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Verfahren zur Gewinnung eines Hydrolase aktivierenden Wirkstoffes Ziel der Erfindung ist die Gewinnung eines dialysierbaren Wirkstoffes aus Gallenblase, der auf eines oder mehrere der hydrolytischen Pankreas-Enzyme eine ausgeprägte aktivierende Wirkung ausübt, Ausfallserscheinungen der Gallenblasenfunktion verhütet, einen schmerzlindernden Effekt bei Erscheinungen des Postcholecystektomiesyndroms bewirkt und die Fettverträglichkeit verbessert. i In der Literatur (vgl. Münchner Medizinische Wochenschrift [1935], S. 1823) wurde bereits über das Vorhandensein eines Wirkstoffes in der Gallenblasenwand von hormonartigem Charakter berichtet, der die Wirkung der Pankreas-Lipase erhöht und Ausfallserscheinungen bei Leber-und Gallenerkrankungen wirksam
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stickstofffreieCholesterin-ähnliche Substanz handeln.
Versuche, den vermuteten Wirkstoff zu isolieren, hatten bisher keinen Erfolg. Insbesondere ergab die
Extraktion mit Fettlösungsmitteln, was für die Isolierung von Cholesterin-ähnlichen Substanzen in erster
Linie in Frage kommt, keinen Extrakt von Substanzen mit der gewünschten Wirkung.
Nach dem erfindungsgemässen Vorschlag wird der Hydrolase aktivierende Wirkstoff dadurch gewonnen, dass man zerkleinerte Gallenblasenwand mit Wasser oder wässerigen Lösungen bei einem pH-Wert von über 4, vorzugsweise 7, 5 bis 8, autolysiert, den Autolysenextrakt gegen Wasser oder Pufferlösungen mit einem pH-Wert von über 4 dialysiert oder mit Eiweissfällungsmitteln, wie Aceton oder Ammoniumsulfat, fraktioniert fällt, worauf im Falle der Dialysierung das Dialysat konzentriert und im Falle der fraktionierten Fällung das ausgefällte Produkt gesammelt wird.
Die Autolyse kann vorteilhaft bei einer Temperatur von Raumtemperatur bis 45 C, vorzugsweise 37 bis 400C, während einer Dauer von weniger als 8 h, vorzugsweise 3-5 h, durchgeführt werden.
Es kann vorteilhaft sein, die Autolyse in Gegenwart eines Fettlösungsmittels, wie Toluol, oder nach einer vorhergehenden mehrfachen Kryolyse durchzuführen. Der Zusatz von Toluol bewirkt die Zerstörung von eventuell vorhandener Lipase, ohne die gewünschte Hydrolase aktivierende Substanz zu beeinträchtigen.
Wie bereits oben erwähnt, kann die Aufarbeitung des Autolysates entweder durch Dialyse oder durch Behandlung mit Eiweissfällungsmitteln durchgeführt werden. Bei Anwendung des Dialysierungsverfahren verwendet man zweckmässig destilliertes Wasser oder verdünnte Pufferlösungen im pH-Bereich zwischen 7 und 8 als Dialysierungsmittel gegenüber dem Autolysenextrakt. Wenn die Aufarbeitung des Autolysenextraktes durch fraktionierte Fällung erfolgt, hat sich als beste Methode eine zweifache Fällung erwiesen, wobei der Autolysenextrakt zuerst mit der etwa dreifachen Volumsmenge kaltem Aceton behandelt, der Niederschlag verworfen und die übrigbleibende Flüssigkeit ein zweites Mal mit der etwa dreifachen Volumsmenge kaltem Aceton behandelt wird, worauf der Niederschlag, der den aktivierenden Wirkstoff enthält, in Wasser gelöst wird.
Die Reinigung des aktivierenden Wirkstoffes bzw. der Lösung, die den Aktivator enthält, kann zweckmässig durch Adsorption bzw. Chromatographie erfolgen. Die zur chromatographischen Trennung verwendeten Lösungsmittelgemische bestehen vorzugsweise aus einer Mischung von sek. Butanol, Ameisensäure und Wasser und aus einer Mischung von Äthanol, Butanol, Propionsäure und Wasser, die nacheinander angewendet werden.
Das erfindungsgemässe Verfahren wird durch das nachfolgende Beispiel näher erläutert.
Beispiel : Gereinigte trockene Gallenblasenwand wird mit gereinigtem Seesand und, der etwa
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35fachen Gewichtsmenge einer n/100 mol. Phosphatpufferlösung mit einem PH-Wert von 7, 5 feinst zer- rieben ; nach Zusatz von 5. VOl. -% Toluol wird die Mischung einer 5stündigen Autolyse bei 370C unter- worfen, wobei der Autolysebrei von Zeit zu Zeit geschüttelt oder langsam gerührt wird.
Nach erfolgter Autolyse wird die Mischung zentrifugiert, der Rückstand mit n/100 mol. Ammoniaki Ammoniumchloridpufferlësung bei einem PH-Wert von 8, 3 dreimal kurz gewaschen und das Waschwasser mit der zentrifugierten Lösung vereinigt. Die Lösung wird neutralisiert und der Niederschlag verworfen. a) Nach einer Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens kann der Gallenblasenwandextrakt durch Dialyse isoliert werden. Dies geht in folgender Weise vor sich :
50 ml des bereiteten Autolysates werden mittels einer dünnwandigen Dialysemembran gegen 500 ml destilliertes Wasser 24 h bei Raumtemperatur dialysiert. Zum Schutz gegen Bakterienbefall kann dem Di- alysat eine Spur Chloroform zugesetzt werden. Die Dialyse wird vorteilhaft durch langsame Rotation des
Dialysenschlauches beschleunigt.
Die Bestimmung der Aktivität, deren Methodik später genau erläutert wird, ergab die folgenden
Werte :
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<tb>
<tb> Aktivität <SEP> des <SEP> Enzyms <SEP> e <SEP> = <SEP> zo
<tb> Aktivierung <SEP> : <SEP> 2200/0. <SEP>
<tb>
Aktivität <SEP> des <SEP> Enzyms <SEP> nach <SEP> Zusatz <SEP> von <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> ml <SEP> Dialysat <SEP> e <SEP> = <SEP> 0, <SEP> 193
<tb> (e <SEP> = <SEP> molarer <SEP> Extinktionskoeffizient)
<tb>
Einengen des Dialysates im Vakuum (14 mm Hg/37 C) auf ungefähr die Hälfte (von 425 ml auf 210 ml) ergab :
Aktivität des Enzyms nach Zusatz von 0, 5 ml Konzentrat e = 0, 226 Aktivierung : 276%.
Das Dialysenwasser kann auch durch Gefirertrocknung entfernt und die Lyophilisate anschliessend wieder in Wasser gelöst werden, was schonender ist als die Einengung im Vakuum. Derartige durch Gefriertrocknung erhaltene Extrakte zeigten eine Aktivierung in vitro um mehrere 100%. b) Nach einer andern Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens kann der gewünschte Wirkstoff durch Acetonfällung aus dem Autolysenextrakt gewonnen werden.. Dies geht in folgender Weise vor sich :
50 ml des Autolysenextraktes werden in einer Eis-Kochsalzmischung gekühlt und mit 150 ml eiskaltem Aceton tropfenweise gefällt. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren abgetrennt, mit je 10 ml n/100 mol.Ammoniak-Ammoniumchloridpufferlösung bei einem pH-Wert von 8, 3 gewaschen und die Waschflüssigkeit mit dem Zentrifugat vereinigt.
Die so vereinigten Flüssigkeitsmengen werden aufeinen pH-Wert von 7, 9 eingestellt und eiskalt wieder mit der dreifachen Volumsmenge an eiskaltem Aceton unter Rühren tropfenweise gefällt. Der entstehende Niederschlag wird abgetrennt und in Wasser gelöst ; die Lösung enthält den Hauptanteil des Aktivators.
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<tb>
<tb>
Aktivität <SEP> des <SEP> Enzyms <SEP> e <SEP> =O'O54}
<tb> Aktivität <SEP> des <SEP> Enzyms <SEP> nach <SEP> Zusatz <SEP> von <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> ml <SEP> der <SEP> Aktivelerung: <SEP> 530%.
<tb> wässerigen <SEP> Lösung <SEP> aus <SEP> der <SEP> zweiten <SEP> Acetonfällung <SEP> e <SEP> = <SEP> 0, <SEP> 285 <SEP>
<tb>
Die Dialysenmethode kann auchin Kombination mit der Fraktionierungsmethode angewendet werden.
Beispielsweise kann die Dialyse zur Abtrennung von Resteiweiss dienen, wenn durch fraktionierte Fällung ein an aktivierendem Wirkstoff angereichertes und durch wiederholte Fällung eiweissarmes Produkt erhalten worden ist.
Die Reinigung der aktivierenden Substanz kann auf chromatographischem Wege in folgender Weise durchgeführt werden :
Als erstes Lösungsmittelgemisch wird eine Mischung von sek. Butanol, Ameisensäure und Wasser im Verhältnis von 75 : 15 : 10 verwendet. Im aufsteigenden Papierchromatogramm hat der Aktivator unter diesen Bedingungen den Rf-Wert : 0, 141. An derselben Stelle befinden sich noch fünf Aminosäuren. Von diesen kann der aktivierende Wirkstoff getrennt werden, indem er aus dem Papierchromatogramm eluiert und das Eluat abermals chromatographiert wird. Dabei wird das Lösungsmittelgemisch : Äthanol : Buta- nol : Wasser : Propionsäure = 10 : 10 : 5 : 2 verwendet. Unter diesen Bedingungen hat der Aktivator im aufsteigenden Chromatogramm den Rf-Wert : 0, 49.
Der aktivierende Wirkstoff ist nun von den Aminosäuren abgetrennt (Rf 0, 25). Die Chlorimidreaktion auf Peptide ist positiv. Eluate sowohl der ersten als auch der zweiten Laufrichtung aktivierten die Enzymreaktion in vitro um mehr als 100%.
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Die Methodik der Aktivitätsbestimmung war wie folgt :
Für die Bestimmung hat sich ein photometrisches Verfahren als geeignet gezeigt, bei welchem die aktivierende Wirkung der Gallenblasenwandextrakte auf eine Hydrolase des Pankreas bei der enzymati- schen Hydrolyse von ss-Naphthyllaurat als Substrat gemessen wird.
Durch die Hydrolase wird ss-Naphthyllaurat in ss-Naphthol und Laurinsäure gespalten. ss-Naphthol wird mit einer Azokomponente zu einem Azofarbstoff gekuppelt, dessen Farbintensität ein Mass für die Enzymwirkung darstellt. Die Differenz der Farbintensität mit und ohne Aktivatorzusatz ist ein Mass der aktivierenden Wirkung der Gallenblasenwandextrakte auf das Enzym und kann in %-Aktivierung ausgedrückt werden :
Reagentien :
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im Kühlschrank.
2. Tetra-azodiorthoanisidin : 0, 1 g in 25 ml Wasser gelöst. Bereitung der Lösung knapp vor Versuchsbeginn.
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mol. VeronalpufferlösungpH-Wert 7, 4.
4. 40% igue Trichloressigsäure.
5. n-Butanol.
6. Ferment : Glycerinextraktaus Pankreasgewebe (Willstätter und Waldschmidt-Leitz, Z. f. physiologische Chemie 125 [1923], S. 132 wurde in folgender Weise hergestellt :
Das feingemahlene Drüsentrockenmaterial wird mit 10 - 20 Teilen Sägern Glycerin 4 h bei 300C extrahiert und die Suspension durch ein weiches Faltenfilter filtriert. Hiedurch wird eine wesentliche Reinigung der Lipase von andern Fermenten und in dem Trockenpulver enthaltenen Stoffen, die durch Glycerin nicht gelöst werden, erzielt. In einem Messkölbchen wird 0, 1 ml des Glycerinextraktes auf 10 ml
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2Methodik :
Zu einer Mischung aus 35 ml Wasser und 10 ml Pufferlösung (Reagens 3) werden unter ständigem
Schütteln aus einer Pipette 5 ml der Stammlösung des Substrates zugesetzt.
Es entsteht eine milchige Suspension, die das Substrat für die einzelnen Versuche darstellt. In 6 Eprouvetten werden je 5 ml des wie oben bereiteten Substrates pipettiert, und die Eprouvetten in einem Thermostaten auf 370C vorgewärmt. Sodann wird in die Eprouvetten Nr. 2und 3 1/10 mldes im Verhältnis 1 : 100 verdünnten Glycerinextraktes pipettiert, und in die Eprouvetten Nr. 5 und 6 dieselbe Enzymmenge plus einer entsprechenden Menge des Gallenblasenwandextraktes (etwa 0, 2 ml). Man inkubiert etwa 30 min bei 370C und fügt nach dieser Zeit in die Eprouvette Nr. l 0, 1 ml Fermentlösung bzw. in die Eprouvette Nr. 4 0, 1 ml Enzymlösung plus der entsprechenden Gallenblasenwandlösung, die auch für den Versuch Anwendung fand.
Die in den Eprouvetten Nr. l und 4 enthaltenen Lösungen dienen als Leerwert.
Nun wird sofort jeder der Eprouvetten 1 ml Farbstoffkomponente zugesetzt, gut durchgeschüttelt und nach etwa 1 min 1 ml 40% Lge Triehloressigsäure zugegeben und wiederum geschüttelt. Nun wird der ausgebildete Farbstoff mit 10 ml Butanol ausgeschüttelt, das farbstoffhaltige Butanol durch ein kleines Faltenfilter filtriert und die klare Lösung für die photometrische Messung verwendet.
Man bestimmt die Enzymaktivität, indem man die Werte 2 und 3 gegen den Leerwert 1 kompensiert, und die aktivierende Wirkung des Gallenbiasenwandextraktes, indem man die Werte 5 und 6 gegen den Leerwert 4 photometriert. Die Menge des freigesetzten ss-Naphthols wird aus einer entsprechend angelegten Eichkurve entnommen. Die aktivierende Wirkung wrd erhalten, indem der Mittelwert des Ansatzes 2 und 3 vom Mittelwert des Ansatzes 4 und 5 abgezogen wird. Die Aktivierung ist in % der Fermentaktivität ausdrückbar.
Die photometrische Messung wird bei 538 mu und in Kuvetten mit der Schichtdicke 1 cm durchgeführt.
Das durch chromatographische Reinigung des Aktivators erhaltene Produkt-wobei die oben erwähnten Lösungsmittelgemische verwendet werden - kann frei von Aminosäuren, Zuckern, Bakterien und Gallensäuren erhalten werden. Qualitative Untersuchungen machen es wahrscheinlich, dass es sich um eine definierte, Stickstoff- und Eiweissverbindungen enthaltende Substanz handelt, also um kein Cholesterinderi- vat.
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Das erfindungsgemäss hergestellte Präparat ist der Wirkstoff von Gallenblasenwandrohprodukten. Es wurde während mehrerer Jahre an einer grossen Zahl von Patienten stationär angewendet. Zur Anwendung gelangten sowohl Injektionslösungen als auch Tabletten.
Die Erfolge waren überaus befriedigend. Ausfallserscheinungen der Gallenblasenfunktion wurden zu- verlässig verhütet. Der Schmerz bei Erscheinungen des Posteholecystektomiesyndroins im engeren Sinn ge- lindert und die Fettverträglichkeit verbessert. Es hat sich auch bei klinischer Beobachtung gezeigt, dass bei nicht operierten Fällen die Fettverträglichkeit wesentlich gebessert wird.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Gewinnung eines Hydrolase aktivierenden Wirkstoffes, dadurch gekennzeichnet, dass man zerkleinerte Gallenblasenwand mit Wasser oder wässerigen Lösungen bei einem pH-Wert von über 4, vorzugsweise 7, 5-8, autolysiert, den Autolysenextrakt gegen Wasser oder Pufferlösungen mit einem PH-Wert von über 4 dialysiert oder mit Eiweissfällungsmitteln, wie Aceton oder Ammoniumsulfat, fraktioniert fällt, wobei im Falle der Dialysierung das Dialysat konzentriert und im Falle der fraktionierten Fällung das ausgefällte Produkt gesammelt wird.