JPH01287031A - 抗エイズウィルス剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、（１）式のくり返し単位からなり分子量１０
０万以下の多糖（以下（当該多糖）という）の硫酸化物
を有効成分として含む抗エイズウィルス剤に関する。

（従来技術および問題点） エイズ（ＡＩＤＳ、　ａｃｑｕｉｒｅｄ　ｉｍｍｕｎｏ
ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｓｙｎｄｒｏｍｅ）　は、その原
因ウィルスであるＨＩＶ（ｈｕｍａｎ　ｉｍｍｕｎｏｄ
ｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｖｉｒｕｓ）によってひきおこさ
れるウィルス感染症である。エイズウィルスに感染する
と、主としてヘルパーＴ細胞が破壊される。又、Ｔ細胞
全般にわたる異常やＢ細胞の異常が生じるため、免疫不
全となる。その結果、日和見感染症、カポジ肉腫・脳リ
ンパ腫などの悪性腫瘍、中枢神経系疾患および臓器障害
を起し、ついには死に至る恐ろしい病気である。

エイズを完治させる医薬品は現在までのところ見出され
ていないが、アジドチミジン（ＡＺＴ）、ジデオキシシ
チジン、ジデオキシアデノシン、スラミン（ｓｕｒａｍ
ｉｎ）、リバビリン（ｒｉｂａｖｉｒｉｎ＞、ＨＰＡ−
２３、およびインターフェロン等の物質が抗エイズ効果
を示すことが知られている。これらのうちＡＺＴはエイ
ズウィルスの逆転写酵素の阻害作業を有し、エイズ患者
に対する有用性も証明されたためアメリカにおいてはす
でに使用が許可されている。

しかしながら、ＡＺＴをはじめとするヌクレオシド関連
物質は副作用を有し、骨髄障害、大赤血球性貧血、胃腸
障害、皮疹などが発生する。スラミン、リバビリン、Ｈ
ＰＡ−２３等については、なお実用上の有効性が確証さ
れるに至っていない。

最近、紅藻由来の多糖体ＳＡＥがエイズウィルスの逆転
写酵素の阻害作用を有することが見出され、さらにλ、
に、Ｃ−カラゲナン、ヘパリン、コンドロイチン硫酸等
天然物由来の硫酸多糖体が同様の生理活性を有すること
が見出されている。

他方、種々の多糖体の硫酸化物の抗エイズウイルス作用
に関する研究も進められており、抗エイズウイルス活性
をもたないデキストラン、キシロフラナンおよびリボフ
ラナンなどの多糖体の硫酸化物である、デキストラン硫
酸、キシロフラナン硫酸およびリボフラナン硫酸が抗エ
イズウイルス活性を有することが見出されている。この
ように、硫酸化によって抗エイズウイルス活性をもたな
い物質に抗エイズウイルス活性を賦与するという方法は
、今や抗エイズウイルス剤開発の一手法として利用され
はじめている。

このような硫酸多糖体を抗エイズウィルス剤として開発
する場合の問題点として、（１）多糖体は一般に精製す
るのが難しく、雑物として含まれる糖類、蛋白質或は発
熱性物質等を除去するには高レベルの技術を要すること
。（２）抗エイズウイルス活性は多糖体の構造、分子量
および硫酸基の含有量によって異なること。（３）生体
内に投与された場合、体内酵素によって分解されてしま
う可能性もあることが列挙され、これらの問題の解明が
急がれている。

本発明者らは硫酸多糖体の生理活性について研究を重ね
、硫酸多糖体はリンパ球を非特異的に幼若化させる、い
わゆるマイトジェン活性の強弱が、硫酸多糖体の構造に
よって変化することを見出した。

すなわち、異種の構成単糖からなるいわゆるヘテロ多糖
の硫酸化物と、同一種の構成単糖からなるホモ多糖の硫
酸化物とに分けてそのマイトジェン活性を比較すると、
前者の硫酸多糖体よりも後者の硫酸多糖体の方が、より
強いマイトジェン活性を有することを見出し、さらに抗
エイズウイルス活性についても検討した結果、ヘテロな
硫酸多糖体よりもホモ硫酸多糖体に強力な抗エイズウイ
ルス活性があることを見出した。（ＴＨＥ　ＪＡＰＡＮ
ＥＳＥＪＯ［ＩＲＮＡＬ　　ＯＦ　　ＥＸＰＥＲＩＭＥ
ＮＴＡＬ　　ＭＥＤＩＣＩＮＥ、　Ｖ口り、　　５　８
゜Ｎα３．ＰＰ　　１４７−１５３　　（１９８８））
本発明者らはこの知見にもとづき、いくつかのホモ多糖
体を硫酸化して、その抗エイズウイルス効果を比較した
ところ、マンナン、プルラン、アルギン酸等の硫酸化物
よりもデキストランの硫酸化物が強い活性を持つことを
見出した。本発明者らは、さらに他のホモ多糖の硫酸化
物の抗エイズウィルス効果の試験を行い、当該多糖の硫
酸化物がデキストラン硫酸以上に強い抗エイズウイルス
活性を示すことを見出し、さらに当該多糖硫酸化物の分
子量や、硫酸含量のエイズウィルス活性に与える影響に
ついても試験を行い、本発明を完成するに至った。

（発明の構成） 当該多糖とては、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ　　ｃｏ
ｍｍｕｎｅＦｒｉｅｓ（スエヒロタケ）が産生ずるシゾ
フィラン、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ　ｇｌｕｃａｎｉｃｕ
ｍが産生ずるスクレログルカン、Ｐｏｒｏｄｉｓｃｕｌ
ｕｓ　Ｐｅｎｄｕｌｕｓの産生するペンジュランなどが
あり、これらのホモ多糖はいずれもそれぞれの生産菌を
培養することによって菌体外に産生されるので、多糖の
分離、精製が容易である。

これらの培養で得られる当該多糖は極めて高粘性かつチ
クソトロピックな水溶液を作るため、その精製は一般に
困難である。これらの当該多糖を本発明の目的である医
薬品として利用するために高度に精製するには、多糖の
解重合によって分子量を低下せしめることが望ましい。

このための解重合法としては、多糖水溶液に超音波を照
射するか、或は高剪断力で処理する方法が望ましい。こ
れらの解重合法では、当該多糖のβ−１，３−グルコシ
ド結合からなる主鎖だけが選択的に切断され、β−１，
６−グルコシド結合の側鎖は殆ど切断されることがない
。

かくて当該多糖の基本構造は解重合後も変わることなく
保持されるのである。

当該多糖を医薬品製造のために利用するまでに精製する
には、当該多糖の分子量は１０６以下（（１）式のｎと
して１５４４以下）、好ましくは、５　Ｘ　１０’以下
（（１）式のｎとして７７２以下）にまで低下すること
が望ましい。当該多糖の分子量がこれ以上になるとその
水溶液の高粘性のために、濾過、イオン交換、活性炭処
理等の精製操作を行うことがむずかしい。

当該多糖はβ−１，３グルコシド結合を主鎖にもつ多糖
体であるため、デンプンやデキストラン等のαグルコシ
ド結合をもった多糖体とは異なり、体内酵素によって分
解されにくく、非常に低毒性であるという特徴を有する
。

当該多糖を硫酸化する場合、硫酸化の方法は既知の方法
のいずれを用いてもよいが例えば、硫酸を用いる方法、
クロロスルホン酸を用いる方法、スルファ−トリオキサ
イドを用いる方法等が使用できる。これらの方法のうち
、ルイス塩基との組合せで用いる、クロロスルホン酸法
およびスルファ−トリオキサイドを用いる方法は硫酸を
用いる方法に比較して多糖体の分解が少ないので、本発
明の硫酸化多糖の調製に適している。ルイス塩基として
は、ピリジン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、
ジオキサンおよびビス（２−クロロエチル）エーテル等
が用いられる。また、ピリジン無水硫酸コンプレックス
をピリジン中或はジメチルスルホキシド中で当該多糖と
反応させて硫酸化する方法も簡便法として用いることが
できる。

調製した硫酸化多糖は、加水分解を防ぐために適当な塩
の形にしておくのが普通である。塩の種類としては、例
えば、アンモニウム塩或はナトリウム塩をはじめとする
アルカリ金属塩が一般的であるが、アルカリ土類金属塩
、鉄塩などの金属塩或は第４級アミンとの塩の形成が可
能である。

当該多糖、並びにその硫酸化物は、次のような赤外吸収
スペクトルを示す。

（イ）当該多糖（第１図） ３４００ｃｒ’付近におけるＯ−Ｈの伸縮振動、１２５
０ａｒ’付近におけるＣ−０−Ｃの非対称伸縮振動、１
０５１０５Ｏ’付近におけるＣ−００伸縮振動及び８９
０ｃｍ−’付近におけるβ−グルコシド結合特有の吸収
を示す。

（ロ）当該多糖硫酸化物（第２図） １２４０ｃｍ−’付近に８０２の対称伸縮振動、８１０
ｃｍ’付近にはＣ−０−Ｓの伸縮振動による吸収を夫々
示す。

本発明者らは当該多糖硫酸化物の調製に用いる出発原料
としての当該多糖の平均分子量或は硫酸化後のイオウ含
量と、マイトジェン活性或は抗エイズウイルス活性との
関係について調べた結果、これらの生理活性が当該多糖
の平均分子量に依存するよりはむしろ、硫酸化後のイオ
ウ含量に強く依存して発現されていることを見出した。

マイトジェン活性は、硫酸化多糖のイオウ含量が２〜１
７重量％の範囲で発現され、抗エイズウイルス活性は、
イオウ含量が３〜１７重量％の範囲で発現され、イオウ
含量が３重量％以下では抗エイズウイルス活性は減少し
た。また、イオウ含量が１７重量％の硫酸化物シゾフィ
ランの細胞毒性試験では、２０００μｇ　／ｉｌｌ！、
の濃度まで細胞毒性を示さなかったが、これ以上のイオ
ウ含量では医薬品としての利用に適さないと予想される
。

当該多糖硫酸化物の抗エイズウイルス活性は当該多糖の
分子量依存性が小さい。従って本発明に使用する当該多
糖の分子量は、その充分な精製に適する範囲であればよ
く、一般に１０６以下（（１）式のｎとして１５４４以
下）、望ましくは５Ｘ１０５以下（（１）式のｎとして
７７２以下）である。

尚、他の多糖体、例えば、デキストラン、カードラン、
レンチナン等の硫酸化物においても、イオウ含量がシゾ
フィランにおける上述の知見と大体同じ範囲において抗
エイズウイルス活性をもつことをも本発明者らは見出し
たが、これらの知見は本願発明とは無関係である。

以下実施例により、具体的に説明をおこなう。

実施例１ 種々の方法により、当該多糖の硫酸化物を調製し、マイ
トジェン活性および抗エイズウイルス活性についてしら
べた。

（１）硫酸化シゾフィランの調製 Ａ　法： 当該多糖０．５　ｇまたは１ｇをピリジン１００ｍｌ中
に４５℃で５分間懸濁させた後ピリジン無水硫酸コンプ
レックス（２〜６ｇ）を添加し、撹拌しながら、６０〜
７０℃で反応させ、硫酸化をおこなった。

反応後、沈殿物を少量の水に溶解し、遊離の硫酸を硫酸
バリウムの沈殿として遠沈除去した。上澄液を減圧濃縮
し過剰量のエタノールを加えて硫酸化物の沈殿を析出さ
せた。沈殿を水に溶解しイオン交換処理後、ＮａＯＨで
中和した。濃縮後エタノールを加え、沈殿を生成させた
のち遠沈によって沈殿を集め、少量の水に溶解させ凍結
乾燥し、硫酸化シゾフィラン（１）〜（３）、（７）〜
αＱを得た。

Ｂ　法ニ ジシフイラン１ｇをジメチルスルホキシド１０〇−に溶
解し、ピリジン無水硫酸コンプレックス３ｇ、６ｇまた
は９ｇを加え、室温で５分間反応させて硫酸化をおこな
った。

反応後反応液を氷水で冷却し、上清除去後沈殿物に冷水
５０ｍｊｌ！を加え溶解した。水酸化バリウム飽和水溶
液を添加して中和し、遠沈により沈殿除去後、上澄液を
透析した。透析内液を減圧濃縮しアセトンを過剰量加え
、遠沈により得た沈殿を５０ｍ１の水に溶解しイオン交
換処理後、ｌＮ−ＮａＯＨを添加して中和し、凍結乾燥
して硫酸化シゾフィラン（４）〜（６）を得た。

Ｃ法： 丸底フラスコにピリジン２５ｍ７を入れ、−１０℃に冷
却し撹拌しながら、クロルスルホン酸５−を徐々に加え
、１５〜２０分間反応させた。反応物を６０〜７０℃で
溶解させた後、シゾフィラン１ｇを加え、１時間激しく
撹拌して硫酸化をおこなった。

反応後、土浦除去し、沈殿物を冷水１００ｍ１！に溶解
させ、飽和炭酸ナトリウム溶液を加えて中和し、過剰量
のアセトンを加えて硫酸化物の沈殿を析出させた。遠沈
により沈殿を回収し、水を加えて溶解しイオン交換処理
後、炭酸ナトリウムを加えてｐＨを９〜１０に調整した
。これに過剰量のアセトンを加え、遠心分離して得た沈
殿を少量の水に溶解後、凍結乾燥して硫酸化多糖αυお
よびαδを得た。

以上の方法により得たシゾフィランの硫酸化物を表１に
要約した。

表　１　試料 （２）硫酸化シゾフィランのマイトジェン活性の検討マ
ウスの牌臓を無菌的にとり出し、培地中でほぐして３×
１０′１個／ｍｌの細胞懸濁液を調製した。

９６穴マイクロプレートに３Ｘ１０’個／ウェルの細胞
をまき、培地および試料を添加して３日間培養した。３
日目に０．５μＣｉの３Ｈ−チミジンを各ウェルに添加
し、さらに７時間培養した後、細胞をハーベストし、よ
く洗浄し液体シンチレーションカウンターで細胞内に取
り込まれた３Ｈ−チミジンの量を測定した。

測定値を表２に要約した。

硫酸化シゾフィランにはシゾフィランにはみられない高
いマイトジェン活性が観察された。

表　２　硫酸化シゾフィランのマイトジェン活性（３）
硫酸化シゾフィランの抗エイズウイルス活性の検討 ＭｏＨ−４／ｃｌ、　Ｎα８細胞とＴａ１ｌ　−１／Ｈ
ＴＬＶ　−ＩＩ［由来のウィルスを細胞に吸着させた後
、細胞を培地で洗って吸着していないウィルスを除去し
、この細胞を試験に供した。

２４穴マイクロプレートの各ウェルに ３．５Ｘ１０’個／ｒｎｌの細胞懸濁液１−５．培地１
−８及びＰＢＳに溶解した試料を最終濃度１００μｇ　
／　ｍｊ２　、になるように加え、８日間培養し、ウィ
ルスによる細胞変性効果（ＣＰＥ）を観察した。

また８日目に培養上清を採取し、逆転写酵素活性の測定
に供した。細胞はウィルス抗原の検出のため間接蛍光抗
体法に供した。

逆転写酵素活性の測定結果を表３に要約した。

表　３　　　硫酸化シゾフィランの抗エイズウイルス作
用（Ｍｏｌｔ　−４／ｃ１．　ｍ８細胞）表３に示した
ように、硫酸化シゾフィランは顕著にエイズウィルスの
増殖を抑制する、強力な抗エイズウイルス活性を有した
。

これらの硫酸化シゾフィランはエイズウィルスによる細
胞変性効果によってひき起こされる、ジャイアントセル
形成を完全に抑制した。また、これらの硫酸化シゾフィ
ランとともに培養した細胞には間接蛍光抗体法でウィル
ス抗原は検出されなかった。

実施例２ さらに、硫酸化シゾフィランの抗エイズウイルス活性を
ＭＴ−４細胞を用いて調べた。

実施例１の（３）と同様の方法で細胞を準備し、各ウェ
ルに１４×１０４個／−０の細胞懸濁液１ｍｊｌ！。

培地１ｍｌ、および試料溶液を加え、１０日間培養した
。

細胞変性効果め観察、逆転写酵素活性の測定および間接
蛍光抗体法によって、硫酸化シゾフィランの抗エイズウ
イルス作用について調べた。

表４に逆転写酵素活性の測定結果を要約した。

表４に示されているように、硫酸化シゾフィランはＭＴ
−４細胞のようなエイズウィルスに高感受性の細胞系に
おいても強い抗エイズウイルス活性を有した。

これらの試料、（３）、αＱ、αＤ、およびαりはまた
細胞変性によるジャイアントセル形成を抑制した。

これらの硫酸化物とともに培養した細胞は間接蛍光抗体
法でウィルス抗原は全く検出されないか、検出されても
非常にわずかであった。

表　４　硫酸化シゾフィランの抗エイズウイルス作用（
ＭＴ−４細胞） 実施例３ 以上は、セルライン化された培養細胞系において硫酸化
シゾフィランの抗エイズウイルス活性を調べたものであ
るが、本実施例では、ヒト末梢血リンパ球における硫酸
化シゾフイランのエイズウィルス増殖抑制効果について
試験をおこなった。

エイズ患者の末梢血から、比重遠心法によってリンパ球
を分離し、無血清培地で３回洗浄後、１０％ＦＣ３の入
った培地に懸濁させた。吸着性細胞を除去した後、浮遊
細胞を集め、培地に９濁させた後、ＰＨＡおよびＩＬ−
２を添加した。健常人のリンパ球は３日前に上記の方法
により準備しておく。２４大のマイクロプレートの各ウ
ェルに、患者リンパ球１０′１個／１ｍｌ、培地、健常
人のリンパ球１０６個／１．ｍｊｌ！、および硫酸化シ
ゾフィラン溶液を入れ、混合培養する。培養開始後７日
目、１１日口重と上清を採取し、逆転写酵素の活性測定
に供した。採取した上清と同量の培地を各ウェルに入れ
、培養を続けた。

表５に結果を要約する。

表　　５　　　　ヒト末梢血リンパ球における硫酸化シ
ゾフィランの抗エイズウイルス作用 このように、ヒト末梢血リンパ球においても硫酸化シゾ
フィランの抗エイズウイルス効果が確認された。

実施例４ シゾフィランは抗腫瘍活性を有する多糖体であり、硫酸
化によってもこの活性が残る場合もあり、抗エイズウィ
ルス剤として他にない特徴を有する。

マウス、鼠践部皮下にＳａｒｃｏｍａ　　１８０細胞を
２Ｘ１０６個移植する。２４時間後に、硫酸化シゾフィ
ランの０．５％ＰＢＳ溶液を０．０５ｍｆ！、後肢大腿
部筋肉内に投与する。３０日後にマウスを解剖して腫瘍
を摘出し重量を測定する。

次式により抑制率を計算する。

抑制率（％）＝ 対照群の平均腫瘍重量（ｇ） ×１００ 尚、マウスは１群６匹、対照群にはＰＢＳを試料投与群
と同量投与した。

結果を表６に要約した。

表　６　　硫酸化シゾフィランの抗腫瘍効果この結果の
ように、一部の硫酸化シゾフィランには、強い抗腫瘍活
性が維持されており、他にない大きな特徴といえる。

以上具体的に実施例をいくつかあげて、硫酸化シゾフィ
ランの抗エイズウィルス剤としての有用性について述べ
た。

尚、急性毒性試験の結果を表１０に要約した。

表　　７　　硫酸化シゾフィランの急性毒性試験実施例
５ シゾフィランと同様（１）式のくり返し単位からなる多
糖体、スクレログルカンとペンデユランの水溶液に超音
波を照射して、それぞれの分子量を４０万に調整後、そ
れらを実施例１のΔ法（当該多糖、０．５ｇ；ピリジン
−無水硫酸コンプレックス、５ｇ；反応時間、５時間〉
によって硫酸化を行い多糖硫酸化物を得た。

得られたスクレログルカンおよびペンデユランの硫酸化
物について実施例１の（３）の方法に従って、抗エイズ
ウイルス活性を調べた。

対照として硫酸化シゾフィラン（実施例１の試料（３）
）およびデキストラン硫酸を使用した。結果を表８に示
す。

表　　８　　スクレログルカンおよびペンジュランの硫
酸化物の抗エイズウィルス作用 表１１に示したように、スクレログルカンおよびペンジ
ュランの硫酸化物は硫酸化シゾフィランと同様、デキス
トラン硫酸以上の強いエイズウィルス増殖抑制効果を有
した。また、これらの硫酸化物は細胞変性効果によって
ひき起こされるジャイアントセルの形成を完全に抑制し
た。

さらに、間接蛍光抗体法では、これらの硫酸化物ととも
に培養した細胞には、ウィルス抗原は検出されなかった
。

実施例６ 分子量の異なるシゾフィランを実施例１のＡ法（当該多
糖、０．５ｇ；ピリジン−無水硫酸コンプレックス、５
ｇ；反応時間、５時間）によって硫酸化を行った。得ら
れた多糖硫酸化物について、実施例１の（３）の方法に
従って抗エイズウイルス活性を調べた。対照としてデキ
ストラン硫酸を使用した。結果を表−９に示す。

表　　９　　抗エイズウイルス活性の 当該多糖分子量依存性 （発明の効果） 本願発明の抗エイズウィルス剤は、原料物質として構成
単糖がグルコースのみからなる、ホモ多糖体を硫酸化し
て用いているため、ヘテロな構造を有する硫酸多糖体に
はない非常に強いマイトジェン活性および抗エイズウイ
ルス活性を有する。

さらに、当該多糖の硫酸化物はイオウ含量が３〜１７％
と規定されたために、強力な抗エイズ活性をもちながら
低毒性であるという特徴を有する。

Ｍｏ１ｔ−４／ｃ１．　　Ｎｏ、８細胞やＭＴ−４細胞
のようなセルライン化された培養細胞のみならず、ヒト
末梢血リンパ球においても抗エイズウイルス作用を有す
ることが証明されたことにより、当該多糖の硫酸化物が
非常にすぐれた抗エイズウィルス剤となりうろことを示
すものである。

また、当該多糖の平均分子量が１万〜５０万に調整され
ているため、濾過、精製といった製造工程上の種々の問
題が解決され、高度に精製された多糖体を用いることが
でき、従って本則も医薬品として高い品質を保ちうる。

【図面の簡単な説明】

第１図は当該多糖の赤外吸収スペクトル、第２図は当該
多糖の硫酸化物の赤外吸収スペクトルを示す。 １、事件の表示　　昭和６３年特許願第１１６４９９号
２０発明の名称　　　　抗エイズウィルス剤３、補正を
する者 事件との関係　　出願人 名称　台糖株式会社 ４、代理人

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記（１）式のくり返し単位からなり、分子量１
   ００万以下（ｎ≦１５４４）の多糖の硫酸化物を含む抗
   エイズウィルス剤。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （１）式
2. （２）分子量５０万以下（ｎ≦７７２）の多糖の硫酸化
   物含む請求項（１）記載の抗エイズウィルス剤。
3. （３）（１）式のくり返し単位からなる多糖がシゾフィ
   ランである請求項（１）記載の抗エイズウィルス剤。
4. （４）（１）式のくり返し単位からなる多糖がスクレロ
   グルカンである請求項（１）記載の抗エイズウィルス剤
   。
5. （５）（１）式のくり返し単位からなる多糖がペンジュ
   ランである請求項（１）記載の抗エイズウィルス剤。
6. （６）多糖硫酸化物中の硫酸基の含量が、硫黄含量とし
   て３〜１７重量％である請求項（１）記載の抗エイズウ
   ィルス剤。