KR840001513B1 - 대장균 내열성 장독소 유도체의 제조방법 - Google Patents

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Description

대장균 내열성 장독소 유도체의 제조방법

본 발명은 설사병 예방에 유용한 신규의 면역원성 대장균 내열성 장독소 유도체의 제조방법에 관한 것이다.

대장균 균주가 인체뿐 아니라 동물에 있어서 설사병의 원인이 될 수 있다는 사실은 알려져 있으며, 다른 연구 [예 : Gyles and Barnum J. Infect. Dis. 120, 419-426, 1969]로부터 대장균 균주의 장내병원성은 장독소의 생성과 관련이 있는 것으로 나타났다.

두가지 장독소, 즉 열에 불안정(LT)한 장독소와 열에 안정(ST)한 장독소가 알려져 있으며, 스미드와 자일즈 [참조 : Smith and Gyles ; J. Med. Microbiol. 3, 387-401, 1970]는 다른 동물종의 수많은 장내병원성 대장균 균주를 LT 및 ST 장독소의 생성체로서 또는 ST 장독소만의 생성체로서 분류했다. 인체의 ST 생성체 대장균 균주는 다른 저자에 의해서도 기술되었거나 언급되었다 [참조 : R.A. Giannella, Infect. Immun. 14, 95-99 1976]. 열에 불안정한 장독소는 운반 가능한 플라스미드의 유전적 통제하에 있으며 ; 그것은 약 24,000의 분자량을 갖는 일군의 연결된 펩타이드로 구성되어 있다. LT 장독소는 소장의 상피세포의 쇄자연(brush border)에서 갱그리오 사이드에 흡수되며, 여기에서 효소작용이 개재되어 장공속으로 물 및 클로라이드를 과다분비시키고, 나트륨의 재흡수를 억제하여 장공을 유동액으로 팽창시키고 운동항진 및 설사를 일으킨다.

LT 장독소는 항원성이며, 이전에 대장균의 독소생성 균주로 감염되었던 사람이나 동물의 혈청내에서 항체의 중화를 촉진한다. 내열성 장독소는 이종그룹의 플라스미드의 유전적 통제하에 있으며, 이것도 또한 구아니딘 시클라제를 촉진하여 설사를 야기시킨다(J. M. Hughes et al., Nature 271, 766-7, 1978). LT 및 ST 생성균에 대해서 제조된 항혈청은 ST가 아닌 LT를 중화시키는 것으로 나타났으며, ST에 대해서 유사한 방법으로 제조된 항혈청은 ST나 LT에 대해서 중화효과가 없었음을 고려하여, 스미스와 자일즈(loc. cit.)는 ST는 항원성이 아니라고 결론지었다. "장독소생성 대장균을 갖는 돼지 균주에 의해 생성되는 내열성 장독소의 정제 및 화학적 특성"이란 명칭의 연구논문 [Infect. Immun. 19, 1021-1030, 1978]에서, 제이. 에프. 앨더리트와 디. 씨. 로버트슨(J.F. Alderete 및 D.C. Robertson)은 정제된 ST는 나트륨 도데실 설페이트-겔 전기영동 및 겔여과로 측정했을 때 4400의 분자량을 나타냈으며, 아미노산 분석 데이타로 부터는 47개의 진기를 나타내며, 5100의 분자량을 갖는 것으로 계산되었다고 보고하고 있으며, 이들은 또한 ST 또는 소혈청 알부민에 결합된 ST로 면역시킨 토끼로부터 얻은 항혈청은 젖먹이 마우스에서 장독소의 작용을 중화시켰음을 지적하고 있으나 수동혈구 응집반응 및 용혈현상 역가분석은 ST가 빈약한 항원임을 나타내었다. 다른 저자들에 의한 ST 분자량 측정은 다르며, 낮은 수치, 예를 들어 1000 내지 1200, 1500 내지 2000 및 2500달톤 [각기 E.V. Lee et al., R. Lallier et al. 및 G.L. Madsen et al.에 의해 American Society of Microbiology meeting 1973 abstract M168, 1979 abstract B34 및 1979 abstract p.29에 기술되어 있음]을 나타내는데, 이러한 불일치는 ST 생성, 분리 또는 정제단계에서의 차이뿐 아니라 장독소가 세포를 이탈할 때 다른 효소과정에서 기인될 수 있다.

최근의 연구 [참조 : R.A. Kapitany et al., Infect. Immun. 26, 173-177, 1979]는 ST의 이종성 문제에 까지 미치고 있으나, 아미노산 조성 열 안정성 및 생물학적 활성에 근거를 둔(R.A. Kapitany et al.(loc. cit.)에 의해 지적된 바와 같이) 다른 형태의 ST의 발견은 본 발명에 대해 어떠한 영향도 미치지 못하며 이는 다른 ST 장독소의 각 아미노산 조성에 약간 적용될 수 있을 뿐이다. 여러가지 배지 및 배양방법이 다른 연구자들에 의해 다른 대장균 ST 생성균주의 배양에 사용되었다. 그러한 배지로는 에프ㆍ지이ㆍ에반스 등의 복합배지(F.G. Evans et al., Infect. Immun. 8, 731-35, 1973), 제이ㆍ에프ㆍ앨더리트 등의 최소한정 배지(J.F. Alderete et al., Infect. Immun. 15, 781-88, 1977) 및 이들의 변형배지 등이 있다.

다음의 실시예에서, ST 장독소는 돼지 대장균 균주 K12[기탁일 : 1980년 3월 13일, 기탁장소 : American Type Culture Collection(Rockville, Maryland, U.S.A), 기탁번호 : ATCC 31621]로부터 제조된다.

대장균 균주 ATCC 31621은 1922년에 회복기 디프테리아 환자의 대변에서 분리한 공지의 대장균 K12균주로부터 유도된 돌연변이 종으로서, 통상 세균성 유전학 및 분자생물학의 기초 연구에 사용된다 [참조 : B.J. Bachmann, Bacteriol Rev. 36,4,525,1972]. 대장균 K12는 길이가 약 2미크론이고, 직경이 1미크론인 간상그림 음성균이다. 균주는 37℃에서 가장 잘 증식되나, 20℃ 정도의 낮은 온도에서도 또한 증식하고 분열한다. 대장균 K12는 0^-: K(?) : H48의 혈청형을 갖는 바-캡슐화 운동성 세균이며 : 람다파아지에 대해 매우 특이한 감수성을 나타낸다.

대장균균주 ATCC 31621은 대장균 K12의 대표적인 특성을 나타내며, 그것은 생장촉진에 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘 및 프롤린을 필요로 하며, 락토오즈를 발효시키지 않는데, 이는 유즙(lac)y 돌연변이에 기인된다(그것은 MC Conkey의 락토오즈 배지상에 백색콜로니를 형성한다). 대장균균주 ATCC 31621은 병원성 돼지 대장균 균주로부터 유도된 플라스미드 DNA의 제한 앤도뉴클레아제 분해작용에 의해 수득되며, 내열성 장독소의 합성을 위한 유전부호를 함유하는 2.1×10⁶달톤 DNA단편을 갖는 재조합 플라스미드를 함유한다. 균주는 클로람페니콜 저항성(㎖당 25mcg)이다.

상술한 바와 같이, 본 발명은 대장균균주 ATCC 31621의 사용이나 후술하는 발효방법에만 한정되는 것이 아니고, 상기균주 및 발효조건은 ST 장독소를 제조하기 위한 실예에 불과하다.

본 발명에 따르는 ST 장독소 유도체는 ST 장독소를 단백질에 대한 이 작용성 가교 결합제와 반응시킴으로써 제조될 수 있고, 따라서 수득된 ST 장독소 유도체는 ST 장독소 자체보다 실질적으로 더 큰 분자량을 나타내는 분자내 또는 분자간에 가교 결합된 ST 장독소이다.

본 발명의 제법에 있어서, ST 장독소를 동종작용성 시약 또는 이종작용성 시약으로 작용하는 단백질에 대한 비독성, 이 작용성 가교 결합제와 반응시켜, 가교 결합된 ST 장독소를 수득한다. 동종작용성 시약으로서 작용하는 이 작용성 단백질 가교 결합제로는 디-알데하이드 ; 디-케톤 ; 카보디이미드 ; 디이소시아네이트 ; 디이소티오시아네이트 ; 아릴디아자이드 ; 아실디아자이드 ; 아릴(활성화된) 디플루오라이드 ; 아릴 디설포닐(활성화된) 클로라이드 또는 브로마이드 ; 디카복실산(활성화된) 아자이드 ; 클로라이드 또는 에스테르 ; 디-알파 할로케톤 ; 폴리메틸렌(n=3 내지 12) 디이미드산 에스테르 ; 비스-(말레이도메틸) 에테르 ; 겜-비스-디아조 아세틸 알칸 ; 비스-디아조아렌 및 N,N'-아틸렌-디말렌이미드가 있으며 ; 이종작용성 시약의 예로는 상기 가교 결합제중 양립할 수 있는 작용그룹을 제외한 2개가 다르게 존재하는 시약으로서, 특히 이소시아네이토 및 이소티오시아네이토-아렌 ; (활성화된) 플루오토-및 아지도-아렌 ; (활성화된) 아지도- 및 플루오로-아렌 ; (활성화된) 아지도-아릴알파-할로알킬케톤 ; 클로로- 또는 브로모-아세트이미드산저급알킬 에스테르 ; 클로로 포름산 저급알킬 에스테르 및 에피할로히드린이 있다.

본 명세서에서 언급된 단백질에 대한 이작용성 가교결합제는 본 분야에 공지되어 있다. 예를들면, 단백질로의 인공 가교결합에 관한 고찰이 문헌 [참조 : Rosa UY 및 Finn WOLD in chap. 9 of Advances in Experimental Medicine and Biology entitled Protein Crosslinking (Biochemical and Molecular Aspects) edited by Mendel Friedman, Plenum Press, New York]에 기술되어 있다.

이들 다른 가교 결합제중에서, 실용상의 이유로 글루타르알데하이드, 디플루오로디니트로벤젠, 이소시아네이트 및 이소티오시아네이트 화합물, 카보디이미드 및 디이미드산 에스테르와 같은 동종작용성 시약이 가장 보편적으로 사용된다.

따라서 본 발명에 따르면 ST 장독소를 단백질 가교 결합제와 반응시킴을 특징으로 하는 대장균 ST 장독소 유도체의 제조방법이 제공된다.

본 발명의 제법에서 출발물질로 사용되는 대장균 ST 장독소는 어떠한 대장균 ST 장독소 생성균주로부터도 수득할 수 있다.

배양물 상등액에 존재하는 ST 장독소를 수득한 다음, 통상적으로 초여과법, 겔여과 크로마토그라피법, 이온교환 크로마토그라피법, 에탄올을 사용한 추출법 또는 폴리아크릴아미드 겔 디스크 전기영동법에 의해 오염물질을 제거하므로써 추출하고 정제한다. 상기 방법에 관한 설명은 논문 [참조 : Y. Takeda et al., in Infect. Immun. 25, 978-985, 1979]에 기술되어 있다.

ST 장독소는 온도에 대해서 상당히 내성이 있기 때문에, 본 반응이 실질적으로는 37℃ 이하, 바람직하게는 실온(예, 약 20 내지 25℃)에서 수행되는 것이 바람직하더라도 본 발명에 따르는 반응은 광범한 온도범위에 걸쳐 수행될 수 있다.

반응은 수성, 바람직하게는 완충배지 중에서 수행되며, 이때 pH는 가교 결합제의 성질에 따라 좌우된다. 예를 들면 디알데하이드 또는 디케톤의 경우 반응의 pH는 중요하지 않으며, 약 4 내지 약 8의 범위가 적당하고, pH 약 5가 바람직한데, 알데하이드의 자체축합반응을 감소시키기 위해서는 매우 낮은 pH값은 피해야 한다. 카보디이미드 및 이소시아네이트 가교 결합제의 경우에도 또한 pH5가 적당하나, 에피할로히드린의 경우에는 약 알칼리성의 pH(예, 약 pH8)가 적당하다.

배지 중에 저농도로 존재하는 ST 장독소를 가교 결합시키는데 디알데하이드 또는 디케톤을 사용할 경우, ST를 염석법으로, 예를 들면 황산나트륨을 먼저 가한 다음 가교 결합제를 가하여 침전시키므로써 가교 결합반응을 개선시킬 수 있다.

본 발명에 따르는 ST 장독소유도체의 용해도는 가교 결합정도에 의해 영향을 받는다.

본 발명에 따르는 ST 장독소 유도체는 투여에 적절한 무독한 담체를 가하여 근육내 또는 경구투여용 약제학적 또는 수의학적 제제로 제형화할 수 있다. 적절한 담체로는 등장성염 또는 완충용액 및 본 분야에 공지되어 있는 다른 물질이 있다.

ST 장독소 유도체의 수성용해도에 따르면 투여되는 약제학적 또는 수의학적 조성물은 액제 또는 현탁제의 형태일 수 있더라도, 이는 프로인트 완전보조제(수의용의 경우) 또는 수산화 알루미늄 등과 같은 보조제를 함유할 수 있으며, 실제로 조성물은 동결건조된 형태로 저장되고, 액제는 예를 들어 프로인트완전 보조제를 가하여 즉성에서 재조성된다. 본 발명에 따르는 ST 장독소 유도체의 용량 단위는 체중 ㎏당 가교 결합된 ST를 0.1㎎ 함유한다.

본 발명에 따라 제조되는 ST 장독소 유도체는 기타의 목적에, 예를 들면 면역분석에 유용한 항 ST 항혈청을 용이하게 제조하는데 사용될 수 있다.

[실시예 1]

대장균 균주 ATCC 31621을 멸균 식염수로 재수화시킨 다음, ㎖당 클로람페니콜 25mcg을 보충시킨 선택성 LB 한천고형배지(DIFCO Laboratories, Detroit, Michigan, U.S.A의 제품) 20㎖씩을 함유하며, 115℃에서 45분간 미리 가열시킨 페트리 접시중에서 37℃에서 18시간 동안 배양한다.

다음에는 프로테오즈 펩톤 n°3(DIFCO Laboratories의 제품) 30g, 효모추출물 4g 및 덱스트로즈 5g을 60℃에서 물 1ℓ중에 용해시켜 액체배양기(PP3으로 칭함)를 제조한다. 냉각시킨 후, 액체배양기에 NaCI 5g, Na₂HPO₄5.05g 및 KH₂PO₄1.2g을 가한다. pH가 6.9 내지 7.0인 배지를 자이쯔(seitz) EKS 여과기 상에서 여과하고, 분취액 30㎖를 250㎖ 배양 플라스크에 분배시킨다.

이들 배양플라스크를 PP3 액체배지 30㎖당 4개의 콜로니를 사용하여 페트리 접시상에서 수득한 평활형콜로니로 접종시키고, 37℃에서 진동판상에서 진탕시키면서(분당 20 내지 30회 진동) 7시간 동안 배양시킨다.

5%(V/V) 제1계대 접종물을 사용하여 PP3 배지 800㎖가 함유된 6ℓ 삼각플라스크 내에서 제2계대 접종을 행한다(16시간 동안).

121℃에서 30분간 멸균시킨 후 최종용액 1ℓ에 대해 ℓ-프롤린 1.42g ; ℓ-아스파르트산 0.87g ; ℓ-알라닌 0.39g ; ℓ-세린 0.69g ; ℓ-페닐알라닌 0.05g ; ℓ-히스티딘 0.05g ; ℓ-트립토판 0.05g 및 카스아미노산(DIFCO Laboratories의 제품) 5g을 보충시킨 변형앨더리트 배지 [modified Alderete medium ; 물 1ℓ중의 K₂HPO₄8.71g ; NaCl 2.35g ; NH₄Cl 1.0g ; 트리신 1.8g ; MgSO₄ㆍ7aq 50㎎ ; MnCl₂ㆍ4aq 4.95g 및 FeCl₃4.9㎎] 80ℓ가 들어 있는 발효조 내에서, 수득된 전배양물을 접종물(5% V/V)로 사용하여 증식시키는데, 이중 아미노산 성분은 따로 10배 농도용액으로 제조하여 pH7.5로 조정하고 최초용액과 합하기 전에 121℃에서 30분간 멸균시킨다.

증식배지를 36℃에서 10 내지 15시간 동안, 예를 들어 pH가 8.2 내지 8.4에 달하고, 산소소비가 0에 달할 때까지 교반하면서 호기적으로 배양시킨다.

증식단계말에 육즙을 30분간 60℃로 만들어 6000g에서 원심분리한 다음 상등액을 자이쯔 EKSI 여과기상에서 여과한다.

다음에는 ST 장독소를 농축하여 다음과 같이 3단계 공정으로 정제시킨다 :

제1단계에서 있어서, 여과한 발효배지의 분취량 40ℓ를, 1,000개의 컷-오프(cut-off)를 갖는 펠리콘 PTAC 막 [Pellicon PTAC는 Millipore Corporation, Bedford, Messachusetts, U.S.A에 의해 시판되고 있는 셀룰로오즈 혼합 에스테르 한외막에 대한 상품명이다] 상에서 여과하고, 이어서 동일한 PTAC막상에서 전도도가 500마이크로시멘(microsimen)으로 감소될 때까지 투석하여 5ℓ용적까지 농축시킨다. 다음에는 잔류물을 추가로 1ℓ까지 농축시켜 동결 건조시킨다. 동결-건조된 생성물을 ST-MP라 한다.

제2단계에서, ST-MP 생성물의 분취량 3g을 물 150㎖ 중에 용해시키고, 용액을 0 내지 4℃로 냉각시킨다. 냉아세톤 1.5ℓ를 교반하면서 적가한 다음 30분간 방치시킨다. 혼합물을 3000g에서 원심분리하고, 상등액을 감압하에 30㎖까지 농축시킨 후 메탄올/클로로포름 2 : 1(V/V) 혼합물 180㎖를 가한다. 세차게 진탕시킨 후 물 42㎖를 가하고, 상층을 분리시켜 감압하에 증발 건고시킨 다음 동결-건조시킨다. 동결-건조된 생성물을 이후에는 ST-ACF-D라 한다.

제3단계에 있어서, ST-ACF-D의 분자량 200㎎을 물 2㎖ 중에 용해시켜, 물로 평형화시킨 세르바크롬-8[Servachrom-8 ; Serva GmbH and Co., Heidelberg, German Federal Republic에 의해 시판되고 있는 크로마토그라피용 폴리아크릴산 메틸에스테르에 대한 상품명] 50g이 함유되어 있는 냉동칼럼(2.5×30㎝)의 상부에 적용시킨 다음 물을 사용하여 용출시킨다. 제1분획을 용출시킨 후, 메탄올/물 6 : 4(V/V)의 혼합물을 사용하여 계속해서 용출시켜 ST-함유분획을 얻는다. 용매를 증발시켜 ST를 분리시키고, 수득된 잔사를 ST-PAE라 한다.

ST-PAE는 초기배치(batch) 활성에 대해 1000 내지 4000의 정제인자를 나타내며, ST-PAE 생성물의 비활성도는 배치마다 5.5 내지 15ng로 변화된다.

분획물의 생물학적 활성은 문헌 [참조 : A.G. Dean; J. Infect. Dis. 125, 407-411 1972]에 기술된 방법에 따라 어린마우스 시험에 의해 입증된다. 그러므로, 생후 48 내지 72시간된 마우스에게 독소용액 0.025㎖를 위내로 접종시키고, 2시간이 경과한 후 장내 액체축적을 측정한다.

비가 독소의 생물학적 활성척도이다. 그 값이 0.09보다 높거나 같으면 양성으로 간주한다. ST 분획의 비활성도는 어린 마우스 시험에서

값이 0.100이 되는 ST의 양(동결건조 생성물의 ng로)으로 표시된다.

[실시예 2]

ST-PAE 10㎎을 아세트산염 완충액(pH 5.1) 0.25㎖ 중에 용해시키고 동일한 완충액 중의 36% 황산나트륨용액(W/V) 0.25㎖를 가하여 침전시킨다. 수성글루타르 알데하이드(25% V/V 용액 20㎕)를 가하여, 반응을 실온에서 2시간 동안 진행시킨다. 반응이 끝나면 과량의 시약을 원심분리에 의해 분리시키고, 물로 세척한 다음 침전물을 동결 건조시킨다.

동결-건조된 생성물은 세파덱스 G-100 [Sephadex는 Pharmacia, Uppsala, Sweden에 의해 시판되고 있는 크로마토그라피용 덱스트란 제제에 대한 상품명이다] 상 겔크로마토 그라피에 의해 입증된 바와 같이 출발물질로 사용된 바-변형 ST에 대해 증가된 분자량을 갖는 면역원성 가교 결합된 ST로 이루어져 있다.

분자량의 증가를 입증할 경우에는 동결 건조된 생성물에 물 1㎖를 가하고, 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반시키면서 부분적으로 용해시킨다. 용해된 분획은 불용성분획 30 내지 50%를 나타내고, 10,000에서 주피크를 나타내는 반면 동일조건하에서 출발 ST-PAE물질은 4000(세파덱스상에서 피이크 아래부분의 Vt, 여기서 Vt는 칼럼의 베드부피)에서 주피크를 나타낸다.

[실시예 3]

ST-PAE 20㎎을 물 1㎖에 용해시키고, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 염산염 200㎎을 가한다. 혼합물을 가교 결합반응이 진행되는 동안 25℃에서 12시간 동안 정치시킨다. 용성반응 생성물을 PM-10 아미콘막(Amicon은 Amicon Corporation, Lexington, Massachusetts, USA에 의해 시판되고 있는 한외막의 상품명이다)상에 투석시켜 비반응된 ST를 제거하고, 잔류분획 13㎎을 동결 건조시킨다.

실시예 2에서와 같이 세파덱스 G-100상 겔크로마토 그라피로 측정하면 가교결합된 ST의 분자량은 약 10,000(출발물질의 경우 2000에 대해)이다. 또한, 가교 결합된 ST의 흡수 스펙트럼은 출발물질로 사용된 ST-PAE분획의 흡수 스펙트럼과 다르다.

[실시예 4]

ST-PAE 5㎎을 pH 8.0의 0.1M붕산염(Na₂B₄O₇/NaOH) 완충액 0.5㎖에 용해시키고, 에탄올중의 0.02M 디플루오로디니트로벤젠 100㎕를 가한다. 실온에서 4시간 동안 교반시키면서 가교 결합반응을 수행한다. 반응시킨 후, 비반응된 ST를 14,000개의 컷-오프를 갖는 스펙트랩퍼 투석튜우빙 [Spectrapor의 Spectrum Medical Industrie, New York, USA에 의해 시판되고 있는 투석튜우빙의 상품명이다]을 통해 투석하여 경사시킨다.

세파덱스 G-100상에서 겔크로마토그라피하면(실시예 2에 지시된 바와 같이), 가교 결합된 용성 ST의 분자량은 50,000(출발 ST-PAE의 경우 2,000에 대해)으로 나타낸다. 가교 결합된 ST의 흡수 스펙트럼은 출발 ST-PAE의 흡수 스펙트럼에 대해 350㎚에서 추가의 피이크를 나타내었다.

[실시예 5]

실시예 2의 말에 수득한 동결-건조된 ST 장독소 유도체 100㎎을 생리식염수 0.5ℓ및 프로인트 완전 보조제 0.5ℓ현탁시키고, 조성물을 수의용으로 가교 결합된 ST 장독소 유효량을 함유하도록 유리 바이알에 분배시킨다. 바이알을 밀폐시켜 4℃에서 보관한다.

[실시예 6]

실시예 2에서 수득한 동결-건조된 ST 장독소 유도체 100㎎을 생리식염수 1ℓ및 알하이드로겔(Alhydrogel은 Superfos Export Company, Copenhagen, Denamark의 제품) 10g에 현탁시키고, 조성물을 인체에 투여하기 위한 가교 결합 ST 장독소 유효량을 함유하는 유리 바이알 각각에 분배시킨다. 바이알을 밀폐시켜 4℃에서 보관한다.

[실시예 7]

실시예 5에서 제조된 조성물을 동물당 0.1㎎의 용량 단위로 3마리의 토끼(A,B 및 C)에게 피하 투여하고, 21일 후 동일하게 피하 투여한다. 처음 투여한지 28일째 혈액(항혈청) 시료를 취한다.

면역된 토끼의 혈청을 어린 마우스시험(A.G. Dean, loc. cit.)에 의해 결정된 고정량의 ST를 중화시키는 효능(시험관내, 37℃에서 2시간)에 대해 시험하고 ; 대조군의 경우에는 항혈청 대신 식염수를 함유한 인산염 완충액 또는 정상혈청을 사용한다.

혈청중화 시험결과를 다음 표 I에 나타내었다. 표 I에서, PBS는 증류수 800㎖ 중의 NaCl 8g ; KCl 0.2g ; Na₂HPO₄1.15g ; KH₂PO₄0.2g의 용액을 증류수 100㎖ 중의 MgCl₂ㆍ6H₂O 100㎎의 용액과 혼합한 뒤 증류수 100㎖ 중의 CaCl₂0.1g의 용액에 가하여 이루어진 완충용액을 의미한다.

-0.09 이하의 gw/bw치는 ST 중화의 지수이다.

-각 gw/bw치는 측정치 3개의 평균치며, 이들 각각은 4마리의 어린 마우스군의 gw/bw을 나타낸다.

-ST 부피는 ㎖당 ST-ACF-D용 독소 1.4mcg을 함유하는 ST 용액을 말한다.

[표 Ⅰ]

결과는 가교 결합된 ST의 면역원성을 입증해 준다.

[실시예 8]

실시예 5에서 제조된 바와 같으나, 단 실시예 3에서 수득된 가교 결합된 독소를 갖는 조성물(10000 이상의 분자량을 갖는 용성분획)을 동물당 0.1㎎의 용량단위로 3마리의 토끼(K, L 및 M)에게 피하 투여하고, 21일 후에 동일하게 피하 투여한다. 처음 투여한 지 28일째 혈액(예, 항혈청) 시료를 취하고, PBS 대신 정상혈청을 사용하여 실시예 7에서와 같이 혈청중화 시험을 수행한다. 결과를 표 II에 기술하였으며, 이는 3마리 중 한 마리에서 가교 결합된 ST의 면역원성이 있음을 보여준다.

[표 Ⅱ]

[실시예 9]

실시예 5에서 제조된 바와 같으나, 단지 실시예 4에서 수득된 가교 결합된 독소를 갖는 조성물(14000 이상의 분자량을 갖는 용성 분획)을 동물당 0.5㎎의 용량단위로 3마리 토끼(H,I 및 J)에 투여하고, 21일 후에 동일하게 피하 투여한다. 처음 투여한지 28일째 혈액(예, 항혈청) 시료를 취하여 실시예 7에서와 같이 혈청중화시험을 수행한다.

결과는 다음 표 III에 나타내었으며, 이는 가교 결합된 ST의 면역원성을 보여준다.

[표 Ⅲ]

[실시예 10]

실시예 5에서 제조된 조성물을 세 마리의 작은 돼지(체중 20㎏)에게 투여하는데 ; 돼지 A 및 B에 대해서는 0.5㎎(시험시작날), 0.5㎎(제21일) 및 5㎎(제46일)의 용량단위로 피하투여하고, 작은 돼지 C에 대해서는 0.1㎎(시험시작한 날), 1㎎(제21일) 및 5㎎(제46일)의 용량으로 피하 투여한다. 제61일에 혈액(예, 항혈청) 시료를 취하여, 실시예 7에서와 같이 면역중화시험을 수행한다.

결과를 표 IV에 기재하였으며, 이는 가교 결합된 ST의 면역원성을 보여준다.

[표 Ⅳ]

Claims (1)

1. 대장균 내열성(ST) 장독소를 디알데하이드, 카보디이미드 및 디플루오라이드 중에서 선택된 단백질에 대한 비독성, 이 작용성 가교 결합제와 반응시킨 후 대장균 내열성(ST) 장독소 유도체를 회수하여, 대장균 내열성 장독소 유도체를 제조하는 방법.