FI73738B - Foerfarande foer framstaellning av ett stafylocidinantibiotikum, vilket aer bundet till cellmureinet och har en selektiv antimikrobiell aktivitet mot stafylokocker. - Google Patents

Description

1 73738

Menetelmä solumureiiniin sitoutuneen stafylosidiinianti-biootin tuottamiseksi, jolla on selektiivinen mikrobien vastainen vaikutus stafylokokkeja vastaan 5 Tämän keksintö koskee menetelmää solumureiiniin si toutuneen kapeaspektrisen stafylosidiiniantibiootin tuottamiseksi, jolla antibiootilla on selektiivinen mikrobien vastainen vaikutus stafylokokkeja, S. aureus ja S. epidor-midis mukaan luettuina, vastaan.

10 On yritetty pit<ään kehittää kapeaspektrisiä anti biootteja, jotka ovat tehokkaita tiettyjä patogeenisiä mikrobeja vastaan, mutta eivät vaikuta normaaliin bakteerikasvustoon, joka ilmeisesti muodostaa erään elimistön normaaleista taudin vastaisista suojajärjestelmistä. Organis-15 meihin, jotka saattavat olla sangen resistenttejä monien tunnettujen antibioottien suhteen, ja joita vastaan tarvitaan selektiivisiä bukterisidojä, kuuluvat stafylokokit, esimerkiksi Staphylococcus aureus ja Staphylococcus epider-midis. Nämä gram-positiiviset organismit ovat molemmat 20 liittyneet haava- ja proteesi-infektioihin, ja S. aureus on ollut osallisena myös lukuisissa yleis- ja paikallissai-rauksissa. Vaikka joukko laajaspektrisiä antibiootteja, kuten klindamysiini, gentamisiini, rifampiini ja metisillii-ni, ovat tehokkaita näitä bakteereja vastaan, ei aiemmin 25 ole kehitetty yhtään kapeaspektristä antibioottia, joka olisi selektiivisesti tällaisten stafylokokki-infektioiden vastainen.

Keksinnön päämääränä on siten menetelmä kapeaspektri-sen antibiootin, jolla on selektiivinen antimikrobinen vai-30 kutus S. aureus- ja S. epidermidis-bakteereihin liittyvissä stafylokokki-infektioissa, valmistamiseksi. Keksinnön mukaisesti valmistetaan näin ollen antibiootti, joka on tehokas paikallisesti annettuna, joka ei vaikuta haitallisesti normaaliin kasvustoon ja jota käytettäessä vältetään sen ra-35 joittuneen imeytymisen ansiosta systeemisen myrkyllisyyden vaara, erityisesti kriittisessä tilassa olevan potilaan ollessa kyseessä.

2 73738

Keksinnön mukaisen menetelmän ja valmisteen antibiootin edut ilmenevät jäljempänä olevasta edullisten toteutus-muotojen kuvauksesta yhdessä liitteenä olevan piirroksen kanssa.

5 Piirros on käyrä, joka valaisee uuden keksinnön mu- kiasesti valmistetun antibiootin vaikutusta S. epidermidis-viljelmän elinkykyyn ja sameuteen.

Keksinnön mukaisesti on löydetty uusi mikro-organismin Rothia dentocariosa kanta. Uusi kanta, josta tästä lähiö tien käytetään nimitystä R. dentocariosan Howland-kanta, eristettiin ihmisen nielun nomraalin aerobisen bakteerikasvuston viljelmästä. Fermentoitaessa aerobisesti uusi kanta tuottaa uutta antibioottista ainetta, josta käytetään tässä nimitystä "stafylosidiini", jonka antibioottinen spektri 15 on kapea ja jolla on selektiivinen mikrobien vastainen vaikutus stafylokokkeja, S. aureus ja S. epidermidis mukaan luettuina, vastaan.

Howland-kannan puhdasviljelmä on talletettu American Type Culture Collection'iin, Rockville, Maryland, numerol-20 la ATCC 31918. Tämän elävän organismin alaviljelmä on saatavissa pyynnöstä ATCC:n pysyvästä kokoelmasta.

On havaittu, että Howland-kanta (ATCC 31918) tuottaa stafylosidiiniä fermentoitäessä vesipitoisessa ravintoliuoksessa, joka sisältää yhteytettäviä hiili- ja typpilähteitä 25 ja epäorgaanisia aineita, pinnan alaisissa aerobisissa olosuhteissa. Fermentoinnin aikana muodostunut stafylosidii-r.ipitoinen tuote, joka muodostuu soluseinämistä tai mureii-nistä*, erotetaan sen jälkeen ja tuote kerätään sinänsä tunnetulla fraktiointimenettelyllä /Park. J. T. ja Hancock, 30 A., "A Fractionation Procedure for Studies of the Synthesis *Kuten kirjallisuudesta ilmenee, on solun mureiini peptido-glykaaniheteropolymeeri, joka muodostuu lyhyiden peptidien välityksellä ristisidotuista glykaanisäikeistä /fSchleifer, K. H. ja Handler, O., "Peptidoglycan Types Of Bacterial 35 Cell Walls and their Taxonomic Implications", Bact. Rev.

36 (1972) 407-477_7 .

3 73738 of Cell-wall Mucopeptide and of other Polymers in Cells of Staphylococcus aureus" J. Gen. Micro 22 (1960) 249-2587-

Howland-kannan fermentointia S. aureus- ja S. epider-midis-bakteerien vastaisen selektiivisen antibiootin tuot-5 tamiseksi kuvataan kahden tämän keksinnön tekijän artikkelissa "Antistaphylococcal Substance(s) from a Pharyngeal Organism", joka esitettiin The American Pediatric Society'n ja The Society for Pediatric Research'n symposiumissa 29.4 - 2.5.1970. Howland-kantaa ei ollut identifoitu jul-10 kaisussa, eikä sitä ollut silloin talletettu mihinkään yleiseen viljelmäkokoelmaan, myöskään stafylosidiiniä sisältävän solumureiinifermentaatiotuotteen erottamista, talteenottoa tai karakterisoimista ei artikkelissa esitetty.

R. dentocariosa on aiemmin identifioitu American Type 15 Culture Collection1 iin talletetun prototyyppikannan ATCC

17931 perusteella. Scheiferin et ai., supra, kuvaaman solu-mureiinien tyypillisen peptidoglykaanirakenteen perusteella uskotaan, että R. dentocariosan ATCC-kannasta 17931 valmistetulla mureiinilla (tässä "ATCC-mureiini") on polymee-20 rinen rakenne, jossa esiintyvät alla olevan kaavan I mukaiset toistuvat yksiköt: 73738 Λ L1

Kaava I

N-asetyyliglukosamiiniyksikkö N-asetyylimuramiinihappoyksikkö 5 CH2CH F CH2OH

°\jV i> >-Jy? >x-

C--c H / c-c H

10 ' \ /11 __ N H Ac _ I _ / H NHAc / / / / 15 / r_ /__

I C H - C - H

3 20 C = 0 I ^ [ 1 - A1 a d-Glu I (d-GluNH tai d-AlaNH.) 1 — Ly s 4-j* l — A13 1 ~ A1 3 κ-~ 1—A 1 s 4- d ** A13 25 * i * d-Ala ! 1-Lys---- ^ j._ - __

I (d-Ala) J I

peptidi- peptidin sisäinen silta! yksikkö 30

Kuten kuvasta ilmenee, ATCC-mureiinin oletettuun polymee-rirakenteeseen kuuluvat siten hiilihydraattirunko, joka muodostuu N-aset.yyliglukosamiinista ja N-asetyylimura-miinihaposta toistuvina yksikköinä, peptidiyksiköstä 35 ja peptidin sisäisestä sidoksesta, joka liittää peptidi-yksiköt toisiinsa.

Il 5 73738

Useimmissa bakteereissa hiilihydraattirunko muodostuu samalla tavalla toistuvista -1,4-sidotuista N-aset-yyliglukosamiini- ja N-asotyylimuramiinihappoyksiköistä, kuten kaavassa I esitetään. Tähän mennessä on kirjallisuu-5 dessa esitetty vain kuusi muunnelmaa, ja kukin muunnelma on esiintynyt N-asetyylimuramiinihapporyhmässä /Ghuysen, J.M. ja Shockman, G.D., "Biosynthesis of Peptidoglycan" teoksessa "Bacterial Membranes and Walls" toim. L. Leive, Marcel Dekker, Inc. New York (1973) 37J.

10 Keksinnön mukaisesti uutta Howland-kantaa fermentoi- malla tuotetun solumureiinin (tässä "Howland-mureiini") rakenteen uskotaan kuitenkin eroavan ATCC-mureiinista sekä hiilihydraattirungon että peptidien sisäisten sidosyksiköi-den koostumuksen suhteen. Tämä hypoteesi perustuu sekä 15 ATCC- että Howland-mureiinien aminohappo- ja aminosokeri-analyyseihin, joita kuvataan edempänä tarkemmin. Nämä analyysit osoittavat, että muramiinihapon ja qlukosamiinin pitoisuuksien suhde on Howland-mureiinissa noin kolmasosan pienempi kuin näiden ryhmien pitoisuussuhde ATCC-mureiinis-20 sa ja että Howland-mureiinin alaniinipitoisuus on noin puolet ATCC-mureiinin alaniinipitoisuudesta. Ensimmäinen seikka viittaa eroon näiden peptidoglykaanien hiilihydraatti-runkojen rakenteessa, ehkä Howland-mureiinin N-asetyyli-muramiinihappoyksiköiden ylimääräiseen substituutioon so-25 kerillä, jossa ei ole aminoryhmiä. Toinen seikka viittaa eroihin näiden makromolekyylien peptidien sisäisten sidos-yksiköiden rakenteessa.

Edeltävästä ilmenee', ettei Howland-mureiinin tarkkaa kemiallista rakennetta vielä tunneta. Se voidaan kuitenkin 30 karakterisoida jäljempänä tarkemmin ilmenevällä tavalla muodostuvaksi peptidoglykaanipolymeeristä, joka on otettu talteen Howland-kannan formentointituotteesta, ja jonka moiekyylipaino vastaa vähintään 20 miljoonaa daltonia ja jonka aminohappo- ja aminosokerisi sältö on jäljempänä il-35 moitettua ja joka sisältää antibioottista ainetta, stafy-losidiiniä, joka on selektiivisesti stafylokokkien, S. aureus ja S. epidermidi s mukaan luettuina, vastainen.

6 73738

Stafylosidiinin rakennetta ei ole tähän mennessä määritetty. Uskotaan kuitenkin, että stafylosidiini on Howland-mureiinimakromolekyylin sisäisenä osana.

Todisteita siitä, että stafylosidiini on Howland-5 mureiinin polymeerirakenteen kiinteä osa, saadaan antamalla Howland-mureiinin reagoida erilaisten murolyyttisten entsyymien kanssa. Siten, jos Howland-mureiinin annetaan ensinnäkin reagoida minkä tahansa entsyymeistä amylaasi, ribonukleaasi A, fosfolipaasi A, kymotrypsiini, pronaasi 10 tai trypsiini kanssa, sen mikrobien vastaisessa aktiivisuudessa ei tapahdu mitään muutosta. Kun Howland-mureiinia käsitellään toisaalta entsyymeillä, jotka pystyvät hajottamaan mureiinia, esimerkiksi lysotsyymillä (jolla on N-asetyylimuramidaasivaikutus), lysostafiinilla (sisältää 15 N-asetyyliglukosaminidaasia ja N-asetyylimuramyylialaniini-amidaasia) tai basidiomykeettoja hajoittavilla entsyymeillä (sisältävät N-asetyylimuramyylialaniiniamidaasia), tuhoutuu sen mikrobien vastainen vaikutus. Jälkimmäiset entsyymit hydrolysoivat Howland-mureiinin hiilihydraattirungon 20 sokerimolekyylien välisiä sidoksia tai hiilihydraattirungon ja peptidiyksikön välistä sidosta. Näiden tulosten perusteella on ilmeistä, että Howland-mureiinin koskematon hii-lihydraattirunko muodostaa stafylosidiinin aktiivisuuden tai on steerisesti olennainen osa siitä ja että antibioot-25 ti on siten kiinteästi liittyvänä osana Howland-mureiini-makromolekyylissä.

Stafylosidiinin liittymiseen Howland-mureiinin viit-taavat lisäksi geelisuodatuskokeet, joissa Howland-fermen-tointiliemiä johdettiin Sephadex G-75-kolonnin (helmenmuo-30 toinen, ristisidottu dekstraani-adsorbenttigeeli, kaupallisesti saatavissa Pharmacia Inc:sta) läpi ja aktiivinen fraktio otettiin talteen kolonnin vapaasta tilavuudesta, jopa sen jälkeen, kun kolonnia oli eluoitu liuoksella, jonka suolapitoisuus oli suuri (0,5M KC1), 8M urealla, tai 35 sen jälkeen, kun fermentointilieminäytteitä oli keitetty 1 ?, natriundodekyylisulfaattiliuoksessa ja eluoitu 0,1 % nat-

II

7 73738 riumdodekyylisulfaattiliuoksella. Koska geelipylväs (jonka erottelualue on M = 3000 - 80 000 pallomaisille proteiineille) ei erottanut stafylosidiinipitoista fraktiota, oletetaan, että stafylosidiini on kovalenttisesti sitoutuneena 5 mureiinimakromolekyyliin.

Kuten edellä mainittiin, antibioottista stafylosidii-niä tuotetaan fermentoimalla uutta R. dentocariosa-kantaa (Howland-kantaa). Stafylosidiinipitoinen fermentointituote saadaan eristämällä Howland-mureiini ja sen aktiiviset osat 10 (joita voi olla mm. fermentointiliuoksessa). Itse stafy-losidiiniä ei ole eristetty Howland-mureiinista, mutta sen uskotaan olevan kovalenttisesti sitoutuneena ja osana mureiinin makromolekyylirakennetta. Uuden mikro-organismin ja sen kasvatuksen edulliset toteutusmuodot stafylosidiini-15 pitoisten tuotteiden tuottamiseski, tuotteita luonnehtivat tiedot, niiden selektiivistä mikrobien vastaista aktiivisuutta kuvaavat tiedot, ja antibioottia sisältävien tuotteiden käyttötavan kuvaus ovat seuraavassa yksityiskohtaisesti esitettyinä.

20 Howland-kanta (ATCC 31918) on tunnistettu R. dentoca- riosa'ksi American Type Culture Collection'issa sekä sen morfologian että biokemiallisten reaktioiden perusteella. Siten R. dentocariosa-kantojen ilmoitetaan olevan positiivisia seuraavien ominaisuuksien suhteen: katalaasin tuontan-25 to, nitraatin pelkistys, eskuliinin hydrolyysi sekä hapon tuotanto glukoosista, maltoosista, mannoosista, meletsitoo-sista, salisiinista, sakkaroosista ja trehaloosista (Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, 8 p.). Kun Howland-kanta on siirrostettu aivosydäninfuusioalustalle 30 (Difco BHI) ja kasvatettu 48 h 37°C:ssa, on se positiivinen kaikissa näissä reaktioissa. Samoin kokonaisten solujen hydrolyysi ja hiilihydraattifermentointilopputuotteiden analyysit sopivat yhteen R. dentocariosan kanssa.

Howland-kantaa voidaan lisäksi karakterisoida seu-35 raavasti: 8 73738 a) BHI-agarilla 37°C:ssa 72 h kasvatettujen pesäkkeiden morfologia: pesäkkeet ovat sileitä, kermamaisia, har-maanvalkoisia ja ehytreunaisia, kun taas yksittäiset solut kussakin pesäkkeessä ovat gram-positiivisia ja muodoltaan 5 kokkibasillimaisia, eivät sisällä säiemäisiä muotoja, eivätkä ole hapolla kiinnittyviä; b) Biokemialliset reaktiot 48 h:n kasvatuksen 37°C:ssa jälkeen ovat seuraavat (koetulokset määritetty 7 vrk reaktion alkamisesta): 10 Positiivinen (+) tai negatiivinen (-) reaktio

Lampaan veren hemolyysi Indoli

Voges-Proskauer ._ Gelatinaasi +

1 D

Nitraatin pelkistys +

Katalaasi +

Ureaasi Lesitinaasi 20 Lipaasi H^S-tuotanto Hippuraatin hydrolyysi

Eskuliinin hydrolyysi + Tärkkelyksen hydrolyysi c) Haponmuodostusreaktiot seuraavista yhdisteistä: 2 5

Positiivinen (+) tai negatiivinen (-) reaktio

Adonitoli

Amygdaliini o o L-arabinoosi

Sellobioosi

Dulsitoli

Erytritoli D-fruktoosi + 35 D-galaktoosi 73738 9 D-glukoosi +

Glyseroli Glykogeeni i-inositoli 5 Inuliini Laktoosi

Maltoosi + D-mannitoli D-mannoosi + 10 D-meletsitoosi +

Melibioosi

Raffinoosi L-ramnoosi D-riboosi 15 Salisiini + D-sorbitoli L-sorboosi

Sakkaroosi +

Trehaloosi + 20 D-ksyloosi d) Kokonaisten solujen hydrolysaatti: galaktoosi ainoana hiilihydraattina, ei diaminopimeliinihappoa eikä arabinoosia; ja e) Hiilihydraattifermentaation lopputuotteet: maito- 25 happo ja meripihkahappo, ei propionihappoa.

On selvää, että Howland-kannan morfologia ja bio kemialliset reaktiot saattavat vaihdella riippuen viljelmän kasvuvaiheesta tarkastelu- ja reaktioajankohtana. Siten erilaisissa kasvuolosuhteissa viljellyissä kasvustoissa 30 voi esimerkiksi olla soluja, joilla on sekä säiemäisiä että kokkibasillimuotoja.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle uuden solumureiiniin sitoutuneen stafylosidiiniantibiootin tuottamiseksi on tunnusomaista, että viljellään mikro-organismin Rothia dento-35 cariosa ATCC 31918 biologisesti puhdasta viljelmää, joka kykenee tuottamaan stafylosidiiniantibioottia, vesipitoises- 10 737 3 8 sa ravintoalustassa, joka sisältää yhteytettävissä olevia hiili- ja typpilähteitä ja epäorgaanisia suoloja, pinnan alaisissa aerobisissa olosuhteissa, kunnes syntyy oleellinen stafylosidiinin aikaan saama antibakteerinen aktiivi-5 suus, stafylosidiiniä sisältävä tuote otetaan talteen erottamalla fermentointiliemestä solumureiini, johon stafylosi-diini on sitoutunut ja joka käsittää peptidoglykaanipoly-meerin, jonka aminohappo- ja aminosokerikoostumus on suunnilleen seuraava: 10 Suhteellinen massa

Aminohappo alaniiniin verrattuna

Asp 0,16

Thr 0,09

Ser 0,07 15 Glu 0,43

Gly 0,16

Ala 1,00

Vai 0,16

Ile 0,09 20 Leu 0,20

Tyr 0,06

Phe 0,08

Lys 0,34

His 0,04 25 Arg 0,10

Muramiinihappo 0,47

Glukosamiini 1,04 ja jolla solumureiinilla on seuraavat R^-arvot ohutkerros-kromatografiässä, jossa on eluenttina isopropanoli/etikka-30 happo/vesi-seos ja jossa käytetään silikageeli G-levyjä, lysotsyymillä ja lysostafiinilla tapahtuneen pilkkomisen jälkeen: 73738 11

Fraktio R^-arvo (1) 0,66 ± 0,01 £N-asetyyliglukosamiini = 0,657 5 (2) 0,58 ± 0,01 (3) 0,59 ± 0,01 (4) 0,74 ± 0,01

Tll-asetyylimuramiinihappo = 0,73_7 -

Fermentointiolosuhteet biologisessa muuttamisessa 10 stafylosidiiniksi ovat yleensä samanlaiset kuin mitä käytetään tällä hetkellä tunnetuissa menetelmissä erilaisten antibioottien tuottamiseksi submerssifermentoimalla ja ilmastaen. Fermentointiliuos sisältää tavanomaisia ravintoaineita ja mineraaleja. Soveltuvia ravintoaineita ovat kaik-15 ki yhteytettävissä olevat hiililähteet, kuten polysakkaridit ja tärkkelykset, tai polyalkoholit, kuten glyseroli. Yhteytettävissä olevana typpilähteenä voi olla proteiini, proteiinihydrolysaatti, urea, maissin liotusliemi, peptoni, tislausliuokset, kalajauho ja muut tavanomaiset aineet.

20 Tavallisia anioneja ja kationeja lisätään myrkyttöminä suoloina. Hivenaineita, kuten mangaania, kobolttia, sinkkiä, kuparia jne. saadaan joko yllä mainittujen yhdisteiden epäpuhtauksina, käyttämällä vesijohtovettä tai lisäämällä erikseen liuoksia, jotka sisältävät erityisesti näitä hivenai-25 neita.

Muut fermentoinnin yleiset olosuhteet, kuten vetyioni-pitoisuus, lämpötila, aika, ilmastusnopeus, siirrostuksen valmistus, sterilointi, siirrostus ja vastaavat ovat tavanomaiset ja myös samanlaiset kuin tuotettaessa muita anti-30 biootteja.

Fermentoinnin annetaan edetä normaaleissa olosuhteissa 24-72 h, mikä aika normaalisti tarvitaan Howland-kannan hyvän kasvun aikaan saamiseksi. Antiboottiaktiivisuus otetaan sen jälkeen talteen koko organismista menettelyillä, jotka 35 on suunniteltu mureiinin puhdistukseen, esimerkiksi Parkin et ai., supra, menetelmällä, johon kuuluu kokonaisten solu- 12 73738 jen kerääminen, kuumentaminen trikloorietikkahapon kanssa, puskurointi ja sen jälkeen käsittely trypsiinillä. Howland-mureiini voidaan muutoin ottaa talteen alalla tunnetuin menetelmin, esimerkiksi käsittelemällä trypsiinillä, poly-5 oksietyleenieettereillä (esimerkiksi "Triton X-100") ja natriumdodekyylisulfaatilla.

Erityisen edullisia esimerkkejä Howland-kannan fer-mentointiprosesseista ja stafylosidiiniä sisältävän Howland-mureiinin talteenotosta kuvataan seuraavassa: 10 Esimerkki 1

Stafylosidiinin valmistus fermentoimalla BHI-väli-aineessa

Howland-kantaa kasvatettiin ilman pakkosyötöllä varustetussa inkubaattorissa aivosydäninfuusioliemessä (Difco 15 BHI) 35°C:ssa ilmastaen varovasti ravistamalla. 65 h:n viljelyn jälkeen solut kerättiin sentrifugoimalla nopeudella 10 000 G 30 min ja pestiin sitten tislatulla vedellä kolmesti.

Sitten solut suspendoitiin 10 % trikloorietikkahappo-20 liuokseen ja pidettiin 95°C:ssa 20 min. Suspensio sentri-fugoitiin nopeudella 10 000 G 20 min ja tuloksena oleva pelletti pestiin viisi kertaa 0,IM fosfaattipuskurilla, joka sisälsi lisäksi 100 /jg/ml trypsiiniä, ja suspensiota inkuboitiin 2 h 37°C:ssa.

25 Siten kerätty Howland-mureiini pestiin sitten vielä neljä kertaa tislatulla vedellä. Tuloksena oleva materiaali 011 valkeaa jauhemaista ainetta, jolla oli, kuten jäljempänä ilmenee, erinomainen mikrobien vastainen vaikutus sekä S. aureus- että S. epidermidis-lajeja vastaan.

30 Esimerkki 2

Stafylosidiinin valmistus fermentoimalla hiivauute-sakkaroosi-väliaineessa

Howland-kantaa inkuboitiin muuten esimerkin 1 mukaisesti, mutta kasvatus tehtiin väliaineessa, joka sisälsi 35 4 % kaupallista laatua olevaa hiivauutetta (myyjä Corn

Products Co., kauppanimellä Ardamine Z) ja 2 % sakkaroosia 13 73738 (myyjä Corn Products Co. kauppanimellä Cerelose) hiililäh-teinä ja jonka pH oli 6,8. Mureiini otettiin talteen esimerkin 1 mukaisesti.

Stafylosidiiniä sisältävän tuotteen karakterisointi 5 Howland-mureiini, joka on eristetty yllä kuvatulla tavalla, ja jolla on stafylosidiinivaikutus, näyttää muodostavan peptidoglykaanimakromolekyylistä. Howland-mureii-nin kemiallinen rakenne eroaa kuitenkin ATCC-mureiinin rakenteesta, mikä ilmenee osittain vaihteluina näiden mureii-10 nien aminohappo- ja aminosokerikoostumuksissa.

Aminophappo- ja aminosokerikoostumukst määritettiin analysoimalla sisäläpimiteiltaan pienessä laitteistossa, jossa käytettiin o-ftaalidialdehydifluoresenssiin perustuvaa erittäin herkkää detektorijärjestelmää (Durrum), joka 15 oli liitetty Perkin-Elmer'in tietokoneeseen, integraatto-riin ja mikroprosessoriin. Aminohappojen ja aminosokerien kvantitaviiset analyysitulokset saatiin vertaamalla kahden mureiinin kromatogrammeja autenttisten standardien kromato-grammeihin. Aminohappokoostumukset määritettiin, kun 20 näytteitä oli hydrolysoitu 6N HCl:ssä 110°C:ssa alipaineessa 24 h. Aminosokerianalyysit tehtiin lievän happohydrolyy-sin (2N HC1 2h) jälkeen.

Saatiin seuraavat suhteelliset tulokset: _________ -· II . .......

73738 14

Taulukko I

Howland- ja ATCC-mureiininäytteiden suhteelliset aminohappo- ja aminosokerikoostumukset 5 Aminohappo1_Howland-mureiini_ATCC-mureiini

Asp 0,16 0,07

Thr 0,09 0,05

Ser 0,07 0,04

Glu 0,43 0,35 10 Gly 0,16 0,09

Ala 1,00 1,00

Vai 0,16 0,08

Ile 0,09 0,05

Leu 0,20 0,11 15 Tyr 0,06 0,03

Phe 0,08 0,04

Lys 0,34 0,29

His 0,04 0,02

Arg 0,10 0,05 20 Muramiinihappo 0,47 0,63

Glukosamiini 1,04 0,97 *Suhteessa alaniiniin: Aminohapot 24 h:n hydrolyysin, ami-nosokerit 2 h:n hydrolyysin jälkeen.

Stafylosidiiniä sisältävä Howland-mureiinituote ka-25 rakterisoitiin edelleen ja erotettiin ATCC-mureiinista ohutkerroskromatografisella analyysillä. Analyysi tehtiin seuraavasti: 200 mg joko Howland- tai ATCC-mureiinia inkuboitiin lysotsyymin (10 mg), lysostafiinin (10 mg), natriumatsidin 30 (0,02 %) ja fosfaattipuskurin (0,01M), pH 7, kanssa 48 h 37°C:ssa vesihauteessa. Mureiinipilkkoutumistuotteet sentr.i-fugoitiin nopeudella 10 000 G 20 min ja suodatettiin 0,45 /um:n suodattimien läpi. Suodokset kylmäkuivattiin ja sus-pendoitiin uudelleen 0,5 ml:aan tislattua vettä.

35 Sephadex G-10-geeli (heImenmuotoinen, ristisidottu dekstraani-adsorbenttigeeli, kaupallisesti saatavana Pharma- 15 73738 cia Inc.rsta) autoklavoitiin ja pakattiin kolonniin valmista j an ohjeiden mukaisesti. Ajoliuoksena käytettiin steriiliä tislattua vettä ja kerättiin 40 1 ml:n fraktiota. Hiili-hydraattikoe, joka tehtiin fenoli/rikkihappo-menetelmällä, 5 varmisti hiilihydraattien läsnäolon fraktioissa. Sen jälkeen fraktiot kylmäkuivattiin ja liuotettiin 50 ml:aan tislattua vettä.

Eri fraktiot, N-asetyylimuramiinihappo ja N-asetyyli-glukosamiini laitettiin täpliksi inaktivoiduille silikagee-10 li G-levyille ja eluoitiin yhteen suuntaan käyttäen ajo-liuoksena isopropanoli-etikkahappo-vesi-seosta tilavuus-suhteessa 75:10:15. Kuivauksen jälkeen levyt ruiskutettiin 5 %, ammoniakkipitoisella hopeanitraattiliuoksella ja pidettiin 100°C:ssa 10 min tai kunnes täplät tulivat näkyviin. 15

Taulukko II

ATCC- ja Howland-mureiinien entsyymilläjoitustuottei-den Sephadex G-10-fraktioiden sisältämien sokerien ohutker-roskromatografia 20

Fraktion Howland-hajoitus- ATCC-hajoitustuote

Rf-arvo tuote A 0,66 + 0,01 0,65 ± 0,01 N-asetyyliglukosamiini = 0,65 N-asetyyliglukos- amiini = 0,62 B 0,58 ± 0,01 0,58 + 0,01 C 0,41 ± 0 D 0,59 + 0,01 0,59 + 0,01 E 0,74 ± 0,01 N-asetyylimuramiinihappo = 0,73 1 R^ on yhdisteen kulkeman matkan ja eluentin kulkeman matkan suhde.

73738 16

Stafylosidiiniä sisältävien tuotteiden mikrobien vastainen aktiivisuus

Yllä olevan esimerkin 1 mukaisesti valmistetun How-land-mureiinin mikrobien vastainen spektri määritettiin ja 5 sitä verrattiin samalla tavalla tuotetun ATCC-mureiinin spektriin. Kokeissa, joiden yhteenveto on taulukossa III, kutakin tutkittavaa organismia siirrostettiin 1 ml:aan aivo-sydäninfuusioalustaa, joko lisäten tai jättäen lisäämättä 5 % lampaan verta (organismista riippuen) ja inkuboitiin 10 yön yli 37°C:ssa. Howland-mureiinin mikrobien vastaiset pitoisuudet määritettiin mikrogrammoina Howland-mureiinia/ 1 ml Mueller Hinton-agaria, joka sisälsi 5 % lampaan verta, ja jossa kasvoi alle viisi tutkittavan organismin pesäkettä. Kuten jäljempänä ilmenee, samat ATCC-mureiini-pitoisuu-15 det eivät vaikuttaneet mikrobien vastaisesti.

Il 17 73738

Taulukko III

Howland-mureiinin ja ATCC-mureiinin mikrobien vastainen spektri 5 Howland-mu- ATCC-mureiinin reiinin mik- mikrobien vas-

Kanto- robien vas- , . . , .

, . täinen pitoisuus jen täinen pi- c

Organismi_lkm_toisuus_

Listeria 5 NK^ NK^

10 B - Streptococcus A 5 NK NK

B - Streptococcus B 3 NK NK

Pneumococcus 5 NK NK

Providencia 5 NK NK

Serratia 5 NK NK

15 Citrobacter diversus 5 NK NK

Citrobacter freudii 5 NK NK

Pseudomonas 9 8-NK NK

1-2,1 ug/ml^ NK

Actinobacter 5 NK NK

20 Shigella 5 NK NK

Salmonella 5 NK NK

Morganella 5 NK NK

Staphylococcus

epidermidis 4 3-2,1 ug/ml^ NK

25 1-33 ug/ml NK

S.epidermidis* 17* 7-2,1 ug/ml NK

6-4,2 ug/ml NK

3-8,3 ug/ml NK

1-33 ug/ml NK

30 Staphylococcus aureus 10 1-2,1 ug/ml NK

6-4,2 ug/ml NK

1-8,3 ug/ml NK

2-NK NK

S. aureus* 12* 6-2,1 ug/ml NK

35 5-4,2 ug/ml NK

1-8,3 ug/ml NK

is 73738

Howland-mu- ATCC-mureiinin reiinin mik- mikrobien vas-Kanto- robien vas- täinen pitoi-jen täinen pi- suus

Organismi__lkm__ toisuus_____

5 Enterobacter aeroqenes 5 NK NK

Enterobacter cloacae 5 NK NK

Proteus rettgeri 5 NK NK

Proteus mirabilis 5 NK NK

Proteus vulgaris 5 NK NK

„ Klebsiella pneumoniae 10 NK NK

10 --------*·-

Escherichia coli 10 9-NK NK

1-33 ug/ml^ NK

-2

Tutkittavat organismit laimennettiin suhteessa 10 3HI-alustaan, joko lisäten tai ollen lisäämättä lampaan ^ r. verta, tai fos f aatt ipuskuroi tuun fysiologiseen suolaliuokseen, pH 7,4 tähdellä merkityissä tapauksissa.

1 NK = ei tappavaa vaikutusta 2 Luvut ilmoittavat kuolleiden kantojen lukumäärää annetussa mikrobien vastaisessa pitoisuudessa 2Q Lisänäyttöä stafylosidiiniä sisältävän tuotteen se lektiivisestä mikrobien vastaisesta vaikutuksesta S. aureus-ta vastaan saatiin kokeilla, jotka tehtiin S. aureus-bak-teerin viljelmillä, joista puuttuivat soluseinät (L-muodot). L-muodot indusoitiin aivosydäninfuusioagarilla, joka sisäl-2^ si 5 % NaCl 0,05M Tris-HCl:ssa, pH 7,0, 20 % hevosen seerumia ja 900 /ug/ml metisilliiniä. Howland-kasvualustanäytteet (65 h:n viljelyn jälkeen) ja esimerkin 1 mukaisesti valmistetut Howland- ja ATCC-mureiin it (40 mg/ml) laimennettiin samalla tavalla suhteessa 1:10 liuoksella, jossa oli 5 % 3Q NaC1 0,05K Tris-HCl:ssa, pH 7,0.

Tutkittava soluseinätön S. aureus-kanta levitettiin agarmaljoille. 20 /ui erilaisia tutkittavia liuoksia (pelkkä puskuri, Howland-kasvualus ta, Ilowland-mureiini ja ATCC-mureiini, jotka oli valmistettu edellä kuvatulla tavalla) 33 laitettiin täpliksi agarmaljoi Ile. 48 h:n inkuboinnin (37°C) jälkeen kunkin pisaran alueella oleva kirkas alue 11 13 73738 arvosteltiin puolikvantitatiivisesti asteikolla 1+ (alhainen aktiivisuus) - 4+ (korkea aktiivisuus). Kuten alla olevasta taulukosta IV ilmenee, oli sekä Howland-kasvualustal-la että Howland-mureiini11a arvosanaa 4+ vastaava aktiivi-5 suus, kun taas puskurilla ja ATCC-mureiinilla ei ollut ollenkaan aktiivisuutta.

Taulukko IV

Howland- ja ATCC-mureiinien mikrobien vastainen vaikutus Staphylococcus aureuksen soluseinämättömiin muotoihin 10 Näyte Aktiivisuus puskuri ei

Howland-alusta 4+

Howland-mureiini 4+ ATCC-mureiini ei 15 Keksinnön mukaisten stafylosidiinipitoisten tuottei den mikrobien vastainen vaikutus S. epidermidis-vi1jelmiä vastaan on myös osoitettu. Kuten jäljempänä ilmenee, on stafylosidiini sekä bakterisidinen että bakteriolyyttinen S. epidermidisin suhteen.

20 Ensimmäisessä kokeessa siirrostettiin yön yli kasva tettua S. epidermidis-viljelmää BHI-alustalle. Howland-vil-jelmä, joka oli syntynyt 65 h:n fermentoinnin aikana esimerkin 1 mukaisesti, ja jonka mikrobien vastainen arvo oli 4+ laimennettuna 1:100 ja 1+ laimennettuna 1:400, lisättiin 25 sitten ensimmäiseen S. epidermidis-viljelmän alustanäyttee-seen viljelmän kasvettua 4 h. Ensimmäisen alustanäytteen lopullinen suhde S. epidermidis:Howland-alusta oli siten noin 1:10.

Elävien solujen pitoisuus S. epidermidis-alustanäyt-30 teessä (käyrä 2 liitteenä olevassa piirroksessa) ja S.

epidermidis/Howland-alusta-näytteessä (käyrä 20 piirroksessa) määritettiin ja siitä piirrettiin käyrä. Samalla määriteltiin valon absorbanssi (aallonpituudella 620 nm) sekä S. epidermidis alustanäytteelle (käyrä 4 liitteenä olevassa 35 piirroksessa) ja S. epidermidis/Howland-alusta -näytteelle (käyrä 40 piirroksessa). Käyrän 40 absorbanssiarvot korjät- 20 7 3 7 3 8 tiin itse Howland-alustan aiheuttaman optisen vaikutuksen suhteen, siten käyrät 4 ja 40 kuvaavat vain sameuden alenemista, jonka aiheuttaa stafylosidiinipitoisen Howland-alus-tan aikaan saama S. epidermidisin hajoaminen. Kuten kuvasta 5 on nähtävissä, sekä S. epidermidis -viljelmän elinkyky että sen sameus aleni huomattavasti Howland-alustan lisäämisen jälkeen.

Toisessa kokeessa verrattiin Howland-mureiinin aktiivisuutta ATCC-mureiinin aktiivisuuteen S. epidermidis -kan-10 taa vastaan. Howland- ja ATCC-mureiineja lisättiin erilaisina laimennoksina 1 ml:aan S. epidermidis -kannan kasvu-alustasuspensiota. Näytteitä inkuboitiin 35°C:ssa 3 h voimakkaasti ravistaen. Kuten alla olevasta taulukosta V ilmenee, ATCC-mureiinin lisäämisen havaittiin tehokaasti es-15 tävän Howland-mureiinin mikrobien vastaista vaikutusta S. epidermidisiä vastaan.

Taulukko V

ATCC-mureiinin vaikutus Howland-mureiinin mikrobien vastaiseen aktiivisuuteen S. epidermisiä vastaan 20

Eläviä pesäkkeitä muodostavia yksi- __Näyte__köitä/ml_

Staph. 1,1 x 106

Staph. + 1:100 Howland-mureiini 0 o 25 Staph. + 1:500 Howland-mureiini 1 x 10

Staph. + 1:100 Howland + 1:10 ATCC-mureiini 7 x 10^

Staph. + 1:500 Howland + 1:10 ATCC-mureiini 3,5 x 105

Staph. + 1:10 ATCC-mureiini 5,4 x 10^

Hiirillä tehdyissä in vivo -esikokeissa on osoitettu 30 myös, että keksinnön mukaisesti valmistetuilla stafylosidii-niä sisältävillä fraktioilla ei ole havaittavaa myrkkyvaikutusta isäntäeläimelle. Siten ensimmäisessä kokeessa, jossa käytettiin autoklaavikäsiteltyä, laimentamatonta Howland-kannan fermentoinnista saatua alustan supernatanttia, ei 35 havaittu mitään selviä merkkejä myrkyllisyydestä hiirillä 2i 73738 (13-15 g), joille ruiskutettiin vatsakalvon sisäisesti 0,5 ml tutkittavaa ainetta kahdesti 24 h:n kuluessa.

Lisäkokeessa osoitettiin, että solumureiini, jota otettiin talteen Howland-kannan alapopulaation fermentaa-5 tiosta, oli aktiivinen S. aureusta vastaan käsiteltäessä välittömästi hiiren leikkaushaavainfektiota aiheuttamatta akuutteja myrkkyvaikutuksia käytetyissä koeolosuhteissa.

Stafylosidiiniä sisältävä aine valmistettiin Howland-kannan esiasteella olevasta alapopulaatiosta (talletettu 10 American Type Culture Collection'iin numerolla ATCC 31919). Esiasteella olevat pesäkkeet olivat kuivia, ryppyisiä, murenevia ja niiden reunat olivat epäsäännölliset, kun taas yksittäiset solut kussakin pesäkkeessä olivat gram-positiivisia sauvoja, pleomorfisiä ja niissä oli difteroi-15 disia ja kokkimuotoja samoin kuin lukuisia säiemäisiä muotoja. Solut eivät olleet hapolla kiinnittyviä. Esiasteella olevan alapopulaation biokemialliset reaktiot olivat samanlaiset kuin koko viljelmän, ainoana erona oli se, että esiaste reagoi heikosti Voges-Proskauer-kokeessa ja tuotti 20 happoa raffinoosin kanssa reagoidessaan. Esiasteen solumu-reiinilla oli samanlainen kapea, selektiivinen mikrobien vastainen spektri kuin Howland-mureiinilla, mutta sen aktiivisuus oli vain 1/10 Howland-mureiinin aktiivisuudesta.

Käytettäessä esiasteen solumureiinia, oli aktiivisuus 25 selvästi suurempi kuin plasebomateriaalilla, mutta merkittävästi pienempi kuin gentamisiinia sisältävällä paikallisvalmisteella hiirikokeissa.

Stafylosidiiniä sisältävien tuotteiden antaminen ja käyttö 30 Tällä hetkellä on edullista käyttää tässä kuvatulla tavalla valmistettuja stafylosidiinipitoisia valmisteita paikallisesti estettäessä tai hoidettaessa stafylokokkien tai muiden valmisteelle herkkien organismien aiheuttamia paikallisia tiloja. Annettaessa tällä tavalla paikallisesti 35 sekoitetaan aktiivinen materiaali soveltuvaan kantaja-aineeseen, kuten voiteeseen, geeliin tai maitoon. Tässä yhtey- 22 7 3 7 3 8 dessä on edullista käyttää geelipohjäistä kantaja-ainetta, kuten esimerkiksi akryylihappopolymeeriä (esimerkiksi kaupallisesti saatavissa olevaa 0,2 % vesisuspensiota, Carbo-pol 940, valm. B.G. Goodrich Corporation).

5 Yleensä voidaan sekoittaa noin 1 - noin 50 % aktii vista ainetta tällaiseen kantaja-aineeseen soveltuvan paikallisvoiteen valmistamiseksi. Menetelmät tällaisten paikallisvalmisteiden valmistamiseksi, antamiseksi ja käyttökohteiden valitsemiseksi ovat alalla hyvin tunnettuja.

10 Näiden valmisteiden antibakteerisen S. aureus- ja S.

epidermidis-lajien vastaisen vaikutuksen mekanismia ei tällä hetkellä tunneta. Kuitenkin, a) murolyyttisen entsyymin aiheuttaman pilkkoutumisen antamat tiedot, (jotka osoittavat, että vaurioitumattomat hiilihydraattisidokset ovat 15 tärkeitä aktiivisuuden kannalta), b) se, että stafylosi-diiniä sisältävät tuotteet tappavat soluseinämättömiä bakteereja, ja c) aminohappoanalyysit, jotka osoittavat eroja aktiivisen ja inaktiivisen mureiinin hiilihydraattirungossa, antavat viitteitä mahdollisesta biologisesta mekanismista.

20 Ne mureiinin biosynteesin vaiheet, joissa ei tapahdu reaktioita soluseinässä, vaan vahingoittumattomissa hiili-hydraattisidoksissa, tapahtuvat lipidin siirtosyklissä. On mahdollista, että mureiinikomponentit, jotka sisältävät stafylosidiiniä, sitoutuvat irreversiibelisti lipidiä kanta-25 vaan molekyyliin estäen alayksiköiden siirron sytoplasmasta solukalvoon tai kalvosta soluseinään.

li

Claims (9)

1. 23 7 3 7 3 8 Patenttivaatimus Menetelmä solumureiiniin sitoutuneen kapeaspektrisen stafylosidiiniantibiootin tuottamiseksi, jolla antibiootil-5 la on selektiivinen mikrobien vastainen vaikutus stafylokokkeja, S. aureus ja S. epidermidis mukaan luettuina, vastaan, tunnettu siitä, että viljellään mikro-organismin Rothia dentocariosa ATCC 31918 biologisesti puhdasta viljelmää, joka kykenee tuottamaan stafylosidiiniantibioot-10 tia, vesipitoisessa ravintoalustassa, joka sisältää yhtey-tettävissä olevia hiili- ja typpilähteitä ja epäorgaanisia suoloja, pinnan alaisissa aerobisissa olosuhteissa, kunnes syntyy oleellinen stafylosidiinin aikaan saama antibaktee-rinen aktiivisuus, stafylosidiiniä sisältävä tuote otetaan 15 talteen erottamalla fermentointiliemestäsolumureiini, johon stafylosidiini on sitoitunut ja joka käsittää peptidogly-kaanipolymeerin, jonka aminohappo- ja aminosokerikoostumus on suunnilleen seuraava: Suhteellinen massa
2. 20 Aminohappo alaniiniin verrattuna Asp 0,16 Thr 0,09 Ser 0,07 Glu 0,43
3. 2. Gly 0,16 Ala 1,00 Vai 0,16 Ile 0,09 Leu 0,20
4. 30 Tyr 0,06 Phe 0,08 Lys 0,34 His 0,04 Arg 0,10
5. 35 Muramiinihappo 0,47 Glukosamiini 1,04 24 737 38 ja jolle solumureiinilla on seuraavat R^-arvot ohutkerros-kromatografiässä, jossa on eluenttina isopropanoli/etikka-happo/vesi-seos ja jossa käytetään silikageeli G-levyjä, lysotsyymillä ja lysostafiinilla tapahtuneen pilkkomisen 5 jälkeen: Fraktio R^-arvo (1) 0,66 ± 0,01 /N-asetyyliglukosamiini = 0,65.7 10 (2) 0,58 ± 0,01 (3) 0,59 ± 0,01 (4) 0,74 ± 0,01 /N-asetyy limuramiinihappo = 0,7 3_7. 25 7 3 7 3 8 Förfarande för framställning av det smalspektriga antibiotikumet stafylocidin, vilket är bundet tili cell-5 mureinet och har en selektiv antimikrobiell aktivitet mot stafylokocker, inklusive S. aureus och S. epidermidis, kännetecknat därav, att man odlar en biologiskt ren odling av mikroorganismen Rothia dentocariosa ATCC 31918, vilken förmär producera antibiotikumet stafylocidin, 10 i ett vattenhaltigt näringsmedium innehällande assimiler- bara källor av koi, väte och oorganiska saltcr under submer-sa aerobiska förhällanden, tills en väsentlig antibakte-riell aktivitet, orsakad av stafylocidin, bildas, den sta-fylocidinhaltiga produkten utvinns frän fermenteringslös-15 ningen genom separering av cellmureinet, tili vilket stafy-locidinet är bundet och vilket omfattar en peptidoglykan-polymer med följande ungefärliga aminosyra- och aminosocker-innehäll; Relativ massa i förhal-
6. 20 Aminosyra lande tili alanin_ Asp 0,16 Thr 0,09 Ser 0,07 Glu 0,43
7. 25 Gly 0,16 Ala 1,00 Vai 0,16 Ile 0,09 Leu 0,20
8. 30 Tyr 0,06 Phe 0,08 Lys 0,34 His 0,04 Arg 0,10
9. 35 Muraminsyra 0,47 Glukosamin 1,04