JPS6047245B2 - グラム陰性菌溶菌剤 - Google Patents
グラム陰性菌溶菌剤Info
- Publication number
- JPS6047245B2 JPS6047245B2 JP54003731A JP373179A JPS6047245B2 JP S6047245 B2 JPS6047245 B2 JP S6047245B2 JP 54003731 A JP54003731 A JP 54003731A JP 373179 A JP373179 A JP 373179A JP S6047245 B2 JPS6047245 B2 JP S6047245B2
- Authority
- JP
- Japan
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- gram
- permetin
- negative
- negaricin
- bacteria
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
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-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はバチルス属の細菌によつて生産される酵素ネガ
リン及び新規環状アシルペプチド系抗生物質パーメチン
Ａからなるグラム陰性菌溶菌剤に関する。
リン及び新規環状アシルペプチド系抗生物質パーメチン
Ａからなるグラム陰性菌溶菌剤に関する。
近時、細菌を工業的に大量培養し、その菌体より蛋白質
を分離して飼料又は食料として利用する試みが行われて
いる。
を分離して飼料又は食料として利用する試みが行われて
いる。
この目的で培養される細菌としては、シュードモナス属
をはじめとするグラム陰性細菌が多く利用されており、
これら細菌菌体から蛋白質を簡便に抽出する技術の開発
が強く望まれている。一方、医療や飼料分野に於ては、
各種有害微生物を防除する目的で、いろいろの抗生物質
が広く利用されているが、グラム陰性細菌の防除に関し
ては必ずしも充分な成果が上つているとはいえない。特
に、院内感染菌として問題となつている縁膿菌や腸内細
菌群については満足すべき防除法がなく、有効な防除法
の開発が強く望まれている。
をはじめとするグラム陰性細菌が多く利用されており、
これら細菌菌体から蛋白質を簡便に抽出する技術の開発
が強く望まれている。一方、医療や飼料分野に於ては、
各種有害微生物を防除する目的で、いろいろの抗生物質
が広く利用されているが、グラム陰性細菌の防除に関し
ては必ずしも充分な成果が上つているとはいえない。特
に、院内感染菌として問題となつている縁膿菌や腸内細
菌群については満足すべき防除法がなく、有効な防除法
の開発が強く望まれている。
また、家畜の病気の原因菌としてグラム陰性菌第１表溶
菌咋用の最適ｐＨ ｐＨ安定性 の占める割合は多いいが、これらの細菌による病気を予
防し、家畜の生長を助長する目的の飼料添加物に対する
要望も大きい。
菌咋用の最適ｐＨ ｐＨ安定性 の占める割合は多いいが、これらの細菌による病気を予
防し、家畜の生長を助長する目的の飼料添加物に対する
要望も大きい。
このような事情に鑑み、本発明者らは簡便で有効なりラ
ム陰性菌の防除法を開発すべく鋭意研究を重ねた結果、
バチルス属の細菌によつて生産されるグラム陰性細菌溶
解能を潜在的に有する酵素ネガリシンと新規環状アシル
ペプチド系抗生物質パーメチンＡとはグラム陰性菌に対
して相乗的に作用し、これを溶解せしめることを発見し
、本発明を完成するに至つた。
ム陰性菌の防除法を開発すべく鋭意研究を重ねた結果、
バチルス属の細菌によつて生産されるグラム陰性細菌溶
解能を潜在的に有する酵素ネガリシンと新規環状アシル
ペプチド系抗生物質パーメチンＡとはグラム陰性菌に対
して相乗的に作用し、これを溶解せしめることを発見し
、本発明を完成するに至つた。
本発明のグラム陰性菌溶解剤はグラム陰性菌の生菌体に
温和な生理条件下て作用し、これを容易に溶菌するもの
で、種々の有害なグラム陰性菌の・汚染に起因する人や
家畜の病気の治療・予防に大いに役立つものであり、又
食品衛生の分野でも利用されるものである。
温和な生理条件下て作用し、これを容易に溶菌するもの
で、種々の有害なグラム陰性菌の・汚染に起因する人や
家畜の病気の治療・予防に大いに役立つものであり、又
食品衛生の分野でも利用されるものである。
本発明のネガリシンは、環状アシルペプタイド系抗生物
質パーメチンＡの存在下で、グラム陰性フ細菌の生菌体
を溶解する酵素で、現在ネガリシンＩ及びネガリシン■
の２種類が知られており、その理化学的性質は第１表に
示すとおりである。
質パーメチンＡの存在下で、グラム陰性フ細菌の生菌体
を溶解する酵素で、現在ネガリシンＩ及びネガリシン■
の２種類が知られており、その理化学的性質は第１表に
示すとおりである。
ガリシンの理学的性質酵素名
、大ガリシンＩ ネガリシンΠ
８・５８．５
４．０・、６．０４．０〜６．０
第１表は、ネガリシンのパーメチンＡ共存下でのシュー
ドモナス エルギノーサ（ＰｓｅｕｄＯｍＯｎａｓａｅ
ｒｕｇｉｎＯｓａ）の生菌体に対する溶菌作用の最適Ｐ
Ｈ．ＰＨ安定性、及び温度安定性を示すもので第１表中
の値は夫々次のようにして測定した時の値てある。
ドモナス エルギノーサ（ＰｓｅｕｄＯｍＯｎａｓａｅ
ｒｕｇｉｎＯｓａ）の生菌体に対する溶菌作用の最適Ｐ
Ｈ．ＰＨ安定性、及び温度安定性を示すもので第１表中
の値は夫々次のようにして測定した時の値てある。
最適ＰＨ：マツクルベイン広域緩衝液（イオン強度 ０
．０５．ＰＨ２〜８）又はホウ酸緩衝液（ＰＨ７．Ｏ〜
１１．０）にＰｓ．ａｅｒｕｇｉｎＯｓａＡＴＣＣｌＯ
ｌ４５の生菌体を懸濁し、６６０ｎＭに於け る吸光
度が０．８の菌体懸濁液を作り、こ の懸濁液２．０
ｍ１に酵素１呼位及びパーメ チンＡＯ．ｌｍ９を加
え３７℃で１０分間酵素 反応を作り、吸光度の減少
率を測定す る。
．０５．ＰＨ２〜８）又はホウ酸緩衝液（ＰＨ７．Ｏ〜
１１．０）にＰｓ．ａｅｒｕｇｉｎＯｓａＡＴＣＣｌＯ
ｌ４５の生菌体を懸濁し、６６０ｎＭに於け る吸光
度が０．８の菌体懸濁液を作り、こ の懸濁液２．０
ｍ１に酵素１呼位及びパーメ チンＡＯ．ｌｍ９を加
え３７℃で１０分間酵素 反応を作り、吸光度の減少
率を測定す る。
安定ＰＨ：上記緩衝液中に３弾位の酵素を加え３ｒｃ１
詩間保温後ＰＨ７．Ｏのリン酸緩衝液（イ． オン強
度０．１）で３倍に希釈後最適ＰＨと 同様操作で残
存活性を測定した。
詩間保温後ＰＨ７．Ｏのリン酸緩衝液（イ． オン強
度０．１）で３倍に希釈後最適ＰＨと 同様操作で残
存活性を測定した。
分子量：セフアデツクスＧ−７５カラム（１．５×９０
ｃｒｒ１）を０．０１Ｍ醋酸緩衝液で平衡化（ＰＨ５。
ｃｒｒ１）を０．０１Ｍ醋酸緩衝液で平衡化（ＰＨ５。
Ｏ）し標準蛋白質及ひ本酵素を上昇法５ で流し各々
の溶出位置より分子量を算出 した。等電点：電点の
測定はＵｅｓｔｅｒｂｅｒｇらの方法に 従い、１１
０ｍＬの電気泳動カラムを用いた 焦点電気泳動を行
つて決定した。
の溶出位置より分子量を算出 した。等電点：電点の
測定はＵｅｓｔｅｒｂｅｒｇらの方法に 従い、１１
０ｍＬの電気泳動カラムを用いた 焦点電気泳動を行
つて決定した。
ＰＨ９〜４１１のＡｍｐｈＯｌｌｎｅ（ＬＫＢ−ＰｒＯ
ｄｕｋｔｅｒＡＢ）を使用し、シユークロースで密接
勾配を作成し、７℃で７００Ｖ１４８時間泳 動し
て測定する。
ｄｕｋｔｅｒＡＢ）を使用し、シユークロースで密接
勾配を作成し、７℃で７００Ｖ１４８時間泳 動し
て測定する。
ネガリシンは単独ではグラム陰性菌の生菌体を５溶解す
る能力はないが、後述するパーメチンＡが共存すると相
乗的にグラム陰性菌の生菌体を速やかに溶解する酵素で
ある。
る能力はないが、後述するパーメチンＡが共存すると相
乗的にグラム陰性菌の生菌体を速やかに溶解する酵素で
ある。
しかしながら、ネガリシンはパーメチンＡが共存しても
グラム陰性菌には全く作用せず、この点に於いて里村（
農化誌）３１．２８１（１９５７）、岡田ら（農化誌３
４、１２８、１９６０）又は根本ら（農化誌３８１０９
１９６４）の酵素とは明らかに異なる。ネガリシンの製
造法については、バチルス属に属し、ネガリシン生産能
を有する微生物、例えばバチルス・ズブチリスＡＪ３４
４９ＦＥＲＭ−Ｐｌ９６２を通常の栄養培地で培養する
ことにより、ネガリシンＩ，■は同時に培養液中に生産
畜積される。
グラム陰性菌には全く作用せず、この点に於いて里村（
農化誌）３１．２８１（１９５７）、岡田ら（農化誌３
４、１２８、１９６０）又は根本ら（農化誌３８１０９
１９６４）の酵素とは明らかに異なる。ネガリシンの製
造法については、バチルス属に属し、ネガリシン生産能
を有する微生物、例えばバチルス・ズブチリスＡＪ３４
４９ＦＥＲＭ−Ｐｌ９６２を通常の栄養培地で培養する
ことにより、ネガリシンＩ，■は同時に培養液中に生産
畜積される。
培養液からのネガリシンの単離・精製は、アンパーライ
トＩＲＣ−５０等の弱酸性陽イオン交換樹脂、もしくは
ＳＰ−セフアデツクスＣ−２時強酸性イオン交換セフア
デツクス等によるイオン交換クロマトグラフィー、又は
セフアデツクスＧ−７＼Ｇ−１０蒔によるゲル濾過等を
適宜組合わせることによつて行われる。
トＩＲＣ−５０等の弱酸性陽イオン交換樹脂、もしくは
ＳＰ−セフアデツクスＣ−２時強酸性イオン交換セフア
デツクス等によるイオン交換クロマトグラフィー、又は
セフアデツクスＧ−７＼Ｇ−１０蒔によるゲル濾過等を
適宜組合わせることによつて行われる。
本発明のグラム陰性菌溶菌剤は、ネガリシンの他にパー
メチンＡからなるものであるが、パーメチンＡは、本発
明者らが開発した新規環状アシルペプチド系抗生物質で
、その名称はＮα一（３−ＨｙｄｒＯｘｙ−４−Ｍｅｔ
ｈｙｌ−１一０ｘ０ｈｅｘｙ】）上−α，γ−Ｄｉａｍ
ｉｎＯｂｕｔｙｒｙＩ−Ｌ−１ｓ０１ｅｕｃｙ１上−α
，γ−ＤｉａｍｉｎＯｂｕｔｙｒ３／１ 一Ｄ−Ｐｈｅ
ｎｙＩａｌａｎｙｌ上−１ｅｕｃｙ１上−α９ γ−Ｄ
ｊａｍｊｎＯｂｕｔｙｒｙＩ−Ｄ−ＶａＩｙＩ上−１ｅ
ｕｃｙ１（式中Ｄａｂは２，４−ジアミノ酪酸を示す）
パーメチンＡはグラム陽性菌、陰性菌、及び真菌類等の
広範囲な微生物に対し強い抗菌力を示ノし、代表的な菌
株である。
メチンＡからなるものであるが、パーメチンＡは、本発
明者らが開発した新規環状アシルペプチド系抗生物質で
、その名称はＮα一（３−ＨｙｄｒＯｘｙ−４−Ｍｅｔ
ｈｙｌ−１一０ｘ０ｈｅｘｙ】）上−α，γ−Ｄｉａｍ
ｉｎＯｂｕｔｙｒｙＩ−Ｌ−１ｓ０１ｅｕｃｙ１上−α
，γ−ＤｉａｍｉｎＯｂｕｔｙｒ３／１ 一Ｄ−Ｐｈｅ
ｎｙＩａｌａｎｙｌ上−１ｅｕｃｙ１上−α９ γ−Ｄ
ｊａｍｊｎＯｂｕｔｙｒｙＩ−Ｄ−ＶａＩｙＩ上−１ｅ
ｕｃｙ１（式中Ｄａｂは２，４−ジアミノ酪酸を示す）
パーメチンＡはグラム陽性菌、陰性菌、及び真菌類等の
広範囲な微生物に対し強い抗菌力を示ノし、代表的な菌
株である。
Ｐｓ．ａｅｒｕｇｉｎＯｓａＡＴＣＣｌＯｌ４５及びＳ
ａＩｍＯｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍＡＪ３２２
４に対する最少発育阻止濃度（ＭＩＣ）は、夫々１２．
５、及び２５ｍｃｑ／Ｍｔである。このように、パーメ
チンＡはグラム陰性菌に対して抗菌作用を示すが、単独
では溶菌作用をほとんど示さない。本発明のパーメチン
Ａはバチルス属に属しパーメチンＡを生産する能力を有
する細菌、例えばバチルス・サーキユランスＡＪ３９Ｏ
２（ＦＥＲＭ−Ｐ３Ｏ９７）等を栄養培地で好気的に培
養することに−より培養液中に生産される。
ａＩｍＯｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍＡＪ３２２
４に対する最少発育阻止濃度（ＭＩＣ）は、夫々１２．
５、及び２５ｍｃｑ／Ｍｔである。このように、パーメ
チンＡはグラム陰性菌に対して抗菌作用を示すが、単独
では溶菌作用をほとんど示さない。本発明のパーメチン
Ａはバチルス属に属しパーメチンＡを生産する能力を有
する細菌、例えばバチルス・サーキユランスＡＪ３９Ｏ
２（ＦＥＲＭ−Ｐ３Ｏ９７）等を栄養培地で好気的に培
養することに−より培養液中に生産される。
栄養培地としては通常の微生物の培養に用いられている
ものでよく、炭素源としてグルコース、シヨ糖等の糖類
、窒素源としてペプトン、肉工キズ、イーストエキス、
硫安、硝安、尿素等、無機塩類として食塩、リン酸根、
Ｋ＋、Ｎａ＋、ＳＯ４−２、Ｍｇ２＋、Ｆｅ２＋、等が
用いられる。
ものでよく、炭素源としてグルコース、シヨ糖等の糖類
、窒素源としてペプトン、肉工キズ、イーストエキス、
硫安、硝安、尿素等、無機塩類として食塩、リン酸根、
Ｋ＋、Ｎａ＋、ＳＯ４−２、Ｍｇ２＋、Ｆｅ２＋、等が
用いられる。
培養法としては通常の振盪または通気攪拌培養て培養さ
れ、培養温度は２５〜４５゜Ｃで２４〜ｎ時間培養する
ことによりパーメチンＡは主として培養液中に著積され
る。
れ、培養温度は２５〜４５゜Ｃで２４〜ｎ時間培養する
ことによりパーメチンＡは主として培養液中に著積され
る。
培養終了後培養液よりパーメチンＡを採取する方法は一
般の発酵生産物を採取する方法に準じて行えばよく、例
えば各種有機溶剤による抽出法、ヘリアンチン酸ナトリ
ウム等の沈澱剤による゜沈澱法、ＣＭ−セルロース等の
各種イオン交換体によるイオン交換クロマトグラフィー
、ゲル濾過法、あるいはカウンターカレント等を適宜組
合せて行うことにより目的とするパーメチンＡを単離す
ることができる。例えば、まず培養液を遠心分離し、上
清液についてブタノール抽出を行い有効成分を抽出する
。
般の発酵生産物を採取する方法に準じて行えばよく、例
えば各種有機溶剤による抽出法、ヘリアンチン酸ナトリ
ウム等の沈澱剤による゜沈澱法、ＣＭ−セルロース等の
各種イオン交換体によるイオン交換クロマトグラフィー
、ゲル濾過法、あるいはカウンターカレント等を適宜組
合せて行うことにより目的とするパーメチンＡを単離す
ることができる。例えば、まず培養液を遠心分離し、上
清液についてブタノール抽出を行い有効成分を抽出する
。
抽出物を水溶液とし、これにヘリアンチン酸ナトリウム
を加えてヘリアンチン酸塩として沈澱せしめ、沈澱物を
濾別後酸性水溶液とし、不溶物（解ｒ創キしｌ射Ｉｌｌ
Ｏ／．；セｑζであり構造式は次の如くである。離した
ヘリアンチン酸）を除き、上清をセフアデツクスＧ−２
５でゲル濾過し、溶出液の活性区分を採取する。
を加えてヘリアンチン酸塩として沈澱せしめ、沈澱物を
濾別後酸性水溶液とし、不溶物（解ｒ創キしｌ射Ｉｌｌ
Ｏ／．；セｑζであり構造式は次の如くである。離した
ヘリアンチン酸）を除き、上清をセフアデツクスＧ−２
５でゲル濾過し、溶出液の活性区分を採取する。
次に弱酸性陽イオン交換体を用いてイオン交換クロマト
グラフィーを行う。ＣＭ−セルロースを用いて食塩の濃
度勾配溶出法て溶出すると活性区分は３つに分かれ、最
後に溶出される活性区分のみを採取し、セフアデツクス
ＬＨ−２０を用いてゲル濾過を行う。このＣＭ−セルロ
ース及びセフアデツクスＬＨ−２０による精製をもう一
度繰り返し行うことによつてパーメチンＡを単離するこ
とができる。本発明のグラム陰性菌溶菌剤はこのように
して得られるネガリシンとパーメチンＡを配合比１：１
〜１：２０の割合で配合してなることが望ましいが、特
に限定する必要はなく、目的に応じて決められる。
グラフィーを行う。ＣＭ−セルロースを用いて食塩の濃
度勾配溶出法て溶出すると活性区分は３つに分かれ、最
後に溶出される活性区分のみを採取し、セフアデツクス
ＬＨ−２０を用いてゲル濾過を行う。このＣＭ−セルロ
ース及びセフアデツクスＬＨ−２０による精製をもう一
度繰り返し行うことによつてパーメチンＡを単離するこ
とができる。本発明のグラム陰性菌溶菌剤はこのように
して得られるネガリシンとパーメチンＡを配合比１：１
〜１：２０の割合で配合してなることが望ましいが、特
に限定する必要はなく、目的に応じて決められる。
又グラム陰性の生菌体に作用させる際の必要濃度はパー
メチンＡが１０〜１００μｑ／Ｍｔｌネガリシンが２〜
２０ｐｇである。以下実施例にて具体的に説明する。実
施例１ グルコース０．５％、肉工キズ１％、ポリペプト・ン１
％、食塩０．３％（ＰＨ６．Ｏ）を含む培地を５０ｍｔ
づつ肩付フラスコに分注し１２０℃、２０分オートクレ
ーブ殺菌後、グルコース０．２％、肉工キズ１％、ポリ
ペプトン１％、食塩０．３％、寒天１．５％、（ＰＨ６
．Ｏ）の寒天斜面培地で３ＴＣ、２橋間培養したバ′チ
ルス・ズプチリスＡＪ３４４９を１白金耳接種し３７℃
で１時間培養して種培養液を得た。
メチンＡが１０〜１００μｑ／Ｍｔｌネガリシンが２〜
２０ｐｇである。以下実施例にて具体的に説明する。実
施例１ グルコース０．５％、肉工キズ１％、ポリペプト・ン１
％、食塩０．３％（ＰＨ６．Ｏ）を含む培地を５０ｍｔ
づつ肩付フラスコに分注し１２０℃、２０分オートクレ
ーブ殺菌後、グルコース０．２％、肉工キズ１％、ポリ
ペプトン１％、食塩０．３％、寒天１．５％、（ＰＨ６
．Ｏ）の寒天斜面培地で３ＴＣ、２橋間培養したバ′チ
ルス・ズプチリスＡＪ３４４９を１白金耳接種し３７℃
で１時間培養して種培養液を得た。
一方、上記液体培地３６ｅを４０ｅシャー・フアーメン
ターに入れ殺菌後、上記バチルス・ズブチリスＡＪ３４
４９の種培養液を接種し３０℃、３００ｒ′Ｐｍ／分、
１１２ｖ／ｖで３（転）間培養後希酸でＰＨを４〜５に
調整し遠心分離した。
ターに入れ殺菌後、上記バチルス・ズブチリスＡＪ３４
４９の種培養液を接種し３０℃、３００ｒ′Ｐｍ／分、
１１２ｖ／ｖで３（転）間培養後希酸でＰＨを４〜５に
調整し遠心分離した。
３０ｅの上清液をＨ＋型としたアンパーライトＩＲＯ−
５０１３５ｅをつめた７×１００ＣＷｉカラムに２０ｍ
Ｌ／分で通過させた後１０ｅ（７）０．２規定リン酸二
ナトリウム溶液を流し、カラムを洗い、次いで０．５Ｎ
のリン酸二ナトリウムで酵素を溶出した。
５０１３５ｅをつめた７×１００ＣＷｉカラムに２０ｍ
Ｌ／分で通過させた後１０ｅ（７）０．２規定リン酸二
ナトリウム溶液を流し、カラムを洗い、次いで０．５Ｎ
のリン酸二ナトリウムで酵素を溶出した。
活性区分を取り４０゜Ｃ以下で減圧濃縮し、５゜Ｃ以下
で３倍容アセントを加え沈澱した酵素を遠心分離し０．
２Ｍ酢酸緩衝液に溶解し、同溶液に透析、その後同緩衝
液で平衡下したアンパーライトＩＲＯ−５０カラム（３
×３０Ｃ７７りに吸着させＩＭ酢酸緩衝液まで直線的に
濃度を上げ溶出した。各フラクシヨンについてＰｓｅｕ
ｄＯｍＯｎｓａｅｒｕｇｉｎＯｓａＡＴＣＣｌＯｌ４５
生菌体溶菌活性を調べ、該活性を有する区分を集め、永
冷下、７８％までアセトンを加えて酵素を沈澱させ、沈
澱物を０．２Ｍ酢酸緩衝液（ＰＨ５．Ｏ）に溶解して、
同緩衝液で緩衝化したＳＰ−ＳｅｐｈａｄｅｘＣ−２５
カラム（２．５×４２ｃｍ）を通過させた。溶出緩衝液
中の食塩の濃度を０から０．５Ｍまで直線的に増加させ
ることにより吸着した酵素を溶出した。ＳＰ−Ｓｅｐｈ
ａｄｅｘＣ−２５カラムクロマトグラフを第１図に示す
。第１図中、縦軸はＰｓ．ａｅｒｕｇｉｎＯｓａＡＴＣ
ＣｌＯｌ４５、Ｍ．ＬｙｓＯｄｅｊｋｔｌｃｕｓＡＪｌ
ＯＯ２に対する溶菌活性（夫々×１σ単位／Ｔｎｔｌ×
１０４単位／ＴｒＬｔ）、食塩濃度（Ｍ）、及び蛋白質
量（０Ｄａｔ２８０ｎｍ）を示し、横軸はフラクシヨン
ＮＯ．（１フラクシヨンニ５ｍ１）を示す。黒丸印（●
−●）はＰｓ．ａｅｒｕｇｉｎＯｓａ，Δ印はＭ．Ｌｙ
ｓＯｄｅｊｋｔｌｃｕに対する溶菌活性を示し、白丸印
（０−０）は蛋白量を示す。更に破線は食，塩濃度を示
す。Ｐｓ．ａｅｒｕｇｉｎＯｓａ生菌体溶解活性を示す
区分は３つの区分に分かれ、それぞれＦｒａｃｔｉＯｎ
ＡｌＦｒａｃｔｊＯｎ〜およびＦｒａｃｔｉＯｎＢと名
ずけた。
で３倍容アセントを加え沈澱した酵素を遠心分離し０．
２Ｍ酢酸緩衝液に溶解し、同溶液に透析、その後同緩衝
液で平衡下したアンパーライトＩＲＯ−５０カラム（３
×３０Ｃ７７りに吸着させＩＭ酢酸緩衝液まで直線的に
濃度を上げ溶出した。各フラクシヨンについてＰｓｅｕ
ｄＯｍＯｎｓａｅｒｕｇｉｎＯｓａＡＴＣＣｌＯｌ４５
生菌体溶菌活性を調べ、該活性を有する区分を集め、永
冷下、７８％までアセトンを加えて酵素を沈澱させ、沈
澱物を０．２Ｍ酢酸緩衝液（ＰＨ５．Ｏ）に溶解して、
同緩衝液で緩衝化したＳＰ−ＳｅｐｈａｄｅｘＣ−２５
カラム（２．５×４２ｃｍ）を通過させた。溶出緩衝液
中の食塩の濃度を０から０．５Ｍまで直線的に増加させ
ることにより吸着した酵素を溶出した。ＳＰ−Ｓｅｐｈ
ａｄｅｘＣ−２５カラムクロマトグラフを第１図に示す
。第１図中、縦軸はＰｓ．ａｅｒｕｇｉｎＯｓａＡＴＣ
ＣｌＯｌ４５、Ｍ．ＬｙｓＯｄｅｊｋｔｌｃｕｓＡＪｌ
ＯＯ２に対する溶菌活性（夫々×１σ単位／Ｔｎｔｌ×
１０４単位／ＴｒＬｔ）、食塩濃度（Ｍ）、及び蛋白質
量（０Ｄａｔ２８０ｎｍ）を示し、横軸はフラクシヨン
ＮＯ．（１フラクシヨンニ５ｍ１）を示す。黒丸印（●
−●）はＰｓ．ａｅｒｕｇｉｎＯｓａ，Δ印はＭ．Ｌｙ
ｓＯｄｅｊｋｔｌｃｕに対する溶菌活性を示し、白丸印
（０−０）は蛋白量を示す。更に破線は食，塩濃度を示
す。Ｐｓ．ａｅｒｕｇｉｎＯｓａ生菌体溶解活性を示す
区分は３つの区分に分かれ、それぞれＦｒａｃｔｉＯｎ
ＡｌＦｒａｃｔｊＯｎ〜およびＦｒａｃｔｉＯｎＢと名
ずけた。
この内ＦｒａｃｔｉＯｎＢのみが、Ｍ．ＬｙｓＯｄｅｉ
ｋｔｉｃｕｓを溶解し；他の区分はＭ．ＬｙｓＯｄｅｉ
ｋｔｊｃｕｓを溶解しなかつた。ＡＪ３４４９株の培養
液中に検出された、セルラーゼ活性、リボヌクレアーゼ
活性およびプロテアーゼ活性はいずれも非吸着部分に検
出され、Ｐｓ．ａｅｒｕｇｉｎＯｓａ生菌体溶解酵素区
分はこれらの酵素と３完全に分離された。Ｆｒａｃｔｌ
ＯｎＡｌ，ＦｒａｃｔｉＯｎＡ２、およびＦｒａｃｔｉ
ＯｎＢは夫々ＳＰ−ＳｅｐｈａｄｅｘＣ−２５カラムに
より同条件で再クロマトグラフィーを行い、夫々のフラ
クシヨン同志の分別をさらに確かなものとした。
ｋｔｉｃｕｓを溶解し；他の区分はＭ．ＬｙｓＯｄｅｉ
ｋｔｊｃｕｓを溶解しなかつた。ＡＪ３４４９株の培養
液中に検出された、セルラーゼ活性、リボヌクレアーゼ
活性およびプロテアーゼ活性はいずれも非吸着部分に検
出され、Ｐｓ．ａｅｒｕｇｉｎＯｓａ生菌体溶解酵素区
分はこれらの酵素と３完全に分離された。Ｆｒａｃｔｌ
ＯｎＡｌ，ＦｒａｃｔｉＯｎＡ２、およびＦｒａｃｔｉ
ＯｎＢは夫々ＳＰ−ＳｅｐｈａｄｅｘＣ−２５カラムに
より同条件で再クロマトグラフィーを行い、夫々のフラ
クシヨン同志の分別をさらに確かなものとした。
４すなたち、０．１ＭＫＣ１Ｍ酢酸緩衝液（ＰＨ５．Ｏ
）で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘＧ−７５カラム（１．
５×９０ｃｒｎ）で上昇法により、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｄ
ｅｘＣ−２５カラムクロマトグラフィーで得たＦｒａｃ
ｔｊＯｎＡｉ，ＦｒａｃｔｉＯｎＡ，およびＦｒａｃｔ
ｉＯｎＢをそれぞれゲル濾過した。
）で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘＧ−７５カラム（１．
５×９０ｃｒｎ）で上昇法により、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｄ
ｅｘＣ−２５カラムクロマトグラフィーで得たＦｒａｃ
ｔｊＯｎＡｉ，ＦｒａｃｔｉＯｎＡ，およびＦｒａｃｔ
ｉＯｎＢをそれぞれゲル濾過した。
ＳＰ−ＳｅｐｈａｄｅｘＣ−２５カラムクロマトグラフ
ィーにおいて近接するＦｒａｃｔｉＯｎＡ２とＦｒａｃ
ｔｉＯｎＢを完全に相互分離するため、さらにＳｅｐｈ
ａｄｅｘＧ−７５カラムにより再クロマトグラフィーを
行つた。ゲル濾過によつて得られた各フラクシヨンを夫
々蒸留水に２日間透析後、凍結乾燥して保存した。Ｆｒ
ａｃｔｉＯｎＡｌ，ＦｒａｃｔｉＯｎＡ２を本発明者ら
はネンガリシンＩ，■と命名した。
ィーにおいて近接するＦｒａｃｔｉＯｎＡ２とＦｒａｃ
ｔｉＯｎＢを完全に相互分離するため、さらにＳｅｐｈ
ａｄｅｘＧ−７５カラムにより再クロマトグラフィーを
行つた。ゲル濾過によつて得られた各フラクシヨンを夫
々蒸留水に２日間透析後、凍結乾燥して保存した。Ｆｒ
ａｃｔｉＯｎＡｌ，ＦｒａｃｔｉＯｎＡ２を本発明者ら
はネンガリシンＩ，■と命名した。
このようにして得られたネガリシンの理化学的性質は既
に述べた。ネガリシンの活性測定法は以下のようにして
測定される。まず被溶解菌（シュードモナス・エルギノ
ーニサ、ＡＴＣＣｌＯｌ４５）を、０．２％グルコース
、１％ポリペプトン、１％肉工キズ０．３％ＮａＣｌｌ
（ＰＨ７．５）からなる液体培地で３７℃又は３０℃で
１８〜２４時間振蓋培養した後、集菌、洗浄後、ベロナ
ール緩衝液（ＰＨ７．Ｏ、イオン強度０．０１）に懸濁
し、６６０ｎｍに於ける吸光度が０．８の懸濁液とする
。
に述べた。ネガリシンの活性測定法は以下のようにして
測定される。まず被溶解菌（シュードモナス・エルギノ
ーニサ、ＡＴＣＣｌＯｌ４５）を、０．２％グルコース
、１％ポリペプトン、１％肉工キズ０．３％ＮａＣｌｌ
（ＰＨ７．５）からなる液体培地で３７℃又は３０℃で
１８〜２４時間振蓋培養した後、集菌、洗浄後、ベロナ
ール緩衝液（ＰＨ７．Ｏ、イオン強度０．０１）に懸濁
し、６６０ｎｍに於ける吸光度が０．８の懸濁液とする
。
この菌体懸濁液２．０ｗＬＬにネガリシン溶液０．２５
ｍ１、パーメチンＡ溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）０．２５
ｍ１を加えて混合し、３ＴＣで１吟間反応し、６６０ｎ
ｍに於る吸光度の減少量を測定する。ネガリシン及びパ
ーメチンＡの代りに水を用いたものを対照とし、上記吸
光度０．００１減少させる酵素活性１単位とする。バチ
ルス●サーキユランスＡＪ３９Ｏ２をプイヨン寒天斜面
培地上で３０℃、２Ｓｆ間生育させる。
ｍ１、パーメチンＡ溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）０．２５
ｍ１を加えて混合し、３ＴＣで１吟間反応し、６６０ｎ
ｍに於る吸光度の減少量を測定する。ネガリシン及びパ
ーメチンＡの代りに水を用いたものを対照とし、上記吸
光度０．００１減少させる酵素活性１単位とする。バチ
ルス●サーキユランスＡＪ３９Ｏ２をプイヨン寒天斜面
培地上で３０℃、２Ｓｆ間生育させる。
一方ポリペプトン３％、肉工キズ１％、食塩０．３％を
含む液体培地（ＰＨ６．Ｏ）を１００ｍ１当て５００ｍ
ｔの肩付フラスコに分注し１２０℃−２０１ｉｊ−高圧
減菌後前述の斜面培地上に生育した菌を１白金耳接種し
、３０℃、３日間、１２０ｒｐｍで振？培養を行つた。
培養終了後１００００ｒｐｍて遠心分離Ｌ、上清液を１
１５に減圧濃縮した後ｎ−ブタノールを添加し抽出した
。ブタノール層を分離し減圧濃縮することにより粗標品
を得た。粗標品５９を水１００ｍ１に溶解し、不溶部を
除去後上清に５ｇのヘリアンチン酸ナトリウム（メチル
オレンジ）をジメチルホルムアミド２５ｍ１と水７５ｎ
ｔの混液に溶解したものを加え、析出した結晶を分離し
た。
含む液体培地（ＰＨ６．Ｏ）を１００ｍ１当て５００ｍ
ｔの肩付フラスコに分注し１２０℃−２０１ｉｊ−高圧
減菌後前述の斜面培地上に生育した菌を１白金耳接種し
、３０℃、３日間、１２０ｒｐｍで振？培養を行つた。
培養終了後１００００ｒｐｍて遠心分離Ｌ、上清液を１
１５に減圧濃縮した後ｎ−ブタノールを添加し抽出した
。ブタノール層を分離し減圧濃縮することにより粗標品
を得た。粗標品５９を水１００ｍ１に溶解し、不溶部を
除去後上清に５ｇのヘリアンチン酸ナトリウム（メチル
オレンジ）をジメチルホルムアミド２５ｍ１と水７５ｎ
ｔの混液に溶解したものを加え、析出した結晶を分離し
た。
この結晶をジメチルホルムアミド９０ｍ１に溶解し、不
溶部を除去後、上清に水１５００ｍ１を加え再結晶させ
た。結晶を０．３晰定塩酸にとかすと不溶のヘリアンチ
ン酸が解離しするのでこれを濾別後濾液をブタノール抽
出し、抽出液を減圧乾固した。これを０．０２規定塩酸
にとかし、０．乾規定塩酸で平衡化したセフアデツクス
Ｇ２５カラム（１．５×９０α）でゲル濾過を行つた。
溶部を除去後、上清に水１５００ｍ１を加え再結晶させ
た。結晶を０．３晰定塩酸にとかすと不溶のヘリアンチ
ン酸が解離しするのでこれを濾別後濾液をブタノール抽
出し、抽出液を減圧乾固した。これを０．０２規定塩酸
にとかし、０．乾規定塩酸で平衡化したセフアデツクス
Ｇ２５カラム（１．５×９０α）でゲル濾過を行つた。
活性区分のみを集めて濃縮し、再び同じカラムでゲルロ
濾過を行つた。活性区分を集めて濃縮・乾個して２．０
ｙの白色粉末を得た。この内１．０ｑを０．０５Ｍギ酸
アンモニア緩衝液（ＰＨ７．Ｏ）：メタノールニ１：１
の溶液に溶かし、同じ溶液で緩衝化したＣＭ−セルロー
スカラム（２．５×４０ｃｍ）に吸着させ、食塩濃度を
Ｏから１．０Ｍまで直線的に増加させて溶出した。
濾過を行つた。活性区分を集めて濃縮・乾個して２．０
ｙの白色粉末を得た。この内１．０ｑを０．０５Ｍギ酸
アンモニア緩衝液（ＰＨ７．Ｏ）：メタノールニ１：１
の溶液に溶かし、同じ溶液で緩衝化したＣＭ−セルロー
スカラム（２．５×４０ｃｍ）に吸着させ、食塩濃度を
Ｏから１．０Ｍまで直線的に増加させて溶出した。
図活性は大きく分けて３つの区分に分かれた。最後に溶
出される活性区分のみを集め減圧乾固した。これをメタ
ノールに溶かしメタノールで緩衝化したセフアデツクス
ＬＨ−２０（フアルマシヤ社製のゲル濾過剤）のカラム
（２．５×４０ｃｍ）を通過させた脱塩した。活性区分
を減圧乾固し再び上記ＣＭ−セルロースによるイオン交
換クロマトグラフィーを行つた。活性区分を集め再びセ
フアデツクスＬＨ−２０でゲル濾過を行い活性区分を減
圧乾固して５００ｍｇのパーメチンＡ白色粉末を得た。
このパーメチンＡ白色粉末のアミノ酸分析結果は第２表
に示す。（★６ＮＨＣＩで１１０℃、ｎ時間加水分解し
た時の値）このパーメチンＡ白色粉末で？の塩で１１０
℃、１時間加水分解し、ジアゾ化後ガスクロマトグライ
ーを行うと有機酸が検出された。
出される活性区分のみを集め減圧乾固した。これをメタ
ノールに溶かしメタノールで緩衝化したセフアデツクス
ＬＨ−２０（フアルマシヤ社製のゲル濾過剤）のカラム
（２．５×４０ｃｍ）を通過させた脱塩した。活性区分
を減圧乾固し再び上記ＣＭ−セルロースによるイオン交
換クロマトグラフィーを行つた。活性区分を集め再びセ
フアデツクスＬＨ−２０でゲル濾過を行い活性区分を減
圧乾固して５００ｍｇのパーメチンＡ白色粉末を得た。
このパーメチンＡ白色粉末のアミノ酸分析結果は第２表
に示す。（★６ＮＨＣＩで１１０℃、ｎ時間加水分解し
た時の値）このパーメチンＡ白色粉末で？の塩で１１０
℃、１時間加水分解し、ジアゾ化後ガスクロマトグライ
ーを行うと有機酸が検出された。
この有機酸はマスベクトル及びＮＭＲスペクトルで調べ
た結果、であつた。
た結果、であつた。
又、この白色粉末を臭化カリウム錠として測定した１Ｒ
スペクトル及びＮＭＲスペクトルは夫々第２図、第３図
に示した。このようにして得たネガリシンＩまたは■の
白色粉末１ｍ９とパーメチンＡ白色粉末５ｍ９を混合し
グラム陰性菌溶解剤を調整し第３表に示す各種微生物の
生菌体に対する溶菌作用を調べた。
スペクトル及びＮＭＲスペクトルは夫々第２図、第３図
に示した。このようにして得たネガリシンＩまたは■の
白色粉末１ｍ９とパーメチンＡ白色粉末５ｍ９を混合し
グラム陰性菌溶解剤を調整し第３表に示す各種微生物の
生菌体に対する溶菌作用を調べた。
第３表に示す微生物の生菌体をベロナール緩衝液（ＰＨ
７．へイオン強度０．０１）に、６６０ｒ１ｍに於る吸
光度（０Ｄ）が０．８になるように懸濁し、この懸濁液
２．０ｍ１に、上記グラム陰性菌溶解剤水溶液０．５ｍ
Ｌ（濃度６００μｇ／ｍｌ）を加え３７゜Ｃで３扮間反
応し、反応液の吸光度の減少の割合（溶菌率％＝吸光度
の・減少値／反応前の吸光度値を調べた。その結果を第
３表に示す。第３表中ＧＮＢＮＯの付されている菌株は
病源菌として人の膿から分離されたグラム・ネガティブ
バクテリア（ＧｒａｍＮ．ｅ？ＴｉｖｅＢ．ａｃｔｅｒ
ｉａ）でいずれもＰｓ．ａｅｒｕｇｉｎＯｓａに属する
ものである。
７．へイオン強度０．０１）に、６６０ｒ１ｍに於る吸
光度（０Ｄ）が０．８になるように懸濁し、この懸濁液
２．０ｍ１に、上記グラム陰性菌溶解剤水溶液０．５ｍ
Ｌ（濃度６００μｇ／ｍｌ）を加え３７゜Ｃで３扮間反
応し、反応液の吸光度の減少の割合（溶菌率％＝吸光度
の・減少値／反応前の吸光度値を調べた。その結果を第
３表に示す。第３表中ＧＮＢＮＯの付されている菌株は
病源菌として人の膿から分離されたグラム・ネガティブ
バクテリア（ＧｒａｍＮ．ｅ？ＴｉｖｅＢ．ａｃｔｅｒ
ｉａ）でいずれもＰｓ．ａｅｒｕｇｉｎＯｓａに属する
ものである。
第３表に示すように本発明のグラム陰性菌溶菌剤は酵母
（ＳａｃｃｈａｒＯｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
やグラム陰性菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｌｓ）
には全く作用しないが、大腸菌（Ｅ．ｃＯｌｊ）や縁膿
菌（Ｐｓ．ａｅｒｕｇｉｎＯｓａ）を良く溶解し、特に
縁膿菌に対して強い溶菌作用を示すものである。
（ＳａｃｃｈａｒＯｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
やグラム陰性菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｌｓ）
には全く作用しないが、大腸菌（Ｅ．ｃＯｌｊ）や縁膿
菌（Ｐｓ．ａｅｒｕｇｉｎＯｓａ）を良く溶解し、特に
縁膿菌に対して強い溶菌作用を示すものである。
第１図はネガリシンＩ，■弐ＳＰ−セフアデツフクスＧ
−２５カラムクロマトグラムを示す。
−２５カラムクロマトグラムを示す。
Claims (1)
- １ ネガリシン及びパーメチンＡを含有してなるグラム
陰性菌溶菌剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP54003731A JPS6047245B2 (ja) | 1979-01-16 | 1979-01-16 | グラム陰性菌溶菌剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP54003731A JPS6047245B2 (ja) | 1979-01-16 | 1979-01-16 | グラム陰性菌溶菌剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5598115A JPS5598115A (en) | 1980-07-25 |
| JPS6047245B2 true JPS6047245B2 (ja) | 1985-10-21 |
Family
ID=11565397
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP54003731A Expired JPS6047245B2 (ja) | 1979-01-16 | 1979-01-16 | グラム陰性菌溶菌剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6047245B2 (ja) |
-
1979
- 1979-01-16 JP JP54003731A patent/JPS6047245B2/ja not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5598115A (en) | 1980-07-25 |
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