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Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes zur Vorbeugung und Heilung
der Hundestaupe Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes
zur Vorbeugung und Heilung der Hundestaupe.
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Es ist bereits bekannt, eine Vaccine zur Prophylaxe der Hundestaupe
aus fein zerkleinerter, mit Staupe -infizierter Gehirnmasse her zustellen. Der Gehalt
des bekannten Erzeugnisses an Erregern war aber so arm, daß es ohne Abtötung oder
Inaktivierung der Erreger verwendet werden konnte. Das Mittel hatte nur beschränkte
Verwendbarkeit.
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Demgegenüber besteht 4as Verfahren nach der-Erfindung, das die Herstellung
eines Mittels unbeschränkter Verwendbarkeit sowohl für die Prophylaxe als auch die
Therapie der Hundestaupe betrifft, darin, daß man das den Erreger enthaltende Material
von mit Staupe infizierten Tieren zunächst in einer durch Verdauen von Fleisch mit
Pepsin hergstellteilt Brühe aufschwemmt und filtriert, worauf das nunmehr von Fremdbakterien
freie Filtrat auf feste spezifische Nährböden, z. B.
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Schrägblutagarnährböden, übertragen und auf diesen bebrütet wird um
eine Reinkultur des Asterococcus canis zu erhalten. Der die Reinkultur enthaltende
Nährboden wird nun niit flüssigem spezifischem Nährboden übergossen und die Gesamtmasse
nochmals bebrütet, wodurch die Reinkultur in der Fliissigl:eit erhalten wird. Der
die Kultur enthaltende flüssige Nährboden wird schließlich mit verdünnten Konservierungsmitteln,-
wie Phenol und Brillantgrün, versetzt, wodurch die Ast.-canis-Mikroben ohne Schädigung
ihrer Antigene abgetötet werden.
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Der vom Erfinder entdeckte Asterococcus canis tritt in zwei Arten
auf: Asterococcus canis, Typus I Diese Art ist ein kleiner unbeweglictler pleomorpher
Mikroorganismusl der sogar durch Filterkerzen, z. B. Berkefeld N oder Chamberland
L 2 hindurchgeht. Es handelt sich demnach um einen filtrierharen Mikroorganismus.
Bei Betrachtung im Mikroskop mit Ölimmersion und Blaufärbung der Präparate mit Viktoriablau
erscheint er als pleomorphe, sehr kleine WIikrobe, die kokkoid-, asteroid-, spiral-,
mycoidenförmig u. dgl. sein kann. Die Mikrobe ist von den anderen Bakterien deutlich
zu unterscheiden. Ihre Größe beträgt 0,02o,o4 bis 0,I e. Sie ist färbbar nach Gram,
mit den meisten Anilinfarbstoffen aber nur schlecht färbbar, dagegen läßt sie sich
mit Giemsalösung- oder mit einer schwachen Essigsäurelösung von Viktoriablan färben.
Die Besttemperatur für das Wachstum beträgt 37 bis 380 C. Die Mikrobe ist fakultativ
anaerob. Auf normalen Kulturnährböden, wie Nähragar, Nährgelatine, Bouillon u. dgl.,
ist weder ÄVadstum noch Vermehrung möglich, ebenso auf dem gewöhnlichen Blutagar
oder Serumagar. Am besten läßt sie sich auf dem Seh rägblutagar kultivieren, der
aus durch Verdauen von Fleisch bereiteter Brühe (»AI.P.«-Brühe) hergestellt ist.
Die
auf einem derartigen Nährboden sich bildenden Kolonien haben
einen Durchmesser von 0,4 bis o,6 mm, wenn sie völlig entwickelt sind, d. h. nach
4 Tagen bei 370 C. Sie haben dann tautropfenähnl iche Form. Säurebildung aus Kohlehydraten,
wie Glukose, Saccharose; Lävulose, Maltose u. dgl., ist im Gegensatz zu A. mycoides
nicht festzustellen.
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Eine I%ige Phenollösung tötet A. canis bei 200 C in 8 Minuten, eine
o,5°/Oige Phenollösung bei 370 C in 10 bis 20 Minuten. Wenn man eine 0,I0%ige Phenollösung
bei 370 C verwendet, ist eine Abtötung noch nicht einmal nach 2 Stunden zu beobachten.
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Asterococcus canis, Typus II Diese Art von A. c. ist dem A. c. Typus
I sehr ähnlich; es sind lediglich folgende Unterschiede vorhanden: I. A. c. Typus
II wächst schneller und üpeiner auf bluthaltigen Nährböden und Serumagar als Typus
1.
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2. Die Farbänderungen an der Unterseite der Kolonien sind bei der
Züchtung auf Blutagar viel deutlicher als bei Typus I.
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3. Die pathogene Wirkung ist in leicht infizierbaren Tieren schwächer
als bei Typus I.
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Sie scheint eine untergeordnete Rolle in der Hundestaupe zu spielen.
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Die Herstellung der »NI. P.«-Brühe ist folgende: Rinderfiletfleisch
(fingerdicke Stücke) 500 g, I°/Oige Salzsäurelösung I000 ccm, Pepsin I g werden
in einen Behälter getan und 4 Stunden bei 500 C erwärmt. Darauf erhitzt man I Stunde
bei 70" C und schließlich 10 Minuten bei 800 C. Die Säure wird mit 350/0iger Ätzuatronlösung
(etwa 10 bis I2 ccm) bei 700 C neutralisiert. Darauf wird die Brühe durch Papier
filtriert und der p11-Wert auf 7,2 bis 7,4 eingestellt.
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Herstellung des »M. P.«-Blutagars: Von der »M. P.«-Brühe wird vor
dem Abfiltern durch Filtrierpapier das auf der Oberfläche sich ansammelnde Fett
abgeschöpft, wonach die trübe Lösung mit Agar im Verhältnis von 2,5 °/0 versetzt
und der Agar durch Erwärmen gelöst wird. Sodann stellt man den pH-Wert auf 7,2 bis
7,4 ein, füllt die Masse in gereinigteReagenzröhrchen ab und sterilisiert. Vor jeder
Verwendung wird dem geschmolzenen Nährboden (»M. P . «-Blutagar) der auf 45 bis
480 C erhalten wird, 1/3 bis V4 steriles defibriniertes Pferde- oder Kaninchenblut
zugesetzt, worauf der Schrägblutagar in üblicher Weise gebildet wird.
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Im einzelnen wird das Verfahren in folgender Weise durchgeführt:
Pathogenes Material von an Staupe erkrankten Tieren wird einer »M. P.«.Brühe suspendiert.
Durch den fleischverdauenden Charakter der Brühe wird der Erreger in Freiheit gesetzt.
Man filtriert sodann die Brühe durch eine Chamberland-L 2-Fi lterkerze oder eine
Berkefeld-N-Filterlierze. Man erhält so eine fremdbakterienfreie, jedoch staupeerregerhaltige
Flüssigkeit. Diese bewahrt man in einem Brutschrank bei einer Temperatur von 37-bis
380 C auf.
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Dieses erregernaltige Material impft man auf »51. P.«-Schrägblutagar
auf, der in der oben angegebenen Weise hergestellt ist. Man bebrütet den Schrägblutagar
3 bis 4 Tage lang. Es entwickeln sich auf dem Schrägblutagar tautropfenähnliche
Kolonien.
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Auf den bebrüteten »Äl. P. «-Schrägblutagar gießt man als flüssigen
Nährboden die oben beschriebene »M. P.«-Brühe in Misdiung mit einer geringen Menge
I°/Oigem Cystein in alkalischer Glyzerinlösung. Das Ganze wird 3 bis 4 Tage lang
bei 37 bis 38° C bebrütet.
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Die über dem festen Nährboden stehende Flüssigkeit wird dabei trübe.
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Die Flüssigkeit wird sodann bakteriologisch steril gesammelt. Die
auf dem Schrägblutagar verbliebenen A. c.-Kolonien werden mit 10 0/0 physiologischer
Salzlösung abgewaschen. Die NVasdlüssigkeit setzt man der bebrüteten Nährflüssigkeit
zu und filtriert beides durch steriles Filtrierpapier. Die auf diese Weise aus den
Kulturen von Typus 1 und II hergestellten Filtrate werden in gleichen Mengenanteilen
gemischt. Der Alischung werden besondere chemische Konservierungsmittel, z. B. Phenol,
in einer Menge von 0,25 01o und Brillantgrün in einer Menge von 0,005010 zugesetzt,
d. h. in einer Menge, welche die Mikroben zwar abtötet, die gebildeten Antigene
jedoch unbeeinflußt läßt.
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Für prophylaktische Zwecke werden 2 ccm dieser Vaccine subkutan in
die Schulter eines Hundes eingespritzt. Nach 3 bis 4 Tagen wird nochmals eine Einspritzung
von gleicher Menge und in gleicher Weise gemacht. Die Immunität des so behandelten
Tieres gegen Hundestaupe beträgt 6 Monate.
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Für therapeutische Zwecke wird die Vaccine ebenfalls subkutan in
die Schulter des Hundes gespritzt, und zwar in Mengen zwischen 2 und 4 ccm und in
Abständen von nicht weniger als 24 Stunden.