンパク質カセットは、Ｅ２およびＥ１糖タンパク質をコードするが、カ
プシドタンパク質をコードしない。いくつかの実施形態では、アルファウイルス構造タン
パク質カセットは、Ｅ１またはＥ２糖タンパク質（両方ではない）をコードするが、カプ
シドタンパク質をコードしない。

いくつかの実施形態では、ＶＲＰは、様々な供給源の細胞の中へのレプリコンおよびヘ
ルパーＲＮＡの同時の導入によって産生される。これらの条件下で、たとえば、ＢＨＫＶ
細胞（１×１０^７）は、１０μｇレプリコンＲＮＡ：６μｇ不完全ヘルパーＣａｐ ＲＮ
Ａ：１０μｇ不完全ヘルパーＧｌｙ ＲＮＡを、たとえば２２０ボルト、１０００μＦ、
２つの手動のパルスでエレクトロポレーションされ、アルファウイルス含有上清は、約２
４時間後に収集される。レプリコンおよび／またはヘルパーはまた、トランスフェクトさ
れた細胞内に適したＲＮＡを送り出すＤＮＡ形態で導入することもできる。

パッケージング細胞は、哺乳動物細胞または昆虫細胞（たとえばＳＦ９）またはトリの
細胞（たとえば初代ニワトリもしくはアヒル線維芽細胞もしくは線維芽細胞細胞株）など
の非哺乳動物細胞であってもよい。米国特許第７，４４５，９２４号を参照されたい。細
胞のトリの供給源は、ＥＢ６６（登録商標）（ＶＩＶＡＬＩＳ）などのトリの胚性幹細胞
；ＥＢｘ（登録商標）細胞、ニワトリ胚性線維芽細胞、およびニワトリ胚性生殖細胞など
のニワトリ胚性幹細胞を含むニワトリ細胞；たとえばＶａｃｃｉｎｅ ２７巻：４９７５
〜４９８２頁（２００９年）および国際公開第２００５／０４２７２８号において記載さ
れるＡＧＥ１．ＣＲおよびＡＧＥ１．ＣＲ．ｐＩＸ細胞株（ＰｒｏＢｉｏＧｅｎ）などの
アヒル細胞；ならびにガチョウ細胞を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形
態では、パッケージング細胞は、ＡＧＥ．ＣＲ（ＰＲＯＢＩＯＧＥＮ）などの初代アヒル
線維芽細胞またはアヒル網膜細胞株である。

同時の核酸導入および／またはパッケージング細胞のための細胞の哺乳動物の供給源は
、たとえば国際公開第０１／３８３６２号および国際公開第０２／４０６６５号において
記載され、ＥＣＡＣＣ寄託番号９６０２２９４０下で寄託されるＰｅｒＣ６（ＰＥＲ．Ｃ
６）細胞（ＣＲＵＣＥＬＬ Ｎ．Ｖ．）；ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１７１）；Ｗ
Ｉ−３８（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−７５）；胎児アカゲザル肺細胞（ＡＴＣＣ ＣＬ−１６０
）；ヒト胎児腎臓細胞（たとえば剪断されたアデノウイルス５型ＤＮＡによって典型的に
形質転換された２９３細胞）；サル腎臓由来のＶＥＲＯ細胞を含むヒトまたは非ヒト霊長
類細胞；ウマ、ウシ（たとえばＭＤＢＫ細胞）、ヒツジ、イヌ（たとえば、国際公開第９
７／３７００１号において記載されるようなイヌ腎臓由来のＭＤＣＫ細胞、ＡＴＣＣ Ｃ
ＣＬ３４ ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）、またはＭＤＣＫ ３３０１６、寄託番号ＤＳＭ ＡＣ
Ｃ ２２１９）の細胞；ネコ、ならびにげっ歯類（たとえば、ＢＨＫ２１−Ｆ、ＨＫＣＣ
細胞、またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などのハムスター細胞）を含む
が、これらに限定されず、たとえば成体、新生児、胎児、および胚を含む種々様々の発生
段階から取得され得る。

いくつかの実施形態では、パッケージング細胞は、１つまたは複数の構造タンパク質発
現カセット（複数可）により安定して形質転換される。構造タンパク質発現カセットは、
トランスフェリン−ポリカチオン媒介性のＤＮＡ移行（ＤＮＡ ｔｒａｎｓｆｅｒ）、裸
の核酸または被包された核酸でのトランスフェクション、リポソーム媒介性の細胞融合、
ＤＮＡでコーティングされたラテックスビーズの細胞内輸送、プロトプラスト融合、ウイ
ルス感染、エレクトロポレーション、「遺伝子銃」法、およびＤＥＡＥまたはリン酸カル
シウム媒介性のトランスフェクションを含む、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して、細
胞の中に導入することができる。構造タンパク質発現カセットは、ＤＮＡ分子として宿主
細胞の中に典型的に導入されるが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡとして導入する
こともできる。発現カセットはそれぞれ、別々にまたは実質的に同時に導入することがで
きる。

いくつかの実施形態では、安定したアルファウイルスパッケージング細胞株は、組換え
アルファウイルス粒子を産生するために使用される。これらは、それらのゲノムの中に安
定して組み込まれる不完全ヘルパーＲＮＡを発現するＤＮＡカセットを含むアルファウイ
ルス許容細胞である。Ｐｏｌｏら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ９６巻、４５９８〜６０３頁、１９９９年を参照されたい。ヘルパーＲＮＡは、構成
的に発現されるが、アルファウイルス構造タンパク質は、遺伝子がアルファウイルスサブ
ゲノムプロモーターの制御下にあるので、そうではない（Ｐｏｌｏら、１９９９年）。ト
ランスフェクションまたはＶＲＰ感染によるパッケージング細胞のゲノムの中へのアルフ
ァウイルスレプリコンの導入に際して、レプリカーゼ酵素は、産生され、ヘルパーＲＮＡ
上でカプシドおよび糖タンパク質遺伝子の発現を引き起こし、結果としてＶＲＰが産生さ
れる。レプリコンの導入は、アルファウイルスレプリコン粒子のシードストックによるト
ランスフェクションおよび感染の両方を含む様々な方法によって達成することができる。
その後、パッケージング細胞は、培養上清中にパッケージされたアルファウイルスレプリ
コン粒子を産生するのに十分な条件下でかつ十分な時間、インキュベートされる。

したがって、パッケージング細胞は、ＶＲＰが自己増殖ウイルスとして作用するのを可
能にする。この技術は、ＶＲＰが、弱毒化生ワクチンまたはアデノウイルスＥ１Ａおよび
Ｅ１Ｂ遺伝子を発現する細胞において成長させた複製能力がないアデノウイルスベクター
などの入手可能なプロデューサー細胞株を有する他のウイルスベクターに使用されるもの
とほとんど同じ様式で、また同じ設備を使用して産生されるのを可能にする。

いくつかの実施形態では、２ステップのプロセスが、使用され、第１のステップは、レ
プリコンＲＮＡまたはプラスミドＤＮＡベースのレプリコンによりパッケージング細胞を
トランスフェクトすることによってアルファウイルスレプリコン粒子のシードストックを
産生することを含む。その後、レプリコン粒子のはるかに多くのストックは、シードスト
ックによりパッケージング細胞の新鮮な培養物を感染させることによって、第２のステッ
プにおいて産生される。この感染は、ＭＯＩ＝０．００００１、０．００００５、０．０
００１、０．０００５、０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５
、１．０、３、５、１０、または２０を含む、様々な感染多重度（ＭＯＩ）を使用して実
行することができる。いくつかの実施形態では、感染は、低いＭＯＩ（たとえば１未満）
で実行される。ある期間にわたって、レプリコン粒子は、シードストックにより感染させ
たパッケージング細胞から収集することができる。いくつかの実施形態では、その後、レ
プリコン粒子は、繰り返しの低多重度の感染によって、ナイーブパッケージング細胞のさ
らにより多くの培養物において継代され得、同一の高い力価を有する商業規模の調製物を
もたらすことができる。

自己複製ＲＮＡプラットフォーム
２つ以上のＣＭＶタンパク質は、被験体の細胞における、タンパク質をコードする組換
え核酸の発現によって産生することができる。好ましくは、組換え核酸分子は、２つ以上
のＣＭＶタンパク質をコードし、たとえばこれらはポリシストロニックである。上記に定
義されるように、「ポリシストロニック」は、バイシストロニックを含む。ＣＭＶタンパ
ク質の産生を引き起こすために被験体に投与することができる好ましい核酸は、自己複製
ＲＮＡ分子である。本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、ＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡに基
づくが、１つまたは複数の構造タンパク質をコードする遺伝子を欠く。自己複製ＲＮＡ分
子は、自己複製ＲＮＡによってコードされるＲＮＡウイルスの非構造タンパク質およびＣ
ＭＶタンパク質を産生するために翻訳することができる。

自己複製ＲＮＡは、一般的に、ウイルスレプリカーゼ、ウイルスプロテアーゼ、ウイル
スヘリカーゼ、および他の非構造ウイルスタンパク質から成る群から選択される少なくと
も１つまたは複数の遺伝子を含有し、また、５’および３’末端シス活性複製配列ならび
に２つ以上の所望のＣＭＶタンパク質をコードする異種配列を含む。異種配列（複数可）
の発現を指示するサブゲノムプロモーターは、自己複製ＲＮＡ中に含むことができる。所
望の場合、異種配列は、自己複製ＲＮＡにおける他のコード領域に対してインフレームで
融合されてもよいおよび／または内部リボソーム導入部位（ＩＲＥＳ）の制御下にあって
もよい。

本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、自己複製ＲＮＡ分子が感染性ウイルス粒子の産生を誘
発することができないように、設計することができる。これは、たとえば、自己複製ＲＮ
Ａにおけるウイルス粒子の産生に必要な構造タンパク質をコードする１つまたは複数のウ
イルス遺伝子を取り除くことによって達成することができる。たとえば、自己複製ＲＮＡ
分子が、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）、セムリキ森林ウイルス、およびベネズエラウマ
脳炎ウイルス（ＶＥＥ）などのアルファウイルスに基づくものである場合、カプシドおよ
び／またはエンベロープ糖タンパク質などのウイルス構造タンパク質をコードする１つま
たは複数の遺伝子は、取り除くことができる。所望の場合、本発明の自己複製ＲＮＡ分子
は、弱毒化されたもしくは毒性のある感染性ウイルス粒子の産生を誘発するようにまたは
１回の続く感染が可能なウイルス粒子を産生するように設計することができる。

自己複製ＲＮＡ分子は、あらゆるタンパク質がなくても、脊椎動物細胞に送達された場
合、それ自体からの（またはそれ自体のアンチセンスコピーからの）転写によって複数の
娘ＲＮＡの産生を導くことができる。自己複製ＲＮＡは、細胞に送達した後に、直接翻訳
することができ、この翻訳は、送達されたＲＮＡから転写物をその後産生するＲＮＡ依存
性ＲＮＡポリメラーゼを提供する。したがって、送達されたＲＮＡは、複数の娘ＲＮＡの
産生を導く。これらの転写物は、送達されたＲＮＡに関してアンチセンスであり、コード
されるＣＭＶタンパク質のｉｎ ｓｉｔｕ発現をもたらすためにそれら自体翻訳されても
よいまたはコードされるＣＭＶタンパク質（複数可）のｉｎ ｓｉｔｕ発現を提供するた
めに翻訳される、送達されたＲＮＡと同じセンスを有する転写物をさらに提供するために
転写されてもよい。

自己複製を達成するのに適したある系は、本明細書において記載されるようなアルファ
ウイルスレプリコンなどのアルファウイルスベースのＲＮＡレプリコンを使用することで
ある。これらの＋鎖レプリコンは、レプリカーゼ（またはレプリカーゼ−トランスクリプ
ターゼ）を産生するために細胞に送達した後に翻訳される。レプリカーゼは、＋鎖送達Ｒ
ＮＡのゲノム−鎖コピーを生成する複製複合体を提供するために自己切断するポリプロテ
インとして翻訳される。これらの−鎖転写物は、＋鎖の親ＲＮＡのコピーをさらに提供す
るために、また、２つ以上のＣＭＶタンパク質をコードする１つまたは複数のサブゲノム
転写物をも生じさせるために、それら自体を転写することができる。サブゲノム転写物の
翻訳は、したがって、感染細胞によるＣＭＶタンパク質（複数可）のｉｎ ｓｉｔｕ発現
を導く。適したアルファウイルスレプリコンは、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイ
ルス、東部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルスなどに由来するレプリカーゼ
を使用することができる。

好ましい自己複製ＲＮＡ分子は、したがって、（ｉ）自己複製ＲＮＡ分子からＲＮＡを
転写することができるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよび（ｉｉ）２つ以上のＣＭＶ
タンパク質またはその断片をコードする。ポリメラーゼは、たとえばアルファウイルスタ
ンパク質ｎｓＰ４を含むアルファウイルスレプリカーゼであり得る。タンパク質ｎｓＰ４
は、レプリカーゼの重要な触媒成分である。

天然アルファウイルスゲノムは、非構造レプリカーゼポリプロテインに加えて構造ビリ
オンタンパク質をコードするのに対して、本発明のアルファウイルスベースの自己複製Ｒ
ＮＡ分子は、すべてのアルファウイルス構造タンパク質をコードするわけではないことが
好ましい。したがって、自己複製ＲＮＡは、ＲＮＡ含有アルファウイルスビリオンの産生
ではなく、細胞におけるそれ自体のゲノムＲＮＡコピーの産生を導くことができる。これ
らのビリオンを産生することができないということは、野生型アルファウイルスと異なり
、自己複製ＲＮＡ分子が感染性形態でそれ自体を永続させることができないことを意味す
る。野生型ウイルスにおいて永続化に必要なアルファウイルス構造タンパク質は、本発明
の自己複製ＲＮＡに存在せず、それらの場所は、所望の遺伝子産物（ＣＭＶタンパク質ま
たはその断片）をコードする遺伝子（複数可）によって使用され、サブゲノム転写物は、
構造アルファウイルスビリオンタンパク質ではなく所望の遺伝子産物をコードする。

したがって、本発明による有用な自己複製ＲＮＡ分子は、異なるＣＭＶタンパク質また
はその断片をコードする２つの配列を有する。ＣＭＶタンパク質または断片をコードする
配列は、任意の所望の方向とすることができ、同じまたは別々のプロモーターに作動可能
に連結することができる。所望の場合、ＣＭＶタンパク質または断片をコードする配列は
、単一のオープンリーディングフレームの一部であり得る。いくつかの実施形態では、Ｒ
ＮＡは、たとえば他の追加のＣＭＶタンパク質またはその断片をコードする、１つまたは
複数の追加の（下流）配列またはオープンリーディングフレームを有していてもよい。自
己複製ＲＮＡ分子は、コードされるレプリカーゼと適合性の５’配列を有することができ
る。

一態様では、自己複製ＲＮＡ分子は、本明細書において定義されるようなアルファウイ
ルスレプリコンなどのアルファウイルスに由来するまたはそれに基づく。他の態様では、
自己複製ＲＮＡ分子は、アルファウイルス以外のウイルス、好ましくはプラス鎖ＲＮＡウ
イルスおよびより好ましくはピコルナウイルス、フラビウイルス、ルビウイルス、ペスチ
ウイルス、ヘパシウイルス、カリシウイルス、またはコロナウイルスに由来するまたはそ
れに基づく。適した野生型アルファウイルス配列は、周知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔ
ｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．などの配
列保管機関から入手可能である。適したアルファウイルスの代表的な例は、アウラ（ＡＴ
ＣＣ ＶＲ−３６８）、ベバルウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−６００、ＡＴＣＣ ＶＲ−１
２４０）、カバス（Ｃａｂａｓｓｏｕ）（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２２）、チクングニヤウイ
ルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−６４、ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４１）、東部ウマ脳脊髄炎ウイルス
（ＡＴＣＣ ＶＲ−６５、ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４２）、フォートモーガン（ＡＴＣＣ
ＶＲ−９２４）、ゲタウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３６９、ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４３）
、キジラガチ（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２７）、マヤロウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−６６；Ａ
ＴＣＣ ＶＲ−１２７７）、ミッデルブルグ（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７０）、ムカンボウイ
ルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−５８０、ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４４）、ヌドゥム（ＡＴＣＣ Ｖ
Ｒ−３７１）、ピクスナウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７２、ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４５
）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７３、ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４６）、セム
リキ森林（ＡＴＣＣ ＶＲ−６７、ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４７）、シンドビスウイルス（
ＡＴＣＣ ＶＲ−６８、ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４８）、トナテ（Ｔｏｎａｔｅ）（ＡＴＣ
Ｃ ＶＲ−９２５）、トリニティ（ＡＴＣＣ ＶＲ−４６９）、ユナ（ＡＴＣＣ ＶＲ−
３７４）、ベネズエラウマ脳脊髄炎（ＡＴＣＣ ＶＲ−６９、ＡＴＣＣ ＶＲ−９２３、
ＡＴＣＣ ＶＲ−１２５０ ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４９、ＡＴＣＣ ＶＲ−５３２）、西
部ウマ脳脊髄炎（ＡＴＣＣ ＶＲ−７０、ＡＴＣＣ ＶＲ−１２５１、ＡＴＣＣ ＶＲ−
６２２、ＡＴＣＣ ＶＲ−１２５２）、ワタロア（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２６）、およびＹ
−６２−３３（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７５）を含む。

本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含有し、そのた
め、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて改善された安定性を有し、分解およびクリアランスに対して
抵抗性であり、また他の利点を有することができる。あらゆる特定の理論によって束縛さ
れることを望むものではないが、修飾ヌクレオチドを含有する自己複製ＲＮＡ分子は、自
己複製ＲＮＡが細胞に送達される場合、エンドソームおよび細胞質内免疫受容体の刺激を
回避するまたは低下させると考えられる。これは、自己複製、増幅、およびタンパク質の
発現が起こるのを可能にする。修飾ヌクレオチドを含有する自己複製ＲＮＡが、自然免疫
系の活性化および続く望まれない結果（たとえば注射部位の炎症、注射部位の刺激、痛み
、およびその他同種のもの）を低下させるので、これはまた、修飾ヌクレオチドを含有し
ない自己複製ＲＮＡに関する安全性の問題をも低下させる。自己複製の結果として産生さ
れるＲＮＡ分子が、細胞質内免疫受容体によって外来核酸として認識されることもまた、
考えられる。したがって、修飾ヌクレオチドを含有する自己複製ＲＮＡ分子は、宿主細胞
におけるＲＮＡの効率的な増幅およびＣＭＶタンパク質の発現ならびにアジュバント効果
を提供する。

ＲＮＡ配列は、たとえば、ＲＮＡの翻訳の有効性および半減期を増大させるために、そ
のコドン使用頻度に関して修飾されてもよい。ポリＡテイル（たとえば約３０アデノシン
残基以上の）は、その半減期を延長させるためにＲＮＡの３’末端に付加されてもよい。
ＲＮＡの５’末端は、構造ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ（キャップ０構造）を有する
修飾リボヌクレオチドまたはその誘導体によりキャップされてもよく、これは、ＲＮＡ合
成の間に組み込むことができるまたはＲＮＡ転写後に酵素により操作することができる（
たとえば、Ｎ７−モノメチル化キャップ０構造の構築を触媒する、ｍＲＮＡトリホスファ
ターゼ、グアニリルトランスフェラーゼ、およびグアニン−７−メチルトランスフェラー
ゼ（ｇｕａｎｉｎｅ−７−ｍｅｔｈｙｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）から成るワクシニアウイ
ルスキャッピング酵素（ＶＣＥ）を使用することによって）。キャップ０構造は、ＲＮＡ
分子に対して、安定性および翻訳の有効性を提供することができる。ＲＮＡ分子の５’キ
ャップは、翻訳の有効性をさらに増大させ得るキャップ１構造（ｍ７Ｇｐｐｐ［ｍ２’−
Ｏ］Ｎ）の生成をもたらす２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼによってさらに修飾され
てもよい。キャップ１構造はまた、ｉｎ ｖｉｖｏにおける効力をも増大させてもよい。

本明細書において使用されるように、「修飾ヌクレオチド」は、ヌクレオシド（たとえ
ばシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）もしくはウラシル（Ｕ）、アデニン（Ａ）、またはグア
ニン（Ｇ））の窒素を含む塩基においてまたはその塩基上に１つまたは複数の化学修飾（
たとえば置換）を含有するヌクレオチドを指す。所望の場合、自己複製ＲＮＡ分子は、ヌ
クレオシドの糖部分（たとえばリボース、デオキシリボース、修飾リボース、修飾デオキ
シリボース、６員環糖アナログ、もしくは鎖状糖アナログ）またはホスフェート中にまた
はその上に化学修飾を含有することができる。

自己複製ＲＮＡ分子は、好ましくは５’キャップの一部ではない、少なくとも１つの修
飾ヌクレオチドを含有することができる（たとえば、５”キャップの一部である修飾に加
えて）。したがって、自己複製ＲＮＡ分子は、単一の位置に修飾ヌクレオチドを含有する
ことができるか、２つ以上の位置に特定の修飾ヌクレオチド（たとえばプソイドウリジン
、Ｎ６−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、５−メチルウリジン）を含有すること
ができるか、または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくはそれ以上の修飾ヌ
クレオチドを含有することができる（たとえば、それぞれ１つもしくは複数の位置に）。
好ましくは、自己複製ＲＮＡ分子は、窒素を含む塩基上にまたはその中に修飾を含有する
が、修飾糖部分または修飾ホスフェート部分を含有しない修飾ヌクレオチドを含む。

いくつかの例では、自己複製ＲＮＡ分子におけるヌクレオチドの０．００１％〜９９％
または１００％は、修飾ヌクレオチドである。たとえば、自己複製ＲＮＡ分子におけるヌ
クレオチドの０．００１％〜２５％、０．０１％〜２５％、０．１％〜２５％、または１
％〜２５％は、修飾ヌクレオチドである。

他の例では、自己複製ＲＮＡ分子における特定の未修飾ヌクレオチドの０．００１％〜
９９％または１００％は、修飾ヌクレオチドと交換される。たとえば、ウリジンを含有す
る自己複製ＲＮＡ分子におけるヌクレオチドの約１％は、ウリジンのプソイドウリジンと
の交換によってなどのように、修飾することができる。他の例では、自己複製ＲＮＡ分子
における所望の量（パーセンテージ）の２、３、または４つの特定のヌクレオチド（ウリ
ジン、シチジン、グアノシン、またはアデニンを含有するヌクレオチド）は、修飾ヌクレ
オチドである。たとえば、自己複製ＲＮＡ分子における特定のヌクレオチドの０．００１
％〜２５％、０．０１％〜２５％、０．１％〜２５、または１％〜２５％は、修飾ヌクレ
オチドである。他の例では、自己複製ＲＮＡ分子における特定のヌクレオチドの０．００
１％〜２０％、０．００１％〜１５％、０．００１％〜１０％、０．０１％〜２０％、０
．０１％〜１５％、０．１％〜２５、０．０１％〜１０％、１％〜２０％、１％〜１５％
、１％〜１０％、または約５％、約１０％、約１５％、約２０％は、修飾ヌクレオチドで
ある。

自己複製ＲＮＡ分子におけるヌクレオチドの１００％未満が、修飾ヌクレオチドである
ことが好ましい。自己複製ＲＮＡ分子における特定のヌクレオチドの１００％未満が、修
飾ヌクレオチドであることもまた好ましい。したがって、好ましい自己複製ＲＮＡ分子は
、少なくともいくつかの未修飾ヌクレオチドを含む。

哺乳動物ＲＮＡ上に見つけられる９６を超える天然に存在するヌクレオシド修飾がある
。たとえばＬｉｍｂａｃｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２巻
（１２号）：２１８３〜２１９６頁（１９９４年）を参照されたい。ヌクレオチドおよび
修飾ヌクレオチドならびにヌクレオシドの調製物は、当技術分野において、たとえば、す
べてそれらの全体が参照によって本明細書において組み込まれる米国特許第４３７３０７
１号、第４４５８０６６号、第４５００７０７号、第４６６８７７７号、第４９７３６７
９号、第５０４７５２４号、第５１３２４１８号、第５１５３３１９号、第５２６２５３
０号、第５７００６４２号から周知であり、多くの修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオ
チドが、市販で入手可能である。

修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドの中に組み込むことができ、ＲＮＡ分子において
存在することができる修飾核酸塩基は、ｍ５Ｃ（５−メチルシチジン）、ｍ５Ｕ（５−メ
チルウリジン）、ｍ６Ａ（Ｎ６−メチルアデノシン）、ｓ２Ｕ（２−チオウリジン）、Ｕ
ｍ（２’−Ｏ−メチルウリジン）、ｍ１Ａ（１−メチルアデノシン）；ｍ２Ａ（２−メチ
ルアデノシン）；Ａｍ（２−１−Ｏ−メチルアデノシン）；ｍｓ２ｍ６Ａ（２−メチルチ
オ−Ｎ６−メチルアデノシン）；ｉ６Ａ（Ｎ６−イソペンテニルアデノシン）；ｍｓ２ｉ
６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６イソペンテニルアデノシン）；ｉｏ６Ａ（Ｎ６−（ｃｉｓ−
ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）；ｍｓ２ｉｏ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−（
ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）；ｇ６Ａ（Ｎ６−グリシニルカルバモ
イルアデノシン）；ｔ６Ａ（Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン）；ｍｓ２ｔ６Ａ
（２−メチルチオ−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン）；ｍ６ｔ６Ａ（Ｎ６−メ
チル−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン）；ｈｎ６Ａ（Ｎ６−ヒドロキシノルバ
リルカルバモイルアデノシン）；ｍｓ２ｈｎ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノ
ルバリルカルバモイルアデノシン）；Ａｒ（ｐ）（２’−Ｏ−リボシルアデノシン（ホス
フェート））；Ｉ（イノシン）；ｍ１Ｉ（１−メチルイノシン）；ｍ’Ｉｍ（１，２’−
Ｏ−ジメチルイノシン）；ｍ３Ｃ（３−メチルシチジン）；Ｃｍ（２Ｔ−Ｏ−メチルシチ
ジン）；ｓ２Ｃ（２−チオシチジン）；ａｃ４Ｃ（Ｎ４−アセチルシチジン）；ｆ５Ｃ（
５−ホルミルシチジン（ｆｏｎｎｙｌｃｙｔｉｄｉｎｅ）））；ｍ５Ｃｍ（５，２−Ｏ−
ジメチルシチジン）；ａｃ４Ｃｍ（Ｎ４アセチル２ＴＯメチルシチジン）；ｋ２Ｃ（リシ
ジン）；ｍ１Ｇ（１−メチルグアノシン）；ｍ２Ｇ（Ｎ２−メチルグアノシン）；ｍ７Ｇ
（７−メチルグアノシン）；Ｇｍ（２’−Ｏ−メチルグアノシン）；ｍ２２Ｇ（Ｎ２，Ｎ
２−ジメチルグアノシン）；ｍ２Ｇｍ（Ｎ２，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン）；ｍ２２
Ｇｍ（Ｎ２，Ｎ２，２’−Ｏ−トリメチルグアノシン）；Ｇｒ（ｐ）（２’−Ｏ−リボシ
ルグアノシン（ホスフェート））；ｙＷ（ワイブトシン）；ｏ２ｙＷ（ペルオキシワイブ
トシン）；ＯＨｙＷ（ヒドロキシワイブトシン）；ＯＨｙＷ＊（非修飾（ｕｎｄｅｒｍｏ
ｄｉｆｉｅｄ）ヒドロキシワイブトシン）；ｉｍＧ（ワイオシン）；ｍｉｍＧ（メチルグ
アノシン）；Ｑ（クエオシン）；ｏＱ（エポキシクエオシン）；ｇａｌＱ（ガルタクトシ
ル−クエオシン）；ｍａｎＱ（マンノシル−クエオシン）；ｐｒｅＱｏ（７−シアノ−７
−デアザグアノシン）；ｐｒｅＱｉ（７−アミノメチル−７−デアザグアノシン）；Ｇ＊
（アーケオシン）；Ｄ（ジヒドロウリジン）；ｍ５Ｕｍ（５，２’−Ｏ−ジメチルウリジ
ン）；ｓ４Ｕ（４−チオウリジン）；ｍ５ｓ２Ｕ（５−メチル−２−チオウリジン）；ｓ
２Ｕｍ（２−チオ−２’−Ｏ−メチルウリジン）；ａｃｐ３Ｕ（３−（３−アミノ−３−
カルボキシプロピル）ウリジン）；ｈｏ５Ｕ（５−ヒドロキシウリジン）；ｍｏ５Ｕ（５
−メトキシウリジン）；ｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５−オキシ酢酸）；ｍｃｍｏ５Ｕ（ウリジ
ン５−オキシ酢酸メチルエステル）；ｃｈｍ５Ｕ（５−（カルボキシヒドロキシメチル）
ウリジン））；ｍｃｈｍ５Ｕ（５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエス
テル）；ｍｃｍ５Ｕ（５−メトキシカルボニルメチルウリジン）；ｍｃｍ５Ｕｍ（Ｓ−メ
トキシカルボニルメチル−２−Ｏ−メチルウリジン）；ｍｃｍ５ｓ２Ｕ（５−メトキシカ
ルボニルメチル−２−チオウリジン）；ｎｍ５ｓ２Ｕ（５−アミノメチル−２−チオウリ
ジン）；ｍｎｍ５Ｕ（５−メチルアミノメチルウリジン）；ｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５−メチル
アミノメチル−２−チオウリジン）；ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ（５−メチルアミノメチル−２−
セレノウリジン）；ｎｃｍ５Ｕ（５−カルバモイルメチルウリジン）；ｎｃｍ５Ｕｍ（５
−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン）；ｃｍｎｍ５Ｕ（５−カルボキシメ
チルアミノメチルウリジン）；ｃｎｍｍ５Ｕｍ（５−カルボキシメチルアミノメチル−２
−Ｌ−Ｏメチルウリジン）；ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５−カルボキシメチルアミノメチル−２
−チオウリジン）；ｍ６２Ａ（Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン）；Ｔｍ（２’−Ｏ−メ
チルイノシン）；ｍ４Ｃ（Ｎ４−メチルシチジン）；ｍ４Ｃｍ（Ｎ４，２−Ｏ−ジメチル
シチジン）；ｈｍ５Ｃ（５−ヒドロキシメチルシチジン）；ｍ３Ｕ（３−メチルウリジン
）；ｃｍ５Ｕ（５−カルボキシメチルウリジン）；ｍ６Ａｍ（Ｎ６，Ｔ−Ｏ−ジメチルア
デノシン）；ｒｎ６２Ａｍ（Ｎ６，Ｎ６，Ｏ−２−トリメチルアデノシン）；ｍ２’７Ｇ
（Ｎ２，７−ジメチルグアノシン）；ｍ２’２’７Ｇ（Ｎ２，Ｎ２，７−トリメチルグア
ノシン）；ｍ３Ｕｍ（３，２Ｔ−Ｏ−ジメチルウリジン）；ｍ５Ｄ（５−メチルジヒドロ
ウリジン）；ｆ５Ｃｍ（５−ホルミル−２’−Ｏ−メチルシチジン）；ｍ１Ｇｍ（１，２
’−Ｏ−ジメチルグアノシン）；ｍ’Ａｍ（１，２−Ｏ−ジメチルアデノシン）イリノメ
チルウリジン）；ｔｍ５ｓ２Ｕ（Ｓ−タウリノメチル−２−チオウリジン））；ｉｍＧ−
１４（４−デメチルグアノシン）；ｉｍＧ２（イソグアノシン）；ａｃ６Ａ（Ｎ６−アセ
チルアデノシン）、ヒポキサンチン、イノシン、８−オキソ−アデニン、その７−置換誘
導体、ジヒドロウラシル、シュードウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５
−アミノウラシル、５−（Ｃ_１〜Ｃ_６）−アルキルウラシル、５−メチルウラシル、５−
（Ｃ_２〜Ｃ_６）−アルケニルウラシル、５−（Ｃ_２〜Ｃ_６）−アルキニルウラシル、５−
（ヒドロキシメチル）ウラシル、５−クロロウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロ
モウラシル、５−ヒドロキシシトシン、５−（Ｃ_１〜Ｃ_６）−アルキルシトシン、５−メ
チルシトシン、５−（Ｃ_２〜Ｃ_６）−アルケニルシトシン、５−（Ｃ_２〜Ｃ_６）−アルキ
ニルシトシン、５−クロロシトシン、５−フルオロシトシン、５−ブロモシトシン、Ｎ^２
−ジメチルグアニン、７−デアザグアニン、８−アザグアニン、７−デアザ−７−置換グ
アニン、７−デアザ−７−（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニルグアニン、７−デアザ−８−置換グ
アニン、８−ヒドロキシグアニン、６−チオグアニン、８−オキソグアニン、２−アミノ
プリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２，４−ジアミノプリン、２，６−ジアミノプ
リン、８−アザプリン、置換７−デアザプリン、７−デアザ−７−置換プリン、７−デア
ザ−８−置換プリン、水素（無塩基残基）、ｍ５Ｃ、ｍ５Ｕ、ｍ６Ａ、ｓ２Ｕ、Ｗ、また
は２’−Ｏ−メチル−Ｕを含む。これらの修飾核酸塩基のいずれか１つまたは任意の組み
合わせは、本発明の自己複製ＲＮＡ中に含まれてもよい。これらの修飾核酸塩基およびそ
れらの対応するリボヌクレオシドの多くは、民間の供給者から入手可能である。

所望の場合、自己複製ＲＮＡ分子は、ホスホロアミデート、ホスホロチオエート、およ
び／またはメチルホスホネート連結を含有することができる。

少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む自己複製ＲＮＡ分子は、任意の適した方法を
使用して調製することができる。修飾ヌクレオチドを含有するＲＮＡ分子を産生するため
のいくつかの適した方法は、当技術分野において公知である。たとえば、修飾ヌクレオチ
ドを含有する自己複製ＲＮＡ分子は、Ｔ７ファージＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ファージ
ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ファージＲＮＡポリメラーゼ、およびその他同種のものまたは
ＲＮＡ分子への修飾ヌクレオチドの効率的な組み込みを可能にするポリメラーゼの突然変
異体などの適したＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用して、自己複製ＲＮＡ分子をコ
ードするＤＮＡを転写すること（たとえばｉｎ ｖｉｔｒｏ転写）によって、調製するこ
とができる。転写反応は、ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドならびに適した緩衝剤お
よび適した塩などの、選択されるポリメラーゼの活性を支持する他の成分を含有するであ
ろう。自己複製ＲＮＡへのヌクレオチドアナログの組み込みは、たとえば、そのようなＲ
ＮＡ分子の安定性を改変するために、ＲＮアーゼに対する抵抗性を増大させるために、適
切な宿主細胞に導入した後に複製を確立するために（ＲＮＡの「感染性」）、ならびに／
または自然および適応免疫応答を誘発するもしくは低下させるために操作されてもよい。

適した合成方法は、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含有する自己複製ＲＮＡ分子
を産生するために、単独でまたは１つもしくは複数の他の方法（たとえば組換えＤＮＡも
しくはＲＮＡ技術）と組み合わせて使用することができる。デノボ合成に適した方法は、
当技術分野において周知であり、特定の用途に適合させてもよい。例示的な方法は、たと
えば、ＣＥＭなどの適した保護基を使用する化学合成（Ｍａｓｕｄａら、（２００７年）
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５１巻：３〜４頁）
、β−シアノエチルホスホラミダイト法（Ｂｅａｕｃａｇｅ Ｓ Ｌら（１９８１年）Ｔ
ｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ ２２巻：１８５９頁）；ヌクレオシドＨ−ホスホネー
ト法（Ｇａｒｅｇｇ Ｐら（１９８６年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ ２７巻：
４０５１〜４頁；Ｆｒｏｅｈｌｅｒ Ｂ Ｃら（１９８６年）Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｒｅ
ｓ １４巻：５３９９〜４０７頁；Ｇａｒｅｇｇ Ｐら（１９８６年）Ｔｅｔｒａｈｅｄ
ｒｏｎ Ｌｅｔｔ ２７巻：４０５５〜８頁；Ｇａｆｆｎｅｙ Ｂ Ｌら（１９８８年）
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ ２９巻：２６１９〜２２頁）を含む。これらの化学
反応は、実行することができるまたは市販で入手可能な自動核酸合成装置との使用に適合
させることができる。追加の適した合成方法は、Ｕｈｌｍａｎｎら（１９９０年）Ｃｈｅ
ｍ Ｒｅｖ ９０巻：５４４〜８４頁およびＧｏｏｄｃｈｉｌｄ Ｊ（１９９０年）Ｂｉ
ｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ １巻：１６５頁において開示される。核酸合成はまた
、ポリヌクレオチドおよびそのようなポリヌクレオチドによってコードされる遺伝子産物
のクローニング、プロセシング、ならびに／または発現を含む、当技術分野において周知
であり通常の適した組換え法を使用して実行することができる。無作為の断片化ならびに
遺伝子断片および合成ポリヌクレオチドのＰＣＲ再構築によるＤＮＡシャフリングは、ポ
リヌクレオチド配列を設計し、操作するために使用することができる公知の技術の例であ
る。部位特異的突然変異誘発は、核酸およびコードされるタンパク質を改変するために、
たとえば、新しい制限部位を挿入する、グリコシル化パターンを改変する、コドン優先度
（ｃｏｄｏｎ ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）を変化させる、スプライスバリアントを産生する
、突然変異を導入する、およびその他同種のもののために、使用することができる。核酸
配列の転写、翻訳、および発現に適した方法は、当技術分野において公知であり、通常の
ものである。（一般的に、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２巻、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈ．
Ａｓｓｏｃ． ＆ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、第１３章、１９８８年；
Ｇｌｏｖｅｒ、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第ＩＩ巻、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈ．，
Ｄ．Ｃ．、第３章、１９８６年；Ｂｉｔｔｅｒら、ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ １５３巻：５１６〜５４４頁（１９８７年）；Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓ
ｔｒａｔｈｅｒｎら編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、第Ｉ巻お
よびＩＩ巻、１９８２年；およびＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｐｒｅｓｓ、１９８９年を参照されたい）。

自己複製ＲＮＡ分子における１つまたは複数の修飾ヌクレオチドの存在および／または
量は、任意の適した方法を使用して決定することができる。たとえば、自己複製ＲＮＡは
、モノホスフェートに消化され得（たとえば、ヌクレアーゼＰ１を使用して）、脱リン酸
化することができ（たとえば、ＣＩＡＰなどの適したホスファターゼを使用して）、結果
として生じるヌクレオシドは、逆相ＨＰＬＣ（たとえばＹＭＣ Ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＱ
カラム（５ミクロン、４．６×２５０ｍｍ）を使用して、勾配、３０％Ｂ（０〜５分）〜
１００％Ｂ（５〜１３分）を使用し、１００％Ｂ（１３〜４０）分、流量（０．７ｍｌ／
分）、ＵＶ検出（波長：２６０ｎｍ）、カラム温度（３０℃）で溶離することによって分
析することができる。緩衝液Ａ（２０ｍＭ酢酸−酢酸アンモニウムｐＨ３．５）、緩衝液
Ｂ（２０ｍＭ酢酸−酢酸アンモニウムｐＨ３．５／メタノール［９０／１０］））。

自己複製ＲＮＡは、送達系と結合させてもよい。自己複製ＲＮＡは、アジュバントと共
にまたはなしで、投与されてもよい。

ＲＮＡ送達系
本明細書において記載される自己複製ＲＮＡは、裸のＲＮＡ送達または細胞への侵入を
容易にする脂質、ポリマー、もしくは他の化合物と組み合わせたものなどの様々なモダリ
ティーの送達に適している。自己複製ＲＮＡ分子は、任意の適した技術を使用して、たと
えば直接的な注射、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポフェクシ
ョン、微粒子銃（ｂｉｏｌｙｓｔｉｃｓ）、およびその他同種のものによって、標的細胞
または被験体の中に導入することができる。自己複製ＲＮＡ分子はまた、受容体媒介性エ
ンドサイトーシスによって細胞の中に導入されてもよい。たとえば米国特許第６，０９０
，６１９号；ＷｕおよびＷｕ、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６３巻：１４６２１頁
（１９８８年）；およびＣｕｒｉｅｌら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ
．ＵＳＡ，８８巻：８８５０頁（１９９１年）を参照されたい。たとえば、米国特許第６
，０８３，７４１号は、それ自体インテグリン受容体結合部分（たとえば配列Ａｒｇ−Ｇ
ｌｙ−Ａｓｐ（配列番号＿＿＿＿）を有する環状ペプチド）にカップリングされているポ
リカチオン部分（たとえば３〜１００リシン残基を有するポリＬ−リシン）に核酸を結合
することによって、哺乳動物細胞の中に外因性の核酸を導入することを開示する。

自己複製ＲＮＡ分子は、両親媒性物質によって細胞の中に送達することができる。たと
えば米国特許第６，０７１，８９０号を参照されたい。典型的に、核酸分子は、カチオン
性両親媒性物質と共に複合体を形成してもよい。複合体と接触させた哺乳動物細胞は、容
易にそれを取り込むことができる。

自己複製ＲＮＡは、裸のＲＮＡとして（たとえば単にＲＮＡの水溶液として）送達する
ことができるが、細胞への侵入およびまた続く細胞間の効果をも増強するために、自己複
製ＲＮＡは、好ましくは、微粒子またはエマルジョン送達系などの送達系と組み合わせて
投与される。多くの送達系は、当業者らに周知である。そのような送達系は、たとえばリ
ポソームベースの送達（ＤｅｂｓおよびＺｈｕ（１９９３年）国際公開第９３／２４６４
０号；ＭａｎｎｉｎｏおよびＧｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ（１９８８年）ＢｉｏＴｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ ６巻（７号）：６８２〜６９１頁；Ｒｏｓｅ 米国特許第５，２７９，
８３３号；Ｂｒｉｇｈａｍ（１９９１年）ＷＯ ９１／０６３０９；ならびにＦｅｌｇｎ
ｅｒら（１９８７年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４巻：
７４１３〜７４１４頁）ならびにウイルスベクターの使用（たとえばアデノウイルス（た
とえばＢｅｒｎｓら（１９９５年）Ａｎｎ． ＮＹ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．７７２巻：９
５〜１０４頁；Ａｌｉら（１９９４年）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１巻：３６７〜３８４頁；
およびＨａｄｄａｄａら（１９９５年）Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９巻（Ｐｔ ３）：２９７〜３０６頁を検討のために参照されたい
）、パピローマウイルス、レトロウイルス（たとえばＢｕｃｈｓｃｈｅｒら（１９９２年
）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．６６巻（５号）２７３１〜２７３９頁；Ｊｏｈａｎｎら（１９９２
年）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．６６巻（５号）：１６３５〜１６４０頁（１９９２年）；Ｓｏｍ
ｍｅｒｆｅｌｔら、（１９９０年）Ｖｉｒｏｌ．１７６巻：５８〜５９頁；Ｗｉｌｓｏｎ
ら（１９８９年）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．６３巻：２３７４〜２３７８頁；Ｍｉｌｌｅｒら、
Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．６５巻：２２２０〜２２２４頁（１９９１年）；Ｗｏｎｇ−Ｓｔａａ
ｌら、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００、ならびにＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＦａｕｃｉ（
１９９３年）ｉｎ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第３版 Ｐａｕｌ
（編）Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｔｄ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋおよびその中の参考文献
、ならびにＹｕら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４年）前掲を参照されたい）、な
らびにアデノ随伴ウイルスベクター（Ｗｅｓｔら（１９８７年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６
０巻：３８〜４７頁；Ｃａｒｔｅｒら（１９８９年）米国特許第４，７９７，３６８号；
Ｃａｒｔｅｒら ＷＯ ９３／２４６４１（１９９３年）；Ｋｏｔｉｎ（１９９４年）Ｈ
ｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５巻：７９３〜８０１頁；Ｍｕｚｙｃｚｋａ（１
９９４年）Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｓｔ．９４巻：１３５１頁、およびＳａｍｕｌｓｋ
ｉ（前掲）をＡＡＶベクターの概要について参照されたい；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ、米国特
許第５，１７３，４１４号；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（１９８５年）Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ．
Ｂｉｏｌ．５巻（１１号）：３２５１〜３２６０頁；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（１９８４
年）Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．，４巻：２０７２〜２０８１頁；Ｈｅｒｍｏｎａ
ｔおよびＭｕｚｙｃｚｋａ（１９８４年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ
．ＵＳＡ、８１巻：６４６６〜６４７０頁；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら（１９８８年）、お
よびＳａｍｕｌｓｋｉら（１９８９年）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、６３巻：０３８２２〜３８
２８頁もまた、参照されたい）、ならびにその他同種のものを含む。

３つの特に有用な送達系は、（ｉ）リポソーム、（ｉｉ）無毒性で生分解性のポリマー
微粒子、および（ｉｉｉ）カチオン性サブミクロン水中油型エマルジョンである。

リポソーム
様々な両親媒性脂質は、リポソームとしてＲＮＡ含有水性コアを被包するために、水性
環境において二重層を形成することができる。これらの脂質は、アニオン性、カチオン性
、または両性イオン性の親水性頭部基（ｈｅａｄ ｇｒｏｕｐ）を有することができる。
アニオン性リン脂質からのリポソームの形成は、１９６０年代にさかのぼり、カチオン性
リポソーム形成脂質は、１９９０年代から研究されてきた。いくつかのリン脂質は、アニ
オン性であるのに対して、他のものは、両性イオン性である。適したクラスのリン脂質は
、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、お
よびホスファチジルグリセロールを含むが、これらに限定されず、いくつかの有用なリン
脂質は、表２に列挙される。有用なカチオン性脂質は、ジオレオイルトリメチルアンモニ
ウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジステアリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−ア
ミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ ジメチル−３−アミ
ノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミ
ノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−
アミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）を含むが、これらに限定されない。両性イオン性脂質
は、アシル両性イオン性脂質およびエーテル両性イオン性脂質を含むが、これらに限定さ
れない。有用な両性イオン性脂質の例は、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＣ、およびドデシルホスホコ
リンである。脂質は、飽和または不飽和であってもよい。

リポソームは、単一の脂質または脂質の混合物から形成することができる。混合物は、
（ｉ）アニオン性脂質の混合物（ｉｉ）カチオン性脂質の混合物（ｉｉｉ）両性イオン性
脂質の混合物（ｉｖ）アニオン性脂質およびカチオン性脂質の混合物（ｖ）アニオン性脂
質および両性イオン性脂質の混合物（ｖｉ）両性イオン性脂質およびカチオン性脂質の混
合物、または（ｖｉｉ）アニオン性脂質、カチオン性脂質、および両性イオン性脂質の混
合物を含んでいてもよい。同様に、混合物は、飽和および不飽和脂質の両方を含んでいて
もよい。たとえば、混合物は、ＤＳＰＣ（両性イオン性、飽和）、ＤｌｉｎＤＭＡ（カチ
オン性、不飽和）、および／またはＤＭＰＧ（アニオン性、飽和）を含んでいてもよい。
脂質の混合物が使用される場合、混合物における成分脂質のすべてが、両親媒性である必
要があるとは限らない、たとえば、１つまたは複数の両親媒性脂質は、コレステロールと
混合することができる。

脂質の親水性部分は、ペグ化することができる（すなわち、ポリエチレングリコールの
共有結合によって修飾することができる）。この修飾は、リポソームの安定性を増大させ
、非特異的吸着を予防することができる。たとえば、脂質は、Ｈｅｙｅｓら（２００５年
）Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １０７巻：２７６〜８７頁において開示
されるものなどの技術を使用してＰＥＧにコンジュゲートすることができる。

ＤＳＰＣ、ＤｌｉｎＤＭＡ、ＰＥＧ−ＤＭＰＧ、およびコレステロールの混合物は、リ
ポソームを形成するために使用することができる。本発明の別の態様は、ＤＳＰＣ、Ｄｌ
ｉｎＤＭＡ、ＰＥＧ−ＤＭＧ、およびコレステロールを含むリポソームである。このリポ
ソームは、好ましくは、たとえば免疫原をコードする自己複製ＲＮＡなどのＲＮＡを被包
する。

リポソームは、３つの群に通常分けられる：多重膜小胞（ＭＬＶ）；小型単層小胞（Ｓ
ＵＶ）；また大型単層小胞（ＬＵＶ）。ＭＬＶは、いくつかの別々の水性コンパートメン
トを形成する、それぞれの小胞において複数の二重層を有する。ＳＵＶおよびＬＵＶは、
水性コアを被包する単一の二重層を有する；ＳＵＶは、典型的に、直径≦５０ｎｍを有し
、ＬＵＶは、直径＞５０ｎｍを有する。本発明で有用なリポソームは、理想的には、５０
〜２２０ｎｍの範囲の直径を有するＬＵＶである。異なる直径を有するＬＵＶの集団を含
む組成物については：（ｉ）数の上で少なくとも８０％が、２０〜２２０ｎｍの範囲の直
径を有するべきであり、（ｉｉ）集団の平均直径（Ｚａｖ、強度による）は、理想的には
、４０〜２００ｎｍの範囲にあり、および／または（ｉｉｉ）直径は、多分散指数（ｐｏ
ｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ ｉｎｄｅｘ）＜０．２を有するべきである。

適したリポソームを調製するための技術は、当技術分野において周知であり、たとえば
Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、第１巻：Ｐｈａ
ｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒｓ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒ
ｏｔｏｃｏｌｓ．（Ｗｅｉｓｓｉｇ編）．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、２００９年．ＩＳ
ＢＮ １６０３２７３５９Ｘ；Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第Ｉ巻、ＩＩ
巻、およびＩＩＩ巻．（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ編）．Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈｃ
ａｒｅ、２００６年；ならびにＦｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｏｌｌｏｉｄ
ｓ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ 第４巻（Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ、ｍｉ
ｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ ＆ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ）．（Ａｒｓｈａｄｙ ＆ Ｇｕｙｏ
ｔ編）．Ｃｉｔｕｓ Ｂｏｏｋｓ、２００２年を参照されたい。１つの有用な方法は、（
ｉ）脂質のエタノール性の溶液、（ｉｉ）核酸の水溶液、および（ｉｉｉ）緩衝剤を混合
し、その後に、混合、平衡化、希釈、および精製を続けることを含む（Ｈｅｙｅｓら（２
００５年）Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １０７巻：２７６〜８７頁．）
。

ＲＮＡは、好ましくは、リポソーム内に被包され、したがって、リポソームは、水性Ｒ
ＮＡ含有コアのまわりに外層を形成する。この被包は、ＲＮアーゼ消化からＲＮＡを保護
することが分かっている。リポソームは、いくつかの外部ＲＮＡを含むことができる（た
とえばリポソームの表面上に）が、好ましくは、少なくともＲＮＡの半分（理想的には、
実質的にそのすべて）は、被包される。

ポリマー微粒子
様々なポリマーは、ＲＮＡを被包するまたは吸着するために微粒子を形成することがで
きる。実質的に無毒性のポリマーの使用は、レシピエントが安全に粒子を受けることがで
きることを意味し、生分解性ポリマーの使用は、粒子が、長期的な存続を回避するように
送達後に代謝され得ることを意味する。有用なポリマーはまた、医薬グレードの処方物を
調製するのを支援するために滅菌することもできる。

適した無毒性で生分解性のポリマーは、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪
酸、ポリラクトン（ポリカプロラクトンを含む）、ポリジオキサノン、ポリバレロラクト
ン、ポリオルトエステル、ポリ酸無水物、ポリシアノアクリレート、チロシン由来ポリカ
ーボネート、ポリビニルピロリジノン、またはポリエステルアミドおよびその組み合わせ
を含むが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、微粒子は、ポリ（ラクチド）（「ＰＬＡ」）などのポリ（α
−ヒドロキシ酸）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（「ＰＬＧ」）などの
ラクチドおよびグリコリドのコポリマー、ならびにＤ，Ｌ−ラクチドおよびカプロラクト
ンのコポリマーから形成される。有用なＰＬＧポリマーは、たとえば２０：８０〜８０：
２０、たとえば２５：７５、４０：６０、４５：５５、５５：４５、６０：４０、７５：
２５の範囲のラクチド／グリコリドモル比を有するものを含む。有用なＰＬＧポリマーは
、たとえば５，０００〜２００，０００Ｄａ、たとえば１０，０００〜１００，０００、
２０，０００〜７０，０００、４０，０００〜５０，０００Ｄａの分子量を有するものを
含む。

微粒子は、理想的には、０．０２μｍ〜８μｍの範囲の直径を有する。異なる直径を有
する微粒子の集団を含む組成物については、数の上で少なくとも８０％が、０．０３〜７
μｍの範囲の直径を有するべきである。

適した微粒子を調製するための技術は、当技術分野において周知であり、たとえばＦｕ
ｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｏｌｌｏｉｄｓ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉ
ｃｌｅｓ 第４巻（Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ， ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ ＆ ｌ
ｉｐｏｓｏｍｅｓ）．（Ａｒｓｈａｄｙ ＆ Ｇｕｙｏｔ編）．Ｃｉｔｕｓ Ｂｏｏｋｓ
、２００２年；Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．（Ｕｃｈｅｇｂ
ｕ ＆ Ｓｃｈａｔｚｌｅｉｎ編）．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、２００６年．（特に第７章）
、およびＭｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｌ
ｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｖａｃｃｉｎｅｓ．（Ｃｏｈｅｎ ＆
Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ編）．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９９６年を参照されたい。ＲＮＡの吸
着を容易にするために、微粒子は、たとえばＯ’Ｈａｇａｎら（２００１年）Ｊ Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ７５巻：９０３７〜９０４３頁；およびＳｉｎｇｈら（２００３年）Ｐｈａｒ
ｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０巻：２４７〜２５１頁において開示され
るように、カチオン性界面活性剤および／または脂質を含んでいてもよい。ポリマー微粒
子を作製するための代替方法は、たとえば国際公開第２００９／１３２２０６号において
開示されるように成形し、硬化することによるものである。

本発明の微粒子は、４０〜１００ｍＶのゼータ電位を有することができる。ＲＮＡは、
微粒子に吸着することができ、吸着作用は、微粒子中にカチオン性材料（たとえばカチオ
ン性脂質）を含めることによって容易になる。

水中油型カチオン性エマルジョン
水中油型エマルジョンは、インフルエンザワクチンのアジュバント添加（ａｄｊｕｖａ
ｎｔｉｎｇ）、たとえばＦＬＵＡＤ（商標）製品におけるＭＦ５９（商標）アジュバント
、およびＰＲＥＰＡＮＤＲＩＸ（商標）製品におけるＡＳ０３アジュバントについて公知
である。エマルジョンが１つまたは複数のカチオン性分子を含むという条件で、ＲＮＡ送
達は、水中油型エマルジョンの使用により達成することができる。たとえば、カチオン性
脂質は、負に荷電したＲＮＡが付着することができる正に荷電した液滴表面を提供するた
めにエマルジョン中に含むことができる。

エマルジョンは、１つまたは複数の油を含む。適した油（複数可）は、たとえば、動物
（魚類など）供給源または植物供給源に由来するものを含む。油は、理想的には、生分解
性（代謝可能）かつ生体適合性である。植物油についての供給源は、堅果、種子、および
穀類を含む。最も一般的に入手可能なラッカセイ油、ダイズ油、ヤシ油およびオリーブ油
は、堅果油を例示する。たとえばホホバ豆から得られるホホバ油を使用することができる
。種子油は、ベニバナ油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ油、およびその他同種のものを
含む。穀類の群において、コーン油は、最も容易に入手可能であるが、コムギ、カラスム
ギ、ライムギ、イネ、テフ、ライコムギ、およびその他同種のものなどの他の穀物粒（ｃ
ｅｒｅａｌ ｇｒａｉｎ）の油もまた、使用されてもよい。グリセロールおよび１，２−
プロパンジオールの６〜１０炭素脂肪酸エステルは、種子油中に天然に存在しないが、堅
果および種子油から出発して、適切な材料の加水分解、分離、およびエステル化によって
調製されてもよい。哺乳動物の乳由来の脂肪および油は、代謝可能であり、したがって、
使用されてもよい。動物供給源から純粋な油を得るために必要な分離、精製、けん化、お
よび他の手段についての手順は、当技術分野において周知である。

ほとんどの魚は、容易に回収され得る代謝可能な油を含有する。たとえば、タラ肝油、
サメ肝油、および鯨ろうなどの鯨油は、本明細書において使用されてもよいいくつかの魚
油を例示する。多くの分枝鎖油は、５−炭素イソプレン単位で生化学的に合成され、一般
的にテルペノイドと呼ばれる。スクアラン（スクアレンに対する飽和アナログ）もまた、
使用することができる。スクアレンおよびスクアランを含む魚油は、市販の供給源から容
易に入手可能であるまたは当技術分野において公知の方法によって得られてもよい。

他の有用な油は、特にスクアレンと組み合わせたトコフェロールである。エマルジョン
の油相がトコフェロールを含む場合、α、β、γ、δ、ε、またはζトコフェロールのい
ずれかを使用することができるが、α−トコフェロールが好ましい。Ｄ−α−トコフェロ
ールおよびＤＬ−α−トコフェロールは両方とも使用することができる。好ましいα−ト
コフェロールは、ＤＬ−α−トコフェロールである。スクアレンおよびトコフェロール（
たとえばＤＬ−α−トコフェロール）を含む油の組み合わせを使用することができる。

好ましいエマルジョンは、スクアレン、分岐不飽和テルペノイドであるサメ肝油を含む
（Ｃ_３０Ｈ_５０；［（ＣＨ_３）_２Ｃ［＝ＣＨＣＨ_２ＣＨ_２Ｃ（ＣＨ_３）］_２＝ＣＨＣＨ_２
−］_２；２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，
２２−テトラコサヘキサエン；ＣＡＳ ＲＮ ７６８３−６４−９）。

エマルジョン中の油は、油、たとえばスクアレンおよび少なくとも１つのさらなる油の
組み合わせを含んでいてもよい。

エマルジョンの水性成分は、淡水（ｐｌａｉｎ ｗａｔｅｒ）（たとえばｗ．ｆ．ｉ．
）であり得るか、または成分、たとえば溶質をさらに含むことができる。たとえば、それ
は、緩衝液を形成するための塩（たとえば、ナトリウム塩などのクエン酸塩またはリン酸
塩）を含んでいてもよい。典型的な緩衝剤は、リン酸緩衝剤；Ｔｒｉｓ緩衝剤；ホウ酸緩
衝剤；コハク酸緩衝剤；ヒスチジン緩衝剤；またはクエン酸緩衝剤を含む。緩衝化された
水相が好ましく、緩衝剤は、典型的に、５〜２０ｍＭの範囲で含まれるであろう。

エマルジョンはまた、カチオン性脂質をも含む。好ましくは、この脂質は、それがエマ
ルジョンの形成および安定化を容易にすることができるように、界面活性剤である。有用
なカチオン性脂質は、一般的に、たとえば第三級または第四級アミンとして生理学的条件
下で正に荷電した窒素原子を含有する。この窒素は、両親媒性界面活性剤の親水性頭部基
中にあり得る。有用なカチオン性脂質は、１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチ
ルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、３’−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエ
タン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣコレステロール）、ジメチルジオクタデシ
ルアンモニウム（ＤＤＡ、たとえばブロミド）、１，２−ジミリストイル−３−トリメチ
ルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、ジパルミトイル（Ｃ１６：０）トリメチルアン
モニウムプロパン（ＤＰＴＡＰ）、ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパン（Ｄ
ＳＴＡＰ）を含むが、これらに限定されない。他の有用なカチオン性脂質は、塩化ベンザ
ルコニウム（ＢＡＫ）、塩化ベンゼトニウム、セトラミド（ｃｅｔｒａｍｉｄｅ）（テト
ラデシルトリメチルアンモニウムブロミドならびにおそらく少量のドデシルトリメチルア
ンモニウム（ｄｅｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ）ブロミドおよびヘキ
サデシルトリメチルアンモニウムブロミドを含有する）、セチルピリジニウムクロリド（
ＣＰＣ）、セチルトリメチルアンモニウムクロリド（ＣＴＡＣ）、Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ポリ
オキシエチレン（１０）−Ｎ−獣脂（ｔａｌｌｏｗ）−１，３−ジアミノプロパン、ドデ
シルトリメチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、
混合アルキルトリメチルアンモニウムブロミド、ベンジルジメチルドデシルアンモニウム
クロリド、ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウムクロリド、ベンジルトリメチルア
ンモニウムメトキシド、セチルジメチルエチルアンモニウムブロミド、ジメチルジオクタ
デシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、メチルベンゼトニウムクロリド、デカメトニ
ウムクロリド、メチル混合トリアルキルアンモニウムクロリド、メチルトリオクチルアン
モニウムクロリド、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［２（２−メチル−４−（１，１，３，３テ
トラメチルブチル）−フェノキシ］−エトキシ）エチル］−ベンゼンメタンアミニウムク
ロリド（ＤＥＢＤＡ）、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、［１−（２，３−ジオレイ
ルオキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ，トリメチルアンモニウムクロリド、１，２−ジア
シル−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（アシル基＝ジミリストイル、ジパルミト
イル、ジステアロイル、ジオレオイル）、１，２−ジアシル−３（ジメチルアンモニオ）
プロパン（アシル基＝ジミリストイル、ジパルミトイル、ジステアロイル、ジオレオイル
）、１，２−ジオレオイル−３−（４’−トリメチルアンモニオ）ブタノイル−ｓｎ−グ
リセロール、１，２−ジオレオイル３−スクシニル−ｓｎ−グリセロールコリンエステル
、コレステリル（４’−トリメチルアンモニオ）ブタノエート、Ｎ−アルキルピリジニウ
ム塩（たとえばセチルピリジニウムブロミドおよびセチルピリジニウムクロリド）、Ｎ−
アルキルピペリジニウム塩、ジカチオン性ボラホルム（ｂｏｌａｆｏｒｍ）電解質（Ｃ１
２Ｍｅ６；Ｃ１２ＢＵ６）、ジアルキルグリセチルホスホリルコリン、リソレシチン、Ｌ
−αジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、コレステロールヘミスクシネートコ
リンエステル、リポポリアミン（ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）
、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミドスペルミン（ＤＰＰＥＳ）、リポポリ
Ｌ（またはＤ）−リシン（ＬＰＬＬ、ＬＰＤＬ）、Ｎ−グルタリルホスファチジルエタノ
ールアミンにコンジュゲートされたポリＬ（またはＤ）−リシン、ペンダントアミノ基を
有するジドデシルグルタミン酸エステル（Ｃ＾ＧｌｕＰｈＣｎＮ）、ペンダントアミノ基
を有するジテトラデシルグルタミン酸エステル（Ｃｌ４ＧＩｕＣｎＮ＋）を含むが、これ
らに限定されない）、コレステロールのカチオン性誘導体（コレステリル−３β−オキシ
スクシンアミドエチレントリメチルアンモニウム塩、コレステリル−３β−オキシスクシ
ンアミドエチレンジメチルアミン、コレステリル−３β−カルボキシアミドエチレントリ
メチルアンモニウム塩、およびコレステリル−３β−カルボキシアミドエチレンジメチル
アミンを含むが、これらに限定されない）である。他の有用なカチオン性脂質は、参照に
よって本明細書において組み込まれるＵＳ ２００８／００８５８７０およびＵＳ ２０
０８／００５７０８０において記載される。カチオン性脂質は、好ましくは、生分解性（
代謝可能）かつ生体適合性である。

油およびカチオン性脂質に加えて、エマルジョンは、非イオン性界面活性剤および／ま
たは両性イオン性界面活性剤を含むことができる。そのような界面活性剤は、ポリオキシ
エチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般的にＴｗｅｅｎと呼ばれる）、とりわけポ
リソルベート２０およびポリソルベート８０；線状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマーなどの
、ＤＯＷＦＡＸ（商標）商標下で販売されている、エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレ
ンオキシド（ＰＯ）、および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー；繰り返し
のエトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の数が変動し得るオクトキシノール、オ
クトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００またはｔ−オクチルフェノキシポリエト
キシエタノール）が特に興味深い；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（Ｉ
ＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；ホスファチジルコリン（レシチン）などのリ
ン脂質；トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ ３０）などの、ラウ
リル、セチル、ステアリル、およびオレイルアルコールから誘導されるポリオキシエチレ
ン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知）；ポリオキシエチレン−９−ラウリル
エーテル；ならびにソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ ８５）およびソルビタンモノ
ラウレートなどのソルビタンエステル（Ｓｐａｎとして一般的に公知）を含むが、これら
に限定されない。エマルジョン中に含むための好ましい界面活性剤は、ポリソルベート８
０（Ｔｗｅｅｎ８０；ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、Ｓｐａｎ ８５
（ソルビタントリオレエート）、レシチン、およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００である。

これらの界面活性剤の混合物、たとえばＴｗｅｅｎ８０／Ｓｐａｎ ８５混合物または
Ｔｗｅｅｎ８０／Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００混合物は、エマルジョン中に含むことができる
。ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０）などのポリオキシエ
チレンソルビタンエステルおよびｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒ
ｉｔｏｎ Ｘ−１００）などのオクトキシノールの組み合わせもまた、適している。他の
有用な組み合わせは、ラウレス９ならびにポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび
／またはオクトキシノールを含む。有用な混合物は、１０〜２０の範囲のＨＬＢ値を有す
る界面活性剤（たとえば、１５．０のＨＬＢを有するポリソルベート８０）および１〜１
０の範囲のＨＬＢ値を有する界面活性剤（たとえば、１．８のＨＬＢを有するソルビタン
トリオレエート）を含むことができる。

最終エマルジョン中の油の好ましい量（容積による％）は、２〜２０％、たとえば５〜
１５％、６〜１４％、７〜１３％、８〜１２％である。約４〜６％または約９〜１１％の
スクアレン含有量は、特に有用である。

最終エマルジョン中の界面活性剤の好ましい量（重量による％）は、０．００１％〜８
％である。たとえば、０．２〜４％、特に０．４〜０．６％、０．４５〜０．５５％、約
０．５％、または１．５〜２％、１．８〜２．２％、１．９〜２．１％、約２％、または
０．８５〜０．９５％、または約１％のポリオキシエチレンソルビタンエステル（ポリソ
ルベート８０など）；０．０２〜２％、特に約０．５％または約１％のソルビタンエステ
ル（ソルビタントリオレエートなど）；０．００１〜０．１％、特に０．００５〜０．０
２％のオクチルまたはノニルフェノキシポリオキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１０
０など）；０．１〜８％、好ましくは０．１〜１０％、特に０．１〜１％、または約０．
５％のポリオキシエチレンエーテル（ラウレス９など）。

油および界面活性剤の絶対量ならびにそれらの比は、なおエマルジョンを形成しながら
も、広い範囲内で変動され得る。当業者は、所望のエマルジョンを得るために成分の相対
的な割合を容易に変動し得るが、油および界面活性剤についての４：１〜５：１の重量比
は、典型的である（過剰な油）。

エマルジョンの免疫賦活性活性を確実にするための重要なパラメーターは、特に大型の
動物において、油滴サイズ（直径）である。最も有効なエマルジョンは、サブミクロン（
ｓｕｂｍｉｃｒｏｎ）範囲の液滴サイズを有する。適切には、液滴サイズは、範囲５０〜
７５０ｎｍにあるであろう。最も有用には、平均液滴サイズは、２５０ｎｍ未満、たとえ
ば２００ｎｍ未満、１５０ｎｍ未満である。平均液滴サイズは、有用には、８０〜１８０
ｎｍの範囲にある。理想的には、エマルジョンの油滴の少なくとも８０％（数で）は、直
径２５０ｎｍ未満であり、好ましくは少なくとも９０％がそうである。エマルジョン中の
平均液滴サイズおよびサイズ分布を決定するための装置は、市販で入手可能である。これ
らは、典型的に、動的光散乱および／または単一粒子光学検知法（ｓｉｎｇｌｅ−ｐａｒ
ｔｉｃｌｅ ｏｐｔｉｃａｌ ｓｅｎｓｉｎｇ）の技術、たとえば、Ｐａｒｔｉｃｌｅ
Ｓｉｚｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ、ＵＳＡ）から入手可能な
機器のＡｃｃｕｓｉｚｅｒ（商標）およびＮｉｃｏｍｐ（商標）シリーズ、またはＭａｌ
ｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（ＵＫ）からのＺｅｔａｓｉｚｅｒ（商標）機器、ま
たはＨｏｒｉｂａ（Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）からのＰａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｅ Ｄｉ
ｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｚｅｒ機器を使用する。

理想的には、液滴サイズの分布（数による）は、１つの最大値だけを有する、すなわち
、２つの最大値を有するのではなく、平均値（モード）のあたりで分布する液滴の単一の
集団がある。好ましいエマルジョンは、＜０．４、たとえば０．３、０．２、またはそれ
以下の多分散性を有する。

サブミクロン液滴および狭いサイズ分布を有する適したエマルジョンは、マイクロフル
イダイゼーションの使用によって得ることができる。この技術は、高圧および高速度で、
幾何学的に固定されたチャネルを通して入力成分のストリームを推進させることによって
、平均油滴サイズを低下させる。これらのストリームは、チャネル壁、チャンバー壁、お
よび互いに接触する。その結果としての剪断力、衝撃力、およびキャビテーション力は、
液滴サイズの低下を引き起こす。マイクロフルイダイゼーションの繰り返しのステップは
、所望の液滴サイズ平均値および分布を有するエマルジョンが達成されるまで、実行する
ことができる。

マイクロフルイダイゼーションの代替物として、熱的方法は、転相を引き起こすために
使用することができる。これらの方法もまた、厳密な粒度分布を有するサブミクロンエマ
ルジョンを提供することができる。

好ましいエマルジョンは、濾過滅菌することができる、すなわち、それらの液滴は、２
２０ｎｍのフィルターを通過することができる。滅菌の提供と同様に、この手順はまた、
エマルジョン中のあらゆる大きな液滴をも除去する。

ある実施形態では、エマルジョン中のカチオン性脂質は、ＤＯＴＡＰである。カチオン
性水中油型エマルジョンは、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰを含ん
でいてもよい。たとえば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約
２５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ〜約２５
ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ
／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．１ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍ
ｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．３ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、
約１．４ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１
．６ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．７ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．５
ｍｇ／ｍｌ〜約２４ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ
／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１８ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍ
ｌ〜約１５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜
約１０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２ｍ
ｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．９ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．８ｍ
ｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．７ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍ
ｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍ
ｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍ
ｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍ
ｇ／ｍｌ、約１．１ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ、約１．３ｍｇ／ｍｌ、約１．４ｍ
ｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ、約１．６ｍｇ／ｍｌ、約１２ｍｇ／ｍｌ、約１８ｍｇ／
ｍｌ、約２０ｍｇ／ｍｌ、約２１．８ｍｇ／ｍｌ、約２４ｍｇ／ｍｌなどのＤＯＴＡＰを
含んでいてもよい。例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．
８ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、たとえば０．８ｍｇ／ｍｌ、１．２ｍｇ／ｍｌ、１
．４ｍｇ／ｍｌ、または１．６ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰを含む。

ある実施形態では、カチオン性脂質は、ＤＣコレステロールである。カチオン性水中油
型エマルジョンは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ ＤＣコレステロールのＤＣコ
レステロールを含んでいてもよい。たとえば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０
．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．３ｍｇ
／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．４ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜
約５ｍｇ／ｍｌ、約０．６２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／
ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約２．
４６ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約３．５ｍｇ／ｍ
ｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約４ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約４．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ
／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約４．９２ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約４．５ｍ
ｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約４ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約３．５ｍｇ／
ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２．４６ｍｇ／ｍ
ｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１．５ｍｇ／ｍｌ、
約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約０．６２ｍｇ／ｍｌ、約
０．１５ｍｇ／ｍｌ、約０．３ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ、約０．６２ｍｇ／ｍｌ
、約０．９ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ、約２．４６ｍｇ／ｍｌ、約４．９２ｍｇ／
ｍｌなどのＤＣコレステロールを含んでいてもよい。例示的な実施形態では、カチオン性
水中油型エマルジョンは、約０．６２ｍｇ／ｍｌ〜約４．９２ｍｇ／ｍｌ、たとえば２．
４６ｍｇ／ｍｌのＤＣコレステロールを含む。

ある実施形態では、カチオン性脂質は、ＤＤＡである。カチオン性水中油型エマルジョ
ンは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌのＤＤＡを含んでいてもよい。たとえば、カ
チオン性水中油型エマルジョンは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ
／ｍｌ〜約４．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約４ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍ
ｌ〜約３．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜
約２．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１
．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１．４５ｍｇ／ｍｌ、約０．２ｍｇ／ｍｌ〜約
５ｍｇ／ｍｌ、約０．３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．４ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／
ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約
０．７３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．９
ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍ
ｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．４５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍ
ｇ／ｍｌ、約２．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約
３．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約４ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約４．５ｍｇ／
ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ、約１．４５ｍｇ／ｍｌなどのＤＤＡを含ん
でいてもよい。その代わりに、カチオン性水中油型エマルジョンは、約２０ｍｇ／ｍｌ、
約２１ｍｇ／ｍｌ、約２１．５ｍｇ／ｍｌ、約２１．６ｍｇ／ｍｌ、約２５ｍｇ／ｍｌの
ＤＤＡを含んでいてもよい。例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは
、約０．７３ｍｇ／ｍｌ〜約１．４５ｍｇ／ｍｌ、たとえば１．４５ｍｇ／ｍｌのＤＤＡ
を含む。

カテーテルまたは同様のデバイスは、標的器官または組織の中に、裸のＲＮＡとしてま
たは送達系と組み合わせて、本発明の自己複製ＲＮＡ分子を送達するために使用されても
よい。適したカテーテルは、たとえば、すべてが参照によって本明細書において組み込ま
れる米国特許第４，１８６，７４５号；第５，３９７，３０７号；第５，５４７，４７２
号；第５，６７４，１９２号；および第６，１２９，７０５号において開示される。

本発明は、単独でまたは他の高分子と組み合わせて、たとえば、免疫応答を引き起こす
ために、２つ以上のＣＭＶタンパク質をコードする自己複製ＲＮＡ分子を送達するために
、被包されたまたは吸着された自己複製ＲＮＡを有するリポソーム、ポリマー微粒子、ま
たはサブミクロンエマルジョン微粒子などの適した送達系の使用を含む。本発明は、吸着
されたおよび／または被包された自己複製ＲＮＡ分子を有するリポソーム、微粒子、およ
びサブミクロンエマルジョンならびにその組み合わせを含む。

リポソームおよびサブミクロンエマルジョン微粒子と結合した自己複製ＲＮＡ分子は、
宿主細胞に有効に送達することができ、自己複製ＲＮＡによってコードされるタンパク質
に対する免疫応答を誘発することができる。

ＣＭＶタンパク質をコードするポリシストロニック自己複製ＲＮＡ分子およびポリシス
トロニックアルファウイルスレプリコンを使用して産生されるＶＲＰは、細胞においてＣ
ＭＶタンパク質複合体を形成するために使用することができる。複合体は、ｇＢ／ｇＨ／
ｇＬ；ｇＨ／ｇＬ；ｇＨ／ｇＬ／ｇＯ；ｇＭ／ｇＮ；ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３
０／ＵＬ１３１；およびＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１を含むが、これらに限定さ
れない。

いくつかの実施形態では、ＶＲＰの組み合わせは、細胞に送達される。組み合わせは、
１．ｇＨ／ｇＬ ＶＲＰおよび別のＶＲＰ；
２．ｇＨ／ｇＬ ＶＲＰおよびｇＢ ＶＲＰ；
３．ｇＨ／ｇＬ／ｇＯ ＶＲＰおよびｇＢ ＶＲＰ；
４．ｇＢ ＶＲＰおよびｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１ ＶＲＰ；
５．ｇＢ ＶＲＰおよびＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１ ＶＲＰ；
６．ｇＢ ＶＲＰおよびｇＭ／ｇＮ ＶＲＰ；
７．ｇＢ ＶＲＰ、ｇＨ／ｇＬ ＶＲＰ、およびＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１
ＶＲＰ；
８．ｇＢ ＶＲＰ、ｇＨ／ｇＬｇＯ ＶＲＰ、およびＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３
１ ＶＲＰ；
９．ｇＢ ＶＲＰ、ｇＭ／ｇＮ ＶＲＰ、ｇＨ／ｇＬ ＶＲＰ、およびＵＬ１２８／ＵＬ
１３０／ＵＬ１３１ ＶＲＰ；
１０．ｇＢ ＶＲＰ、ｇＭ／ｇＮ ＶＲＰ、ｇＨ／ｇＬ／Ｏ ＶＲＰ、およびＵＬ１２８
／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１ ＶＲＰ；
１１．ｇＨ／ｇＬ ＶＲＰおよびＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１ ＶＲＰ
を含むが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、自己複製ＲＮＡ分子の組み合わせは、細胞に送達される。組
み合わせは、
１．ｇＨ／ｇＬをコードする自己複製ＲＮＡ分子および他のタンパク質をコードする自己
複製ＲＮＡ分子；
２．ｇＨおよびｇＬをコードする自己複製ＲＮＡ分子ならびにｇＢをコードする自己複製
ＲＮＡ分子；
３．ｇＨ、ｇＬ、およびｇＯをコードする自己複製ＲＮＡ分子ならびにｇＢをコードする
自己複製ＲＮＡ分子；
４．ｇＢをコードする自己複製ＲＮＡ分子ならびにｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０
、およびＵＬ１３１をコードする自己複製ＲＮＡ分子；
５．ｇＢをコードする自己複製ＲＮＡ分子ならびにＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ
１３１をコードする自己複製ＲＮＡ分子；
６．ｇＢをコードする自己複製ＲＮＡ分子ならびにｇＭおよびｇＮをコードする自己複製
ＲＮＡ分子；
７．ｇＢをコードする自己複製ＲＮＡ分子、ｇＨおよびｇＬをコードする自己複製ＲＮＡ
分子、ならびにＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１をコードする自己複製ＲＮＡ
分子；
８．ｇＢをコードする自己複製ＲＮＡ分子、ｇＨ、ｇＬ、およびｇＯをコードする自己複
製ＲＮＡ分子、ならびにＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１をコードする自己複
製ＲＮＡ分子；
９．ｇＢをコードする自己複製ＲＮＡ分子、ｇＭおよびｇＮをコードする自己複製ＲＮＡ
分子、ｇＨおよびｇＬをコードする自己複製ＲＮＡ分子、ならびにＵＬ１２８、ＵＬ１３
０、およびＵＬ１３１をコードする自己複製ＲＮＡ分子；
１０．ｇＢをコードする自己複製ＲＮＡ分子、ｇＭおよびｇＮをコードする自己複製ＲＮ
Ａ分子、ｇＨ、ｇＬ、およびｇＯをコードする自己複製ＲＮＡ分子、ならびにＵＬ１２８
、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１をコードする自己複製ＲＮＡ分子；
１１．ｇＨおよびｇＬをコードする自己複製ＲＮＡ分子ならびにＵＬ１２８、ＵＬ１３０
、およびＵＬ１３１をコードする自己複製ＲＮＡ分子
を含むが、これらに限定されない。

ＣＭＶタンパク質
適したＣＭＶタンパク質は、ｇＢ、ｇＨ、ｇＬ、ｇＯを含み、任意のＣＭＶ株由来のも
のであり得る。他の適したＣＭＶタンパク質は、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１
３１を含み、任意のＣＭＶ株由来のものであり得る。たとえば、ＣＭＶタンパク質は、Ｃ
ＭＶのＭｅｒｌｉｎ、ＡＤ１６９、ＶＲ１８１４、Ｔｏｗｎｅ、Ｔｏｌｅｄｏ、ＴＲ、Ｐ
Ｈ、ＴＢ４０、またはＦｉｘ株由来のものであり得る。例示的なＣＭＶタンパク質および
断片は、本明細書において記載される。これらのタンパク質および断片は、ヒト細胞など
の所望の宿主における発現のためにコドン最適化された（ｃｏｄｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚｅ
ｄ）かまたはコドン脱最適化された（ｃｏｄｏｎ ｄｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄ）配列を含む
任意の適したヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＣＭＶタンパク質およびそれら
のタンパク質をコードする核酸の例示的な配列は、表２において提供される。

ＣＭＶ ｇＢタンパク質
ｇＢタンパク質は、完全長であり得るかまたはタンパク質の１つもしくは複数の領域を
取り除くことができる。その代わりに、ｇＢタンパク質の断片を使用することができる。
ｇＢアミノ酸は、９０７アミノ酸長である配列番号＿＿＿において示される完全長ｇＢア
ミノ酸配列（ＣＭＶ ｇＢ ＦＬ）に従ってナンバリングされる。完全長タンパク質から
除くことができるまたは断片として含むことができるｇＢタンパク質の適した領域は、シ
グナル配列（アミノ酸１〜２４）、ｇＢ−ＤＬＤディスインテグリン様ドメイン（アミノ
酸５７〜１４６）、フューリン切断部位（アミノ酸４５９〜４６０）、７アミノ酸繰り返
し領域（６７９〜６９３）、膜通過ドメイン（アミノ酸７５１〜７７１）、およびアミノ
酸７７１〜９０６由来の細胞質ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ｇＢタンパク
質は、アミノ酸６７〜８６（中和エピトープＡＤ２）および／またはアミノ酸５３２〜６
３５（免疫優性エピトープＡＤ１）を含む。ｇＢ断片の具体例は、ｇＢの最初の６９２ア
ミノ酸を含む「ｇＢ ｓｏｌ ６９２」およびｇＢの最初の７５０アミノ酸を含む「ｇＢ
ｓｏｌ ７５０」を含む。シグナル配列、アミノ酸１〜２４は、所望されるように、ｇ
Ｂ ｓｏｌ ６９２およびｇＢ ｓｏｌ ７５０に存在してもよいまたは存在しなくても
よい。任意選択で、ｇＢタンパク質は、１０アミノ酸長以上のｇＢ断片であり得る。たと
えば、断片におけるアミノ酸の数は、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０
、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３
００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５
５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８
００、８２５、８５０、または８７５アミノ酸を含むことができる。ｇＢ断片は、残基番
号：

のいずれからでも始まり得る。

任意選択で、ｇＢ断片は、断片の出発残基から、５アミノ酸、１０アミノ酸、２０アミ
ノ酸、または３０アミノ酸だけ、Ｎ末端にさらに伸長することができる。任意選択で、ｇ
Ｂ断片は、断片の最後の残基から、５アミノ酸、１０アミノ酸、２０アミノ酸、または３
０アミノ酸だけ、Ｃ末端にさらに伸長することができる。

ＣＭＶ ｇＨタンパク質
いくつかの実施形態では、ｇＨタンパク質は、完全長ｇＨタンパク質（たとえば、７４
３アミノ酸タンパク質であるＣＭＶ ｇＨ ＦＬ、配列番号＿＿＿）である。ｇＨは、７
１６位から出発して７４３位までの膜通過ドメインおよび細胞質ドメインを有する。７１
７〜７４３のアミノ酸の除去により、可溶性ｇＨ（たとえばＣＭＶ ｇＨ ｓｏｌ、配列
番号＿＿＿）が提供される。いくつかの実施形態では、ｇＨタンパク質は、１０アミノ酸
長以上のｇＨ断片であり得る。たとえば、断片におけるアミノ酸の数は、１０、１５、２
０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２
００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４
５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７
００、または７２５アミノ酸を含むことができる。任意選択で、ｇＨタンパク質は、１０
アミノ酸長以上のｇＨ断片であり得る。たとえば、断片におけるアミノ酸の数は、１０、
１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１
７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４
２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６
７５、７００、または７２５アミノ酸を含むことができる。ｇＨ断片は、残基番号：

のいずれからでも始まり得る。

ｇＨ残基は、配列番号＿＿＿において示される完全長ｇＨアミノ酸配列（ＣＭＶ ｇＨ
ＦＬ）に従ってナンバリングされる。任意選択で、ｇＨ断片は、断片の出発残基から、
５アミノ酸、１０アミノ酸、２０アミノ酸、または３０アミノ酸だけ、Ｎ末端にさらに伸
長することができる。任意選択で、ｇＨ断片は、断片の最後の残基から、５アミノ酸、１
０アミノ酸、２０アミノ酸、または３０アミノ酸だけ、Ｃ末端にさらに伸長することがで
きる。

ＣＭＶ ｇＬタンパク質
いくつかの実施形態では、ｇＬタンパク質は、完全長ｇＬタンパク質（たとえば、２７
８アミノ酸タンパク質であるＣＭＶ ｇＬ ＦＬ、配列番号＿＿＿）である。いくつかの
実施形態では、ｇＬ断片を使用することができる。たとえば、断片におけるアミノ酸の数
は、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、
１５０、１７５、２００、２２５、または２５０アミノ酸を含むことができる。ｇＬ断片
は、残基番号：

のいずれからでも始まり得る。

ｇＬ残基は、配列番号＿＿＿において示される完全長ｇＬアミノ酸配列（ＣＭＶ ｇＬ
ＦＬ）に従ってナンバリングされる。任意選択で、ｇＬ断片は、断片の出発残基から、
５アミノ酸、１０アミノ酸、２０アミノ酸、または３０アミノ酸だけ、Ｎ末端にさらに伸
長することができる。任意選択で、ｇＬ断片は、断片の最後の残基から、５アミノ酸、１
０アミノ酸、２０アミノ酸、または３０アミノ酸だけ、Ｃ末端にさらに伸長することがで
きる。

ＣＭＶ ｇＯタンパク質
いくつかの実施形態では、ｇＯタンパク質は、完全長ｇＯタンパク質（たとえば、４７
２アミノ酸タンパク質であるＣＭＶ ｇＯ ＦＬ、配列番号＿＿＿）である。いくつかの
実施形態では、ｇＯタンパク質は、１０アミノ酸長以上のｇＯ断片であり得る。たとえば
、断片におけるアミノ酸の数は、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８
０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００
、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、または４５０アミノ酸を含むことができる
。ｇＯ断片は、残基番号：

のいずれからでも始まり得る。

ｇＯ残基は、配列番号＿＿＿において示される完全長ｇＯアミノ酸配列（ＣＭＶ ｇＯ
ＦＬ）に従ってナンバリングされる。任意選択で、ｇＯ断片は、断片の出発残基から、
５アミノ酸、１０アミノ酸、２０アミノ酸、または３０アミノ酸だけ、Ｎ末端にさらに伸
長することができる。任意選択で、ｇＯ断片は、断片の最後の残基から、５アミノ酸、１
０アミノ酸、２０アミノ酸、または３０アミノ酸だけ、Ｃ末端にさらに伸長することがで
きる。

ＣＭＶ ｇＭタンパク質
いくつかの実施形態では、ｇＭタンパク質は、完全長ｇＭタンパク質（たとえば、３７
１アミノ酸タンパク質であるＣＭＶ ｇＭ ＦＬ、配列番号＿＿＿）である。いくつかの
実施形態では、ｇＭタンパク質は、１０アミノ酸長以上のｇＭ断片であり得る。たとえば
、断片におけるアミノ酸の数は、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８
０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００
、３２５、または３５０アミノ酸を含むことができる。ｇＭ断片は、残基番号：

のいずれからでも始まり得る。

ｇＭ残基は、配列番号＿＿＿において示される完全長ｇＭアミノ酸配列（ＣＭＶ ｇＭ
ＦＬ）に従ってナンバリングされる。任意選択で、ｇＭ断片は、断片の出発残基から、
５アミノ酸、１０アミノ酸、２０アミノ酸、または３０アミノ酸だけ、Ｎ末端にさらに伸
長することができる。任意選択で、ｇＭ断片は、断片の最後の残基から、５アミノ酸、１
０アミノ酸、２０アミノ酸、または３０アミノ酸だけ、Ｃ末端にさらに伸長することがで
きる。

ＣＭＶ ｇＮタンパク質
いくつかの実施形態では、ｇＮタンパク質は、完全長ｇＮタンパク質（たとえば、１３
５アミノ酸タンパク質であるＣＭＶ ｇＮ ＦＬ、配列番号＿＿＿）である。いくつかの
実施形態では、ｇＮタンパク質は、１０アミノ酸長以上のｇＮ断片であり得る。たとえば
、断片におけるアミノ酸の数は、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８
０、９０、１００、または１２５アミノ酸を含むことができる。ｇＮ断片は、残基番号：

のいずれからでも始まり得る。

ｇＮ残基は、配列番号＿＿＿において示される完全長ｇＮアミノ酸配列（ＣＭＶ ｇＮ
ＦＬ）に従ってナンバリングされる。任意選択で、ｇＮ断片は、断片の出発残基から、
５アミノ酸、１０アミノ酸、２０アミノ酸、または３０アミノ酸だけ、Ｎ末端にさらに伸
長することができる。任意選択で、ｇＮ断片は、断片の最後の残基から、５アミノ酸、１
０アミノ酸、２０アミノ酸、または３０アミノ酸だけ、Ｃ末端にさらに伸長することがで
きる。

ＣＭＶ ＵＬ１２８タンパク質
いくつかの実施形態では、ＵＬ１２８タンパク質は、完全長ＵＬ１２８タンパク質（た
とえば、１７１アミノ酸タンパク質であるＣＭＶ ＵＬ１２８ ＦＬ、配列番号＿＿＿）
である。いくつかの実施形態では、ＵＬ１２８タンパク質は、１０アミノ酸長以上のＵＬ
１２８断片であり得る。たとえば、断片におけるアミノ酸の数は、１０、１５、２０、３
０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、または１５０アミノ酸を含
むことができる。ＵＬ１２８断片は、残基番号：

のいずれからでも始まり得る。

ＵＬ１２８残基は、配列番号＿＿＿において示される完全長ＵＬ１２８アミノ酸配列（
ＣＭＶ ＵＬ１２８ ＦＬ）に従ってナンバリングされる。任意選択で、ＵＬ１２８断片
は、断片の出発残基から、５アミノ酸、１０アミノ酸、２０アミノ酸、または３０アミノ
酸だけ、Ｎ末端にさらに伸長することができる。任意選択で、ＵＬ１２８断片は、断片の
最後の残基から、５アミノ酸、１０アミノ酸、２０アミノ酸、または３０アミノ酸だけ、
Ｃ末端にさらに伸長することができる。

ＣＭＶ ＵＬ１３０タンパク質
いくつかの実施形態では、ＵＬ１３０タンパク質は、完全長ＵＬ１３０タンパク質（た
とえば、２１４アミノ酸タンパク質であるＣＭＶ ＵＬ１３０ ＦＬ、配列番号＿＿＿）
である。いくつかの実施形態では、ＵＬ１３０タンパク質は、１０アミノ酸長以上のＵＬ
１３０断片であり得る。たとえば、断片におけるアミノ酸の数は、１０、１５、２０、３
０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、または２
００アミノ酸を含むことができる。ＵＬ１３０断片は、残基番号：

のいずれからでも始まり得る。

ＵＬ１３０残基は、配列番号＿＿＿において示される完全長ＵＬ１３０アミノ酸配列（
ＣＭＶ ＵＬ１３０ ＦＬ）に従ってナンバリングされる。任意選択で、ＵＬ１３０断片
は、断片の出発残基から、５アミノ酸、１０アミノ酸、２０アミノ酸、または３０アミノ
酸だけ、Ｎ末端にさらに伸長することができる。任意選択で、ＵＬ１３０断片は、断片の
最後の残基から、５アミノ酸、１０アミノ酸、２０アミノ酸、または３０アミノ酸だけ、
Ｃ末端にさらに伸長することができる。

ＣＭＶ ＵＬ１３１タンパク質
いくつかの実施形態では、ＵＬ１３１タンパク質は、完全長ＵＬ１３１タンパク質（た
とえば、１２９アミノ酸タンパク質であるＣＭＶ ＵＬ１３１、配列番号＿＿＿）である
。いくつかの実施形態では、ＵＬ１３１タンパク質は、１０アミノ酸長以上のＵＬ１３１
断片であり得る。たとえば、断片におけるアミノ酸の数は、１０、１５、２０、３０、４
０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、または２００ア
ミノ酸を含むことができる。ＵＬ１３１断片は、残基番号：

のいずれからでも始まり得る。

ＵＬ１３１残基は、配列番号＿＿＿において示される完全長ＵＬ１３１アミノ酸配列（
ＣＭＶ ＵＬ１３１ ＦＬ）に従ってナンバリングされる。任意選択で、ＵＬ１３１断片
は、断片の出発残基から、５アミノ酸、１０アミノ酸、２０アミノ酸、または３０アミノ
酸だけ、Ｎ末端にさらに伸長することができる。任意選択で、ＵＬ１３１断片は、断片の
最後の残基から、５アミノ酸、１０アミノ酸、２０アミノ酸、または３０アミノ酸だけ、
Ｃ末端にさらに伸長することができる。

上記に述べられるように、本発明は、第１のヘルペスウイルスタンパク質またはその断
片をコードする第１の配列および第２のヘルペスウイルスタンパク質またはその断片をコ
ードする第２の配列を含有する組換えポリシストロニック核酸分子に関する。したがって
、アルファウイルスＶＲＰおよび２つ以上のＣＭＶタンパク質またはその断片をコードす
る配列を含有する自己複製ＲＮＡなどのある好ましい実施形態の前述の記載は、本発明の
例証となるが、本発明の範囲を限定するものではない。そのような好ましい実施形態にお
けるＣＭＶタンパク質をコードする配列は、ＨＨＶ−１、ＨＨＶ−２、ＨＨＶ−３、ＨＨ
Ｖ−４、ＨＨＶ−６、ＨＨＶ−７、およびＨＨＶ−８などの他のヘルペスウイルス由来の
ｇＨおよびｇＬまたは１０アミノ酸長以上のその断片などのタンパク質をコードする配列
と交換することができることが十分に理解されるであろう。たとえば、適したＶＺＶ（Ｈ
ＨＶ−３）タンパク質は、ｇＢ、ｇＥ、ｇＨ、ｇＩ、およびｇＬならびに１０アミノ酸長
以上のその断片を含み、任意のＶＺＶ株由来のものであり得る。たとえば、ＶＺＶタンパ
ク質またはその断片は、ＶＺＶのｐＯｋａ、Ｄｕｍａｓ、ＨＪＯ、ＣＡ１２３、またはＤ
Ｒ株由来のものであり得る。これらの例示的なＶＺＶタンパク質およびその断片は、ヒト
細胞などの所望の宿主における発現のためにコドン最適化されたかまたはコドン脱最適化
された配列を含む任意の適したヌクレオチド配列によってコードすることができる。ＶＺ
Ｖタンパク質の例示的な配列は、本明細書において提供される。

たとえば、一実施形態では、ポリシストロニック核酸分子は、ＶＺＶ ｇＨタンパク質
またはその断片をコードする第１の配列およびＶＺＶ ｇＬタンパク質またはその断片を
コードする第２の配列を含有する。

いくつかの実施形態では、ポリシストロニック核酸分子中に存在するヘルペスウイルス
タンパク質または断片をコードする配列のそれぞれは、それ自体の制御エレメントに作動
可能に連結されている。たとえば、ヘルペスウイルスタンパク質または断片をコードする
それぞれの配列は、それ自体のサブゲノムプロモーターに作動可能に連結されている。し
たがって、アルファウイルスレプリコンなどのポリシストロニック核酸分子は、２、３、
４、または５つのサブゲノムプロモーターを含有することができ、これらのそれぞれは、
ヘルペスウイルスタンパク質または断片の発現を制御する。このタイプのポリシストロニ
ック核酸分子がアルファウイルスレプリコンなどの自己複製ＲＮＡである場合、それは、
ＶＲＰとしてパッケージすることができるまたはＲＮＡ送達系と結合することができるも
しくはそれと共に処方することができる。

方法および使用
いくつかの実施形態では、自己複製ＲＮＡ分子またはＶＲＰは、免疫応答を刺激するた
めに個体に投与される。そのような実施形態では、自己複製ＲＮＡ分子またはＶＲＰは、
典型的に、薬学的に許容される担体および任意選択でアジュバントを含んでいてもよい組
成物中に存在する。たとえば米国特許第６，２９９，８８４号；米国特許第７，６４１，
９１１号；米国特許第７，３０６，８０５号；およびＵＳ ２００７／０２０７０９０を
参照されたい。

免疫応答は、体液性免疫応答、細胞媒介性免疫応答、またはその両方を含むことができ
る。いくつかの実施形態では、免疫応答は、それぞれの送達されるＣＭＶタンパク質に対
して誘発される。細胞媒介性免疫応答は、ヘルパーＴ細胞（Ｔ_ｈ）応答、ＣＤ８＋細胞傷
害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答、またはその両方を含むことができる。いくつかの実施形態で
は、免疫応答は、体液性免疫応答を含み、抗体は、中和抗体である。中和抗体は、細胞の
ウイルス感染を遮断する。ＣＭＶは、上皮細胞におよびまた線維芽細胞の細胞にも感染す
る。いくつかの実施形態では、免疫応答は、両方の細胞型の感染を低下させるまたは予防
する。中和抗体応答は、補体依存性または補体非依存性であってもよい。いくつかの実施
形態では、中和抗体応答は、補体非依存性である。いくつかの実施形態では、中和抗体応
答は、交差中和性である；すなわち、投与された組成物に対して生成される抗体は、組成
物において使用される株以外の株のＣＭＶウイルスを中和する。

当技術分野における抗体効力の有用な尺度は、「５０％中和力価」である。５０％の中
和性の力価を決定するために、免疫化された動物由来の血清を希釈し、どれくらい希釈し
た血清が、依然として細胞への５０％のウイルスの侵入を遮断する能力を保持するかを評
価する。たとえば、７００の力価は、血清が、７００倍に希釈された後にウイルスの５０
％を中和する能力を保持したことを意味する。したがって、より高い力価は、より強力な
中和抗体応答を示す。いくつかの実施形態では、この力価は、約２００、約４００、約６
００、約８００、約１０００、約１５００、約２０００、約２５００、約３０００、約３
５００、約４０００、約４５００、約５０００、約５５００、約６０００、約６５００、
または約７０００の下限を有する範囲にある。５０％の中和力価範囲は、約４００、約６
００、約８００、約１０００、約１５００、約２００、約２５００、約３０００、約３５
００、約４０００、約４５００、約５０００、約５５００、約６０００、約６５００、約
７０００、約８０００、約９０００、約１００００、約１１０００、約１２０００、約１
３０００、約１４０００、約１５０００、約１６０００、約１７０００、約１８０００、
約１９０００、約２００００、約２１０００、約２２０００、約２３０００、約２４００
０、約２５０００、約２６０００、約２７０００、約２８０００、約２９０００、または
約３００００の上限を有することができる。たとえば、５０％の中和力価は、約３０００
〜約６５００であり得る。「約」は、記載される値のプラスまたはマイナス１０％を意味
する。中和力価は、下記の具体例において記載されるように測定することができる。

免疫応答は、個体、典型的に、ヒトを含む哺乳動物にＶＲＰまたは自己複製ＲＮＡを投
与することによって刺激することができる。いくつかの実施形態では、誘発される免疫応
答は、防御免疫応答である、つまり、応答は、ＣＭＶ感染の危険性または重症度を低下さ
せる。防御免疫応答の刺激は、特にＣＭＶ感染および疾患の危険性のあるいくつかの集団
において特に望ましい。たとえば、危険な状態にある集団は、実質臓器移植（ＳＯＴ）患
者、骨髄移植患者、および造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）患者を含む。ＶＲＰは、移植前の
移植ドナーまたは移植前および／もしくは後の移植レシピエントに投与することができる
。母親から子供への垂直伝播が乳児を感染させるよくある原因であるので、妊娠し得る女
性へのＶＲＰまたは自己複製ＲＮＡの投与は、特に有用である。

投与の任意の適したルートを使用することができる。たとえば、組成物は、筋肉内に、
腹腔内に、皮下に、または経皮的に投与することができる。いくつかの実施形態は、口腔
内に（ｉｎｔｒａ−ｏｒａｌｌｙ）、鼻腔内に、腟内に、および直腸内になどのように、
粘膜内ルートを通して投与されるであろう。組成物は、任意の適したスケジュールに従っ
て投与することができる。

受託番号によって言及されるヌクレオチドおよびアミノ酸配列を含む本開示において引
用される特許、特許出願、および参考文献はすべて、参照によって本明細書において明確
に組み込まれる。上記の開示は、全般的な説明である。より完全な理解は、例示のみの目
的のために提供される次の特定の実施例に対する参照によって得ることができる。

（実施例１）
ＶＲＰプラットフォームを使用する個々のＣＭＶ抗原の送達
それぞれのＣＭＶ糖タンパク質ｇＢおよびｇＨは、中和応答を誘発し、ｇＢは、線維芽
細胞の感染を中和するヒト血清中の抗体の間で有力な抗原である（Ｂｒｉｔｔら（１９９
０年）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．６４巻（３号）：１０７９〜８５頁）。次の実験は、マウスに
おいてＶＲＰプラットフォームを使用して送達されたこれらの抗原に対する中和応答を実
証する。

ＣＭＶ抗原はそれぞれ、ｐｃＤＮＡ−６Ｈｉｓベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の中
にクローニングし、図２において示される構築物をもたらす、Ｐｅｒｒｉら（Ｊ． Ｖｉ
ｒｏｌ ７７巻（１９号）１０３９４〜１０４０３頁（２００３年））によって記載され
るプラスミドに由来するアルファウイルスレプリコンベクター、ｐＶＣＲ ２．１ Ｓａ
ｌＩ／ＸｂａＩの中にクローニングする前にタンパク質発現について試験した。ｐＶＣＲ
２．１ ＳａｌＩ／ＸｂａＩは、不完全ヘルパーのカプシドおよび糖タンパク質ＲＮＡ
と共にエレクトロポレーションされた場合、感染性アルファウイルス粒子を形成する自己
複製ＲＮＡベクターである。

ｐＶＣＲベクターは、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）に由来する不完全ヘルパ
ーのカプシドおよび糖タンパク質ＲＮＡの存在下において、ベビーハムスター腎臓（ＢＨ
ＫＶ）細胞の中にエレクトロポレーションされるＲＮＡを作製するために使用した。エレ
クトロポレーション後に、分泌されたアルファウイルスベクター粒子（ＶＲＰ）を含有す
る上清は、収集し、精製し、力価測定し（ｔｉｔｅｒ）、マウス免疫化研究に使用した。
マウスは、３週間、間隔をあけた一連の２回の免疫化において１×１０^６感染単位／マウ
ス（ＩＵ）で免疫化した。最終的な採血は、２回目の免疫化の３週間後であった。

モノシストロニックｇＢ、ｇＨ、およびｇＬ ＶＲＰ
可溶性ｇＢの異なる２つのバージョンを構築した：「ｇＢ ｓｏｌ ７５０」は、膜貫
通ドメインおよび細胞質ドメインを欠き、「ｇＢ ｓｏｌ ６９２」もまた、疎水性領域
を欠き（図２Ａ）、Ｒｅａｐらの構築物に類似する。膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイ
ンを欠く可溶性ｇＨ（「ｇＨ ｓｏｌ ７１６」）もまた、構築した（図２Ｃ）。免疫化
マウス由来の血清は、いくつかのアッセイにおいてスクリーニングした。免疫ブロット法
（データ示さず）および免疫蛍光アッセイは、抗原に対する特異的な抗体応答を確認する
ために使用した。中和アッセイは、引き起こされた抗体応答が、ＣＭＶ感染を中和するこ
とができたことを実証するために使用した。

免疫化マウス由来の血清は、ｇＢ−６Ｈｉｓを発現する構築物によりトランスフェクト
した２９３Ｔ細胞においてｇＢの認識について免疫蛍光法によって検査した。細胞は、抗
Ｈｉｓ抗体（「抗６Ｈｉｓ」）、モノクローナルｇＢ抗体（「抗ｇＢ ２７〜１５６」）
、または収集したプールマウス血清のいずれかによりプローブした。免疫前血清は、すべ
ての場合において陰性であった。ｇＢ ＦＬ−６Ｈｉｓを発現する構築物によりトランス
フェクトし、固定し、透過処理した細胞において、抗６Ｈｉｓ染色は、エンドサイトーシ
ス／エキソサイトーシス輸送経路に対応する可能性が最も高い点状の細胞質パターンと共
に表面発現の発現パターンを明らかにした。抗ｇＢ ２７〜１５６およびプールマウス血
清の両方は、同様の発現パターンを示した。それぞれのｇＢ ＦＬ ＶＲＰ、ｇＢ ｓｏ
ｌ ７５０ ＶＲＰ、およびｇＢ ｓｏｌ ６９２ ＶＲＰにより免疫化したマウス由来
の血清は、同じ発現パターンを示した。

ｇＨ ＦＬ ＶＲＰおよびｇＨ ｓｏｌ ７１６ ＶＲＰにより免疫化したマウスは、
ｇＨに特異的な抗体を産生した。ｇＨ ＦＬ−６Ｈｉｓを発現する構築物によりトランス
フェクトした２９３Ｔ細胞の免疫蛍光分析は、抗６Ｈｉｓ、抗ｇＨ、およびプールマウス
血清によるｇＨの強力な認識を検出した。ｇＬ ＶＲＰにより免疫化したマウスから収集
された血清は、免疫ブロット法分析および免疫蛍光法によって決定されるように、特異的
な抗体応答をもたらした。ｇＬ ＶＲＰは、中和応答を引き起こさなかった。

ｇＢ ＶＲＰまたはｇＨ ＶＲＰにより免疫化したマウス由来の血清は、ＣＭＶ中和ア
ッセイを使用して、中和抗体の存在について分析した。様々に希釈した血清を、ＣＭＶウ
イルスＴＢ４０ＵＬ３２ＥＧＦＰ（「ＴＢ４０−ＧＦＰ」、ＧＦＰを発現するように操作
した臨床分離株と共にあらかじめインキュベートし、その後、ＡＲＰＥ−１９上皮細胞を
追加し、５日間インキュベートした。感染の５日後に、ＧＦＰ陽性細胞を数えた。このア
ッセイにおいて、中和抗体を含有する血清と共にインキュベートした細胞は、ウイルスの
みと共にまたは免疫前血清と共にインキュベートしたウイルスと共にインキュベートした
細胞と比較して、ＧＦＰ陽性細胞がより少ない。ｇＢ ＶＲＰ、ｇＢ ＦＬ ＶＲＰ、ｇ
Ｂ ｓｏｌ ７５０ ＶＲＰ、またはｇＢ ｓｏｌ ６９２ ＶＲＰにより免疫化したマ
ウス由来の血清は、モルモット補体の存在下において強力な中和活性を有した（１：１２
８０〜１：２５６０の血清希釈で５０％の中和力価；図３）。ｇＨ ＦＬ ＶＲＰまたは
ｇＨ ｓｏｌ ＶＲＰにより免疫化したマウス由来の血清は、モルモット補体に非依存性
のある程度の中和活性を有した（図３）。

（実施例２）
ポリシストロニックアルファウイルスベクターの構築
ＣＭＶは、感染の間にいくつかの多タンパク質複合体を産生する。所望の複合体の成分
をすべて発現する単一のレプリコンを、被験体においてＣＭＶ複合体を産生するために使
用することができるかまたは複合体の成分を、複数のレプリコンベクターから同時送達す
ることができるかどうかを決定するために、発明者らは、複数のＣＭＶタンパク質の発現
の制御を可能にするプラットフォームを設計した。

アルファウイルスベクター（ｐＶＣＲ ２．１ ＳａｌＩ／ＸｂａＩ）は、複数のサブ
ゲノムプロモーター（ＳＧＰ）および目的の遺伝子（ＧＯＩ）の構築を可能にするために
修飾した。１１０２６〜３１ｂｐのｐＶＣＲ ２．１ ＳａｌＩ／ＸｂａＩ ＡｐａＩ部
位は、

に変更した。ＣｌａＩおよびＰｍｌＩ制限部位は、第１のサブゲノムプロモーターおよび
ＳａｌＩ−ＸｂａＩ挿入部位の直ぐ下流の領域に追加した。７７２７〜７７５４ｂｐの配
列は、

に変更した。

シャトルベクター系は、ＳａｌＩ−ＸｂａＩ部位を使用してＳＧＰの直ぐ下流にＧＯＩ
の挿入を可能にするように設計した。ｐｃＤＮＡ ３．１（−）Ｃは、以下のように修飾
した。３つのＳａｌＩ部位を欠失させた：１０４６〜１０５１ｂｐ、３３３２〜３３３７
ｂｐ、および５５１９〜２１、１〜３ｂｐ位を

ｐｃＤＮＡ ３．１（−）Ｃは、

位置９１６〜９２１ｂｐのＸｂａＩ部位を突然変異させるために修飾した。ｐｃＤＮＡ
３．１（−）Ｃは、

に、位置９４２〜９４７（ＣｌａＩ）および９５０〜９５５（ＳａｃＩＩ）ｂｐにＣｌａ
Ｉ部位およびＳａｃＩＩ部位を追加するために修飾した。

一度、制限部位を追加し、結果として生じる配列を検証したら、ｂｐ ７６１１〜７６
８９からの領域

を次のプライマーを使用して、修飾ｐＶＣＲ ２．１アルファウイルスベクターから増幅
した。

増幅した領域は、適切な部位（ＮｏｔＩ−ＣｌａＩまたはＣｌａＩ−ＳａｃＩＩ）の間
に、シャトルベクター（ｐｃＤＮＡ ＳＶ）を作製するために、修飾ｐｃＤＮＡ ３．１
（−）Ｃベクターの中に追加した。ＮｏｔＩ−ＳＧＰ Ｓａｌ−Ｘｂａ−ＣｌａＩの挿入
により、ｐｃＤＮＡ ＳＶカセット２を形成し、ＣｌａＩ−ＳＧＰ Ｓａｌ−Ｘｂａ−Ｓ
ａｃＩＩの挿入によりｐｃＤＮＡ ＳＶカセット３を形成する。これらのＳＶカセットは
、配列決定した。ｐｃＤＮＡ ＳＶカセット２は、ＣｌａＩ部位がｐｃＤＮＡ ＳＶカセ
ット２ベクターにおいてカットされなかったので、ＸｂａＩ部位およびＣｌａＩ部位の間
に追加の１２ｂｐ（ＣＣＡＣＴＧＴＧＡＴＣＧ）（配列番号＿＿＿＿）を含有する。その
ため、ＰｍｌＩ部位を追加した。ｐｃＤＮＡ ＳＶカセット２については、ＰｍｌＩ部位
は、ｂｐ １０１２（ＣＡＣＧＴＧ）（配列番号＿＿）に挿入した。カセット３について
は、ＰｍｌＩ部位は、ｂｐ ９３５〜９４０に追加した。

それぞれのポリシストロニックベクターについては、第１の遺伝子は、ＳａｌＩ−Ｘｂ
ａＩ部位を使用して、ｐＶＣＲ ２．１修飾ベクターの中に直接挿入した。第２の遺伝子
は、ＳａｌＩ−ＸｂａＩを使用して、ｐｃＤＮＡ ＳＶカセット２の中にライゲーション
し、ＮｏｔＩ−ＰｍｌＩ、ＮｏｔＩ−ＳａｃＩＩを使用して切り取ったまたはＮｏｔＩ−
ＣｌａＩについてプライマーを使用してＰＣＲし、ＮｏｔＩおよびＣｌａＩを使用して消
化した。結果として生じる挿入物ＳＧＰ−ＳａｌＩ−ＧＯＩ−Ｘｂａは、ＮｏｔＩ−Ｐｍ
ｌＩ、ＮｏｔＩ−ＳａｃＩＩ、またはＮｏｔＩ−ＣｌａＩ部位を使用して修飾ｐＶＣＲ
２．１ベクターの中にライゲーションした。構築物中の所望の遺伝子がＰｍｌＩ部位を含
有した場合に限り、ＮｏｔＩ−ＣｌａＩ挿入物を使用した。

いくつかの場合には、第３の遺伝子は、ＳａｌＩ−ＸｂａＩを使用して、ｐｃＤＮＡ
ＳＶカセット３の中にライゲーションし、ＰｍｌＩ−ＳａｃＩＩを使用して切り取ったま
たはＣｌａＩ−ＳａｃＩＩについてプライマーを使用してＰＣＲし、ＣｌａＩおよびＳａ
ｃＩＩを使用して消化した。結果として生じる挿入物ＳＧＰ−ＳａｌＩ−ＧＯＩ−Ｘｂａ
Ｉは、ＰｍｌＩ−ＳａｃＩＩまたはＣｌａＩ−ＳａｃＩＩを使用して、修飾ｐＶＣＲ ２
．１の中にライゲーションした。

ＳａｌＩ−ＸｂａＩ消化は、ポリシストロニックベクターＤＮＡの構築を検証するため
に使用した。ＳａｌＩ−ＸｂａＩによる消化後に、アガロースゲル電気泳動は、ＧＯＩの
存在を確認するために実行した。その後、ポリシストロニックベクターＤＮＡは、Ｐｍｅ
Ｉにより一晩直線化し、ＱｉａｇｅｎのＰＣＲ精製キットを使用して精製し、Ａｍｂｉｏ
ｎ ｍＭｅｓｓａｇｅ ｍＭａｃｈｉｎｅキットを使用して、ＲＮＡを作製するために鋳
型として使用した。ＲＮＡ品質は、ＲＮＡアガロースゲル上に試料のアリコートを泳動す
ることによってチェックした。

ポリシストロニックベクターからの発現
蛍光タンパク質ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）およびｍＣｈｅｒｒｙ（赤色蛍光タンパ
ク質）は、ポリシストロニックベクターが２つのタンパク質を発現する能力を評価するた
めに、ＧＯＩとして使用した。発明者らは、ＧＦＰが第１のサブゲノムプロモーターを使
用して、発現され、ｍＣｈｅｒｒｙが第２のサブゲノムプロモーターから発現されるバイ
シストロニックベクターを調製した（図４Ａ）。これらのタンパク質についてのコード配
列を含有するポリヌクレオチドは、ＳａｌＩ−ＸｂａＩ部位を使用して挿入した。第１の
ポリヌクレオチド（ＧＦＰ）は、修飾アルファウイルスレプリコンベクターの中に直接挿
入した。第２のポリヌクレオチド（ｍＣｈｅｒｒｙ）は、コード配列の直ぐ上流にサブゲ
ノムプロモーターを含有するシャトルベクターの中に最初に挿入した。第２のサブゲノム
プロモーターおよび第２のポリヌクレオチドの両方を含有する断片を単離し、第１のポリ
ヌクレオチドを含有する修飾アルファウイルスレプリコンベクターの中にライゲーション
し、複数のサブゲノムプロモーターを有するアルファウイルスレプリコンがもたらされた
。

ＶＲＰは、ＣａｐおよびＧｌｙについての不完全ヘルパーＲＮＡとともにレプリコンＲ
ＮＡをエレクトロポレーションすることによって、ＢＨＫＶ細胞において産生した。ＶＲ
Ｐは、エレクトロポレーションの２４時間後に収集し、細胞当たり２０感染単位（ＩＵ）
の感染多重度（ＭＯＩ）でＢＨＫＶ細胞を感染させるために使用した。

実験により、４セットのＶＲＰを試験した：ＧＦＰのみを発現する１つのＶＲＰ；ｍＣ
ｈｅｒｒｙを発現する１つのＶＲＰ；両方とも２０ＩＵ／細胞のＭＯＩで、ＧＦＰのみを
発現する１つのＶＲＰおよびｍＣｈｅｒｒｙのみを発現する１つのＶＲＰ；ならびにバイ
シストロニックベクターＧＦＰ（１）−ＳＧＰｍＣｈｅｒｒｙ（２）を含有する１つのＶ
ＲＰ。ＶＲＰ感染ＢＨＫＶ細胞は、共存のパーセントを決定するために感染の２４時間後
に検査した。一つずつ感染させた場合、細胞は、ほぼすべて、ＧＦＰまたはｍＣｈｅｒｒ
ｙについて陽性であった。２つの別々のＶＲＰを感染させた細胞は、緑色または赤色のい
ずれかに見えた。黄色の細胞はほとんどなく、少数の細胞が等しいレベルでＧＦＰおよび
ｍＣｈｅｒｒｙを発現し、同時感染のレベルが低かったことを示した。これらのデータは
、ＦＡＣＳ分析を使用して確認した（図４Ｂ）。

対照的に、バイシストロニックベクターＧＦＰ（１）−ＳＧＰｍＣｈｅｒｒｙ（２）を
含有するアルファウイルスを感染させた細胞は、すべて黄色であり、これは、ＧＦＰおよ
びｍＣｈｅｒｒｙのほぼ等しい発現を示す。本研究は、単一のポリシストロニックアルフ
ァウイルスレプリコンベクターから複数のタンパク質を成功裏に発現させることができる
ことを実証する。

（実施例３）
ＣＭＶ複合体の産生
本実施例は、ポリシストロニックアルファウイルスレプリコンベクターから、複合体成
分の送達後に細胞においてＣＭＶタンパク質複合体を形成することができることを実証す
る。

ｇＨ／ｇＬおよびｇＨ／ｇＬ／ｇＯ複合体
ポリシストロニックｇＨ／ｇＬおよびｇＨ／ｇＬ／ｇＯアルファウイルスレプリコンは
、上記に記載される（図５Ａにおいて概略的に示される）ように構築した。ｇＨ、ｇＬ、
ｇＯ、ｇＨ／ｇＬ、およびｇＨ／ｇＬ／ｇＯをコードするレプリコンを含有するＶＲＰは
、上記に記載されるようにＢＨＫＶ細胞において産生し、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける複合
体形成を実証するためにＢＨＫＶ細胞を感染させるために使用した。ＶＲＰ感染ＡＲＰＥ
−１９細胞は、ｇＨ／ｇＬのジスルフィド結合複合体を産生した。ｇＯは、ｇＨ／ｇＬ結
合を検出可能な程度に改変しなかった（図５Ｂ）。

免疫蛍光研究は、単独で送達されたｇＨおよびｇＬの局在化を評価し、ポリシストロニ
ックアルファウイルスを使用して送達した場合に、同時発現された場合のタンパク質の再
局在化を調べるために行なった。ｇＨ局在化は、ｇＬまたはｇＬ／ｇＯの存在下または非
存在下において変化するように見えなかった。ｇＨおよびｇＨ／ｇＯの存在下における場
合、ｇＬ局在化は変化した。

最後に、ｇＨ／ｇＬの結合を、免疫沈降によって検査した。市販のｇＨ抗体（Ｇｅｎｗ
ａｙ）は、ｇＨおよびｇＬの結合を調査するために使用した。すべての場合において、ｇ
Ｈ抗体は、ｇＨを効率的に免疫沈降させた（図５Ｃ）。ｇＨが存在しなかった場合、ｇＬ
は、免疫沈降しなかった。ｇＬがｇＨまたはｇＨ／ｇＯの存在下において発現した場合、
ｇＨとｇＬが結合した（図５Ｃ）。

ｇＨの存在下におけるｇＬの再局在化およびｇＨ／ｇＬの結合（ｇＯありまたはなし）
は、ポリシストロニックアルファウイルスレプリコンの成分がすべて、発現され、複合体
を形成するように結合することを示す。

（実施例４）
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてｇＨ／ｇＬ複合体形成を達成するＶＲＰは、ｇＢ ＶＲＰに
対して引き起こされる免疫応答より質的かつ量的に優れた、ＣＭＶに対する強力な免疫応
答を誘発する
本実施例は、単一成分を送達するＶＲＰもしくは組み合わせて投与される単一成分ＶＲ
Ｐを使用して得られる免疫応答またはｇＢ ＶＲＰによって引き起こされる応答と比較し
た、ポリシストロニックｇＨ／ｇＬ ＶＲＰまたはｇＨ／ｇＬ／ｇＯ ＶＲＰを送達する
ことによって形成される複合体に対する頑健な免疫応答の誘発を実証する。

マウスは、３週間間隔で投与したＶＲＰにより３回感染させた（マウス１匹あたり１０
^６ＩＵ；５匹のＢａｌｂＣマウス／群）。単一のおよびポリシストロニックＶＲＰによる
免疫化から収集した血清は、上記に記載されるように、ＣＭＶ中和アッセイを使用して中
和抗体についてスクリーニングした。中和力価は、以下のように測定した。血清の様々な
希釈物は、モルモット補体の存在下または非存在下においてＴＢ４０−ＵＬ３２−ＥＧＦ
Ｐと共にあらかじめインキュベートし、その後、ＡＲＰＥ−１９上皮細胞またはＭＲＣ−
５線維芽細胞の細胞に追加し、５日間インキュベートした。ウイルスによる５日の感染後
に、ＧＦＰ陽性細胞を数えた。ＡＲＰＥ−１９細胞についての結果は、図６Ａ、図６Ｂ、
および図６Ｃに示す。ＭＲＣ−５細胞についての結果は、図７Ａおよび図７Ｂに示す。

ｇＨ ＦＬ ＶＲＰにより免疫化したマウス由来の血清は、低度の補体非依存性中和活
性を有した（図６Ａおよび図６Ｂ）。中和活性は、モルモット補体の存在下または非存在
下において、ｇＬまたはｇＯのみにより免疫化したマウス由来の血清を使用した場合観察
されなかった（図６Ｃ）。いくつかのＣＭＶ ｇＢタンパク質（ｇＢ ＦＬ、ｇＢ ｓｏ
ｌ ７５０、およびｇＢ ｓｏｌ ６９２）による免疫化由来のプール血清は、モルモッ
ト補体の存在下において強力な中和活性を実証し、１：１２８０血清希釈で５０％の中和
力価であった。しかしながら、プールｇＢ血清についてＡＲＰＥ−１９細胞においてモル
モット補体の非存在下における中和活性はなかった。単一のＣＭＶタンパク質を発現する
ＶＲＰ（１０^６ＩＵ／マウス／ＶＲＰで、ｇＨ−もしくはｇＬ−ＶＲＰまたはｇＨ−、ｇ
Ｌ−、およびｇＯ−ＶＲＰの同時投与）は、ｇＨのみのものを超えて中和活性を増強しな
かった。

対照的に、バイシストロニックｇＨ／ｇＬまたはトリシストロニックｇＨ／ｇＬ／ｇＯ
ＶＲＰ（１×１０^６ＩＵ／マウス）により免疫化したマウス由来の血清は、頑健な中和
応答を実証した。さらに、応答は、モルモット補体の存在下および非存在下において類似
しており、ポリシストロニックＶＲＰが補体非依存性免疫応答を成功裏に誘発したことを
示した（図６Ｃ）。５０％の中和力価は、ＴＢ４０−ＧＦＰ ＣＭＶウイルスを有するＡ
ＲＰＥ−１９細胞において１：３５００〜６４００＋血清希釈であった。この力価は、ｇ
Ｂプール血清についての５０％の補体依存性中和力価のほぼ３〜４倍の力価である。

ＭＲＣ−５線維芽細胞の細胞における結果は、ＡＲＰＥ−１９細胞における結果に類似
した（図７Ａおよび７Ｂ）。バイシストロニックｇＨ／ｇＬまたはトリシストロニックｇ
Ｈ／ｇＬ／ｇＯ ＶＲＰにより免疫化したマウス由来の血清は、ｇＨのみ、ｇＬのみ、ま
たはｇＯのみをコードするＶＲＰにより免疫化したマウス由来の血清ならびにｇＨ ＶＲ
ＰおよびｇＬ ＶＲＰの同時投与またはｇＨ ＶＲＰ、ｇＬ ＶＲＰ、およびｇＯ ＶＲ
Ｐの同時投与によって免疫化したマウス由来の血清と比較して、強力な中和活性を実証し
た。これらの結果は、ポリシストロニックＶＲＰの投与が、線維芽細胞の細胞のＣＭＶ感
染の好適な補体非依存性中和を提供する免疫応答を誘発したことを実証する。ＣＭＶの異
なる株に対するｇＨ／ｇＬ免疫血清の広さ（ｂｒｅａｄｔｈ）および効力を評価するため
に、発明者らは、血清が、ＣＭＶの６つの異なる株による線維芽細胞および上皮細胞の感
染を遮断する能力を比較した。図８は、ｇＨ／ｇＬ血清が、広範囲の株による両方の細胞
型の感染を強力に中和することを示す。

これらのデータはまた、１つのタンパク質のみを発現するＶＲＰの混合プールによって
ではなく、ポリシストロニックＶＲＰにより免疫化したマウス由来の血清についての強力
な中和活性を実証する。これは、単一のレプリコン上にタンパク質複合体の成分をコード
するポリシストロニックレプリコンがｉｎ ｓｉｔｕにおいて複合体の効率的な産生をも
たらすことを示す。さらに、Ｍｅｒｌｉｎ株ＣＭＶタンパク質をこれらの応答を刺激する
ために使用したので、ＴＢ４０株ＣＭＶウイルスを使用して得られたｉｎ ｖｉｔｒｏに
おけるデータは、ポリシストロニックＶＲＰの送達によって誘発される中和抗体が交差中
和抗体であることを実証する。

（実施例５）
ＲＮＡ合成
アルファウイルスレプリコンをコードするプラスミドＤＮＡ（図１４〜１６を参照され
たい）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＲＮＡの合成のための鋳型としての役目をした。ア
ルファウイルスレプリコンは、ＲＮＡ複製に必要とされる遺伝子エレメントを含有するが
、粒子構築に必要な遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントを欠き、アルファウイルス
ゲノムの構造遺伝子は、異種タンパク質をコードする配列と交換する。真核細胞へのレプ
リコンの送達に際して、プラス鎖ＲＮＡは、４つの非構造タンパク質を産生するように翻
訳され、これらは、ともに、ゲノムＲＮＡを複製し、異種遺伝子産物または目的の遺伝子
（ＧＯＩ）をコードする大量のサブゲノムｍＲＮＡを転写する。アルファウイルス構造タ
ンパク質の発現が欠如していることにより、レプリコンは、感染性粒子の生成を誘発する
ことができない。アルファウイルスｃＤＮＡの上流のバクテリオファージプロモーター（
Ｔ７またはＳＰ６）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるレプリコンＲＮＡの合成を容易にし、
ポリ（Ａ）テイルの直ぐ下流のデルタ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）リボザイムは、その自己
切断活性を通して正確な３’末端を生成する。

抗原性タンパク質複合体の形成を可能にするために、同じ細胞における当該複合体の個
々の成分の発現は、最も重要である。理論上、これは、個々の成分をコードする遺伝子に
より細胞を同時トランスフェクトすることによって達成することができる。しかしながら
、非ウイルスまたはＶＲＰ送達アルファウイルスレプリコンＲＮＡの場合には、この戦略
は、複数のＲＮＡの同じ細胞への非効率的な同時送達によってか、あるいは個々の細胞に
おける複数の自己複製ＲＮＡの非効率的な開始（ｌａｕｎｃｈ）によって妨げられる。タ
ンパク質複合体の成分の同時発現を容易にするための潜在的により効率的な方法は、同じ
自己複製ＲＮＡ分子の一部としてそれぞれの遺伝子を送達することである。この目的のた
めに、発明者らは、目的の複数の遺伝子をコードするアルファウイルスレプリコン構築物
を創出した。すべてのＧＯＩの前に、アルファウイルス転写機構によって認識されるそれ
自体のサブゲノムプロモーターを置く。それによって、複数のサブゲノムメッセンジャー
ＲＮＡ種は、個々の細胞において合成され、多成分タンパク質複合体の構築を可能にする
。

適した制限エンドヌクレアーゼによるＨＤＶリボザイムの下流のプラスミドＤＮＡの直
線化の後に、ランオフ（ｒｕｎ−ｏｆｆ）転写物を、Ｔ７バクテリオファージ由来のＤＮ
Ａ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて合成した。転写は、
製造者（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）によって提供される説明書に従って、７．
５ｍＭのそれぞれのヌクレオシド三リン酸（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、およびＵＴＰ）の
存在下において３７℃で２時間実行した。転写の後に、鋳型ＤＮＡは、ＴＵＲＢＯ ＤＮ
アーゼ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）により消化した。レプリコンＲＮＡは、Ｌ
ｉＣｌにより沈殿させ、ヌクレアーゼを含まない水で再構成した。キャップがないＲＮＡ
は、ユーザーマニュアルにおいて概説されるように、ＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｍ^７Ｇキャッ
ピングシステム（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏ
ｎ、ＷＩ）を使用して、ワクシニアキャッピング酵素（ＶＣＥ）により転写後にキャップ
した。転写後にキャップしたＲＮＡは、ＬｉＣｌにより沈殿させ、ヌクレアーゼを含まな
い水で再構成した。ＲＮＡ試料の濃度は、２６０ｎｍでの光学濃度を測定することによっ
て決定した。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける転写物の完全性は、変性アガロースゲル電気泳動
によって確認した。

脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）処方物
１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭ
Ａ）は、以前に公開された手順を使用して合成した［Ｈｅｙｅｓ， Ｊ．、Ｐａｌｍｅｒ
， Ｌ．、Ｂｒｅｍｎｅｒ， Ｋ．、ＭａｃＬａｃｈｌａｎ， Ｉ．Ｃａｔｉｏｎｉｃ
ｌｉｐｉｄ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａ
ｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ
．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ， １０７巻：２７６
〜２８７頁（２００５年）］。１，２−ジステアロイル（Ｄｉａｓｔｅａｒｏｙｌ）−ｓ
ｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）は、Ｇｅｎｚｙｍｅから購入した。コレス
テロールは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｉｓ、ＭＯ）から得た。１，２−
ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリ
エチレングリコール）−２０００］（アンモニウム塩）（ＰＥＧ ＤＭＧ ２０００）は
、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓから得た。

ＬＮＰ（ＲＶ０１（１４））は、次の方法を使用して処方した。１５０μｇバッチ、（
ＰＥＳ中空繊維、ムスタング（ｍｕｓｔａｎｇ）なし）：エタノール中の新たな脂質スト
ック溶液を調製した。３７ｍｇのＤｌｉｎＤＭＡ、１１．８ｍｇのＤＳＰＣ、２７．８ｍ
ｇのコレステロール、および８．０７ｍｇのＰＥＧ ＤＭＧ ２０００を秤量し、７．５
５ｍＬのエタノール中に溶解した。新たに調製した脂質ストック溶液は、均質の混合物を
形成するために約１５分間、３７℃で穏やかに揺り動かした。その後、２ｍＬの使用脂質
ストック溶液を作製するために、４５３μＬのストックを、１．５４７ｍＬエタノールに
追加した。脂質のこの量は、８：１ Ｎ：Ｐ（窒素 対 ホスフェート）比の１５０μｇ
ＲＮＡを有するＬＮＰを形成するために使用した。ＤｌｉｎＤＭＡ（カチオン性脂質）
上のプロトン化可能な（ｐｒｏｔｏｎａｔａｂｌｅ）窒素およびＲＮＡ上のホスフェート
は、この計算に使用される。自己複製ＲＮＡ分子 １μｇは、３ｎｍｏｌｅのアニオン性
ホスフェートを含有することが想定され、ＤｌｉｎＤＭＡ １μｇは、１．６ｎｍｏｌｅ
のカチオン性窒素を含有することが想定された。ＲＮＡの２ｍＬ使用溶液もまた、１００
ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６）（Ｔｅｋｎｏｖａ）において約１μｇ／μＬのストック溶
液から調製した。３つの２０ｍＬガラスバイアル（撹拌棒を含む）は、ＲＮａｓｅ Ａｗ
ａｙ溶液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）によりすすぎ、ＲＮアーゼか
らバイアルを除染するために使用の前に多量のＭｉｌｌｉＱ水により洗浄した。バイアル
の１つは、ＲＮＡ使用溶液に使用し、他のものは脂質およびＲＮＡミックスを収集するた
めに使用した（後に記載する）。使用脂質およびＲＮＡ溶液は、３ｃｃ ｌｕｅｒ−ｌｏ
ｋシリンジ（ＢＤ Ｍｅｄｉｃａｌ）の中に装填する前に１０分間、３７℃で加熱した。
２ｍＬのクエン酸緩衝液（ｐＨ６）を他の３ｃｃのシリンジ中に装填した。ＲＮＡおよび
脂質を含有するシリンジは、ＦＥＰチューブ（［フッ化エチレンプロピレン］ ２ｍｍ
ＩＤ×３ｍｍ ＯＤ、Ｉｄｅｘ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｏａｋ Ｈａｒｂｏｒ
、ＷＡ）を使用してＴミキサー（ＰＥＥＫ（商標）５００μｍ ＩＤジャンクション）に
接続した。Ｔミキサーからの出口もまた、ＦＥＰチューブ（２ｍｍ ＩＤ×３ｍｍ）とし
た。クエン酸緩衝液を含有する第３のシリンジは、チューブの別々の部分（２ｍｍ ＩＤ
×３ｍｍ ＯＤ）に接続した。その後、シリンジはすべて、シリンジポンプ（ｋｄＳｃｉ
ｅｎｔｉｆｉｃ製、モデル番号ＫＤＳ−２２０）を使用して、７ｍＬ／分の流量で駆動し
た。チューブの出口は、２０ｍＬガラスバイアル中に混合物を収集するように位置づけた
（撹拌しながら）。撹拌棒を取り出し、１時間、室温でエタノール／水溶液を平衡化させ
た。その後、混合物は、ＦＥＰチューブ（２ｍｍ ＩＤ×３ｍｍ ＯＤ）の部分に取り付
けた５ｃｃシリンジ（ＢＤ Ｍｅｄｉｃａｌ）中に装填し、等しい長さのＦＥＰチューブ
を有する他の５ｃｃシリンジ中に、等しい容積の１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６）を
装填した。２つのシリンジは、シリンジポンプを使用して７ｍＬ／分の流量で駆動し、最
終混合物は、２０ｍＬガラスバイアル中に収集した（撹拌しながら）。次に、ＬＮＰは、
２ｍＬまで濃縮し、最終生産物を回収する前に、タンジェンシャルフローフィルトレーシ
ョン（ＴＦＦ）システムを使用して１０〜１５容積の１×ＰＢＳ（Ｔｅｋｎｏｖａ製）に
対して透析した。ＴＦＦシステムおよび中空繊維濾過膜は、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｓ
から購入し、製造者のガイドラインに従って使用した。１００ｋＤ孔径カットオフおよび
２０ｃｍ^２表面積を有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）中空繊維濾過膜（部品番号Ｐ
−Ｃ１−１００Ｅ−１００−０１Ｎ）を使用した。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖ
ｏにおける実験のために、処方物は、１×ＰＢＳ（Ｔｅｋｎｏｖａ製）により、必要とさ
れるＲＮＡ濃度まで希釈した。

粒度
粒度は、製造者の説明書に従って、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅ
ｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を使用して測定
した。粒度は、多分散指数（ｐｄｉ）によるＺ平均値として報告する。リポソームは、測
定の前に１×ＰＢＳにおいて希釈した。

被包効率およびＲＮＡ濃度
被包されたＲＮＡのパーセンテージおよびＲＮＡ濃度は、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ Ｒｉｂｏ
Ｇｒｅｅｎ ＲＮＡ試薬キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって決定した。アッセイに
おいて製造者の説明書に従った。キット中に提供されるリボソームＲＮＡ標準物質は、標
準曲線を生成するために使用した。方法１または方法２〜５から得たＬＮＰは、色素の追
加前に、１×ＴＥ緩衝液（キットからの）においてそれぞれ１０倍または１００倍に希釈
した。別々に、ＬＮＰは、色素の追加の前に、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ（Ｓｉｇｍａ−
Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する１×ＴＥ緩衝液中に１０または１００倍に希釈した。その後
、等量の色素をそれぞれの溶液に追加し、その後、色素追加後の約１８０μＬのそれぞれ
の溶液を、９６ウェル組織培養プレート（ＶＷＲから得た、カタログ番号３５３０７２）
の中に二連で入れた。蛍光（Ｅｘ４８５ｎｍおよびＥｍ５２８ｎｍ）は、マイクロプレー
トリーダー（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．製）上で読み取った。

Ｔｒｉｔｏｎ Ｘは、ＬＮＰを破壊するために使用し、全ＲＮＡ量に対応する蛍光の読
み取り値を提供し、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘを用いない試料は、被包されていないＲＮＡに対応
する蛍光を提供した。ＲＮＡ被包％は、以下のように決定した：ＬＮＰ ＲＮＡ被包（％
）＝［（Ｆ_ｔ−Ｆ_ｉ）／Ｆ_ｔ］×１００、Ｆ_ｔは、ｔｒｉｔｏｎ Ｘの追加ありのＬＮＰ
の蛍光強度であり、Ｆ_ｉは、洗浄剤の追加なしのＬＮＰ溶液の蛍光強度である。これらの
値（Ｆ_ｔおよびＦ_ｉ）は、ブランク（１×ＴＥ緩衝液）蛍光強度からの減算後に得た。被
包されたＲＮＡの濃度は、生成された標準曲線とＦ_ｔ−Ｆ_ｉを比較することによって得た
。ＬＮＰ処方物はすべて、被包用量に基づいてｉｎ ｖｉｖｏにおいて投薬した。

ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）
レポーター遺伝子または抗原のｉｎ ｖｉｖｏにおける発現を達成するための従来のＲ
ＮＡベクター（ＲＮＡ−ｖｅｃｔｏｒｅｄ）アプローチとＲＮＡワクチンを比較するため
に、発明者らは、対応するＲＮＡ構築物と同じ抗原の発現をコードする、Ｐｅｒｒｉら（
Ｊ． Ｖｉｒｏｌ ７７巻（１９号）：１０３９４〜１０４０３頁（２００３年））によ
って記載される方法によってＢＨＫ細胞において産生されるウイルスレプリコン粒子（Ｖ
ＲＰ）を利用した。この系において、抗原は、シンドビスウイルスの３’末端配列（３’
ＵＴＲ）およびシンドビスウイルスパッケージングシグナル（ＰＳ）を含有するように操
作された、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）のゲノムに由来するアルファウイル
スキメラレプリコン（ＶＣＲ）から成った（Ｐｅｒｒｉらの図２を参照されたい）。レプ
リコンは、シンドビスウイルスのカプシドおよび糖タンパク質遺伝子をコードする不完全
ヘルパーＲＮＡと共に、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞の中にそれらを同時にエレ
クトロポレーションすることによってＶＲＰにパッケージした（Ｐｅｒｒｉらの図２を参
照されたい）。その後、ＶＲＰは、収集し、スクロースクッション上で超遠心分離法によ
って部分的に精製し、Ａｍｉｃｏｎ濃縮機で濃縮した。結果として生じるＶＲＰストック
は、標準的な方法によって力価を測定し、培養液または他の等張性の緩衝液で動物に接種
した。ベネズエラウマ脳炎およびシンドビスウイルスに由来するアルファウイルスレプリ
コン粒子キメラは、強力な遺伝子ベースのワクチン送達ベクターである。Ｊ． Ｖｉｒｏ
ｌ．７７巻、１０３９４〜１０４０３頁。

マウス免疫原性研究
８〜１０週齢で体重が約２０ｇである１０匹の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスの群を、０日目
、２１日目、および４２日目に、１×１０^６ＩＵ（ＶＲＰ）または１．０μｇ（ＲＮＡ）
により免疫化し、２回目のワクチン接種の３週間後および３回目のワクチン接種の３週後
に採血した。動物はすべて、それぞれ２本の後肢の四頭筋に注射し、等価な容積（部位当
たり５０μｌ）を受けた。

マイクロ中和アッセイ
血清試料は、感染低下中和試験によって中和抗体の存在について試験した。ＨＩ血清（
１０％ＨＩ ＦＢＳを有するＤＭＥＭ中）の２倍段階希釈物を、およそ２００ＩＵ／５０
μｌを示すようにあらかじめ力価測定した等しい容積のＣＭＶ（株ＴＢ４０または臨床分
離株８８１９）に追加した。ＶＲ１８１４、Ｔｏｗｎｅ、ＡＤ１６９株、および臨床分離
株８８２２もまた、使用した。血清／ウイルス混合物は、ウイルス中和が起こるように、
３７℃および５％ＣＯ_２で２時間インキュベートし、その後、５０μｌのこの混合物（お
よそ２００ＩＵを含有する）を、９６ハーフウェルプレート中のＡＲＰＥ−１９細胞の二
連のウェル上に接種した。プレートは、４０〜４４時間インキュベートした。その他に示
されない限り、陽性感染した増殖巣（ｆｏｃｕｓ）の数は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８
８コンジュゲートＩＥ１ ＣＭＶモノクローナル抗体により免疫染色し、その後自動計数
を続けることによって決定した。中和力価は、対照（血清なし）と比べた、ウェル当たり
の陽性ウイルス増殖巣の数における５０％の低下をもたらす血清希釈の逆数として定義さ
れる。

ｇＨ／ｇＬ ＶＲＰおよびＬＮＰ処方ＲＮＡの免疫原性
ＣＭＶの表面糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）を発現するＡ３２３レプリコン、完全長糖タンパ
ク質ＨおよびＬ（ｇＨ／ｇＬ）の膜複合体を発現するＡ１６０レプリコン、ならびに糖タ
ンパク質ＨおよびＬの可溶性の形態の膜複合体（ｇＨｓｏｌ／ｇＬ）を発現するＡ３２２
レプリコンを本実験に使用した。ＢＡＬＢ／ｃマウス、群当たり１０匹の動物に、ｇＢを
発現するＶＲＰ（１×１０^６ＩＵ）、ｇＨ／ｇＬを発現するＶＲＰ（１×１０^６ＩＵ）、
ｇＨｓｏｌ／ｇＬを発現するＶＲＰ（１×１０^６ＩＵ）、および対照としてのＰＢＳによ
り、０日目、２１日目、および４２日目に、両側の筋肉内ワクチン接種（肢当たり５０μ
Ｌ）を与えた。３つの試験群は、ＬＮＰ（ＲＶ０１（１４）中に処方した自己複製ＲＮＡ
（Ａ１６０、Ａ３２２、またはＡ３２３）を受けた。血清は、３９日目（３ｗｐ２）およ
び６３日目（３ｗｐ３）に免疫学的分析のために収集した。

結果
実験のために作製したＲＶ０１（１４）処方物における被包ＲＮＡのｓｉｖｅおよびパ
ーセンテージを表３に示す。

最終的な血清（６３日目、最終ワクチン接種の３週後）についての５０％の中和性の力
価を表４に示す。

ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ複合体の完全長形態または推定される可溶性の形態を発現するＲ
ＮＡは、２つの異なるＨＣＭＶ株を使用して上皮細胞上でアッセイされる場合、高い力価
の中和抗体を引き起こす。ｇＨ／ｇＬ ＲＮＡによって引き起こされる平均力価は、対応
するｇＨ／ｇＬ ＶＲＰについての平均力価と少なくとも同じくらい高い（図１７を参照
されたい）。

（実施例６）
ＣＭＶタンパク質をコードするバイシストロニックおよびペンタシストロニック核酸
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）由来の糖タンパク質複合体を発現する追加のバ
イシストロニックおよびペンタシストロニックアルファウイルスレプリコンを、調製した
、また、図１８および２０に概略的に示す。アルファウイルスレプリコンは、ベネズエラ
ウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）に基づいた。レプリコンは、ウイルスレプリコン粒子（ＶＲ
Ｐ）の中にパッケージした、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中に被包した、またはカチオン性ナ
ノエマルジョン（ＣＮＥ）と共に処方した。レプリコンのそれぞれからのコードされたＨ
ＣＭＶタンパク質およびタンパク質複合体の発現は、免疫ブロット法、免疫共沈降、およ
びフローサイトメトリーによって確認した。フローサイトメトリーは、五量体複合体上に
存在するコンフォメーション性エピトープに特異的なヒトモノクローナル抗体を使用して
、複合体のタンパク成分をコードする五量体のレプリコンからの五量体のｇＨ／ｇＬ／Ｕ
Ｌ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１複合体の発現を検証するために使用した（Ｍａｃａｇ
ｎｏら（２０１０年）、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．８４巻（２号）：１００５〜１３頁）。図１
９は、これらの抗体が、ＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五
量体複合体（Ａ５２７）を発現するレプリコンＲＮＡによりトランスフェクトされたＢＨ
ＫＶ細胞に結合することを示す。細胞を同じレプリコン構築物から作製したＶＲＰにより
感染させた場合、同様の結果が得られた。これは、五量体複合体を発現するように設計し
たレプリコンが、潜在的な副産物ｇＨ／ｇＬではなく所望の抗原を実際に発現することを
示す。

ＶＲＰ、ＬＮＰ中に被包したＲＮＡ、およびＣＮＥと共に処方したＲＮＡは、後方の四
頭筋への筋肉内注射によってＢａｌｂ／ｃマウスを免疫化するために使用した。マウスは
、３回、３週間間隔で免疫化し、血清試料は、それぞれの免疫化に先立ってならびに３回
目および最終の免疫化の３週間後に収集した。血清は、ワクチン接種によって引き起こさ
れる中和抗体応答の効力を測定するためにマイクロ中和アッセイにおいて評価した。力価
は、５０％の中和性の力価として表現する。

ＶＲＰにおける可溶性のＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ複合体についてのバイシストロニック発
現カセットの多くの異なる構成の免疫原性を評価した。図２０は、膜に係留された完全長
ｇＨ／ｇＬ複合体を発現するＶＲＰが、類似するバイシストロニック発現カセットから発
現された可溶性複合体（ｇＨｓｏｌ／ｇＬ）よりもわずかに高度な力価で、強力な中和抗
体を引き起こしたことを示す。ｇＨｓｏｌおよびｇＬをコードする遺伝子の順序の変更ま
たはサブゲノムプロモーターのうちの１つのＩＲＥＳもしくはＦＭＤＶ ２Ａ部位との交
換は、実質的に免疫原性を改善しなかった。

ｇＨ／ｇＬを発現するＶＥＥ／ＳＩＮ ＶＲＰにより免疫化したマウス由来の血清にお
けるＨＣＭＶ中和活性の広さおよび効力は、ＨＣＭＶの異なる株による線維芽細胞および
上皮細胞の感染を遮断するために血清を使用することによって評価した。表５は、ｇＨ／
ｇＬ免疫血清が、補体の非存在下における両方の細胞型に対するＨＣＭＶの６つの異なる
株に対して広くかつ強力に中和性であったことを示す。補体の追加は、血清の中和性の効
力に対してわずかな陰性な影響を有した。

ＬＮＰ被包ＲＮＡ（Ａ１６０）およびｇＨ／ｇＬを発現するＶＲＰ（ｐＶＣＲ修飾ｇＨ
−ＳＧＰｇＬ）と比較した、五量体複合体をコードするＬＮＰ被包ＲＮＡ（Ａ５２６およ
びＡ５２７）の免疫原性を評価した。表６は、五量体複合体を発現するレプリコンがｇＨ
／ｇＬを発現するレプリコンよりも強力に中和抗体を引き起こしたことを示す。

中和抗体の最高の力価を引き起こしたペンタシストロニックＶＥＥベースのＲＮＡレプ
リコン（Ａ５２７）は、ＶＲＰとしてパッケージし、ＶＲＰの免疫原性は、ｇＨ／ｇＬ発
現ＶＲＰおよびｇＨ／ｇＬおよび五量体複合体を発現するＬＮＰ被包レプリコンと比較し
た。表７は、五量体複合体を発現するＶＲＰがｇＨ／ｇＬを発現するＶＲＰよりも高度な
力価の中和抗体を引き起こしたことを示す。さらに、ＶＲＰの１０^６感染単位は、ＶＲＰ
およびＲＮＡが同じタンパク質複合体をコードした場合、ＬＮＰ被包ＲＮＡの１μｇと少
なくとも同じくらい強力である。

五量体複合体をコードするＶＥＥベースのＲＮＡ（Ａ５２７）により免疫化したマウス
由来の血清におけるＨＣＭＶ中和活性の広さおよび効力は、ＨＣＭＶの異なる株による線
維芽細胞および上皮細胞の感染を遮断するために血清を使用することによって評価した。
表８は、抗ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１免疫血清が広く強力に上皮
細胞の感染を中和したことを示す。この効果は、補体非依存性であった。対照的に、血清
は、線維芽細胞の感染に対して低下したまたは検出可能でない効果を有した。五量体複合
体が線維芽細胞の感染に必要とされず、その結果として、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およ
びＵＬ１３１に対する抗体が線維芽細胞の感染を遮断しないので、これらの結果は、ｇＨ
／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合体に対して特異的な抗体をほと
んど含有する免疫血清について期待されるものである（Ａｄｌｅｒら（２００６年）、Ｊ
． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ．８７巻（Ｐｔ．９）：２４５１〜６０頁；ＷａｎｇおよびＳ
ｈｅｎｋ（２００５年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １
０２巻（５０号）：１８１５３〜８頁）。したがって、これらのデータは、ｇＨ／ｇＬ／
ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合体をコードする五量体レプリコンがｉｎ
ｖｉｖｏにおいて複合体に対する抗体を特異的に引き起こすことを実証する。

ｇＨ／ｇＬおよび五量体複合体を発現するバイシストロニックおよびペンタシストロニ
ックレプリコンが異なる処方物において中和抗体を引き起こすかどうか確かめるために、
コットンラットは、カチオン性ナノエマルジョン（ＣＮＥ）と混合したバイシストロニッ
クまたはペンタシストロニックレプリコンにより免疫化した。表９は、ＣＮＥにおけるレ
プリコンが、ＬＮＰ中に被包された同じレプリコンと同等の中和抗体力価を引き起こした
ことを示す。

（実施例７）
ＶＺＶタンパク質をコードするレプリコン
ＶＺＶタンパク質をコードする核酸は、ｇＢ、ｇＨ、ｇＬ、ｇＥ、およびｇＩをコード
するモノシストロニックレプリコンを産生するためにおよびｇＨ／ｇＬまたはｇＥ／ｇＩ
をコードするバイシストロニックレプリコンを産生するために、ＶＥＥレプリコンベクタ
ーの中にクローニングした。バイシストロニックレプリコンにおいて、それぞれのＶＺＶ
オープンリーディングフレームの発現は、別々のサブゲノムプロモーターによって駆動さ
れた。

レプリコンＲＮＡを調製するために、レプリコンをコードするプラスミドは、ＰｍｅＩ
による消化によって直線化し、直線化されたプラスミドは、フェノール／クロロホルム／
イソアミルアルコール（ｉｓｏａｍｙｌａｌｃｈｏｈｏｌ）により抽出し、酢酸ナトリウ
ム／エタノール中に沈殿させ、２０μｌのＲＮアーゼを含まない水において再懸濁した。

ＲＮＡは、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ Ｔ７キット（ＡＭＢＩＯＮ＃ ＡＭ１３３３）を使
用して、直線化されたＤＮＡの１μｇのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける転写によって調製した
。２０μｌ反応は、キャップアナログを用いないで製造者の説明書に従って設定し、３２
℃で２時間インキュベートした。ＴＵＲＢＯ ＤＮアーゼ（１μｌ）を追加し、混合物を
３２℃で３０分間インキュベートした。ＲＮアーゼを含まない水（３０μｌ）および酢酸
アンモニウム溶液（３０μｌ）を追加した。溶液は混合し、−２０℃で少なくとも３０分
間冷やした。その後、溶液は、４℃で２５分間、最高速度で遠心分離した。上清を廃棄し
、ペレットは７０％エタノールによりすすぎ、４℃で１０分間、最高速度で再び遠心分離
した。ペレットは風乾し、５０μｌのＲＮアーゼを含まない水中に再懸濁した。ＲＮＡの
濃度を測定し、品質は、変性ゲル上でチェックした。

ＲＮＡは、ＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｍ７Ｇ Ｃａｐｐｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｐｉｃｅ
ｎｔｒｅ ＃ＳＣＣＥ０６２５）を使用してキャップした。反応は、ＲＮＡおよびＲＮア
ーゼを含まない水を組み合わせることによって調整した。その後、ＲＮＡは、６５℃で５
〜１０分間変性させた。変性したＲＮＡは、氷に素速く移し、次の試薬を次の順序で追加
した：ＳｃｒｉｐｔＣａｐ Ｃａｐｐｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ、１０ｍＭ ＧＴＰ、新たに
調製した２ｍＭ ＳＡＭ、ＳｃｒｉｐｔＧｕａｒｄ ＲＮアーゼ阻害剤、およびＳｃｒｉ
ｐｔＣａｐ Ｃａｐｐｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ。混合物は、３７℃で６０分間インキュベー
トした。反応は、ＲＮアーゼを含まない水および７．５Ｍ ＬｉＣｌを追加し、よく混合
し、−２０℃で少なくとも３０分間、混合物を保存することによって停止させた。その後
、混合物は、４℃で２５分間、最高速度で遠心分離し、ペレットは、７０％エタノールに
よりすすぎ、４℃で１０分間、最高速度で再び遠心分離した。ペレットは風乾させた。ペ
レットは、ＲＮアーゼを含まない水中に再懸濁した。ＲＮＡの濃度を測定し、品質は、変
性ゲル上でチェックした。

ＲＮＡトランスフェクション
細胞（ＢＨＫ−Ｖ細胞）は、６ウェルプレート上にまき、トランスフェクションの時に
９０〜９５％コンフルエンスに至った。それぞれのトランスフェクションのために、３μ
ｇのＲＮＡを第１のチューブにおいて５０ｍＬ ＯＰＴＩＭＥＭ培地において希釈した。
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を、５０ｍＬ ＯＰＴＩＭＥＭ培地を含有する第
２のチューブに追加した。第１および第２のチューブを組み合わせ、室温で２０分間維持
した。６ウェルプレート中の培養培地を、新たな培地と交換し、ＲＮＡ−Ｌｉｐｏｆｅｃ
ｔａｍｉｎｅ複合体を細胞上に配置し、プレートを穏やかに揺り動かすことによって混合
した。プレートは、ＣＯ_２インキュベーターにおいて３７℃で２４時間インキュベートし
た。

トランスフェクトした細胞におけるＶＺＶタンパク質の発現は、ウエスタンブロットお
よび免疫蛍光法によって評価した。ウエスタンブロットのために、トランスフェクト細胞
の溶解産物は、電気泳動（５μｇ総タンパク質／レーン）によって分離し、ブロットした
。ＯＫＡ／Ｍｅｒｃｋワクチン株に由来する、透明なウイルス懸濁液（７μｇ総タンパク
質／レーン）を、陽性対照として使用した。ブロットは、ＶＺＶタンパク質に結合する市
販で入手可能な抗体（１：１０００希釈）を使用してプローブした。

免疫蛍光法のために、トランスフェクトした細胞を、収集し、９６ウェルプレート中に
まき、細胞内染色は、市販で入手可能なマウスｍＡｂ（希釈範囲１：１００ １：４００
）を使用して実行した。細胞ペレットを固定し、Ｃｉｔｏｆｉｘ−Ｃｉｔｏｐｅｒｍ溶液
により透過処理した。二次試薬、Ａｌｅｘａ４８８標識ヤギ抗マウスＦ（ａｂ’）_２（１
：４００最終希釈）を使用した。

ＶＺＶタンパク質ｇＥおよびｇＩの発現は、モノシストロニック構築物（ｇＥまたはｇ
Ｉ）によりトランスフェクトした細胞において検出され、ｇＥおよびｇＩの両方の発現は
、市販で入手可能なマウス抗体、ｇＥについては１３Ｂ１およびｇＩについては８Ｃ４を
使用して、ウエスタンブロットにおいてバイシストロニックｇＥ／ｇＩ構築物によりトラ
ンスフェクトした細胞において検出された。ＶＺＶタンパク質ｇＢの発現は、市販で入手
可能な抗体１０Ｇ６を使用して、免疫蛍光法によって、ｇＢをコードするモノシストロニ
ック構築物によりトランスフェクトした細胞において検出された。ＶＺＶタンパク質複合
体ｇＨ／ｇＬの発現は、モノシストロニックｇＨおよびモノシストロニックｇＬによりま
たはバイシストロニックｇＨ／ｇＬ構築物によりトランスフェクトされた細胞において免
疫蛍光法によって検出された。ｇＨ／ｇＬ複合体は、市販で入手可能な抗体ＳＧ３を使用
して検出された。

マウス免疫原性研究
６〜８週齢で体重が約２０ｇである８匹の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスの群を、０日目、２
１日目、および４２日目に、ＣＮＥまたはＬＮＰ（ＲＶ０１）と共に処方した７．０また
は１．０μｇのレプリコンＲＮＡにより筋肉内で免疫化した。血液試料は、２回目の免疫
化の３週間後および３回目の免疫化の３週間後に、免疫化した動物から取った。群を表１
０に示す。

ＶＺＶ抗原に対する免疫応答
血清試料は、ＶＺＶレプリコンでトランスフェクトしたＭＲＣ−５細胞の細胞内染色に
よってｇＢに対する抗体の存在について試験した。ＭＲＣ−５細胞は、１０％ウシ胎仔血
清を有するＤｕｌｂｅｃｃｏ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍにおい
て維持した。ＶＺＶ Ｏｋａ株接種材料（ＡＴＣＣから得た）は、ＭＲＣ−５細胞培養物
を感染させるために使用し、感染した細胞全体は、ウイルスの二次継代（ｓｕｂｐａｓｓ
ａｇｅ）のために使用した。感染した細胞および感染しなかった細胞の間の比は、１：１
０であった。感染後３０時間の細胞は、免疫化後に得られたマウス血清（希釈範囲１：２
００〜１：８００）のプールによる細胞内染色を実行するために、９６ウェルプレート中
にまくためにトリプシンにより分散させた。市販のｍＡｂは、感染レベルを定量化するた
めに対照として使用した。細胞ペレットを固定し、Ｃｉｔｏｆｉｘ−Ｃｉｔｏｐｅｒｍ溶
液により透過処理した。二次試薬、Ａｌｅｘａ４８８標識ヤギ抗マウスＦ（ａｂ’）_２を
使用した（１：４００最終希釈）。

ｇＢ（１０Ｇ６）、ｇＨ（ＳＧ３）、ならびにｇＥ（１３Ｂ１（ＳＢＡ）および８６１
２（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））に対する市販の抗体は、陽性対照として使用し、それぞれ、
感染したＭＲＣ−５細胞を細胞内染色した。ＣＮＥまたはＬＮＰと共に処方した１または
７μｇのＲＮＡによる３回目の免疫化の３週間後に得られた免疫血清は、１／２００、１
／４００、および１／８００に希釈し、感染したＭＲＣ−５細胞を細胞内染色するために
使用した。結果は、図２１（研究１、群１、５、７、９、１１、１３、および１５、ＣＮ
Ｅ処方物）ならびに図２２（研究２、群１〜７、ＬＮＰ処方物）に示す。

中和アッセイ
免疫化マウス血清はそれぞれ、標準的な培地において１：２０から出発して、２倍の増
分ずつ連続的に希釈し、モルモット補体の存在下において等しい容積のＶＺＶ懸濁液に追
加した。３７℃での１時間のインキュベーション後に、ヒト上皮細胞株Ａ５４９を追加し
た。感染細胞は、顕微鏡下で培養物中に形成されたプラークを数えることによって培養の
１週間後に測定することができる。プラーク数から、それぞれの血清希釈での阻害％を計
算した。それぞれの血清試料のチャートは、希釈係数である対数目盛に対する阻害％の値
をプロットすることによって作製した。続いて、希釈係数および阻害％の間の関係につい
ての近似の線（approximateline）を引いた。その後、５０％の中和力価を、線が５０％
の阻害の値で交差する希釈係数として決定した。

表１１は、モノシストロニックｇＥ、バイシストロニックｇＥ／ｇＩ、およびバイシス
トロニックｇＨ／ｇＬにより免疫化したマウスから得られた血清が頑健な中和抗体力価を
含有したことを示す。

Claims (1)

1. 図面に記載された発明。