KR100682154B1 - 아쥬번트 조성물 및 그의 사용방법 - Google Patents

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Abstract

대사 가능한 오일, 하나 또는 그 이상의 계면활성제, 항산화제, 및 에멀젼 등장화 성분을 포함하는 안정한 수중유(oil-in-water) 에멀젼인 아쥬번트(adjuvant) 조성물이 기술되고 청구된다. 상기 안정한 에멀젼의 혐수성-친지성 밸런스("HLB")는 약 7.5 내지 10.5이며, 입자 크기는 3㎛ 이하이다. 바람직한 구현에서, 상기 안정한 에멀젼은 10%(v/v) 스쿠알렌, 0.09%(w/v) PLURONIC F-68 블록 공중합체, 1.9%(w/v) 에그 포스파티딜 콜린, 1.75%(v/v) 글리세롤, 및 0.05%(w/v) α-토코페롤을 포함한다. 바람직한 에멀젼은 8.0의 HLB와 0.2㎛의 입자 크기를 가지고 있다. 특히 바람직한 구현에서, 상기 안정한 에멀젼은 조성물의 아쥬번트성을 증강시키고자 모노포스포릴 리피드 A 또는 3-탈아실화 모노포스포릴 리피드 A와 같은 약화된 리피드 A 유도체와 조합된다.
아쥬번트, 에멀젼, 리피드 A 유도체

Description

아쥬번트 조성물 및 그의 사용방법{ADJUVANT COMPOSITION AND METHODS FOR ITS USE}
백신은 항온 동물에 투여 시 질병을 예방하거나, 개선하거나, 또는 처치하는 항원 또는 항원의 조합을 포함한다. 전염성 질병용 백신은 최초에는 완전한, 약화된, 또는 죽은 병원균을 포함하였다. 그러나, 병원균 또는 세포의 소수의 단백질 또는 단백질 단편들만이 보호 면역 반응을 자극하며, 사실상 완전한 세포로부터 유래된 외래 물질의 포함은 면역 반응을 방해할 수 있음이 곧 밝혀졌다. 따라서, 백신 개발은 특정한 단백질, 단백질 단편, 에피토프(epitope), 및 보호 면역 반응을 촉발시키는 에피토프를 코딩하는 DNA 단편의 규명에 초점을 두었다. 하지만, 항원 규명이 더욱 정확해졌음에도 불구하고, 백신 효율은 감소하였다. 규명된 항원은 종종 항원 처리 세포(antigen processing cell)에 의하여 인식될 수 없을 정도로 작은 분자였다. 따라서, 이러한 항원을 상기 항원의 항원성을 증강시키고 우수한 면역 반응을 유발하는 물질과 조합할 필요가 있었다. 이러한 물질이 아쥬번트(adjuvant)이다.
아쥬번트는 몇 가지 수단에 의하여 작용한다. 몇몇은 항원을 항원 처리 세포(antigen processing cell, "APC")에 제시하는 것을 돕는다. 수중유(oil-in- water) 에멀젼(emulsion), 유중수(water-in-oil) 에멀젼, 리포좀, 및 마이크로비드(microbead) 각각은 항원을 APC에 제시하는 것을 돕는다. 작은 항원 또는 합텐(hapten)은 종종 APC에 의한 인식을 촉진시키고자 보다 큰 면역원성(免役原性)의 단백질 또는 다당체에 연결된다. 어떤 아쥬번트는 신체가 면역 반응을 취할 기회를 얻을 때까지 항원을 한 곳에 유지해두는 보관소 효과를 가지고 있다. 다른 아쥬번트는 일반적으로 항원에 대하여 유발된 특이적인 반응을 증대시키는 면역계를 자극한다.
약화된 리피드 A 유도체(attenuated lipid A derivatives, "ALD")인 모노포스포릴 리피드 A(monophosphoryl lipid A, "MLA") 및 3-탈아실화 모노포스포릴 리피드 A(3-deacylated monophosphoryl lipid A, "3D-MLA")는 감염성 질병을 위한 예방용 백신, 및 악성 종양과 만성 감염증 처치를 위한 치료용 백신에 사용되는 강력한 면역학적 아쥬번트이다. MLA 및 3D-MLA는 박테리아 내독소(endotoxin) 리포다당체(lipopolysaccharide, "LPS")의 변형된 형태이며, 미국특허 제 4,436,727호 및 미국특허 제 4,912,094호에 각각 개시되어 있다. MLA 및 3D-MLA는 항원과 함께 상기 화합물을 투여받은 환자에게서 체액성 항원 반응 및 세포-매개 면역 반응 모두를 유발한다.
효과적인 백신은 항원을 항온 동물에 제공하여 그 동물이 그러한 항원에 대하여 보호 면역 반응을 취할 수 있도록 한다. 종종, 백신 조성물은 이러한 효과를 달성하기 위하여 아쥬번트를 포함하여야만 한다. 체액성 및 세포성 면역 반응 모두를 자극하고 안전하며 독성이 없는 아쥬번트는 모든 백신의 효능을 증진시킬 것 이다.
[발명의 요약]
본 발명은 신규한 아쥬번트 조성물이다. 상기 아쥬번트 조성물은 대사 가능한 오일, 계면활성제, 항산화제, 및 에멀젼 등장화 성분을 포함하는 안정한 수중유 에멀젼(stable oil-in-water emulsion, "SE")이다. 청구된 안정한 에멀젼의 입자 크기는 130㎚ 내지 3㎛ 이하이다. 70 내지 200㎚ 범위의 에멀젼은 여과에 의하여 멸균될 수 있다. 상기 안정한 에멀젼의 혐수성-친지성 밸런스(hydrophobic-lipophilic balance, "HLB")는 약 7.5 내지 10.5, 바람직하게는 약 8.0이다.
바람직한 구현에서, 상기 아쥬번트 조성물은 약화된 리피드 A 유도체("ALD")와 조합된다. ALD의 첨가는 상기 조성물의 아쥬번트성(adjuvanticity)을 증가시킨다. 본 발명에 따른 유용한 ALD는 모노포스포릴 리피드 A 및 3-탈아실화 모노포스포릴 리피드 A를 포함한다. ALD는 약 1 내지 12,000㎍/㎖ 범위의 농도로 상기 조성물 중에 포함될 수 있다. 신규한 안정한 에멀젼으로 된 백신 조성물 또한 청구된다.
본 발명은 대사 가능한 오일, 계면활성제, 항산화제, 및 에멀젼 등장화 성분을 포함하는 안정한 수중유 에멀젼인 아쥬번트 조성물이다. 최종적인 에멀젼은 완충제로 처리되고, 3㎛ 이하의 입자 크기를 가지고 있으며, 상기 안정한 에멀젼의 혐수성-친지성 밸런스는 약 7.5 내지 10.5, 바람직하게는 약 8.0이다.
바람직한 구현에서, 상기 안정한 에멀젼은 대사 가능한 오일인 스쿠알렌을 약 2 내지 15%(v/v), 바람직하게는 10%(v/v) 포함한다. 계면활성제는 상기 안정한 에멀젼 중에 약 2%로 존재한다. 약 50㎍의 항산화제 및 약 1.75%의 등장화제가 본 발명의 안정한 에멀젼에 첨가될 수 있다.
본 발명에 따른 유용한 대사 가능한 오일은 스쿠알렌, 콩기름, 참기름, 및 MIGLYCOL 810 오일을 포함한다. 스쿠알렌이 바람직하다.
본 발명에 따른 유용한 계면활성제는 Tween 80, CAMPUL POE-O Low PV 계면활성제(ABITEC Corp., Janesville, WI), SOLITOL HS15 계면활성제(BASF Corp., Chicago, IL), PLURONIC F68 블록 공중합체(BASF Corp., Chicago, IL), 소디움 콜레이트, 글리세로디옥시 콜레이트, 및 포스파티딜 콜린이며, PLURONIC F68 블록 공중합체가 바람직하다. Tween 80 및 CAMPUL POE-O Low PV 계면활성제는 개에 정맥내로 투여되었을 때 히스타민 타입 반응을 유발하는 것으로 밝혀졌다. 다른 적절한 계면활성제는 스핑고미엘린 및 스핑고신과 같은 스핑고리피드와, 에그 포스파티딜 콜린, 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, L-α-포스파티딜아탄올아민, 및 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린("DPPC")과 같은 포스포리피드, 또는 그들의 혼합물을 포함한다. DPPC는 인간에 사용할 수 있다.
본 발명의 안정한 에멀젼에 유용한 항산화제는 α-토코페롤 및 아스코르브산을 포함하며, α-토코페롤이 바람직하다.
아쥬번트를 등장화하기 위하여 본 발명의 에멀젼에 첨가될 수 있는 제제는 덱스트로스, 글리세롤, 만니톨, 소르비톨, PEG300, PEG400, 및 폴리에틸렌 글리콜 을 포함하며, 글리세롤이 바람직하다.
특히 바람직한 구현에서, 약화된 리피드 A 유도체("ALD")가 본 발명의 조성물에 포함된다. ALD는 더 적거나 또는 상이한 리피드 A의 역효과를 나타내도록 변형 또는 고안된 리피드 A-유사 분자이다. 상기 역효과는 발열성, 국소적인 슈바르쯔만(Schwarzman) 반응성, 및 닭 배아 50% 치사량 검정법(chick embryo 50% lethal dose assay, "CELD50")으로 평가되는 독성을 포함한다. 본 발명에 따른 유용한 ALD는 모노포스포릴 리피드 A("MLA") 및 3-탈아실화 모노포스포릴 리피드 A("3D-MLA")를 포함한다. MLA 및 3D-MLA는 공지되어 있으며, 여기에서 상세히 기술할 필요가 없다. 예를 들면, 모노스포릴 리피드 A 및 그의 제조방법을 개시하고 있는 1984년 3월 13일자에 등록된 리비 이뮤노켐 리서치 인코포레이션(Ribi ImmunoChem Research, Inc.)의 미국특허 제 4,436,727호를 참조하라. 역시 리비 이뮤노켐 리서치 인코포레이션(Ribi ImmunoChem Research, Inc.)의 미국특허 제 4,912,094호 및 마이어스 등(Myers et al.)의 재심사 증명서 B1 4,912,094는 3-탈아실화 모노포스포릴 리피드 A 및 그의 제조방법을 개시하고 있다. 이들 특허 각각의 MLA 및 3D-MLA에 대한 개시가 여기에 참조문헌으로서 포함된다.
참조 특허로써 포함된 선행기술의 상세한 내용에 대한 조사 없이, 여기에 사용된 모노포스포릴 리피드("MLA")는 강력하나 매우 유독한 면역계 조절자인 엔테로박테리아 리포다당체("LPS")의 성분인 리피드 A로부터 유래된 것이다. 에드가 리비(Edgar Ribi) 및 그의 동료들은 최초에는 정제된 비독성화된 내독소(refined detoxified endotoxin, "RDE")라 불린 모노포스포릴 리피드 A의 생산에 성공하였다. MLA는 그람-음성 박테리아의 헵토스-결여(heptoseless) 변이주로부터 수득된 내독소 추출물(LPS 또는 리피드 A)을 적절한 강도(0.1N HCl)의 미네랄산 용액 중에서 약 30분 동안 역류(reflux)시킴으로써 생산된다. 이러한 처리는 환원성 말단(reducing end) 글루코스아민의 1번 위치에 있는 인산기의 손실을 초래한다.
이와 동시에, 상기 처리 동안 핵심 탄수화물이 비환원성 글루코스아민의 6번 위치로부터 제거된다. 이로부터 생성되는 산물(MLA)은 발열성, 국소적인 슈바르쯔만 반응성, 및 CELD50으로 평가된 독성과 같은, 통상적으로 내독소 출발 물질(starting material)과 결부되어 있는 내독소 활성의 상당히 약화된 수준을 시현한다. 그러나, 그것은 뜻밖에 리피드 A 및 LPS의 면역조절자로서의 기능성을 유지한다.
본 발명의 실현에 사용될 수 있는 또 다른 비독성화된 내독소는 3-탈아실화 모노포스포릴 리피드 A("3D-MLA")라 불린다. 3D-MLA는 미국특허 제 4,912,094호 및 재심사 증명서 B1 4,912,094호에 개시되어 있으며, 다른 작용기에 해로운 영향을 주지 않는 조건하에서 3번 위치의 환원성 말단 글루코스아민에 에스테르 결합되어 있는 β-히드록시미리스틱 아실(β-hydroxymyristic acyl) 잔기가 MLA 분자로부터 선택적으로 제거되어 있다는 점에서 MLA와 다르다. 3-탈아실화 모노포스포릴 리피드 A는 리비 이뮤노켐 리서치 인코포레이션(Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, Montana 59840)으로부터 구입 가능하다.
상기 MLA 및 3D-MLA 분자는 다양한 지방산 길이를 가지는 다수의 지방산 치환 패턴 즉, 헵타아실, 헥사아실, 펜타아실 등의 조성물 또는 혼합물이다. 따라서, 다양한 형태의 MLA와 3D-MLA, 및 그들의 혼합물이 본 발명에 포함된다. 미국특허 제 4,912,094호에 개시되어 있는 리피드 A 골격은 에스. 미네소타(S. minnesota) R595로부터 유래된 헵타아실 리피드 A의 3-탈아실화에 의하여 수득되는 산물에 해당한다. 다른 지방산 치환 패턴이 상기 개시에 포함된다; 필수적인 특징은 상기 물질이 3-탈아실화되어 있다는 점이다.
본 발명에 사용되는 변형된 3D-MLA는 리피드 A 골격의 3번 위치로부터 오로지 하나의 지방산의 손실만을 초래하는 조건 하에서 MLA를 알칼리 가수분해 함으로써 제조된다. 3번 위치의 β-히드록시미리스틴 지방산(β-hydroxymyristic acid)은 일반적으로 알칼리 배지에서 불안정하다. 리피드 A를 완전하게 3-디알실화하는 데에는 단지 매우 약한 알칼리 처리만이 요구된다. 리피드 A에 있는 다른 에스테르 결합은 가수분해가 일어나기 전에 다소 강한 조건을 필요로 하므로, 리피드 A 분자의 나머지 부분에는 심각한 영향을 주지 않으면서 3번 위치에서 리피드 A를 선택적으로 탈아실화시키는 것이 가능하다. 3번 위치의 에스테르 결합된 β-히드록시미리스틴 지방산이 알칼리 배지에 일반적으로 민감한 이유는 현재는 알려져 있지 않다.
알칼리 가수분해 방법이 공지되어 있음에도 불구하고, 3번 위치의 β-히드록시미리스틴 지방산에의 에스테르 결합을 지나쳐 더 가수분해 되는 현상을 유발하지 않는 조건을 선택하는 것이 중요하다.
일반적으로, 상기 가수분해는 수성 또는 유기성 배지 내에서 이루어질 수 있다. 유기성 배지의 경우, 용매는 메탄올(알코올), 디메틸설폭사이드("DMSO"), 디메틸포름아미드("DMF"), 클로로포름, 디클로로메탄 등뿐만 아니라 그들의 혼합물을 포함한다. 물과 상기 유기 용매 중 하나 또는 그 이상을 조합하여 사용할 수도 있다.
알칼리 염기는 다양한 수산화물, 탄산염, 인산염, 및 아민 중에서 선택될 수 있다. 예시적인 염기는 수산화 나트륨, 수산화 칼륨, 탄산 나트륨, 탄산 칼륨, 중탄산 나트륨, 중탄산 칼륨 등의 무기 염기, 및 알킬 아민과 같은 유기 염기를 포함하며, 디에틸아민, 트리에틸아민 등을 포함하나 그에 한정되는 것은 아니다.
수성 배지에서 pH는 전형적으로 약 10 내지 14 사이이며, 약 12 내지 13.5의 pH 범위가 바람직하다. 가수분해 반응은 전형적으로 약 20 내지 80℃의 온도, 바람직하게는 약 50 내지 60℃의 온도에서 약 10 내지 30분 동안 수행된다. 예를 들면, 상기 가수분해는 3% 트리에틸아민 수용액 중에서 실온(22 내지 25℃)에서 48시간 동안 수행될 수 있다. 가수분해 온도 및 시간의 선택에 있어 유일한 요구사항은 탈아실화가 오로지 3번 위치의 β-히드록시미리스틴 지방산만을 제거하도록 일어나야 한다는 것이다.
실제로, 특히 바람직한 가수분해 방법은 리피드 A 또는 모노포스포릴 리피드 A를 클로로포름:메탄올=2:1(v/v) 용액에 용해시키고, 상기 용액을 0.5M Na2CO3를 포함하는 pH 10.5의 수성 완충액으로 포화시킨 다음, 40 내지 50℃에서 진공하(약 100mmHg)에서 아스피레이터(aspirator)로 용매를 증발시키는 단계를 포함하는 것으로 밝혀졌다. 이로부터 생성되는 물질은 3번 위치에서 선택적으로 탈아실화되어 있다. 이러한 방법은 또한 상술한 무기 염기 중 어느 것을 사용하여도 수행될 수 있다. 수성 완충액으로 포화시키기 이전에 테트라부틸 브롬화 암모늄과 같은 상 전달(phase transfer) 촉매를 상기 유기 용액에 첨가하는 것이 어떤 경우에는 바람직할 수 있다. 상술한 바와 같이 생산된 MLA 및 3D-MLA 뿐만 아니라, 합성 또는 반합성 방법으로 생산된 ALD를 사용하여도 좋다.
본 발명의 조성물은 아쥬번트이다. 유효량(effective amount)의 조성물이 단백질 항원과 함께 숙주에게 투여된다. 그 항원에 대한 상기 숙주의 면역 반응이 증강된다. 청구된 아쥬번트 조성물의 유효량이란 면역 반응을 자극하거나 또는 증강시키는 양이다. 당업게에서 통상의 지식을 가진 자는 그 항원에 대한 면역 반응을 자극하는데 필요한 항원의 양을 알 것이다. 예를 들면, 본 발명의 바람직한 구현에서 투여된 B형 간염 바이러스의 표면 항원(hepatitis B surface antigen, "HBsAg") 2.5㎍은 마우스에서 체액성 반응을 유발하였다.
뜻밖에 본 발명의 안정한 에멀젼은 ALD와 결합되었을 때 ALD의 발열성을 상당히 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 발열성이란 화합물에 의하여 열이 나는 상태가 유발되는 것이다. ALD, 3D-MLA는 본 발명의 안정한 에멀젼에 조성물화 되었을 때보다 40% 폴리에틸렌 글리콜, 10% 에탄올에 조성물화 되었을 때 더 높은 발열 반응을 유발한다. 조성물의 발열성은 스탠다드 쓰리 래빗 USP 발열물질 테스트(standard three rabbit USP pyrogen test)로 평가될 수 있다. 즉, 3 마리 의 토끼에게 다양한 투여량으로 화합물을 투여한다. 각 동물의 체온을 4시간에 걸쳐 모니터링한다. 모든 온도 감소는 온도 상승 제로로 기록된다. 0.5。F 이하의 온도 상승은 비발열성으로 간주된다. 만약 조성물이 0.5。F 이상의 온도 상승을 야기했다면, 그 조성물은 5 마리의 다른 토끼를 사용하여 재검사된다. 8 마리의 토끼 중 최대 3 마리가 0.5。F 이상의 온도 상승을 시현하고, 8 마리 토끼 각각에서의 온도 상승의 총합이 3.3。F를 초과하지 않는다면, 상기 조성물은 비발열성으로 간주된다.
하기는 본 발명의 실행을 위한 과정을 기술하는 실시예이다. 달리 언급하지 않는 한 모든 퍼센트는 중량%이며, 모든 용매 혼합 비율은 부피비이다.
실시예 1: 3D-MLA/SE의 제조
특히 바람직한 구현에 있어서, 본 발명의 안정한 에멀젼은 다음을 포함한다:
재료 양
3D-MLA 1.200-0.005%(w/v)
스쿠알렌 10.000%(v/v)
PLURONIC-F68 블록 공중합체 0.091%(w/v)
에그 포스파티딜 콜린 1.909%(w/v)
글리세롤 1.800%(v/v)
α-토코페롤 0.050%(w/v)
주사용 물 78.200%(v/v)
인산 암모늄 완충액 10.000%(v/v)

당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 청구된 에멀젼을 제조하는 방법은 분명할 것이다. 그러나, 청구된 에멀젼은 3개의 스톡(stock) 용액 즉, MLA/egg PC 스톡, 오일 스톡 용액 및 수성 스톡 용액을 정해둠으로써 가장 용이하게 제조되는 것으로 밝혀졌다.
상기 MLA/egg PC 스톡을 제조하기 위하여, 3-탈아실화 모노포스포릴 리피드 A(3D-MLA; Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT) 및 에그 포스파티딜 콜린("egg PC") 각각을 클로로포름:메탄=4:1("C:M")에 용해시킨다. 이어서, 상기 용액을 취합한 후 C:M을 증발시킨다. 상기 혼합물을 동결건조기에서 감압 하에 약 1 내지 2시간 동안 방치하여 남아있는 C:M을 제거한다.
α-토코페롤 및 스쿠알렌을 혼합하고 가열된 수조에서 용해될 때까지 저어 오일상(oil phase) 스톡 용액을 제조한다.
PLURONIC F-68 NF 블록 공중합체 및 글리세롤을 스크류 캡 병에 무게를 달아 넣어 수성상(aqueous phase) 스톡 용액을 제조한다. 상기 병에 주사용 물(Water for Injection)을 첨가하고, 병을 데우면서 내용물이 용해될 때까지 서서히 혼합한다. 0.25M 인산 암모늄 완충액(pH 5.1±0.005)을 상기 PLURONIC F-68 NF 블록 공중합체/글리세롤/물에 첨가한다. 원하는 부피가 되도록 물을 더 첨가한다.
안정한 에멀젼을 제조하기 위하여, 스톡 오일상을 MLA/egg PC 혼합물과 합한다. 상기 혼합물을 MLA가 용해될 때까지 초음파 처리한다. 이어서, 상기 수성상을 75℃까지 가열하면서 상기 오일상을 75℃까지 가열한다. 상기 오일상 MLA/egg PCC 혼합물에 수성상을 서서히 가하면서 실버슨 에멀젼화기(Silverson Emulsifier) 로 에멀젼화시킨다. 이로부터 생성되는 SE 에멀젼은 8.0의 HLB를 가지고 있으며, 얼음 속에서 실온으로 냉각된다. 상기 에멀젼은 애브스틴 C-50 균등기(Avestin C-50 homogenizer)를 사용하여 22,000 내지 25,000 psi의 밸브 압력에서 입자 크기가 ≤0.2㎛가 될 때까지 더 균등질화(homogenation) 될 수 있다. 최종적인 아쥬번트 산물을 0.2㎛ 친수성 막 필터를 사용하여 여과한다. 추가적인 균등질화 및 최종적인 필터 멸균(sterilization)은 조성물 중의 3D-MLA의 양 또는 그 조성물의 아쥬번트성에 영향을 주지 않는다.
실시예 2: 3D-MLA/SE를 사용한 항체 반응의 유발
마우스를 상기 실시예 1에서 제조된 아쥬번트 중에 조성물화 된 B형 간염 바이러스 표면 항원("HBsAg") 2.5㎍으로 0일째에 1차 면역화(1°)시켰다. 이때, 주입은 피하로 이루어졌다(200㎕/주입). 21일째에 상기 마우스를 2차 면역화(2°)시켰다(200㎕/주입). 상기 1차 면역화 후 제 19일(day 19 post 1°)과 2차 면역화 후 제 27일(day 27 post 2°)에 마우스로부터 채혈하였다. 혈청을 수집하여 항-HBsAg 항체에 대한 표준 ELISA로 검사하였다. 하기 표 1은 본 발명의 아쥬번트 조성물이 HBsAg과 함께 동물에 투여되었을 때, 항-HBsAg 항체의 생산을 유도함을 보여준다.
3D-MLA/SE를 사용하여 생성된 항-HBsAg 항체 역가(titer)
항-HBsAg 역가 -1
IgG 1 -특이적 IgG 2a -특이적
아쥬번트 3D-MLA ㎍ 1차 면역화 후 제 19일 2차 면역화 후 제 27일 1차 면역화 후 제 19일 2차 면역화 후 제 27일
면역화 7일전에 미리 1/10 희석됨 3D-MLA/SE 50 16K* 256K 64K 1000K
3D-MLA/SE 25 32K 512K 64K 1000K
3D-MLA/SE 5 16K 256K 16K 512K
3D-MLA/SE 1 8K 256K 16K 256K
SE(Vehicle) 0 4K 128K 2K 64K
PBS 0 2K 32K 2K 64K
면역화 당일에 1/10 희석됨 3D-MLA/SE 50 16K 256K 64K 1000K
3D-MLA/SE 25 16K 256K 64K 1000K
3D-MLA/SE 5 8K 128K 32K 512K
3D-MLA/SE 1 4K 128K 16K 256K
SE(Vehicle) 0 2K 128K 1K 64K
PBS 0 1K 128K 2K 32K
정상 혈청 -- <0.5K <0.5K <0.5K <0.5K
*K=103
실시예 3: 세포독성 T-림프구 반응의 자극
A) 본 발명의 아쥬번트 조성물 및 단백질 항체 투여 후의 세포독성 T-림프구("CTL") 반응의 유도를 세포독성 검정법으로 확인하였다. C57/BL/6 마우스 군들을 본 발명의 안정한 에멀젼("SE") 전달체(vehicle) 중에 조성물화 된 B형 간염 바이러스 표면 항원("HBsAg") 1.0㎍ 및 3D-MLA/SE로 피하로(서혜부, inguinal region) 1차 면역화시켰다. MLA/SE 아쥬번트는 상기 실시예 1에서와 같이 제조되었다. 청구된 안정한 에멀젼의 안정성을 검사하기 위하여, 상기 에멀젼을 항원과 혼합하기 7일 전에 또는 면역화 당일에 1/10 희석하였다. 주입량은 200㎕였다. 14일 후에, 실험군 당 3 마리의 마우스를 죽여서 비장을 제거한 후에, 단일 세포 현탁액으로 수집하고 수를 세었다. 각 군에 남아있는 마우스를 SE 전달체 중에 조성물화 된 HBsAg 1.0㎍ 및 3D-MLA/SE 아쥬번트로 피하로(서혜부) 2차 면역화시켰다. 14일 후에, 각 실험군의 모든 마우스를 죽여서 비장을 제거한 후에, 단일 세포 현탁액으로 수집하고 수를 세었다.
상기 실험군으로부터의 비장 세포(3-4㎖ 배지 중의 75×106 세포)를 25㎠ T-플라스크에 넣었다. 그런 다음, 1.0㎖의 방사선(20,000rads) 처리된 E.G7(OVA) 세포(5×106 세포/㎖)를 상기 플라스크에 첨가하였다. 부피를 10㎖로 맞추었다. 상기 T-플라스크를 37℃, 5% CO2 배양기에 4일 동안 놓아둠으로써 상기 배양액을 유지하였다. 4일째에 살아남은 세포를 플라스크로부터 회수하여, 1회 세척하고 5.0㎖에 재현탁한 다음, 수를 세었다.
회수된 작동세포(effector cell)를 5×106 생균/㎖로 조정하고, 100㎕를 희석제로 100㎕/웰의 배지를 사용하여 96웰 라운드-바텀(round-bottom) 플레이트(Corning 25850)의 웰에 3중으로 계단희석(serial dilution) 하였다. 그런 다음, 51Cr으로 표지된(하기를 참조할 것) 1×105 세포/㎖ 농도의 타겟세포[E.G7(OVA)-오브알부민 유전자로 형질감염된 EL-4 세포계] 100㎕를 상기 웰에 첨가하였다. MR(maximal release) 웰은 타겟세포 100㎕와 계면활성제(2% Tween 20) 100㎕를 포함하였다. 작동세포/타겟세포(E/T) 비는 50:1, 25:1, 12.5:1, 6.25:1이었다. 상기 플레이트를 400×g에서 원심분리하고 37℃, 5% CO2 배양기에서 4일 동안 배양하였다. 배양 후에 웰 상등액을 스카트론 수퍼네이턴트 콜렉션 시스템(Skartron Supernatant Collection System)을 사용하여 회수하였다.
특이적인 용해 퍼센트(percent specific lysis)=
Figure 112000023428362-pct00001
타겟세포인 E.G7(OVA)는 51Cr(크롬산 나트륨)으로 하기와 같이 표지되었다. 15㎖ 코니칼 튜브에서 총 부피 1.0㎖ 중에 5×106 타겟세포와 250μCi 51Cr을 혼합하였다. 상기 세포 현탁액을 매 15분 마다 부드럽게 혼합해주면서 37℃ 항온수조에서 90분 동안 배양하였다. 배양 후, 상기 표지된 세포를 원심분리하고 15㎖ 배지로 옮겨 따르기를 반복하여 3회 세척하였다. 세 번째 원심분리 후에 세포를 10㎖의 신선한 배지에 재현탁하고 30분 동안 실온에서 방치하였다. 최종적으로 세포를 1×105 세포/㎖의 농도로 배지에 재현탁하였다. 세포독성 검정의 결과를 하기 표 2 및 표 3에 나타내었다.
1차 면역화 후 제 14일의 세포독성 반응
% 세포독성 E/T
아쥬번트 MLA ㎍ 50:1 25:1 12.5:1 6.25:1
면역화 7일 전에 미리 희석됨 3D-MLA/SE 50 44 30 18 7
3D-MLA/SE 25 36 17 11 6
3D-MLA/SE 5 29 13 9 4
3D-MLA/SE 1 27 13 7 3
SE(Vehicle) 0 25 13 7 4
PBS 0 7 5 2 0
면역화 당일에 희석됨 3D-MLA/SE 50 21 12 5 3
3D-MLA/SE 25 48 36 24 13
3D-MLA/SE 5 22 14 9 4
3D-MLA/SE 1 25 14 7 3
SE(Vehicle) 0 24 11 6 3
PBS 0 8 3 1 0
정상 혈청 -- 6 3 2 0
2차 면역화 후 제 14일의 세포독성 반응
% 세포독성 E/T
아쥬번트 MLA ㎍ 50:1 25:1 12.5:1 6.25:1
면역화 7일 전에 미리 희석됨 3D-MLA/SE 50 89 65 41 25
3D-MLA/SE 25 79 64 40 23
3D-MLA/SE 5 64 45 27 16
3D-MLA/SE 1 44 30 18 8
SE(Vehicle) 0 65 39 31 18
PBS 0 28 18 10 6
면역화 당일에 희석됨 3D-MLA/SE 50 80 56 39 26
3D-MLA/SE 25 77 48 31 18
3D-MLA/SE 5 86 68 43 28
3D-MLA/SE 1 63 36 23 11
SE(Vehicle) 0 63 42 28 14
PBS 0 17 12 7 4
정상 혈청 -- 7 2 0 0
B) 3D-MLA/SE 및 단백질 항원의 투여는 처리된 마우스에서 세포독성 T-림프 구 반응 및 항원 생산 모두를 유도하였다. BALB/C 마우스를 제 0일(1°)과 제 21일(2°)에 2.0㎍ HBsAg+25㎍ 3D-MLA/SE로 피하로 면역화시켰다. CTL 검정을 상기와 같이 수행하였다. 3D-MLA/SE 아쥬번트는 상기 실시예 1에서와 같이 제조되었다. 하기 표 4는 세포독성 T-림프구의 반응이 유도되었음을 보여준다.
세포독성 반응
% 세포독성 E/T
아쥬번트 경과일 50:1 25:1 12.5:1 6.25:1
3D-MLA/SE 1차 면역화 후 제 17일 55 27 14 10
Vehicle SE 32 16 9 6
3D-MLA/SE 2차 면역화 후 제 16일 81 62 47 24
Vehicle SE 38 23 14 8

HBsAg에 대한 항체가(antibody titer)의 결과를 하기 표 5에 나타내었다. 2차 면역화 후 제 28일에 채혈한 혈액으로부터의 혈청을 HBsAg 또는 HBsAg의 S-영역에서 발견되는 B-세포 에피토프를 포함하는 110번-137번 아미노산 잔기의 28개 아미노산 펩티드(p72)로 코팅된 ELISA 플레이트 상에서 역가측정하였다.
처리된 마우스에서의 항-HBsAg 항체 역가
항-HBsAg 역가 -1
HBsAg p72-펩티드
아쥬번트 IgG 1 IgG 2a IgG 1 IgG 2a
3D-MLA/SE 1024K 2048K 64K 256K
Vehicle SE 1024K 64K 64K 4K
정상 마우스 혈청 <0.5K <0.5K <0.5K <0.5K

3D-MLA/SE로 처리된 마우스는 B형 간염 바이러스 표면 항원에 대하여 체액성 반응 및 세포독성 T-림프구 반응 모두를 나타내었다.
실시예 4: 3D-MLA/SE의 발열성 평가
3D-MLA/SE 아쥬번트를 스탠다드 쓰리 래빗 USP 발열물질 테스트(standard three rabbit USP pyrogen test; NAMSA, Northwood, OH)로 평가하였다. 본 발명의 3D-MLA/SE 아쥬번트를 40% 프로필렌 글리콜("PG") 및 10% 에탄올("EtOH") 중에 조성물화된, 5, 8, 11, 14, 15, 17, 20, 25, 30, 35 ㎍/㎏의 투여량으로 2회의 실험에 걸쳐 평가된 3D-MLA와 비교하였다. 상기 3D-MLA/SE 조성물을 동일한 래빗 발열물질 테스트에서 75, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350㎍/㎏의 투여량으로 2회의 실험에 걸쳐 평가하였다. 발열성 투여량 및 경계치(borderline) 발열성 투여량을 확립된 USP 정의에 따라 정하였다. 경계치 발열성 투여량이란 3 마리 토끼 중 적어도 한 마리가 투여 후 3시간에 걸쳐 베이스 라인 위로 ≥0.5℃의 온도 상승 피크를 나타내는 투여량이다.
40% PG/10% EtOH 중의 3D-MLA의 발열성
최대 온도 상승
투여량 ㎍/㎏ 토끼 1 토끼 2 토끼 3 합계 ℃
35 1.1 0.6 0.9 2.6
35 1.1 0.9 2.4 4.3
30 0.9 0.6 0.7 2.2
25 0.7 1.1 0.9 2.7
20 0.5 0.6 0.6 1.7
17 0.4 0.3 0.3 1.0
15 0.4 0.3 0.4 1.1
14 0.4 0.3 0.3 1.0
11 0.1 0.2 0.1 0.4
8 0.0 0.1 0.1 0.2
5 0.1 0.0 0.0 0.1

3D-MLA/SE의 발열성
최대 온도 상승
투여량 ㎍/㎏ 토끼 1 토끼 2 토끼 3 합계 ℃
350 0.7 0.6 0.8 2.1
350 0.3 0.6 0.6 1.5
300 0.8 0.7 0.6 2.1
250 0.4 0.5 0.3 1.2
200 1.0 1.0 1.1 3.1
200 0.2 0.1 0.1 0.4
150 0.3 0.2 0.2 0.7
150 0.1 0.3 0.2 0.6
125 0.1 0.1 0.1 0.1
100 0.1 0.2 0.1 0.4
75 0.0 0.1 0.1 0.2

3D-MLA/SE 아쥬번트를 발열성에 대하여 더 평가하고, 10% EtOH 중에 조성물화된 3D-MLA와 비교하였다.
3D-MLA/SE 대 10% EtOH 중의 3D-MLA의 발열성
최대 온도 상승
물질 투여량 ㎍/㎏ 토끼 1 토끼 2 토끼 3 합계 ℃
3D-MLA/EtOH 10 1.5 1.5 1.5 4.5
3D-MLA/EtOH 5 0.7 0.9 0.4 2.0
3D-MLA/EtOH 2.5 0.3 0.4 0.1 0.8
3D-MLA/EtOH 2.5 0.1 0.2 0.1 0.4
3D-MLA/EtOH 1.25 0.0 0.0 0.0 0.0
3D-MLA/SE 200 0.6 0.6 1.0 2.2
3D-MLA/SE 150 0.5 0.2 0.4 1.1
3D-MLA/SE 100 0.2 0.3 0.1 0.6
3D-MLA/SE 50 0.0 0.0 0.0 0.0
3D-MLA/SE 75 0.1 0.1 0.3 0.5
3D-MLA/SE 50 0.0 0.2 0.0 0.2
3D-MLA/SE 35 0.3 0.1 0.1 0.5
3D-MLA/SE 20 0.0 0.0 0.0 0.0
3D-MLA/SE 10 0.0 0.0 0.1 0.1
3D-MLA/SE 0 0.4 0.0 0.0 0.4

40% PG/10% EtOH 중의 3D-MLA는 20㎍/㎏이 경계치 발열성 투여량이고, 3D-MLA/SE는 200㎍/㎏이 경계치 발열성 투여량이므로, 발열성에 있어 10배의 차이가 있다. 3D-MLA/SE 아쥬번트는 3D-MLA의 다른 조성물보다 훨씬 덜 발열성이었다(참조: 표 6 및 7). 또한, 본 발명의 아쥬번트 조성물은 주입 부위 및 주입 부위와 비장을 draining하는 림프절에서 약제와 연관된 병소를 최소한도로 유발하거나 또는 전혀 유발하지 않으므로 안전하다.
여기에 기술된 실시예 및 구현은 오로지 설명의 목적을 위한 것으로, 그들의 다양한 변형 또는 변화가 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 제안될 것이며, 본 출원 및 첨부된 청구항의 정신 및 권한 내에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.

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  25. 3D-MLA 25 ㎍; 및
    대사 가능한 오일, 하나 또는 그 이상의 계면활성제, 항산화제, 및 조성물 등장화 성분을 포함하는 수중유 에멀젼(oil in water emulsion)으로 이루어진 아쥬번트 조성물.
  26. 제 25항에 있어서, 상기 대사 가능한 오일은 스쿠알렌인 것을 특징으로 하는 아쥬번트 조성물.
  27. 제 25항에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 계면활성제는 Tween 80, CAMPUL POE-O Low PV 계면활성제, SOLITOL HS15 계면활성제, PLURONIC F68 블록 공중합체, 소디움 콜레이트, 글리세로디옥시 콜레이트, 스핑고미엘린 스피노신, 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, L-α-포스파티딜에탄올아민, 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 및 에그 포스파티딜 콜린, 또는 그들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 아쥬번트 조성물.
  28. 제 25항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항산화제는 α-토코페롤 및 아스코르브산으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 아쥬번트 조성물.
  29. 제 28항에 있어서, 상기 항산화제는 α-토코페롤인 것을 특징으로 하는 아쥬번트 조성물.
  30. 3D-MLA 25 ㎍; 및
    대사 가능한 오일, 하나 또는 그 이상의 계면활성제, 항산화제, 및 조성물 등장화 성분을 포함하는 수중유 에멀젼(oil in water emulsion)으로 이루어진 백신(vaccine) 조성물.
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