HU219762B - Neisseria meningitidis fertőzések elleni alegység vakcina és a megfelelő tisztított alegységek - Google Patents

Neisseria meningitidis fertőzések elleni alegység vakcina és a megfelelő tisztított alegységek Download PDF

Info

Publication number
HU219762B
HU219762B HU9301631A HU9301631A HU219762B HU 219762 B HU219762 B HU 219762B HU 9301631 A HU9301631 A HU 9301631A HU 9301631 A HU9301631 A HU 9301631A HU 219762 B HU219762 B HU 219762B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
subunit
molecular weight
neisseria meningitidis
strain
gly
Prior art date
Application number
HU9301631A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9301631D0 (en
HUT69929A (en
Inventor
Ling Lissolo
Marie-José Quentin-Millet
Original Assignee
Pasteur Merieux Serums Et Vaccine S.A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pasteur Merieux Serums Et Vaccine S.A. filed Critical Pasteur Merieux Serums Et Vaccine S.A.
Publication of HU9301631D0 publication Critical patent/HU9301631D0/hu
Publication of HUT69929A publication Critical patent/HUT69929A/hu
Publication of HU219762B publication Critical patent/HU219762B/hu

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/22Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Neisseriaceae (F)
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04Antibacterial agents
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215Microorganisms
    • Y10S435/822Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/871Neisseria

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

A jelen találmány tárgyát egy Neisseria meningitidis törzshumántranszferrin-receptorának kisebb molekulatömegű alegységeiképezik tisztított formában, valamint egy olyan vakcinális gyógyászatikészítmény, amelynek az a célja, hogy megakadályozza a Neisseriameningitidis-fertőzést, illetve gyengítse a hatását, és amelygyógyászati készítmény az említett alegységet tisztított formábantartalmazza. ŕ

Description

A jelen találmány tárgyát a Neisseria meningitidis által okozott agyhártyagyulladás megelőzésére szolgáló gyógyászati készítmények képezik.
Az agyhártyagyulladások általában vagy virális, vagy bakteriális eredetűek. A fő bakteriális kórokozók a Neisseria meningitidis és a Haemophilus influenzáé, amelyek a bakteriális eredetű agyhártyagyulladásoknak körülbelül 40-50%-át okozzák.
Franciaországban a Neisseria meningitidis által okozott agyhártyagyulladások száma évente 600 és 800 között változik. Az Amerikai Egyesült Államokban az esetek száma évente 2500 és 3000 között van.
A Neisseria meningitidis fajt szerocsoportokra osztják, a kapszuláris poliszacharid természetétől függően. Jóllehet körülbelül tizenkét szerocsoport létezik, az agyhártyagyulladásos esetek 90%-át 3 szerocsoport okozza, az A, B és C.
A kapszuláris poliszacharidokon alapuló hatékony vakcinák léteznek a Neisseria meningitidis A, B és C szerocsoportjai által okozott agyhártyagyulladások megelőzésére. Ezek a poliszacharidok önmagukban egyáltalán nem, vagy csak nagyon gyengén immunogének a 2 év alatti gyermekekben, és nem indukálják az immunológiai memóriát. Ezek a hátrányok azonban leküzdhetők, ha ezeket a poliszacharidokat egy hordozó fehérjével konjugáljuk.
Ezzel szemben, a Neisseria meningitidis B csoportjának poliszacharidja egyáltalán nem, vagy csak csekély mértékben immunogén emberben, függetlenül attól, hogy konjugált formában van-e vagy sem. Ezért nagyon kívánatosnak tűnne egy olyan vakcina kidolgozásának a B szerocsoportba tartozó Neisseria meningitidis által okozott agyhártyagyulladás-fertőzés ellen, amely nem poliszacharidalapű.
Ebből a célból a Neisseria meningitidis külső membránjában levő számos fehérje felhasználását javasolták már. Ez főleg a humántranszferrinmembrán-receptor.
Általában a baktériumok nagy többségének vasra van szükségük a növekedésükhöz, és ezért ennek a fémnek a megszerzésére specifikus rendszereket dolgoztak ki. Különösen ami a Neisseria meningitidist illeti, amely szigorúan patogén emberre, a vas csak a humán vastranszport fehérjékből, például a transzferrinből és a laktoferrinből származhat, mivel a szabad állapotban levő vas mennyisége az emberben elhanyagolható (10-18 mol/1 nagyságrendben van), és ezért egy esetben sem teszi lehetővé a bakteriális növekedést.
Tehát a Neisseria meningitidisnek humántranszferrin- és humánlaktofemn-receptora van, amely lehetővé teszi számára, hogy megkösse ezeket a fémkelátképző fehérjéket, majd ezt követően a növekedéséhez szükséges vasat befogja.
A Neisseria meningitidis B16B6 törzs transzferrinreceptorát Schryvers és munkatársai izolálták és tisztították (WO 90/12591) egy membránkivonatból. Ez a fehérje a tisztítást követően lényegében két típusú polipeptidet tartalmaz: egy nagy látszólagos molekulatömeggel (körülbelül 100 kD) rendelkező polipeptidet, és egy alacsonyabb látszólagos molekulatömeggel rendelkező polipeptidet az SDS-poli(akril-amid) gélelektroforézis alapján.
A Schryvers által azonosított tisztított terméket az önkényes meghatározás alapján és a jelen találmány céljaira transzferrinreceptomak nevezzük, és az alkotóelemeit, alegységeit is. Az alább következő szövegben a nagy molekulatömegű és a kis molekulatömegű alegységek jelzése Tbpl, illetve Tbp2.
Meglepő módon felfedeztük, hogy a nagy molekulatömegű alegység nem képes semlegesítő hatású antitest termelését indukálni. A receptornak a két alegysége közül csak a kisebb képes ezt a funkciót betölteni.
Ennek következtében a találmány tárgya
i) Egy Neisseria meningitidis törzs humántranszferrin-receptorának alacsony molekulatömegű alegysége, az említett alegység ffagmentje vagy analógja tisztított formában; azaz az említett receptor nagy molekulatömegű alegységétől disszociált és tisztított formában; és ii) Egy vakcinális gyógyászati készítmény, amely hatóanyagként legalább egy Neisseria meningitidis törzs humántranszferrin-receptorának alacsony molekulatömegű alegységét tartalmazza, illetve az említett alegység egy ffagmentjét vagy analógját; az említett receptor nagy molekulatömegű alegységének távollétében;
iii) Legalább egy Neisseria meningitidis törzs humántranszferrin-receptora alacsony molekulatömegű alegységének vagy az említett alegység fragmentjének vagy analógjának terápiás alkalmazása; az említett receptor nagy molekulatömegű alegységének távollétében; és iv) Vakcinálási módszer Neisseria meningitidis-fertőzés ellen, ami abban áll, hogy terápiás szempontból hatásos mennyiséget adunk be az ilyen kezelést igénylő betegnek legalább egy Neisseria meningitidis törzs humántranszferrin-receptora alacsony molekulatömegű alegységéből, illetve az említett alegység fragmentjéből vagy analógjából, az említett receptor nagy molekulatömegű alegységének távollétében.
Az alacsony molekulatömegű alegység előállítható tisztított formában (azaz a nagy molekulatömegű alegységtől disszociálva és izolálva) egy transzferrinreceptorból. Az utóbbit egy Neisseria meningitidis törzsből állíthatjuk elő, amely törzset szabad állapotú vasat nem tartalmazó táptalajban tenyésztünk, leginkább Schryvers és munkatársai módszerével [WO 90/12591, illetve Infect. Immun., 56 (5), 1144 (1988)]. A tisztított receptort erősen denaturáló anyag, például 8 mol/1 karbamid vagy 6 mol/1 guanidin-HCl hatásának tesszük ki. A disszociált alegységeket standard kromatográfiás módszerekkel, például ioncserélő kromatográfiával vagy gélszűréssel választjuk el egymástól.
Egy másik módszer szerint az alacsony molekulatömegű alegységet génsebészeti módszerekkel lehet előállítani. Az ezt az alegységet kódoló DNS-ffagmentet egy heterológ expressziós rendszerben expresszálhatjuk (például baktérium, élesztő, emlőssejt). Ebben az esetben az alegységet egy tenyészetből nyeljük ki és tisztítjuk. Ezek a módszerek egyebek mellett teljesen alkalmasak az alegység fragmentjeinek vagy analógjainak előállítására.
HU 219 762 Β „A humán transzferrinhez kapcsolódni képes alacsony molekulatömegű alegység fragmentje” alatt egy olyan peptidet értünk, amelynek aminosavszekvenciája megtalálható az alegység szekvenciájában. „A humán transzferrinhez kapcsolódni képes alacsony molekulatömegű alegység analógja” alatt egy olyan fehérjét értünk, amelynek aminosavszekvenciája legalább 80%os, előnyösen legalább 90%-os és legelőnyösebben legalább 95%-os homológiát mutat az alegység szekvenciájával. A jelen találmány szempontjából a szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy egy ilyen fragment vagy egy analógnak a fragmentje meg kell, hogy tartsa az alegység immunogén tulajdonságait.
A Tbp2 alegység szempontjából a Neisseria meningitidis törzsek 2 fő csoportra oszthatók:
- az egyik csoportban a Tbp2 alegység molekulatömege körülbelül 65-75 kD (ezek a 2394-es jelű törzsek); és
- a másik csoportban a Tbp2 alegység molekulatömege körülbelül 75-90 kD (ezek a 2169-es jelű törzsek).
Általában a jelen találmány szempontjából hasznos alacsony molekulatömegű alegység bármely szerocsoportba tartozó Neisseria meningitidis törzsből származhat. Előnyösen egy B szerocsoportba tartozó Neisseria meningitidis törzsből származik. A találmány egy abszolút előnyös megvalósítási módja szerint a Neisseria meningitidis B16B6 törzsből származik, amelyet még 2394 (B:2a:P1.2:L2.3) jelzéssel is elláttak, illetve a Neisseria meningitidis M982 törzsből, amelynek lehet még a 2169 (B:9:P1.9:L3.7) jelzése is.
A Neisseria meningitidis 2394-es (B:2a:Pl. 12:L2.3) és 2169-es (B:9:P1.9:L3.7) törzsek, amelyeket általánosan használnak a laboratóriumokban, szabadon hozzáférhetők a Collection de Institute Pasteur-nél, 25 rue de Dr. Roux 75015 Párizs, a CIP79808 és a CIP7917 szám alatt.
Például a 2394-es és a 2169-es törzsek Tbp2 alegységét az aminosavszekvenciák alapján íijuk le, az 1-es és a 2-es szekvenciaazonosítókra való hivatkozással (SEQ ID NO. 1 és 2). Ezeknek az alegységeknek a látszólagos molekulatömege körülbelül 68-70, illetve 87 kD, SDS jelenlétében végzett poli(akril-amid) gélelektroforézis alapján.
Egy, a találmány szerinti gyógyászati készítmény különösen hasznos a Neisseria meningitidis-fertőzés megelőzésében vagy hatásainak gyengítésében.
Egy, a találmány szerinti gyógyászati készítményt szokványos módon lehet előállítani. Pontosabban a találmány szerinti terápiás hatású anyagot vagy anyagokat egy hígítóanyaggal vagy egy hordozóval kombináljuk, amely gyógyászati szempontból elfogadható. Egy, a találmány szerinti készítményt bármely, a vakcinálás területén elfogadott szokványos módszerrel beadhatunk, különösen szubkután, intramuszkulárisan vagy intravénásán, például egy injekciózható szuszpenzió formájában. A beadás egyetlen dózis formájában, illetve egy bizonyos időtartam eltelte után egyszer vagy többször ismételt dózis formájában történhet. A megfelelő dózis különböző paraméterektől függően változhat, például a kezelt pácienstől, illetve a beadás módjától függően.
Végezetül a találmány szerinti készítmény egy vagy több alacsony molekulatömegű alegységet tartalmazhat, attól függően, hogy az utóbbi különböző Neisseria meningitidis törzsekből származik-e. Tehát a találmány egy megvalósítási módja szerint egy előnyös gyógyászati készítmény tartalmazza a 2394-es törzs humántranszferrinreceptorának alacsony molekulatömegű alegységét (molekulatömege 65-74 kD), valamint a 2169-es törzs humántranszferrin-receptorának alacsony molekulatömegű alegységét (molekulatömege 75-90 kD).
Előnyösen egy, a találmány szerinti készítmény tartalmazza a 2394-es törzs humántranszferrin-receptorának alacsony molekulatömegű alegységét (molekulatömege 68-70 kD), valamint a 2169-es törzs humántranszferrin-receptorának alacsony molekulatömegű alegységét (molekulatömege 87 kD).
A találmányt az alábbiakban példákon keresztül részletesen ismertetjük.
1. példa
A transzferrinreceptor tisztítása a 2394-es törzsből
1A - A tenyészet
A Neisseria meningitidis IM2394 törzs fagyasztva szárított sejtjeit körülbelül 1 ml Mueller-Hinton táptalajban (MHB, Difco) vesszük fel. A baktériumszuszpenziót ezután szilárd Mueller-Hinton táptalajra visszük, amely forralt vért tartalmaz (5%).
óra hosszat 37 °C-on inkubáljuk 10% CO2-t tartalmazó atmoszférában, majd a baktériumréteget kinyerjük azzal a céllal, hogy 150 ml MHB táptalajt oltsunk vele (pH=7,2, 3 db 250 ml-es Erlenmeyer-lombikba elosztva). Az inkubálást három óra hosszat folytatjuk 37 °C-on, kevertetés közben. Az így előállított, mindhárom tenyészettel oltható 400 ml MHB (pH=7,2, kiegészítve 30 pmol/l etilén-diamin-di(o-hidroxi-fenilecetsav)-val (EDDA, Sigma), amely szabad formájában egy vaskelátot képező vegyület.
Miután 16 óra hosszat tenyésztettük kevertetés közben, a tenyészetek tisztaságát Gram-festést követően mikroszkóposán megvizsgáljuk. A szuszpenziót centrifugáljuk, majd a patogén mikroorganizmust tartalmazó üledéket leméqük és -20 °C-on tároljuk.
IB - Tisztítás
A tisztítást lényegében a Schryvers és munkatársai által közölt módszerrel végezzük az alábbiak szerint.
A baktériumüledéket megolvasztjuk, majd 200 ml 50 mmol/1 TRIS-HC1 pH=8,0 pufferben (A puffer) szuszpendáljuk. A szuszpenziót centrifugáljuk (20 perc, 15 000 xg, 4 °C). Az üledéket kinyerjük, majd ismét az A pufferben szuszpendáljuk 150 g/1 végkoncentrációban. 150 ml-es frakciókat kezelünk 8 percig 80 MPa nyomással egy sejtfeltáró berendezésben (Rannie, 8.30H modell). Az így kapott sejtlizátumat 15 percig centrifugáljuk 4 °C-on 15 000 χ g-vel. A felülúszót kinyerjük, majd 75 percig 4 °C-on 200 000 χ g-vel centrifugáljuk.
A felülúszó eltávolítása után az üledéket A pufferben vesszük fel, majd Lowry-féle módszerrel végzett fe3
HU 219 762 Β hérjemérés után a szuszpenzió koncentrációját 5 mg/mlre állítjuk.
1,4 ml membránszuszpenzióhoz 1,75 mg, Schryvers által leírt módszerrel biotinilezett humán transzferrint adunk. A membránfrakció végkoncentrációja mg/ml. Az elegyet 1 óra hosszat inkubáljuk 37 °C-on, majd 100 OOOxg-vel centrifugáljuk 75 percig 4 °C-on. A membránüledéket 0,1 mol/1 NaCl-t tartalmazó A pufferben vesszük fel, majd 60 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk.
Miután oldatba vittük, olyan térfogatú 30%-os (tömeg/térfogat) N-lauroil-szarkozint és 500 mmol/1 EDTA-t adunk ehhez a szuszpenzióhoz, hogy a szarkozil és az EDTA végkoncentrációja 0,5%, illetve mmol/1 legyen. Miután 15 percig inkubáltuk 37 °C-on kevertetés közben, 1 ml streptavidin-agarózt (Pierce) adunk hozzá, amelyet előzőleg A pufferben mostunk. A szuszpenziót 15 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk, majd lOOOxg-vel 10 percig centrifugáljuk. A gyantát ezután oszlopba töltjük, és a közvetlen eluátumot elöntjük.
A gyantát 3 oszloptérfogatnyi 50 mmol/1 TRIS-HC1 pH = 8,0 pufferrel mossuk, amely 1 mol/1 NaCl-t, 10 mmol/1 EDTA-t, 0,5% szarkozilt tartalmaz (B puffer), majd 1 oszloptérfogatnyi, 750 mmol/1 guanidinHCl-t tartalmazó B pufferrel mossuk. A transzferrinreceptort ezután 2 mol/1 guanidin-HCl, 50 mmol/1 TRIS-HC1 pH=8,0, 1 mol/1 NaCl, 10 mmol/1 EDTA, 0,05% szarkozil összetételű pufferrel eluáljuk. Az eluátumot frakciókban gyűjtjük, olyan csövekbe, amelyek azonos térfogatú 50 mmol/1 TRIS-HC1 pH=8,0,1 mol/1 NaCl összetételű puffért tartalmaznak. Az eluátum optikai sűrűségét 280 nm-en mérjük, az oszlopból való kilépés pontjánál, UV-detektorral.
Az elúciós csíknak megfelelő frakciókat kinyerjük, 10 mmol/1 foszfátpufferrel (pH=8,0) szemben dializáljuk, amely 0,5 mol/1 karbamidot tartalmaz, majd Amicon típusú töményítőcellában töményítjük, amely 10 000 D vágási értékű membránt tartalmaz, oly módon, hogy körülbelül 3 mg fehérje/ml végkoncentrációt kapjunk.
Bizonyos mennyiségű karbamidot adunk a töményített oldathoz, hogy a végső karbamidkoncentráció 8 mol/1 legyen, és a fehérjeoldat végkoncentrációja 2 és 3 mg/ml között legyen. Az oldatot 6 napig 4 °C-on inkubáljuk.
Az elegyet azután anioncserélő gyantán (Q Sepharose, Pharmacia) kromatografáljuk, amelyet előzőleg 50 mmol/1 TRIS-HC1 pH=8,0 pufferrel hoztunk egyensúlyba, amely 5 mol/1 karbamidot tartalmaz.
Ilyen körülmények között a nagy molekulatömegű alegységet (Tbpl) közvetlenül az átfolyó oldatból nyerjük ki, míg az alacsony molekulatömegű alegységet (Tbp2) 0-1 mol/1 lineáris NaCl-gradienssel eluáljuk, amely A pufferben 0,5% szarkozilt és 5 mol/1 karbamidot tartalmaz.
Az elúciós csíknak megfelelő frakciókat kinyerjük, 10 mmol/1 foszfátpufferrel (pH=8,0) szemben dializáljuk, amely 0,05% szarkozilt tartalmaz, majd fagyasztva szárítjuk. A fagyasztva szárított terméket vízben felvesszük 10-szer nagyobb töménységben. Az oldatot másodszor is dializáljuk 50 mmol/1 foszfátpuffer, pH=8,0, 0,05% szarkozil (C puffer) összetételű oldattal szemben, majd az oldatot 0,22 pm-es pórusméretű membránon szűrjük át.
A fehérjetartalmat meghatározzuk, majd 1 mg/mlre állítjuk C puffer hozzáadásával, aszeptikus körülmények között. Ezt a készítményt -70 °C-on tároljuk.
2. példa
A 2169-es törzsből származó transzferrinreceptor alacsony molekulatömegű alegységének tisztítása A 2169-es törzs tenyésztését és a transzferrinreceptor tisztítását az 1. példában leírtakkal azonos körülmények között végezzük.
3. példa
A Neisseria meningitidis 2394-es törzséből származó transzferrinreceptor alacsony molekulatömegű alegységének tisztítása hidrofób kromatográfiával A 2394-es törzs tenyésztését és a tisztítási lépéseket egészen a membránszuszpenzió készítéséig az 1. példában leírtakkal azonos körülmények között végezzük.
Egy térfogatnyi membránszuszpenzióhoz azonos térfogatú 50 mmol/1 TRIS-HC1 pH = 8,0 puffért adunk; amely 2 mol/1 NaCl-t, 20 mmol/1 EDTA-t és 1 (tömeg/térfogat)% szarkozilt tartalmaz. Az elegyet 14 percig 37 °C-on inkubáljuk óvatos kevertetés közben. Ennek az oldatnak egy térfogatát azután érintkezésbe hozzuk azonos térfogatú Sepharose 4B gyantával, amelyhez humán transzferrin van hozzákötve. Ezt az affinitásgyantát úgy állítjuk elő, hogy humán transzferrint graftolunk (Sigma, St. Louis, Amerikai Egyesült Államok) Sepharose 4B-CNBr-hez (Pharmacia), a gyártó előírásai szerint. A ligandum sűrűsége 5 mg transzferrin/ml gyanta. Az érintkezés egy fürdőben megy végbe 1 óra hosszat szobahőmérsékleten, enyhe körkörös rázatás közben. A gyantát azután oszlopba töltjük, és a közvetlen elfolyó eluátumot elöntjük.
A gyantát 3 oszloptérfogatnyi 50 mmol/1 TRIS-HC1 pH=8,0 pufferrel mossuk, amely 1 mol/1 NaCl-t, 10 mmol/1 EDTA-t, 0,5% szarkozilt tartalmaz (B puffer), majd 1 oszloptérfogatnyi, 750 mmol/1 guanidinHCl-t tartalmazó B pufferrel mossuk. A transzferrinreceptort ezután 2 mol/1 guanidin-HCl, 50 mmol/1 TRISHC1 pH=8,0, 1 mol/1 NaCl, 10 mmol/1 EDTA, 0,05% szarkozil összetételű pufferrel eluáljuk. Az eluátum optikai sűrűségét 280 nm-en mérjük, az oszlopból való kilépés pontjánál, UV-detektorral.
Az elúciós csíknak megfelelő frakciókat összegyűjtjük, majd a fehérjét három térfogatnyi hűtött etanol hozzáadásával kicsapjuk.
Éjszakán át 4 °C-on inkubáljuk, majd a fehérjét centrifugálással kinyerjük (1 óra, 10 000xg). Az üledéket olyan mennyiségű 10 mmol/1 koncentrációjú foszfátpufferben (pH=7,0, 0,5 mol/1 NaCl-t, 5 mol/1 guanidinHCl-t tartalmaz, ez a D puffer) vesszük fel, hogy a fehérje végkoncentrációja körülbelül 1 mg/ml legyen. Az oldatot fenil-Sepharose gyantával hozzuk érintkezésbe
HU 219 762 Β (Pharmacia), amelyet előzőleg ugyanezzel a pufferrel hoztunk érintkezésbe. Az inkubálást fürdőben végezzük körkörös rázatás közben 2 óra hosszat szobahőmérsékleten. A gélt azután oszlopba töltjük.
Ilyen körülmények között a nagy molekulatömegű alegységet (Tbpl) a közvetlenül átfolyó eluátumból nyerjük ki, míg az alacsony molekulatömegű alegység (Tbp2) kötve marad a gyantához. Az oszlopot 3 térfogat D pufferrel, majd 5 térfogat foszfátpufferrel (10 mmol/1, pH=8,0, 0 ,5% szarkozil) mossuk. A Tbp2 elúciós pufferben levő, fölöslegben levő szarkozilt etanolos kicsapással eltávolítjuk, majd a fehérjét 50 mmol/1 foszfátpufferben vesszük fel (50 mmol/1, pH=8,0, 0,05% szarkozil, ez a C puffer).
Az oldatot azután 0,22 pm-es membránon szűrjük át. A fehéijetartalmat meghatározzuk, majd 1 mg/ml-re állítjuk C puffer hozzáadásával, aszeptikus körülmények között. Ezt a készítményt -70 °C-on tároljuk.
4. példa
A Neisseria meningitidis 2169-es törzséből származó transzferrinreceptor alacsony molekulatömegű alegységének tisztítása hidrofób kromatográfiával A 2169-es törzs tenyésztését és a transzferrinreceptor alacsony molekulatömegű alegységének (Tbp2) tisz- 25 títását az 1. példában leírtakkal azonos körülmények között végezzük.
5. példa
Az alacsony molekulatömegű alegység vakcináló hatóanyagként való fontosságának igazolása A szérumok Neisseria meningitidis 2394-es és 2169-es törzsek transzferrinreceptora alacsony molekulatömegű alegysége (Tbp2) elleni specifikus baktericid aktivitását értékeljük.
New Zealand albínó nyulaknak bőr alá és intramuszkulárisan 100 pg IM2394 vagy IM2169 receptort 5 adunk be komplett Freund-féle adjuváns jelenlétében. Az első injekció után 21, illetve 42 nappal a nyulaknak ismét beadunk 100 pg-ot a tisztított receptorból, de ez alkalommal inkomplett Freund-féle adjuváns jelenlétében. Az utolsó injekció után 15 nappal az állatokból szé10 rumot gyűjtünk, és komplementmentesitjük, majd 0,45 pm-es pórusméretű membránon szűrjük át.
Az egyes antiszérumokból, az anti-2394-es receptorból és az anti-2169-es receptorból hígítási sort készítünk Ml99 táptalajban (Gibco). Az egyes hígításokból 15 200-200 pl-t egy mikrotiterlemez lukaiba teszünk (20,3 χ 30,5 cm). Egy kontrollvizsgálatot is elvégzünk 200 pl Ml99 táptalajjal. Mindegyik lukhoz hozzáadunk (i) 100 pl-t egy Neisseria meningitidis exponenciális növekedési fázisban levő tenyészetéből, Muel20 ler-Hinton táptalajban, amelyet 30 pmol/l EDTAval egészítettünk ki, és (ii) 100 pl komplementet (fiatal nyúl széruma, hígítva).
Miután 30 percig hígítottuk 37 °C-on óvatos rázatás közben, 1 ml Mueller-Hinton táptalajt adunk mindegyik lukhoz, amely 1 ml Noble-agart tartalmaz túlhűtött állapotban. A táptalaj megszilárdulása után az inkubálást 37 °C-on végezzük 18-24 óráig; az egyes lukakban megjelenő telepképző egységek számát kiértékel30 jük. Az antiszérum azon hígításának a reciproka, amelynek jelenlétében 50%-os a lízis a kontrolihoz viszonyítva, felel meg a baktericid titemek. Az eredményeket az alábbi táblázatban mutatjuk be.
Az anti-Tbp2 2394 és az anti-Tbp2 2169 antiszérumok baktericid aktivitása
Neisseria meningitidis Baktericid aktivitás
Törzs Szerocso- port/típus/altípus Anti-Tbp2 2394 szérumimmunizálás Anti-Tbp2 2169 szérumimmunizálás
előtt után előtt után
2394 B, 2a, P1.2 <8 512 - -
2169 B, 9, Pl.9 - - <8 128
Az antiszérum baktericid hatással rendelkezik arra a törzsre nézve, amelyből a Tbp2-t tisztítottuk, igazolva 50 ezzel azt, hogy az indukált anti-Tbp2 antitestek működőképesek, és megvan a kapacitásuk, hogy a baktériumot lizálják a komplement jelenlétében.
6. példa
Vakcinális gyógyászati készítmény a Neisseria meningitidis-fertőzések megelőzésére A 3. és 4. példa szerint előállított steril oldatokat megolvasztjuk. Abból a célból, hogy egy liter olyan vakcinát állítsunk elő, amely 200 pg-ot tartalmaz az 60 egyes aktív adalékanyagokból, az alábbi oldatokat keverjük össze steril körülmények között:
- A 2394-es (vagy 2169-es) receptor Tbp2 alegységét tartalmazó oldata 1 mg/ml koncentrációban, C pufferben 200 ml
- Puffereit fiziológiás sóoldat (PBS), pH=6,0 300 ml
- Alumínium-hidroxid, 10 mg/ml AL+++-iont tartalmaz milliliterenként 50 ml
- Merthiolát, 1% (tömeg/térfogat)
PBS-ben 10 ml
- PBS szükség szerint 1000 ml
HU 219 762 Β
7. példa - A 2169-es receptor Tbp2 alegységét
Vakcinális gyógyászati készítmények a Neisseria tartalmazó oldata 1 mg/ml meningitidis-fertőzések megakadályozására koncentrációban, Cpufferben 100 ml
A 3. és 4. példa szerint előállított steril oldatokat - Puffereit fiziológiás sóoldat (PBS), megolvasztjuk abból a célból, hogy egy liter olyan vak- 5 pH=6,0 300 ml cinát állítsunk elő, amely 100 pg-ot tartalmaz az egyes - Alumínium-hidroxid, 10 mg/ml aktív adalékanyagokból, az alábbi oldatokat keverjük AL+++-iont tartalmaz milliliterenként 50 ml össze steril körülmények között: - Merthiolát, 1% (tömeg/térfogat)
- A 2394-es receptor Tbp2 alegységét tartalmazó PBS-ben 10 ml oldata 1 mg/ml koncentrációban, 10 - PBS szükség szerint 1000 ml
Cpufferben 100 ml A továbbiakban bemutatjuk a szekvenciákat.
SEQIDNO: 1
Subject: Amino acid sequence of the N. meningitidis 2394 subunit Tbp2.
Cys 1 Leu Gly Gly Gly 5 Gly Ser Ph e As p Leu 10 As p Ser Val Glu Thr 15
Va 1 Gin Asp Me t Hi s Ser Ly s Pro Lys Tyr Gl u As p Glu Ly s Ser
20 25 30
Gin Pro Glu Ser Gin Gin Asp Va 1 Ser Glu Asn Ser Gly Al a Alá
35 40 45
Tyr Gly Phe Al a Val Ly s Leu Pro Arg Arg Asn Al a Hi s Phe Asn
50 55 60
Pro Lys Tyr Lys Glu Lys Hi s Ly s Pro Leu Gly Ser Me t As p Trp
65 70 75
Lys Lys Leu Gin Arg Gly Glu Pro Asn Ser Phe Ser Glu Arg As p
80 85 90
Glu Leu Glu Ly s Ly s Arg Gly Ser Ser Glu Leu Ile Glu Ser Lys
95 100 105
Trp Gl u Asp Gly Gin Ser Arg Va 1 Val Gly Tyr Thr Asn Phe Thr
110 115 120
Tyr Va 1 Arg Ser Gly Tyr Va 1 Tyr Leu Asn Ly s Asn Asn Ile Asp
125 130 135
Ile Ly s Asn Asn Ile Va 1 Leu Phe Gly Pro As p Gl y Tyr Le u Tyr
140 145 150
Tyr Ly s Gly Ly s Glu Pro Ser Ly s Glu Leu Pro Ser Glu Ly s I le
155 160 165
Thr Tyr Lys Gly Thr Trp As p Tyr Va 1 Thr Asp Al a Me t Glu Ly s
170 175 180
Gin Arg Phe Glu Gly Leu Gly Ser Al a Al a Gly Gly Asp Ly s Ser
185 190 195
Gly Al a Leu Ser Alá Leu Glu Gl u Gly Va 1 Leu Arg Asn Gin Al a
200 205 210
Glu Al a Ser Ser Gly Hi s Thr As p Phe Gly Me t Thr Ser Glu Phe
215 220 225
Glu Val As p Phe Ser Asp Ly s Thr Ile Lys Gly Thr Leu Tyr Arg
230 235 240
Asn Asn Arg Ile Thr Gin Asn As n Ser Glu As n Lys Gin Ile Lys
245 250 255
Thr Thr Arg Tyr Thr Ile Gin Al a Thr Leu Hi s Gly Asn Arg Phe
260 265 270
Lys Gly Ly s Al a Leu Al a Al a As p Ly s Gly Alá Thr As n Gly Ser
275 280 285
Hi s Pro Phe Ile Ser Asp Ser As p Ser Leu Glu Gly Gly Phe Tyr
290 295 300
Gly Pro Lys Gly Glu Glu Leu Al a Gly Ly s Phe Leu Ser Asn As p
305 310 315
Asn Ly s Val Al a Al a Val Phe Gly Alá Lys Gin Lys Asp Lys Lys
320 325 330
Asp Gly Glu Asn Al a Alá Gly Pro Al a Thr Glu Thr Val Ile Asp
335 340 345
HU 219 762 Β
Al a Tyr Arg I le Thr 350 Gly Glu Glu Phe Ly s 355 Ly s Glu Gin I le Asp 360
Ser Phe Gly Asp Val Lys Ly s Leu Leu Val As p Gly Val Glu Leu
365 370 375
Ser Leu Leu Pro Ser Glu Gly As n Lys Al a Al a Phe Gin Hi s Glu
380 385 390
I le Glu Gin Asn Gly Val Lys Al a Thr Va 1 Cy s Cys Ser As n Leu
395 400 405
Asp Tyr Me t Ser Phe Gly Lys Leu Ser Ly s Glu Asn Ly s As p As p
410 415 420
Me t Ph e Leu Gin Gly Val Arg Thr Pro Val Ser As p Val Al a Al a
425 430 435
Arg Thr Glu Al a Ly s Tyr Arg Gly Thr Gly Thr Trp Tyr Gly Tyr
440 445 450
I le Al a Asn Gly Thr Ser Trp Ser Gly Glu Al a Ser Asn Gin Glu
455 460 465
Gly Gly Asn Arg Al a Glu Phe As p Val As p Phe Ser Thr Lys Lys
470 475 480
I le Ser Gly Thr Leu Thr Al a Lys Asp Arg Thr Ser Pro Al a Phe
485 490 495
Thr I le Thr Al a Me t I le Ly s Asp Asn Gly Phe Ser Gly Va 1 Al a
500 505 510
Lys Thr Gly Glu Asn Gly Phe Al a Leu Asp Pro Gin Asn Thr Gly
515 520 525
As n Ser Hi s Tyr Thr Hi s I le Glu Al a Thr Va 1 Ser Gly Gly Phe
530 535 540
Tyr Gly Ly s Asn Al a I le Glu Me t Gly Gly Ser Phe Ser Phe Pro
545 550 555
Gly As n Al a Pro Glu Gly Ly s Gin Glu Lys Al a Ser Va 1 Va 1 Phe
560 565 570
Gly Al a Lys Arg Gin Gin Leu Va 1 Gin
575
SEQIDNO: 2
Subject: Amino acid sequence of the N. meningitidis 2169 subunit Tbp2
Cys 1 Leu Gly Gly Gly 5 Gly Ser Phe As p Leu 10
Asp Ser Val As p Thr Glu Al a Pro Arg Pro Al a Pro Lys Tyr Gin
15 20 25
Asp Va 1 Ser Ser Glu Lys Pro Gin Al a Gin Ly s As p Gin Gly Gly
30 35 40
Tyr Gly Phe Al a Me t Arg Leu Ly s Arg Arg Asn Trp Tyr Pro Gly
45 50 55
Al a Glu Glu Ser Glu Val Ly s Leu Asn Glu Ser As p Trp Glu Al a
60 65 70
Thr Gly Leu Pro Thr Lys Pro Ly s Glu Leu Pro Lys Arg Gin Lys
75 80 85
Ser Val I le Glu Ly s Val Glu Thr As p Gly As p Ser Asp I le Tyr
90 95 100
Ser Ser Pro Tyr Leu Thr Pro Ser Asn Hi s Gin Asn Gly Ser Alá
105 110 115
Gly Asn Gly Val Asn Gin Pro Ly s Asn Gin Al a Thr Gly Hi s Glu
120 125 130
Asn Phe Gin Tyr Val Tyr Ser Gly Trp Phe Tyr Ly s Hi s Al a Al a
135 140 145
Se r Glu Ly s Asp Phe Ser Asn Lys Lys I le Lys Ser Gl y As p Asp
150 155 160
Gly Tyr I le Phe Tyr Hi s Gly Glu Ly s Pro Ser Arg Gin Leu Pro
165 170 175
Al a Ser Gly Ly s Va 1 I le Tyr Ly s Gly Val Trp Hi s Phe Va 1 Thr
180 185 190
HU 219 762 Β
Asp Thr Ly s Lys Gly Gin 195 Asp Phe Arg Glu 200 Ile Ile Gin Pro Ser 205
Lys Ly s Gin Gly As p Arg Tyr Ser Gly Phe Ser Gly As p Gly Ser
210 215 220
Glu Glu Tyr Ser Asn Ly s Asn Glu Ser Thr Le u Ly s Asp As p Hi s
225 230 235
Glu Gly Tyr Gly Phe Thr Ser As n Leu Glu Va 1 As p Phe Gly Asn
240 245 250
Lys Lys Leu Thr Gly Lys Leu Ile Arg As n As n Al a Ser Leu Asn
255 260 265
Asn As n Thr Asn As n Asp Ly s Hi s Thr Thr Gin Tyr Tyr Ser Leu
270 275 280
Asp Al a Gin Ile Thr Gly Asn Arg Phe Asn Gly Thr Al a Thr Al a
285 290 295
Thr As p Lys Lys Glu Asn Glu Thr Ly s Leu Hi s Pro Phe Va 1 Ser
300 305 310
Asp Ser Ser Ser Leu Ser Gly Gly Phe Phe Gly Pro Gin Gly Glu
315 320 325
Glu Leu Gly Phe Arg Phe Leu Ser Asp Asp Gin Lys Val Al a Val
330 335 340
Val Gly Ser Al a Ly s Thr Lys As p Lys Leu Glu Asn Gly Al a Al a
345 350 355
Al a Ser Gly Ser Thr Gly Al a Al a Al a Ser G1 y Gly Al a Al a Gly
360 365 370
Thr Se r Ser Glu As n Ser Lys Leu Thr Thr Va 1 Leu Asp Al a Val
375 380 385
Glu Leu Thr Leu Asn Asp Lys Ly s Ile Ly s As n Leu Asp Asn Phe
390 395 400
Ser Asn Alá Alá Gin Leu Val Val Asp Gly Ile Me t Ile Pro Leu
405 410 415
Leu Pro Lys Asp Ser Glu Ser Gly Asn Thr Gin Alá As p Ly s Gly
420 425 430
Lys As n Gly Gly Thr Glu Phe Thr Arg Lys Phe Glu Hi s Thr Pro
435 440 445
Glu Ser Asp Lys Ly s As p Al a Gin Al a Gly Thr Gin Thr Asn Gly
450 455 460
Al a Gin Thr Al a Ser Asn Thr Al a Gly As p Thr Asn Gly Ly s Thr
465 470 475
Lys Thr Tyr Glu Va 1 Glu Val Cy s Cys Ser Asn Leu Asn Tyr Leu
480 485 490
Ly s Tyr Gly Me t Le u Thr Arg Ly s Asn Ser Ly s Ser Al a Me t Gin
495 500 505
Al a Gly Gly Asn Ser Ser Gin Al a As p Al a Ly s Thr Glu Gin Val
510 515 520
Glu Gin Ser Me t Phe Leu Gin Gly Glu Arg Thr As p G1 u Ly s Glu
525 530 535
Ile Pro Thr Asp Gin Asn Val Val Tyr Arg Gly Ser Trp Tyr Gly
540 545 550
Hi s Ile Al a Asn Gly Thr Ser Trp Ser Gly Asn Alá Ser Asp Lys
555 560 565
G1 u Gly Gly Asn Arg Al a Glu Phe Thr Val As n Phe Al a As p Lys
570 575 580
Ly s Ile Thr Gly Ly s Leu Thr Al a Glu Asn Arg Gin Al a Gin Thr
585 590 595
Phe Thr Ile Glu Gly Me t Ile G1 n Gly Asn Gly Phe Glu Gly Thr
600 605 610
Al a Ly s Thr Al a Glu Ser Gly Phe Asp Leu As p Gin Ly s As n Thr
615 620 625
Thr Arg Thr Pro Ly s Al a Tyr Ile Thr Asp Al a Ly s Va 1 Ly s Gly
630 635 640
HU 219 762 Β
Gly Phe Tyr Gly Pro Ly s 645 Al a Glu Glu Leu 650 Gly Gly Trp Phe Al a 655
Tyr Pro Gly Asp Ly s Gin Thr Glu Lys Al a Thr Al a Thr Ser Ser
660 665 670
As p Gly Asn Ser Al a Ser Ser Al a Thr Val Va 1 Phe Gly Al a Lys
675 680 685
Arg Gin Gin Pro Val Gin
690
SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims (18)

1. Egy Neisseria meningitidis törzs humántranszferrin-receptorának nagyobb molekulatömegű alegységétől mentes kisebb molekulatömegű alegysége, az alegység immunológiai sajátságait megtartó, annak aminosavszekvenciájából fragmentálással származtatott szekvenciájú peptid vagy az alegység olyan immunológiai sajátságait megtartó analógja, melynek aminosavszekvenciája legalább 80%-ban homológ az alegység aminosavszekvenciájával, azzal jellemezve, hogy tisztított formában lett előállítva.
2. Az 1. igénypont szerinti alegység, azzal jellemezve, hogy B szerocsoportba tartozó Neisseria meningitidis törzsből származik.
3. Az 1. igénypont szerinti alegység, azzal jellemezve, hogy molekulatömege mintegy 65-74 kD.
4. Az 1. igénypont szerinti alegység, azzal jellemezve, hogy a 2394-es számú Neisseria meningitidis törzsbői származik és aminosavszekvenciája SEQ. ID. NO.
1 szerinti.
5. Az 1. igénypont szerinti alegység, azzal jellemezve, hogy molekulatömege mintegy 75-90 kD.
6. Az 1. igénypont szerinti alegység, azzal jellemezve, hogy a 2169-es számú Neisseria meningitidis törzsből származik és aminosavszekvenciája SEQ. ID. NO.
2 szerinti.
7. Vakcinális gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként legalább egy Neisseria meningitidis törzs humántranszferrin-receptorának kisebb molekulatömegű alegységét, az alegység aminosavszekvenciájából fragmentálással származtatott szekvenciájú peptidet vagy az alegységnek egy aminosavszekvencia vonatkozásában legalább 80%-ban homológ analógját ^5 tartalmazza, a receptor nagy molekulatömegű alegységének távollétében.
8. A 7. igénypont szerinti vakcinális gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként legalább egy Neisseria meningitidis törzs humántranszferrin-receptorának kisebb molekulatömegű alegységét tartalmazza.
9. A 8. igénypont szerinti vakcinális gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként legalább egy, B szerocsoportba tartozó Neisseria meningitidis törzs humántranszferrin-receptorának kisebb molekulatömegű alegységét tartalmazza.
10. A 8. igénypont szerinti vakcinális gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként egy Neisseria meningitidis törzs humántranszferrin-recep- θθ torának mintegy 65-74 kD molekulatömegű kisebb alegységét tartalmazza.
11. A 10. igénypont szerinti vakcinális gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként a 2394-es számú Neisseria meningitidis törzs humántranszferrin-receptorának kisebb molekulatömegű alegységét tartalmazza, melynek aminosavszekvenciája SEQ. ID. NO. 1 szerinti.
12. A 8. igénypont szerinti vakcinális gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként egy Neisseria meningitidis törzs humántranszferrin-receptorának mintegy 75-90 kD molekulatömegű kisebb alegységét tartalmazza.
13. A 12. igénypont szerinti vakcinális gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként a 2169-es számú Neisseria meningitidis törzs humántranszferrin-receptorának kisebb molekulatömegű alegységét tartalmazza, melynek aminosavszekvenciája SEQ. ID. NO. 2 szerinti.
14. Gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként az alábbiakat tartalmazza:
i) egy első Neisseria meningitidis törzs humántranszferrin-receptorának egy első kisebb, mintegy 65-74 kD molekulatömegű alegységét; és ii) egy második Neisseria meningitidis törzs humántranszferrin-receptorának egy második kisebb, mintegy 75-90 kD molekulatömegű alegységét, az első és második Neisseria meningitidis törzs említett receptora nagy molekulatömegű alegységeinek távollétében.
15. A 14. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként az alábbiakat tartalmazza:
i) a Neisseria meningitidis 2394 humántranszferrin-receptora SEQ. ID. NO. 1 szerinti aminosavszekvenciájú kisebb molekulatömegű alegységét; és ii) a Neisseria meningitidis 2169 humántranszferrin-receptora SEQ. ID. NO. 2 szerinti aminosavszekvenciájú kisebb molekulatömegű alegységét;
a 2394-es és 2169-es számú Neisseria meningitidis törzsek nagy molekulatömegű alegységeinek távollétében.
16. Eljárás egy Neisseria meningitidis törzs humántranszferrin-receptorának nagyobb molekulatömegű alegységétől mentes kisebb molekulatömegű alegysége, az alegység immunológiai sajátságait megtartó, annak aminosavszekvenciájából fragmentálással származtatott, szekvenciájú peptid vagy az alegységnek egy aminosavszekvencia vonatkozásában legalább 80%-ban homológ,
HU 219 762 Β immunológiai sajátságait megtartó analógja előállítására tisztított formában, azzal jellemezve, hogy az alegységet, pepiidet vagy analógot természetes forrásából izoláljuk, vagy az alegység, pepiid vagy analóg aminosavszekvenciáját kódoló nukleinsavmolekulát expresszáltatunk és az alegységet, peptidet vagy analógot izoláljuk.
17. Eljárás hatóanyagként legalább egy Neisseria meningitidis törzs humántranszferrin-receptorának kisebb molekulatömegű alegységét, az alegység aminosavszekvenciájából fragmentálással származtatott szekvenciájú peptidet vagy az alegységnek egy aminosavszekvencia vonatkozásában legalább 80%-ban homológ analógját tartalmazó vakcinális gyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy a hatóanyagot a receptor nagy molekulatömegű alegységének távollétében gyógyászatilag elfogadható hordozó és/vagy egyéb segédanyagokkal elegyítjük.
18. Eljárás hatóanyagként
i) egy első Neisseria meningitidis törzs humántranszferrin-receptorának egy első kisebb, mintegy 65-74 kD molekulatömegű alegységét; és ii) egy második Neisseria meningitidis törzs humántranszferrin-receptorának egy második kisebb, mintegy 75-90 kD molekulatömegű alegységét tartalmazó gyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy a hatóanyagot az első és második Neisseria meningitidis törzs említett receptora nagy molekulatömegű alegységeinek távollétében gyógyászatilag elfogadható hordozó- és/vagy egyéb segédanyagokkal elegyítjük.
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest
HU9301631A 1991-10-03 1992-09-29 Neisseria meningitidis fertőzések elleni alegység vakcina és a megfelelő tisztított alegységek HU219762B (hu)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9112176A FR2682114B1 (fr) 1991-10-03 1991-10-03 Vaccin de sous-unite contre les infections a neisseria meningitidis et sous-unites correspondantes a l'etat purifie.
PCT/FR1992/000904 WO1993007172A1 (fr) 1991-10-03 1992-09-29 Vaccin de sous-unite contre les infections a neisseriameningitidis et sous-unites correspondantes a l'etat purifie

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9301631D0 HU9301631D0 (en) 1993-10-28
HUT69929A HUT69929A (en) 1995-09-28
HU219762B true HU219762B (hu) 2001-07-30

Family

ID=9417548

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9301631A HU219762B (hu) 1991-10-03 1992-09-29 Neisseria meningitidis fertőzések elleni alegység vakcina és a megfelelő tisztított alegységek

Country Status (15)

Country Link
US (2) US5618540A (hu)
EP (1) EP0560969B1 (hu)
JP (1) JPH06503364A (hu)
AT (1) ATE174930T1 (hu)
AU (1) AU668522B2 (hu)
CA (1) CA2096411A1 (hu)
DE (1) DE69227984T2 (hu)
DK (1) DK0560969T3 (hu)
ES (1) ES2128358T3 (hu)
FI (1) FI107262B (hu)
FR (1) FR2682114B1 (hu)
GR (1) GR3029580T3 (hu)
HU (1) HU219762B (hu)
NO (1) NO309865B1 (hu)
WO (1) WO1993007172A1 (hu)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2692592B1 (fr) * 1992-06-19 1995-03-31 Pasteur Merieux Serums Vacc Fragments d'ADN codant pour les sous-unités du récepteur de la transferrine de Neisseria meningitidis et procédés les exprimant.
US5928647A (en) * 1993-01-11 1999-07-27 Dana-Farber Cancer Institute Inducing cytotoxic T lymphocyte responses
AU705998B2 (en) * 1993-11-08 1999-06-03 Connaught Laboratories Limited Haemophilus transferrin receptor genes
FR2720408B1 (fr) * 1994-05-31 1996-08-14 Pasteur Merieux Serums Vacc Fragments Tbp2 de Neisseria meningitidis.
US6290970B1 (en) * 1995-10-11 2001-09-18 Aventis Pasteur Limited Transferrin receptor protein of Moraxella
FR2785293B1 (fr) * 1998-10-30 2002-07-05 Pasteur Merieux Serums Vacc Acides nucleiques et polypeptides specifiques des souches pathogenes du genre neisseria
AU2107400A (en) * 1999-01-15 2000-08-01 Smithkline Beecham Biologicals (Sa) Neisseria meningitidis antigen
NZ597007A (en) 2009-05-14 2013-09-27 Sanofi Pasteur Meningococcus vaccine containing lipooligosaccharide (los) from modified strains of l6 immunotype neisseria meningitidis
AU2010288240B2 (en) * 2009-08-27 2014-03-27 Novartis Ag Hybrid polypeptides including meningococcal fHBP sequences
JP2016539950A (ja) 2013-12-02 2016-12-22 ビー. シュライバーズ,アンソニー 細菌表面受容体タンパク質由来の免疫原性組成物およびワクチン

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5141743A (en) * 1989-04-27 1992-08-25 University Technologies International, Inc. Method for isolating and purifying transferrin and lactoferrin receptor proteins and vaccines containing the same
US5292869A (en) * 1989-04-27 1994-03-08 The Board Of Governors Of The University Method for isolating and purifying transferrin and lactoferrin receptor proteins from bacteria and the preparation of vaccines containing the same
WO1992003467A1 (en) * 1990-08-23 1992-03-05 The University Of North Carolina Of Chapel Hill Transferrin binding proteins from neisseria gonorrhoeae and neisseria meningitidis
FR2682041B1 (fr) * 1991-10-03 1994-01-14 Pasteur Merieux Serums Vaccins Vaccin contre les infections a neisseria meningitidis.

Also Published As

Publication number Publication date
DE69227984D1 (de) 1999-02-04
FI932490A0 (fi) 1993-06-01
NO932009D0 (no) 1993-06-02
FI932490A (fi) 1993-06-01
DE69227984T2 (de) 1999-05-12
FR2682114A1 (fr) 1993-04-09
FI107262B (fi) 2001-06-29
CA2096411A1 (en) 1993-04-04
AU2764092A (en) 1993-05-03
AU668522B2 (en) 1996-05-09
ES2128358T3 (es) 1999-05-16
US5928650A (en) 1999-07-27
ATE174930T1 (de) 1999-01-15
NO309865B1 (no) 2001-04-09
US5618540A (en) 1997-04-08
FR2682114B1 (fr) 1996-02-23
GR3029580T3 (en) 1999-06-30
HU9301631D0 (en) 1993-10-28
WO1993007172A1 (fr) 1993-04-15
EP0560969B1 (fr) 1998-12-23
NO932009L (no) 1993-07-20
DK0560969T3 (da) 1999-08-23
JPH06503364A (ja) 1994-04-14
EP0560969A1 (fr) 1993-09-22
HUT69929A (en) 1995-09-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU662176B2 (en) Vaccine for Neisseria Meningitidis infections
JP2907552B2 (ja) ヘモフィルス外膜タンパク質
JPH10504717A (ja) 肺炎双球菌感染症に対する免疫化のための肺炎双球菌多糖−組み換えニューモリシン結合体ワクチン類
CA2167677A1 (en) Method for the high level expression, purification and refolding of the outer membrane group b porin proteins from neisseria meningitidis
KR100293025B1 (ko) 고나도트로핀방출호르몬에대한면역원성캐리어시스템
KR20010089280A (ko) 스트렙토코쿠스 뉴모니애로부터의 인간 보체 c3 분해폴리펩티드
JPH09506247A (ja) ヘモフィリス属菌株トランスフェリン受容体遺伝子
US4285931A (en) E. coli enterotoxin vaccine for veterinary and human use
US4220584A (en) E. coli enterotoxin vaccine for veterinary and human use
US7902349B2 (en) Nucleic acids encoding protective epitopes of adenyl cyclase-haemolysin (AC-Hly)
HU219762B (hu) Neisseria meningitidis fertőzések elleni alegység vakcina és a megfelelő tisztított alegységek
US6268171B1 (en) Recombinant PilC proteins, methods for producing them and their use
JP3236610B2 (ja) 豚胸膜肺炎用ワクチン
US5352450A (en) Method for preparing vaccine for dental caries and vaccinal compositions for dental caries used as nasal drop
KR20190110090A (ko) 폐렴구균 표면 단백질 a의 선택된 알파 나선 도메인 및 프롤린 풍부 도메인을 조합한 폐렴구균 백신
US5176910A (en) Treponema hyodysenteriae hemolysin and uses therefor
JPH09500537A (ja) B型インフルエンザウイルス由来のタンパク質p2の発現および精製方法
JP4749641B2 (ja) ワクチン用の肺炎球菌タンパク質の相同体および断片
Chen et al. A nontoxic Pseudomonas exotoxin A induces active immunity and passive protective antibody against Pseudomonas exotoxin A intoxication
JP2002523521A (ja) ワクチン抗原としてのスーパーオキシドジスムターゼ
KR100382239B1 (ko) 황색 포도상 구균의 변이 독소 에스이씨-에스이알, 그것의발현벡터 및 숙주세포, 그 생산방법 및 백신제조방법
JP3169379B2 (ja) ブタのヘモフィロシス予防ワクチン
JP3140776B2 (ja) 無細胞ワクチン
JP2002511490A (ja) モラキセラ(moraxella)のトランスフェリン受容体遺伝子
CA2081950A1 (en) Vaccine for the prevention of infections caused by pasteurella haemolytica

Legal Events

Date Code Title Description
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee