BRPI0616687A2 - compostos de pirimidinil amida que inibem a adesão leucocitária mediada por vla-4 - Google Patents

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BRPI0616687A2
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carbonyloxy
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BRPI0616687-3A
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Christopher Michael Semko
Frank Stappenbeck
Jenifer Lea Smith
Kassandra Inez Rossiter
Juri Y Fukuda
Ying-Zi Xu
Andrei W Konradi
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Elan Pharm Inc
Wyeth Corp
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Abstract

COMPOSTOS DE PIRIMIDINIL AMIDA QUE INIBEM A ADESãO LEUCOCITáRIA MEDIADA POR VLA-4 SãO REVELADOS compostos que se ligam à VLA-4. alguns desses compostos também inibem a adesão leucocitária e, em particular, a adesão leucocitária mediada por VLA-4. Tais compostos são úteis no tratamento de doenças inflamatórias em um indivíduo humano ou animal, por exemplo, asma, doença de Alzheimer, aterosclerose, demência por AIDS, diabetes, doença inflamatória do intestino, artrite reumatóide, transplante de tecidos, metástase tumoral e isquemia miocárdica. Os compostos também podem ser administrados para o tratamento de doenças cerebrais inflamatórias como, por exemplo, esclerose múltipla (Fórmula I).

Description

COMPOSTOS DE PIRIMIDINIL AMIDA QUE INIBEM A ADESAOLEUCOCITÃRIA MEDIADA POR VLA-4
REFERÊNCIA CRUZADA COM PEDIDO RELACIONADO
Este pedido reivindica os benefícios sob 35 U.S.C.119 (e) para o pedido U.S. provisório co-pendente N0 deSérie 60/722.358, depositado em 29 de setembro de 2005, queé aqui incorporado por referência em sua totalidade.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
Campo da invenção
Esta invenção está relacionada aos compostos queinibem a adesão leucocitária e, em particular, a adesãoleucocitária mediada por integrinas α4, em que a integrinaa4 é, de preferência, VLA-4. Esta invenção também estárelacionada às composições farmacêuticas que compreendemesses compostos, além de métodos para o tratamento, porexemplo, de inflamação, com o uso de um dos compostos oudas composições farmacêuticas desta invenção.
Referências
As publicações a seguir são citadas neste pedido comonúmeros sobrescritos:
1 Hemler e Takada, Publicação de Patente EuropéiaN0 330.506, publicada em 30 de agosto de 1989
2 Elices, e cola., Cell, 60: 577-584 (1990)
3 Springer, Nature, 346: 425-434 (1990)
4 Osborn, Cell, 62: 3-6 (1990)
5 Vedder, e cols., Surgery, 106: 509 (1989)
6 Pretolani, e cols., J. Exp. Med., 180: 795 (1994)
7 Abraham, e cols., J. Clin. Invest., 93: 776
8 Mulligan, e cols., J. Immunology, 150: 2.407 (1994)(1993)
9 Cybulsky, e cols., Science, 251: 788 (1991)
10 Li, e cols., Arterioscler. Thromb., 13: 197(1993)
11 Sasseville, e cols., Am. J. Path., 144: 27 (1994)
12 Yang, e cols., Proc. Nat. Acad. Science (USA),90: 10.494 (1993)
13 Burkly, e cols., Diabetes, 43: 529 (1994)
14 Baron, e cols., J. Clin. Invest., 93: 1.700(1994)
15 Hamann, e cols., J. Immunology, 152: 3.238 (1994)
16 Yednock, e cols., Nature, 356: 63 (1992)
17 Baron, e cols., J. Exp. Med., 177: 57 (1993)
18 van Dinther-Janssen, e cols., J. Immunology, 147:4.207 (1991)
19 van Dinther-Janssen, e cols., Annals. RheumaticDis., 52: 672 (1993)
20 Elices, e cols., J. Clin. Invest., 93: 405 (1994)
21 Postigo, e cols., J. Clin. Invest., 89: 1.445(1991)
22 Paul, e cols., Transpl. Proceed., 25:813 (1993)
23 Okarhara, e cols., Can. Res., 54: 3.233 (1994)
24 Paavonen, e cols., Int. J. Can., 58: 298 (1994)
25 Schadendorf, e cols., J. Path., 170: 429 (1993)
26 Bao, e cols., Diff., 52: 239 (1993)
27 Lauri, e cols., British J. Câncer, 68: 862 (1993)
28 Kawaguchi, e cols., Japanese J. Câncer Res., 83:1.304 (1992)
29 Konradi, e cols., PCT/US00/01686, depositado em21 de janeiro de 2000Todas as publicações acima são aqui incorporadas porreferência em sua totalidade, na mesma extensão como secada publicação individual fosse específica eindividualmente indicada para ser incorporada porreferência em sua totalidade.
Técnica estabelecida
VLA-4 (também denominada integrina α4β1 e CD49d/CD29),identificada inicialmente por Hemler e Takada,1 é um membroda família de integrina βΐ de receptores da superfíciecelular, cada um dos quais compreende duas subunidades, umacadeia α e uma cadeia β. VLA-4 contém uma cadeia a4 e umacadeia βΐ. Há pelo menos nove integrinas βΐ, todascompartilhando a mesma cadeia βΐ e cada uma tendo umacadeia α distinta. Todos esses nove receptores se ligam aum complemento diferente das várias moléculas da matrizcelular, por exemplo, fibronectina, laminina e colãgeno.VLA-4, por exemplo, ,se liga à fibronectina. VLA-4 também seliga às moléculas que não são da matriz que são expressaspor células endoteliais e outras células. Essas moléculasque não são da matriz incluem VCAM-1, que é expressa emcélulas endoteliais da veia umbilical humana ativadas porcitocina, em cultura. Epitopos distintos de VLA-4 sãoresponsáveis pelas fibronectina e atividades de ligação deVCAM-1, e foi demonstrado que cada atividade era inibidaindependentemente.2
A adesão intercelular mediada por VLA-4 e por outrosreceptores da superfície celular está associada a diversasrespostas inflamatórias. No local de uma lesão ou de outroestímulo inflamatório, células endoteliais vascularesativadas expressam moléculas que são adesivas paraleucócitos. A mecânica da adesão leucocitária às célulasendoteliais envolve, em parte, o reconhecimento e a ligaçãode receptores da superfície celular em leucócitos àsmoléculas da superfície celular correspondentes em célulasendoteliais. Uma vez ligados, os leucócitos migram atravésda parede do vaso sangüíneo para entrar no local lesado eliberar mediadores químicos para combater a infecção. Pararevisões sobre receptores de adesão do sistema imunológico,veja, por exemplo, Springer3 e Osborn.4
Distúrbios cerebrais inflamatórios como, por exemplo,encefalomielite autoimune experimental (EAE), esclerosemúltipla (EM) e meningite, são exemplos de distúrbios dosistema nervoso central nos quais o mecanismo de adesãoendotélio/leucócito causa a destruição de tecido cerebralaté então saudável. Grandes números de leucócitos migramatravés da barreira hematencefálica (BHC) em indivíduos comessas doenças inflamatórias. Os leucócitos liberammediadores tóxicos que causam dano tecidual extenso queproduzem prejuízo à condução nervosa e paralisia.
Em outros sistemas orgânicos, o dano tecidual tambémocorre através de um mecanismo de adesão que causa amigração ou ativação de leucócitos. Por exemplo, foidemonstrado que a agressão inicial após isquemia miocárdicaao tecido cardíaco pode ser ainda mais agravada pelaentrada de leucócitos no tecido danificado, causando aindamais agressão (Vedder, e cols.).5 Outras condiçõesinflamatórias ou médicas mediadas por um mecanismo deadesão incluem, por exemplo, asma,6"8 doença de Alzheimer,aterosclerose,9"10 demência por AIDS,11 diabetes 12~14(incluindo diabetes agudo de surgimento juvenil), doençainflamatória do intestino (incluindo colite ulcerativa edoença de Crohn), esclerose múltipla,16"17 artritereumatóide,18-21 transplante de tecidos,22 metástasetumoral, 23-28 meningite, encefalite, acidente vascularcerebral e outros traumas cerebrais, nefrite, retinite,dermatite atópica, psoríase, isquemia miocárdica e lesãopulmonar aguda mediada por leucócitos, como a que ocorre nasindrome de sofrimento respiratório do adulto.
Aminopirimidinas substituídas, como uma classe, foramdescobertas como inibidoras de ligação de VLA-4 ao VCAM-Ie, conseqüentemente, exibem propriedadesantiinflamatórias.29 Embora esses compostos possuampropriedades antagonistas para tal ligação, abiodisponibilidade aumentada desses compostos aumentariasua eficácia.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Esta invenção fornece compostos, saisfarmaceuticamente aceitáveis destes, composições destes, assínteses destes, e métodos para o tratamento de doençasmediadas por VLA-4.
Em uma modalidade,compostos de fórmula I:
<formula>formula see original document page 6</formula>
em que: 1
R1 é selecionado do grupo que consiste em C1 a C4alquil, C1 a C4 haloalquil, heteroaril e N(R5) (R6) , em queR5 e R6 são selecionados independentemente do grupo queconsiste em hidrogênio, C1 a C4 alquil, ou R5 e R6, juntoscom o nitrogênio a eles pendente, se unem para formar umanel heterocíclico;
R2 é selecionado do grupo que consiste em C1 a C4alquil, C2 a C4 alquenil e C2 a C4 alquinil; e
R3 e R4 são independentemente C1 a C3 alquil, ou R3 eR4, juntos com o átomo de nitrogênio a eles pendente, seunem para formar um anel heterocíclico;
ou um sal, éster ou pró-fármaco farmaceuticamenteaceitável destes.
Em outra modalidade, a presente invenção fornece umcomposto de fórmula II:
<formula>formula see original document page 7</formula>
em que:
R7 é C1 a C4 alquil, C1 a C4 haloalquil ou heteroaril;
R8 é C1 a C4 alquil;
R9 e R10 são independentemente C1 a C3 alquil, ou R9 eR10, juntos com o átomo de nitrogênio a eles pendente, seunem para formar um anel heterocíclico;
ou um sal, éster ou pró-fármaco farmaceuticamenteaceitável destes.
Em outra modalidade, a presente invenção fornececompostos de fórmula III:
<formula>formula see original document page 7</formula>em que:
R11 e R12 são independentemente Ci a C4 alquil, ou R11 eR12, juntos com o átomo de nitrogênio a eles pendente, seunem para formar um anel heterocíclico;
R13 é Ci a C4 alquil; eR14 e Ris são independentemente Ci a C3 alquil, ou R14 eR15, juntos com o átomo de nitrogênio a eles pendente, seunem para formar um anel heterocíclico;
ou um sal, éster ou pró-fármaco farmaceuticamenteaceitável destes.
A presente invenção também fornece os compostos naTabela 4.Tabela 4
<table>table see original document page 8</column></row><table><table>table see original document page 9</column></row><table><table>table see original document page 10</column></row><table><table>table see original document page 11</column></row><table>
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Como citado anteriormente, esta invenção estárelacionada a compostos que inibem a adesão leucocitária e,em particular, a adesão leucocitária mediada, pelo menos emparte, por integrinas α4, preferivelmente VLA-4. Noentanto, antes de descrever esta invenção com maisdetalhes, inicialmente serão definidos os seguintes termos.
Definições
A menos que especificado de forma diferente, osseguintes termos usados na especificação e nasreivindicações possuem os significados apresentados abaixo:Como aqui usado, e a menos que definido de formadiferente, "alquil" refere-se a grupos alquil lineares,ramificados e cíclicos que preferivelmente possuem de 1 a 4átomos de carbono e, mais pref erivelmente, 1 a 3 átomos decarbono. Esse termo é exemplificado por grupos como metil,etil, n-propil, iso-propil, n-butil, iso-butil, sec-butil,t-butil, ciclopropil, ciclobutil e metileno-ciclopropil.
"Alquenil" refere-se a um grupo alquenil linear eramificado que possui de 2 a 4 átomos de carbono e,preferivelmente, 2 a 3 átomos de carbono, e que possui pelomenos 1 e, preferivelmente, 1 sítio de insaturação dealquenil. Exemplos de tais grupos alquenil incluem vinil (-CH=CH2), alil (-CH2CH=CH2), n-propen-l-il (-CH=CHCH3), n-buten-2-il (CH2CH=CHCH3), e semelhantes. Estão incluídosdentro desse termo os isômeros eis e trans ou misturasdesses isômeros.
"Alquinil" refere-se a um grupo alquinil linear eramificado que possui de 2 a 4 átomos de carbono e,preferivelmente, 2 a 3 átomos de carbono, e que possui pelomenos 1 e, preferivelmente, 1 sítio de insaturação dealquinil. Exemplos desses grupos alquinil incluemacetilenil (C=CH), propargil (-CH2C-CH), n-propin-l-il (-CH-CHCH3), e semelhantes.
"Aril" ou "Ar" refere-se a um grupo carbocíclicoaromático monovalente de 6 a 14 átomos de carbono, quepossui um anel único (por exemplo, fenil) ou múltiplosanéis condensados (por exemplo, naftil ou antril), cujosanéis condensados podem ser ou não aromáticos (por exemplo,2-benzoxazolinona, 2H-1,4-benzoxazin-3(4H)-ona-7-il, esemelhantes) , desde que o ponto de adesão esteja em umátomo de carbono aromático. Aris preferidos incluem fenil enaftil.
"Aril substituído" refere-se a grupos aril que sãosubstituídos com de 1 a 3 substituintes e, preferivelmente,1 a 2 substituintes, selecionados do grupo que consiste emhidroxil, acil, acilamino, acilóxi, alquil, alquilsubstituído, alcóxi, alcóxi substituído, alquenil, alquenilsubstituído, alquinil, alquinil substituído, amino, aminosubstituído, aminoacil, aril, aril substituído, arilóxi,arilóxi substituído, carboxil, ésteres carboxílicos, ciano,tiol, tioalquil, tioalquil substituído, tioaril, tioarilsubstituído, tioheteroaril, tioheteroaril substituído,tiocicloalquil, tiocicloalquil substituído,tioheterocíclico, tioheterocíclico substituído,cicloalquil, cicloalquil substituído, halo, nitro,heteroaril, heteroaril substituído, heterocíclico,heterocíclico substituído, heteroariloxi, heteroariloxisubstituído, heterocicliloxi, heterocicliloxi substituído,amino sulfonil (NH2-SO2-), e amino sulfonil substituído.
"Halo" ou "halogênio" refere-se a flúor, cloro, bromoe iodo e, preferivelmente, é flúor ou cloro.
"Haloalquil" refere-se aos grupos alquil que possuemde 1 a 5 grupos halo. De preferência, esses grupos possuemde 1 a 3 grupos halo e 1 a 2 átomos de carbono. Gruposhaloalquil particularmente preferidos incluem trihalometil(por exemplo, trifluormetil) e trihaloetil (por exemplo,2,2,2-trifluoret-1-il).
"Heteroaril" refere-se a um grupo carbocíclicoaromático de 2 a 10 átomos de carbono e 1 a 4 heteroátomosselecionados de oxigênio, nitrogênio e enxofre dentro doanel. Esses grupos heteroaril podem ter um anel único (porexemplo, piridil ou furil) ou múltiplos anéis condensados,em que o anel condensado pode ser aril ou heteroaril.
Exemplos desses heteroaris incluem, por exemplo, furan-2-il, furan-3-il, tien-2-il, tien-3-il, pirrol-2-il, pirrol-3-il, piridil (2-, 3- e 4-piridis), e semelhantes. Em umamodalidade, os átomos de enxofre e/ou nitrogênio doheteroaril são opcionalmente oxidados (ou seja, -S(O)- ou -S(O)2- e/ou N-óxidos).
"Heterociclo" ou "heterocíclico" refere-se a um gruponão-heteroaromático saturado ou insaturado que possui umanel único ou múltiplos anéis condensados, de 1 a 10 átomosde carbono e de 1 a 4 heteroátomos selecionados denitrogênio, enxofre ou oxigênio dentro do anel, em que, emsistemas de anéis fundidos, um ou mais dos anéis podem seraril ou heteroaril. Em uma modalidade, os átomos de enxofree/ou nitrogênio do heterociclo são opcionalmente oxidados(ou seja, -S(O)- ou -S(O)2- e/ou N-óxidos).
"Veículo farmaceuticamente aceitável" significa umveículo que é útil na preparação de uma composiçãofarmacêutica que seja geralmente segura, atóxica e não sejabiologicamente ou de algum outro modo indesejável, e incluium veículo que seja aceitável para uso veterinário, bemcomo para uso farmacêutico humano. Um "veículofarmaceuticamente aceitável", como usado na especificação enas reivindicações, inclui um ou mais desses veículos.
"Pró-fármaco" refere-se a qualquer derivadofarmaceuticamente aceitável de um composto desta invençãoque seja capaz, direta ou indiretamente, de fornecer umcomposto desta invenção ou um metabólito ativo, ou resíduodeste, quando administrado a um indivíduo. Derivados e pró-fármacos particularmente preferidos são aqueles queaumentam a biodisponibilidade dos compostos desta invençãoquando esses compostos são administrados a um indivíduo(por exemplo, permitindo que um composto administradooralmente seja mais facilmente absorvido na correntesangüínea) ou que aumente a liberação do composto originala um compartimento biológico (por exemplo, o cérebro ou osistema linfático) em relação à espécie original. Pró-fármacos incluem as formas de éster dos compostos dainvenção. Exemplos de pró-fármacos de éster incluemderivados de formato, acetato, propionato, butirato,acrilato e etilsuccinato. Uma visão geral de pró-fármacos éfornecida em T. Higuchi e V. Stella, "Pro-drugs as NovelDelivery Systems", Vol. 14 da "A.C.S. Symposium Series", eem Edward B. Roche, ed. , "Bioreversible Carriers in DrugDesign", "American Pharmaceutical Association and PergamonPress", 1987, ambos aqui incorporados por referência.
"Sal farmaceuticamente aceitável" refere-se aos saisque retêm a eficácia e as propriedades biológicas doscompostos desta invenção, e que não são biologicamente oude algum outro modo indesejáveis. Em muitos casos, oscompostos desta invenção são capazes de formar sais deácidos e/ou de bases em virtude da presença de grupos aminoe/ou carboxil ou grupos similares a esses.
Sais de adição de bases farmaceuticamente aceitáveispodem ser preparados a partir de bases inorgânicas eorgânicas. Sais derivados de bases inorgânicas incluem,apenas como exemplo, sais de sódio, potássio, litio,amônio, cálcio e magnésio. Sais derivados de basesorgânicas incluem, sem limitação, sais de aminas primárias,secundárias e terciárias, tais como alquil aminas, dialquilaminas, trialquil aminas, alquil aminas substituídas,di(alquil substituído) aminas, tri(alquil substituído)aminas, alquenil aminas, dialquenil aminas, trialquenilaminas, alquenil aminas substituídas, di(alquenilsubstituído) aminas, tri(alquenil substituído) aminas,cicloalquil aminas, di(cicloalquil) aminas,tri(cicloalquil) aminas, cicloalquil aminas substituídas,cicloalquil aminas dissubstituídas, cicloalquil aminastrissubstituídas, cicloalquenil aminas, di(cicloalquenil)aminas, tri(cicloalquenil) aminas, cicloalquenil aminassubstituídas, cicloalquenil aminas dissubstituídas,cicloalquenil aminas trissubstituídas, aril aminas, diarilaminas, triaril aminas, heteroaril aminas, diheteroarilaminas, triheteroaril aminas, aminas heterocíclicas, aminasdiheterocíclicas, aminas triheterocíclicas, di- e tri-aminas mistas nas quais pelo menos dois dos substituintesna amina são diferentes, e são selecionados do grupo queconsiste em alquil, alquil substituído, alquenil, alquenilsubstituído, cicloalquil, cicloalquil substituído,cicloalquenil, cicloalquenil substituído, aril, heteroaril,heterocíclico, e semelhantes. Também estão incluídas aminasnas quais dois ou três substituintes, juntos com onitrogênio de amino, formam um grupo heterocíclico ouheteroaril.
Exemplos de aminas adequadas incluem, apenas comoexemplo, isopropilamina, trimetil amina, dietil amina,tri(iso-propil) amina, tri(n-propil) amina, etanolamina, 2-dimetilaminoetanol, trometamina, lisina, arginina,histidina, cafeína, procaína, hidrabamina, colina, betaína,etilenodiamina, glicosamina, N-alquilglucaminas,teobromina, purinas, piperazina, piperidina, morfolino,N-etilpiperidina, e semelhantes. Deve-se entender tambémque outros derivados do ácido carboxílico seriam úteis naprática desta invenção, por exemplo, amidas de ácidocarboxílico, incluindo carboxamidas, carboxamidas de alquilinferior, dialquil carboxamidas, e semelhantes.
Sais de adição de ácidos farmaceuticamente aceitáveispodem ser preparados a partir de ácidos inorgânicos eorgânicos. Sais derivados de ácidos inorgânicos incluemácido clorídrico, ácido hidrobrômico, ácido sulfúrico,ácido nítrico, ácido fosfórico, e semelhantes. Saisderivados de ácidos orgânicos incluem ácido acético, ácidopropiônico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico,ácido málico, ácido malônico, ácido succínico, ácidomaléico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico,ácido benzóico, ácido cinâmico, ácido mandélico, ácidometanossulfônico, ácido etanossulfônico, ácido p-tolueno-sulfônico, ácido salicílico, e semelhantes.
O termo "cátion farmaceuticamente aceitável" refere-seao cátion de um sal farmaceuticamente aceitável.
Entende-se que, em todos os grupos substituídos aquidefinidos, polímeros produzidos pela definição desubstituintes com substituintes adicionais para elespróprios (por exemplo, aril substituído que possui um grupoaril substituído como substituinte, o qual, ele próprio, ésubstituído com um grupo aril substituído etc.) não sãoaqui incluídos. Nesses casos, o número máximo dessessubstituintes é de três. Isso eqüivale a dizer que cada umadas definições acima é restrita por uma limitação de que,por exemplo, grupos aril substituídos se limitam a -arilsubstituído-(aril substituído)-(aril substituído)."Tratar" ou "tratamento" de uma doença inclui:(1) a prevenção da doença, ou seja, fazer com que ossintomas clínicos da doença não se desenvolvam em ummamífero que pode estar exposto ou predisposto à doença,mas que ainda não apresenta ou exibe os sintomas da doença,
(2) a inibição da doença, ou seja, interromper oureduzir o desenvolvimento da doença ou de seus sintomasclínicos, ou
(3) o alívio da doença, ou seja, causar a regressão dadoença ou de seus sintomas clínicos.
Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" significa aquantidade de um composto que, quando administrada a ummamífero para o tratamento de uma doença, é suficiente paraefetuar tal tratamento para a doença. A "quantidadeterapeuticamente eficaz" irá variar, dependendo docomposto, da doença e de sua gravidade, e da idade, pesoetc., do mamífero a ser tratado.
"Sal farmaceuticamente aceitável" refere-se aos saisfarmaceuticamente aceitáveis de um composto de fórmula Icujos sais são derivados de diversos contra-íons orgânicose inorgânicos bem conhecidos na técnica, e incluem, apenascomo exemplo, sódio, potássio, cálcio, magnésio, amônio,tetraalquilamônio, e semelhantes; e, quando a moléculacontém uma funcionalidade básica, sais de ácidos orgânicosou inorgânicos, tais como cloridrato, hidrobrometo,tartarato, mesilato, acetato, maleato, oxalato esemelhantes.
As integrinas são uma grande família de proteínashomólogas de ligação transmembrana que são os receptoresprincipais em células animais para ligação da maioria dasproteínas da matriz extracelular como, por exemplo,colágeno, fibronectina e laminina. As integrinas sãoheterodímeros compostos por uma cadeia α e uma cadeia β.Até hoje, vinte heterodímeros de integrina diferentes,feitos de 9 subunidades α diferentes e 14 subunidades βdiferentes, foram identificados. 0 termo "integrinas α 4"refere-se à classe de receptores da superfície celular deheterodímeros, ligados à enzima, que contêm a subunidade α4 pareada com qualquer uma das subunidades β. VLA-4 é umexemplo de uma integrina α 4, e é um heterodímero dassubunidades α 4 e βΐ, e é também denominada integrina α 4Esta invenção fornece compostos, saisfarmaceuticamente aceitáveis destes, composições destes, assínteses destes, e métodos para o tratamento de doençasmediadas por VLA-4.
Em uma modalidade, a presente invenção fornececompostos de fórmula I:
<formula>formula see original document page 19</formula>
em que:
R1 é selecionado do · grupo que consiste em Ci a C4alquil, C1 a C4 haloalquil, heteroaril e -N(R5)(Re), em queR5 e R6 são selecionados independentemente do grupo queconsiste em hidrogênio, C1 a C4 alquil, ou R5 e R6, juntoscom o nitrogênio a eles pendente, se unem para formar umanel heterocíclico;
R2 é selecionado do grupo que consiste em C1 a C4alquil, C2 a C4 alquenil, e C2 a C4 alquinil; e
R3 e R4 são independentemente C1 a C3 alquil, ou R3, R4,juntos com o átomo de nitrogênio a eles pendente, se unempara formar um anel heteroclclico;
ou um sal, éster ou pró-fármaco farmaceuticamenteaceitável destes.
Em algumas modalidades, o grupo -OC(O)NR3R4 está naposição para do anel fenila.
Em algumas modalidades, R3 e R4 são unidos para formarum anel heterocíclico. Em outras modalidades, R3 e R4 sãounidos para formar um anel pirrolidinil.
Em algumas modalidades, R2 é C1 a C4 alquil. Em outrasmodalidades, R2 é etil.
Ainda em outras modalidades, R3 e R4 são unidos paraformar um anel heterocíclico, e R2 é C1 a C4 alquil. Aindaem outras modalidades, R3 e R4 são unidos para formar umanel pirrolidinil, e R2 é etil.
Exemplos de compostos desta invenção incluem aquelesque possuem os grupos R1i R2, R3 e R4 citados na Tabela 1.
Tabela 1
<table>table see original document page 20</column></row><table><table>table see original document page 21</column></row><table>
Em outra modalidade, a presente invenção fornece umR7 é C1 a C4 alquil, C1 a C4 haloalquil ou heteroaril;
R8 é C1 a C4 alquil;
R9 e R10 são independentemente C1 a C3 alquil, ou R9,R10, juntos com o átomo de nitrogênio a eles pendente, seunem para formar um anel heterocíclico;ou um sal, éster ou pró-fármaco farmaceuticamenteaceitável destes.
Em algumas modalidades, o grupo -OC(O)NR9R10 está naposição para do anel fenila.
Em algumas modalidades, R9 e R10 são unidos para formarum anel heterociclico. Em outras modalidades, R9 e R10 sãounidos para formar um anel pirrolidinil.
Em algumas modalidades, R8 é Ci a C4 alquil. Em outrasmodalidades, R8 é etil.
Em algumas modalidades, R7 é C1 a C4 alquil. Em outrasmodalidades, R7 é selecionado do grupo que consiste emisopropil e t-butil.
Em algumas modalidades, R7 é Ci a C4 haloalquil. Emoutras modalidades R7 é trifluormetil.
Em algumas modalidades, R7 é heteroaril. Em outrasmodalidades, R7 é selecionado do grupo que consiste emfuran-2-il, furan-3-il, tien-2-il e tien-3-il.
Em algumas modalidades, R9 e-R10 são unidos para formarum anel heterociclico, R8 é Ci a C4 alquil, e R7 éheteroaril. Em outras modalidades, R9 e R10, juntos com onitrogênio pendente, formam um anel pirrolidina, R8 é etil,e R7 é heteroaril.
Em algumas modalidades, R9 e R10 são unidos para formarum anel heterociclico, R8 é Ci a C4 alquil, e R7 é alquil.Em outras modalidades, R9 e R10, juntos com o nitrogêniopendente, formam um anel pirrolidina, R8 é etil, e R7 éalquil.
A presente invenção ainda fornece os compostos deFórmula II que possuem os grupos R7, R8, R9 e R10 citados na
Tabela 2.Tabela 2
<table>table see original document page 23</column></row><table>
Em outra modalidade, a presente invenção fornece
<formula>formula see original document page 23</formula>em que:
R11 e R12 são independentemente Cx a C4 alquil, ou R11 eR12, juntos com o átomo de nitrogênio a eles pendente, seunem para formar um anel heterocíclico;
R13 é C1 a C4 alquil; eR14 e R15 são independentemente Ci a C3 alquil, ou R14 eR15, juntos com o átomo de nitrogênio a eles pendente, seunem para formar um anel heterocíclico;
ou um sal, éster ou pró-fármaco farmaceuticamenteaceitável destes.
Em algumas modalidades, o grupo -OC (O) NR14R15 está naposição para do anel fenila.
Em algumas modalidades, R14 e R15 são unidos paraformar um anel heterocíclico. Em outras modalidades, R14 eR15 são unidos para formar um anel pirrolidinil.
Em algumas modalidades, R13 é C1 a C4 alquil. Em outrasmodalidades, R13 é etil.
Em algumas modalidades, R11 e R12 são independentementeC1 a C4 alquil. Em outras modalidades, R11 é etil e R12 éisopropil.
Em algumas modalidades, R11 e R12, juntos com o átomode nitrogênio a eles pendente, se unem para formar um anelheterocíclico. Em outras modalidades, o anel heterocíclicoé selecionado do grupo que consiste em piperidin-l-il e 3-tiapirrolidin-l-il.
Ainda em outras modalidades, R14 e R15 são unidos paraformar um anel heterocíclico, R13 é C1 a C4 alquil, e R11 eR12, juntos com o átomo de nitrogênio a eles pendente, seunem para formar um anel heterocíclico.
A presente invenção ainda fornece compostos de fórmulaIII que possuem os grupos R11, R12, R13, R14 e R15 citados naTabela 3.
Tabela 3
<formula>formula see original document page 25</formula>
Em algumas modalidades, a presente invenção fornececompostos de fórmula I, II e III que possuem substituintes
<formula>formula see original document page 25</formula>
em suas respectivas fórmulas anexados ao anel fenila naposição para. Ainda em outras modalidades, os compostos nas
Tabelas 1, 2, e 3 possuem os substituintes carbamilanexados na posição para.
Em algumas modalidades, a presente invenção tambémfornece compostos de fórmula I, II e III, incluindo aquelesnas Tabelas 1, 2 e 3, que possuem os substituintes carbamilanexados nas posições orto ou meta.
A presente invenção também fornece os compostos naTabela 4.
Tabela 4
<table>table see original document page 26</column></row><table><table>table see original document page 27</column></row><table><table>table see original document page 28</column></row><table>
Em outro aspecto, esta invenção fornece composiçõesfarmacêuticas que compreendem um veículo farmaceuticamenteaceitável e uma quantidade terapeuticamente eficaz de um oumais dos compostos aqui definidos.
Em um dos aspectos do seu método, esta invenção édirigida a um método para o tratamento de uma doençamediada, pelo menos em parte, pela integrina α.4,preferivelmente VLA-4, em um paciente, cujo métodocompreende a administração de uma composição farmacêuticaque compreende um veículo farmaceuticamente aceitável e umaquantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais doscompostos desta invenção. Em outro aspecto, esta invenção édirigida ao uso de uma composição farmacêutica quecompreende um composto desta invenção para a fabricação deum medicamento para o tratamento de uma doença mediada porintegrina a4.
Os compostos e as composições farmacêuticas destainvenção são úteis para o tratamento de condições de doençamediadas, pelo menos em parte, pelas integrinas α4, em quea integrina a4 é, de preferência, VLA-4 ou de adesãoleucocitária. Essas condições de doença incluem, porexemplo, asma, doença de Alzheimer, aterosclerose, demênciapor AIDS, diabetes (incluindo diabetes agudo de surgimentojuvenil), doença inflamatória v do intestino (incluindocolite ulcerativa e doença de Crohn), esclerose múltipla,artrite reumatóide, transplante de tecidos, metástasetumoral, meningite, encefalite, acidente vascular cerebrale outros traumas cerebrais, nefrite, retinite, dermatiteatópica, psoríase, isquemia miocárdica e lesão pulmonaraguda mediada por leucócitos como, por exemplo, a queocorre na síndrome de sofrimento respiratório do adulto.
Outras condições de doença incluem, sem limitação,condições inflamatórias como, por exemplo, eritema nodoso,conjuntivite alérgica, neurite óptica, uveite, rinitealérgica, espondilite anquilosante, artrite psoriática,vasculite, síndrome de Reiter, lúpus eritematoso sistêmico,esclerose sistêmica progressiva, polimiosite,dermatomiosite, granulomatose de Wegner, aortite,sarcoidose, linfocitopenia, arterite temporal, pericardite,miocardite, insuficiência cardíaca congestiva, poliarteritenodosa, síndromes de hipersensibilidade, alergia, síndromeshipereosinofílicas, síndrome de Churg-Strauss, doençapulmonar obstrutiva crônica, hipersensibilidadepneumonite, hepatite crônica ativa, cistite intersticial,falência endócrina autoimune, cirrose biliar primária,anemia aplásica autoimune, hepatite crônica persistente, etireoidite.
Em uma modalidade preferida, a condição de doençamediada pela integrina a4 é uma doença inflamatória.
Os compostos desta invenção incluem, por exemplo, osseguintes:
N- [2-dietilamino-5-{N-etil-N-(trifluoracetil)amino}pirimidin-4-il]-L-4' -{(pirrolidin-l-il)carbonilóxi}fenilalanina;
N- [2-dietilamino-5-{N-etil-N-(iso-propilcarbonil)amino}pirimidin-4-il]-L-4' -{(pirrolidin-l-il)carbonilóxi}fenilalanina;
N- [2-dietilamino-5-{N-etil-N-(t-butilcarbonil)amino}pirimidin-4-il]-L-41 -{(pirrolidin-l-il)carbonilóxi}fenilalanina;
N- [2-dietilamino-5-{N-etil-N-(furan-2-ilcarbonil)amino}pirimidin-4-il]-L-4'-{(pirrolidin-l-il)carbonilóxi}fenilalanina;
N-[2-dietilamino-5-{N-etil-N-(piperidin-l-ilcarbonil)amino}pirimidin-4-il] -L-4'-{(pirrolidin-l-il)carbonilóxi}fenilalanina;
N- [2-dietilamino-5-{N-etil-N-(N-etil-N-iso-propilaminocarboni1)amino}-pirimidin-4-il]-L-4 ' -{(pirrolidin-l-il)carbonilóxi}fenilalanina;
N- [2-dietilamino-5-{N-etil-N-(tien-3-ilcarbonil)amino}pirimidin-4-il]-L-4'-{(pirrolidin-1-il)carbonilóxi}fenilalanina;
N- [2-dietilamino-5-{N-etil-N-(tien-2-ilcarbonil)amino}pirimidin-4-il]-L-4'-{(pirrolidin-l-il)carbonilóxi}fenilalanina;
N- [2-dietilamino-5-{N-etil-N-(furan-3-ilcarbonil)amino}pirimidin-4-il]-L-4'-{(pirrolidin-l-il)carbonilóxi}fenilalanina;
N- [2-dietilamino-5-{N-etil-N-(3-tiapirrolidin-l-ilcarbonil)amino}pirimidin-4-il]-L-4'-{(pirrolidin-l-il)carbonilóxi}fenilalanina;
Ester t-butílico de N-[2-dietilamino-5-{N-etil-N-(tien-2-ilcarbonil)amino}pirimidin-4-il]-L-4'-{(pirrolidin-l-il) carbonilóxi}-fenilalanina;
Ester t-butílico de N-[2-dietilamino-5-{N-etil-N-(trifluormetilcarbonil)amino}pirimidin-4-il]-L-4 ' -{(pirrolidin-l-il)carbonilóxi}-fenilalanina;
Ester t-butílico de N-[2-dietilamino-5-{N-etil-N-(t-butilcarbonil)amino}pirimidin-4-il]-L-4'-{(pirrolidin-1-il)carbonilóxi}-fenilalanina; e
Ester t-butílico de N-[2-dietilamino-5-{N-etil-N-(furan-3-ilcarbonil)amino}pirimidin-4-il]-L-4'-{(pirrolidin-l-il)carbonilóxi}-fenilalanina;
ou o sal, éster ou pró-fármaco farmaceuticamenteaceitável destes.
Preparação do composto
Os compostos desta invenção podem ser preparados apartir de materiais de partida facilmente disponíveis com ouso dos seguintes métodos e procedimentos gerais. Seráobservado que, quando forem fornecidas condições deprocesso típicas ou preferidas (ou seja, temperaturas dareação, tempos, proporções molares de reagentes, solventes,pressões etc.), outras condições de processo também poderãoser usadas, a menos que especificado de forma diferente. Ascondições de reação ótimas podem variar de acordo com osreagentes ou solventes específicos usados, mas essascondições podem ser determinadas por aqueles habilitados natécnica, por procedimentos de otimização de rotina.
Adicionalmente, como ficará evidente para aqueleshabilitados na técnica, podem ser necessários gruposprotetores convencionais para evitar que certos gruposfuncionais sejam submetidos a reações indesejadas. Gruposprotetores adequados para vários grupos funcionais, além decondições adequadas para a proteção e desproteção de gruposfuncionais específicos, são bem conhecidos na técnica. Porexemplo, diversos grupos protetores são descritos em T.W.Greene e G.M. Wuts, "Protecting Groups in OrganicSynthesis", Segunda Edição, Wiley, Nova York, 1991, ereferências nele citadas.
Além disso, os compostos desta invenção tipicamenteconterão um ou mais centros quirais. Conseqüentemente, casodesejado, tais compostos podem ser preparados ou isoladoscomo estereoisômeros puros, ou seja, como enantiômeros oudiastereoisômeros individuais, ou como misturasenriquecidas em estereoisômeros. Todos essesestereoisômeros (e misturas enriquecidas) estão incluídosdentro do escopo desta invenção, a menos que indicado deforma diferente. Estereoisômeros puros (ou misturasenriquecidas) podem ser preparados, por exemplo, com o usode materiais de partida opticamente ativos ou reagentesestéreo-seletivos bem conhecidos na técnica.
Alternativamente, misturas racêmicas desses compostos podemser separadas, por exemplo, com o uso de cromatografia decoluna quiral, agentes de resolução quiral, e semelhantes.
Em uma modalidade, os compostos desta invenção podemser preparados como descrito abaixo no Esquema 1:
<formula>formula see original document page 33</formula>
Esquema 1
em que R1, R2, R3, R4, R5 e R6 são como definidos acima,e Pg é um grupo protetor carboxil como, por exemplo,benzil, t-butil, e semelhantes.
No Esquema 1, os intermediários de partida 5-aminopirimidina, composto 1.1, são descritos em detalhe emWO 03/099809 e, apenas como forma de ilustração, sãomostrados nesse esquema como derivados de fenilalanina 4-substituidos. Deve-se entender, evidentemente, quederivados de fenilalanina 2- e 3-substituídos seguiriam umavia de reação similar.
Especificamente, no Esquema 1, pirimidina 5-amino-2-dietilamino-4-substituída, composto 1.1 (preparada a partirda 5-nitro-pirimidina correspondente por redução com Pd/C5% ou PtO2 5% por peso) é convertida na trifluoracetamidacorrespondente, composto 1.2, por métodos convencionais.Por exemplo, um ligeiro excesso de anidrido trifluoracéticoé combinado com o composto 1.1 em um diluente inerteadequado, por exemplo, tetrahidrofurano, cloreto demetileno, piridina, e semelhantes. A reação é mantida em decerca de 0°C a cerca de 30°C, até que a reação estejasubstancialmente completa, o que tipicamente ocorre em atécerca de 0,5 a 24 horas. Após o término da reação, ocomposto 1.2 é recuperado por métodos convencionais,incluindo neutralização, evaporação, extração,precipitação, cromatografia, filtração, e semelhantes, ou,alternativamente, é empregado na etapa seguinte sempurificação e/ou isolamento.
A conversão do composto 1.2 naN(R2),N-trifluoracetamidopirimidina correspondente,composto 1.3, novamente é feita através de técnicasconvencionais. Por exemplo, um excesso do haleto, R2-I, écombinado com o composto 1.2 em um diluente inerteadequado, por exemplo, DMF, na presença de um excesso deuma base adequada, por exemplo, carbonato de potássio. Emuma modalidade preferida, aproximadamente dois equivalentesde R2-I e carbonato de potássio são empregados. A reação émantida sob condições ambientes em um recipiente lacrado eé continuada até que a reação esteja substancialmentecompleta, o que tipicamente ocorre em 20-72 horas. Após otérmino da reação, o composto 1.3 é recuperado por métodosconvencionais, incluindo neutralização, evaporação,extração, precipitação, cromatografia, filtração, esemelhantes ou, alternativamente, é empregado na etapaseguinte sem purificação e/ou isolamento.
o grupo protetor carboxil do composto 1.3 pode serremovido por condições convencionais para gerar um compostode Fórmula I (não mostrado) . Em uma modalidade, um grupoprotetor t-butil pode ser removido por contato com ácidofórmico. Em outra modalidade, um grupo protetor benzil podeser removido por contato com hidrogênio na presença de umcatalisador de paládio/carbono, tipicamente em um solventeprótico como, por exemplo, metanol, sob pressões elevadasde hidrogênio.
Alternativamente, o grupo trifluoracetil pode serremovido para gerar a amina correspondente, composto 1.4.Nessa modalidade, o grupo trifluoracetil atua como um grupoprotetor amina. Como acima, essa reação convencionalmenteavança, por exemplo, por contato do composto 1.3 com umexcesso grande de uma base adequada, por exemplo, carbonatode potássio, em uma mistura de água e um solvente próticocomo, por exemplo, metanol. A reação é realizada emtemperaturas elevadas como, por exemplo, 40° a 60°C, e écontinuada até que a reação esteja substancialmentecompleta. Após o término da reação, o composto 1.4 é recuperado por métodos convencionais, incluindoneutralização, evaporação, extração, precipitação,cromatografia, filtração, e semelhantes, ou,alternativamente, é empregado na etapa seguinte sempurificação e/ou isolamento.
No Esquema 1, o composto 1.4 pode ser usado parapreparar derivados de uréia em que R1 = -NR5R6, ou derivadosde acilamino em que R1 é Ci a C4 alquil, Ci a C4 haloalquilou heteroaril ligados ao grupo carbonil por outro meio quenão através de um átomo de nitrogênio. Na primeiramodalidade, os derivados de uréia são preparados pormétodos convencionais como, por exemplo, preparando-seinicialmente o cloreto de amido, composto 1.7. Essecomposto é preparado por contato do composto 1.4 com umexcesso de fosgeno na presença de uma base adequada, porexemplo, carbonato de potássio, bicarbonato de potássio,carbonato de sódio, e semelhantes. Após o término dareação, o composto 1.7 pode ser recuperado por métodosconvencionais, incluindo neutralização, evaporação,extração, precipitação, cromatografia, filtração, esemelhantes, mas, pref erivelmente, é empregado na etapaseguinte sem purificação e/ou isolamento.
0 cloreto de amido, composto 1.7, é então convertidono derivado de uréia correspondente, composto 1.8, porreação com uma amina adequada, R5R6NH, sob condiçõesconvencionais. De preferência, a reação com uma quantidadeeqüimolar ou excesso da amina é colocada em contato com ocomposto 1.7 em um solvente adequado como, por exemplo,tetrahidrofurano, dioxano, clorofórmio, e semelhantes. Apóso término da reação, o composto 1.8 pode ser recuperado pormétodos convencionais, incluindo neutralização, evaporação,extração, precipitação, cromatografia, filtração, esemelhantes, ou, alternativamente, é empregado na etapaseguinte sem purificação e/ou isolamento.
0 grupo protetor carboxil do composto 1.8 pode serremovido por condições convencionais para gerar o composto1.9, um composto de Fórmula I. Em uma modalidade, um grupoprotetor t-butil pode ser removido por contato com ácidofórmico. Em outra modalidade, um grupo protetor benzil podeser removido por contato com hidrogênio na presença de umcatalisador de paládio/carbono, tipicamente em um solventeprótico como, por exemplo, metanol, sob pressões elevadasde hidrogênio. Após o término da reação, o composto 1.9pode ser recuperado por métodos convencionais, incluindoneutralização, evaporação, extração, precipitação,cromatografia, filtração, e semelhantes.
Na segunda modalidade, derivados de acilamino,composto 1.5, são preparados por contato do composto 1.4com um ligeiro excesso de um haleto de acila na presença deuma base adequada, por exemplo, trietilamina,diisopropiletilamina, e semelhantes, a fim de remover oácido gerado. A reação é realizada, de preferência, em umsolvente inerte adequado como, por exemplo,
tetrahidrofurano, dioxano, clorofórmio, e semelhantes. Areação é realizada, de preferência, a de cerca de 0°C a30°C, e é continuada até que a reação estejasubstancialmente completa, o que tipicamente ocorre em 2-48horas. Após o término da reação, o composto 1.5 pode serrecuperado por métodos convencionais, incluindoneutralização, evaporação, extração, precipitação,cromatografia, filtração, e semelhantes, ou,alternativamente, é empregado 1 na etapa seguinte sempurificação e/ou isolamento.
o grupo protetor carboxil do composto 1.5 pode serremovido por condições convencionais para gerar o composto1.6, um composto de Fórmula I. Em uma modalidade, um grupoprotetor t-butil pode ser removido por contato com ácidofórmico. Em outra modalidade, um grupo protetor benzil podeser removido por contato com hidrogênio na presença de umcatalisador de paládio/carbono, tipicamente em um solvente prótico como, por exemplo, metanol, sob pressões elevadasde hidrogênio. Após o término da reação, o composto 1.6pode ser recuperado por métodos convencionais, incluindoneutralização, evaporação, extração, precipitação,cromatografia, filtração, e semelhantes.
Formulações farmacêuticas
Quando empregados como substâncias farmacêuticas, oscompostos desta invenção são normalmente administrados naforma de composições farmacêuticas. Esses compostos podemser administrados por diversas vias, incluindo a via oral,retal, transdérmica, subcutânea, intravenosa, intramusculare intranasal. Esses compostos são eficazes como composiçõestanto injetáveis quanto orais. Essas composições sãopreparadas de uma forma bem conhecida na técnicafarmacêutica, e compreendem pelo menos um composto ativo.
Esta invenção também inclui composições farmacêuticasque contêm, como ingrediente ativo, um ou mais doscompostos de Fórmula I-III acima, associados a veículosfarmaceuticamente aceitáveis. Na fabricação das composiçõesdesta invenção, o ingrediente ativo é normalmente misturadocom um excipiente, diluído por um excipiente, ou englobadodentro desse veículo, que pode estar na forma de umacápsula, sachê, papel ou outro recipiente. O excipienteempregado é tipicamente um excipiente adequado paraadministração a seres humanos ou a outros mamíferos. Quandoo excipiente serve como diluente, ele pode ser um materialsólido, semi-sólido ou líquido, que atua como um veículo,transportador ou meio para o ingrediente ativo. Dessaforma, as composições podem estar na forma de comprimidos,pílulas, pós, pastilhas, sachês, sinetes, elixires,suspensões, emulsões, soluções, xaropes, aerossóis (como umsólido ou em um meio líquido) , pomadas contendo, porexemplo, até 10% por peso do composto ativo, cápsulas degelatina macia e dura, supositórios, soluções injetáveisestéreis, e pós embalados estéreis.
Na preparação de uma formulação, pode ser necessáriotriturar o composto ativo para gerar o tamanho de partículaapropriado, antes da combinação com os outros ingredientes.Caso o composto ativo seja substancialmente insolúvel, elenormalmente será triturado até um tamanho de partícula demenos de 200 mesh. Caso o composto ativo sejasubstancialmente hidrossolúvel, o tamanho de partícula seránormalmente ajustado por trituração, para gerar umadistribuição substancialmente uniforme na formulação, porexemplo, cerca de 4 0 mesh.
Alguns exemplos de excipientes adequados incluemlactose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, amidos,goma acácia, fosfato de cálcio, alginatos, tragacanto,gelatina, silicato de cálcio, celulose microcristalina,polivinilpirrolidona, celulose, água, xarope e metilcelulose. As formulações podem adicionalmente incluir:agentes lubrificantes, tais como talco, estearato demagnésio e óleo mineral; agentes umidificantes; agentesemulsificantes e de suspensão; agentes conservantes, taiscomo metil- e propil-hidróxi-benzoatos; agentes adoçantes;e agentes flavorizantes. As composições da invenção podemser formuladas de forma a fornecer uma liberação rápida,sustentada ou retardada do ingrediente ativo apósadministração ao paciente pelo emprego de procedimentosconhecidos na técnica.
A administração de agentes terapêuticos por formulaçãointravenosa é bem conhecida na indústria farmacêutica. Umaformulação intravenosa deve possuir certas qualidades alémde ser apenas uma composição na qual o agente terapêutico ésolúvel. Por exemplo, a formulação deve promover aestabilidade global do ingrediente(s) ativo(s) e, alémdisso, a fabricação da formulação deve ser economicamenteviável. Todos esses fatores em última análise determinam osucesso global e a utilidade de uma formulação intravenosa.
Outros aditivos acessórios que podem ser incluídos emformulações farmacêuticas de compostos da presente invençãosão os seguintes: solventes: etanol, glicerol, propilenoglicol; estabilizantes: ácido etileno diamina tetra-acético(EDTA), ácido cítrico; conservantes antimicrobianos: álcoolbenzílico, metil parabeno, propil parabeno; agentes detamponamento: ácido cítrico/citrato de sódio, tartarato depotássio hidrogênio, tartarato de sódio hidrogênio, ácidoacético/acetato de sódio, ácido maléico/maleato de sódio,hidrogênio ftalato de sódio, ácido fosfórico/fosfato depotássio dihidrogênio, ácido fosfórico/fosfato dissódico dehidrogênio; e modificadores da tonicidade: cloreto desódio, manitol, dextrose.
A presença de um tampão pode ser necessária paramanter o pH aquoso na faixa de cerca de 4 a cerca de 8 e,mais preferivelmente, em uma faixa de cerca de 4 a cerca de6.0 sistema tampão é geralmente uma mistura de um ácidofraco e um sal solúvel deste, por exemplo, citrato desódio/ácido cítricô; ou o sal de monocátion ou dicátion deum ácido dibásico, por exemplo, tartarato de potássiohidrogênio; tartarato de sódio hidrogênio, ácidofosfórico/fosfato de potássio dihidrogênio e ácidofosfórico/fosfato dissódico de hidrogênio.
A quantidade de sistema tampão usada depende: (1) dopH desejado; e (2) da quantidade de fármaco. Geralmente, aquantidade de tampão usada está em uma proporção molar0,5:1 a 50:1 de tampão: fármaco (em que os moles de tampãosão considerados como os moles combinados dos ingredientesdo tampão, por exemplo, citrato de sódio e ácido cítricô)de formulação para manter um pH na faixa de 4 a 8 e,geralmente, é usada uma proporção molar de 1:1 a 10:1 detampão (combinado) para o fármaco presente.
Um tampão útil na invenção é citrato de sódio/ácidocí tricô na faixa de 5 a 50 mg por ml de citrato de sódiopara 1 a 15 mg por ml de ácido cítrico, suficiente paramanter um pH aquoso de 4-6 da composição.
O agente tampão também pode estar presente para evitara precipitação do fármaco através da formação de complexometálico solúvel com íons metálicos dissolvidos, porexemplo, Ca, Mg, Fe, Al, Ba, que podem se desprender derecipientes de vidro ou tampas de borracha ou estarpresentes na água corrente comum. 0 agente pode atuar comoum agente competitivo de formação de complexos com ofármaco e produzir um complexo metálico solúvel, levando àpresença de particulados indesejáveis.
Além disso, a presença de um agente, por exemplo,cloreto de sódio, em uma quantidade de cerca de 1-8 mg/ml,para ajustar a tonicidade no mesmo valor do sangue humano,pode ser necessária para evitar o edema ou o encolhimentode eritrócitos mediante a administração da formulaçãointravenosa, causando efeitos colaterais indesejáveis como,por exemplo, náuseas ou diarréia e, possivelmente,distúrbios sangüíneos associados. Em geral, a tonicidade daformulação combina com a do sangue humano, que é de cercade 282 a 288 mOsm/kg e, em geral, é de 285 mOsm/kg, o que éequivalente à pressão osmótica que corresponde a umasolução 0,9% de cloreto de sódio.
A formulação intravenosa pode ser administrada porinjeção intravenosa direta, i.v. em bolo, ou pode seradministrada por infusão por adição a uma solução deinfusão apropriada como, por exemplo, injeção de cloreto desódio 0,9% ou outra solução de infusão compatível.
As composições são formuladas preferivelmente em umaforma de dosagem unitária, cada dosagem contendo de cercade 5 a cerca de 100 mg, mais normalmente de cerca de 10 acerca de 3 0 mg do ingrediente ativo. O termo "formas dedosagem unitária" refere-se às unidades fisicamentedistintas adequadas às dosagens unitárias para sereshumanos e outros mamíferos, cada unidade contendo umaquantidade predeterminada de material ativo calculada paraproduzir o efeito terapêutico desejado, associado a umexcipiente farmacêutico adequado.O composto ativo é eficaz em uma ampla faixa dedosagens, e é geralmente administrado em uma quantidadefarmaceuticamente eficaz. Subentende-se, no entanto, que aquantidade do composto realmente administrada serádeterminada por um médico, à luz das circunstânciasrelevantes, incluindo a condição a ser tratada, a via deadministração escolhida, o composto especificoadministrado, a idade, o peso e a resposta do pacienteindividual, a gravidade dos sintomas do paciente, esemelhantes.
Para a preparação de composições sólidas como, porexemplo, comprimidos, o ingrediente ativo principal émisturado com um excipiente farmacêutico para formar umacomposição de pré-formulação sólida que contém uma misturahomogênea de um composto da presente invenção. Quando sediz que essas composições de pré-formulação são homogêneas,isso significa que o ingrediente ativo está dispersoigualmente por toda a composição, de forma que a composiçãopode ser facilmente subdividida em formas de dosagemunitária igualmente eficazes, tais como comprimidos,pílulas e cápsulas. Essa pré-formulação sólida é entãosubdividida em formas de dosagem unitária do tipo descritoacima, contendo, por exemplo, de 0,1 a cerca de 500 mg doingrediente ativo da presente invenção.
Os comprimidos ou as pílulas da presente invençãopodem ser revestidos ou de algum outro modo compostos parafornecer uma forma de dosagem, gerando a vantagem da açãoprolongada. Por exemplo, o comprimido ou a pílula podecompreender um componente de ~· dosagem interno e umcomponente de dosagem externo, esse último estando na formade um envelope sobre o primeiro. Os dois componentes podemser separados por uma camada entérica que serve pararesistir à desintegração no estômago, e permitir que ocomponente interno passe intacto para o duodeno ou quetenha a sua liberação retardada. Diversos materiais podemser usados para essas camadas ou revestimentos entéricos,tais materiais incluindo vários ácidos poliméricos emisturas de ácidos poliméricos com materiais como gomalaca, álcool cetilico e acetato de celulose.
As formas líquidas nas quais as composições inéditasda presente invenção podem ser incorporadas paraadministração por via oral ou por injeção incluem soluçõesaquosas, adequadamente xaropes flavorizados, suspensõesaquosas ou oleosas, e emulsões flavorizadas com óleoscomestíveis como, por exemplo, óleo de semente de algodão,óleo de gergelim, óleo de coco ou óleo de amendoim, além deelixires, e veículos farmacêuticos similares.
Composições para inalação ou insuflação incluemsoluções e suspensões em solventes aquosos ou orgânicosfarmaceuticamente aceitáveis, ou misturas destes, e pós. Ascomposições líquidas ou sólidas podem conter excipientesfarmaceuticamente aceitáveis adequados, como descritosupra. De preferência, as composições são administradaspela via respiratória oral ou nasal para efeito local ousistêmico. As composições, preferivelmente em solventesfarmaceuticamente aceitáveis, podem ser nebulizadas pelouso de gases inertes. Soluções nebulizadas podem serinaladas diretamente do dispositivo de nebulização, ou odispositivo de nebulização pode ser anexado a uma tenda demáscaras, ou a um respirador de pressão positivaintermitente. De preferência, composições de solução,suspensão ou pó podem ser administradas oral ou nasalmente,por dispositivos que liberam a formulação de formaadequada.
Os seguintes exemplos de formulações ilustram ascomposições farmacêuticas da presente invenção.
Exemplo de formulação 1
São preparadas cápsulas de gelatina dura contendo osseguintes ingredientes:
<table>table see original document page 45</column></row><table>
Os ingredientes acima são misturados e preenchidos emcápsulas de gelatina dura em quantidades de 34 0 mg.
Exemplo de formulação 2
Uma fórmula de comprimido é preparada com o uso dosingredientes abaixo:
<table>table see original document page 45</column></row><table>
Os componentes são misturados e compactados paraformar comprimidos, cada um pesando 24 0 mg.
Exemplo de formulação 3
É preparada uma formulação de inalador de pó secocontendo os seguintes componentes:
<table>table see original document page 45</column></row><table>Lactose 95
o ingrediente ativo é misturado com a lactose, e amistura é adicionada a um aparelho de inalação de pó seco.Exemplo de formulação 4
Comprimidos, cada um contendo 3 0 mg de ingrediente
ativo, são preparados da seguinte forma:
Quantidade (mg/comprimido)
Ingrediente ativo 30,0 mg
Amido 45,0 mg
Celulose microcristalina 35,0 mg
Polivinilpirrolidona 4 , 0 mg
(como solução 10% em água estéril)Amido de carboximetil sódico 4,5 mg
Estearato de magnésio 0,5 mg
Talco 1,0 mg
o ingrediente ativo, o amido e a celulose são passadosatravés de uma peneira U.S. de trama N0 20 e misturadoscuidadosamente. A solução de polivinilpirrolidona émisturada com os resultantes, que são então passadosatravés de uma peneira U.S. de trama 16. Os grânulos assimproduzidos são secos a 500C a 60°C, e passados através deuma peneira U.S. de trama 16. 0 amido de carboximetilsódico, o estearato de magnésio e o talco, passadospreviamente através de uma peneira U.S. de trama N0 30, sãoentão adicionados aos grânulos, os quais, após mistura, sãocompactados em uma máquina de comprimidos para gerarcomprimidos, cada um pesando 120 mg.
Exemplo de formulação 5
Cápsulas, cada uma contendo 4 0 mg de medicamento, sãofeitas da seguinte forma:Ingrediente Quantidade (mg/cápsula)
Ingrediente ativo 40,0 mg
Amido 109,0 mg
Estearato de magnésio 1,0 mg
Total 150,0 mg
O ingrediente ativo, o amido e o estearato de magnésiosão misturados, passados através de uma peneira U.S. detrama N0 20, e preenchidos em cápsulas de gelatina dura emquantidades de 150 mg.
Exemplo de formulação 6
Supositórios, cada um contendo 25 mg de ingredienteativo, são feitos da seguinte forma:
Ingrediente Quantidade
Ingrediente ativo 25 mg
Glicerídeos de ácido graxo
saturado até 2.000 mg
O ingrediente ativo é passado através de uma peneirade trama N0 60 e suspenso nos glicerídeos de ácido graxosaturado previamente derretidos com o uso do mínimo decalor necessário. A mistura é então despejada em um moldede supositório de capacidade nominal de 2,0 g, e permite-seque resfrie.
Exemplo de formulação 7
Suspensões, cada uma contendo 50 mg de medicamento pordose de 5,0 ml, são feitas da seguinte forma:
Ingrediente Quantidade
Ingrediente ativo 50,0 mg
Goma xantana 4,0 mg
Carboximetil celulose sódica (11%)
Celulose microcristalina (89%) 50,0 mg47/113
Sacarose 1/75 g
Benzoato de sódio 10,0 mg
Flavorizante e corante q.v.
Água purificada até 5,0 ml
0 ingrediente ativo, a sacarose e a goma xantana sãomisturados, passados através de uma peneira U.S. de tramaNc 10, e depois misturados com uma solução feitapreviamente da celulose microcristalina e da carboximetilcelulose sódica em água. 0 benzoato de sódio, oflavorizante e o corante são diluídos com um pouco da águae adicionados com agitação. É então adicionada águasuficiente para a produção do volume necessário.Exemplo de formulação 8
Ingrediente Quantidade (mg/cápsula)
Ingrediente ativo 15,0 mg
Amido 4 07,0 mg
Estearato de magnésio 3,0 mg
Total 425,0 mg
0 ingrediente ativo, o amido e o estearato de magnésiosão misturados, passados através de uma peneira U.S. detrama N° 20, e preenchidos em cápsulas de gelatina dura emquantidades de 425,0 mg.Exemplo de formulação 9
Uma formulação subcutânea pode ser preparada daseguinte forma:
Ingrediente Quantidade
Ingrediente ativo 5 , 0 mg
Óleo de milho 1,0 ml
Exemplo de formulação 10Uma formulação tópica pode ser preparada da seguinte<table>table see original document page 49</column></row><table>
A parafina macia branca é aquecida até derreter. Aparafina líquida e a cera emulsificante são incorporadas eagitadas até dissolvidas. O ingrediente ativo é adicionado,e a agitação é continuada até a dispersão. A mistura éentão resfriada até ficar sólida.
Exemplo de formulação 11
Uma formulação intravenosa pode ser preparada daseguinte forma:
<table>table see original document page 49</column></row><table>
Outra formulação preferida empregada nos métodos dapresente invenção emprega dispositivos de liberaçãotransdérmica ("emplastros"). Esses emplastros transdérmicospodem ser usados para fornecer infusão contínua oudescontínua dos compostos da presente invenção emquantidades controladas. A construção e o uso de emplastrostransdérmicos para a liberação de agentes farmacêuticos sãobem conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, a PatenteU.S. 5.023.252, emitida em 11 de junho de 1991, aquiincorporada por referência. Esses emplastros podem serconstruídos para liberação contínua, pulsátil ou sobdemanda de agentes farmacêuticos.
Freqüentemente, será desejável ou necessáriointroduzir a composição farmacêutica no cérebro, direta ouindiretamente. As técnicas diretas normalmente evolvem acolocação de um cateter de liberação de fármaco no sistemaventricular do hospedeiro para ultrapassar a barreirahematencefálica. Um desses sistemas de liberaçãoimplantáveis usado para o transporte de fatores biológicospara regiões anatômicas do corpo específicas é descrito naPatente U.S. 5.011.472, que é aqui incorporada porreferência.
Técnicas indiretas, que são geralmente preferidas,normalmente envolvem a formulação das composições paragerar uma latência do fármaco pela conversão de fármacoshidrofílicos em fármacos lipossolúveis. Essa latência égeralmente obtida através do bloqueio dos grupos hidroxil,carbonil, sulfato e amina primária presente no fármaco paratorná-los mais lipossolúveis e passíveis de transporteatravés da barreira hematencefálica. Alternativamente, aliberação de fármacos hidrofílicos pode ser aumentada porinfusão intra-arterial de soluçoes hipertônicas que podemabrir transitoriamente a barreira hematencefálica.
Outras formulações adequadas para uso na presenteinvenção podem ser encontradas em "Remington1SPharmaceutical Sciences", Mace Publishing Company,Philadelphia, PA, 17a ed. (1985).
Como observado acima, os compostos aqui descritos sãoadequados para uso em diversos sistemas de liberação defármacos descritos acima. Adicionalmente, a fim de aumentara meia-vida sérica in vivo do composto administrado, oscompostos podem ser encapsulados, introduzidos no lúmen delipossomos, preparados como um colóide, ou podem serempregadas outras técnicas convencionais que fornecem umaumento da meia-vida sérica dos compostos. Vários métodossão disponíveis para a preparação de lipossomos, comodescrito, por exemplo, em Szoka, e cols., Patentes U.S. Nos4.235.871, 4.501.728 e 4.837.028, cada uma delas aquiincorporada por referência.
Os conjugados desta invenção são antagonistas de VLA-4e são contemplados por fornecerem aumento da retenção invivo, quando comparados com os compostos não conjugados.
Esse aumento da retenção do conjugado dentro do corporesultaria na redução das dosagens do fármaco necessárias,o que, por sua vez, resultaria em menos efeitos colateraise probabilidade reduzida de toxicidade. Além disso, aformulação do fármaco pode ser administrada menosfreqüentemente ao paciente, embora obtendo um efeitoterapêutico similar ou aprimorado.
Prevê-se que os conjugados desta invenção exibaminibição, in vivo, da adesão de leucócitos às célulasendoteliais mediada por VLA-4 por ligação competitiva àVLA-4. De preferência, os compostos desta invenção podemser usados em formulações intravenosas para o tratamento dedoenças mediadas por VLA-4 ou por adesão leucocitária.
Essas doenças incluem doenças inflamatórias em pacientesmamíferos como, por exemplo, asma, doença de Alzheimer,aterosclerose, demência por AIDS, diabetes (incluindodiabetes agudo de surgimento juvenil), doença inflamatóriado intestino (incluindo colite ulcerativa e doença deCrohn), esclerose múltipla, artri.te reumatóide, transplantede tecidos, metástase tumoral, meningite, encefalite,acidente vascular cerebral e outros traumas cerebrais,nefrite, retinite, dermatite atópica, psoríase, isquemiamiocárdica e lesão pulmonar aguda mediada por leucócitoscomo, por exemplo, a que ocorre na síndrome de sofrimentorespiratório do adulto. As formulações da presente invençãosão especialmente úteis no tratamento de esclerose múltiplae artrite reumatóide.
Modelos in vivo adequados para a demonstração daeficácia no tratamento de condições inflamatórias incluemEAE (encefalomielite autoimune experimental) emcamundongos, ratos, porquinhos-da-índia ou primatas, alémde outros modelos inflamatórios que dependem das integrinas a4.
A doença inflamatória do intestino é um termo coletivopara duas doenças similares denominadas doença de Crohn ecolite ulcerativa. A doença de Crohn é uma doençainflamatória idiopática crônica, úlcero-constritiva,caracterizada por envolvimento nitidamente delimitado etipicamente transmural de todas as camadas da paredeintestinal por uma reação inflamatória granulomatosa.
Qualquer segmento do trato gastrintestinal, da boca aoânus, pode estar envolvido, embora a doença mais comumenteafete o íleo terminal e/ou o cólon. A colite ulcerativa éuma resposta inflamatória limitada grandemente à mucosa esubmucosa do cólon. Os Iinfócitos e macrófagos sãonumerosos nas lesões da doença inflamatória do intestino, epodem contribuir para a lesão inflamatória.
A asma é uma doença caracterizada por aumento dacapacidade de resposta da árvore traqueobrônquica a váriosestímulos que potencializam a constrição paroxísmica dasvias aéreas brônquicas. Os estímulos causam a liberação devários mediadores da inflamação dos mastócitos cobertos porIgEi incluindo histamina, fatores quimiotáticoseosinofílicos e neutrofílicos, leucotrineos,prostaglandina, e fator de ativação plaquetária. Aliberação desses fatores recruta basófilos, eosinófilos eneutrófilos, que causam a lesão inflamatória.
A aterosclerose é uma doènça das artérias (porexemplo, coronárias, carótidas, aorta e iliacas). A lesãobásica, o ateroma, consiste em uma placa focai elevadadentro da intima, que possui um núcleo de lipideo e umacapa fibrosa de cobertura. Os ateromas comprometem o fluxosangüíneo arterial e enfraquecem as artérias afetadas.Infartos do miocárdio e cerebrais são as conseqüênciasprincipais dessa doença. Macrófagos e leucócitos sãorecrutados para os ateromas e contribuem para a lesãoinflamatória.
A artrite reumatóide é uma doença inflamatóriacrônica, recidivante, que primariamente causa adeterioração e destruição das articulações. A artritereumatóide normalmente afeta primeiro as pequenasarticulações das mãos e dos pés, mas então pode envolver ospunhos, cotovelos, tornozelos e joelhos. A artrite resultada interação de células sinoviais com leucócitos que seinfiltram da circulação para dentro do revestimentosinovial das articulações. Veja, por exemplo, Paul,Immunology (3a ed., Raven Press, 1993).
Outra indicação para os compostos desta invenção é notratamento de rejeição de órgãos ou enxertos mediada porVLA-4. Nos últimos anos, houve uma melhora considerável naeficiência de técnicas cirúrgicas para o transplante detecidos e órgãos como a pele, o rim, fígado, coração,pulmão, pâncreas e medula óssea. Talvez o principalproblema existente seja a ausência de agentes satisfatóriospara a indução de imunotolerância no receptor ao aloenxertoou órgão transplantado. Quando células alogênicas ou órgãossão transplantados em um hospedeiro (ou seja, o doador e oreceptor são indivíduos diferentes da mesma espécie), osistema imunológico tem tendência a montar uma respostaimunológica contra os antígenos estranhos presentes notransplante (doença enxerto versus hospedeiro), levando àdestruição do tecido transplantado. As células CD8+, ascélulas CD4 e os monócitos estão envolvidos na rejeição detecidos transplantados. Os compostos desta invenção que seligam à integrina alfa-4 são úteis, inter alia, para obloqueio das respostas imunológicas induzidas poraloantógenos no receptor, evitando, dessa forma, que essascélulas participem na destruição do tecido ou órgãotransplantado. Veja, por exemplo, Paul e cols., TransplantInternational 9, 420-425 (1996); Georczynski e cols.,Immunology 87, 573-580 (1996); Georcyznski e cols.,Transplant. Immunol. 3, 55-61 (1995); Yang e cols.,Transplantation 60, 71-76 (1995); Anderson e cols., APMIS102, 23-27 (1994).
Um uso relacionado para os compostos desta invençãoque se ligam à VLA-4 é na modulação da resposta imunológicaenvolvida na doença "enxerto versus hospedeiro" (DEVH).
Veja, por exemplo, Schlegel e cols., J. Immunol. 155,3.856-3.865 (1995). A DEVH é uma doença potencialmentefatal que ocorre quando células imunologicamentecompetentes são transferidas para um receptor alogênico.Nessa situação, as células imunocompetentes do doador podematacar tecidos no receptor. Tecidos da pele, epitéliosintestinais e do fígado são alvos freqüentes, e podem serdestruídos durante a evolução da DEVH. A doença apresentaum problema especialmente grave no caso de transplante detecido imunológico, como, por exemplo, no transplante demedula óssea; mas também há relatos de DEVH menos gravetambém em outros casos, incluindo transplantes cardíacos ehepáticos. Os agentes terapêuticos da presente invenção sãousados, inter alia, para bloquear a ativação das células Tdo doador, interferindo, dessa forma, com sua habilidadepara lisar células-alvo no hospedeiro.
Um uso adicional dos compostos desta invenção é nainibição de metástase tumoral. Há relatos de que váriascélulas tumorais expressam VLA-4, e os compostos que seligam à VLA-4 bloqueiam a adesão dessas células às célulasendoteliais. Steinback e cols., Urol. Res. 23, 175-83(1995); Orosz e cols., Int. J. Câncer 60, 867-71 (1995);Freedman e cols., Leuk. Lymphoma 13, 47-52 (1994); Okaharae cols., Câncer Res. 54, 3.233-6 (1994).
Os compostos que possuem a atividade biológicadesejada podem ser modificados da forma necessária parafornecerem as propriedades desejadas como, por exemplo,propriedades farmacológicas aprimoradas (por exemplo,estabilidade in vivo, biodisponibilidade), ou a habilidadepara serem detectados em aplicações diagnosticas. Aestabilidade pode ser testada de diversas formas como, porexemplo, pela determinação da meia-vida das proteínasdurante incubação com peptidases ou plasma ou soro humano.Foram descritos vários desses ensaios de estabilidade deproteínas (veja, por exemplo, Verhoef e cols. , Eur. J. DrugMetab. Pharmacokinet., 1990, 15(2):83-93).
Um uso adicional dos compostos desta invenção é notratamento de esclerose múltipla. A esclerose múltipla éuma doença autoimune neurológica progressiva que afeta umnúmero estimado de 250.000 a 350.000 pessoas nos EstadosUnidos. Acredita-se que a esclerose múltipla seja oresultado de uma reação autoimune específica na qual algunsleucócitos atacam e iniciam a destruição de mielina, abainha de isolamento que cobre as fibras nervosas. Em ummodelo animal para esclerose múltipla, demonstrou-se queanticorpos monoclonais murídeos dirigidos contra VLA-4bloqueiam a adesão de leucócitos ao endotélio e, dessaforma, evitam a inflamação do sistema nervoso central e asubseqüente paralisia nos animais.16
As composições farmacêuticas da invenção são adequadasao uso em diversos sistemas de liberação de fármacos.Formulações adequadas para uso na presente invenção sãoencontradas em wRemingtonlS Pharmaceutical Sciences", MacePublishing Company, Philadelphia, PA, 17a ed. (1985).
A quantidade administrada ao paciente irá variar,dependendo do composto administrado, da finalidade daadministração, por exemplo, profilaxia ou terapia, doestado do paciente, da forma de administração, esemelhantes. Em aplicações terapêuticas, as composições sãoadministradas a um paciente que já sofre de uma doença emuma quantidade suficiente para curar, ou pelo menosinterromper parcialmente, os sintomas da doença e suascomplicações. Uma quantidade adequada para atingir esseobjetivo é definida como "dose terapeuticamente eficaz". Asquantidades eficazes para esse uso dependerão da condiçãode doença que estiver sendo tratada, bem como da avaliaçãodo médico assistente, levando em consideração fatores comoa gravidade da inflamação, da idade, peso e condição geraldo paciente, e semelhantes, com referência aos dados domodelo animal apropriado, como aqueles aqui apresentados.Métodos para se estimar dosagens humanas adequadas com basenesses dados são conhecidos na técnica (veja, por exemplo,Wagner, J.G. "Pharmacokinetics for the PharmaceuticalScientist". Technomic, Inc., Lancaster, PA 1993).
As composições administradas a um paciente estão naforma de composições farmacêuticas descritas acima. Essascomposições podem ser esterilizadas por técnicasconvencionais de esterilização, ou podem ser filtradas deforma estéril. As soluções aquosas resultantes podem serembaladas para uso imediato, ou Iiofilizadas, a preparaçãoliofilizada sendo combinada com um veiculo aquoso estéril,antes da administração.
A dosagem terapêutica dos compostos da presenteinvenção irá variar de acordo, por exemplo, com o uso emparticular para o qual o tratamento é feito, a forma deadministração do composto, a saúde e a condição dopaciente, e a avaliação do médico responsável pelaprescrição. Por exemplo, para administração intravenosa, a dose estará tipicamente na faixa de cerca de 20 pg a cercade 2.000 pg por quilograma de peso corporal,preferivelmente cerca de 20 pg a cerca de 500 pg, maispreferivelmente, cerca de 100 pg a cerca de 300 pg porquilograma de peso corporal. Faixas de dosagens adequadaspara administração intranasal são geralmente de cerca de0,1 pg a 1 mg por quilograma de peso corporal. Doseseficazes podem ser extrapoladas a partir de curvas de dose-resposta derivadas de sistemas de teste in vitro ou emmodelo animal.
Os compostos desta invenção também são capazes de seligar ou antagonizar as ações das integrinas α6βι, α9βι,α4β7, adP2# ciePi (embora α4βι e α9βχ sejam preferidas nestainvenção). Conseqüentemente, os compostos desta invençãotambém são úteis para a prevenção ou reversão dos sintomas,distúrbios ou doenças induzidos pela ligação dessasintegrinas aos seus respectivos ligantes.
Por exemplo, a Publicação Internacional Número WO98/53817, publicada em 3 de dezembro de 1998 (cujarevelação é aqui incorporada por referência em suatotalidade) e as referências nela citadas descrevemdistúrbios mediados por α4β7. Essa referência tambémdescreve um ensaio para determinação do antagonismo daligação dependente de α4β7 à proteína de fusão VCAM-Ig.
Adicionalmente, compostos que se ligam às integrinasαάβ2 e αεβ7 são particularmente úteis para o tratamento deasma e doenças pulmonares relacionadas. Veja, por exemplo,Μ. H. Grayson e cols. , J. Exp. Med. 1998, 188 (11) 2.187-2.191. Os compostos que se ligam à integrina αββ7 também sãoúteis para o tratamento de lúpus eritematoso sistêmico(veja, por exemplo, M. Pang e cols., Arthritis Rheum. 1998,41(8), 1.456-1.463); doença de Crohn, colite ulcerativa edoença inflamatória do intestino (DII) (veja, por exemplo,D. Elewaut e cols., Scand. J. Gastroenterol. 1998, 33(7)743-748); sindrome de Sjõgren (veja, por exemplo, U.Kroneld e cols., Scand. J. Gastroenterol. 1998, 27(3), 215-218) ; e artrite reumatóide (veja, por exemplo, Scand. J.Gastroenterol. 1996, 44 (3), 293-298), e compostos que seligam à αββι podem ser úteis na prevenção da fertilização(veja, por exemplo, H. Chen e cols., Chem. Biol. 1999, 6,1-10) .
Em outro aspecto da invenção, os compostos e ascomposições aqui descritos podem ser usados para inibir amigração de células imunológicas da corrente sangüínea parao sistema nervoso central no caso, por exemplo, deesclerose múltipla, ou para áreas que resultam nadestruição induzida por inflamação da mielina. Depreferência, esses reagentes inibem a migração de célulasimunológicas de um modo que inibe a desmielinização e aindapodem promover a remielinização. Os reagentes também podemevitar a desmielinização e promover a remielinização dosistema nervoso central para distúrbios metabólicoscongênitos nos quais a infiltração de células imunológicasafeta o desenvolvimento da bainha de mielina,principalmente no SNC. Os reagentes preferivelmente tambémreduzem paralisia quando administrados a um indivíduo comparalisia induzida por uma doença ou condiçãodesmielinizante.
Doenças inflamatórias que estão incluídas para otratamento pelas composições, compostos e métodos aquirevelados incluem geralmente condições relacionadas àdesmielinização. Histologicamente, as anormalidades demielina são desmielinizantes ou dismielinizantes. Adesmielinização implica na destruição de mielina. Adismielinização refere-se à formação ou manutençãodefeituosa da mielina causada por disfunção dosoligodendrócitos. De preferência, as composições e osmétodos aqui revelados são contemplados para o tratamentode doenças e condições relacionadas à desmielinização eauxiliam a remielinização. Doenças ou condições adicionaiscontempladas para o tratamento incluem meningite,encefalite e lesões da medula vertebral e condições quegeralmente induzem a desmielinização em conseqüência de umaresposta inflamatória.
As composições, os compostos e os coquetéis aquirevelados são contemplados para uso no tratamento decondições e doenças associadas à desmielinização. Asdoenças e condições que envolvem a desmielinização incluem,sem limitação, esclerose múltipla, distúrbios metabólicoscongênitos (por exemplo, fenilcetonúria, doença de Tay-Sachs, doença de Niemann-Pick, doença de Gaucher, síndromede Hurler, doença de Krabbe e outras leucodistrofias),neuropatias com mielinização anormal (por exemplo, GuillainBarré, polineuropatia desmielinizante imune crônica (PDIC),PDIC multifocal, síndrome anti-MAG, síndrome GALOP,síndrome do anticorpo anti-sulfatida, síndrome do anticorpoanti-GM2, síndrome POEMS, perineurite, síndrome doanticorpo IgM anti-GD lb) , desmielinização relacionada afármacos (por exemplo, causada pela administração decloroquina, FK506, perhexilina, procainamida e zimeldina),outras condições desmielinizantes hereditárias (porexemplo, glicoproteína deficiente em carboidratos, síndromede Cockayne, hipomielinização congênita, distrofia muscularcongênita, doença de Farber, síndrome de Marinesco-Sjõgren,leucodistrofia metacromática, doença de Pelizaeus-Merzbacher, doença de Refsum, condições relacionadas apríons, e doença de Salla), e outras condições ou doençasdesmielinizantes (por exemplo, meningite, encefalite oulesão da medula vertebral).
Há vários modelos de doença-que podem ser usados paraestudar essas doenças in vivo. Por exemplo, modelos animaisincluem, sem limitação:
Tabela 4
Modelo de doença Espécie
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A doença desmielinizante mais comum é a esclerosemúltipla, mas muitos outros distúrbios metabólicos einflamatórios causam mielinização deficiente ou anormal. AEM é uma doença neurológica crônica, que aparece no inícioda vida adulta e progride até uma incapacidadesignificativa, na maioria dos casos. Há aproximadamente350.000 casos de EM apenas nos Estados Unidos. Nãoconsiderando os traumas, a EM é a causa mais freqüente deincapacidade neurológica no início e meio da vida adulta.
A causa da EM ainda não foi determinada. Ela écaracterizada por inflamação crônica, desmielinização egliose (cicatrização). A desmielinização pode resultar emefeitos negativos ou positivos sobre a condução axonal. Asanormalidades positivas da condução incluem condução axonalmais lenta, bloqueio variável da condução que ocorre napresença de seqüências de impulsos de alta freqüência, masnão de baixa freqüência, ou bloqueio completo da condução.As anormalidades positivas da condução incluem geraçãoectópica de impulso, espontaneamente ou após estressemecânico, e ncross-talk" anormal entre éxonsdesmielinizados.
Observou-se que as células T reativas contra proteínasde mielina, tanto a proteína básica de mielina (MPB) quantoa proteína proteolipídica de mielina (PLP), medeiam ainflamação do SNC na encefalomielite alérgica experimental.Também se observou que os pacientes possuem níveis elevadosde imunoglobulina (Ig) no SNC. É ainda possível que algunsdos danos teciduais observados na EM sejam mediados porprodutos de citocina de células T ativadas, macrófagos ouastrócitos.
15 Hoje, 80% dos pacientes diagnosticados com EM vivem 20
anos após o surgimento da doença. Os tratamentos para a EMincluem: (1) tratamento dirigido à modificação da evoluçãoda doença, incluindo tratamento de exacerbações agudas, edirigido à supressão de longo prazo da doença; (2)20 tratamento dos sintomas da EM; (3) prevenção e tratamentode complicações médicas; e (4) gerenciamento dos problemaspessoais e sociais secundários.
0 surgimento da EM pode ser dramático ou tão discretoa ponto de fazer com que o paciente não procure atendimento25 médico. Os sintomas mais comuns incluem fraqueza em um oumais membros, turvação visual causada por neurite óptica,distúrbios sensoriais, diplopia e ataxia. A evolução dadoença pode ser classificada em três categorias gerais: (1)EM recidivada, (2) EM progressiva crônica, e (3) EM30 inativa. A EM recidivada é caracterizada por ataquesrecorrentes de disfunção neurológica. Os ataques da EMgeralmente duram dias a semanas, e podem ser seguidos porrecuperação completa, parcial, ou sem recuperação. Arecuperação dos ataques geralmente ocorre no intervalo desemanas a vários meses a partir do pico dos sintomas,embora raramente algum tipo de recuperação continue por 2ou mais anos.
A EM progressiva crônica resulta em piora gradualmenteprogressiva, sem períodos de estabilização ou remissão.Essa forma se desenvolve em pacientes com uma históriaprévia de EM recidivada, embora em 20% dos pacientes nãohaja relatos de recidivas. As recaídas agudas também podemocorrer durante a evolução progressiva.
A terceira forma é a EM inativa. A EM inativa écaracterizada por déficits neurológicos fixos de magnitudevariável. A maioria dos pacientes com EM inativa possui umahistória anterior de EM recidivada.
A evolução da doença também depende da idade dopaciente. Por exemplo, fatores prognósticos favoráveisincluem surgimento precoce (excluindo a infância), umaevolução em recidivas, e pouca incapacidade residual 5 anosapós o surgimento. Em contraste, um prognóstico ruim estáassociado ao surgimento em uma idade tardia (ou seja, aos40 ou mais) e uma evolução progressiva. Essas variáveis sãointerdependentes, na medida em que a EM progressiva crônicatende a começar em uma idade mais avançada do que a EMrecidivada. A incapacidade da EM progressiva crônica énormalmente causada por paraplegia progressiva ouquadriplegia (paralisia) nos pacientes. Em um aspecto dainvenção, os pacientes preferivelmente serão tratadosquando estiverem em remissão, e não em um estágio derecaída da doença.
0 uso por curto prazo de hormônio adrenocorticotrópicoou corticosteróides orais (por exemplo, prednisona oral oumetilprednisolona intravenosa) é a única medida terapêuticaespecífica para o tratamento de pacientes com exacerbaçãoaguda da EM.
As terapias mais novas para EM incluem o tratamento dopaciente com interferon beta-lb, interferon beta-la eCopaxone® (anteriormente conhecido como copolímero 1).Esses três fármacos demonstraram reduzir significativamentea taxa de recidiva da doença. Esses fármacos são auto-administrados por via intramuscular ou subcutânea.
No entanto, nenhuma das modalidades atuais detratamento inibe a desmielinização, isoladamente promove oupermite a remielinização espontânea, ou reduz a paralisia.Um aspecto da invenção contempla o tratamento de EM comagentes aqui revelados, tanto isoladamente quanto emcombinação com outras modalidades padronizadas detratamento.
Distúrbios metabõlicos congênitos
Os distúrbios metabólicos congênitos incluemfenilcetonúria (FCU) e outras aminoacidúrias, doença deTay-Sachs, doença de Niemann-Pick, doença de Gaucher,síndrome de Hurler, doença de Krabbe, e outrasleucodistrofias que interferem com o desenvolvimento dabainha, como descrito com mais detalhes abaixo.
A FCU é um erro hereditário do metabolismo causado poruma deficiência na enzima fenilalanina hidroxilase. A perdadessa enzima causa retardo mental, danos orgânicos, posturaincomum, e pode, em casos de FCU materna, comprometergravemente a gravidez. Foi descoberto um modelo para oestudo de FCU em camundongos. De preferência, os bebêsidentificados com FCU são mantidos em uma dieta semfenilalanina ou com redução de fenilalanina. Um aspecto dainvenção seria a combinação dessas dietas com os compostose as composições aqui reveladas para evitar adesmielinização e remielinizar as células danificadas pelaFCU.
A doença de Tay-Sachs clássica aparece no indivíduopor volta dos 6 meses de idade, e eventualmente resulta namorte do indivíduo por volta dos 5 anos de idade. A doençaé causada pela ausência da enzima hexoaminidase A (hex A) ,que é necessária para a degradação de certas substânciasgordurosas no cérebro e nas células nervosas. Essassubstâncias, na ausência da enzima, se acumulam e levam àdestruição das células nervosas. Outras formas dedeficiência da enzima hex A ocorrem em uma idade maisavançada, e são denominadas formas juvenis, crônicas e20 adultas de deficiência de hex A. Os sintomas são similaresàqueles que caracterizam a doença de Tay-Sachs clássica.Também existe uma forma de surgimento adulto da deficiênciada enzima. Atualmente, não há cura ou tratamento para adoença/deficiência, apenas a medida preventiva de testar o25 feto no útero quanto à doença. Dessa forma, os compostos eas composições aqui reveladas podem ser úteis na atenuaçãoou prevenção da destruição de células nervosas nessespacientes.
A doença de Niemann-Pick se divide em três categorias:3 0 a forma infantil aguda, o Tipo B, que é uma forma menoscomum, crônica, não neurológica, e o Tipo C, uma formabioquímica e geneticamente distinta da doença. Em umindivíduo normal, o colesterol celular é importado emlisossomos para processamento, após o qual é liberado. Foidemonstrado que células retiradas de indivíduos comNiemann-Pick apresentam defeitos na liberação de colesteroldos lisossomos. Isso leva a um acúmulo excessivo decolesterol dentro dos lisossomos, causando erros deprocessamento. Verificou-se que NPCi possui regiõesconhecidas sensíveis ao esterol similares àquelas em outrasproteínas, o que sugere sua participação na regulação dotráfego de colesterol. Não foram identificadas terapias bemsucedidas para as formas dos Tipos A e C de Niemann-Pick.Para o Tipo C, recomenda-se que os pacientes adotem umadieta pobre em colesterol. Dessa forma, os compostos e ascomposições aqui reveladas podem ser úteis na atenuação ouprevenção da destruição das células.
A doença de Gaucher é uma doença hereditária causadapor uma mutação gênica. Normalmente, esse gene éresponsável por uma enzima chamada glucocerebrosidase, aqual é necessária para que o corpo degrade a gordura,glucocerebrosídeo. Em pacientes com doença de Gaucher, ocorpo não é capaz de produzir adequadamente essa enzima, ea gordura não pode ser degradada. Da mesma forma que adoença de Tay-Sachs, a doença de Gaucher éconsideravelmente mais comum nos descendentes de pessoasjudias do leste europeu (Ashkenazi), embora indivíduos dequalquer grupo étnico possam ser afetados. Dentre apopulação judia Ashkenazi, a doença de Gaucher é odistúrbio genético mais comum, com uma incidência deaproximadamente uma em cada 450 pessoas. No público emgeral, a doença de Gaucher afeta aproximadamente uma emcada 100.000 pessoas.
Em 1991, tornou-se disponível uma terapia de reposiçãoda enzima como o primeiro tratamento eficaz para a doençade Gaucher. 0 tratamento consiste em uma forma modificadada enzima glucocerebrosidase administrada por viaintravenosa. Contempla-se que as composições e os compostosaqui revelados podem ser usados isoladamente ou, depreferência, em combinação com a administração deglucocerebrosidase para o tratamento da doença em umapessoa com a doença.
A síndrome de Hurler, também conhecida comomucopolissacaridose do tipo I, é uma classe de doençassuperpostas. Essas doenças genéticas dividem em comum oacúmulo celular de mucopolissacarídeos em fibroblastos. Asdoenças são geneticamente distinguíveis. O transplante defibroblastos e de medula óssea não parece ser útil e, dessaforma, são necessários compostos e composições úteis naatenuação da gravidade e progressão da doença. Os compostose as composições aqui reveladas podem ser administrados aum indivíduo para atenuar a progressão e/ou a gravidade dadoença.
A doença de Krabbe (também conhecida como25 leucodistrofia de células globóides) é uma condiçãoautossômica recessiva causada por deficiência degalactosilceramidase (ou galactocerebrosidase), uma enzimalipossômica que cataboliza um componente lipídicoimportante da mielina. Estima-se que a incidência na França30 seja de 1:150.000 nascimentos. A doença leva àdesmielinização do sistema nervoso central e periférico. 0surgimento geralmente ocorre durante o primeiro ano devida, e a condição é rapidamente progressiva, mas formasjuvenis, adolescentes ou adultas também foram relatadas,com uma taxa de progressão mais variável. 0 diagnóstico éestabelecido por um ensaio enzimático (deficiência degalactosilceramidase). Há vários modelos animais naturais(camundongo, cachorro, macaco). A doença de Krabbe, comotodas as leucodistrof ias, não tem cura ou tratamentoseficazes conhecidos. Uma modalidade da presente invençãoconsiste na utilização das composições e dos compostos aquirevelados para tratar ou atenuar a doença de Krabbe eoutras leucodistrofias.
As leucodistrofias são um grupo de distúrbiosprogressivos geneticamente determinados que afetam océrebro, a medula vertebral e os nervos periféricos. Elaspodem incluir adrenoleucodistrofia (ALD),adrenomieloneuropatia (AMN), síndrome de Aicardi-Goutiers,doença de Alexander, CACH (ou seja, ataxia infantil comhipomielinização do sistema nervoso central ou doença dodesaparecimento da substância branca), CADASIL (ou seja,arteriopatia cerebral autossômica dominante com infartossubcorticais e leucoencefalopatia), doença de Canavan(degeneração esponjosa), Xantomatose Cerebrotendinosa(CTX), doença de Krabbe (discutida acima), leucodistrofiametacromática (MLD), adrenoleucodistrofia neonatal,síndrome de ovário-leucodistrofia, doença de Pelizaeus-Merzbacher (paraplegia espástica ligada ao X), doença deRefsum, síndrome de van der Knaap (leucodistrofiavacuolizante com cistos subcorticais), e síndrome deZellweger. Nenhuma das doenças possui cura através detratamentos isolados eficazes. Conseqüentemente, sãonecessários meios de tratamento ou atenuação dos sintomasda doença, por exemplo, pela utilização das composições edos compostos aqui revelados.
Neuropatias com mielinização anormal
Há várias polineuropatias imunes crônicas que causamdesmielinização no paciente. A idade de surgimento dascondições varia de acordo com a condição. Existemtratamentos padronizados para essas doenças, e essespoderiam ser combinados com as composições' e os compostosaqui revelados. Alternativamente, as composições e oscompostos revelados podem ser usados isoladamente. Asterapias padronizadas incluem as seguintes:
Tabela 5
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Desmielinização induzida por fármacos e radiação
Certos fármacos e radiação podem induzir adesmielinização nos indivíduos. Fármacos responsáveis peladesmielinização incluem, sem limitação, cloroquina, FK506,perhexilina, procainamida e zimeldina.
A radiação também pode induzir desmielinização.Acredita-se que a toxicidade do sistema nervoso central(SNC) seja causada por: (1) lesão de estruturas vasculares,(2) eliminação de progenitores de oligodendrÓcito-2astrócito e oligodendrócitos maduros; (3) eliminação depopulações de célula-tronco neurais no hipocampo, cerebeloe córtex, e alterações generalizadas da expressão decitocina. A maioria das lesões por radiação é causada porradioterapias administrada durante o tratamento de certoscânceres. Para uma revisão sobre o tema, veja Belka ecols. , 2001 Br. J. Câncer 85: 1.233-9. No entanto, aexposição à radiação também pode ser um problema paraastronautas (Hopewell, 1994 Adv. Space Res. 14: 433-42),bem como no caso de exposição às substâncias radioativas.
Pacientes que receberam fármacos ou que foram expostosacidental ou intencionalmente à radiação podem sebeneficiar com a administração de um dos compostos ou dascomposições aqui reveladas para evitar a desmielinização oupara promover a remielinização.
Condições que envolvem a desmielinização
Síndromes/doenças hereditárias adicionais que causamdesmielinização incluem a síndrome de Cockayne,hipomielinização congênita, doença de Farber,leucodistrofia metacromática, doença de Peliszaeus-Merzbacher, doença de Refsum, condições relacionadas apríons e doença de Salla.
A síndrome de Cockayne (SC) é um distúrbio hereditárioraro no qual as pessoas são sensíveis à luz solar, possuembaixa estatura e têm a aparência envelhecida prematuro. Naforma clássica da síndrome de Cockayne (Tipo I), ossintomas são progressivos e tipicamente se tornam evidentesapós a idade de um ano. Um surgimento precoce ou a formacongênita de síndrome de Cockayne (Tipo II) é aparente aonascimento. Curiosamente, diferentemente de outras doençasdo reparo do DNA, a síndrome de Cockayne não está ligada aocâncer. A SC é um distúrbio multissistêmico que causa tantofalhas profundas do crescimento do soma e do cérebro quantocaquexia progressiva, degeneração retiniana, coclear eneurológica, com uma leucodistrofia e neuropatiadesmielinizante, sem um aumento da incidência de câncer.Após exposição ao UV (por exemplo, luz solar) , osindivíduos com síndrome de Cockayne não conseguem realizaro reparo acoplado à transcrição. Até agora, foramidentificados dois genes defeituosos na síndrome deCockayne, CSA e CSB. O gene CSA é encontrado no cromossomo
Ambos os genes codificam proteínas que interagem comcomponentes do maquinário da transcrição e com proteínas dereparo do DNA.
Até hoje, não foram identificadas curas ou tratamentoseficazes para pacientes com essa doença. Dessa forma, umaspecto da invenção consiste no tratamento dessa doença comos compostos e as composições aqui revelados.
A hipomielinização congênita tem vários nomes,incluindo neuropatia dismielinizante congênita,polineuropatia por hipomielinização congênita,hipomielinização congênita ("bulbo de cebola"),polineuropatia, neuropatia por hipomielinização congênita,neuropatia congênita causada por hipomielinização,neuropatia por hipomielinização e CHN. Neuropatiasperiféricas hereditárias, dentre os distúrbios genéticosmais comuns em humanos, são um grupo complexo, clínica egeneticamente heterogêneo, de distúrbios que produzemdeterioração progressiva dos nervos periféricos. Ahipomielinização congênita é um de um grupo de distúrbios.Esse grupo inclui neuropatia hereditária com probabilidadede paralisias por pressão, doença de Charcot-Marie-Tooth,síndrome de Dejerine-Sottas, e neuropatia porhipomielinização congênita. Não há curas ou tratamentoseficazes conhecidos para nenhum desses distúrbios.A doença de Farber tem vários nomes, incluindo:lipogranulomatose de Farber, deficiência de ceremidase,deficiência de ácido ceramidase, deficiência AC,deficiência de N-Iaurilesfingosina deacilase e N-acilesfingosina amidohidrolase. Como certos nomes revelam,a doença ocorre por causa de uma deficiência de ácidoceramidase (também conhecida como N-acilesfingosinaamidohidrolase, ASAH). A ausência da enzima resulta em umacúmulo de mucopolissacarideo ácido não sulfonado nosneurônios e nas células gliais. Os pacientes com a doençanormalmente morrem antes dos 2 anos de idade.
A leucodistrofia metacromática (MLD) é um distúrbiogenético causado por uma deficiência da enzimaarilsulfatase A. É de um grupo de distúrbios genéticosdenominados «leucodistrofias" que afetam o crescimento dabainha de mielina. Há três formas de MLD: infantil tardia,juvenil e adulta. Na forma late infantil tardia, que é amais comum, o surgimento de sintomas começa entre 6 meses e2 anos de idade. O bebê é habitualmente normal aonascimento, mas eventualmente perde as habilidadesadquiridas previamente. Os sintomas incluem hipotonia(baixo tônus muscular), anormalidades da fala, perda dashabilidades mentais, cegueira, rigidez (ou seja, forçamuscular descontrolada), convulsões, deglutição alterada,paralisia e demência. Os sintomas da forma juvenil começamentre 4 e 14 de idade, e incluem desempenho escolardeficiente, deterioração mental, ataxia, convulsões edemência. Na forma adulta, os sintomas, que começam após os16 anos de idade, podem incluir déficit de concentração,depressão, alterações psiquiátricas, ataxia, tremor edemência. As convulsões podem ocorrer na forma adulta, massão menos comuns nas outras formas. Em todas as trêsformas, a deterioração mental é normalmente o primeirosinal.
A doença de Peliszaeus-Merzbacher (também conhecidacomo leucodistrofia perinatal sudanofílica) é um distúrbiogenético ligado ao X que causa uma anormalidade de umaproteína proteolipídica. A anormalidade causa a morte dobebê, tipicamente antes de um ano de idade. Não hátratamentos ou curas conhecidas para a doença.
A doença de Refsum (também conhecida como deficiênciade ácido fitânico oxidase, heredopatia atáticapolineuritiforme ou neuropatia motora e sensorialhereditária IV, HMSN IV) é causada por mutações no gene quecodifica fitanoil-CoA hidroxilase (PAHX ou PHYH). Ascaracterísticas clínicas principais são retinitepigmentosa, polineuropatia crônica e sinais cerebelares. Oácido fitânico, um ácido graxo de cadeia ramificada incomum(ácido 3,7,11,15-tetrametil-hexadecanóico) se acumula nostecidos e fluidos corpóreos de pacientes com a doença, e éincapaz de ser metabolizado em função da ausência de PAHX.
A plasmaferese realizada uma ou duas vezes ao mês removeeficazmente o ácido do corpo e permite a liberalização derestrições dietéticas que limitam a ingestão de ácidofitânico.
Condições relacionadas a príons incluem doença deGerstmann-Straussler (GSD), doença de Creutzfeldt-Jakob(CJD), insônia familiar fatal. Isoformas aberrantes daproteína de príon podem atuar como agentes infecciososnesses distúrbios, além de kuru e scrapie (uma doençaencontrada em carneiros). 0 termo "príon" deriva de "agenteinfeccioso protéico" (Prusiner, Science 216: 136-44, 1982).Há uma clivagem proteolítica da proteína relacionada aopríon (PRP) que resulta em um peptídeo amiloidogênico quese polimeriza em fibrilas insolúveis.
A doença de Salla e outros tipos de sialúrias sãodoenças que envolvem problemas com a estocagem de ácidosiálico. São distúrbios neurodegenerativos autossômicosrecessivos que podem se apresentar como uma forma infantilgrave (ou seja, ISSD) ou como uma forma adulta lentamenteprogressiva que é prevalente na Finlândia (ou seja, doençade Salla). Os sintomas principais são hipotonia, ataxiacerebelar e retardo mental. Essas condições e doençastambém são contempladas para tratamentos paliativos ouatenuantes.
Outras condições que causam desmielinização incluemencefalite pós-infecciosa (também conhecida comoencefalomielite aguda disseminada, ADEM), meningite elesões da medula vertebral. As composições e os compostosaqui revelados também são contemplados para uso notratamento dessas outras condições desmielinizantes.
Os exemplos sintéticos e biológicos a seguir sãooferecidos para ilustrar esta invenção, e não devem serconsiderados de forma alguma como limitantes do escopodesta invenção. A menos que especificado de formadiferente, todas as temperaturas estão em graus Celsius.
EXEMPLOS
Nos exemplos abaixo, as seguintes abreviações possuemas definições a seguir. Caso uma abreviação não sejadefinida, ela possui seu significado geralmente aceito.<table>table see original document page 77</column></row><table><table>table see original document page 78</column></row><table>ug = microgramas
μm = microns
μΜ = micromolar
Métodos gerais. Cromatografia instantânea (flash) foirealizada com o uso de um Biotage Flash 75L, usando 800 gde cartuchos de silica KP-Sil (32-63 μΜ, 60 Â, 500-550m2/g). Os Rf são relatados para TLC analítica, com o uso deSilica Gel 60 F (254) da EM Sciences, placas com espessurade 250 μΜ para fase normal. Os espectros de RMN foramobtidos em um espectrômetro Varian Gemini de 300 MHz (3 00MHz para espectros 1H e 75 MHz para espectros 13C). HPLCanalítica foi realizada em um HPLC Agilent Série 1100 comum Phenomenex Luna, de 3 μτη, coluna C-18, de 30 χ 4.6 mm. 0detector era de UV a 210 nm. Os solventes foram TFA 0,1% emágua e TFA 0,1% em acetonitrila. A taxa de fluxopadronizada foi de 1,5 ml/min, e no método-padrão ogradiente de solvente foi alterado de CH3CN 20% para CH3CN70% ao longo de 2,33 minutos. Um segundo método alternativotinha uma taxa de fluxo de 2 ml/min e uma mudança degradiente de CH3CN 20% para CH3CN 70% ao longo de 1,75minuto. Um terceiro método tinha uma taxa de fluxo de 1,5ml/min com a composição de solvente mudando de CH3CN 20%para CH3CN 70% ao longo de 10 minutos, mantido em 7 0% por 2minutos, depois se elevando até 95% por 1 minuto, emantendo em 95% por 2 minutos. LC/MS foi realizada em umaHPLC Agilent Série 1100 com um MSD Série 1100 com ionizaçãopor eletrospray (a menos que indicado de forma diferentecomo ionização química). A coluna e as condições combinavamcom a HPLC auto-suficiente. 1H RMN de amidas tipicamentemostram rotâmeros, e a integração de alguns picos érelatada em valores fracionados de prótons.
Exemplo 1
Preparação de N- [2-dietilamino-5-{N-etil-N-(furan-3-ilcarbonil) amino}pirimidin-4-il] -L-4 -{ (pirrolidin-1-il)carbonilóxi}fenilalanina
<formula>formula see original document page 80</formula>
Etapa 1: Preparação de éster terc-butílico de N- [2-dietilamino-5-{N-amino}pirimidin-4-il] -L-4'-{ (pirrolidin-1-il)carbonilóxi}fenilalanina 2.
<formula>formula see original document page 80</formula>
Uma mistura de nitropirimidina-carbamato 1 (160,25 g,0,3035 mol; preparada como em WO 03/099809) e Pd/C 5% (15g, 50/50 p/p com H2O, Degussa E 101 R/W) em solução THF-água (1 litro de THF e 50 ml de H2O) foi agitada sob 413,68kPa de hidrogênio em temperatura ambiente. Após 22 horas,TLC (EtOAc 50%/hexanos em sílica gel) mostrou 100% deconversão em produto. A mistura de reação foi filtradaatravés de um absorvente de celite (200 ml) . 0 frasco dehidrogenação e o absorvente de celite foram enxaguados comTHF anidro fresco (500 ml) , para gerar uma solução dofiltrado verde. O filtrado foi concentrado in vácuo paragerar o produto bruto como um óleo pegajoso pretoesverdeado. O evaporador rotatório foi descarregado sob N2,e THF anidro fresco (600 ml) foi adicionado. A solução foiconcentrada in vácuo, e descarregada sob nitrogênio (oprocesso de dissolução em THF anidro fresco e concentraçãofoi repetido duas vezes mais para remover de formaazeotrópica água residual) . Esse material é usadoimediatamente na Etapa 2 por causa da sensibilidadeaparente ao ar. m/z = 499,5 for [M+l]+ para o produtodesejado.
Etapa 2: Preparação de éster terc-butílico de N-[2-dietilamino-5-{N-trifluoracetilaminojpirimidin-4-il]-L-4 ' -{(Oirrolidin-l-il)carbonilóxi}fenilalanina 3.
<formula>formula see original document page 81</formula>o carbamato de aminopirimidina bruto 2 da Etapa 1 foidissolvido em 6 00 ml de THF anidro. A solução foi resfriadaaté 0°C sob nitrogênio. Anidrido trifluoracético (45,5 ml,1,51 g/ml, 327 3 mmol) foi adicionado lentamente â soluçãogelada de amina por meio de uma bomba de seringa ao longode 45 minutos. Permitiu-se que a solução aquecesse até atemperatura ambiente, e ela foi agitada de um dia para ooutro. TLC (EtOAc 40% em Hexanos, sílica gel) indicou que areação estava essencialmente completa. A análise por LC/MSconfirmou a reação, e não mostrou nenhum material departida. A reação foi diluída com acetato de etila (1,4litro) e foi lavada com uma mistura de água (400 ml) eNaHCO3 aquoso saturado (700 ml, 0°C) . A solução orgânicafoi lavada com salmoura (700 ml) e seca sobre MgSO4 (105 g)para gerar uma solução marrom-castanha. A solução seca foifiltrada através de um absorvente de sílica gel (400 ml)para gerar uma solução cinza esverdeada (a impureza de corcastanha foi retida na sílica gel). A sílica gel foienxaguada com EtOAc (400 ml). A solução do filtrado foiconcentrada in vácuo, e o frasco foi descarregado sobnitrogênio para minimizar a exposição ao oxigênio. Foiacrescentado tolueno anidro (600 ml). A solução foiconcentrada in vácuo e foi submetida à azeotropia umasegunda vez por tolueno anidro (400 ml), para gerar um óleopegajoso preto esverdeado. O frasco foi descarregado sobN2. Esse produto bruto, m/z = 595,5 para [M+l]+, foiencaminhado à Etapa 3.
Etapa 3: Preparação de éster terc-butílico de N-{2-dietilamino-5- {N-etil-N-trifluoracetilamino}pirimidin-4-il] -L-4 ' - { (pirrolidin-lil) carbonilôxi} fenilalanina 4.
<formula>formula see original document page 82</formula>
0 carbamato de trifluoracetamidopirimidina bruto 3 daEtapa 2 foi dissolvido em DMF (350 ml) . Carbonato depotássio sólido anidro (79,6 g, 575,7 mmol moído até um pófino com um pilão e almofariz, e depois colocado em umforno a vácuo a 110°C sob vácuo de 711,20 mmHg de um diapara o outro) foi adicionado. Iodeto de etila (46,5 ml,89,8 g, 575,7 mmol) foi adicionado rapidamentetemperatura ambiente. O frasco de reação foi tampadofirmemente, e o caldo foi agitado vigorosamente. Apósagitação em temperatura ambiente por 20 horas, a reação foitestada (TLC, LC/MS) . A reação foi agitada por mais 18horas para assegurar o término da reação. Novamente, areação foi testada e um pequeno exame foi realizado, noqual a análise por TLC indicou o consumo do material departida. A reação foi diluída com 2,7 litros de acetato deetila e foi agitada vigorosamente. 0 caldo foi filtradoatravés de papel de filtro Whatman #1 para a remoção deK2CO3 sólido. A solução orgânica foi colocada em um funilde separação de 6 litros. Água (2,5 litros) foi adicionadae misturada vigorosamente. As camadas foram separadaslentamente, depois foi acrescentada (200 ml) para quebrar aemulsão. A camada orgânica foi lavada com mais 1 litro deágua, e depois com 2 litros de salmoura.
A camada orgânica foi seca sobre MgSO4 (50 g) e Na2SO4(200 g) . A solução seca orgânica foi filtrada através de umtampão de sílica gel (700 ml) para obter uma solução turvade cor verde-oliva acastanhada (uma impureza de baseroxa/vermelha foi removida) . A sílica gel foi enxaguada comEtOAc (800 ml) . A solução orgânica foi concentrada paragerar um sólido verde-oliva (194,3 g, 103% do bruto).Hexano (300 ml) foi adicionado. As laterais do frasco foramraspadas com uma espátula de metal para soltar o produtosólido, e uma barra de agitação magnética foi adicionada aofrasco. A mistura foi girada lentamente por 3 0 minutos paraquebrar os pedaços sólidos, e depois rapidamente por 30minutos, até que se formasse um caldo fino. 0 caldo foifiltrado através de papel de filtro Whatman #1, e oprecipitado foi enxaguado com hexano (1,2 litro), paragerar um sólido branco (141 g, 74% de rendimento, 92% puropor LC/MS) . 0 filtrado foi concentrado para gerar uma gomaverde acastanhada (33,3 g) , a qual, através de análise porTLC, contém um pouco do produto desejado.
1H RMN (CDCl3, 300 MHz) δ, ppm: 7,80 (d aparente, 1H) ,7,18 (d aparente, AA1XX', 2H), 7,03 (dd aparente, ΑΑ'ΧΧ·,2H) , 5,00 (d aparente, 1H) , 4,80 (dq aparente, 1H) , 3,95(dsexteto aparente, 1H) , 3,4-3,7 (m, 8,5H), 3,0-3,3 (m,3H) , 2,78 (sexteto, 0,7H), 1,93 (ΑΑ'ΒΒ·, 4H) , 1,38 (daparente, 9H) , 1,24-1,05 (m, 9H) . A 1H RMN mostrarotâmeros, o que é evidenciado pela duplicação da maioriados picos.
13C RMN (CDCl3, 75 MHz) δ, ppm: 166,5, 166,3, 155,6,152,7, 150,9, 146,0, 145,9, 128,7, 128,3, 125,44, 125,39,117,18, 77,66, (72,82, 72,28, 71,97 - CDCl3), 50,23, 49,74,41,72, 41,64, 40,16, 39,90, 37,28, 32,60, 32,44, 23,24,23,17, 21,05, 20,23, 8,50, 8,47, 7,32.
Etapa 4: Preparação de éster terc-butílico de N-[2-dietilamino-5-{N-etilamino}pirimidin-4-il]-L-4 ' -{(pirrolidin-l-il)carbonilóxi}fenilalanina 5.
ΓΛ
S
A trifluoracetamida 4 (14 0 g) foi suspensa/dissolvidaem metanol (1,6 litro). Uma solução aquosa de carbonato depotássio (K2CO3 7%) (480 ml) foi adicionada (atrifluoracetamida se precipitou parcialmente e formou umgel) . O frasco de reação foi reduzido em um banho-maria a55°C. A solução foi misturada a 55°C, com monitoramento porTLC, ao longo de 9 horas. A reação foi concentrada in vácuomuito cuidadosamente, até que 1,2 litro de metanol fossecoletado. A solução foi diluída com água (200 ml) esalmoura (600 ml) , e foi extraída com EtOAc (2 litros) paragerar uma solução de cor laranja. A camada de EtOAc foilavada com água (1 litro), e depois salmoura (400 ml) . Cadauma das três camadas aquosas/lavagens foi extraída de voltaem ordem seqüencial com um único litro de EtOAc, para obteruma solução amarelo brilhante. Os extratos orgânicos foramcombinados e secos sobre MgSO4 (126 g). A solução orgânicaseca foi filtrada através de um absorvente de aluminabásica (3 00 ml), e concentrada in vácuo para gerar uma gomamarrom. Após azeotropia por 600 ml de tolueno, um sólidoavermelhado (117,1 g) foi obtido.
Etapa 5: Preparação de éster terc-butílico de N-[2-dietilamino - 5 -{N-eti1 -N-(furan-3-ilcarboni1)amino}pirimidin-4 -il]-L-4'-{(pirrolidin-l-il)carbonilóxi}
A amino- pirimidina 5 (117,1 g, 222,2 mmol) foidissolvida em THF anidro (1,5 litro). Base de Hunig,diisopropiletil amina, (115 ml, 3 eq. , 666,6 mmol) foiadicionada. A solução foi resfriada até 0°C sob N2. 0frasco de reação foi equipado com um funil de adição para
fenilalanina 6.
6igualar a pressão, e o funil de adição foi carregado comuma solução de cloreto de 3-furoila (32 g; Yamamoto &Maruoka; J. Am. Chem. Soc., 1981, 103, 6.133-6.136) em THF(90 ml) . A solução de cloreto de furoila foi adicionadalentamente à solução gelada de amina ao longo de duashoras. Permitiu-se que a reação atingisse lentamente atemperatura ambiente, e ela foi agitada por 36 horas. Areação foi diluída com EtOAc (2 litros) e lavada duas vezescom 0,2 N de ácido citrico (1,2 litro e 1,0 litro), uma vezcom salmoura (1,8 litro), e uma vez com NaHCO3 aquososaturado (1,3 litro). A solução orgânica de cor laranja-rosa brilhante foi seca sobre Na2SO4 (250 g) e MgSO4 (51 g) .A solução seca foi filtrada através de um absorvente desílica gel (1 litro), e o frasco e a sílica foramenxaguados com EtOAc (1 litro). A solução foi concentradain vácuo. Durante o processo de evaporação, cristalizou-seum sólido branco. Após a solução estar totalmenteconcentrada, foi obtido um sólido da cor laranja, rosa ebranca. Foram acrescentados éter (4 00 ml) e hexanos (500ml) . 0 caldo foi misturado cuidadosamente, e filtradoatravés de papel de filtro Whatman #1, para obter um sólidode coloração pêssego-rosa e um filtrado vermelho brilhante.0 precipitado foi enxaguado com hexanos (500 ml), éter (800ml) , e novamente hexanos (4 00 ml) , para obter um sólido decoloração pêssego-alaranjada. 0 filtrado e os enxágüesforam combinados, concentrados, e colocados de lado paraserem usados posteriormente. 0 sólido foi seco em um fornoa vácuo a 60°C por dois dias, sob um vácuo de 711,20 mmHg(49 Torr), para gerar 100,0 g. LC/MS mostrou que o sólidoera 92% puro. 0 éster bruto 6 foi submetido à cromatografiaem 2 litros (1 kg) de sílica gel que havia sido embaladacom 3 litros de CH2Cl2. 0 éster do produto de cor depêssego foi dissolvido em CH2Cl2 (200 ml) e foi aplicado àcoluna de sílica de 2 litros. A coluna foi eluída comCH2Cl2 (3 litros) , EtOAc 50% em hexanos (4 litros) e EtOAc75% em hexanos (4 litros) . Em poucos minutos, éster doproduto desejado começou a se cristalizar de várias dasfrações de EtOAc-hexano. As frações que foram constatadaspuras por TLC foram concentradas, para gerar um sólidobranco (82,5 g, pureza >99% por LC/MS). Esse material purofoi encaminhado à etapa final de desproteção. As fraçõesque se mostraram por TLC contaminadas foram combinadas como resíduo dos enxágües originais de filtrado/hexano e éter.Esse material foi submetido à cromatografia instantânea deforma simular àquela descrita acima, para gerar um sólidocom coloração ligeiramente de pêssego (13,2 g; m/ζ = 621,5para [M+l] +) .
1H RMN (CDCl3, 300 MHz) δ, ppm: 7,58 (d aparente, 1H) ,7.35-6.90 (AB aparente superposto com ABX, 6H) , 6,45 (daparente, IH) , 5,25 (d aparente, IH) , 4,85 (dq aparente,1H) , 4.05 (octeto aparente, 1H) , 3,7-3,4 (m, 8H), 3,0-3,3(m, 2,5H), 2,90 (sexteto, 0,5H), 1,93 (ΑΑ'ΒΒ', 4H), 1,38 (daparente, 9H) , 1,24-1,05 (m, 9H) . A 1H RMN mostrarotâmeros, o que é evidenciado pela duplicação da maioriados picos.
Etapa 6. Preparação de N- [2-dietilamino-5- {N-etil-N- (furan-3-ilcarbonil) amino)pirimidin-4-il] -L-4 ·-{ (pirrolidín-1-il)carbonilõxi}fenilalanina.
Ao éster t-butílico 6 da Etapa 5 (82,5 g, 132,7 mmol),foi adicionado ácido fórmico (2 litros). A soluçãoresultante foi aquecida até 50°C de um dia para o outro. Aanálise por TLC verificou a reação completa, e a soluçãofoi concentrada in vácuo. Água (-200 ml) foi adicionada aoproduto bruto, e a mistura foi concentrada até seca. Mais150 ml de água foram acrescentados, e o produto bruto foiconcentrado in vácuo novamente. O produto sólido brancobruto foi concentrado por iPrOH, e duas vezes por THFanidro, e depois seco no evaporador rotatório a 45°C e 35-40 mbar (26-30 Torr) de um dia para o outro, para obter 90g de sólido branco. LC/MS mostrou que o produto bruto era97,7% puro.
1H RMN (CD3OD, 300 MHz) δ, ppm: 7,65 (s, 0,55H), 7,45(s, 0,45H), 7,38 (m, 2H), 7,25(d, 1,3H), 7,18 (d, 1H), 7,05(d, 1,2η), 6,90 (d, 1H), 6,55 (s, 0,55H), 6,22 (s amplo,0,45H), 4,9-4,8 de pico de solvente residual superposto compico da amostra, 4.10 (septeto aparente, 1,1H), 3,7 (m,3,3H), 3,58 (m, 7H) , 3,45-2,9 (in, 6H) , 2,78 (sextetoaparente, 0,7H), 1,90 (AA1BB1 , 4,5H), 1,85 (m, 3,16H),1,23-1,0 (m, 10,3H).
13C RMN (CD3OD, 75 MHz) δ, ppm: 169,6, 169,2, 160,8,153,9, 153,6 148,8, 145,8, 145,2, 145,1, 140,7, 140,5,138,0, 137,9, 130,3, 130,2, 124,7, 124,6, 116,5, 116,4,116,2, 116,1, 106,9, 106,6, 105,1, 105,0, 62,4, 50,7, 50,1,41,0, 37,9, 37,2, 30,5, 20,2, 20,0, 19,4, 6,9, 6,8, 6,1,5,9.
Os Exemplos 2-7 abaixo foram preparados de formasimilar ao Exemplo 1.
Exemplo 2
Preparação de ácido (S)-2-(2-(dietilamino)-5-(N-etil-2,2,2-trifluoracetamido)pirimidin-4-ilamino) -3- (4- (pirrolidina-1-carboxiloiloxi)fenil)propanõico
<formula>formula see original document page 89</formula>
1H RMN (300 MHz, CD3OD) δ 1,03 (1,5 Η, t; J = 7,2 Hz),1,10-1,28 (7, 5H, m) , 1,98 (4H, m) , 2,67-2,85 (0,5 H, m) ,2,90-3,05 (0,5 H, m) , 3,05-3,38 (2H, m, superposto comCD3OD), 3,41 (2H, m) , 3,58 (6H, m) , 3,90-4,11 (1H, m) ,4,85-4,90 (1H, superposto com CD3OD), 7,02 (2H, m) , 7,26(2H, m), 7,66 (1H, d,J = 8,7 Hz).
HPLC/EM: MH+ = 567,1.Exemplo 3
ilcarbonil)amino}pirimidin-4-il] -L-4'-{(pirrolidin-1-il)carbonilóxi}fenilalanina
1H RMN (300 MHz, CDCl3) δ 1,09-1,17 (3H, m) , 1,23-1,26(3H, m), 1,47 (12H, m) , 1,87-1,99 (4H, m) , 2,80 (0,4H, brs), 3,10 (1,6H, m), 3,20 (1H, m), 3,44 (2H, t,J = 6,0 Hz),3,54 (2H, t, J = 6,0 Hz), 3,88-4,15 (3H, m), 4,80-4,85 (1H,m) , 6,48 (0, 6H, br s) , 6,75 (0,4H, s) , 6,69-7,08 (5H, m) ,7,41 (1H, s), 7,50 (1H, s), 7,78 (0,4 H, br s), 7,85 (0,6H,br s) .
HPLC/EM: MH+ = 637,2.Etapa 2:
de N- [2-dietilamino-5-{N-etil-N-(tien-2-<formula>formula see original document page 90</formula>
1H RMN (300 MHz, CDCl3) δ 0,90 (3H, t, J = 6,9 Hz),1,10-1,30 (6H, m) ; 1,85-1,94 (4H, m) , 2,85-3,24 (2,4H, m) ,3,35 (8,6H, m) , 4,00-4,15 (1H, m) , 4,55 (0,4H, br s) , 4,73(0,6H, br s), 5,85 (0,6H, d,J = 5,7 Hz), 5,87 (0,4H, brs), 6,60-7,12 (5,4H, m), 7,39 (1H, m), 7,60-7,68 (1,6H, m).
HPLC/EM: MH+ = 581,2.
Exemplo 4
Preparação de N-[2-dietilamino-5-{N-etil-N-(tien-3-ilcarbonil)amino}pirimidin-4-il]-L-41-{(pirrolidin-l-il)carbonilóxi}fenilalanina
<formula>formula see original document page 90</formula>
1H RMN (300 MHz, CDCl3) δ 1,07-1,27 (9H, m) , 1,40 (9H,s), 1,90 (4H, m), 3,05-3,24 (3H, m) , 3,43-3,64 (8H, m) ,4,73-4,95 (1H, m) , 5,22 (1H, m) , 6,95-7,14 (7H, m) , 7,41(0,4H, s), 7,50 (0,6H, s)
HPLC/EM: MH+ = 637,2.
Etapa 2:1H RMN (300 MHz, CDCl3), δ 0,70-1,4 (9Η, m) , 1,81-2,08(4Η, m) , 2,62-4,10 (12Η, πι), 4,95 (1Η, br s) , 6,90-8,07(8Η, m).
HPLC/EM: MH+ = 581,2.
Exemplo 5
Preparação de N- [2-dietilamino-5-{N-etil-N-(furan-2-ilcarbonil)amino}pirimidin-4-il] -L-4'-{(pirrolidin-1-il)carbonilóxi}fenilalanina
Etapa 1:
<table>table see original document page 91</column></row><table>
EfeN,DPMP1 DGM
1H RMN (300 MHz, CDCl3) δ 1,15-1,28 (9H, m) , 1,37(3,6H, s), 1,42 (5,4H, s) , 1,93- 2,05 (4H, m) , 2,85-3,15 (2H, m), 3,19-3,35 (1 H, m) , 3,45-3,75 (8H, m) , 3,90-4,15(1H, m) , 4,76-4,85 (0,4H, m) , 4,90-5,00 (0,6H, m) , 5,15-5,22 (1 H, m), 6,20-6,40 (2H, m) , 6,91-7,18 (4H, m) , 7,39(1 H, S), 7,58 (0,4H, s), 7,65 (0,6H, s).HPLC/EM: MH+ = 621,3.
Etapa 2:
<formula>formula see original document page 91</formula>
1H RMN (300 MHz, CD3OD) δ 0,84-1,25 (9H, m) , 1,85-1,92(4H, m) , 2,70-2,81 (0,5H, m) , 2,92-3,30 (2,5 H, m,superposto com CD3OD), 3,30-3,38 (2H, m) , 3,45-3,59 (6H,m), 4,04-4,12 (1 Η, τη), 4,80-4,89 (1 Η, superposto comCD3OD), 6,18 (1Η, m) , 6,58 (0,5H, br s), 6,78 (0,5H, br s),6,83 (1H, d, J- = 8,1 Hz), 6,92 (1H, d ,J = 8,1 Hz), 7,06 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,19 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,38 (0,5H, brs), 7,44 (0,5H, s), 7,47 (0,5H, br s), 7,48 (0,5H, s).
HPLC/EM: MH+ = 565,2.
Exemplo 6
Preparação de N-{2-dietilamino-5-{N-etil-N-(t-butilcarboni1)amino}pirimidin-4-il)-L-4'-{(pirrolidin-l-il)carbonilóxi}fenilalanina
Etapa 1:
<formula>formula see original document page 92</formula>
1H RMN (300 MHz, CDCl3) δ 1,04-1,11 (18H, m) , 1,40(4, 5H, s), 1,42 (4, 5H, s) , 1,96 (4H, m) , 2,46-2,59 (0,5H,m) , 2,72-2,85 (0,5H, tn) , 3,00-3,32 (2H, m) , 3,45-3,62 (8H,m) , 3,82-4,15 (1H, m) , 4,82-4,93 (1H, m) , 5,05 (0,5H, d, J= 7,2 Hz), 5,15 (0,5H, d,J = 7,2 Hz), 7,08-7,18 (4H, m) ,7, 67 (1H, s).
HPLC/EM: MH+ = 611,3.
ETAPA 2:
<formula>formula see original document page 92</formula>
1H RMN (300 MHz, CD3OD) δ 0,86-1,20 (18H, m) , 1,87(4H, m), 2,32-2,45 (0,5H, m), 2,56-2,68 (0,6H, m), 3,05-3,20 (2Η, m) , 3,29-3,38 (2Η, τη) , 3,43-3,52 (6Η, m) , 3,8-3,99 (1Η, m) , 4,75-4,82 (1Η, superposto com CD3OD), 6,90(2Η, d ,J = 9,0 Hz), 7,15 (2Η, d ,J = 9,0 Hz), 7,43 (1Η,s) .
HPLC/EM: MH+ = 555,2.
Exemplo 7
preparação de N-[2-dietilamino-5-{N-etil-N-(iso-propilcarbonil)amino}pirimidin-4-il]-L-4-{(pirrolidin-1-il)carbonilóxi}fenilalanina
<formula>formula see original document page 93</formula>
1H RMN (300 MHz, CDCl3) δ 0.90-1,21 (15H, m) , 1,38(9H, s), 1,92 (4H, m), 2,28-2,50 (1H, m) , 2,80-3,16 (3H,m), 3,41-3,70 (8H, m) , 3,80-3,95 (1H, m), 4,71-4,85 (1H,m), 5,05-5,11 (1H, m), 7,00-7,08 (2H, m), 7,08-7,16 (2H,m), 7, 65 (1H, d, J= 5,0 Hz) .
HPLC/EM: MH+ = 597,3 10.Etapa 2:
<formula>formula see original document page 93</formula>
1H RMN (300 MHz, CD3OD) δ 0,80-0,98 (9H, m) , 1,15-1,19(6H, m), 1,88 (4H, m) , 2,20-2,42 (IHf m) , 2,65-2,83 (IHfm), 3,08-3,25 (2H, m) , 3,26-3,59 (8H, m) , 3,88-3,97 (IHfm) , 4,70-5,05 (1H, superposto com CD3OD), 6,92 (2H, d,J =7,8 Hz), 7,17 (2H, m), 7,63 (1H, d, J= 5,0 Hz).HPLC/EM: MH+ = 541,3.Exemplo 8
Método geral para a preparação de pirimidinil uréias
Etapa 1:
<formula>formula see original document page 94</formula>
terc-butílico de N-[2-dietilamino-5-{N-etilamino}pirimidin-4-il] -L-4'-{(pirrolidin-l-il)carbonilóxi}fenilalanina (0,436 g, 0,83 mmol) foidissolvido em CH2Cl2 (0,35 ml) e NaHCO3 saturado (0,7 ml). Asolução foi resfriada até zero grau, e agitadavigorosamente por 10 minutos. Após 10 minutos, a agitaçãofoi interrompida e permitiu-se que as camadas imiscíveis seseparassem. Fosgeno (0,52 ml, 4,97 mmol) foi adicionado àcamada do fundo por meio de uma seringa. A mistura dereação foi agitada sob N2 por três horas. Com o término, acamada orgânica foi separada e foi concentrada in vácuo emtemperatura ambiente. Ela foi re-dissolvida em EtOAc elavada com água deionizada e extraída de volta duas vezes.A camada orgânica foi seca sobre Na2SO4 e concentrada invácuo. 0 óleo bruto foi encaminhado à etapa seguinte sempurificação.
HPLC/MS: MH+ = 589,0.
Etapa 2:
<formula>formula see original document page 94</formula>Cloreto de carbamila bruto (1 eq.) e amina (5 eq.)foram dissolvidos em THF (0,2 M) e agitados de um dia parao outro sob N2. A mistura de reação foi concentrada invácuo e re-dissolvida em acetato de etila. A camadaorgânica foi lavada com água, seca sobre Na2SO4 econcentrada in vácuo. Os produtos foram purificados porHPLC. Os produtos foram tratados'com HCOOH como solvente a40°C de um dia para o outro. 0 solvente foi removido sobpressão reduzida e os produtos foram obtidos.
Exemplos 9-11 foram preparados de acordo com o Exemplo8 .
Exemplo 9
preparação de N- [2-dietilamino-5-{N-etil-N-(piperidin-1-ilcarbonil) amino}pirimidin-4-il] -L-4 - { (pirrolidin-1-il)carbonilóxi}fenilalanina
<formula>formula see original document page 95</formula>
1H RMN (300 MHz, CDCl3) δ 1,01 (3 Η, t, J=I Hz),1,22 (6 Η, t, J = 7 Hz), 1,36 (4 Η, m) , 1,49 (2 Η, m) , 1,95(4 Η, m), 3,10-3,66 (16 Η, m) , 4,86-4,92 (1 Η, m) , 6,75 (1Η, d, J- = 7,2 Ηζ), 7,25 (2 Η, d,J= 8,4 Hz), 7,14(2 Η, d,J= 8,4 Ηζ), 7,64 (1 Η, s).
HPLC/MS: MH+ = 582,3.Exemplo 10
preparação de N- [2-dietilamino-5-{N-etil-N-(N-etil-N-iso-propilaminocarbonil)amino}pirimidin-4-il]-L-4'-{(pirrolidin-l-il)carbonilóxi}fenilalanina<formula>formula see original document page 96</formula>
1H RMN (300 MHzf CDCl3) δ 1,01 (9 Η, br s) , 1,21 (9 H7m) , 1,90-1,99 (4 Η, m) , 2,98 (2 Η, m) , 3,15 (3 Η, m) , 3,33(1 Η, πι), 3,45 (2 Η, m) , 3,52-3,60 (6 Η, m) , 3,76 (1 Η, m) ,4,91-4,97 (1 Η, br s) , 6,64 (1 Η, br s), 7,04 (2 Η, d, J =8 Hz) , 7,14 (2 Η, d, J = 8 Hz) , 7,66 (1 Η, s) .
HPLC/MS: MH+ = 584,4.
Exemplo 11
Preparaçao de N-[2-dietilamino-5-{N-etil-N- (3-tiapirrolidin-1-ilcarbonil) amino}pirimidin-4-il] -L-4 1 -{(pirrolidin-l-il)carbonilóxi}fenilalanina
<formula>formula see original document page 96</formula>
1H RMN (300 MHz, CDCl3) δ 1,03 (3 Si, t, J= 6,6 Hz),1,21 (6 H, t, J- = 6,6 Hz), 1,90- 1,99 (4 H, m) , 2,84 (2 H,t, J = 6 Hz), 3,09-3,63 (14 H, m), 4,06-4,14 (2 H, q, J =7,8 Hz), 4,91-4,97 (1 H, m), 6,64 (1 H, d, J=I Hz), 7,04(2 H, d, J = 8,4 Hz), 7,13 (2 H, d,J= 8,4 Hz), 7,75 (1 H, s).
HPLC/MS: MH+ = 586,2.
Exemplo A
Ensaio de adesão de integrina α4β1: adesão celular deJurkat™ à fibronectina do plasma humano
Procedimento
Placas de 96 poços (placas Costar 3590 E IA) foramrevestidas com fibronectina humana (Gibco/BRL, cat. #33016-023) em uma concentração de 10 pg/ml de um dia para ooutro a 4 °C. As placas foram então bloqueadas com umasolução de albumina sérica bovina (BSA; 0,3%) em sorofisiológico. Células Jurkat™ (mantidas em crescimento emfase log) foram marcadas com Calceina AM de acordo com asinstruções do fabricante, e suspensas em uma concentraçãode 2 χ IO6 células/ml em Hepes/soro f isiológico/BSA. Ascélulas foram então expostas aos compostos de teste e decontrole por 30 minutos em temperatura ambiente, antes deserem transferidas para poços individuais da placarevestida com fibronectina. Permitiu-se a ocorrência daadesão por 35 minutos a 37°C. Os poços foram então lavadospor aspiração e pipetagem suaves com soro fisiológicofresco. A fluorescência associada às células aderentesrestantes foi quantificada com a utilização de uma leitorade fluorescência de placas a EX 485/EM 530.
Foram preparadas culturas de células inicialmentedividindo-se as células Jurkat™ em fase estacionária a1:10 no primeiro dia, e 1:2 no segundo dia, para realizar oensaio no 3o dia. As células divididas a 1:10 no primeirodia foram divididas a 1:4 no 3o dia para um ensaio no 4odia.
As placas do ensaio foram preparadas fazendo-seinicialmente uma solução de trabalho de Fibronectina HumanaGibcoBRL (cat. # 33016-023) em PBS++, a 10 pg/ml. Uma placaCostar 3590 EIA foi então revestida com 50 μΐ/poço por 2horas em temperatura ambiente (embora ela também possa serdeixada de um dia para o outro a 4°C). Finalmente, a placafoi aspirada e bloqueada com tampão de Hepes/sorofisiológico, 100 μΐ/poço, por 1 hora em temperaturaambiente seguida por lavagem três vezes com 150 μΐ dePBS++.
As diluições dos compostos foram feitas preparando-sediluições seriais 1:3 dos compostos da seguinte forma: paracada placa (4 compostos/placa), 600 μΐ foram adicionados a4 Titertubes Bio-Rad em uma prateleira de Titertubes. Foiadicionada uma quantidade suficiente de composto a cadatubo apropriado para gerar uma concentração de 2X com o usode métodos bem conhecidos na técnica. Utilizando-seFlexiplates Falcon, 100 μΐ de tampão de Hepes/sorofisiológico ou soro humano foram adicionados às Fileiras Ba G. Foi usado um pipetador de multicanais ajustado em 180μΐ com quatro pontas espaçadas igualmente no pipetador.Cada conjunto de quatro tubos foi misturado 5 vezes, e 180μΐ de composto 2X foram transferidos para a primeira colunade cada diluição do composto na Fileira B, deixando aFileira A vazia. Foram adicionados 18 0 μΐ aos outros poçosna Fileira A. Foram realizadas diluições seriais na placatransferindo-se 50 μΐ à diluição seguinte e misturando-se 5vezes, mudando as pontas a cada vez após a mistura. Asdiluições foram interrompidas na Fileira F. A Fileira G não
tinha composto presente.
Uma solução de 20 μg/ml em tampão de Hepes/soro
fisiológico ou soro humano, de anticorpo 21/6, foi ocontrole positivo e foi colocado de lado em um reagentepara ser adicionada à placa de suspensão de células.
A coloração das células foi obtida colhendo-seinicialmente as células Jurkat™ em fase Iog porcentrifugação em tubos de 50 ml (1.100 rpm por 5 minutos).As células foram re-suspensas em 50 ml de PBS++,centrifugadas e re-suspensas em 20 ml de PBS++. As célulasforam coradas pela adição de 20 μΐ de Calceína AM por 3 0minutos em temperatura ambiente. O volume foi trazido até50 ml com tampão de Hepes/soro fisiológico, e as célulasforam contadas, centrifugadas e re-suspensas até 2 χ IO6células/ml em tampão de Hepes/soro fisiológico ou sorohumano.
Os compostos foram incubados com o uso do seguinteprocedimento: em uma nova flexiplate, 65 μΐ de célulascoradas foram adicionados às Fileiras B a Η. A seguir, 65μΐ de compostos 2X foram adicionados às fileirasapropriadas de acordo com a disposição das placas, emisturados 3X. Foram adicionados 65 μΐ de anticorpo 2X-21/6à Fileira H, e misturados 3X. Finalmente, a placa foiincubada em temperatura ambiente por 3 0 minutos.
A adesão de fibronectina foi medida com o uso de umaleitora de placas fluorescentes a EX 485/EM 530 após oprocedimento de desenvolvimento seguinte. Após incubação,as células foram misturadas 3X, e 100 μΐ foram transferidospara as placas revestidas com fibronectina, e incubadas a37 0C por cerca de 35 minutos. Cada placa foi lavada,fileira a fileira, pipetando-se suavemente 100 μΐ de PBS++em temperatura ambiente pelas laterais dos poços, evirando-se a placa 90 graus para aspiração. Esseprocedimento foi repetido por um total de 3 lavagens. Cadapoço foi preenchido com 100 μΐ após a lavagem por pipetagem
pela lateral do poço.
Foi calculado um valor de IC50 para cada composto,tanto na presença do soro humano quanto na sua ausência. AIC50 é a concentração na qual o crescimento ou a atividadeé inibido em 50%. Verificou-se que todos os compostos aquirevelados têm uma IC50 de menos de 10 μΜ, quando testadosde acordo com o ensaio de fibronectina.Exemplo B
Adesão celular à fibronectina do plasma humano. Ensaio desaturação in vitro para determinação da ligação decompostos candidatos à α4βΐ
A seguir, será descrito um ensaio in vitro paradeterminar os níveis plasmáticos necessários para que umcomposto seja ativo no modelo de Encefalomielite AutoimuneExperimental (wEAEw), descrito no exemplo seguinte, ou emoutros modelos in vivo. Células Jurkat™ em crescimento Iogsão lavadas e re-suspensas em plasma animal normal contendo20 pg/ml do anticorpo 15/7 (Yednock, e cols., J. Biol.
Chem., (1995) 270(48): 2.8740).
As células Jurkat™ são diluídas duas vezes emamostras de plasma normal contendo quantidades conhecidasdo composto candidato em várias concentrações que variam de66 μΜ a 0,01 μΜ, com o uso de uma diluição serialpadronizada de 12 pontos para uma curva-padrão, ou emamostras de plasma obtido do sangue periférico de animaistratados com o composto candidato.
As células são então incubadas por 3 0 minutos emtemperatura ambiente, lavadas duas vezes com sorofisiológico tamponado com fosfato ("PBS") contendo sorofetal bovino 2% e 1 mM de cada um de cloreto de cálcio ecloreto de magnésio (meio de ensaio) para a remoção deanticorpo 15/7 não ligado.
As células são então expostas a Fc de F(ab')2 anti-camundongo de IgG de cabra conjugado à ficoeritrina(Immunotech, Westbrook, ME) , que foi adsorvido paraqualquer reatividade cruzada inespecífica por co-incubaçãocom soro 5% da espécie animal que estiver sendo estudada, a1:200, e incubadas no escuro a 40C por 3 0 minutos.
As células são lavadas duas vezes com meio de ensaio,e re-suspensas no mesmo. Elas são então analisadas com umaanálise por classificador-padrão de células ativadas porfluorescência ("FACS"), como descrito em Yednock e cols.,J. Biol. Chem., 1995, 270: 28.740.
Os dados são então colocados em um gráfico defluorescência versus dose, por exemplo, na forma de umadose-resposta normal. Os níveis de dose que resultam noplatô superior da curva representam os níveis necessáriospara se obter eficácia em um modelo in vivo.
Esse ensaio também pode ser usado para determinar osníveis plasmáticos necessários para saturar os sítios deligação de outras integrinas como, por exemplo, a integrinaα9βι, que é a integrina mais intimamente relacionada à α4βι(Palmer e cols., 1993, J. Cell Bio., 123: 1.289). Essaligação é preditiva da utilidade in vivo para as condiçõesinflamatórias mediadas pela integrina α9βι, incluindo, comoexemplo, a hiper-reatividade das vias aéreas e a oclusãoque ocorrem com asma crônica, proliferação de células demúsculo liso na aterosclerose, oclusão vascular apósangioplastia, fibrose e cicatrização glomerular emconseqüência de doença renal, estenose aórtica, hipertrofiade membranas sinoviais na artrite reumatóide e inflamação ecicatrização que ocorrem com a progressão da coliteulcerativa e da doença de Crohn.Conseqüentemente, o ensaio descrito acima pode serrealizado com uma linhagem de células de carcinoma de cólonhumano, SW 480 (ATTC # CCL228) transfectadas com cDNA quecodifica integrina a9 (Yokosaki e cols., 1994, J. Biol.Chem., 269: 26.691), no lugar das células Jurkat, paramedir a ligação da integrina α9βι. Como controle, podem serusadas células SW 480 que expressam outras subunidades α e
<formula>formula see original document page 102</formula>
Conseqüentemente, outro aspecto desta invenção édirigido a um método para o tratamento de uma doença em umpaciente mamífero, cuja doença é mediada por α9βι, e cujométodo compreende a administração ao referido paciente deuma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto destainvenção. Esses compostos são administrados preferivelmenteem uma composição farmacêutica aqui descrita acima. Adosagem diária eficaz dependerá da idade, do peso, dacondição do paciente, e esses fatores podem ser facilmenteverificados pelo médico assistente. No entanto, em umamodalidade preferida, os compostos são administrados em umadose de cerca de 20 a 500 pg/kg por dia.Exemplo C
Dosagem do cassete e análise sérica para determinação debiodisponibilidade
A biodisponibilidade oral é verificada por dosagem deratos com um cassete, ou seja, uma mistura de 6 compostospor solução de dosagem. 0 cassete inclui 5 artigos de testee um composto-padrão, para uma dose total de 10 mg/kg. Cadacomposto/artigo de teste é convertido no sal sódico com 1 Nde NaOH eqüimolar, e dissolvido em água a 2 mg/ml. 0cassete é preparado por mistura de volumes iguais de cadauma das seis soluções. A solução de dosagem do cassete ébem misturada, e depois o pH era ajustado em 7,5-9. Asolução de dosagem é preparada no dia anterior ao estudo, eé agitada de um dia para o outro em temperatura ambiente.
Machos de ratos Sprague Dawley (SD) de "Charles RiverLaboratories", com 6-8 semanas de idade, foram usados nesseestudo. Os ratos foram colocados em quarentena por pelomenos um dia, e tinham acesso continuo a alimentos e água.Na noite anterior à administração do cassete, os ratosfaziam um jejum de aproximadamente 16 horas.
Quatro ratos SD foram distribuídos em cada cassete.Uma dose única da solução de dosagem foi administradaoralmente a cada rato. 0 volume de dosagem (5 ml/kg) e omomento foram registrados, e os ratos foram alimentados 2horas após a dosagem.
Foram coletadas amostras de sangue por meio de punçãocardíaca nos seguintes momentos: 4 horas, 8 horas e 12horas. Imediatamente antes da coleta de sangue, os ratoseram anestesiados com gás CO2 em até 10-20 segundos. Depoisda coleta das amostras de 12 horas, os ratos foramsubmetidos à eutanásia por meio de asfixia com CO2, seguidapor deslocamento cervical.
As amostras de sangue foram mantidas em tubosmicrotainer heparinizados sob temperatura abaixo datemperatura ambiente (4°C) antes de serem processadas. Elasforam centrifugadas (10.000 rpm por 5 minutos), e asamostras de plasma foram removidas e estocadas em umcongelador a -20°C até serem analisadas quanto aos níveisde fármaco. Os níveis de fármaco no plasma foram analisadoscom a utilização do protocolo a seguir para precipitaçãodireta do plasma.
As amostras de plasma in vivo foram preparadas em umaplaca de 1,5 ml de 96 poços, por adição, em ordem, de 100μl do plasma de teste, 150 μl de metanol, seguido porturbilhonamento por 10-20 segundos. Cento e cinqüenta μΐ de0,05 ng/μl de um Padrão Interno em acetonitrila foramacrescentados e turbilhonados por 30 segundos.
As amostras da curva-padrão foram preparadas em umaplaca de 1,5 ml de 96 poços, por adição, em ordem, de 100μl de plasma de camundongo de controle, seguidos por 150 μlde metanol e turbilhonamento por 10-20 segundos. Cento ecinqüenta 150 μl de 0,05 ng/μl de um Padrão Interno emacetonitrila foram adicionados e turbilhonados por 30segundos. As amostras receberam 0-200 ng (10 concentrações)do composto de interesse em metanol 50% para obter umafaixa da curva-padrão de 0,5 ng/ml a 2.000 ng/ml.Novamente, a amostra é turbilhonada por 30 segundos.
As amostras são centrifugadas por 20-30 minutos a3.000 rpm em uma microcentrífuga Eppendorf, antes de 80-90%de sobrenadante serem transferidos em uma placa limpa de 96poços. 0 solvente orgânico é então evaporado até que asamostras estejam secas (sob N2 a 40°C/30-60 minutos(ZymarkTurbovap)).
O resíduo é então dissolvido em fase móvel de 200-600litros (CH3OH 50%/TFA 0,1%). É então executada LC/MS/MS como uso de um espectrômetro de massa triplo quadripolar PE-Sciex API-3000 (SN0749707) , Perkin-Elmer, autosampler Série200 e uma bomba Shimadzu 10A. A aquisição é feita com umAnalisador PE-Sciex (v 1.1) e a análise e a quantificaçãodos dados foram feitas com o uso de um Analisador PE-Sciex(ν 1.1). Um volume de amostra de 5-50 μΐ foi injetado emuma coluna de fase reversa Thermo Hypersil DASH-18(Keystone 2,0 χ 20 mm, 5 μπι, PN: 8823025-701) usando umafase móvel de CH3OH 25%, TFA 0,1%- CH3OH 100%, TFA 0,1%. Otempo de execução é de cerca de 8 minutos, em uma taxa defluxo de cerca de 300 μΐ/minutos.
A Área Sob a Curva (AUC) é calculada com o uso de umaregra trapezoidal linear de t = 0 para o último tempo deamostragem tx (veja "Handbook of Basic Pharmacokinetics",Wolfgang A. Ritschel e Gregory L. Kearns, 5a ed, 1999) .
<formula>formula see original document page 105</formula>
No caso do paradigma da dosagem do cassete, amostrasem 4, 8 e 12 horas após a dosagem extravascular, a AUC écalculada de t = 0 a t = 12 horas.
Exemplo D
Modelos de asma
Condições inflamatórias mediadas pela integrina α4βιincluem, por exemplo, influxo de eosinófilos, hiper-reatividade das vias aéreas e oclusão que ocorre com asmacrônica. A seguir, serão descritos modelos animais de asmaque são usados para estudas os efeitos in vivo doscompostos desta invenção para uso no tratamento de asma.Modelo de rato em asma
De acordo com os procedimentos descritos por Chapman,e cols., Am. J. Resp. Crit. Care Med. 153-4, A219 (1996) eChapman, e cols., Am. J. Resp. Crit. Care Med. 155: 4, A881(1997), ambos aqui incorporados por referência em suatotalidade.
Ovalbumina (OA; 10 pg/ml) é misturada com hidróxido dealumínio (10 mg/ml) e injetada (intraperitoneal, i.p.) emratos Brown Norway no dia 0. As injeções de OA, junto comadjuvante, são repetidas no 7o e 14° dias. No 21° dia, osanimais sensibilizados são contidos em tubos plásticos eexpostos (60 minutos) a um aerossol de OA (10 mg/kg) em umsistema de exposição somente nasal. Os animais sãosacrificados 72 horas mais tarde, com pentobarbital (250mg/kg, i.ρ.). Os pulmões são lavados através de uma cânulatraqueal com o uso de 3 alíquotas (4 ml) de solução de Hank(HBSS χ 10, 100 ml; 100 mM de EDTA, 100 ml; IM de HEPES,25 ml; trazida até 1 litro com H2O); as células recuperadassão reunidas em um pool e o volume total de fluidorecuperado ajustado até 12 ml por adição de solução deHank. As células totais são contadas (contador demicrocélula Sysmex F-500, TOA Medicai Electronics Otd.,Japan) e são feitos esfregaços por diluição de fluidorecuperado (até aproximadamente IO6 células/ml) e pipetagemde uma alíquota (100 μΐ) em uma centrífuga (Cytospin,Shandon, G.B.). Os esfregaços são secos ao ar, fixadosusando uma solução de verde rápido em metanol (2 mg/ml) por5 segundos, e corados com eosina G (5 segundos) e tiazina(5 segundos) (Diff-Quick, Browne Ltd. G.B.) a fim dediferenciar eosinófilos, neutrófilos, macrófagos elinfócitos. Um total de 500 células por esfregaço é contadopor microscopia óptica sob imersão em óleo (x 100) . Oscompostos desta invenção podem ser formulados em umasuspensão de carboximetilcelulose 0,5% e Tween 80 2%, eadministrados oralmente aos ratos que haviam sidosensibilizados ao alérgeno, ovalbumina. Os compostos queinibiram o acúmulo de leucócitos induzido por alérgeno nasvias aéreas de ratos Brown Norway sensibilizados ativamentesão considerados como ativos nesse modelo.Modelo de asma em camundongos
Os compostos também foram avaliados em um modelo decamundongo de inflamação pulmonar aguda seguindo osprocedimentos descritos por Dung, e cols., Am. J. Respir.Cell. Mol. Biol., 13: 360-365, (1995) e Schneider, e cols.,(1999). Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 20: 448-457, (1999),que são individualmente aqui incorporados por referência emsua totalidade. Seis fêmeas de camundongos pretos (8-12semanas de idade) são sensibilizadas no Io dia por umainjeção intraperitoneal (i.p.) de 0,2 ml de uma misturaova/alum contendo 20 μg de ova (Grau 4, Sigma) e 2 mg deAlum injetável (Pierce). Uma injeção de reforço éadministrada no 14° dia. Os camundongos são atacados nos28° e 29° dias com ova 1% em aerossol (em soro fisiológico0,9%) por 20 minutos. Os camundongos são submetidos àeutanásia, e são coletadas amostras de lavado bronco-aveolar (3 ml) no 30° dia, 4 8 horas após o primeiro ataque.Os eosinófilos são quantificados por um método de coloraçãoFACs/FITC. Os compostos desta invenção são formulados emuma suspensão de carboximetilcelulose 0,5% e Tween 80 2%, eadministrados oralmente aos camundongos que haviam sidosensibilizados ao alérgeno, ovalbumina. Os compostos queinibiam o acúmulo de leucócitos induzido por alérgeno nasvias aéreas de camundongos C57BL/6 sensibilizadosativamente são considerados como ativos nesse modelo.Modelo de asma em carneiros
Esse modelo emprega os procedimentos descritos porAbraham, e cols., J. Clin. Invest., 93: 776-787 (1994) eAbraham, e cols., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 156: 696-703 (1997), ambos aqui incorporados por referência em suatotalidade. Os compostos desta invenção foram avaliados poradministração intravenosa (solução salina aquosa), oral(Tween 80 2%, carboximetilcelulose 0,5%) e por aerossol aoscarneiros que são hipersensíveis ao antigeno de Ascarissuum. Os compostos que diminuem a resposta brônquicainicial induzida por antigeno e/ou bloqueiam a resposta defase tardia das vias aéreas, por exemplo, possuem um efeitoprotetor contra respostas tardias induzidas por antigeno ehiper-sensibilidade das vias aéreas ("AHR"), sãoconsiderados como ativos nesse modelo.
Os carneiros alérgicos que comprovadamente desenvolvemrespostas brônquicas tanto iniciais quanto tardias aoantigeno inalado de Ascaris suum são usados para estudar osefeitos sobre as vias aéreas dos compostos candidatos. Apósanestesia tópica dos condutos nasais com lidocaina 2%, umcateter em balão é passado através de uma narina até oesôfago inferior. Os animais são então incubados com umtubo endotraqueal com um balão através da outra narina,tendo um broncoscópio flexível de fibra óptica como guia.
A pressão pleural é estimada de acordo com Abraham(1994). São gerados aerossóis (veja a formulação abaixo)com o uso de um nebulizador médico descartável que forneciaum aerossol com um diâmetro aerodinâmico de massa média de3.2 μπ\, como determinado com um impactômetro em cascataAndersen. 0 nebulizador está conectado a um sistema dedosímetro que consiste em uma válvula solenóide de umafonte de ar comprimido (137,89 kPa). A saída do nebulizadoré dirigida a uma divisão em "T" de plástico, umaextremidade da qual é conectada à entrada inspiratória deum respirador de pistão. A válvula solenóide é ativada por1 segundo no início do ciclo inspiratório do respirador. Osaerossóis são liberados em VT de 500 ml e uma taxa de 20respirações/minuto. Uma solução apenas de bicarbonato desódio 0,5% é usada como controle.
Para avaliar a capacidade de resposta brônquica, sãogeradas curvas cumulativas de concentração-resposta aocarbacol de acordo com Abraham (1994). São coletadasbiópsias brônquicas antes e depois do início do tratamento,e 24 horas após o ataque com antígeno. São feitas biópsiasbrônquicas de acordo com Abraham (1994).
Também pode ser realizado um estudo in vitro de adesãode macrófagos alveolares de acordo com Abraham (1994), epode ser calculada uma percentagem de células aderentes.
Formulação em aerossol
Uma solução do composto candidato em bicarbonato desódio 0,5%/soro fisiológico (p/v) em uma concentração de30,0 mg/ml é preparada com o uso do seguinte procedimento:A. Preparação de uma solução de estoque de bicarbonato de
<table>table see original document page 109</column></row><table>
Procedimento:
1. Adicionar 0,5 g de bicarbonato de sódio em um frascovolumétrico de 100 ml.
2. Adicionar aproximadamente 90,0 ml de soro fisiológico esonificar até dissolvido.
3. Q.S. até 100,0 ml com soro fisiológico e misturarcuidadosamente.Β. Preparação de 30,0 mg/ml de composto candidato: 10,0 ml
<table>table see original document page 110</column></row><table>
Procedimento:
1. Adicionar 0,300 g do composto candidato em um frascovolumétrico de 10,0 ml.
2. Adicionar aproximadamente 9,7 ml de solução de estoquede bicarbonato de sódio 0,5%/soro fisiológico.
3. Sonificar até que o composto candidato estejacompletamente dissolvido.
4. Q. s. até 10,0 ml com solução de estoque de bicarbonatode sódio 0,5%/soro fisiológico, e misturar cuidadosamente.
Exemplo E
Estudo de toxicidade de 10 dias em camundongos C57B6
Foi feito um estudo de 10 dias para avaliar atoxicidade dos compostos da presente invenção em fêmeas decamundongos C57B6. 0 composto é administrado por engorda emcinco níveis de dose, 0 (controle de veículo), 10, 30, 100,300 e 1.000 mg/kg (mpk), com cinco camundongos em cadanível de dose. O volume da dose para todos os níveis foi de10 ml/kg. As soluções ou suspensões das doses sãopreparadas em Tween 80 2% em carboximetilcelulose 0,5%(CMC), e novas soluções ou suspensões das doses sãopreparadas a cada dois ou três dias. As observações em vidaincluem os pesos corporais (Io, 2o, 3o, 5o, 7o, 8o e 11°dias do estudo), observações clínicas diárias nas gaiolase
(1-2/dia) e observações funcionais periódicas (-1, 2° e 9°dias do estudo).
Ao término, são coletadas amostras por punção cardíacapara exames de patologia clínica (hematologia e bioquímicaclínica) e níveis de fármaco. As amostras de sangue comEDTA são analisadas quanto à contagem total de célulassangüíneas brancas, contagem de células sangüíneasvermelhas, hemoglobina, hematócrito, índices de eritrócito(MCV, MCH, MCHC), plaquetas e uma contagem diferencial decinco células sangüíneas brancas (neutrófilos, linfócitos,monócitos, eosinófilos e basófilos). As amostrasheparinizadas de plasma são analisadas quanto aos níveis dealanina transaminase, aspartato transaminase, fosfatasealcalina, bilirrubina total, albumina, proteína, cálcio,glicose, uréia nitrogenada, creatinina, colesteroltriglicerídeos.
Após a coleta de sangue, a carcaça é submetida ànecropsia, e os órgãos (fígado, baço, rins, coração e timo)são pesados. São coletadas amostras de tecidos (cérebro,glândulas salivares, timo, coração, pulmão, fígado, rim,baço adrenal, estômago, duodeno, íleo, cólon eútero/ovário) e fixadas em formalina. Os tecidos docontrole de veículo e dos animais dos grupos de 300 e 1.000mpk são processados para lâminas de vidro coradas comhematoxilina/eosina, e avaliados quanto a lesõeshistopatológicas.
As alterações do peso corporal, os pesos absolutos erelativos dos órgãos e os resultados da patologia clínicasão analisados quanto à existência de diferençasestatisticamente significativas, comparados com controle deveículo pelo teste de comparação múltipla de Dunnet com ouso do programa de computador Prism. Os resultados dabateria de observações funcionais são analisados quanto adiferenças com o uso dos testes exatos de Dunnet, deFisher, e os efeitos da tendência da dose pelo teste decorrelação de Cochran-Mantel-Haenszel com o uso do programade computador SAS.
Com o uso de uma formulação oral convencional, oscompostos desta invenção seriam ativos nesse modelo.
Exemplo F
Artrite induzida por adjuvante em ratos
A artrite induzida por adjuvante ("AIA") é um modeloanimal útil para o estudo de artrite reumatóide (RA), que éinduzida por injeção de M. tuberculosis na base do rabo deratos Lewis. Entre 10 e 15 dias após a injeção, os animaisdesenvolvem uma artrite grave e progressiva.
Geralmente, os compostos são testados quanto à suahabilidade para alterar o edema da pata traseira e os danosósseos resultantes do edema induzido por adjuvante emratos. Para quantificar a inibição do edema da patatraseira resultante da AIA1 foram definidas duas fases deinflamação: (1) a primária e secundária da pata traseirainjetada, e (2) a secundária da pata traseira não injetada,que geralmente começa a se desenvolver em torno de onzedias a partir da indução de inflamação na pata injetada. Aredução desse último tipo de inflamação é uma indicação deatividade imunossupressora. Veja Chang, Arth. Rheum., 20,1.135-1.141 (1977).
0 uso de um modelo animal de RA, por exemplo, a AIA,permite o estudo dos eventos celulares envolvidos nosestágios iniciais da doença. A expressão de CD44 emmacrófagos e linfócitos está supra-regulada durante odesenvolvimento inicial da artrite por adjuvante, enquantoa expressão de LFA 1 está supra-regulada mais tarde nodesenvolvimento da doença. A compreensão das interaçõesentre as moléculas de adesão e o endotélio nos estágiosmais precoces da artrite por adjuvante poderia levar aavanços significativos nos métodos usados no tratamento deRA.
Verificou-se que todos os compostos a seguir possuemuma IC50 abaixo de 10 μΜ, quando testados de acordo com oExemplo A do ensaio de fibronectina:
N- [2-dietilamino-5-{N-etil-N-(trifluoracetil)amino}pirimidin-4-il]-L-4'-{(pirrolidin-l-il)carbonilóxi}fenilalanina;
N- [2-dietilamino-5-{N-etil-N-(iso-propilcarbonil)amino}pirimidin-4-il] -L-4·-{(pirrolidin-l-il)carbonilóxi}fenilalanina;
N- [2-dietilamino-5-{N-etil-N-(t-butilcarboni1)amino}pirimidin-4-il]-L-4·-{(pirrolidin-l-il)carbonilóxi}fenilalanina;
N- [2-dietilamino-5-{N-etil-N-(furan-2-ilcarbonil)amino}pirimidin-4-il] -L-4 ' -{(pirrolidin-l-il)carbonilóxi}fenilalanina;
N- [2-dietilamino-5-{N-etil-N-(piperidin-l-ilcarbonil)amino}pirimidin-4-il] -L-41 -{(pirrolidin-l-il)carbonilóxi}fenilalanina;
N-[2-dietilamino-5-{N-etil-N-(N-etil-N-iso-propilaminocarboni1)amino}pirimidin-4-il]-L-4'-{(pirrolidin-l-il)carbonilóxi}fenilalanina;N- [2-dietilamino-5- {N-etil-N- (tien-3-ilcarbonil) amino}pirimidin-4-il] -L-4 1 - { (pirrolidin-l-il) carbonilóxi}fenilalanina;
N- [2-dietilamino-5- {N-etil-N- (tien-2-ilcarbonil) amino}pirimidin-4-il] -L-4 -{ (pirrolidin-l-il) carbonilóxi}fenilalanina;
N- [2-dietilamino-5-{N-etil-N- (furan-3-ilcarbonil)amino}pirimidin-4-il] -L-4' -{ (pirrolidin-l-il) carbonilóxi}fenilalanina;
N- [2-dietilamino-5-{N-etil-N-(3-tiapirrolidin-l-ilcarbonil) amino}pirimidin-4-il] -L-4 · - { (pirrolidin-l-il)carbonilóxi}fenilalanina;
Ester t-butilico de N-[2-dietilamino-5-{N-etil-N-(tien-2-ilcarbonil) amino}pirimidin-4 - il] -L-4 ·-{ (pirrolidin-l-il) carbonilóxi}-fenilalanina;
Éster t-butílico de N-[2-dietilamino-5-{N-etil-N-(trifluormetilcarbonil)amino}pirimidin-4-il]-L-4 ' -{(pirrolidin-l-il)carbonilóxi}-fenilalanina;
Éster t-butílico de N-[2-dietilamino-5-{N-etil-N- (t-butilcarbonil) amino}pirimidin-4-il] -L-4 '-{ (pirrolidin-l-il) carbonilóxi}-fenilalanina; e
Éster t-butílico N-[2-dietilamino-5-{(N-etil-N-furan-3-ilcarbonil) amino}pirimidin-4-il] -L-4'-{ (pirrolidin-l-
il) carbonilóxi}-fenilalanina.
Embora tenham sido ilustradas e descritas modalidadespreferidas da invenção, será observado que podem ser feitasvárias alterações sem se afastar do espírito e do escopo dainvenção.

Claims (40)

1. Composto caracterizado por ter a fórmula I:<formula>formula see original document page 115</formula>em que:R1 é selecionado do grupo que consiste em C1 a C4alquil, C1 a C4 haloalquil, heteroaril e -NR5R6, em que R5 eR6 são selecionados independentemente do grupo que consisteem hidrogênio e C1 a C4 alquil, ou R5 e R5, juntos com oátomo de nitrogênio a eles pendente, formam um anelheterocíclico;R2 é selecionado do grupo que consiste em C1 a C4alquil, C2 a C4 alquenil e C2 a C4 alquinil; eR3 e R4 são independentemente C1 a C3 alquil ou R3 e R4,juntos com o átomo de nitrogênio a eles pendente, se unempara formar um anel heterocíclico;ou um sal, éster ou pró-fármaco farmaceuticamenteaceitável destes.
2. Composto, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o grupo -OC(O)NR3R4 está naposição para do anel fenila.
3. Composto, de acordo com a reivindicação 2,caracterizado pelo fato de que R3 e R4, juntos com o átomode nitrogênio a eles pendente, formam um anelheterocíclico.
4. Composto, de acordo com a reivindicação 3,caracterizado pelo fato de que o anel heterocíclico épirrolidinil.
5. Composto, de acordo com a reivindicação 4,caracterizado pelo fato de que R2 é C1 a C4 alquil.
6. Composto, de acordo com a reivindicação 5,caracterizado pelo fato de que R2 é etil.
7. Composto caracterizado por ter a fórmula II:<formula>formula see original document page 116</formula>em que:R7 é C1 a C4 alquil, C1 a C4 haloalquil, ou heteroaril;R8 é C1 a C4 alquil;R9 e R10 são independentemente C1 a C3 alquil, ou R9 eR10, juntos com o átomo de nitrogênio a eles pendente,formam um anel heterocíclico;ou um sal, éster ou pró-fármaco farmaceuticamenteaceitável destes.
8. Composto, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato de que o grupo -OC(O)NR9R10 está naposição para do anel fenila.
9. Composto, de acordo com a reivindicação 8,caracterizado pelo fato de que R9 e R10, juntos com o átomode nitrogênio a eles pendente, formam um anelheterocíclico.
10. Composto, de acordo com a reivindicação 9,caracterizado pelo fato de que o anel heterocíclico épirrolidinil.
11. Composto, de acordo com a reivindicação 10,caracterizado pelo fato de que R8 é C1 a C4 alquil.
12. Composto, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de que R8 é etil.
13. Composto, de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de que R7 é C1 a C4 alquil.
14. Composto, de acordo com a reivindicação 13,caracterizado pelo fato de que R7 é selecionado do grupoque consiste em isopropil e t-butil.
15. Composto, de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de que R7 é C1 a C4 haloalquil.
16. Composto, de acordo com a reivindicação 15,caracterizado pelo fato de que R7 é trifluorometil.
17. Composto, de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de que R7 é heteroaril.
18. Composto, de acordo com a reivindicação 17,.caracterizado pelo fato de que R7 é selecionado do grupoque consiste em furan-2-il, furan-3-il, tien-2-il e tien-3-il.
19. Composto caracterizado por ter a fórmula III:<formula>formula see original document page 117</formula>em que:R11 e R12 são independentemente Ci a C4 alquil, ou R11 eR12, juntos com o átomo de nitrogênio a eles pendente,formam um anel heterocíclico;R13 é Ci a C4 alquil; eR14 e R15 são independentemente C1 a C3 alquil, ou R14 eR15, juntos com o átomo de nitrogênio a eles pendente,formam um anel heterocíclico;ou um sal, éster ou pró-fármaco farmaceuticamenteaceitável destes.
20. Composto, de acordo com a reivindicação 19,caracterizado pelo fato de que o grupo -OC (O) NR14R15 está naposição para do anel fenila.
21. Composto, de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato de que R14 e R15, juntos com o átomode nitrogênio a eles pendente, formam um anelheterocíclico.
22. Composto, de acordo com a reivindicação 21,.caracterizado pelo fato de que o anel heterocíclico épirrolidinil.
23. Composto, de acordo com a reivindicação 22,caracterizado pelo fato de que R13 é Ci a C4 alquil.
24. Composto, de acordo com a reivindicação 23,caracterizado pelo fato de que R13 é etil.
25. Composto, de acordo com a reivindicação 24,caracterizado pelo fato de que R11 e R12 sãoindependentemente C1 a C4 alquil.
26. Composto, de acordo com a reivindicação 25,caracterizado pelo fato de que R11 é etil e R12 é isopropil.
27. Composto, de acordo com a reivindicação 24,caracterizado pelo fato de que R11 e R12, juntos com o átomode nitrogênio a eles pendente, formam um anelheterociclico.
28. Composto, de acordo com a reivindicação 27,caracterizado pelo fato de que o referido anelheterociclico é selecionado do grupo que consiste empiperidin-l-il e 3-tiapirrolidin-l-il.
29. Composto caracterizado por ser selecionado dogrupo que consiste em:N- [2-dietilamino-5-{N-etil-N-(trifluoracetil)amino}pirimidin-4-il]-L-41{(pirrolidin-l-il)carboniloxi}fenilalanina;N- [2-dietilamino-5-{N-etil-N-(iso-propilcarbonil)amino}pirimidin-4-il] -L-4 ' - { (pirrolidin-l-il)carboniloxi}fenilalanina;N- [2-dietilamino-5-{N-etil-N-(t-butilcarbonil)amino}pirimidin-4-il]-L-41 -{(pirrolidin-l-il)carboniloxi}fenilalanina;N- [2-dietilamino-5-{N-etil-N-(furan-2-ilcarbonil)amino}pirimidin-4-il]-L-4 ' -{(pirrolidin-l-il)carboniloxi}fenilalanina;N- [2-dietilamino-5-{N-etil-N-(piperidin-l-ilcarbonil)amino}pirimidin-4-il] -L-4 1 - { (pirrolidin-l-il)carboniloxi}fenilalanina;N- [2-dietilamino-5-{N-etil-N-(N-etil-N-iso-propilaminocarboni1)amino}pirimidin-4-il]-L-4 1 -{(pirrolidin-l-il)carboniloxi}fenilalanina;N- [2-dietilamino-5-{N-etil-N-(tien-3-ilcarbonil)amino}pirimidin-4-il]-L-4'-{(pirrolidin-l-il)carboniloxi}fenilalanina;N- [2-dietilaraino-5-{N-etil-N-(tien-2-ilcarbonil)amino}pirimidin-4-il]-L41 -{(pirrolidin-l-il)carboniloxi}fenilalanina;N- [2-dietilamino-5-{N-etil-N-(furan-3-ilcarbonil)amino}pirimidin-4-il]-L-4'-{(pirrolidin-l-il)carboniloxi}fenilalanina;N- [2-dietilamino-5-{N-etil-N-(3-tiapirrolidin-1-ilcarbonil)amino}pirimidin-4-il] -L-4'-{(pirrolidin-l-il)carboniloxi}fenilalanina;Ester t-butilico N- [2-dietilamino-5-{N-etil-N-(tien-2-ilcarbonil)amino}pirimidin-4-il] -L4'-{ (pirrolidin-l-il)carboniloxi}-fenilalanina;Ester t-butílico N-[2-dietilamino-5-{(N-etil-N-trifluormetilcarbonil)amino}pirimidin-4- il] -1, 4 1 -{(pirrolidin-l-il)carboniloxi}-fenilalanina;Ester t-butílico N-[2-dietilamino-5-{(N-etil-N-fc-butilcarbonil)amino}pirimidin-4-il] -L-4'-{ (pirrolidin-l-il)carboniloxi}-fenilalanina; eEster t-butílico N-[2-dietilamino-5-{ (N-etil-N-furan--3-ilcarbonil)amino}pirimidin-4-il]-L4'-{(pirrolidin-l-il)carboniloxi}-fenilalanina;ou um sal, éster ou pró-fármaco farmaceuticamenteaceitável destes.
30. Composição farmacêutica caracterizada porcompreender um veículo farmaceuticamente aceitável e umaquantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais de umcomposto de qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5,-6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,-22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 ou 29.
31. Método para o tratamento de uma doença mediada porintegrina α4 em um indivíduo humano ou animal caracterizadopor compreender a administração ao indivíduo humano ouanimal de uma composição farmacêutica da reivindicação 30.
32. Método, de acordo com a reivindicação 31,caracterizado pelo fato de que a integrina a.4 é VLA-4.
33. Método, de acordo com a reivindicação 31,caracterizado pelo fato de que a referida doença éselecionada do grupo que consiste em asma, doença deAlzheimer, aterosclerose, demência por AIDS, diabetes,diabetes agudo de surgimento juvenil, doença inflamatóriado intestino, colite ulcerativa, doença de Crohn, esclerosemúltipla, artrite, artrite reumatóide, transplante detecidos, metástase tumoral, meningite, encefalite, acidentevascular cerebral, traumas cerebrais, nefrite, retinite,dermatite atópica, psoríase, isquemia miocárdica, lesãopulmonar aguda mediada por leucócitos e síndrome desofrimento respiratório do adulto.
34. Método, de acordo com a reivindicação 31,caracterizado pelo fato de que a referida doença é umadoença inflamatória.
35. Método, de acordo com a reivindicação 34,caracterizado pelo fato de que a doença inflamatória éselecionada do grupo que consiste em eritema nodoso,conjuntivite alérgica, neurite óptica, uveíte, rinitealérgica, espondilite anquilosante, artrite psoriática,vasculite, síndrome de Reiter, lúpus eritematoso sistêmica,esclerose sistêmica progressiva, polimiosite,dermatomiosite, granulomatose de Wegner, aortite,sarcoidose, Iinfocitopenia, arterite temporal, pericardite,miocardite, insuficiência cardíaca congestiva, poliarteritenodosa, síndromes de hipersensibilidade, alergia, síndromeshipereosinofílicas, síndrome de Churg-Strauss, doençapulmonar obstrutiva crônica, pneumonite porhipersensibilidade, hepatite crônica ativa, cistiteintersticial, falência endócrina autoimune, cirrose biliarprimária, anemia aplásica autoimune, hepatite crônicapersistente e tireoidite.
36. Uso de uma composição farmacêutica dareivindicação 30, caracterizada por ser usada para afabricação de um medicamento para o tratamento de umadoença mediada por integrina a.4 .
37. Uso, de acordo com a reivindicação 38,caracterizado pelo fato de que a integrina a.4 é VLA-4.
38. Uso, de acordo com a reivindicação 38,caracterizado pelo fato de que a referida doença éselecionada do grupo que consiste em asma, doença deAlzheimer, aterosclerose, demência por AIDS, diabetes,diabetes agudo de surgimento juvenil, doença inflamatóriado intestino, colite ulcerativa, doença de Crohn, esclerosemúltipla, artrite, artrite reumatóide, transplante detecidos, metástase tumoral, meningite, encefalite, acidentevascular cerebral, traumas cerebrais, nefrite, retinite,dermatite atópica, psoríase, isquemia miocárdica, lesãopulmonar aguda mediada por leucócitos e síndrome desofrimento respiratório do adulto.
39. Uso, de acordo com a reivindicação 38,caracterizado pelo fato de que a referida doença é umadoença inflamatória.
40. Uso, de acordo com a reivindicação 40,caracterizado pelo fato de que a doença inflamatória éselecionada do grupo que consiste em eritema nodoso,conjuntivite alérgica, neurite óptica, uveíte, rinitealérgica, espondilite anquilosante, artrite psoriática,vasculite, sindrome de Reiter, lúpus eritematoso sistêmica,esclerose sistêmica progressiva, polimiosite,dermatomiosite, granulomatose de Wegner, aortite,sarcoidose, linfocitopenia, arterite temporal, pericardite,miocardite, insuficiência cardíaca congestiva, poliarteritenodosa, síndromes de hipersensibilidade, alergia, síndromeshipereosinofílicas, sindrome de Churg-Strauss, doençapulmonar obstrutiva crônica, pneumonite porhipersensibilidade, hepatite crônica ativa, cistiteintersticial, falência endócrina autoimune, cirrose biliarprimária, anemia aplásica autoimune, hepatite crônicapersistente e tireoidite.
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