KR100720905B1

KR100720905B1 - 음이온성 또는 양이온성 덴드리머의 항균성 또는 구충성조성물

Info

Publication number: KR100720905B1
Application number: KR1020017003211A
Authority: KR
Inventors: 매튜스배리로스; 홀랜조오지
Original assignee: 스타파마 피티와이 리미티드
Priority date: 1998-09-14
Filing date: 1999-09-13
Publication date: 2007-05-25
Also published as: EP1113806A1; CA2343113A1; DE69937059D1; JP4979848B2; EP1113806B1; NZ510289A; JP2002524524A; WO2000015240A1; ATE372123T1; BR9913712A; DE69937059T2; KR20010075066A; US6464971B1; CA2343113C; EP1113806A4; AUPP584298A0; CN1323214A; CN101352451A

Abstract

본 발명은 말단기 중 1 이상이 덴드리머에 결합되어 있거나 또는 연결되어 있는 음이온성 또는 양이온성 부분을 갖는 다수의 말단기를 보유하는 덴드리머를 유효량으로 감염체에 투여하는 것을 포함하는, 인간 또는 인간이 아닌 동물 감염체에 있어서 미생물체 또는 기생체를 예방학적으로 또는 치료학적으로 억제하는 방법에 관한 것이다.

Description

음이온성 또는 양이온성 덴드리머의 항균성 또는 구충성 조성물{ANIONIC OR CATIONIC DENDRIMER ANTIMICROBIAL OR ANTIPARASITIC COMPOSITIONS}

본 발명은 미생물체 또는 기생체의 억제 방법에 관한 것으로서, 특히 세균, 진균 또는 기생충과 같은 병원체에 의한 인간 및 인간이 아닌 동물 감염체의 감염 억제제로서의 덴드리머(dendrimer)의 용도에 관한 것이다.

덴드리머는 다수의 표면 말단기를 특징으로 하며 낮은 다분산성을 갖는 3 차원적 중합체 물질을 의미한다. 더욱이, 상기 물질이 제조되는 방식은 표면기의 크기, 형태 및 수와 유형에 따라서 엄격한 제한을 받는다. 수지형 물질(dendritic material)은 치료 물질로서 사용되는데에 유용한 몇가지 특성, 즉 생물학적 표면 및 수용체와 상호 작용을 하는, 소정의 거대한 표면을 제공하는 고정된 형태 ; 및 생물학적 표적과 다중성 상호 작용을 하는 다수의 말단기를 갖는다.

국제 특허 출원 PCT/AU95/00350(WO 95/34595) 및 PCT/AU97/00447(WO 98/03573)에는 다수의 말단기를 보유하며, 상기 말단기 중 1 이상이 덴드리머와 결합되어 있거나 또는 연결되어 있는 음이온 또는 양이온 함유 부분을 보유하는, 폴리아미도아민 또는 폴리리신 덴드리머와 같은 덴드리머에 관하여 개시되어 있다. 상기 공개된 국제 특허 출원들은 본원에 참고 문헌으로서 인용한다.

본 발명은 세균성 병원체 및 진균성 병원체를 비롯한 미생물체, 그리고 기생체의 억제에 관여하는 수지형 중합체(dendritic polymer)의 용도를 제공한다.

발명의 요약

본 발명에 의하면, 말단기 중 1 이상이 덴드리머에 결합되어 있거나 또는 연결되어 있는 음이온성 또는 양이온성 부분을 갖는 다수의 말단기를 보유하는 덴드리머를 유효량으로 감염체에 투여하는 것을 포함하는, 인간 또는 인간이 아닌 동물 감염체에 있어서 미생물체 또는 기생체를 예방학적으로 또는 치료학적으로 억제하는 방법이 제공된다.

본 발명의 방법에 사용되는 특히 바람직한 화합물로서는 설폰산 함유 부분, 카복시산 함유 부분, 인산 또는 포스폰산 함유 부분, 보론산 함유 부분, 뉴라민산 또는 시알산 함유 부분 또는 뉴라민산 또는 시알산을 함유하는 부분 ; 1차, 2차, 3차 또는 4차 아미노 함유 부분, 피리디늄 함유 부분 ; 구아니디늄 함유 부분 ; 아미디늄 함유 부분 ; 페놀 함유 부분 ; 산성 또는 염기성 수소를 보유하는 복소환 ; 쥬비터 이온 함유 부분 ; 또는 전술한 부분들의 혼합물을 보유하며, 이들의 말단기와 연결되어 있는 덴드리머가 있다.

본 발명의 방법에 사용되는 화합물들은 본원에서 다가 이온성 덴드리머라고 불리우며, 상기 용어는 본원의 명세서 전반에 걸쳐서 덴드리머 그 자체 뿐만 아니라, 예를 들어 나트륨염, 칼륨염 또는 칼슘염과 같은 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속염 및 플루오르화물, 염화물, 브롬화물, 요오드화물, 시트레이트, 아세테이트, p-톨루엔 설포네이트 등과 같은 약리학적으로 허용 가능한 음이온과 같은, 이들의 약리학적 또는 수의학적으로 허용 가능한 염을 포함한다.

발명의 상세한 설명

본 발명에 의하여 사용된 바람직한 화합물로서는 하기 화학식 1 의 다가 이온성 덴드리머를 포함한다.

상기 식중,

I 는 개시 중심이고 ;

Z 는 내부 분지 단위이며 ;

n 은 덴드리머의 세대수를 나타내는 정수이고 ; 및

A 는 임의의 연결기 X 를 통하여 내부 분지 단위 Z 에 연결될 수 있는 음이온 또는 양이온 함유 부분이다.

덴드리머는, 매우 규칙적인 입체 구조의 중합체 화합물을 구성하는 연속적인 "세대(generation)" 에 연속 층 또는 단계가 가해지는, 개시 중심 분자로부터 출발하여 일련의 반복적 반응에 의하여 형성된 고도로 분지화된 거대 분자성 화합물이다. 덴드리머는 다음의 특징들을 갖는다 : 즉,

ⅰ. 덴드리머의 최종 형상을 유지시키도록 충분한 크기를 가질 수 있으며, 1 이상의 반응성 부위 및 점 형상을 지닐 수 있는 개시 중심(I) ;

ⅱ. 개시 코어에 부착된 분지형 반복 단위(Z)의 층 ;

ⅲ. 덴드리머 표면에, 임의로는 연결기(연결기 X 와 같은)에 의하여 부착된 작용성 말단기(A 부분과 같은). 본 발명은 이온성 부분의 결합을 위한 골격으로서 수지형 구조를 사용하며 ; 본 발명은 본원에 상세히 기술된 구형 덴드리머에 제한되지는 않지만 임의의 수지형 구조체가 될 수 있다. 형상 및 구성 모두의 경우에 있어서의 다수의 덴드리머는 당 업계의 숙련자들에게 널리 공지되어 있다.

덴드리머의 제조 방법에 관하여는 널리 공지되어 있으며, 미국 특허 제4,289,872호 및 동 제4,410,688호(리신 단위층계 덴드리머에 관하여 기술됨), 및 미국 특허 제4,507,466호, 동 제4,558,120호, 동 제4,568,737호 및 동 제4,587,329호(폴리아미도아민 또는 PAMAM 덴드리머를 포함하는 기타의 단위계인 덴드리머에 관하여 기술됨)의 실시예에 의하여 기술되어 있다. 상기 미국 특허에 개시된 덴드리머들은, 종이 제조에 있어서 표면 개질제, 금속 킬레이트제, 해유화제 또는 오일/물 유화제, 습윤 강화제로 사용되는데에 적당하며, 페인트와 같은 수성 배합물에 있어서 점도 개질제로 사용되는데에 적당한 것으로 기술되어 있다. 또한 미국 특허 제4,289,872호 및 동 제4,410,688호에서는 리신 단위계 덴드리머가 약리학적 투여제의 제조시 기질로서 사용될 수 있다고 제시하고 있다.

국제 특허 공개 공보 WO 88/01178, WO 88/01179 및 WO88/01180 에는 덴드리머가 운반형 약학 물질 또는 농업용 물질과 같은 기타의 물질과 접합되었거나 또는 결합된 접합체에 관하여 기술되어 있다. 더욱이, 국제 특허 공개 공보 WO 95/24221 에는 생물학적 반응 개질제일 수 있는 담체 물질, 및 임의적으로는 표적 유도제와 결합된, 1 이상의 덴드리머로 구성된 수지형 중합체성 접합체에 관하여 기술되어 있다. 전술한 미국 특허와 함께 상기 특허 공개 공보들은 다양한 덴드리머와 이들의 제조 방법에 관하여 폭넓게 개시되어 있으며, 상기 각각의 공개 공보에 개시된 사항들은 본원에 참고 문헌으로서 첨부되어 있다.

본원에 사용된 "덴드리머" 란 용어는 최광의로 이해되며, 여기에는 특허 공개 공보 WO 88/01178, WO 88/01179 및 WO 88/01180 에 기술되어 있는 모든 형태의 덴드리머와 이들 덴드리머의 조성물을 포함한다. 상기 용어는 또한 상기 특허 공개 공보에서와 같이 결합 또는 가교 결합된 덴드리머를 포함한다.

본 발명의 바람직한 덴드리머들은 2 이상의 수지형 분지에 공유 결합된 다가 중심을 포함하며, 이는 2 세대 이상 확장된 것이 바람직하다. 특히 바람직한 덴드리머들로서는 폴리아미도아민(PAMAM) 덴드리머, PAMAM(EDA) 덴드리머, 폴리(프로필렌이민)(PPI) 덴드리머 및 폴리리신 덴드리머가 있다.

본 발명에 의하면, 1 이상, 바람직하게는 실질적인 수의 상기 덴드리머 표면 말단기가 상기 덴드리머에 공유 결합된 음이온 또는 양이온 함유 부분을 보유한다. 상기 덴드리머의 분지들은, 아미노기, 또는 OH, SH 등과 같은 기타의 작용성 반응기로 말단화되고, 차후에 음이온성 또는 양이온성 부분과 반응할 수 있다. 상기 덴드리머의 말단기가 아민기인 경우, 상기 음이온 또는 양이온 함유 부분은, 아미드 및 티오우레아 결합을 포함하는 다수의 작용기에 의하여 덴드리머에 결합될 수 있다. 덴드리머의 말단기에 결합될 수 있는 바람직한 음이온 또는 양이온 함유 부분의 예로는, 설폰산 함유 부분, 카복시산 함유 부분(뉴라민산 및 시알산 함유 부분, 변형된 뉴라민산 및 시알산 함유 부분 포함), 보론산 함유 부분 및 인산 및 포스폰산 함유 부분(에스테르화된 인산 및 포스폰산 함유 부분 포함) 및 1차, 2차, 3차 또는 4차 아미노 함유 부분, 피리디늄 함유 부분 ; 구아니디늄 함유 부분 ; 아미디늄 함유 부분 ; 페놀 함유 부분 ; 복소환 보유 산성 또는 염기성 수소 ; 쥬비터 이온 함유 부분 ; 또는 전술한 부분들의 혼합물 등이 있다.

아미노 또는 기타 말단기에 결합 또는 연결될 수 있는 적당한 음이온 및 양이온 함유 부분으로서는 예를 들어, 다음의 기(단, n 은 0 또는 양의 정수이며, 더욱 바람직하게 n 은 0 또는 1 ∼ 20 사이의 정수임)들을 들 수 있다.

전술한 바에 더하여, 다양한 뉴라민산 또는 시알산 함유 부분 또는 변형된 뉴라민산 또는 시알산 함유 부분이 본 발명에 의한 덴드리머에 결합 또는 연결될 수 있다. 상기 부분들은 뉴라민산의 다수의 N- 및 O-치환 유도체, 특히 N-아세틸, O-아세틸 및 N-글리콜일 유도체와 같은 N-아실 및 O-아실 유도체, 그리고 뉴라민산기가 변형된 부분들을 포함한다. 적당한 변형 뉴라민산기로서는 4- 위치가 아미노, 아미도, 시아노, 아지도 또는 구아니디노기로 치환된 기와 불포화 뉴라민산 기를 포함한다. 상기 부분들은 2-, 7-, 9- 또는 5-NAc 위치에서 덴드리머와 결합될 수 있다.

화학식 1의 다가 이온성 덴드리머에서, n 은 1 ∼ 20 또는 그 이상의 정수인 것이 바람직하며, 1 ∼ 10 의 정수가 더욱 바람직하다. 또한 상기 덴드리머는 3 이상의 말단기를 포함하는 것이 바람직하다.

덴드리머와 A 부분 사이에 존재하여 스페이서로서 작용하도록 제공될 수 있는 임의의 연결기 X 는 알킬쇄(치환 또는 분지형일 수도 있는), 알콕시, 폴리알콕시, 알킬티오 또는 폴리알킬티오쇄(치환될 수도 있는), 또는 알케닐, 복수개의 알케닐, 알키닐 또는 복수개의 알키닐쇄(치환될 수도 있는)를 포함할 수 있다. 적당한 스페이서 쇄로서는 화학식 -(CH₂)m-Z-(CH₂)m- (상기 식중, Z 는 -CH₂-, -CH=CH-, -C≡C-, -O- 또는 -S- 이며 m 은 1 ∼ 15 사이의 정수임)를 포함한다.

본 발명의 음이온성 또는 양이온성 덴드리머는 당 업계의 숙련자들에게 널리 공지된 표준적인 화학적 방법에 의하여 제조될 수 있다. 적당한 방법은 이하의 실시예의 예를 통하여 기술된다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 음이온성 또는 양이온성 덴드리머는 미생물체 및 기생체를 억제하는 것으로 밝혀졌다. 본원에 사용된 "미생물체(microbial agent)"란 용어는 세균체 및 효모체 또는 진균체, 특히 세균성 및 효모성 또는 진 균성 병원체를 의미하는 것이다. 그러므로, 상기 용어에는 에스케리챠 콜라이(Eschericia coli), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium) 및 스트렙토코커스(Streptococcus), 스타필로코커스(Staphylococcus), 쉬겔라(Shigella), 슈도모나스(Pseudomonas), 클로스트리디움(Clostridium), 네이세리아(Neisseria) 및 뉴모코커스(Pneumococcus)종과 같은(이에 한정되는 것은 아님) 그람 양성 및 그람 음성 세균을 포함한다. 뿐만 아니라, 상기 용어에는 칸디다(Candida)와 같은 효모 병원체 및 아스퍼질러스 퓨미가투스(Aspergillus fumigatus)와 같은 진균성 병원체를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 "기생체(parasitic agent)"란 용어는 특히 기생성 병원체를 의미하는 것으로서, 플라스모듐(Plasmodium), 트리파노소마(Trypanosoma) 및 라이쉬마니아(Leischmania)종, 톡소플라스마 곤디(Toxoplasma gondii), 뉴모시스티스 카리니(Pneumocystis carinii) 및 크립토스포리듐 파르븀(Criptosporidium parvum)과 같은 기생체들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본원에 사용된 바와 같은 "억제(inhibition)"란 용어는 최광의로서 미생물 또는 기생성 병원체에 의한 인간 또는 인간이 아닌 동물 감염체의 감염을 완전히 또는 부분적으로 억제 또는 저지시키거나, 또는 미생물 또는 기생성 병원체에 의한 인간 또는 인간이 아닌 동물 감염체의 감염을 완전히 또는 부분적으로 억제 또는 저지시키는 효과를 포함하는 것이다. 상기 용어는 또한 예방학적 처치와 치료학적 처치를 포함하는데에 사용된다.

그러므로, 본 발명의 다른 관점은 인간 또는 인간이 아닌 동물 감염체의 미생물체 또는 기생체를 예방학적으로 또는 치료학적으로 억제하는 약리학적 또는 수의학적 조성물을 제공하는 것으로서, 여기에는 상기와 같이 광범위하게 기술된 덴드리머와 1 이상의 약리학적 또는 수의학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함한다.

이러한 조성물의 제형은 당 분야의 숙련자들에게 널리 공지되어 있다. 적당한 약리학적으로 허용 가능한 담체들 및/또는 희석제에는 임의의 그리고 모든 종래의 용매, 분산 매체, 충전제, 고형 담체, 수용액, 피복물, 항균제 및 항진균제, 등장성 및 흡수성 지연제 등을 포함한다. 이러한 약리학적으로 활성 물질용인 매체 및 제제의 용도는 당 업계에 널리 공지되어 있으며, 이에 관하여는 Remington's Pharmaceutical Sciences(제18판, USA, Pennsylvania 소재, Mack Publishing Company)의 예를 통하여 기술될 수 있다. 활성 성분과 비혼화성인 지금까지의 임의의 통상적인 매체 또는 제제는 별도로 하고, 본 발명의 약리학적 조성물에 있어서의 이들의 용도에 관하여 생각할 수 있다. 보조적 활성 성분들은 또한 상기 조성물에 혼입될 수 있다.

용이하게 투여하고 그 투여량을 균일하게 하는 투여 단위 형태의 조성물을 제제화하는 것이 특히 유리하다. 본원에 사용된 투여 단위 형태는 치료하고자 하는 인간 개체에 단일 투여 형태로서 적합화시킨, 물리적으로 분리된 단위를 의미하며 ; 여기서 상기 각각의 단위는 의도로 하는 치료 효과를 나타내도록 측정된 소정량의 활성 성분과 함께 필수적인 약리학적 담체 및/또는 희석제를 함유한다. 본 발명의 신규한 투여 단위 형태에 대한 설명은 (a) 활성 성분의 고유한 특성 및 얻고자 하는 특정의 치료 효능, (b) 특정 치료 목적인 활성 성분의 배합과 같은 당 업계 고유의 제한에 의하여 기술되며 또한 이것들에 의해 직접적으로 결정된다.

다른 측면에 있어서, 본 발명은 미생물체 또는 기생체를 억제하여 인간 또는 인간이 아닌 동물 감염체를 예방 또는 치료하는 처리 방법, 또는 상기 감염체의 예방 또는 치료용 의약품의 제조 방법에서 광범위하게 전술된 유효량의 덴드리머의 용도를 제공한다.

다양한 투여 경로가 유용할 수 있다. 물론, 선택된 특정 방식은 치료하고자 하는 특정 조건과 치료 효능을 나타내는 투여량에 의존성이다. 일반적으로, 본 발명의 방법은 의학적으로 허용 가능한 임의의 투여 방식, 즉 의학적으로 허용될 수 없는 역효과를 일으키지 않고 본 발명의 활성 성분의 치료학적 수준을 달성시키는 임의의 방식을 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 투여 방식으로는 경구, 직장, 국소, 비강, 흡입, 경피 또는 비경구적(예를 들어, 피하, 근육내 및 정맥내) 경로를 포함한다. 경구 투여용 제형들로서는 캡슐, 정제, 로진즈 등과 같은 독립적인 단위들을 포함한다. 기타 경로로서는 척수액으로의 직접적인 초내 투여법, 당 업계의 통상의 숙련자들에게 널리 공지되어 있는 다수의 카테터 및 풍선 혈관 성형술 장치에 의한 직접적 도입법, 그리고 표적 부위로의 실질적인 내부 주입법을 포함한다.

본 조성물은 편리하게는 단위 투여 형태로 존재할 수 있으며 당 약업계에 널리 공지된 임의의 방법에 의하여 제조될 수 있다. 이러한 방법들에는 활성 성분을 1 이상의 부가 성분을 이루는 담체와 함께 도입시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 상기 조성물은 활성 성분을 액상 담체, 미세 분화성 고형 담체 또는 이들 모두 와 함께 균일하면서 직접적으로 도입시킨후, 필요한 경우 제품을 조형시켜 제조될 수 있다.

경구 투여에 적당한 본 발명의 조성물은 각각 리포좀내에, 또는 시럽, 엘릭시르 또는 유액과 같은 수성 액체 또는 비수성 액체내 현탁액으로서 소정량의 활성 성분을 함유하는 캡슐, 교갑, 정제 또는 로진즈와 같은 독립적인 단위로서 제공될 수 있다.

비경구 투여에 적당한 조성물은 편리하게는 수혈체 혈액과 등장성인 것이 바람직한 활성 성분의 멸균 수성 제제를 포함한다. 상기 수성 제제는 적당한 분산제 또는 습윤제와 현탁제를 사용하는 공지의 방법에 의하여 제조될 수 있다. 상기 멸균 주사 제제는 또한, 예를 들어 폴리에틸렌글리콜내 용액과 같은, 비독성이며, 비경구적으로 허용 가능한 희석제 또는 용매내 멸균 주사 용액 또는 현탁액일 수 있다. 사용될 수 있는 상기 허용 가능한 비이클 및 용매들로서는, 물, 링거 용액및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 더욱이, 멸균성, 고정 오일들이 용매 또는 현탁 매체로서 통상적으로 사용될 수 있다. 이러한 목적으로, 합성 모노 또는 디글리세리드를 포함하는 임의의 블랜드 고정화 오일이 사용될 수 있다. 뿐만 아니라, 올레산과 같은 지방산을 주사액의 제조에 사용할 수 있다.

활성 성분은 또한, 예를 들어 활성 성분을 함유하는 미세 분산성 에어로졸 스프레이로서, 비강을 통하여 또는 흡입에 의하여 활성 성분을 투여하도록 디자인된 시스템에 운반되도록 제형될 수도 있다.

기타의 운반 시스템으로서는 서방형 전달 시스템(sustained release delivery system)을 포함할 수 있다. 바람직한 서방형 전달 시스템으로서는 지속형 방출 펠렛 또는 캡슐내에 본 발명의 활성 성분을 방출시키도록 제공될 수 있는 것들이 있다. 다수의 지속형 방출 운반 시스템이 유용하다. 여기에는 (a) 활성 성분이 매트릭스내에 함유되어 있는 미란성 시스템, 및 (b) 활성 성분이 중합체를 조절된 속도로 침투하는 분산 시스템을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 더욱이, 펌프계 하드웨어 운반 시스템이 사용될 수 있으며, 이들 중 몇몇은 주입용으로 사용할 수도 있다.

상기 활성 성분은 예방학적 또는 치료학적으로 유효량으로 투여될 수 있다. 예방학적으로 또는 치료학적으로 유효량이란 최소한 부분적으로 나마 목적으로 하는 효과를 얻는데에 필요한 양, 또는 치료하고자 하는 특정 상태의 개시를 지연시키고, 이의 진행을 억제하거나, 또는 모두 정지시키는 데에 필요한 양을 의미한다. 이러한 양은, 물론 치료하고자 하는 특정 상태, 상기 상태의 심각성 및 나이, 물리적 상태, 크기, 중량 및 동시에 수행하는 치료 방법을 포함하는 감염체 개개의 변수에 의존성이다. 상기 인자들은 당 업계의 통상의 숙련자들에게 널리 공지된 것으로서 통상의 실험 방법을 통하여 설명될 수 있다. 일반적으로 최대 투여량, 즉 확실한 의학적 판단에 따라서 가장 안전한 투여량인 것이 바람직하다. 그러나, 의학적 이유, 심리적 이유로 또는 실질적으로 기타 다른 이유로 더욱 낮은 투여량 또는 허용 가능한 투여량으로 투여될 수 있다는 사실을 당 업계의 통상의 숙련자들은 이해할 수 있을것이다.

일반적으로, 활성 성분의 1일 경구 투여량은 1일당 약 0.01 ∼1000 ㎎/㎏ 일 것이다. 처음에는 소량(0.01 ∼ 1 ㎎)이 투여될 수 있으며, 이후 상기 투여량을 1일당 약 1000 ㎎/㎏ 이하까지 증가시킬 수 있다. 이와 같은 투여량의 경우에도 개체에서의 반응이 충분하지 않을 경우, 그 보다 많은 투여량(즉 상이하고 보다 국소화된 운반 경로에 의하여 효과적으로 보다 높은 투여량의 경우)이 감염체의 내성이 허용되는 정도까지 사용될 수도 있다. 전신에 걸쳐서 화합물의 효과를 적당히 달성시키기 위하여 1일당 복수회 투여될 수도 있을 것으로 추측된다.

본 발명에 의한 활성 성분은 또한, 예를 들어 당 업계의 통상적인 방법에 의하여 수의학적 조성물의 형태로 사용되도록 제공될 수도 있다. 이러한 수의학적 조성물들은 이하와 같이 적용시킬 수 있다.

(a) 경구 투여, 외용법, 예를 들어 물약(예를 들어, 수용액 또는 비수용액 또는 현탁액) ; 정제 또는 환제 ; 먹이 성분과 혼합된 분말, 과립 또는 펠렛 ; 혀에 투여되는 페이스트 ;

(b) 비경구 투여, 예를 들어 피하, 근육내 또는 정맥내 주사, 예를 들어 멸균 용액 또는 현탁액 ; 또는 (적당한 경우) 현탁액 또는 용액이 유두를 통하여 유방으로 도입되는 유방내 주사 ;

(c) 국소 투여, 예를 들어 피부에 투여되는 크림제, 연고제 또는 도포제 ; 또는

(d) 질내 투여, 예를 들어 질좌약, 크림 또는 거품제

명세서 중에 별도의 언급이 없는한, 본원 명세서 및 청구항을 통하여 "포함(comprise)"이라는 용어, 또는 이의 변형어인 "포함한다(comprises)" 또는 " 포함하는(comprising)"이라는 용어들은 전술한 정수 또는 상기 정수들의 군을 포함하되, 임의의 기타 정수 또는 정수들의 군을 배제하는 것은 아니라는 사실을 이해하게 될 것이다.

첨부된 도면들에 있어서,

도1은 시험관내 인간 적혈구 세포에서의 P.팔시파럼(P.falciparum) 생장에 BRI 2999 가 미치는 효과를 나타내는 것이다.

도2는 시험관내 인간 적혈구 세포에서의 P.팔시파럼(P.falciparum) 생장에 BRI 6741 이 미치는 효과를 나타내는 것이다.

도3은 시험관내 인간 적혈구 세포에서의 P.팔시파럼(P.falciparum) 생장에 BRI 2998 이 미치는 효과를 나타내는 것이다.

도4는 시험관내 인간 적혈구 세포에서의 P.팔시파럼(P.falciparum) 생장에 BRI 7011 이 미치는 효과를 나타내는 것이다.

도5는 시험관내 인간 적혈구 세포에서의 P.팔시파럼(P.falciparum) 생장에 BRI 6181 이 미치는 효과를 나타내는 것이다.

본 발명의 추가의 특징들은 본 발명을 한정하는 것이 아닌 예시하는 것에 불과한, 이하의 실시예들을 통하여 명백해 질 것이다. 이하의 실시예들에서, PAMAM 덴드리머는 미국 특허 제4,507,466호, 동 제4,558,120호, 동 제4,568,737호 및 동 제4,587,329호에 기술되어 있는 암모니아 중심계 폴리아미도아민 덴드리머를 의미하고 ; PAMAM (EDA) 덴드리머는 에틸렌 디아민 중심계 폴리아미도아민 덴드리머를 의미하며 ; BHAlys_xlys_ylys_z 덴드리머는 미국 특허 제4,289,872호 및 동 제4,410,688호에 기술된 벤즈히드릴아민 중심 및 리신 분지 단위계 폴리리신의 비대칭 덴드리머를 의미한다. 상기 폴리아미도아민 덴드리머인 PAMAM 1.0, PAMAM 2.0, PAMAM 3.0, PAMAM 4.0, PAMAM 5.0 또는 그 이상의 세대, PAMAM 4.0(EDA) 및 폴리리신 덴드리머 BHAlyslys₂, BHAlyslys₂lys₄, BHAlyslys₂lys₄lys₈ 및 BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆, BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆lys₃₂, BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆lys₃₂lys₆₄ 또는 그 이상의 세대는 미국 특허 제4,289,872호, 동 제4,410,688호, 동 제4,507,466호, 동 제 4,558,120호, 동 제4,568,737호 및 동 제4,578,239호 및 국제 특허 공개 공보 WO 88/01178, WO 88/01179, WO 88/01180 및 WO 95/24221 에 기술된 바와 같이 제조된다.

실시예 1

수지형 중합체(dendritic polymer)와 2-아크릴아미도-2-메틸 프로판 설폰산과 반응시킴으로 인한 설폰산 말단 덴드리머의 제조

A. PAMAM 1.0

고체 탄산나트륨(0.13 g ; 1.0 mmol)을 수(3 ㎖)중 2-아크릴아미도-2-메틸 프로판 설폰산(0.41 g ; 2.0 mmol)의 교반된 용액에 천천히 첨가하였다. 기체 발생이 중단된 이후 상기 용액의 pH 는 8.0 이었다. 이후 수(1 ㎖)중 PAMAM 1.0(0.12 g ; 0.33 mmol) 용액을 상기 용액에 첨가한 후 40 % 의 수산화 벤질 트리메틸암모늄 수용액을 4 방울 적가하였다. 이후 상기 용액을 60℃, 질소하에서 3 일 동안 가열시킨후 농축시켰다. 이후 잔류물을 겔 여과법(세파덱스 G10 ; 물)으로 정제한 후 동결 건조시켜 회백색의 고체(0.51 g)인, 설폰화 PAMAM 1.0 덴드리머를 얻었다. 1H 및 ¹³C NMR 스펙트럼을 통하여 이것이 디알킬화 PAMAM 1.0 덴드리머 및 모노알킬화 PAMAM 1.0 덴드리머의 혼합물임을 알 수 있었다(약 70:30).

¹³C nmr(D₂O): δ31.0, 31.1, 37.1, 37.7, 41.3, 48.6, 51.5, 53.1, 53.4, 55.6, 56.2, 61.2, 61.5, 178.3, 179.0, 179.8.

B. PAMAM 2.0

전술된 바와 같이 PAMAM 2.0 을 2-아크릴아미도-2-메틸 프로판 설폰산과 반응시켰다. 이후 미정제 생성물을 겔 여과법(세파덱스 G10 ; 물)에 의하여 정제한 후 이를 동결 건조시켜 회백색 고체를 얻었다. ¹H 및 ¹³C NMR 스펙트럼을 통하여 이것이 디알킬화 PAMAM 2.0 덴드리머 및 모노알킬화 PAMAM 2.0 덴드리머의 혼합물임을 알 수 있었다(약 65:35).

¹³C nmr(D₂O): δ31.0, 31.1, 37.1, 37.7, 41.3, 48.7, 51.5, 53.4, 55.6, 56.2, 61.2, 61.5, 178.4, 179.0, 179.1, 179.6

수산화 벤질트리메틸암모늄을 첨가하지 않고 전술한 반응을 반복 수행하여 유사한 결과를 얻었다.

C. PAMAM 3.0 BRI2783

약간 과량의 탄산나트륨을 사용하고 수산화 벤질트리메틸암모늄을 첨가하지 않았다는 것을 제외하고 전술한 바와 동일한 방법으로 PAMAM 3.0 을 2-아크릴아미도-2-메틸 프로판 설폰산과 반응시켰다. ¹H 및 ¹³C NMR 스펙트럼을 통하여 이것이 디알킬화 PAMAM 3.0 덴드리머 및 모노알킬화 PAMAM 3.0 덴드리머의 혼합물임을 알 수 있었다(약 50:50).

¹³C nmr(D₂O): δ31.0, 31.1, 36.9, 37.4, 41.1, 48.6, 51.5, 53.4, 55.7, 56.2, 61.1, 61.5, 178.2, 178.9, 179.0, 179.8.

D. PAMAM 4.0 BRI2784

PAMAM 3.0 에 대하여 기술된 바와 같이 PAMAM 4.0 을 2-아크릴아미도-2-메틸 프로판 설폰산과 반응시켰다. ¹H 및 ¹³C NMR 스펙트럼을 통하여 이것이 디알킬화 PAMAM 4.0 및 모노알킬화 PAMAM 4.0 덴드리머의 혼합물임을 알 수 있었다(약 35:65).

¹³C nmr(D₂O): δ31.0, 31.1, 36.9, 37.3, 41.1, 48.5, 51.5, 53.5, 55.7, 56.2, 61.1, 61.5, 178.1, 178.1, 178.9, 179.0, 179.8.

실시예 2

나트륨 설포아세트아미드 말단 덴드리머의 제조

A. PAMAM 1.0

무수 DMF(1 ㎖)내 4-니트로페닐 브로모아세테이트(0.40 g ; 1.5 mmol) 용액 을 DMF(3 ㎖)내 PAMAM 1.0 (0.18 g ; 0.5 mmol)의 교반된 용액에 첨가하였다. 생성된 황색 용액을 실온에서 20 시간 동안 교반시켰으며, 이때 닌히드린 시험 결과는 음성으로 나타났다. 이후 상기 용액을 농축시켜(30℃ / 0.1 mmHg) 황색 오일을 얻었다. 상기 오일을 물과 클로로포름 사이에서 분배시키고, 여기서 수성층을 분리하여 클로로포름(2X)으로 세정하고 최종적으로 에틸 아세테이트로 세정하였다. 상기 수용액을 농축시켜(35℃ / 25 mmHg) 황색 오일인 브로모아세틸화 PAMAM 1.0 덴드리머(0.36 g ; 100 %)를 얻었다.

¹³C nmr(D₂O): δ32.8, 33.3, 43.0, 43.5, 54.4, 174.5, 176.4

수(1 ㎖)중 아황산나트륨 용액(0.2 g ; 1.6 mmol)을 전술한 바와 같은 수(5 ㎖)중 브로모아세틸화 PAMAM 1.0 덴드리머 용액(0.36 g ; 0.5 mmol)에 첨가한 후 이 용액을 11 일 동안 실온에 방치하였다. 이후 황색 용액을 농축시켜 황색 고체(0.60 g)를 얻었다.

¹³C nmr(D₂O): δ34.4, 43.1, 43.4, 54.0, 61.7, 171.3, 177.2.

첫번째 반응에서 얻어진 미정제 수성 추출물에 아황산나트륨 용액을 단순히 첨가하여, 브로모아세틸화 덴드리머를 분리시키지 않고 전술한 반응 순서를 수행될 수 있었다.

B. PAMAM 2.0

방법 Ⅰ

무수 DMF(1 ㎖)내 4-니트로페닐 브로모아세테이트 (0.18 g ; 0.7 mmol) 용액 을 DMF(3 ㎖)내 PAMAM 2.0(0.10 g ; 0.1 mmol)의 교반된 용액에 첨가하였다. 이후 생성된 황색 용액을 실온에서 20 시간 동안 교반하였으며, 이때 닌히드린 시험 결과는 음성으로 나타났다. 이후 상기 용액을 교반시키면서 물(150 ㎖)에 첨가하고 이 혼합물을 클로로포름(3X) 및 에틸 아세테이트로 추출하였다. 수(1 ㎖)중 아황산나트륨 용액(0.1 g ; 0.8 mmol)을 미정제 브로모아세틸화 덴드리머 용액에 첨가한후 이 혼합물을 3 일 동안 실온에 방치하여 두었다. 이후 상기 황색 용액을 농축시켜 황색 고체 잔류물을 얻었는데, 이를 다시 겔 여과법(세파덱스 LH20 ; 물)으로 정제한 결과 나트륨 설포아세트아미드 말단 PAMAM 2.0 덴드리머(103 ㎎)를 얻었다.

¹³C nmr(D₂O): δ33.0, 35.7, 36.0, 37.7, 40.3, 43.0, 43.2, 53.4, 53.7, 56.0, 61.6, 171.2, 174.6, 178.5.

방법 Ⅱ

고체 숙신이미딜 아세틸티오아세테이트(67 ㎎ ; 0.33 mmol)를 무수 DMF(2 ㎖)내 PAMAM 2.0 (52 ㎎ ; 0.05 mmol) 용액에 첨가한 후 생성된 용액을 실온에서 2 일 동안 교반하였다. 이후 상기 혼합물을 농축시켜(30℃/10^-3 mmHg) 오일인 잔류물을 얻었다. 상기 잔류물을 물과 클로로포름 사이에서 분배시키고, 이들 중 수층을 분리하여 농축시켜 점성 오일(117 ㎎)을 얻었다. ¹H 및 ¹³C NMR 결과를 통하여 상기 오일이 아실화 덴드리머와 N-히드록시 숙신이미드의 혼합물임을 알 수 있었다. 겔 여과법(세파덱스 G10 ; 물)에 의해서 아세틸티오아세트아미드 말단 PAMAM 2.0 덴드 리머(29 ㎎)의 순수한 시료를 얻을 수 있었다.

¹³C nmr(D₂O): δ34.0, 34.2, 37.3, 43.0, 43.1, 43.3, 53.5, 54.0, 56.3, 175.4, 177.2, 177.5.

이후 40 % 수성 포름산(7 ㎖)내 상기 관능화된 덴드리머 용액을 새로 제조된 빙냉 포름산(2 ㎖)내 퍼포름산 용액(1.6 mmol)에 첨가하였다. 이후 상기 혼합물을 0℃ 에서 1 시간 동안 교반하고 다시 실온에서 20 시간 동안 교반하였다. 이후 여기에 소량의 활성탄을 첨가하여 임의의 과량의 과산을 분해시켰으며, 상기 혼합물을 30 분 동안 교반하여 여과후 농축시켜 점성의 오일을 얻었다.

미정제 생성물을 물에 용해시키고, 수성 중탄산나트륨으로 pH 를 9.0 으로 맞추었으며 이 물질을 세파덱스 G10 컬럼을 통과시켜 탈염화시켰다. 이를 냉동 건조시킨 결과, 방법 1 에 의하여 얻어진 물질과 분광학적으로 동일한 백색 고체(20 ㎎)를 얻었다.

¹³C nmr(D₂O): δ33.0, 38.7, 42.9, 43.0, 43.1, 53.9, 54.3, 56.5, 61.6, 171.2, 176.4, 177.0.

실시예 3

나트륨 설포숙신아미드산 말단 덴드리머의 제조

A. PAMAM 1.0

고체 말레산 무수물(0.11 g ; 1.1 mmol)을 무수 DMF (3 ㎖)내 PAMAM 1.0(0.12 g ; 0.33 mmol)의 교반 용액에 첨가하였다. 이후 상기 무수물이 용해됨에 따라서 상기 혼합물은 약간 따뜻해지고 갈변하였으며 이와 같이 생성된 용액을 실온에서 밤새 동안 교반하였다. 이후 상기 용액을 농축시켜(30℃/10^-4 mmHg) 점성의 오일을 얻었다. ¹H 및 ¹³C NMR (D₂O)을 통하여 PAMAM 1.0 이 트리스아미드와 약간의 말레산으로 완전히 전환되었음을 알 수 있었다.

¹³C nmr(D₂O): δ33.1, 42.8, 43.1, 54.3, 135.0, 137.1, 169.1, 171.9, 173.3.

이후 상기 미정제 트리스아미드를 물(4 ㎖)에 용해시키고 여기에 고체 아황산나트륨(0.20 g ; 1.6 mmol)을 첨가하였다. 생성된 용액을 4 일 동안 실온에 방치시킨 후 농축시켰다. ¹H 및 ¹³C NMR (D₂O)을 통하여 위치 이성체 나트륨 설포숙신아미드산 말단 PAMAM 1.0 덴드리머와 약간의 설포숙신산의 1:1 혼합물임을 알 수 있었다. 미정제 생성물을 겔 여과법(세파덱스 G10 ; 물)으로 정제하여 나트륨 설포숙신아미드산 말단 PAMAM 1.0 덴드리머 시료(107 ㎎)를 얻었다.

¹³C nmr(D₂O): δ33.3, 39.6, 40.0, 42.9, 43.1, 54.0, 67.9, 69.4, 173.8, 176.3, 177.6, 181.8.

B. PAMAM 2.0

위치 이성체 나트륨 설포숙신아미드산 말단 PAMAM 2.0 덴드리머의 혼합물을 전술한 바와 같이 제조하였다.

¹³C nmr PAMAM 2.0 말레아민산 유도체(D₂O) : ¹³C nmr(D₂O): δ32.8, 33.0, 38.7, 42.9, 53.8, 54.3, 56.5, 135.2, 136.8, 169.2, 171.9, 173.5, 174.6.

¹³C nmr PAMAM 2.0 나트륨 설포숙신아미드산 유도체(D₂O) : 37.0, 40.1, 41.1, 43.0, 43.2, 43.9, 53.0, 53.3, 55.5, 68.0, 69.4, 173.8, 177.6, 179.1, 179.5, 179.8, 182.3

C. PAMAM 4.0 BRI6038

고체 말레산 무수물(60 ㎎ ; 0.6 mmol)을 무수 DMF(2 ㎖)내 PAMAM 4.0 (51 ㎎ ; 0.01 mmol)의 교반 용액에 첨가하였다. 상기 혼합물은 처음에는 혼탁하게 변하였으나 이를 실온에서 밤새 동안 교반하였더니 곧 맑은 용액으로 변하였다. 이후 상기 용액을 농축시켜(35℃/10^-4 mmHg) 점성 오일을 얻었다. ¹H 및 ¹³C NMR (D₂O)을 통하여 PAMAM 4.0 이 폴리아미드와 약간의 말레산으로 완전히 전환되었음을 알 수 있었다. 이후 상기 미정제 폴리아미드를 물(2 ㎖)에 용해시키고 여기에 수(2 ㎖)중 아황산나트륨(126 ㎎ ; 1.0 mmol) 용액을 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 2 일 동안 방치시킨후 이를 농축시켰다. ¹H 및 ¹³C NMR (D₂O)을 통하여 위치 이성체 나트륨 설포숙신아미드산 말단 PAMAM 4.0 덴드리머와 약간의 설포숙신산의 혼합물임을 알 수 있었다. 이후 미정제 생성물을 겔 여과법(세파덱스 LH20 ; 물)으로 정제하여 24 개의 위치 이성체 설포숙신아미드산기(90 ㎎)로 말단화된 PAMAM 4.0 시료 를 얻었다.

¹H nmr(D₂O): δ2.4-2.6; 2.7-3.1; 3.2-3.4; 3.9-4.0.

¹³C nmr(D₂O): δ36.2; 39.8; 40.5; 43.0; 43.2; 53.5; 55.8; 68.1; 69.5; 173.8; 177.4; 177.6; 178.7; 182.3.

실시예 4

나트륨 N-(2-설포에틸)숙신아미드 말단 덴드리머의 제조

a. 테트라부틸암모늄 N-(2-설포에틸)숙신아민산의 제조

고체 숙신산 무수물(0.5 g ; 5.0 mmol)을 무수 디클로로메탄(30 ㎖)내 테트라부틸암모늄 2-아미노에틸설폰산(1.83 g ; 5.0 mmol)의 교반 용액에 첨가하였다. 이후 숙신산 무수물을 서서히 용해시키고 이로부터 생성된 혼탁한 용액을 실온에서 밤새 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 여과한 후 이 여과액을 농축시켜 점성 오일(2.41 g)을 얻었다. ¹³C NMR을 통하여 이것이 목적 모노아미드와 소량의 숙신산으로 완전히 전환되었음을 알 수 있었다. 과량의 디에틸 에테르에 디클로로메탄 용액을 적가하여 상기 생성물의 침전을 반복하여 백색 고체인 테트라부틸암모늄 N-(2-설포에틸)숙신아미드산(1.762 g ; 76 %, m.p.125 ∼ 127℃)을 얻었다.

¹H nmr(CDCl₃): δ0.86(t,12H,4xCH₃), 1.28(m,8H,4xCH₂), 1.50(m,8H,4xCH ₂), 2.33(m,2H,CH₂COOH), 2.44(m,2H,CONH), 2.76(m,2H,CH₂NHCO), 3.12(m,8H,4xCH₂N), 3.50(m,2H,CH₂SO₃), 7.53(brt,1H,NH).

¹³C nmr(D₂O): δ13.5, 19.5, 23.8, 30.1, 30.9, 35.6, 50.0, 58.5, 172.0, 174.1.

b. 테트라부틸암모늄 4-니트로페닐 N-(2-설포에틸)숙시나메이트의 제조

무수 디클로로메탄(1 ㎖)내 디시클로헥실카보디이미드(45 ㎎ ; 0.22 mmol) 용액을 디클로로메탄(2 ㎖)내 테트라부틸암모늄 N-(2-설포에틸)숙신아드산 교반 용액(94 ㎎ ; 0.20 mmol)에 첨가하고, 상기 혼합물을 실온에서 밤새 동안 교반하였다. 생성된 현탁액을 여과하고 그 여과물을 농축시켜 추가의 정제 과정을 거치지 않고 사용되는 미정제 활성 에스테르를 얻었다.

A. 나트륨 N-(2-설포에틸)숙신아미드 말단 PAMAM 덴드리머의 제조

PAMAM 4.0 BRI2786

무수 DMF(1 ㎖)내 미정제 테트라부틸암모늄 4-니트로페닐 N-(2-설포에틸)숙시나메이트 용액(0.30 mmol)을 50 % 수성 DMF(3 ㎖)내에 용해시킨 PAMAM 4.0 (51.5 ㎎ ; 0.01 mmol)의 교반 용액에 첨가하고 이로부터 생성된 황색 용액을 실온에서 밤새 동안 교반하였다. 이후 상기 혼합물을 농축시키고(35℃/10^-5 mmHg) 황색 잔류물을 물과 클로로포름 사이에 분배시켰다. 이후 수층을 분리하고 이를 클로로포름(2X)과 에틸 아세테이트로 세정하였으며, 다시 농축시켜 황색 오일(134 ㎎)을 얻었다. 미정제 생성물을 앰버라이트 IR 120(Na)컬럼에 통과시켜 나트륨 염으로 전환시킨 결과, 85 ㎎ 의 물질을 얻었다. 상기 물질을 겔 여과법(세파덱스 LH20 ; 물)으로 추가로 정제하여 나트륨 N-(2-설포에틸)숙신아미드 말단 PAMAM 4.0 덴드리머(45 ㎎)를 얻었다.

¹³C nmr(D₂O): δ33.2, 33.6, 35.5, 39.0, 39.5, 42.8, 43.2, 53.8, 54.1, 54.4, 56.6, 176.5, 176.9, 177.2, 178.9, 179.4.

나트륨 N-(2-설포에틸)숙신아미드기로 말단화된 PAMAM 1.0 및 PAMAM 3.0 (BRI2785) 덴드리머를 이와 유사하게 제조하였다.

¹³C nmr PAMAM 3.0 유도체(D₂O) : δ33.4, 35.5, 39.0, 39.5, 42.9, 43.2, 53.8, 54.1, 54.3, 56.5, 176.4, 176.9, 178.9, 179.4.

¹³C nmr PAMAM 3.0 유도체(D₂O) : δ34.9, 35.3, 39.5, 42.9, 43.1, 53.7, 54.1, 179.0, 179.1, 179.3.

B. 나트륨 N-(2-설포에틸)숙신아미드 말단 폴리리신 덴드리머의 제조

BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆, BRI 2789

트리플루오로아세트산(1 ㎖)를 무수 디클로로메탄(1 ㎖)내 BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆ 현탁액(36.5 ㎎ ; 5.0 μmol)에 첨가한 후 생성된 용액을 실온 및 질소하에서 2 시간 동안 교반한 후 농축시켰다. 잔류물을 무수 DMSO (2 ㎖)에 용해시키고 트리에틸아민으로 pH 를 8.5 로 맞추었다. 이후 DMSO(1 ㎖)내 미가공 테트라부틸암모늄 4-니트로페닐 N-(2-설포에틸)숙시나메이트 (약 0.2 mmol) 용액을 적가하고 상기 혼합물을 실온에서 밤새 동안 교반하였다. 이후 황색 용액을 농축시키고(50℃/10^-5 mmHg), 황색 잔류물을 물과 클로로포름 사이에 분배시켰다. 이후 수성층을 분리하여 이를 클로로포름(3X)과 에틸 아세테이트로 세정한 후, 농축시켜 오일(99 ㎎)을 얻었다. 이후 미정제 생성물을 앰버라이트 IR 120(Na) 컬럼을 통과시켜 나트륨 염으로 전환시킨 결과 81 ㎎ 의 물질을 얻었다. 상기 물질을 겔 여과법(세파덱스 LH20 ; 물)으로 추가로 정제하여 나트륨 N-(2-설포에틸)숙신아미드 말단 BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆ 덴드리머(39 ㎎)를 얻었다.

¹³C nmr(D₂O): δ27.0, 32.3, 35.2, 35.3, 35.6, 35.7, 39.5, 43.5, 54.1, 58.5, 131.5, 132.0, 133.3, 145.1, 177.8, 178.0, 178.4, 178.8, 178.9, 179.3, 179.7, 179.8.

나트륨 N-(2-설포에틸)숙신아미드기로 말단화된 BHAlyslys₂, BHAlyslys₂lys₄(BRI2787) 및 BHAlyslys₂lys₄lys₈(BRI2788)을 이와 유사한 방법으로 제조하였다.

¹³C nmr BHAlyslys₂lys₄lys₈ 유도체(D₂O): δ26.9, 32.3, 35.1, 35.3, 35.6, 35.7, 39.5, 43.5, 54.1, 58.5, 131.6, 131.9, 132.2, 132.3, 133.2, 133.3, 145.0, 145.2, 177.2, 177.8, 177.9, 178.0, 178.2, 178.3, 178.6, 178.7, 178.8, 178.9, 179.2, 179.3, 179.7, 179.8.

¹³C nmr BHAlyslys₂lys₄ 유도체(D₂O): δ26.9, 32.3, 35.1, 35.4, 35.7, 35.8, 39.5, 43.5, 54.1, 58.5, 61.8, 131.7, 132.0, 132.2, 132.3, 133.2, 133.3, 145.0, 145.1, 177.3, 178.0, 178.3, 178.4, 178.7, 178.9, 179.0, 179.3, 179.7, 179.8.

¹³C nmr BHAlyslys₂ 유도체(D₂O): δ26.9, 27.1, 32.2, 32.3, 34.7, 34.8, 35.1, 35.3, 35.6, 35.7, 39.5, 43.4, 54.1, 58.6, 61.8, 131.7, 131.9, 132.2, 132.3, 133.3, 144.9, 145.0, 177.7, 178.4, 178.8, 179.0, 179.3, 180.0.

실시예 5

나트륨 4-설포페닐티오우레아 말단 덴드리머의 제조

A. PAMAM 4.0 BRI2791

고체 나트륨 4-설포페닐이소티오시아네이트 일수화물(500 ㎎ ; 1.96 mmol)를 수(10 ㎖)중 PAMAM 4.0(300 ㎎ ; 0.0582 mmol) 용액에 첨가한 후 이로부터 생성된 용액을 53℃, 질소하에서 2 시간 동안 가열한 후 이를 냉각시켰다. 이후 상기 용액을 농축시키고 황색 고체 잔류물을 겔 여과법(세파덱스 LH20 ; 물)으로 정제하였다. 상기 순수한 분획들을 합하고, 이를 동결 건조시켜 보풀 모양의 백색 고체인 나트륨 4-설포페닐티오우레아 말단 PAMAM 4.0 덴드리머(370㎎)를 얻었다.

¹H nmr(D₂O): δ2.28; 2.52; 2.69; 3.15; 3.27; 3.60; 7.32(d,J=9Hz); 7.72(d,J=9Hz); ¹³C nmr(D₂O): δ36.9; 41.1; 43.1; 48.3; 53.6; 55.8; 129.0; 131.1; 144.4; 178.5; 179.1; 184.4.

각각의 3, 6, 12 및 48 개의 나트륨 4-설포페닐티오우레아기로 말단화된 PAMAM 1.0, PAMAM 2.0(BRI2790), PAMAM 3.0 및 PAMAM 5.0 (BRI2991) 덴드리머를 유사한 방법으로 제조하였다.

B. PAMAM 4.0(EDA) BRI6045

고체 나트륨 4-설포페닐이소티오시아네이트 일수화물(130 ㎎ ; 0.5 mmol)를 수(4 ㎖)중 PAMAM 4.0(EDA)(69 ㎎ ; 0.01 mmol) 용액에 첨가하고, 이로부터 생성된 용액을 53℃, 질소하에서 2 시간 동안 가열한 후 이를 냉각시켰다. 이후 상기 용액을 농축시켜 고체 잔류물을 겔 여과법(세파덱스 LH20 ; 물)으로 정제하였다. 순수한 분획을 합하여 동결 건조시켜, 보풀 모양의 백색 고체인 32 개의 나트륨 4-설포페닐티오우레아기로 말단화된 PAMAM 4.0 (136 ㎎) 을 얻었다.

¹H nmr(D₂O): δ2.30; 2.50; 2.79; 3.18; 3.62; 7.35(d,J=9Hz); 7.72(d,J=9Hz); ¹³C nmr(D₂O): δ36.8; 41.0; 43.1; 48.4; 53.6; 48.4; 53.6; 55.7; 128.9; 131.0; 144.3; 178.5; 179.0; 184.5.

C. BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆ BRI2792

트리플루오로아세트산(4 ㎖)을 질소하에서, 무수 디클로로메탄(4 ㎖)내 BHAlyslys₂lys₄lys₈DBL₁₆ (0.73 g ; 0.1 mmol) 현탁액에 첨가하였다. 이후 잠깐 동안 기체가 격렬하게 발생하였으며, 이로부터 생성된 용액을 2 시간 동안 실온에서 교반시키고 다시 이를 농축시켰다. 잔류하는 시럽을 물(5 ㎖)에 용해시키고, 상기 용액을 앰버라이트 IRA-401(OH) 컬럼에 통과시킨 후 여과액을 농축시켜 점성의 오일인 BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆ (0.49 g)을 얻었다. 이후 상기 오일을 물(5 ㎖)에 재용해시키고 여기에 N,N-디메틸-N-알릴아민 완충액(pH 9.5 ; 3 ㎖)를 첨가하였다. 고체 나트륨 4-설포페닐이소티오시아네이트 일수화물(1.30 g ; 5.1 mmol)을 첨가하고, 생성된 용액을 53℃, 질소하에서 2 시간 동안 가열한 후 이를 냉각시켰다. 이후 상기 용액을 농축시키고 갈색 고체인 잔류물을 겔 여과법(세파덱스 LH20 ; 물)으로 정제하였다. 순수한 분획들을 합한 후, 이를 앰버라이트 IR 120(Na) 컬럼을 통과시킨 후 이를 동결 건조시켜 보풀 모양의 백색 고체인 나트륨 4-설포페닐티오우레아 말단 BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆ 덴드리머(374 ㎎)를 얻었다.

¹H nmr(D₂O): δ1.40; 1.72; 3.08; 3.42; 4.24; 4.60; 7.30; 7.40(d,J=9Hz); 7.78(d,J=9Hz). ¹³C nmr(D₂O): δ27.3; 32.5; 35.9; 43.7; 48.9; 58.6; 63.3; 128.8; 131.0; 143.7; 144.7; 145.1; 177.7; 178.1; 183.8; 185.2.

각각 16 개, 64 개 및 128 개의 나트륨 4-설포페닐티오우레아기로 말단화된 BHAlyslys₂lys₄lys₈, BHAlyslys₂lys₄lys₈lys ₁₆lys₃₂(BRI2992), 및 BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆lys₃₂lys₆₄( BRI2993) 덴드리머를 유사한 방법으로 제조하였다.

실시예 6

나트륨 3,6-디설포나프틸티오우레아 말단 덴드리머의 제조

A. PAMAM 4.0 BRI2923

고체 나트륨 3,6-디설포나프틸이소티오시아네이트(160 ㎎ ; 0.41 mmol)을 수(3 ㎖)중 PAMAM 4.0 용액(51 ㎎ ; 0.01 mmol) 용액에 첨가하고, 이로부터 생성된 용액을 53℃, 질소하에서 2 시간 동안 가열시킨 후 다시 냉각시켰다. 상기 용액을 농축시키고 갈색 고체 잔류물을 겔 여과법(세파덱스 LH20 ; 물)으로 정제하였다. 이후 순수한 분획들을 합하고 이를 농축시켜 갈색 고체인 나트륨 3,6-디설포나프틸티오우레아 말단 PAMAM 4.0 덴드리머(73 ㎎)를 얻었다.

¹H nmr(D₂O): δ2.30; 2.60; 2.74; 3.20; 3.57; 7.75; 7.86; 8.28. ¹³C nmr(D₂O): δ35.0; 39.9; 43.1; 48.1; 53.8; 56.1; 128.4; 128.6; 129.3; 131.0; 131.3; 136.0; 136.8; 138.2; 145.5; 146.0; 177.2; 177.8; 185.5.

나트륨 3,6-디설포나프틸티오우레아기로 말단화된 해당 PAMAM 2.0 덴드리머를 이와 유사하게 제조하였다.

B. PAMAM 4.0 (EDA) BRI6046

고체 나트륨 3,6-디설포나프틸이소티오시아네이트(220 ㎎ ; 0.57 mmol)을 수(4 ㎖)중 PAMAM 4.0 (EDA) 용액(74 ㎎ ; 0.01 mmol)에 첨가하고, 이로부터 생성 된 용액을 53℃, 질소하에서 2 시간 동안 가열한 후 다시 냉각시켰다. 이후 상기 용액을 농축시키고 겔 여과법(세파덱스 LH20 ; 물)으로 정제하여 갈색 고체 잔류물을 얻었다. 순수한 분획들을 합한 후 농축시켜 황갈색 고체인 32 개의 나트륨 3,6-디설포나프틸티오우레아기로 말단화된 PAMAM 4.0 (148 ㎎)을 얻었다.

¹H nmr(D₂O): δ2.30; 2.80; 3.20; 3.54; 7.75; 7.85; 8.25. ¹³C nmr(D ₂O): δ36.0; 40.8; 43.1; 48.3; 53.6; 55.9; 128.5; 129.4; 131.0; 136.0; 136.8; 138.3; 145.5; 146.0; 178.2; 185.6.

C. BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆ BRI2999

트리플루오로아세트산(2 ㎖)을 질소하에서 무수 디클로로메탄 (2 ㎖)내 BHAlyslys₂lys₄lys₈DBL₁₆ 현탁액(73 ㎎ ; 0.01 mmol)에 첨가하였다. 잠시 동안 기체가 격렬하게 발생하였으며, 이때 생성된 용액을 실온에서 2 시간 동안 교반한 후 다시 농축시켰다. 이후 잔류하는 시럽을 물(5 ㎖)에 용해시키고, 이 용액을 앰버라이트 IRA-401(OH) 컬럼에 통과시켜 여과물을 농축한 결과, 점성 오일인 BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆ 을 얻었다. 이후 상기 오일을 물(5 ㎖)에 재용해시키고 여기에 N,N-디메틸-N-알릴아민 완충액(pH 9.5 ; 3 ㎖)을 첨가하였다. 이후 고체 나트륨 3,6-디설포나프틸이소티오시아네이트(234 ㎎ ; 0.60 mmol)을 첨가하고 이로부터 생성된 용액을 53℃, 질소하에서 2 시간 동안 가열한 후 냉각시켰다. 이후 상기 용액을 농축시켜 겔 여과법(세파덱스 LH20 ; 물)으로 정제한 결과 갈색 고체 잔류물 을 얻었다. 순수한 분획들을 합한 후, 앰버라이트 IR 120(Na)로 통과시키고 이를 동결 건조시켜 보풀 모양의 회백색 고체인, 32 개의 나트륨 3,6-디설포나프틸티오우레아기로 말단화된 BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆ 을 얻었다.

¹H nmr(D₂O): δ1.0-2.0; 3.18; 3.43; 4.31; 7.22; 7.80; 7.89; 8.25; ¹³C nmr(D₂O): δ27.2; 32.4; 35.3; 43.7; 49.0; 58.5; 63.6; 128.4; 129.1; 131.4; 136.1; 136.6L 138.6; 139.0; 145.1; 145.6; 178.4; 184.8; 186.7.

실시예 7

나트륨 4-설포나프틸티오우레아 말단 덴드리머의 제조

PAMAM 4.0 BRI2997

고체 나트륨 4-설포나프틸이소티오시아네이트(180 ㎎ ; 0.5 mmol)를 수(5 ㎖)중 PAMAM 4.0(51 ㎎ ; 0.01 mmol) 용액에 첨가하고 상기 혼합물을 53℃, 질소 하에서 2 시간 동안 가열후 냉각시켰다. 이후 감압하에서 상기 생성된 현탁액으로부터 물을 증류하고 겔 여과법(세파덱스 LH20 ; 물)으로 회백색 고체 잔류물을 정제하였다. 순수한 분획들을 합한 후 동결 건조시켜 보풀 모양의 백색 고체인 나트륨 4-설포나프틸티오우레아 말단 PAMAM 4.0 덴드리머(60 ㎎)을 얻었다.

¹H nmr(D₂O): δ2.20; 2.60; 3.14; 3.48; 7.23; 7.47; 7.56; 7.77; 7.93(d,J=6Hz); 8.56(d,J=6Hz). ¹³C nmr(D₂O): δ35.8; 40.5; 43.1; 48.4; 53.6; 55.9; 127.6; 128.6; 130.3; 131.9; 132.5; 134.7; 140.5; 142.7; 177.8; 178.0; 185.4.

실시예 8

나트륨 3,5-디설포페닐티오우레아 말단 덴드리머의 제조

PAMAM 4.0 BRI6039

고체 나트륨 3,5-디설포페닐이소티오시아네이트(110 ㎎ ; 0.32 mmol)를 수(3 ㎖)중 PAMAM 4.0 용액(63 ㎎ ; 0.012 mmol) 용액에 첨가하고 이로부터 생성된 용액을 53℃, 질소하에서 2 시간 동안 가열시킨 후 이를 냉각시켰다. 이후 상기 용액을 농축시키고 겔 여과법(세파덱스 G25 ; 물)으로 갈색 고체 잔류물을 정제하였다. 이후 순수한 분획들을 합하여 농축시킨 결과, 회백색 고체인 24 개의 나트륨 3,5-디설포페닐티오우레아기로 말단화된 PAMAM 4.0(110 ㎎)을 얻었다.

¹H nmr(D₂O): δ2.53; 3.08; 3.36; 3.66; 7.90; 7.95 ¹³C nmr(D₂O): δ34.8; 41.0; 43.1; 48.0; 43.1; 53.7; 56.2; 124.1; 128.6; 143.5; 148.8; 177.6; 185.0.

실시예 9

나트륨 3,6,8-트리설포나프틸티오우레아 말단 덴드리머의 제조

PAMAM 4.0 BRI2998

고체 나트륨 3,6,8-트리설포나프틸이소티오시아네이트(250 ㎎ ; 0.5 mmol)을 수(2 ㎖)중 PAMAM 4.0 (51 ㎎ ; 0.01 mmol) 및 N,N-디메틸-N-알릴아민 완충액(pH 9.5 ; 1 ㎖)의 용액에 첨가한 후 상기 혼합물을 53℃, 질소하에서 2 시간 동안 가 열한 후 이를 냉각시켰다. 이후 감압하에서 상기 혼합물을 농축시켜 오렌지색 고체를 얻었다. 잔류 고체를 물(2 ㎖)에 용해시키고 이를 앰버라이트 IR 120(Na)의 단컬럼에 통과시켰다. 이후 여과물을 농축시키고 잔류물을 겔 여과법(세파덱스 LH20 ; 물)으로 분리하였다. 순수한 분획들을 합한 후 이를 동결 건조시켜 회백색 고체인 나트륨 3,6,8-트리설포나프틸티오우레아 말단의 PAMAM 4.0 덴드리머(102 ㎎)를 얻었다.

¹H nmr(D₂O): δ2.65; 3.02; 3.30; 3.66; 8.05; 8.42; 8.59; 8.67. ¹³C nmr(D₂O): δ33.2; 38.7; 43.2; 43.7; 47.8; 54.0; 54.3; 56.7; 131.0; 131.3; 131.9; 135.9; 138.0; 139.6; 143.8; 144.1; 145.6; 176.2; 176.5; 186.0.

해당 나트륨 3,6,8-트리설포나프틸티오우레아 말단의 덴드리머인 BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆ BRI7011 을 이와 유사하게 제조하였다.

실시예 10

나트륨 4-(설포메틸)벤즈아미드 말단 덴드리머의 제조

PAMAM 4.0 BRI6040

고체 4-니트로페닐 4-(클로로메틸)벤조에이트(200 ㎎ ; 0.68 mmol)을 무수 DMSO(4 ㎖)내 PAMAM 4.0 의 교반 용액 (70 ㎎ ; 0.014 mmol)에 첨가하고 이로부터 생성된 황색 용액을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 이후 상기 용액을 농축시키고(10^-4 mmHg ; 40℃) 잔류물을 물과 디클로로메탄의 혼합물(1:1)로 추출하였다. 남 아 있는 고체 물질을 DMSO(5 ㎖)내에 용해시키고 수(3 ㎖)중 아황산나트륨 용액(130 ㎎ ; 1 mmol)을 첨가하였다. 이로부터 생성된 약간 혼탁해진 혼합물을 4 일 동안 방치시키고, 이후 여기에 추가의 물(2 ㎖)을 첨가한 결과 맑은 균질의 황색 용액이 형성되었다. 이후 상기 용액을, 처음에는 25 mmHg, 40℃ 에서, 그 다음에는 10^-4 mmHg, 50℃ 에서 농축시켜 미정제 생성물을 얻었다. 이후 상기 미정제 생성물을 겔 여과법(세파덱스 G25 ; 물)으로 정제하여 24 개의 나트륨 4-(설포메틸)벤즈아미드기로 말단화된 PAMAM 4.0 (24 ㎎)을 얻었다.

¹H nmr(D₂O): δ2.25; 2.66; 3.08; 3.20; 3.33; 3.38; 4.01; 7.40;(brd); 7.62(brd). ¹³C nmr(D₂O): δ36.7; 40.9; 43.0; 43.6; 53.5; 55.5; 61.0; 131.6; 135.0; 137.2; 140.4; 174.5; 178.6; 179.2.

실시예 11

4-설포벤즈아미드 말단 덴드리머의 제조

PAMAM 4.0 (EDA) BRI6116

고체 칼륨 N-히드록시숙신이미딜 4-설포벤조에이트 (100 ㎎ ; 0.3 mmol) 를 pH 8.5 인 0.1 M 의 보레이트 완충액 (5 ㎖)내 PAMAM 4.0 (EDA) 용액(35 ㎎ ; 0.005 mmol)에 첨가한 후 상기 용액을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 상기 단계에서 pH 4.5 인 유백색 용액이 생성되었다. 이후 1M 의 탄산나트륨 용액(1 ㎖)을 첨가하여 맑은 용액을 얻었으며, 이를 농축시킨 결과 백색 고체인 미정제 생성물을 얻었다. 상기 미정제 생성물을 겔 여과법(세파덱스 G25 ; 물)으로 정제하여 32 개의 나트륨 4-설포벤즈아미드기로 말단화된 PAMAM 4.0 (EDA)(47 ㎎) 을 얻었다.

¹H nmr(D₂O): δ 2.25; 2.42; 2.63; 3.05; 3.18; 3.31; 3.38; 7.72(d,H=8Hz); 7.78(d,J=8Hz). ¹³C nmr(D₂O): δ36.0; 40.4; 43.0; 43.7; 53.7; 55.8; 130.2; 132.2; 140.4; 150.1; 173.6; 178.0; 178.5.

실시예 12

나트륨 N-(4-설포페닐)프로판아미드 말단 덴드리머의 제조

PAMAM 4.0 (EDA) BRI6117

수(4 ㎖)중 PAMAM 4.0 (EDA) 의 교반 용액(78 ㎎ ; 0.011 mmol) 에 고체 나트륨 N-(4-설포페닐)아크릴아미드 (250 ㎎ ; 1 mmol) 및 고체 탄산나트륨 (106 ㎎ ; 1 mmol) 을 연속적으로 첨가하였다. 이로부터 생성된 용액을 질소하에서 4 일 동안 교반한 후 이를 동결 건조시켜 보풀 모양의 백색 고체를 얻었다. 상기 미정제 생성물을 겔 여과법(세파덱스 LH20 ; 물)으로 정제하여 64 개의 나트륨 N-(4-설포페닐)프로판아미드기로 말단화된 PAMAM 4.0 (EDA)(206 ㎎)을 얻었다. ¹³C NMR 을 통하여 상기와 같이 얻어진 생성물은 미량의 모노 알킬화 말단 아미노기를 보유하는 것을 확인할 수 있었다.

¹H nmr(D₂O): δ2.10; 2.48; 2.58; 2.79; 3.20; 7.42(d,J=7Hz); 7.65(d,J=7Hz).

¹³C nmr(D₂O): δ36.5; 37.9; 41.1; 53.4; 55.6; 124.8; 130.9; 143.0; 144.2; 177.4; 178.5.

실시예 13

나트륨 4-설포페닐우레아 말단의 덴드리머의 제조

PAMAM 4.0 (EDA) BRI6115

무수 DMSO (4 ㎖) 내 N,N'-디숙신이미딜 탄산염 용액(530 ㎎ ; 2 mmol)에 무수 DMSO (3 ㎖) 내 나트륨 설파닐산 용액(195 ㎎ ; 1 mmol)을 적가하고 이로부터 생성된 갈색 용액을 실온에서 20 시간 동안 교반하였다. 무수 DMSO (1 ㎖) 내 PAMAM 4.0 (EDA) 용액 (75 ㎎ ; 0.011 mmol) 을 첨가한 후 이 용액을 추가로 18 시간 동안 교반하였다. 이후 상기 용액을 고진공(10^-5 mmHg ; 35℃)하에서 농축시켜 황색의 반고체 물질을 얻었다. 상기 미정제 생성물을 DMSO (4 ㎖)에 용해시키고 이 용액을 200 ㎖ 의 잘 교반된 에틸 아세테이트에 첨가하였다. 이후 침전된 백색 고체를 여과법으로 수집하고 에틸 아세테이트(2X)와 에테르(2X)로 세정한 후, 이를 건조시켜 백색 분말(275 ㎎)을 얻었다. 상기 물질을 겔 여과법(세파덱스 LH20 ; 물)으로 추가로 정제하여 32 개의 나트륨 4-설포페닐우레아기로 말단화된 PAMAM 4.0 (EDA) 를 얻었다.

¹H nmr(D₂O): δ2.31; 2.55; 2.75; 3.19; 7.32(d,J=9Hz); 7.63(d,J=9Hz). ¹³C nmr(D₂O): δ36.3; 40.7; 43.3; 43.8; 53.7; 55.7; 123.3; 130.9; 140.9; 146.0; 161.4; 178.2; 178.6.

실시예 14

염화 N,N,N-트리메틸글리신아미드 말단 덴드리머의 제조

BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆ BRI2922

무수 디클로로메탄(2 ㎖)내 BHAlyslys₂lys₄lysDBL₁₆ 의 현탁액 (220 ㎎ ; 30μmol)에 트리플루오로아세트산(4 ㎖)을 첨가한 후 이로부터 생성된 용액을 실온 및 질소하에서 2 시간 동안 교반하여 농축시켰다. 이후 상기 잔류물을 무수 DMSO (5 ㎖) 내에 용해시키고 여기에 트리에틸아민을 첨가하여 pH 를 8.5 로 맞추었다. 이후 고체 염화 4-니트로페닐 N,N,N-트리메틸글리시네이트 (0.50 g ; 1.8 mmol) 를 첨가한 후 상기 혼합물을 실온에서 밤새 동안 교반하였다. 그 다음, 상기 혼탁해진 용액을 농축(50℃/10^-5 mmHg)시켜 잔류물을 물과 디클로로메탄 사이에 분획화시켰다. 이후 상기 수성층을 분리하여, 디클로로메탄(3X)과 에틸 아세테이트로 세정한 후, 다시 농축시켜 오일(1.128 g)을 얻었다. 상기 미정제 생성물을 겔 여과법(세파덱스 LH20 ; 물)으로 정제하여 N,N,N-트리메틸글리신아미드 말단의 BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆ 덴드리머(116 ㎎)를 얻었다.

¹³C nmr(D₂O): δ25.5, 30.5, 30.8, 33.4, 42.1, 56.5, 57.1, 67.5, 68.1, 166.7, 167.1, 176.0, 176.2.

실시예 15

4-트리메틸암모늄벤즈아미드 말단 덴드리머의 제조

PAMAM 4.0 BRI6043

무수 DMF (4 ㎖)내 4-트리메틸암모늄벤조산 요오드화물 용액 (154 ㎎ ; 0.5 mmol) 에 1,1'-카보닐디이미다졸 (85 ㎎ ; 0.52 mmol)을 첨가하고 상기 혼합물을 실온 및 아르곤하에서 2 시간 동안 교반하였다. 이때 상기 용액으로부터 백색 고체가 분리되었다. 이후 무수 DMF (2 ㎖) 내 PAMAM 4.0 용액(58 ㎎ ; 0.011 mmol)을 첨가한 후 이 혼합물을 실온에서 밤새 동안 교반하였다. 이후 상기 침전물은 거의 모두 용해되었으며 이 용액으로 닌히드린 시험을 수행한 결과 음성 반응을 나타냈다. 상기 혼합물을 농축(10^-4 mmHg ; 30℃)시켜 백색 고체 잔류물을 얻었다. 미정제 생성물을 겔 여과법(세파덱스 LH20 ; 10 % AcOH)으로 정제하여 아세트산 염인 24 개의 4-트리메틸암모늄벤즈아미드기로 말단화된 PAMAM 4.0 (89 ㎎) 을 얻었다.

¹H nmr(D₂O): δ1.96; 1.65-2.85; 3.25-3.55; 3.64; 7.92. ¹³C nmr(D₂O): δ25.8; 33.1; 33.5; 38.7; 43.1; 43.5; 53.5; 54.1; 56.4; 61.2; 124.8; 133.6; 139.9; 153.2; 173.2; 176.3; 176.8; 182.6.

6 개의 4-트리메틸암모늄 벤즈아미드기로 말단화된 PAMAM 2.0 덴드리머를 상기 방법과 유사하게 제조하였다.

실시예 16

4-(트리메틸암모늄메틸)벤즈아미드 말단 덴드리머의 제조

PAMAM 4.0 BRI6044

고체 4-니트로페닐 4-(클로로메틸)벤조에이트(150 mg; 0.5 mmol)를 무수 DMSO(3 ml)내 PAMAM 4.0(52 mg; 0.01 mmol) 교반 용액에 첨가하였다. 이로부터 생성된 황색 용액을 실온에서 20 시간 동안 교반하였으며, 이때 닌히드린 시험 결과는 음성이었다(pH 약 8.5). 이후, 이 용액을 농축시키고(10^-5 mmHg; 40℃), 잔류물을 물과 디클로로메탄(1:1)의 혼합물과 함께 진탕시켰다. 불용성 겔형 물질을 여과법으로 수집하여 물(2X)과 디클로로메탄(2X)으로 세정한 후, 공기 중에서 건조시켰다. 미정제 4-(클로로메틸)-벤즈아미드 말단 덴드리머를 25 % 의 수성 트리메틸아민(20 ml)에 용해시키고, 이 황색 용액을 밤새동안 방치하였다. 그 후, 이 용액을 농축시키고, 잔류물을 물(5 ml)에 용해시킨 다음, 이 용액을 앰버라이트 IRA-401(OH) 컬럼에 통과시켰다. 무색의 여과물을 농축시켜서 점성을 오일을 얻었으며, 이를 겔 여과법(세파덱스 G10; 10% AcOH)으로 정제하여 24개의 4-(트리메틸암모늄메틸)벤즈아미드기로 말단화된 PAMAM 4.0을 얻었다(90 mg). ¹H nmr(D₂O): δ1.88; 2.65-2.80; 2.98; 3.10-3.60; 7.52(br d, J=9Hz); 7.72(br d, J=9Hz). ¹³C nmr(D₂O): δ26.6; 33.4; 38.8; 43.2; 43.5; 53.6; 53.6; 54.1; 56.8; 62.8; 73.0; 132.1; 135.3; 137.5; 140.0; 176.4; 176.9; 183.6

실시예 17

N-(2-아세톡시에틸)-N,N-(디메틸암모늄)메틸-카복스아미드 말단 덴드리머의 제조

PAMAM 4.0

고체 1,1'-카보닐디이미다졸(85 mg; 0.52 mmol)을 무수 DMF(3 ml)내 브롬화 N-(2-아세톡시에틸)-N-(카복시메틸)-N,N-디메틸암모늄(135 mg; 0.5 mmol) 용액에 첨가하고, 이로부터 생성된 용액을 질소하에서 2 시간 동안 교반하였다. 이후 여기에 DMF(2 ml)내 PAMAM 4.0(60 mg; 0.012 mmol) 용액을 첨가하자, 그 즉시 천천히 재용해되는 응집제 침전물이 형성되었다. 이 혼합물을 2일 동안 교반한 다음, 농축시켜(10^-4 mmHg; 40℃) 점성의 오일을 얻었다. 미정제 생성물을 겔 여과법(세파덱스 G10; 10% AcOH)으로 정제하여 24개의 N-(2-아세톡시에틸)-N,N-(디메틸암모늄)메틸카복스아미드기로 말단화된 PAMAM 4.0을 얻었다(64 mg). ¹H nmr(D₂O): δ1.93; 2.05; 2.70; 3.10-3.60; 3.28; 3.93(m); 4.14; 4.48(m). ¹³C nmr(D₂O): δ24.6; 26.2; 33.2; 38.7; 42.8; 42.9; 53.9; 57.4; 62.6; 67.3; 67.5; 168.9; 176.4; 176.8; 177.3; 183.2.

실시예 18

구아니디노 말단 덴드리머의 제조

PAMAM 4.0 BRI6042

수(5 ml)중 PAMAM 4.0(63 mg; 0.012 mmol) 및 황산 메틸티오슈도우레아 (170 mg; 0.61 mmol) 용액(pH 10.5)을 80℃ 및 질소하에서 2 시간 동안 가열하였다. 그 후, 이 용액을 농축시키고, 잔류물을 겔 여과법(세파덱스 G10; 10% AcOH)으로 정제 하여 아세테이트염 형태인 24개의 구아니디노기로 말단화된 PAMAM 4.0을 얻었다(107 mg). ¹H nmr(D₂O): δ2.00; 2.80(br t); 3.09(br t); 3.32; 3.45(br t); 3.60(br t). ¹³C nmr(D₂O): δ25.2; 33.2; 33.4; 38.7; 41.2; 42.6; 43.4; 44.7; 53.5; 54.0; 56.3; 176.5; 176.7; 176.9; 181.6.

이와 유사한 방법으로 대응하는 6개의 구아니디노기 말단을 지닌 PAMAM 2.0 덴드리머를 제조하였다.

실시예 19

4-([1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸]메틸)벤즈아미드 말단 덴드리머의 제조

PAMAM 4.0 BRI6041

pH 7의 포스페이트 완충액(10 ml)내 1-(4-카복시페닐)메틸-1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸 테트라 하이드로클로라이드(120 mg; 0.25 mmol), N-히드록시숙신이미드(60 mg; 0.52 mmol) 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드(250 mg; 1.3 mmol) 용액을 실온에서 1 시간 동안 방치한 다음, 여기에 pH 7의 포스페이트 완충액(10 ml)내 PAMAM 4.0(32 mg; 0.006 mmol) 용액을 첨가하였다. 이 혼합물을 2일 동안 방치한 다음 농축시켰다. 잔류물을 겔 여과법(세파덱스 LH20; 10% AcOH)으로 정제하여 ¹H 및 ¹³C nmr을 통해 측정하였을 때 약 12개의 4-([1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸]메틸)-벤즈아미드기 말단을 지닌 것으로 파악되는 PAMAM 4.0을 얻었다(80 mg). 그 후, 이 생성물을 물에 용해시켜서 앰버라이트 IRA-401(Cl) 수지 컬럼을 통과시킨 다음 농축시켰다. 잔류물을 물(1 ml)에 용해시키고, 농축 HCl(1 ml)을 첨가한 다음, 이 용액을 에탄올(30 ml)로 희석시켜서 백색의 고체를 침전시켰다. 이 고체를 여과법으로 수집하였다(68 mg). 또 다시 ¹H 및 ¹³C nmr을 통해 말단 아미노기의 약 50 % 가 관능화되었음을 확인하였다. ¹H nmr(D₂O): δ2.17; 2.36; 2.50; 2.78; 2.85; 3.25; 3.40; 3.50; 3.60; 3.62; 4.49; 7.63(br d); 7.78(br d). ¹³C nmr(D₂O): δ22.7; 23.1; 33.2; 38.8; 39.9; 40.2; 40.3; 41.0; 41.2; 42.0; 42.9; 43.2; 43.6; 45.5; 46.1; 49.1; 52.2; 53.9; 54.3; 56.6; 62.7; 132.5; 135.7; 137.1; 139.7; 174.3; 176.2; 176.3; 176.7; 177.0; 178.2; 178.5.

실시예 20

4-카복시-3-히드록시벤질아민 말단 덴드리머의 제조

PAMAM 4.0(EDA) BRI6119

수소화 시아노붕소 나트륨(32 mg; 0.5 mmol)를 수(4 ml)중 PAMAM 4.0(EDA)(69 mg; 0.01 mmol), 4-포르밀-2-히드록시벤조산(83 mg; 0.5 mmol) 및 탄산 수소 나트륨(42 mg; 0.5 mmol)의 혼합물에 첨가하였다. 비균질 오렌지색 혼합물을 실온에서 4 시간 동안 교반하였는데, 이때 상기 혼합물이 균질화되었다. 이후, 상기 오렌지색 용액을 농축시키고, 잔류물을 겔 여과법(세파덱스 LH20; 물)으로 정 제하여 약 32개의 4-카복시-3-히드록시벤질아민기로 말단화된 PAMAM 4.0(EDA)를 얻었다(91 mg). ¹H 및 ¹³C nmr(D₂O)을 통하여 말단 아미노기가 몇개의 디알킬화를 제외하면 대부분이 모노 알킬화되었음을 알 수 있었고, 두 스펙트럼 모두 광폭 피크를 나타내었다. ¹³C nmr(D₂O): δ37.0; 41.1; 50.9; 53.4; 55.5; 55.8; 61.5; 120.9; 122.2; 122.4; 132.3; 132.7; 135.0; 135.8; 163.5; 163.7; 169.0; 178.6; 179.3. ¹H nmr(D₂O): δ2.20; 2.35; 2.60; 3.15; 3.30; 3.35; 4.25; 6.68; 7.12; 7.55.

실시예 21

4-카복시페닐아미드 말단 덴드리머의 제조

PAMAM 4.0(EDA)

고체 4-카복시페닐이소티오시아네이트(8.6 mg; 0.48 mmol)를 수(20 ml)중 PAMAM 4.0(EDA)(69 mg, 0.01 mmol) 용액에 첨가하였다. 이렇게 얻은 혼탁 용액의 pH를 포화 NaHCO3 용액을 사용하여 9 로 조정하고, 이를 실온에서 24 시간 동안 방치하였다. 그 후, 상기 반응 혼합물을 여과하고, 여과물을 농축시켜서 백색의 고체 잔류물을 얻었으며, 이를 겔 여과법(세파덱스 LH20; 물)으로 정제한 다음, 동결 건조시켜서 백색의 보풀 모양의 고체 생성물을 얻었다(68 mg).

실시예 22

3,5-디카복시페닐아미드 말단 덴드리머의 제조

PAMAM 4.0(EDA)

고체 3,5-디카복시페닐이소티오시아네이트(112 mg; 0.5 mmol)를 수(5 ml)중 PAMAM 4.0(EDA)(70 mg; 0.01 mmol) 용액에 첨가하였다. 이렇게 얻은 혼탁 용액의 pH를 1 M Na2CO3 용액을 사용하여 10 으로 맞추고, 이를 53℃ 및 질소하에서 2 시간 동안 가열하였다. 그 후, 이 반응 혼합물을 여과하고, 여과물을 농축시켜서 갈색의 고체 잔류물을 얻었으며, 이를 겔 여과법(세파덱스 LH20; 물)으로 정제한 다음, 동결 건조시켜서 연갈색 고체 형태로 생성물을 얻었다(112 mg).

실시예 23

나트륨 4-포스포노옥시페닐티오우레아 말단 덴드리머의 제조

PAMAM 4.0(EDA)

고체 나트륨 4-포스포노옥시페닐이소티오시아네이트(251 mg)를 수(20 ml)중 PAMAM 4.0(EDA)(69 mg; 0.01 mmol) 용액에 첨가하였다. 이렇게 얻은 용액(pH 9)을 질소하의 실온에서 24 시간 동안 교반하였다. 이후, 상기 반응 혼합물을 농축시켜서 백색의 고체 잔류물을 얻었으며, 이를 겔 여과법(세파덱스 LH20; 물)으로 정제한 다음, 동결 건조시켜서 백색의 보풀 모양의 고체 생성물을 얻었다(86 mg).

실시예 24

나트륨 4-(포스포노메틸)페닐티오우레아 말단 덴드리머의 제조

PAMAM 4.0(EDA)

고체 나트륨 4-(포스포노메틸)페닐이소티오시아네이트(97 mg)를 수(30 ml)중 PAMAM 4.0(EDA)(69 mg; 0.01 mmol) 용액에 첨가하였다. 이렇게 얻은 용액에 포화 NaHCO3 용액을 주기적으로 첨가하여 pH 를 8로 유지하면서 질소하의 실온에서 3일 동안 교반하였다. 그 후, 이 반응 혼합물을 농축시켜서 백색의 고체 잔류물을 얻었으며, 이를 겔 여과법(세파덱스 LH20; 물)으로 정제한 다음, 동결 건조시켜서 백색의 보풀 모양의 고체 생성물을 얻었다(102 mg).

실시예 25

나트륨 에틸 4-(포스포노메틸)페닐티오우레아 말단 덴드리머의 제조

PAMAM 4.0(EDA)

고체 나트륨 에틸 4-(포스포노메틸)페닐이소티오시아네이트(109 mg)를 DMF(30 ml)내 PAMAM 4.0(EDA)(69 mg; 0.01 mmol) 용액에 첨가하였다. 이렇게 얻은 용액에 포화 NaHCO3 용액을 주기적으로 첨가하여 pH 를 8 로 유지하면서 질소하의 실온에서 17 시간 동안 교반하였다. 그 후, 이 반응 혼합물을 농축시켜서 백색의 고체 잔류물을 얻었으며, 이를 겔 여과법(세파덱스 LH20; 물)으로 정제한 다음, 동결 건조시켜서 백색의 보풀 모양의 고체 생성물을 얻었다(30 mg).

실시예 26

Cn-알킬 결합 2-티오시알로시드 말단 덴드리머의 제조

메틸[(8-옥탄산 N-히드록시숙신이미드 에스테르)5-아세트아미도-4,7,8,9-테트라-O-아세틸-3,5-디데옥시-2-티오-D-글리세로-α-D-갈락토-2-노눌로피라노시드]오네이트를 이하의 방법에 따라 제조하였다.

무수 디메틸포름아미드(1 ml)내 메틸 5-아세트아미도-4,7,8,9-테트라-O-아세틸-2-S-아세틸-3,5-디데옥시-2-티오-D-글리세로-α-D-갈락토-2-노눌로피라노소네이트(Hasegawa 등, 1986)(100 mg) 용액에 8-브로모옥탄산(41 mg) 및 디에틸아민(280 mg)을 첨가하고, 이 용액을 20℃에서 17 시간 동안 교반하였다. 진공하에서 용매를 제거하고, 잔류물을 에틸 아세테이트와 5% 빙냉 염산 사이에 분획화 시켰다. 유기층을 물로 세정하고, 황산나트륨으로 건조시킨 다음, 증발시켜서 잔류물(130 mg)을 얻었다. 이것을 에틸 아세테이트(5 ml)에 용해시키고, N-히드록시숙신이미드(26 mg) 및 디시클로헥실카보디이미드(46 mg)를 첨가하였다. 이 혼합물을 20℃에서 17 시간 동안 교반한 다음, 백색의 침전물을 여과하였다. 이 침전물을 농축시키고, 실리카 겔 상에서 에틸 아세테이트를 용리시키면서 플래쉬 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 생성물을 포함하는 분획을 합하여 증발시켜서 백색의 거품을 얻었다(97 mg, 71%).

이와 유사한 방법으로 이하의 화합물을 제조하였다:

메틸[(11-운데카논산 N-히드록시숙신이미드 에스테르)5-아세트아미도-4,7,8,9-테트라-O-아세틸-3,5-디데옥시-2-티오-D-글리세로-α-D-갈락토-2-노눌로피라노시드]오네이트.

메틸[(아세트산 N-히드록시숙신이미드 에스테르)5-아세트아미도-4,7,8,9-테트라-O-아세틸-3,5-디데옥시-2-티오-D-글리세로-α-D-갈락토-2-노눌로피라노시드]오네이트.

메틸[(4-부타논산 N-히드록시숙신이미드 에스테르)5-아세트아미도-4,7,8,9-테트라-O-아세틸-3,5-디데옥시-2-티오-D-글리세로-α-D-갈락토-2-노눌로피라노시드]오네이트.

메틸[(4-메틸벤조산 N-히드록시숙신이미드 에스테르)5-아세트아미도- 4,7,8,9-테트라-O-아세틸-3,5-디데옥시-2-티오-D-글리세로-α-D-갈락토-2-노눌로피라노시드]오네이트.

A. PAMAM[EDA]4.0[(8-옥탄아미도)-5-아세트아미도-3,5-디데옥시-2-티오-D-글리세로-α-D-갈락토-2-노눌로피라노시돈산]₃₂ BRI 6112

불활성 대기하에서 무수 디메틸설폭시드(4 ml)내 PAMAM[EDA]4.0(50 mg) 용액에 메틸[(8-옥타논산 N-히드록시숙신이미드 에스테르)5-아세트아미도-4,7,8,9-테트라-O-아세틸-3,5-디데옥시-2-티오-D-글리세로-α-D-갈락토-2-노눌로피라노시드]오네이트(300 mg)를 첨가한 다음, 이 용액을 20℃에서 60 시간 동안 교반하였다. 진공하에서 용매를 제거하고, 잔류물을 메탄올(2 ml)에 용해시켰다. 이 용액을 세파덱스 LH20 상에서 메탄올을 용리시키는 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)를 수행하였다. 용매를 증발시킨 후, 생성물인 PAMAM[EDA]4.0[메틸[(8-옥탄아미도)-5-아세트아미도-4,7,8,9-테트라-O-아세틸-3,5-디데옥시-2-티오-D-글리세로-α-D-갈락토-2-노눌로피라노시드]오네이트]32를 백색의 분말 형태로 얻었다(182 mg, 93%).

이것을 이하의 방법을 통해 유리 시알로시드로 전환시켰다.

20℃, 아르곤하에서 무수 메탄올(3 ml)내 PAMAM[EDA]4.0[메틸[(8-옥탄아미도)-5-아세트아미도-4,7,8,9-테트라-O-아세틸-3,5-디데옥시-2-티오-D-글리세로-α-D-갈락토-2-노눌로피라노시드]오네이트]32(182 mg) 용액에 새로 제조된 메탄올(7 ml)내 0.19 M 나트륨 메톡시드 용액을 첨가한 다음, 이 혼합물을 2 시간 30 분 동안 교반하였다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 물(10 ml)에 용해시킨 다음, 3 시간 동안 교반하였다. 이 용액을 세파덱스 LH20 상에서 물로 용리시키면서 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다. 이후 이를 동결 건조시키고, 생성물인 PAMAM[EDA]4.0[(8-옥탄아미도)-5-아세트아미도-3,5-디데옥시-2-티오-D-글리세로-α-D-갈락토-2-노눌로피라노시돈산]32를 연한 레몬색 분말 형태로 얻었다(110 mg, 77%).

이와 유사한 절차에 따라 하기 화합물을 제조하였다:

PAMAM[EDA]4.0[(11-운데칸아미도)-5-아세트아미도-3,5-디데옥시-2-티오-D-글리세로-α-D-갈락토-2-노눌로피라노시돈산]₃₂ BRI 6147

PAMAM[EDA]4.0[(아세트아미도)-5-아세트아미도-3,5-디데옥시-2-티오-D-글리세로-α-D-갈락토-2-노눌로피라노시돈산]₃₂ BRI 6121

PAMAM[EDA]4.0[(4-메틸벤즈아미도)-5-아세트아미도-3,5-디데옥시-2-티오-D-글리세로-α-D-갈락토-2-노눌로피라노시돈산]₃₂ BRI 6120

BHA lyslys₂lys₄lys₈lys₁₆[(8-옥탄아미도)-5-아세트아미도-3,5-디데옥시-2-티오-D-글리세로-α-D-갈락토-2-노눌로피라노시돈산]₃₂ BRI 6169

트리플루오로아세트산(2 ml) 및 디클로로메탄(2 ml)의 혼합물내 BHA lyslys₂lys₄lys₈lys₁₆(t-Boc)₃₂(20.3 mg) 용액을 20℃에서 2 시간 동안 교반한 다음, 진공하에서 용매를 제거하였다. 잔류물을 무수 디메틸 설폭시드(1 ml)에 용해시키고, 디-이소프로필에틸아민(25 mg) 및 메틸[(8-옥탄산 N-히드록시숙신이미드 에스 테르)5-아세트아미도-4,7,8,9-테트라-O-아세틸-3,5-디데옥시-2-티오-D-글리세로-α-D-갈락토-2-노눌로피라노시드]오네이트(78 mg)를 첨가하였다. 이 혼합물을 20℃, 아르곤하에서 60 시간 동안 교반한 다음, 진공하에서 용매를 제거하였다. 잔류물을 새로 제조한 메탄올(2.5 ml)내 0.1 M 나트륨 메톡시드 용액에 용해시키고, 이 혼합물을 20℃, 아르곤하에서 3 시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시키고 잔류물을 물(1 ml)에 용해시킨 다음 17 시간 동안 교반하였다. 이 용액을 세파덱스 LH20 상에서 물로 용리시키는 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다. 동결 건조시킨 후, 생성물인 BHA lyslys₂lys₄lys₈lys₁₆[(8-옥탄아미도)-5-아세트아미도-3,5-디데옥시-2-티오-D-글리세로-α-D-갈락토-2-노눌로피라노시돈산]₃₂를 백색의 분말 형태로 얻었다(44 mg, 86%).

실시예 27

시알산의 4 - 위치에서 변형된 수지형 시알로시드의 제조

메틸 4-아지도-5-아세트아미도-7,8,9-트리-O-아세틸-2-S-아세틸-3,4,5-트리데옥시-2-티오-D-글리세로-α-D-갈락토-2-노눌로피라노소네이트를 이하의 방법에 따라 제조하였다. 무수 디클로로메탄(150 ml)내 메틸 4-아지도-5-아세트아미도-7,8,9-트리-O-아세틸-2-클로로-3,4,5-트리데옥시-D-글리세로-β-D-갈락토-2-노눌로피라노소네이트(Sabesan, 1994)(5 g) 용액에 미분화된 칼륨 티올아세테이트(5.8 g)를 첨가하고, 이 현탁액을 20℃에서 48 시간 동안 격렬하게 교반하였다. 상기 혼합물을 여과후 증발시켜서 밝은 갈색의 거품을 얻었다(5.2 g). 필요한 생성물은 예비 역상 HPLC[C18, 30% 아세토니트릴/물]를 통해 백색의 거품 형태로 분리하였다(3.9 g, 72%).

메틸[(8-옥탄산 N-히드록시숙신이미드 에스테르)4-아지도-5-아세트아미도-7,8,9-트리-O-아세틸-3,4,5-트리데옥시-2-티오-D-글리세로-α-D-갈락토-2-노눌로피라노시드]오네이트를 이하의 방법에 따라 제조하였다.

무수 디메틸포름아미드(3.5 ml)내 메틸 4-아지도-5-아세트아미도-7,8,9-트리-O-아세틸-2-S-아세틸-3,4,5-트리데옥시-2-티오-D-글리세로-α-D-갈락토-2-노눌로피라노소네이트(300 mg) 용액에 8-브로모옥탄산(155 mg) 및 디에틸아민(1.26 ml)을 첨가하고, 이 용액을 20℃에서 17 시간 동안 교반하였다. 진공하에서 용매를 제거하고, 잔류물을 에틸 아세테이트와 10% 빙냉 염산 사이에 분획화시켰다. 유기층을 물로 세정하고, 황산나트륨으로 건조시킨 다음, 증발시켜서 황색 거품을 얻었다(385 mg). 이것을 에틸 아세테이트(20 ml)에 용해시키고, 여기에 N-히드록시숙신이미드(95 mg) 및 디시클로헥실카보디이미드(175 mg)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 20℃에서 17 시간 동안 교반한 다음, 백색의 침전물을 여과하였다. 여과물을 농축시켜서 정제용 역상 HPLC[C₁₈, 30% 아세토니트릴/물]를 통해 정제하여 백색의 거품을 얻었다(340 mg, 83%).

A. PAMAM[EDA]4.0[(8-옥탄아미도)-4-아지도-5-아세트아미도-3,4,5-트리데옥시-2-티오-D-글리세로-α-D-갈락토-2-노눌피라노시돈산]₃₂ BRI 6146

불활성 대기하에서 무수 디메틸 설폭시드(5 ml)내 PAMAM[EDA]4.0(72 mg) 용 액에 메틸[(8-옥타논산 N-히드록시숙신이미드 에스테르)4-아지도-5-아세트아미도-7,8,9-트리-O-아세틸-3,4,5-트리데옥시-2-티오-D-글리세로-α-D-갈락토-2-노눌로피라노시드]오네이트(318 mg)를 첨가하고, 이 용액을 20℃에서 60 시간 동안 교반하였다. 진공하에서 용매를 제거하고, 잔류물을 메탄올(2 ml)에 용해시켰다. 이 용액을 세파덱스 LH20 상에서 메탄올을 용리시키는 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다. 이후 용매를 증발시켜, 생성물인 PAMAM[EDA]4.0[메틸[(8-옥탄아미도)4-아지도-5-아세트아미도-7,8,9-트리-O-아세틸-3,4,5-트리데옥시-2-티오-D-글리세로-α-D-갈락토-2-노눌로피라노시드]오네이트]32를 백색의 거품 형태로 얻었다(225 mg, 81%).

유리 시알로시드는 하기 방법을 통해 얻었다:

20℃, 아르곤하에서 무수 메탄올(1 ml)내 PAMAM[EDA]4.0[메틸[(8-옥탄아미도)4-아지도-5-아세트아미도-7,8,9-트리-O-아세틸-3,4,5-트리데옥시-2-티오-D-글리세로-α-D-갈락토-2-노눌로피라노시드]오네이트]32(215 mg) 용액에 새로 제조한 메탄올(1 ml)내 1 M 의 나트륨 메톡시드 용액을 첨가하고, 상기 혼합물을 3 시간 동안 교반하였다. 진공하에서 용매를 제거하고, 잔류물을 물(2 ml)에 용해시켜서 17 시간 동안 교반하였다. 이 용액을 세파덱스 LH20 상에서 물을 용리시키는 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다. 이를 동결 건조시킨 후, 생성물인 PAMAM[EDA]4.0[(8-옥탄아미도)-4-아지도-5-아세트아미도-3,4,5-트리데옥시-2-티오-D-글리세로-α-D-갈락토-2-노눌로피라노시돈산]32을 백색의 보풀 모양의 분말 형태로 얻었다(160 mg, 90%).

B. PAMAM[EDA]4.0[(8-옥탄아미도)-4-아미노-5-아세트아미도-3,4,5-트리데옥시-2-티오-D-글리세로-α-D-갈락토-2-노눌로피라노시돈산]₃₂ BRI 6149

20℃에서 5일 동안 수소 설파이드 기체 증기를 피리딘(40 ml)과 물(20 ml)의 혼합물내 PAMAM[EDA]4.0[(8-옥탄아미도)-4-아지도-5-아세트아미도-3,4,5-트리데옥시-2-티오-D-글리세로-α-D-갈락토-2-노눌로피라노시돈산]32(25 mg) 용액에 천천히 통과시켰다. 이후, 상기 용액을 2 시간 동안 질소로 발포시켜 과량의 수소 설파이드를 제거하였다. 상기 용액을 증발시켜서 건조시키고, 잔류물을 물(5 ml)에 넣고 0.45 ㎛ 막 필터를 통해 여과하여 황을 제거하였다. 이후 이를 동결 건조시킨 후, 생성물인 PAMAM[EDA]4.0[(8-옥탄아미도)-4-아미노-5-아세트아미도-3,4,5-트리데옥시-2-티오-D-글리세로-α-D-갈락토-2-노눌로피라노시돈산]32을 백색의 보풀 모양의 분말 형태로 얻었다(23 mg, 96%).

실시예 28

보론산 말단 덴드리머의 제조

4-카복시페닐보론산 N-히드록시숙신이미드 에스테르

무수 디메틸 포름아미드(5 ml)내 4-카복시페닐보론산(500 mg) 용액에 N-히드록시숙신이미드(380 mg) 및 디시클로헥실카보디이미드(680 mg)를 첨가하였다. 이 혼합물을 20℃에서 64 시간 동안 교반한 다음, 백색의 침전물을 여과하였다. 진공하에서 용매를 제거하고, 잔류물을 에틸 아세테이트(100 ml)에 용해시켰다. 이 용액을 물로 세정하고, 황산 나트륨으로 건조시킨후 증발시켜 아세토니트릴/물로부터 결정화되는 백색의 고체를 미세한 바늘 결정 형태로 얻었다(730 mg, 92%).

PAMAM[EDA]4.0[4-벤즈아미도보론산]₃₂ BRI 6160

불활성 대기하에서 무수 디메틸 설폭시드(5 ml)내 PAMAM[EDA]4.0(69 mg)용액에 4-카복시페닐보론산 N-히드록시숙신이미드 에스테르(130 mg)를 첨가하고, 이 용액을 20℃에서 65 시간 동안 교반하였다. 상기와 같은 진한 슬러리에 1 M의 탄산나트륨 용액(1 ml)을 첨가하고, 맑아진 용액을 24 시간 동안 더 교반하였다. 진공하에서 용매를 제거하고, 잔류물을 10% 암모니아 용액(5 ml)에 용해시켰다. 이 용액으로 세파덱스 LH20 상에서 10% 암모니아 용액으로 용리시키는 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다. 용매를 증발시킨 후, 생성물인 PAMAM[EDA]4.0[4-벤즈아미도보론산]32을 백색의 보풀 모양의 고체 형태로 얻었다(110 mg, 94%).

실시예 29

나트륨 3,6-디설포나프틸티오우레아 말단 덴드리머의 제조

BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆lys₃₂

트리플루오로아세트산(2 ml)을 무수 디클로로메탄(2 ml)내 BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆DBL₃₂(147 mg) 교반 현탁액에 첨가하고, 이로부터 생성된 용액을 실온의 질소하에서 2 시간 동안 교반한 다음 농축시켰다. 잔류물을 N,N-디메틸-N-알릴아민 완충액(pH 9.5; 5 ml)에 용해시킨 다음, 고체 3,6-디설포나프틸 이소티오시아네이트(400 mg)를 첨가하였다. 이후 여기에 1 M 탄산나트륨을 첨가하여 이 혼합물의 pH 를 9.5 로 맞추고, 상기 용액을 53℃의 질소하에서 3 시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 물에 재용해시킨 다음, 이 용액을 앰버라이트 IR 120(Na) 컬럼에 통과시켰다. 여과물을 농축시켜서 미정제 생성물을 얻었으며, 이를 겔 여과법(세파덱스 LH20; 물)으로 정제하여 64개의 나트륨 3,6-디설포나프틸우레아기를 보유하는 BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆lys ₃₂를 백색의 보풀 모양의 고체 형태로 얻었다(175 mg).

실시예 30

나트륨 3,5-디설포페닐티오우레아 말단 덴드리머의 제조

BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆lys₃₂

트리플루오로아세트산(3 ml)을 무수 디클로로메탄(3 ml)내 BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆DBL₃₂(300 mg; 0.02 mmol) 교반 현탁액에 첨가하고, 이 용액을 실온의 질소하에서 2 시간 동안 교반한 다음 농축시켰다. 잔류물을 물에 용해시킨 다음, 이 용액을 앰버라이트 IRA 401(OH) 컬럼에 통과시키고, 여과물을 농축시켜서 점성의 오일을 얻었다(187 mg). 이 오일을 피리딘/물의 1:1 혼합물(8 ml)에 용해시키고, 여기에 고체 나트륨 3,5-디설포페닐 이소티오시아네이트(680 mg; 2 mmol)를 첨가하였다. 이 용액을 53℃의 질소하에서 3 시간 동안 가열하였다. 그 후, 이 용액을 농축시켜서 백색의 고체 잔류물을 얻었다. 미정제 생성물을 겔 여과법(세파덱스 LH20; 물)으로 정제하여 64개의 나트륨 3,6-디설포페닐우레아기를 보유하는 BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆lys₃₂를 백색의 보풀 모양의 고체 형태로 얻었다.

실시예 31

나트륨 3,5-디카복시페닐티오우레아 말단 덴드리머의 제조

BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆lys₃₂ BRI 6741

트리플루오로아세트산(3 ml)을 무수 디클로로메탄(3 ml)내 BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆DBL₃₂(300 mg; 0.02 mmol) 교반 현탁액에 첨가하고, 이 용액을 실온의 질소하에서 2 시간 동안 교반한 다음 농축시켰다. 잔류물을 물에 용해시키고, 이 용액을 앰버라이트 IRA 401(OH) 컬럼에 통과시킨 다음, 여과물을 농축시켜서 점성의 오일을 얻었다(186 mg). 상기 오일을 피리딘/물의 1:1 혼합물(8 ml)에 용해시키고, 여기에 나트륨 3,5-디카복시페닐 이소티오시아네이트(450 mg; 2 mmol)를 첨가하였다. 이로부터 생성된 용액을 53℃ 및 질소하에서 13 시간 동안 가열하였다. 그 후, 이 용액을 농축시켜서 백색의 고체 잔류물을 얻었다. 미정제 생성물을 겔 여과법(세파덱스 LH20; 물)으로 정제하여 64개의 나트륨 3,6-디카복시페닐우레아기를 보유하는 BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆lys₃₂를 백색의 보풀 모양의 고체 형태로 얻었다.

이와 유사한 방법으로 대응하는 나트륨 3,5-디카복시페닐티오우레아 말단 덴드리머 PAMAM 4.0(EDA)BRI 6195를 제조하였다.

실시예 32

BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆lys₃₂ BRI 6181

트리플루오로아세트산(2 ml)을 무수 디클로로메탄(2 ml)내 BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆DBL₃₂(147 mg; 0.01 mmol) 교반 현탁액에 첨가하고, 이로부터 생성된 용액을 실온의 질소하에서 2 시간 동안 교반한 다음 농축시켜 점성의 오일을 얻었다. 이 오일을 N,N-디메틸-N-알릴아민 완충액(pH 9.5; 5 ml)에 용해시키고, 고체 4-포스포노옥시페닐 이소티오시아네이트(250 mg)를 첨가하였다. 상기와 같이 생성된 용액의 pH를 1 M 탄산나트륨을 사용하여 10으로 맞춘 다음, 이 혼합물을 53℃의 질소하에서 3 시간 동안 가열하였다. 이 용액을 농축시켜서 백색의 고체 잔류물을 얻었다. 잔류물을 물에 재용해시킨 다음, 이 용액을 앰버라이트 IR 120(Na) 컬럼에 통과시키고, 여과물을 농축시켰다. 그 후, 잔류물을 겔 여과법(세파덱스 LH20; 물)으로 정제하여 이를 64 개의 나트륨 4-포스포노옥시페닐우레아기를 지닌 BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆lys₃₂를 백색의 보풀 모양의 고체 형태로 얻었다(150 mg).

실시예 33

나트륨 4-포스포노페닐티오우레아 말단 덴드리머의 제조

BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆lys₃₂

트리플루오로아세트산(2 ml)을 무수 디클로로메탄(2 ml)내 BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆DBL₃₂(147 mg; 0.01 mmol) 교반 현탁액에 첨가하고, 이로부터 생성된 용액을 실온의 질소하에서 2 시간 동안 교반한 다음 농축시켜서 점성의 오일을 얻었다. 이 오일을 N,N-디메틸-N-알릴아민 완충액(pH 9.5; 5 ml)에 용해시키고, 여기에 고체 4-포스포노페닐 이소티오시아네이트(250 mg)를 첨가하였다. 생성된 용액의 pH를 포화 중탄산나트륨 용액을 사용하여 9 로 맞춘 다음, 이 혼합물을 53℃의 질소하에서 3 시간 동안 가열하였다. 이후 상기 용액을 농축시켜서 백색의 고체 잔류물을 얻었다. 잔류물을 물에 재용해시킨 다음, 이 용액을 앰버라이트 IR 120(Na) 컬럼에 통과시키고, 여과물을 농축시켰다. 잔류물을 겔 여과법(세파덱스 LH20; 물)으로 정제하고 동결 건조시킨 후, 64개의 나트륨 4-포스포노페닐우레아기를 지닌 BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆lys₃₂ BRI 6196 을 백색의 보풀 모양의 고체 형태로 얻었다(152 mg).

실시예 34

나트륨 4,6-디포스포노나프틸티오우레아 말단 덴드리머의 제조

PAMAM 4.0

수(2 ml)중 나트륨 4,6-디포스포노나프틸 이소티오시아네이트(165 mg) 용액을 수(2 ml)중 PAMAM 4.0(51 mg; 0.01 mmol) 용액에 첨가하였다. 이 혼합물의 pH를 포화 중탄산나트륨 용액을 이용하여 9.5로 맞추고 실온에서 1 시간 동안 격렬하게 교반한 다음, 53℃의 질소하에서 3 시간 동안 가열하였다. 이후 상기 혼합물을 여과하고 여과물을 농축시켜서 갈색의 고체 잔류물을 얻었다. 미정제 생성물을 겔 여과법(세파덱스 G25; 물)으로 정제하고, 동결 건조하여 24개의 나트륨 4,6-디포스포노나프틸티오우레아기로 말단화된 PAMAM 4.0을 갈색의 고체 형태로 얻었다(81 mg).

실시예 35

플루오레세인티오우레아 말단 덴드리머의 제조

PAMAM 4.0(EDA)

고체 플루오레세인 이소티오시아네이트(188 mg)를 수(3 ml)중 PAMAM 4.0(EDA)(74 mg; 0.01 mmol) 용액에 첨가하였다. 여기에 포화 중탄산나트륨 용액을 첨가하여 pH를 9로 맞추고, 균질화된 용액을 실온에서 밤새 동안 교반한후 농축시켰다. 오렌지색 잔류물을 겔 여과법(세파덱스 LH20; 물)으로 정제하고 동결 건조시켜 21 개의 플루오레세인티오우레아기로 말단화된 PAMAM 4.0(EDA)을 보풀 모양의 오렌지색 고체 형태로 얻었다(193 mg).

실시예 36

나트륨(페닐-3-보론산)-티오우레아 말단 덴드리머의 제조

PAMAM 4.0(EDA)

고체 (페닐-3-보론산)이소티오시아네이트(100 mg; 0.5 mmol)를 수(5 ml)중 PAMAM 4.0(EDA)(69 mg; 0.01 mmol) 용액에 첨가하였다. 이소티오시아네이트에 1 M 탄산나트륨을 첨가하여 용해시켰다(pH 약 10). 이후 상기 혼합물을 53℃의 질소하에서 2 시간 동안 가열한 다음, 여과하고, 여과물을 농축시켜서 갈색의 고체 잔류물을 얻었다. 미정제 생성물을 겔 여과법(세파덱스 LH20; 물)으로 정제하고, 동결 건조시킨 후, 32개의 (페닐-3-보론산)티오우레아기로 말단화된 PAMAM 4.0(EDA)를 백색의 솜털형 고체 형태로 얻었다(87 mg).

실시예 37

피리디늄 도데실 카복스아미도 말단 덴드리머의 제조

PAMAM 2.0 덴드리머 BRI-6807

PAMAM 세대 2.0 중심(0.0479 mmol; 50 mg)을 MeOH 내 0.5 ml 용액으로부터 증발시킨 다음, 이를 10 ml의 물에 재용해시켰다. 이 용액에 브롬화 1-N-피리디늄 12-도데카논산(0.14 g; 0.384 mmol), N-히드록시벤조트리아졸 수화물[HOBT](52 mg; 0.384 mmol), 트리에틸아민(53 ㎕; 0.384 mmol) 및 1-(3-디에틸아미노프로필-3-에틸)카보디이미드.HCl[EDC](74 mg; 0.384 mmol)을 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 실온에서 밤새 동안 교반하였다. 감압하에서 부피를 1/3로 줄이고, 이 용액으로 LH20 컬럼 상에서 물을 용리액으로 사용하는 크로마토그래피를 수행하였다. 생성물을 포함하는 분획을 수집하여 동결 건조시켜 브롬화 피리디늄 도데실카복스아미드 PAMAM 2.0 을 보풀 모양의 백색 고체 형태로 분리하였다. ¹H nmr(D₂O): δ1.15, 1.45, 1.9, 2.15, 2.75, 2.8, 3.15, 3.35, 3.5, 4.55, 8.05, 8.5, 8.8.

PAMAM 4.0 덴드리머 BRI-6809

PAMAM 세대 4.0 중심(0.05 mmol; 69 mg)을 MeOH 내 1.0 ml 용액으로부터 증발시킨 다음, 15 ml의 물에 재용해시켰다. 이 용액에 브롬화 1-N-피리디늄 12-도데카논산(0.143 g; 0.4 mmol), N-히드록시벤조트리아졸 수화물[HOBT](77 mg; 0.4 mmol), 트리에틸아민(56 ㎕; 0.4 mmol) 및 1-(3-디에틸아미노프로필-3-에틸)카보디이미드.HCl[EDC](77 mg; 0.4 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 밤새동안 교반하였다. 감압하에서 부피를 1/3로 줄이고, 이 용액으로 LH20 컬럼 상에서 수중 1% 트리에틸아민을 용리액으로 사용하는 크로마토그래피를 수행하였다. 생성물을 포함하는 분획을 수집하여 동결 건조시킨 후, 브롬화 피리디늄 도데실카복스아미드 PAMAM 4.0 을 백색의 보풀 모양의 고체 형태로 분리하였다. 소량의 생성물을 아세트화 무수물과 반응시켜서 덴드리머 중심의 NH₂ 말단기가 완전히 캡핑되었는지를 확인하였다. ¹H nmr(D₂O): δ1.10, 1.45, 1.9, 2.1, 2.30, 2.5, 2.7, 3.2, 4.5, 8.00, 8.45, 8.80.

실시예 38

사카린-말단 덴드리머의 제조

PAMAM 4.0 덴드리머 BRI-6157

무수 디메틸 포름아미드(25 ml)내 에틸렌디아민 중심 PAMAM 4.0 덴드리머 중심(275 mg; 39.8 μM) 용액에 6-(벤조설피미도)이소티오시아네이트(400 mg; 1.67 mM)를 첨가하고, 이 혼합물을 실온에서 24 시간 동안 교반하였다. 탄산나트륨 용액으로 pH를 10 내지 10.5로 맞춤으로써 상기의 결과로 생성된 혼탁 용액을 맑게 만들었다. 이 용액을 24 시간 동안 더 교반하고, 회전 증발기에서 휘발성 물질을 제거하였다. 이 용액을 대형 세파덱스 LH20 컬럼 상에서 크로마토그래피시켜 초기 분획(first fraction)을 수집하였다. 남아있는 분획들을 수집하여 보다 작은 규모의 컬럼 상에서 다시 크로마토그래피를 수행하였다. 상기 합한 포기 분획들을 증발후 동결 건조시켜서 백색의 보풀 모양의 고체 형태로 사카린-말단 덴드리머 생성물을 얻었다(450 mg; 78%). ¹H nmr(D₂O): δ2.20, 2.50, 3.23, 3.46, 3.63, 7.52, 7.87.

이와 유사한 방법으로 대응하는 사카린-말단 BHA.Lys.Lys₂Lys₄.Lys₈.Lys₁₆.Lys₃₂...덴드리머 BRI-6189 를 제조하였다.

실시예 39

시험관내 항 기생성 분석법

I: 트리파노솜 억제에 관하여 시험하기 위한 시험관내 분석법으로서 이하와 같은 분석법을 수행하였다.

A. 재료 및 방법

배지 "발츠(Baltz)-MEM" + 열불활성된 10% 말 혈청.

트리파노솜 균주 STIB 900(STIB 704로부터 클로닝한 T.b. 로데시엔스(T.b.rhodesiense))

STIB 920(STIB 348로부터 클로닝한 T.b. 브루사이(T.b.brucei)

STIB 930(STIB 754로부터 클로닝한 T.b. 감비엔스(T.b.gambiense)).

표준 약물 멜라소프롤(아소발, 스페시아, 프랑스), 펜타미딘( 펜타캐리넛, 롱 쁠랑), 수라민(저마닌, 바이 어, 독일).

항온처리 조건 37℃, 습식 대기 중 5% CO₂에서 72 시간.

시험 시스템 96 웰 마이크로역가 플레이트, 웰당 100 ㎕, 웰당 200∼1000 트리파노솜(균주에 따라 상이함) 및 두개 의 종점 기록으로 평가.

평가 a. MIC의 현미경 측정을 이용함.

b. BCECF/AM 첨가 후 형광값을 읽거나 콜터 카운터 또는 CASY를 이용하여 세포수를 측정함.

약물 제조 10% 용매(DMSO, 에탄올 등)내 10 mM 원액, 약물 최고 농도: 50 μM

상세한 시험 방법 본 시험은 LILIT[로우 이노큘럼 롱 인큐베이션 시험; Low Inoculum Long Incubation Test(Brun 및 Lun, Vet. Par. 52(1994)37-46]를 기초로 한다.

1. 96 웰 플레이트의 B-H행, 2-10열의 웰(표시한 웰)에 50 ㎕의 완전 배지를 첨가한다.

2. 시험할 최고 약물 농도의 두배를 함유하는 배지 75 ㎕를 B-D(D1) 및 F-H(D2)행, 11열의 웰에 첨가한다.

3. 멀티피펫을 이용하여 웰의 11열에서 25 ㎕를 덜어 10열로 옮김으로써 연속 희석액을 제조하고, 최소 10회 배지를 빨아들이고 분배하여 혼합한다.

4. 웰의 5열에서 4열로 25 ㎕가 첨가될 때까지 오른쪽에서 왼쪽 방향으로 계속해서 희석시킨다. 혼합한 후, 남아있는 25 ㎕를 버린다. 웰의 각 행의 2열 및 3열은 약물이 없는 대조군 웰로 이용한다.

5. 플레이트의 B, C 및 F, G행, 2-11열의 웰에 트리파노솜 현탁액 50 ㎕를 4 x 103 ml의 시딩(seeding) 밀도로 첨가한다(웰당 200이 되게 함). 트리파노솜이 없는 50 ㎕의 발츠 배지를 웰의 D 및 E행, 2-11열에 첨가하여, 형광 분석용 백그라운드 대조군으로 이용한다.

6. 플레이트를 37℃, 5% CO₂에서 72 시간 동안 항온 처리한다.

7. MIC(최소 억제 농도: 대조군 웰과 비교하였을 때 정상적인 형태 및 운동성을 지닌 트리파노솜을 관찰할 수 없는 최저 약물 농도 또는 트리파노솜이 생존할 수 없는 농도)의 극미세 측정을 위해 역상 현미경하에서 플레이트를 관찰한다.

8. BCECF/AM을 첨가한 후 형광값을 판독하거나 콜터 카운터를 이용한 성장 억제 측정을 통해 이 시험을 추가로 평가할 수 있다.

B. 결과

하기 덴드리머들을 시험하였다.

BRI 번호	MOL 명칭	화합물 유형
BRI 2923	PAMAM 4.0(NHCSNH나프[SO₃Na]₂)₂₄	덴드리머
BRI 2998	PAMAM 4.0(NHCSNH나프-3,6,8-트리SO₃Na)₂₄	덴드리머
BRI 6039	PAMAM 4.0(NHCSNH-1-Ph-3,5-[SO₃Na]₂)₂₄	덴드리머
BRI 6041	PAMAM 4.0(NHCOPhCH₂시클람·4HCl)₃₂	덴드리머
BRI 6042	PAMAM 4.0(NHC=NHNH₂·HOAc)₂₄	덴드리머

(i) 72 시간 형광 분석에서의 T.b. 로데시엔스(STIB 900)에 대한 4개 화합물의 시험관내 활성. 모든 화합물을 4 mg/ml의 농도로 증류수에 용해시킨 다음, 완전 배양 배지에서 원하는 농도로 희석시켰다.

화합물	MTC (㎍/㎖)	MIC (㎍/㎖)	EC₅₀ (㎍/㎖)
BRI 2998	〉100	3.7	7
	333	4.1	6.3

MIC = 최소 억제 농도(minimum inhibition concentration)(생존 트리파노솜 없음)

MTC = 최대 내성 농도(maximum tolerated concentration)(약물 효과 없음)

(ii) 72 시간 형광 분석법에서의 T.b. 로데시엔스(STIB 900)에 대한 5개 화합물의 시험관내 활성. 모든 화합물을 20 ㎕/ml의 농도로 증류수에 용해시킨 다음, 완전 배양 배지(BMEM + 10% HI 말 혈청)에서 1:10으로 희석시켰다.

화합물	MTC		MIC		EC₅₀
화합물	㎍/㎖	μM	㎍/㎖	μM	㎍/㎖	μM
BRI 6042	666	87.7	74	9.7	120	15.8
BRI 6041	666	62.3	74	6.9	190
BRI 6039	1000	75.2	12.3	0.9	22	1.65
BRI 2923	〉1000	〉70	37	2.5	170

II. 트리파노소마(T) 및 플라스모듐(P) 종의 억제를 시험하기 위한 시험관내 분석을 통해 아래의 분석 결과를 얻었다.

하기 화합물들을 시험하였다:

BRI 번호	MOL 명칭
BRI 6157	PAMAM 4.0 EDA(NHCSNH사카린Na)32	폴리아미드 아민 중심 사카린 치환 덴드리머
BRI 6181	BHAlys₃₁lys₃₂(NHCSNHPhOP[O][ONa]₂)₆₄	리신 중심 페닐 포스페이트 치환 덴드리머
BRI 6195	PAMAM 4.0 EDA(NHCSNH-3,5-Ph[COOH]₂)₃₂	폴리아미드 아민 중심 페닐 카복실레이트 치환 덴드리머

하기 균주를 이용하여 시험을 수행하였다:

기생충	균주	단계	표준
T.b.로데시엔스	ST1B 900	트리포마스티고트	멜라소프롤
P.팔시파럼	NF 54	전단계	클로로퀸

화합물	T.b.로데시엔스		P.팔시파럼 IC-50	세포 독성 MIC
화합물	MIC	IC-50	P.팔시파럼 IC-50	세포 독성 MIC
BRI 6157	33	5	22	〉100
BRI 6181	〉100	〉100	24	〉100
BRI 6195	〉100	〉100	20	〉100

실시예 40

항균 활성의 측정

이 분석에 이용된 박테리아는 다음과 같다:

스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)(ATCC 29213)

엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis)(ATCC 29212)

에스케리챠 콜라이(Escherichia coli)(ATCC 25922)

접종물 2∼5 x 104 cfu(로그 단계)를 35℃, 공기 중에서 24 시간 및 48 시간 동안 항온 처리하여, 캐타이온 어저스티드 무엘러-힌톤 브로스(Cation adjusted Muller-Hinton Broth)(pH 7)내에서 미세 배양액 희석법(NCCLS-M7A3 1993)을 통해 최소 억제 농도(MIC) 및 최소 살균 농도(MBC)를 측정하였다. 접종물이 3 로그 감소를 나타내는 역가를 MBC로 간주한다. 이 결과들을 하기 표에 나타내었다(모든 단위는 ㎍/ml로 나타냄).

시험 화합물	S.아우레우스	E.패칼리스	E.콜라이
BRI 6807	32 ;(128)	〉256	128
BRI 6809	8 ; (8)	128(128)	〉256

MIC = 최소 억제 농도

(MBC) = 최소 살균 농도

실시예 41

시험관내 인간 적혈구 세포에서 덴드리머가 인간 말라리아 기생충 플라스모듐 팔시파럼의 침투 및 생장에 미치는 효과의 정량.

방법

말라리아 기생충: 3D7은 P. 팔시파럼 중 특성 규명이 잘 된 시험관 배양용 세포주이다. 이 기생충은 인간 적혈구 세포에서 생장 및 복제 주기를 반복한다. 매 주기의 기간은 48 시간이며, 미성숙 윤상체(ring) 단계 기생충에서 시작하여 착색된 영양체(trophozoite)를 지나(주기의 초기 24 시간 동안) 분할된 번식체(schizont)로 성숙하며, 이때 감염성 메로조이트가 뚫고 나와서 급속히 새로 생성된 적혈구에 침투한다. 새로 침투된 메로조이트는 윤상체형으로 되어 상기 주기를 반복한다.

기생충 배양 및 생장 분석법: 널리 검증된 기술을 이용하여 P. 팔시파럼( 3D7 주) 기생충을 새로 수집한 사람 적혈구 세포와 함께 시험관내에서 배양하였다. 침투를 확인하기 위해서, 성숙한, 착색 영양체를 포함하는 적혈구를 젤라틴 부양법을 통해 정제한 다음, 신선한 사람 적혈구 세포내에 재현탁시켜서, 200개의 적혈구 세포당 약 1개의 세포를 기생충으로 감염시켰다(0.5% 파라시태미아(parasitaemia)). 이후 신선한 배양 배지를 첨가하여 최종 적혈구 농도가 2 x 108 적혈구 세포/ml 이 되게 하였다.

적혈구 세포 현탁액 분취량(각 95 ㎕)을 96 웰 플레이트에 2회 분배하였다. 시험 화합물(BRI 2999; BRI 6741; BRI 2998; BRI 7011; BRI 6181) 또는 PBS(대조군) 중 어느 것을 함유하는 5 ㎕의 기생충 배양 배지를 적절한 웰에 첨가하고, 이 플레이트를 37℃, 1% O₂에서 항온 처리하였다. 배양 즉시(시간=0), 이어서 24, 48 및 72 시간 후, 각 웰에서 얇은 스미어가 형성되었다. 각각의 스미어 파라시태미아 및 기생충 성숙 단계로부터 스미어를 취해 pH 7.2에서 김사(Giemsa) 염색을 수행한 후, 현미경 관찰을 통해 정량하였다. 이를 통해 침투, 기생충 발달 및 후속 재침투를 정량하였다. 매 시료 채취 시점에 나머지 웰의 배양 배지(화합물 포함 여부와 관계없이)를 완전히 교체하였다.

먼저 시험 화합물을 멸균 등장성 포스페이트-완충 염수(pH 7.2)에 20 mg/ml로 용해시킨 다음, 추가로 희석하여 1 mg/ml 내지 200 ㎍/ml이 되도록 농축 원액을 제조하였다. 이후 상기 원액을 분석 기간 전반에 걸쳐 4℃에서 보관하였으며, 필요할 경우 기생충 배양 배지에 적절히 희석하였다.

결과

각 화합물 마다 독립적인 침투/생장 실험을 수행하였으며, 이 결과를 도 1 내지 5에 도시하였다. 최종 농도 10, 25 및 50 ㎍/ml 에서 각 화합물의 효과를 시험하였다. 임의의 주어진 농도에서 5개의 화합물 각각은 기생충 침투, 생장 및 복제에 대해 농도-의존성 억제 효과를 나타냈으며, 절대 억제 정도는 화합물마다 다양하였다. 시험한 모든 농도(50 ㎍/ml 이하)에서, 5개의 화합물 중 어떠한 것도 적혈구 세포의 형태에 뚜렷한 역효과를 나타내지 않았다. BRI 7011 및 BRI 6181을 시험한 실험(도 4 및 5)의 경우, 72 시간 경과시의 대조군 웰의 기생충 재침투 정도는 통상적으로 관찰되는 것보다 더 낮았다. 이것은 배양 48 시간 후 잠시 동안 기생충 생장이 명백히 지연되어서, 72 시간 경과시에는 대부분의 번식체가 아직 침투성 메로조이트를 방출시키지 않았기 때문이었다.

Claims

1 이상의 말단기가 음이온 함유 부분 또는 양이온 함유 부분과 결합되어 있거나 또는 연결되어 있으며 복수개의 말단기를 보유하는 덴드리머를 1 이상의 약리학적 또는 수의학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제와 함께 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 또는 인간이 아닌 동물에서 세균체, 효모체, 진균체 또는 기생체를 예방학적으로 또는 치료학적으로 억제하기 위한 약학적 또는 수의학적 조성물.

제1항에 있어서, 화합물이 2 이상의 수지형 분지에 공유 결합되어 있는 다가 중심을 포함하며 2 이상의 세대로 확장되는 것을 특징으로 하는 조성물.

제2항에 있어서, 상기 덴드리머가 암모니아 중심계 폴리아미도아민 덴드리머인 것을 특징으로 하는 조성물.

제2항에 있어서, 상기 덴드리머가 에틸렌 디아민 중심계 폴리아미도아민 덴드리머인 것을 특징으로 하는 조성물.

제2항에 있어서, 상기 덴드리머가 벤즈히드릴아민 또는 기타 적당한 중심계 폴리리신 덴드리머인 것을 특징으로 하는 조성물.

제2항에 있어서, 상기 덴드리머가 폴리(프로필렌이민)덴드리머인 것을 특징으로 하는 조성물.

제2항에 있어서, 상기 화합물이 하기 화학식 1 의 다가 이온성 덴드리머인 것을 특징으로 하는 조성물.

화학식 1

상기 식중,

I 는 개시 중심이고 ;

Z 는 내부 분지 단위이며 ;

n 은 덴드리머의 세대수를 나타내는 20이하의 정수이고 ; 및

제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 화합물 중의 음이온 함유 부분(들) 또는 양이온 함유 부분(들)이 덴드리머의 아민, 설프히드릴, 히드록시 또는 기타 반응성 말단기에 아미드 결합 또는 티오우레아 결합으로 결합된 것을 특징으로 하는 조성물.

제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 화합물 중의 음이온 함유 부분 또는 양이온 함유 부분은 설폰산 함유 부분, 카복실산 함유 부분(뉴라민산 및 시알산 함유 부분 및 변형된 뉴라민산 및 시알산 함유 부분 포함), 보론산 함유 부분, 인산 및 포스폰산 함유 부분(에스테르화 인산 및 포스폰산 함유 부분 포함), 1차, 2차, 3차 또는 4차 아미노 함유 부분, 피리디늄 함유 부분, 구아니디늄 함유 부분, 아미디늄 함유 부분, 페놀 함유 부분, 산성 수소 또는 염기성 수소 보유 복소환, 및 쥬비터 이온 함유 부분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.

삭제

제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 화합물이

ⅰ. 알킬설폰산 말단의 덴드리머 ;

ⅱ. 설포아세트아미드 말단의 덴드리머 ;

ⅲ. 설포숙신아미드산 말단의 덴드리머 ;

ⅳ. N-(2-설포에틸)숙신아미드 말단의 덴드리머 ;

ⅴ. 4-설포페닐티오우레아 말단의 덴드리머 ;

ⅵ. 3,6-디-설포나프틸티오우레아 말단의 덴드리머 ;

ⅶ. 4-설포나프틸티오우레아 말단의 덴드리머 ;

ⅷ. 3,5-디-설포페닐티오우레아 말단의 덴드리머 ;

ⅸ. 3,6,8-트리-설포나프틸티오우레아 말단의 덴드리머 ;

ⅹ. 4-(설포메틸)벤즈아미드 말단의 덴드리머 ;

ⅹⅰ. 4-설포벤즈아미드 말단의 덴드리머 ;

ⅹⅱ. N-(4-설포페닐)프로판아미드 말단의 덴드리머 ;

ⅹⅲ. 4-설포페닐우레아 말단의 덴드리머 ;

ⅹⅳ. N,N,N-트리-메틸글리신아미드 말단의 덴드리머 ;

ⅹⅴ. 4-트리메틸암모늄 벤즈아미드 말단의 덴드리머 ;

ⅹⅵ. 4-(트리메틸암모늄메틸)벤즈아미드 말단의 덴드리머 ;

ⅹⅶ. N-(2-아세톡시에틸)-N,N-(디메틸암모늄)메틸-카복스아미드 말단의 덴드리머 ;

ⅹⅷ. 구아니디노 말단의 덴드리머 ;

ⅹⅸ. 4-([1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸]메틸)벤즈아미드 말단의 덴드리머 ;

ⅹⅹ. 4-카복시-3-히드록시-벤질아민 말단의 덴드리머 ;

ⅹⅹⅰ. 4-카복시페닐아미드 말단의 덴드리머 ;

ⅹⅹⅱ. 3,5-디카복시페닐아미드 말단의 덴드리머 ;

ⅹⅹⅲ. 4-포스포노옥시페닐티오우레아 말단의 덴드리머 ;

ⅹⅹⅳ. 4-(포스포노메틸)페닐티오우레아 말단의 덴드리머 ;

ⅹⅹⅴ. 에틸-4-(포스포노메틸)페닐티오우레아 말단의 덴드리머 ;

ⅹⅹⅵ.(8-옥탄아미도)-5-아세트아미도-3,5-디데옥시-2-티오-D-글리세로-α-D-갈락토-2-노눌로피라노시드산 말단의 덴드리머 ;

ⅹⅹⅶ.(11-운데칸아미도)-5-아세트아미도-3,5-디데옥시-2-티오-D-글리세로-α-D-갈락토-2-노눌로피라노시드산 말단의 덴드리머 ;

ⅹⅹⅷ.(아세트아미도)-5-아세트아미도-3,5-디데옥시-2-티오-D-글리세로-α-D-갈락토-2-노눌로피라노시드산 말단의 덴드리머 ;

ⅹⅹⅸ.(4-부탄아미도)-5-아세트아미도-3,5-디데옥시-2-티오-D-글리세로-α-D-갈락토-2-노눌로피라노시드산 말단의 덴드리머 ;

ⅹⅹⅹ. (4-메틸벤즈아미도)-5-아세트아미도-3,5-디데옥시-2-티오-D-글리세로-α-D-갈락토-2-노눌로피라노시드산 말단의 덴드리머 ;

ⅹⅹⅹⅰ. (8-옥탄아미도)-4-아지도-5-아세트아미도-3,4,5-트리데옥시-2-티오-D-글리세로-α-D-갈락토-2-노눌로피라노시드산 말단의 덴드리머 ;

ⅹⅹⅹⅱ. (8-옥탄아미도)-4-아미노-5-아세트아미도-3,4,5-트리데옥시-2-티오-D-글리세로-α-D-갈락토-2-노눌로피라노시드산 말단의 덴드리머 ;

ⅹⅹⅹⅲ. 4-벤즈아미도보론산 말단의 덴드리머 ;

ⅹⅹⅹⅳ. 3,5-디카복시페닐티오우레아 말단의 덴드리머 ;

ⅹⅹⅹⅴ. 4-포스포노옥시페닐티오우레아 말단의 덴드리머 ;

ⅹⅹⅹⅵ. 4-포스포노페닐티오우레아 말단의 덴드리머 ;

ⅹⅹⅹⅶ. 4,6-디포스포노나프틸티오우레아 말단의 덴드리머 ;

ⅹⅹⅹⅷ. 플루오레세인티오우레아 말단의 덴드리머 ;

ⅹⅹⅹⅸ.(페닐-3-보론산)-티오우레아 말단의 덴드리머 ;

ⅹl. 피리디늄 도데실카복스아미드 말단의 덴드리머 ; 및

ⅹl1. 사카린 말단의 덴드리머

로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.

제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 세균, 효모 또는 진균 병원체, 또는 기생성 병원체를 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.

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