DE1617889C - Verfahren zur Herstellung eines Wirk Stoffs zur Stimulierung der Funktion des retikulo endothehalen Systems aus einer einzelligen grünen Alge - Google Patents

Description

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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur endotheüalen Systems besitzt, die derjenigen des Herstellung eines Wirkstoffs zur. Stimulierung der »Zymosans« überlegen ist.

Funktion des retikulo-endothelialen Systems aus Der Erfindung liegt demgemäß die Aufgabe zueiner einzelligen grünen Alge, wie z. B. »Chlorella« gründe, ein verbessertes Verfahren zur Extraktion oder »Scenedesmus«, durch sukzessive Extraktion 5 eines zur Stimulierung der Funktion des retikuloder grünen Alge mit einem hydrophilen organischen endothelialen Systems wirksamen Stoffs aus einLösungsmittel, Wasser, einer alkalischen wäßrigen zelligen grünen Algen, wie z. B. »Chlorella« zu schaf-Lösung und einer sauren wäßrigen Lösung. ien, bei welchem die Stufe der Entfernung der Ver-

Der allgemeine Ausdruck »retikulo-endotheliales unreinigungen durch Zugabe von Bleiacetat und System« bezieht sich auf gewisse Gewebezellen, wie io Zugabe von Schwefelwasserstoff weggelassen wird, z. B. Zellen, die in der Leber, im Knochenmark, der Diese Aufgabe wird nach der Erfindung dadurch Milz, der Nebennierendrüse und der Hypophyse vor- gelöst, daß man die grüne Alge aufeinanderfolgend kommen, oder auf Adventitazellen, die im Binde- mit einem hydrophilen organischen Lösungsmittel, gewebe vorkommen, und auf einzelne Zellen, die einem Gemisch des hydrophilen organischen Lösungsim Blut oder in ähnlichem vorhanden sind. Der 15 mittels mit Wasser, Wasser, einer alkalischen oder Ausdruck bezieht sich jedoch insbesondere auf Ge- sauren wäßrigen Lösung unter Erwärmen extrahiert, webezellen, wie das Endothel der genannten inneren um einen Lösungsmittelextrakt, einen Wasserextrakt, Organe, die auf Grund von Phagocytose degeneriert einen alkalischen Wasserextrakt und einen sauren sind. Die charakteristische Funktion des retikulo- Wasserextrakt herzustellen, daß man das hydroendothelialen Systems ist eng mit der Entfernung von 20 phile organische Lösungsmittel, den alkalischen Stoff Fremdkörpern, der Bildung von Antikörpern und und den sauren Stoff von den einzelnen Extrakten der Erhöhung der nicht-spezifischen Resistenzen des abtrennt, daß man die einzelnen Extrakte bei verWirtes gegen Infektion verknüpft. mindertem Druck jeweils zu einem ersten konzentrier-

Kürzlich wurde ein Stoff zur Stimulierung der ten Extrakt konzentriert, daß man durch Zusatz von Funktion des retikulo-endothelialen Systems gefun- 25 Äthanol zu jedem der ersten konzentrierten Extrakte, den. Es wurde berichtet, daß das sogenannte «Zymo- bis die Konzentration an Äthanol etwa 80 °/o erreicht, san», welches ein aus den Zellwandungen von Hefe die Verunreinigungen als Niederschlag ausfällt, daß extrahiertes wasserunlösliches Polysaccharid ist, eine man den ausgefällten Niederschlag von den einzelnen derartige Funktion besitzt (Annals of the New York Extrakten abtrennt, daß man die einzelnen Extrakte Scientific Institute, Bd. 118, Art. 4, S. 233 [1964]). 30 bei vermindertem Druck zu jeweils einem zweiten Es wurde auch berichtet, daß das »Zymosan« zur konzentrierten Extrakt erneut konzentriert, daß man Verhinderung von Arteriosklerose, zum Schutz gegen durch Eingießen der einzelnen zweiten konzentrierten einen bösartigen Tumor oder zum Schutz gegen Extrakte in einen großen Überschuß von absolutem Infektionskrankheiten und zur Vermeidung von Äthanol den Wirkstoff als weißen Niederschlag ausradioaktiven Krankheiten wirksam ist, und zwar auf 35 fällt, daß man den weißen Niederschlag jeweils von Grund seiner Funktion der Stimulierung der Aktivi- den zweiten konzentrierten Extrakten abtrennt und tat des retikulo-endothelialen Systems. daß man gewünschtenfalls die weißen Niederschläge

Die einzellige grüne Alge »Chlorella« enthält die entweder für sich oder nach ihrer Vereinigung reinigt,

allgemein bekannten Monosaccharide, wie z. B. Zweckmäßigerweise fällt man den Wirkstoff durch

Pentose, Hexose usw., und gewisse Polysaccharide 40 Eingießen der einzelnen Extrakte in das lOOfache

mit einer komplizierten chemischen Zusammenset- Volumen von absolutem Äthanol aus.

zung und Struktur. Es wurde bisher angenommen, Beim erfindungsgemäßen Verfahren kann die ein-

daß diese Polysaccharide nicht als Stoff in der zellige grüne Alge, wie z. B. »Chlorella« oder

»Chlorella« eingelagert sind, sondern Bestandteile ■ »Scenedesmus« im pulverisierten trockenen Zustand

der Zellwandungen der »Chlorella« bilden. Es wurde 45 oder im Zustand von rohen grünen Algen, die eine

deshalb auch angenommen, daß diese Polysaccharide beträchtliche Menge Wasser enthalten, verwendet

schwierig aus den Zellen zu extrahieren sind, und werden. Beispiele für hydrophile organische Lösungs-

zwar auf Grund der Steifheit der Zellwandungen. mittel, die erfindungsgemäß verwendet werden kön-

JEs wurde bereits von den gleichen Erfindern ein nen, sind Methanol, Äthanol, Aceton u.a. Ein der-Verfahren zur Extraktion eines zur Stimulierung der 50 artiges hydrophiles organisches Lösungsmittel kann Funktion des retikulo-endothelialen Systems Wirk- mit der wasserhaltigen rohen einzelligen grünen Alge Stoffs aus einzelligen grünen Algen, wie z. B. »Chlo- gemischt werden, so daß eine Konzentration des rclla« gefunden, bei welchem man die grüne Alge organischen Lösungsmittels von ungefähr 80 %> eraufeinanderfolgend mit Wasser, einer alkalischen zielt wird. Wenn andererseits die einzellige grüne wäßrigen Lösung und einer sauren wäßrigen Lösung 55 Alge im trockenen Zustand verwendet wird, dann extrahiert, die in jedem der Extrakte enthaltenen kann die grüne Alge mit einem hydrophilen organi-Verunreinigungen durch Zugabe von Bleiacetat ent- sehen Lösungsmittel, das eine Konzentration von fernt, eine Fällung eines unlöslichen Stoffs durch ungefähr 80 % besitzt, gemischt werden. Auf jeden Zugabe von Äthylalkohol zu jedem der konzentrier- Fall wird die einzellige grüne Alge in einen Extraktor ten Extrakte herstellt, und die Fällung aus jedem der 60 eingebracht, der mit einem Rückflußkühler ausgekonzeiitrischen Extrakte abtrennt. Es wurde festge- rüstet ist, und dann mit dem hydrophilen organistcllt, daß der chemisch extrahierte Stoff Stickstoff- sehen Lösungsmittel unter Erhitzung extrahiert, haltige Polysaccharide enthält und daß sich dieser um einen Lösungsmittelextrakt herzustellen. Der Stoir von allen bekannten Polysacchariden unter- Lösungsmittclextrakt wird durch Entfernung des scheidet. Weiterhin wurde bei der Untersuchung der 65 hydrophilen organischen Lösungsmittels bis zum physiologischen Funktion eine wichtige Tatsache ge- sirupöscii Zustand unter vermindertem Druck konfimdcn, niiinlich daß dor Stoff eine vorteilhafte Funk- zentriert,
tion bei der Stimulierung der Aktivität des retikulo- Die mit dem Lösungsmittel extrahierte restliche

grüne Alge wird dann unter Erhitzen mit Wasser extrahiert, um einen Wasserextrakt herzustellen. Der Wasserextrakt wird unter vermindertem Druck bis zum sirupösen Zustand konzentriert. Die. mit Wasser extrahierte restliche grüne Alge wird dann unter Erhitzen mit einer alkalischen wäßrigen Lösung extrahiert, um einen alkalischen Wasserextrakt herzustellen. Der alkalische Stoff wird von dem Wasserextrakt entfernt, worauf der alkalische Wasserextrakt unter vermindertem Druck bis zum sirupösen Zustand konzentriert wird.

Weiterhin wird die mit alkalischem Wasser extrahierte restliche grüne Alge unter Erhitzen mit einer sauren wäßrigen Lösung extrahiert, um einen sauren Wasserextrakt herzustellen. Der saure Stoff wird vom sauren Wasserextrakt entfernt, und der saure Wasserextrakt wird unter vermindertem Druck bis zum sirupösen Zustand konzentriert.

Jeder der oben genannten konzentrierten Extrakte wird mit dem hydrophilen organischen Lösungsmittel gemischt, bis die Konzentration eines jeden Gemisches ungefähr 80 % erreicht, wodurch Verunreinigungen, wie z. B. Protein, organische Säuren, Tannin und färbende Stoffe, ausgefällt werden. Die Ausfällung wird von jedem Gemisch durch Filtration abgetrennt, und hierauf wird jedes der Gemische abermals durch Entfernung des hydrophilen organischen Lösungsmittels bis zum sirupösen Zustand konzentriert. Der Sirup wird unter Rühren in absolutes Ätanol gegossen, worauf eine weiße, flockige Fällung aus der Äthanollösung ausfällt. Die Äthanollösung wird über Nacht in einen Kühlschrank gestellt, um die Ausfällung zu vervollständigen, worauf die Ausfällung abgetrennt und gereinigt wird, wobei der in den einzelligen grünen Alge enthaltene Polysaccharidkomplex erhalten wird. . Diese Polysaccharide sind im Wasser löslich und können als Wasserlösung gelagert werden. Die Wasserlösung der weißen flockigen Fällung ist eine klare blaßbraune Lösung. Nach der Entfernung der freien Saccharide aus der Wasserlösung werden die Proben der enthaltenen Lösung durch die Molischsche Reak- , tion getestet, wobei gefunden wird, daß sie positiv ausfällt. Dies zeigt die Tatsache, daß die weiße Fällung das Polysaccharid ist. Die gleichen Proben werden auch durch Stickstoffanalyse getestet, wobei gefunden wird, daß sie große Mengen Stickstoff enthalten. Dies zeigt die Tatsache, daß in der weißen Fällung der stickstoffhaltige Polysaccharidkomplex enthalten ist.

Es ist darauf hinzuweisen, daß das erfindungsgemäße Verfahren auf jede grüne Alge, wie z. B. »Scenedesmus«, anwendbar ist und daß der dabei erhaltene Stoff die gleichen pharmakologischen Wirkungen besitzt wie der aus der »Chlorella« hergestellte Stoff. .

Die Erfindung wird durch das folgende Beispiel erläutert.

Beispiel

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100 g trockenes Pulver der »Chlorella« wurden in einen Extraktor eingebracht, der mit einem Rückflußkühler ausgerüstet war, und mit 2 I Äthanol mit einer Konzentration von 80 %> extrahiert, indem das Gemisch bei 80° C auf einem Wasserbad ungefähr 1 Stunde unter Rühren erhitzt wurde. Das erhaltene Gemisch wurde abgekühlt und filtriert, wobei ein dunkelgrüner opaker Extrakt erhalten wurde. Die restliche »Chlorella« wurde ein weiteres Mal mit 21 Äthanol mit einer Konzentration von 80 % in der gleichen Weise, wie oben beschrieben, extrahiert, um einen zweiten Extrakt herzustellen. Das Äthanolextraktionsverfahren wurde mit der restlichen »Chlorella« in der gleichen Weise wie oben beschrieben fünfmal wiederholt. Die fünf Extrakte wurden in einem Behälter gesammelt, der dann ungefähr 101 Extrakt enthielt. Der auf diese Weise gesammelte Extrakt wurde unter vermindertem Druck destilliert, um Äthanol zu entfernen, und die wasserunlöslichen Stoffe, wie z. B. Chlorophyl usw., wurden durch Filtration abgetrennt. Wenn das auf diese Weise erhaltene Filtrat dunkel gefärbt war, dann wurde es mit Aktivkohle entfärbt und dann unter vermindertem Druck konzentriert, so daß ungefähr 30 ml sirupöse Flüssigkeit erhalten wurde. Die so erhaltehe sirupöse Flüssigkeit wurde in ungefähr 3 1 absolutes Äthanol unter Rühren eingegossen und es wurde eine weiße flockige Fällung erhalten. Das Gemisch aus dieser Fällung und Äthanol wurde über Nacht in einen Kühlschrank gestellt, worauf das Äthanol von dem Gemisch durch zentrifugieren abgetrennt wurde. Die Fällung wurde durch mehrmaliges Waschen mit Äthanol gereinigt. Die auf diese Weise erhaltene Fällung wurde mit »Fraktion I« bezeichnet. Die mit Äthanol extrahierte restliche »Chorella« wurde mit 21 Wasser unter 5stündigem Sieden, währenddessen das Gemisch gerührt wurde, extrahiert. Das Gemisch wurde abgekühlt und filtriert, wobei ein hellbrauner bis gelblicher trüber Extrakt erhalten wurde. Das Wasserextraktionsverfahren wurde mit der restlichen »Chlorella« wiederholt, bis der Extrakt farblos wurde; auf diese Weise wurden insgesamt etwa 7 1 Extrakt erhalten. Dieser Extrakt wurde unter vermindertem Druck auf ungefähr 100 ml konzentriert, worauf 400 ml absolutes Äthanol unter Rühren zugegeben wurden, wobei sich . eine Fällung bildete. Die Fällung wurde vom Extrakt durch Filtration abgetrennt, worauf das Äthanol vom Extrakt unter vermindertem Druck entfernt wurde; dabei wurden ungefähr 30 ml einer sirupösen Flüssigkeit gebildet.

Die auf diese Weise erhaltene sirupöse Flüssigkeit wurde unter Rühren in ungefähr 31 absolutes Äthanol gegossen, wobei eine heiße flockige Fällung erhalten wurde. Die Fällung wurde in der gleichen Weise, wie oben beschrieben, behandelt, um eine gereinigte Fällung herzustellen. Diese gereinigte Fällung wird als »F'raktion II« bezeichnet.

Die mit Wasser extrahierte restliche »Chlorella« wurde mit 21 einer 5prozentigen Ätznatronlösung extrahiert, indem die »Chlorella« auf einem siedenden Wasserbad ungefähr 3 Stunden unter Rühren erhitzt wurde. Das Gemisch wurde abgekühlt und filtriert, wobei ungefähr 2 1 eines dunkelgrünen, opaken Extrakts erhalten wurden. Zum Extrakt wurde eine lOprozentige Salzsäure zugegeben, um seinen pH-Wert auf 6,5 einzustellen und um eine Fällung zu erzeugen. Die Fällung wurde filtriert, und der Extrakt wurde unter vermindertem Druck auf ungefähr lÖO ml konzentriert, worauf der konzentrierte Extrakt über Nacht in fließendem Wasser dialysiert wurde, um die anorganischen Salze zu entfernen. Der Extrakt wurde schließlich auf ungefähr 50 ml konzentriert. Dieser konzentrierte Extrakt wurde unter Rühren in ungefähr 200 ml absolutes Äthanol

gegossen, um die Verunreinigung, wie z. B. Protein und färbende Stoffe, abzuscheiden, worauf die Verunreinigungen vom Extrakt durch Filtration entfernt wurden. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck xur Entfernung des Äthanols destilliert und weiterhin zu ungefähr 20 ml einer sirupösen Flüssigkeit konzentriert. Diese sirupöse Flüssigkeit wurde unter Rühren in ungefähr 21 absolutes Äthanol eingegossen, wobei eine weiße flockige Fällung erhalten wurde. Diese Fällung wurde in der gleichen Weise, wie oben beschrieben, zur Herstellung einer gereinigten Fällung behandelt. Die gereinigte Fällung wird als »Fraktion III« bezeichnet.

Schließlich wurde die mit alkalischem Wasser extrahierte restliche »Chlorella« mit 1 1 einer 5prozentigen Schwefelsäure extrahiert, indem die »Chlorella« auf einem siedenden Wasserbad unter Rühren , 3 Stunden erhitzt wurde. Das Gemisch wurde abgekühlt und filtriert, wobei ungefähr 1 1 eines gelblichbraun Extrakts erhalten wurde. Zu diesem Extrakt wurde Kalziumkarbonat gegeben, um Kalziumsulfat zu bilden. Das Kalziumsulfat wurde aus dem Extrakt durch Filtration entfernt, worauf der Extrakt unter vermindertem Druck auf ungefähr 50 ml konzentriert wurde, worauf 200 ml absolutes Äthanol unter Rühren zugegeben wurden, um die Verunreinigungen auszufällen, die durch Filtration vom Extrakt entfernt wurden. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck destilliert, um das Äthanol zu entfernen, und dann weiterhin zu 20 ml einer sirupösen Flüssigkeit konzentriert. Diese sirupöse Flüssigkeit wurde unter Rühren in ungefähr 2 1 absolutes Äthanol gegossen, wodurch eine weiße flockige Fällung erhalten wurde. Diese Fällung wurde in der gleichen Weise, wie oben beschrieben, behandelt, um eine gereinigte Fällung herzustellen. Die gereinigte Fällung wird mit »Fraktion IV« bezeichnet.

»Fraktion I«, »Fraktion II«, »Fraktion III« und »Fraktion IV« waren wasserlöslich. Jede Fraktion wurde in Wasser zur Herstellung einer Lösung aufgelöst. Nach Entfernung der freien Saccharide aus jeder Lösung wurde sie durch die Molischsche Reaktion und durch Stickstoffanalyse untersucht. Die Reaktion war positiv, und es wurde auch gefunden, daß die Lösung ungefähr 3 %> Stickstoff enthielt. Hs war deshalb anzunehmen, daß die gereinigte Fällung aus einem stickstoffhaltigen Polysaccharidkomplex bestand. Die gesamte Ausbeute der »Fraktionen I bis IV« betrug ungefähr 3 %. Weiterhin Wurde die gereinigte Fällung auf die Funktion zur Stimulierung der Aktivität des retikulo-endothelialen Systems untersucht.

Der Versuch zur Messung der Funktion des retikulo-endothelialen Systems wurde unter Verwendung der Halpernschen Methode durchgeführt, welche in der Wissenschaft allgemein bekannt ist und in »British Journal of Experimental Pathology«, Bd. 34, S. 426 bis 441 (1953) beschrieben ist.

Bei dieser Methode wird einem Versuchstier »Donryu-Ratte« Tusche intravenös injiziert, und nach einer gewissen Zeit wird die Versuchsratte ausbluten gelassen, und die Menge der Kohlenstoffteilchen im Blut wird gemessen. Wenn die Funktion der Ratte bei der Entfernung der Kohlenstoffteilchen erhöht wird, dann wird die Tusche aus dem Blut der Versuchsratte rascher entfernt und die Menge der verbleibenden Kohlcnstoffteilchen wird herabgesetzt.

Die Versuchsergebnisse sind in den F i g. 1 und 2 angegeben.

Fig. 1 zeigt den granulopektischen Index des Versuchstiers »Donryu-Ratte«, welches unter Verwendung einer Kontrollprobe, Zymosah/4, Zymosan B, Stoff A und Stoff B getestet wurde. Es wird bemerkt, daß die Stoffe A und B die Polysaccharide waren, die nach den Verfahrensweisen des Beispiels 1 hergestellt wurden. Weiterhin wird bemerkt,

ίο daß Zymosan A und Stoff A in die Versuchsratte in einer Menge von 1 mg je 100 g Körpergewicht und daß Zymosan B und Stoff B in die Versuchsratte in einer Menge von 10 mg je 100 g Körpergewicht injiziert wurden. »K« bedeutet den granulopektischen Index der Versuchsratteh und wurde aus der Formel Log. C · Log. C/T errechnet, worin C die Konzentration der Tusche im Blut (mg/100 ml) 10 Minuten nach der Injektion der Tusche, C die Konzentration der Tusche im Blut (mg/100 ml) 20 Minuten nach Injektion der Tusche und T 10 Minuten bedeutet. »X«. bedeutet den Durchschnittswert von »K«.

Aus den in F i g. 1 gezeigten Ergebnissen geht hervor, daß die Stoffe A und B, die erfindungsgemäß extrahiert worden waren, einen höheren granulopektischen Index ergeben, als die Kontrollprobe, Zymosan A und Zymosan B. Diese Tatsache zeigt, daß die Stoffe A und B eine bessere Stimulierungswirkung auf das retikulo-endotheliale System besitzen als die anderen untersuchten Proben.

F i g. 2 zeigt den Zusammenhang zwischen der Konzentration der Kohlenstoffteilchen im Blut der Versuchsratte und der verstrichenen Zeit. Linie 1 zeigt die Änderungen in der Konzentration der Kohlenstoffteilchen im Blut der Versuchsratte, die mit dem gemäß der Erfindung hergestellten extrahierten Stoff injiziert worden war, Linie 2 zeigt die Änderungen .der Konzentration der Kohlenstoffteilchen im Blut der Versuchsratte, die mit Zymosan injiziert worden war, und Linie 3 bezieht sich auf die Vergleichsratte, die mit keiner Medizin injiziert worden war. Ein Vergleich der Linie 1 mit der Linie 2 zeigt, daß die medizinische Wirkung des gemäß der Erfindung extrahierten Stoffs im wesentlichen die gleiche ist wie von Zymosan.

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung eines Wirkstoffs zur Stimulierung der Funktion des retikulo-endothelialen Systems aus einer einzelligen grünen Alge, dadurch gekennzeichnet, daß man die grüne Alge aufeinanderfolgend mit einem hydrophilen organischen Lösungsmittel, einem Gemisch des hydrophilen organischen Lösungsmittels mit Wasser, Wasser, einer alkalischen oder sauren wäßrigen Lösung unter Erwärmen extrahiert, um einen Lösungsmittelextrakt, einen Wasserextrakt, einen alkalischen Wasserextrakt und einen sauren Wasserextrakt herzustellen, daß man das hydrophile organische Lösungsmittel, den alkalischen Stoff und den sauren Stoff von den einzelnen Extrakten abtrennt, daß man> die einzelnen Extrakte bei vermindertem Druck jeweils zu einem ersten konzentrischen Extrakt konzentriert, daß man durch Zusatz von Äthanol zu jedem der ersten konzentrierten Extrakte, bis die Konzentration an Äthanol etwa 80 % erreicht, die Verunreinigungen als Niederschlag ausfällt, daß man

den ausgefällten Niederschlag von den einzelnen Extrakten abtrennt, daß man die einzelnen Extrakte bei vermindertem Druck zu jeweils einem zweiten konzentrierten Extrakt erneut konzentriert, daß man durch umgießen der einzelnen zweiten konzentrierten Extrakte in einen großen Überschuß von absolutem Äthanol den Wirkstoff als weißen Niederschlag ausfällt, daß man den weißen Niederschlag jeweils von den zweiten

konzentrierten Extrakten abtrennt und daß man gewünschtenfalls die weißen Niederschläge entweder für . sich oder nach ihrer Vereinigung reinigt.

.2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Wirkstoff durch Eingießen der einzelnen zweiten konzentrierten Extrakte in das lOOfache Volumen von absolutem Äthanol ausfällt.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

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