DE681024C - Verfahren zur schonenden Gewinnung loeslicher Vollantigene aus Mikroorganismen - Google Patents

Description

• Verfahren zur schonenden Gewinnung löslicher Voliantigene aus Mikroorganismen Die bisherigen Bemühungen, durch Einwirkung chemischer Agentien lösliche Vollantigene aus Mikroorganismen, wie z. B. B.akterien, zu gewinnen, haben bisher nicht zu befriedigenden Ergebnissen geführt, weil die äußerst labilen Zellantigene durch chemische Eingriffe entweder zerstört oder derart modifiziert werden, daß sie sich für eine aktive Immunisierung leblender Individuen gegen natürliche Bakterieninfektionen nicht mehr eignen. Auch die häufig benutzten rein physikalischen Aufschließnngsverfahren von Bakterienzellen haben für die Freilegung der Vollantigene nicht in dem Maße zu Erfolgen geführt wie bei der Isolierung anderer ebenfalls empfindlicher Wirkstoffe; denn es hat sich gezeigt, daß die Vollantigene sehr hochmolekulare Zellbestandteile sind, die im Gegensatz zu Substanzen geringerer Molekülgröße schon allein durch mechanische Be, an spruchung oder durch Änderungen der Milieubedingungen infolge Verkrackung und Depolymerisation an Wirksamkeit verlieren.
• Wie nun gefunden wurde, kann man durch Einwirkung von chemisch indifferenten wäßrigen Lösungen besonderer Zusammensetzung, die zur Herstellung wäßriger Lösungen von Lipoiden und vor allem von Wachsen geeignet sind, sehr wirksame Vollantigene aus Bakterien gewinnen. Die Bereitung der in Frage kommenden Wachslösungsmittel geschieht in der Weisle, daß man in mehrprozentigen Lösungen von Polyäthylenglykoläthern höherer Fettalkohole oder von Polyäthylenglykolestern höherer Fettsäuren organische Fettlösungsmittel, wie Chloroform, Methylenchlorid, höhere Fettalkohole, Kohlenwasserstoffe usw., unter Erwärmen auflöst. Hierdurch werden klare wäßrige Lösungen der Fettlösungsmittel erhalten, die bei Einwirkung. auf frisch isolierte Bakteriensuspensionen diese oft schon in der Kälte in wenigen Minuten auflösen. In manchen Fällen ist es zweckmäßig, die Mikroorganismen während des Lösungsvorg ; an$es bei einer Wasserstoffionenkonzentration von pH 8,0 zu halten. Durch Anwendung des Verfahrens in der Wärme, bei etwa 37°, gelingt es selbst bei Tuberkelbazillen, die hier sehr beträchtlichen intermicellaren Kohäsionskräfte zu überwinden und durch mehrtägige Einwirkung der Bakterien in Lösung zu bringen.
• Für besondere Zwecke kann es ratsam sein, die Temperatur noch weiter, beispielsweise auf 80 bis 100°, ZU steigern Oft ist es zweckmäßig, die vollständige Auflösung der Mikroorganismen nicht abzuwarten, sondern den noch ungelösten Anteil abzuscheiden und evtl. nochmals mit dem Lösungsmittelgemisch zu behandeln.
• Ein besonderer Vorteil des Verfahrens liegt darin, daß die Bakterien bei der Behandlung mit dem Lösungsmittel ihre Lebens. und Keimfähigkeit verlieren, so daß ein Zusatz von Desinfektionsmitteln, der leicht zu D enaturierungen führt, vermieden und anderseits auch störende Einflüsse durch unerwünschte Stoffwechselreaktionen ausgeschlossen werden können.
• Es hat sich weiter als vorteilhaft erwiesen, die gelösten Beakterienantigene aus dem Lösungsgemisch zur Abscheidung zu bringen und in ein physiologisches Milieu zu überführen. Dies gelingt in besonders schonender Weise dadurch, daß man die Bakterienlösung mit organischen wasserlöslichen Flüssigkeiten, z. B. Äthylalkohol oder Aceton, oder mit Neutralsalzen, z. B. Ammoniumsulfat, und zwar in solchen Mengen versetzt, daß die Ausfällungsgrenze nahezu erreicht, aber nicht überschritten wird, und dann durch Einleiten von Kohlensäure oder durch einen geringen Säurezusatz die Vollantigene zur Ausfällung bringt.
• Die hierbei entstehenden grobflockigen, oft zu langen Fäden zusammengeballten Niederschläge werden durch Zentrifugieren isoliert und mit physiologischen Lösungsmitteln bei PH 7 bis 8 in Lösung gebracht. Es werden je nach der Konzentration, an gelösten Stoffen opaleszentie bis wasserklare Lösungen erhalten, die imstande sind, brei parenteraler Einverleibung die Bildung von spezifischen Antikörpern gegen VollbaktSerien hervorzurufen. Es gelingt z. B., schon mit wenigen Milligramm und oft mit Bruchteilen eines Milligramms des ge-Iösten Vollantigens agglutinierende Antikörper gegen Vollbakterien zu erzeugen; die im Immunserum selbst in Verdünnungen bis 1 : 10000 noch deutlich nachzuweisen sind.
• Gegenüber der Behandlung mit abgetöteten Vollkulturen besitzen die nach dem Verfahren gewonnenen löslichen Bakterienantigene den Vorteil, daß sie besonders bei intravenöser Applikation weit besser vertragen werden, aber auch für die zur aktiven Immunisierung gegen pathogene Mikroorganismen meist angewandte Methode der intramuskulären oder subkutanen Verabreichung bedeuten die gelösten Vollantigene einen erheblichen Fortschritt, weil es gelingt, sie an geeignete Trägersubstanzen, wie z. B. Aluminiumhydroxyd, zu binden und hierdurch eine weit bessere Depotwirkung zu erzielen, als sie bei entsprechender Immunisierung mit abgetöteten Bakterienleibern zustande kommen kann.
• Die gelösten Vollantigene lassen sich auch für diagnostische Zwecke verwenden, da sie mit Immunseren sowohl spezifische Präcipitinwie SomplemEentbindungsreaktionerl geben.
• Bei Aufarbeitung solcher Mikroorganismen, die bei ihrer Züchtung auf flüssigen Nährböden spontan Bestandteile ihrer Leibessubstanzen in die Nährflüssigkeit abgeben, kann -man Vollantigene in der Weise gewinnen, daß man die Mikroorganismen zunächst eine Zeitlang auf flüssigen Nährböden kultiviert und dann eine Lösung des Zellantigens nach der hier beschriebenen Weise herstellt und dieser Lösung die filtrierte Nährflüssigkeit als solche oder nach geeigneter Verarbeitung hinzufügt.
• Beispiele I. Eine eintägige Kultur von Gonokokken auf Aseites-Agar wird mit physiologischer Kochsalzlösung abgeschwemmt, gewaschen und auf 50 C abgekühlt. Versetzt man 10 ccm der Suspension mit 200 ccm einer eiskalten klaren Lösung von 2,7 0/0 Nonylalkohol und 10 10 % Polyäthylenglykolrizinolsäureester, so entsteht nach wenigen Minuten eine vollständige Auflösung der Bakterien. Die erhaltene Lösung wird mit 150 ccm Aceton versetzt, wobei sie stärker opaleszent wird, aber keine Ausfällung entsteht. Sänert man nun mit einigen Tropfen Essigsäure etwa auf PH 5,0 an, so bilden sich reichliche Mengen eines farblosen, fadenziehenden Niederschlages, der durch Zentrifugieren abgeschieden und mit Wasser, Na Cl und etwas verdünnter Natronlauge in eine blutisotonische Lösung von PH 7,0 überführt wird. Das erhaltene Präparat enthält 0,25% gelöste Bakterienb, estandt, eile. Es gibt eine starke Präcipitinreaktion sowohl mit dem Serum von Versuchstieren, die mit Vollbakterien, wie von solchen, die mit Idem gelösten Bakterienpräparat selbst immunisiert worden waren.
• 2. Eine Abschwemmung von Coli- oder Typhusbazillen von einem Agarnährboden wird wie bei Beispiel 1 mit einer Lösung von 2 % CH Cl3 in 10 % Polyäthylenglykololeyläther versetzt und mit wenigen Tropfen verdünnten Alkalis oder mit etwas sekundärem Kaliumphosphat auf ein pH 8, o eingestellt.
• Das Gemisch wird 24 Stunden im Eisschrank stehengelassen. Der gelöste Bakterienanteil wird sodann durch Zentrifugieren isoliert und mit 4/5 Volumenanteilen Alkohol oder mit 1% Volumenanteil gesättigter Ammonsulfatlösung versetzt. Durch den Zusatz wird eine Ausfällung nicht erzeugt. Wird nun Kohlensäure in die Lösung eingeleitet, so entsteht bei PH 6,9 ein grobflockiger Niederschlag, der nach dem Abzentrifugieren nach Beispiel 1 in eine physiologische Lösung überführt wird.
• Der ungelöste Bakterienanteil kann nochmals mit dem Lösungsgemisch behandelt und die nunmehr in Lösung gegangenen Bestandteile in entsprechender Weise aufgearbeitet werden.
• Die erhaltenen gelösten Vollantigene zeigen im Tierversuch bei guter Verträglichkeit eine sehr starke, antigene Wirkung. Bei Kaninchen wird durch eine an mehreren Tagen erfolgende intravenöse Injektion von insgesamt 3,5 mg gelöstes Typhusantigen ein Agglutinationstiter des Serums von über 1 : 10 000 hervorgerufen.
• Mit Coliantigen gelingt es mit der gleichen Menge spezifische Agglutinine gegen Colibakterien zu erhalten. Die gelösten Antigene eignen sich auch zu einer aktiven spezifischen Immunisierung von Lebewesen gegen Infektionen durch Typhus- bzw. pathogene Colibazillen.
• 3. Dysenterieshigahazillen werden mehrere Tage bei 370 auf Peptonbouillon gezüchtet.
• Die Bakterien werden abzentrifugiert und nach Beispiel 2 in Lösung gebracht. Durch einmalige Behandlung mit dem Lösungsgemisch gehen etwa 80% der angewandten Bakterienmenge in Lösung. Der gelöste anteil wird nach Beispiel 1 in ein physiologisches Milieu überführt. Auch in diesem Falle erweist sich das gelöste Bakterienantigen von guter antigener Wirksamkeit für die Erzeugung antibakterieller Antikörper. Für die intramuskuläre Verabreichung hat sich eine Adsorption des Antigens an Aluminium-Hydroxyd als besonders vorteilhaft erwiesen.
• Die Nährflüssigkeit kann der Lösung des Zellantigens entweder nach bloßem Filtrieren zugegeben oder vor dem Hinzufügen noch weiter aufgearbeitet werden. Hierzu wird das von Bakterien befreite klare Filtrat oder Zentrifugat zweckmäßigerweise zunächst so lange mit 0>5 0/0 Formaldehyd bei 370 erwärmt, bis eine Probe keine Giftwirkung im Tierversuch mehr aufweist. Sodann wird die entgiftet Lösung mit 3/5 Volumen Aceton versetzt, wodurch sie oplaeszent wird. Ausfällungen entstehen jedoch nicht. Beim Ansäuern mit verdünnter Salzsäure auf ein PH von 5,5 entsteht jedoch eine beträchtliche Menge Niederschlag, die nach dem Abzentrifugieren und Auflösen in schwach alkalischer physiologischer Na Cl-Lösung ebenfalls von starker antigener Wirksamkeit ist.
• Durch Vereinen der aus den lebenden Dysenteriebazillen mit der aus der Kulturflüssigkeit gewonnenen Antigenlösung wird ein äußerst wirkungsvolles Vollantigen gewonnen, das sich als Impfstoff zur aktiven Immunisierung gegen Dysenterieinfektionen gut eignet. Die Wirksamkeit kann durch Adsorption an Ahimini'umhydi-oxyd noch verbessert werden.

Claims (2)

1. P A T E N T A N S P R Ü C H E : I. Verfahren zur schonenden Gewinnung löslicher Vollantigene aus Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen mit klaren Auflösungen von Fettlösungsmitteln in wäßrigen Lösungen von Polyäthylenglykoläthern höherer Fettalkohole oder von Polyäthylenglykolestern höherer Fettsäuren innerhalb eines p-Bereichs von etwa 6-8 und gegebenenfalls bei erhöhter Temperatur behandelt.
2. 2. Verfahren nach Anspruchs, dadurch gekennzeichet, daß man die gelösten Vollantigene mit organischen wasserlöslichen Flüssigkeiten oder mit Neutralsalzen in solchen Mengen versetzt, daß die Ausfällungsgrenze nahezu erreicht, aber nicht überschritten wird, die Lösung durch gelindes Ansäuern ausflockt und den Niederschlag in physiologischen Lösungsmitteln aufnimmt und die so gewonnene Lösung gegebenenfalls an schwer resorbierbare Trägerstoffe adsorbiert.